Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология
Автореферат диссертации по теме "Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость"
На правах рукописи
БРЯНЦЕВ АНТОН ЛЕОНИДОВИЧ
ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ ПЕРЕРАСПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЖА Нзр25/27 ПОД ДЕЙСТВИЕМ СТРЕССА: РЕГУЛЯЦИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва-2003
Работа выполнена в лаборатории молекулярной и клеточной кардиологии НИИ экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ.
Научные руководители:
кандидат биологических наук А.Е. Кабаков
доктор медицинских наук, профессор Э.М. Тарарак
Официальные оппоненты:
кандидат биологических наук, В.В. Кушниров
доктор биологических наук, профессор Н.Б. Гусев
Ведущая организация: Московский Государственный
Университет им. Ломоносова, Биологический факультет
Защита состоится 16 октября 2003 года в 11.00 на заседании диссертационного совета Д 208.073.01 в РК НПК МЗ РФ (Москва, 121552, 3-я Черепковская ул., д. 15 а).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ.
Автореферат разослан 16 сентября 2003 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.
Т.И. Венгерова
2-оо5-Д
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ ( БИБЛИОТЕКА I С. Петербург ¿.чЛ
» ОЭ шЗ шпЭ то [
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Важнейшим компонентом внутриклеточной защиты, обеспечивающим выживание клеток в таких стрессовых условиях, как повышение температуры (тепловой шок, ТШ), изменение значений pH, нарушение энергетического баланса, воздействие свободных радикалов и токсинов и др., являются белки теплового шока (heat shock proteins, HSP). Одним из представителей HSP является белок Hsp25/27. Название Hsp27 принято для определения белка человека, тогда как для гомологичных ему белков крысы и мыши используется аббревиатура Hsp25. Хотя Hsp25/27 конститутивно экспрессируется в достаточно больших количествах во многих мышечных тканях, особенно в сердце (Kiemenz et al 1993; Scheler et al 1997; Knowlton et al 1998), его функциональная роль в нормальных физиологических условиях представляется неясной. При патофизиологических состояниях этот белок выступает в качестве защитного фактора. Избирательное увеличение количества Hsp25/27 в клетках защищает последние от действия теплового шока (Chretien and Landry 1988; Landry et al 1989), окислительного стресса (Mehlen et al 1995; Rogalla et al 1999), ишемии/реперфузии (Loktionova et al 1998; Brar et al 1999; Vander Heide 2002), действия некоторых токсических веществ (Huot et al 1991; Garrido et al 1996; Wu and Welsh 1996). В последнее время получены также данные о том, что Hsp25/27 может блокировать апоптоз (Guenal et al 1997; Garrido et al 1999; Brar et al 1999; Wagstaff et al 1999; Charette et al 2000; Bruey et al 2000), повышая тем самым выживаемость клеток при патофизиологических состояниях. Таким образом, данные литературы демонстрируют несомненное участие Hsp25/27 в процессе клеточной защиты от стрессового воздействия, однако молекулярные механизмы подобного действия пока остаются нераскрытыми. По некоторым данным этот белок способен связываться с различными элементами цитоскелета, особенно с актиновыми фибриллами (Benndorf et al 1994; Loktionova et al 1996; Bryantsev et al 2002), с другой стороны известно, что под действием стресса Hsp25/27 образует крупные внутриклеточные гранулы, локализация которых, по разным сведениям, может быть ядерной (Arrigo et al 1988; Loktionova et al 1996) или
цитоплазматической (Collier and Schlesinger 1986; Collier et al 1988). Наконец, в экспериментах in vitro была продемонстрирована способность Hsp25/27 восстанавливать нативную кон формацию денатурированных белков (т.е. производить рефолдинг), на основании чего этот белок и был отнесен к семейству молекулярных шаперонов (Merck et al 1993; Jakob et al 1993; Ehrnsperger et al 1997). Однако, до сих пор отсутствуют данные о существовании шаперонной активности Hsp25/27 in vivo, в живой клетке, что ставит под сомнение шаперонную активность этого белка. Таким образом, предположение о функционировании Hsp25/27 в роли молекулярного шаперона в клетках в условиях стресса остается недоказанным. Противоречивыми также являются и имеющиеся в литературе сведения об участии фосфорилирования Hsp25/27 в механизмах клеточной защиты. Известно, что тепловой шок и другие стрессы вызывают быстрое фосфорилирование этого белка в клетках (Crete and Landry 1990; Barchowsky et al 1994; Loktionova et al 1996). Однако роль различных фосфо-изоформ белка Hsp25/27 в клетке остается не вполне ясной. С одной стороны, в экспериментах in vitro показано, что нефосфорилированные изоформы Hsp25/27 связывают F-актин и ингибируют его дальнейшую полимеризацию (Benndorf et al 1994), с другой, - что именно фосфорилированные изоформы этого белка обнаруживаются в клеточной фракции актиновых фибрилл (Zhu et al 1994). Также остается непонятным, почему белок Hsp25/27 в момент стресса подвергается фосфорилированию. По данным экспериментов in vitro, фосфорилирование Hsp25/27 ведет к значительному снижению его шаперонной активности (Rogalla et al 1999), однако именно эта активность Hsp25/27 и должна бы быть в первую очередь востребована клеткой как в процессе протеотоксического стресса, так и после окончания его действия.
Цель н задачи исследования.
Целью данной работы явилось исследование внутриклеточного поведения белка теплового шока Hsp25/27 для более детального выявления возможных механизмов защиты клеток от стресса. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1. Выявить изменения внутриклеточного распределения белка Hsp25/27 в ответ на действие стрессов различной этиологии;
2. Исследовать роль фосфорилирования белка Нвр25/27 в его внутриклеточном перераспределении;
3. Изучить функциональные последствия перераспределения белка Нвр25/27.
Научная новизна н практическая значимость работы.
В результате работы было продемонстрировано, что под воздействием ряда стрессов, обладающих различными повреждающими механизмами, в клетках происходит однотипное перераспределение конститутивно экспрессируюемого Нзр25/27: белок ко-локализуется с пучками актиновых фибрилл и перемещается в ядра клеток, где формирует ядерные гранулы. Показано, что регуляция внутриклеточного стресс-индуцируемого перераспределения белка Нзр25/27 осуществляется путем изменения статуса его олигомеризации, вызываемого фосфорилированием. Ассоциация белка Нвр25/27 с актиновыми фибриллами придает большую стабильность актиновому цитоскелету. В работе впервые показана совместная локализация ядерных гранул белка Няр25/27 с местами накопления поврежденных стрессом ядерных белков. Также впервые продемонстрировано участие Нзр25/27 в качестве фактора, усиливающего эффективность процесса репарации белков с поврежденной конформационной структурой - рефолдинга, протекающего в ядрах стрессированных клеток. В результате полученных данных сделано заключение, что ядерные гранулы, формируемые белком Нзр25/27, связаны с системой протеолитической деградации.
Результаты данного исследования вносят существенный вклад в развитие представлений о механизмах клеточной защиты от различных повреждающих и стрессовых воздействий. Обнаруженное в работе стресс-индуцируемое внутриклеточное перераспределение белка Нвр25/27 может быть положено в основу тест-системы для определения факта стрессового воздействия на клетки и ткани.
Апробация работы.
Результаты работы были представлены на межлабораторном семинаре НИИЭК РК НПК МЗ РФ (Москва, 10 июня 2003), дважды - на Голландских съездах по изучению молекулярных шаперонов (Неймеген,
январь 2001; Амстердам, февраль 2003) и дважды - на конференциях «Молекулярные шапероны и реакция теплового стресса» (Колд Спринг Харбор, США, май 1998, май 2002).
Публикации.
Результаты работы опубликованы в 2х статьях и в 6™ тезисах международных конференций.
Структура н объем диссертации.
Диссертационная работа построена по традиционному принципу и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 120 страниц машинописного текста, 3 схемы, 2 таблицы и 16 рисунков. Список литературы включает 353 источника.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клеточные культуры. В исследовании использовались постоянные клеточные линии Н9с2 (крысиные кардиомиобласты) и Rat-1 (крысиные фибробласты сердца), конститутивно экспрессирующие эндогенный Hsp25. В некоторых экспериментах были использованы мышиные фибробласты линии L929, не имеющие экспрессии собственного Hsp25.
Индукция стрессовых условий. Тепловой шок вызывался путем погружения предварительно загерметизированных с помощью Parafilm чашек Петри с культивируемыми клетками в водяную баню (Instrutemp) с точностью поддержания температуры до 0.1 °С. Клетки прогревали при температуре 43°С в течение 30 мин. При необходимости после действия теплового шока клетки оставляли на 30-60 мин. для восстановления в термостате в обычных условиях культивирования. Для индукции энергетического голодания (имитируемая клеточная ишемия) клетки помещали в среду DMEM без глюкозы (Sigma), с добавлением 1% эмбриональной телячьей сыворотки, 20 мМ HEPES, 50 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, а также 2мкМ ротенона для ингибирования дыхательной цепи митохондрий, где инкубировали указанное в тексте
время. Для индукции ацидозного стресса клетки инкубировали в течение 1 часа в обычной ростовой среде с рН 5.5-6.0. Все инкубации проводили при температуре 37°С в культуральном инкубаторе.
Трансфекции клеток. Для эктопической экспрессии необходимых белков в клетках использовался метод временной трансфекции. Процедура трансфекции клеток проводилась с помощью химических реагентов Gene Porter или Lipofectamine по протоколу, указанному производителем.
Получение цитопластов. Для исключения контаминации детергент-нерастворимой цигосклетной фракции клеток ядерным содержимым, для фракционирования использовались денуклеированные клетки (цитопласты). Для этого клетки (Н9с2 линии) выращивались на круглых пластиковых стеклах (LUX, Miles Scientific). Двухдневные субконфлуентные культуры клеток денуклеировали в соответствии с методикой, описанной ранее (Prescott et al 1972), но с небольшими модификациями.
Анализ эффективности рефолдннга после теплового шока. Для измерения скорости и эффективности рефолдннга использовалось измерение активности люциферазы в лизатах клеток. Клетки, трансфицированные плазмидой, кодирующей ген люциферазы (и при необходимости совместно трансфицированные с другими плазмидами), рассевали в 24-луночные культуральные плашки с концентрацией 8.0x104 клеток/лунка. Спустя 24 часа клетки в плашках подвергали экспериментальным воздействиям, плашки герметизировали при помощи Parafilm и опускали в водяную баню для индукции теплового шока. Для предотвращения ошибочной интерпретации результатов из-за синтеза люциферазы de novo, сразу после воздействия тепловым шоком в среду культивирования клеток добавляли циклогексимид (Sigma), ингибитор белкового синтеза, до конечной концентрации 20 мкг/мл. Лизис клеток до и в различное время после действия теплового шока проводили в буфере BLUC (130 мкл/лунка), после чего лизаты переносились в микропробирки и замораживались. Для анализа активности люциферазы в лизатах измерялась световая активность 50 мкл аликвот при добавлении 50 мкл субстратного буфера (BLUC, 1.25 мМ АТФ, 0.087 мг/мл D-люциферина) в люминометре Luminoskan (ThermoLab Systems) в режиме интегрального
считывания в течение 10 сек. После отсечения фоновых значений результаты усреднялись (на каждую экспериментальную точку собирались лизаты из 4 лунок) и нормировались на данные лунок, лизированных до воздействия тепловым шоком, которые принимались за 100%. Статистическая обработка проводилась с использованием программы Excel 2000 (Microsoft).
Электрофорез, изоэлектрическое фокусирование и иммуноблоттннг. Электрофорез в полиакриламидном геле проводили в системе Лэммли, с использованием 4% концентрирующего и 10% разделяющего гелей в редуцирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия (Laemmli 1970).
Нативный электрофорез проводили в вертикальных пластинах на аппарате фирмы LKB. Использовали 3% концентрирующий гель и 2%-18% градиентный разделяющий гель. Электродный буфер имел следующий состав: 0.09 М Трис, 0.08 М борная кислота, 0.002 М ЭДТА, рН-8.4. Перед нанесением образцов проводили пред-форез геля в течение 20 мин. при напряжении 70В. После нанесения образцов 15-20 мин. электрофорез вели при напряжении 70В, пока белки не входили в гель. Затем напряжение увеличивали до 120 В и проводили электрофорез в течение 16-18 часов при +4°С. Перед переносом белков с геля на нитроцеллюлозу гель вымачивали в буфере переноса в течение 40 мин.
Изоэлекгрофокусирование (ИЭФ) белков в градиенте рН проводили в 8% поли акрил амидном геле, содержащем 8 М мочевину и 4% амфолинов (равная смесь амфолинов диапазона рН 5-7 и 5-8; Pharmacia). Использовался ИЭФ-аппарат (LKB) со следующими установками: 3000 В, 10 Вт, 6000 Вольт-часов. Перед нанесением образцов, растворенных в ИЭФ буфере, производили предфокусирование геля в течение 15 мин. Температура геля во время фокусирования поддерживалась с помощью охлаждающей водяной бани (LKB) не более 5°С в течение первой половины процесса и затем поднималась до 12°С.
Разделенные электрофорезом или электрофокусированием белки переносили из геля на нитроцеллюлозный фильтр (0.45 мкм) или PVDF-мембрану (Amersham-Pharmacia) в буфере электропереноса (25 мМ Трис-НС1, 180 мМ глицина, 0,04% SDS) при 300 мА в течение 2 часов или при 30 мА в течение ночи, блокировали в 5% обезжиренном молоке,
приготовленном на буфере TBS-T (25 мМ Трис-HCl pH 7.5, 150 мМ NaCl, 0.05% Твин-20). После инкубации мембраны с первичными и вторичными (мечеными пероксидазой хрена) антителами, разведенными на TBS-T с добавлением 3% обезжиренного молока, места связывания белков с антителами выявляли с помощью метода усиленной люминесценции (ECL, Amersham-Pharmacia). Для проявления сигнала использовались рентгеновские мембраны (Kodak) и стандартный набор проявляющих и фиксирующих реагентов для рентгеновских фотопластин.
Иммунофлуоресценция. Клетки выращивали на стеклах в 35-мм чашках Петри или в лунках 24-луночных плашек. За 1-2 часа до начала экспериментальных процедур ростовая среда заменялась на свежую. После окончания экспериментальных процедур стекла с клетками промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH 7.2-7.4) и фиксировали в течение 5 мин. раствором 4% формальдегида, приготовленном на ФСБ с добавлением 0.1% детергента Тритон Х-100. После фиксации клетки отмывали в трех сменах ФСБ и инкубировали в растворе первичных антител, разведенных на ФСБ с добавлением 1% БСА. Инкубация клеток с первичными антителами проводилась в течение 1 часа при 37°С или в течение ночи при 4°С. После быстрой процедуры отмывки первых антител, клетки окрашивали вторичными антителами, мечеными флуорохромами, в течение 45 мин. при 37°С. Для визуализации ядер в среду инкубации также добавлялся флуорохром для ДНК, DAPI. После инкубации с антителами стекла отмывали в двух-трех сменах ФСБ и монтировали на предметных стеклах клетками вниз при помощи водорастворимой среды Mowiol с добавлением DABCO в качестве антиобесцвечивающего агента. Анализ окрашенных клеток производили с помощью эпифлуоресцентного микроскопа (Opton III, Karl Zeiss), оборудованного стандартными наборами фильтров для голубой (DAPI), зеленой (FITC или зеленый флуоресцирующий белок) и красной (Техасский красный) флуоресценции. Препараты также изучались с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа (Leica).
Тестирование стабильности F-актина. Для тестирования стабильности актинового цитоскелета нестрессированные и предобработанные стрессами клетки инкубировали в стандартной ростовой среде, содержащей 3 мкг/мл цитохалазина Б или 0.5 мкг/мл
цитохалазина Д (оба Sigma) в течение 10 мин. После инкубации клетки фиксировали и пермеабилизировали по протоколу для иммунофлуоресценции. Клеточный полимеризованный актин и ядра метили фаллоидин-FITC и DAPI соответственно. Для оценки устойчивости актина, клетки фотографировали и подсчитывали процент клеток, содержащих нативные, длинные фибриллы. Для оценки тотального количества клеток также подсчитывали количество клеточных ядер. На каждую экспериментальную точку учитывалось не менее 200 клеток.
Компьютерная обработка изображений. Для интерпретации результатов флуоресцентной и конфокальной микроскопии проводилось совмещение изображений клеток в программе Photoshop (версия 6.0). Для этого, изображениям, полученным в разных световых каналах (для разных флуорохромов), присваивали псевдоцвета. Как правило, сигнал, поступающий с красителя DAPI, выявляющего ДНК, изображался синим цветом, окрашивание на белок Hsp25/27 — красным, сигнал зеленого флуоресцентного белка (EGFP) - зеленым. При совмещении изображений одного и того же объекта, сделанных в разных цветовых каналах, места ко-локализации двух антигенов (меченых зеленым и красным цветами) выявлялись по изменению цвета в этом участке изображения на желтый (из-за совмещения зеленого и красного цветов). Синий сигнал, выявляющий ДНК, определял границы клеточного ядра.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изменения внутриклеточной локализации Hsp25, вызванные действием теплового шока н других стрессов.
Как следует из результатов иммунофлуоресцентного анализа, в клетках Н9с2 и Rat-1 белок Hsp25 присутствовал преимущественно в цитоплазме, где он был распределен диффузно (рис. 1а). После 20-30 мин. воздействия температурой 43°С, картина распределения Hsp25 в клетках претерпевала значительные изменения. Диффузное распределение этого белка в цитоплазме сменялось на фибриллярное (что было более характерно для Н9с2 клеток), и кроме того, Hsp25 перемещался в ядра клеток, где концентрировался в характерных компактных участках, называемых ядерными гранулами (рис. 16). Методом двойного мечения
удалось ко-локализовать фибриллярное распределение Нвр25 в цитоплазме стрессированных клеток с пучками актиновых фибрилл (рис.
). Изменения в распределении Нвр25, наблюдаемые при иммунофлуоресценции клеток, подтверждались биохимическими данными: если до действия теплового шока Нзр25 локализовался исключительно в детергент-растворимой фракции, то после стресса значительная часть пула этого белка перемещалась в детергент-нерастворимую фракцию, что свидетельствовало об ассоциации белка с детергент-устойчивыми структурами клетки - цитоскелетом и ядерным матриксом.
а О в
> с д е
ж ж * ж"
Рис. 1: Иммуиофлуоресцеитное выявление внутриклеточного перераспределения белка Н$р25 в клетках под влиянием теплового шока и других стрессовых воздействий, е.- контрольные клетки; б: клетки после обработки тепловым шоком; в: клетки, восстанавливающиеся в течение 2 часов после окончания действия теплового шока; г.* клетки, культивируемые в течение 1 часа в среде с рН 5.5; д: клетки, инкубируемые в среде с ЮмМ ионофора А23187; е: клетки после 30 мин. блокады синтеза АТФ; ж-ж": край цитоплазмы одной клетки после теплового шока, с выявлением Н$р25 (красный цвет) и Р-актина (зеленый цвет). При совмещении изображений места ко-локализации окрашены в желтый цвет. Маркер - 10 мкм.
Вышеописанные изменения внутриклеточной локализации №р25 и частичная потеря им растворимости сохранялись некоторое время и после снятия стрессового воздействия по возвращении клеток в нормальные физиологические условия. При продолжении культивирования клеток при 37°С внутриклеточная локализация, а также растворимость этого белка постепенно возвращались к состоянию, наблюдаемому до стрессового воздействия (рис. 1в). Продолжительность периода, при котором сохранялись изменения во внутриклеточной локализации Нзр25 (ассоциация с актиновым цитоскелетом и наличие ядерных гранул) и его растворимости, находились в положительной зависимости от силы (температуры) и продолжительности воздействия теплового стресса.
Для исследования специфичности реакции Шр25 (изменение его внутриклеточной локализации) было изучено поведение этого белка в ответ на действие стрессов другой этиологии: ацидоз (низкое значение рН среды инкубации), повышение концентрации внутриклеточного Са2+ и истощение АТФ. При закислении среды культивирования (рН 5.5), в течение часа распределение Няр25 внутри клеток изменялось и в целом напоминало стресс-индуцированную локализацию этого белка после воздействия тепловым шоком: ассоциация с пучками актиновых фибрилл и наличие ядерной локализации и ядерных гранул (рис. 1г). Повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция индуцировалось при помощи кальциевого ионофора А23187. Присутствие 10 мМ А23187 в культуральной среде также вызывало характерное перемещение Нвр25 в ядра клеток и его ассоциацию с актиновым цитоскелетом (рис. 1д). Реакция Няр25 в ответ на полное блокирование синтеза АТФ в клетке носила более сложный характер. В течение первых 60 мин. после начала инкубации клеток в среде, лишенной глюкозы, в присутствии ингибиторов митохондриальной дыхательной цепи, белок перемещался в ядра клеток и образовывал ядерные гранулы, а в цитоплазме ко-локализовался с акгиновыми фибриллами (рис. 1е). При более длительной инкубации (1.5-2 часа), когда общий процент содержания АТФ в клетках линии Н9с2 должен был составлять около 3% от исходного (СЫш й а1 2000), ядерные гранулы и ассоциация белка с актиновым цитоскелетом
исчезали и белок диффузио распределялся по всей клетке. При этом происходили значительные негативные изменения в морфологии клеток: наблюдалось разрушение их актинового цитоскелета, накопление большого количества вакуолей в цитоплазме, уплотнение ядер и т.п. Полученные данные позволяют заключить, что в клетках, конститутивно экспрессирующих Няр25, этот белок быстро и достаточно консервативно реагирует на влияние неблагоприятных воздействий - стрессов. При этом становится очевидным, что существуют как минимум два клеточных компартмента, являющихся мишенями этого белка во время стресса, -актиновый цитоскелет и ядро.
Для ответа на вопрос о белковой композиции ядерных гранул был применен метод двойного иммунофлуоресцентного мечения, когда одной флуоресцентной меткой в клетке визуализировался Нвр25, обозначающий месторасположение стресс-индуцируемых ядерных гранул, а второй меткой в этой же клетке обнаруживался другой белок, выбранный в качестве кандидата на возможное присутствие в этих структурах.
а а \ а"
INp25 I Ьс70
IKp2- 2(>S
Рис. 2: Конфокальный анализ белковой композиции ядерных гранул Hsp25 в ядрах стрессиро ванных тепловым током клеток.
Иммунофлуоресцентное выявление: а,6 - Hsp25; а" - Hsc70; б' - 20S протеасомы; а" - совмещенные изображения а и а'; б" - совмещенные изображения б и б\ Места ко-локализации видны в желтом цвете. Звездочки обозначают месторасположение ядрышек. Синий цвет - ДНК. Размер изображений - 16.5x16.5 мкм2
Конфокальная микроскопия позволила четко ко-локализовать в ядерных гранулах, образуемых Hsp25, другой белок теплового шока -Hsc70 (рис. 2а-а ). При этом, присутствие Hsc70 в ядерных гранулах Hsp25 было не слишком значительным. Основным местом накопления в ядре стрессированной клетки белка Hsc70, являлось ядрышко, в то время как Hsp25 в них никогда не накапливался. Присутствие в ядерных гранулах молекулярного шаперона Hsc70 было прогнозируемо, поскольку, как известно из литературы, этот белок также эффективно перераспределяется при стрессе в клеточное ядро (Yamane et al 1995; Manzerra and Brown 1996) и, кроме того, может взаимодействовать с Hsp25/27 (Wang et al 2000). Однако мы обнаружили лишь частичное совпадение мест накопления этих белков в ядре, что, по всей видимости, свидетельствует о разграничении функциональных особенностей ядрышка (основного места накопления Hsc70) и ядерных гранул, образуемых Hsp25/27. Это также подтверждается тем фактом, что с ядерными гранулами ко-локализуется часть внутриядерного пула 20S протеасом (рис 2б-б"). Обнаружение 20S протеасомальных комплексов в ядерных гранулах подтверждает, что эти компартменты обладают своей специфической функцией в стрессированной клетке, вероятно отличной от функции ядрышка. Если ядрышки были охарактеризованы в качестве мест для продуктивного рефолдинга поврежденных стрессом ядерных белков (Nollen et al 2001), то наличие в ядерных гранулах Hsp25/27 протеасомальных компонентов предполагает возможное участие этих структур в протеолитической деградации поврежденных белков.
Роль фосфорилирования Hsp25 в регуляции его внутриклеточной локализации.
Hsp25/27 является фосфопротеином и подвергается быстрому фосфорилированию при воздействии на клетку стрессов различной этиологии (Welch 1985; Li et al 1996; Wong et al 2000). Вместе с тем, несмотря на то, что роль фосфорилирования признается важной в механизмах клеточной защиты от некоторых типов повреждения клетки (Lavoie et al 1995; Armstrong et al 1999; Loktionova and Kabakov 1998), практически не имеется данных о том, каким образом этот процесс регулирует обнаруженное нами перераспределение Hsp25 внутри клетки
(рис. 1). В несгрессированных клетках (Н9с2 и Rat-1 линий) около половины белка Hsp25 было фосфорилировано по одному сайту (рис. 3). Между тем, в нашем исследовании тепловой шок вызывал гиперфосфорилирование Hsp25, выражающееся в накоплении бифосфорилированной изоформы этого белка (изоформа с) и истощении его нефосфорилированной изоформы (изоформа а, рис. 3). Этот процесс сопровождался изменением внутриклеточной локализации Hsp25 (рис. 16). После окончания действия ТШ, при восстановлении клеток, спектр фосфоизоформ белка Hsp25, также как и его внутриклеточная локализация, возвращались в дострессовое состояние. Эти наблюдения
Рис. 3: Стресс-индуцируемые изменении в изоформном спектре белка Н»р25.
Изоэлектрические профили лизатов кстгрольных клеток (контроль); клеток, подвергнутых тепловому шоку (ТШ); клеток, подвергнутых тепловому шоку в присутствии ингибитора р38 MAP киназы SB202190 (T1U+SB202190) или ингибитора протеинфосфатаз оргованадата натрия (TIll+NftVO,). в,ft,с - названия изоформ. «+», «-» обозначают направление градиента ¡Л.
позволили нам предположить, что гиперфосфорилирование может влиять на распределение Hsp25/27 в клетке. Для доказательства этого предположения был применен ингибиторный анализ. Использование специфических ингибиторов р38 MAP киназы, (SB203580 и SB202190), блокировало гиперфосфорилирование Hsp25 при воздействии ТШ (рис. 3), ослабляя при этом его ассоциацию с актиновым цитоскелетом и перераспределение в ядро. Напротив, применение ингибиторов дефосфорилирования (кантаридин и ортованадат натрия), стимулирующих гиперфосфорилирование (рис. 3), давало противоположный результат: актиновая ко-локализация и ядерное перераспределение усиливались. Таким образом, данные, полученные с использованием киназных и протеинфосфатазных ингибиторов, согласуются с нашим предположением о важной роли гиперфосфорилирования в регулировании стресс-индуцируемого перераспределения белка Hsp25/27. Дальнейшее подтверждение того, что фосфорилированные изоформы Hsp25/27
участвуют в миграции на актиновый цитоскелет, было получено при исследовании цитоскелетной фракции цитопластов. Цитопласты были использованы для того, чтобы исключить контаминацию цитоскелетной фракции содержимым ядра. Данные анализа четко продемонстририровали, что только фосфорилированные изоформы (Ь и с) белка присутствуют в цитоскелетной фракции, тогда как в цитозоле существуют все типы изоформ. Вместе с тем, индукция гиперфосфорилирования Hsp25 в клетках в отсутствие стрессового воздействия (при помощи экспрессии в клетках конститутивно активной МАРКАР киназы-2) вызывала миграцию Hsp25 в ядра, однако не приводила к образованию этим белком ядерных гранул и ассоциации с актиновыми фибриллами. По-видимому, для проявления подобных изменений в локализации белка Hsp25, кроме гиперфосфорилирования требуются дополнительные условия в виде повреждений, вызываемых стрессовым воздействием.
Для более детального изучения механизма, по которому происходит стресс-индуцируемая миграция Hsp25/27 в ядро клетки, было исследовано поведение мутантных белков с измененными сайтами фосфорилирования. Для этого, клетки линии Rat-1 были трансфицированы плазмидой, кодирующей человеческий белок теплового шока Hsp27. Последующая визуализация человеческого Hsp27 in situ осуществлялась видоспецифическими антителами, не имеющими перекрестного связывания с Hsp25 грызунов. Более того, нами также использовались антитела, обладающие специфичностью только к Hsp25 грызунов, что позволило в одной клетке выявлять места внутриклеточной локализации как эндогенного Hsp25, так и трансфицированного Hsp27. Результаты двойного иммунофлуоресцентного мечения показали, что в клетках Rat-1 человеческий Hsp27 полностью повторяет стресс-индуцибельную реакцию эндогенного Hsp25, выражавшуюся в перемещении в ядро и образовании ядерных гранул (рис. 4а, а% после чего в клетках были экспрессированы мутанты Hsp27 с измененными сайтами фосфорилирования. В молекуле А-мутанта (Hsp27-S15A,S78A,S82A) все три сериновых (S) аминокислотных остатка, находящихся в положениях
Hsp27 A-мутант D-мутант
Рис. 4: Внутриклеточная локализация трансфнцированного человеческого Н»р27 и его мутантов в крысиных фибробластах до и после действия теплового шока, а, б, в - контрольные клетки; г, д, е -клетки после действия теплового шока. Иммунофлуоресцентное выявление эктопически экспрессированного человеческого №р27 (а, г), А-мутанта (б, д) и О-мутанта (в, е). Маркер -10 мкм.
15, 78, 82 и являющихся сайтами фосфорилирования in vivo (Landry et al 1992), были заменены на неспособный к фосфорилированию аланин (А). Напротив, в D-мутанте (Hsp27-S15A,S78A,S82A) эти же сериновые остатки были заменены на отрицательно заряженный аспартат (D), имитирующий фосфорилированный серии. В результате произведенных аминокислотных замен, A-мутант был не способен к фосфорилированию и имитировал нефосфорилированные изоформы Hsp27, тогда как D-мутант имитировал гиперфосфорилиро ванный Hsp27. По результатам иммунофлуоресцентного анализа оказалось, что A-мутант в клетке имеет цитоплазматическую локализацию и плохо перераспределяется в ядра при действии ТШ (рис. 46, б "). Напротив, D-мутант свободно проникал в ядра до и после действия ТШ (рис. 4в, в "). Обнаруженные различия в ядерной миграции А- и D-мутантов могут быть объяснены как активацией сигнала ядерной транслокации (NLS), так и изменениями в их статусе олигомеризации. Однако поиск в сиквенсе Hsp27 консервативных последовательностей NLS, охарактеризованных для ряда ядерных белков, не принес результата. В то же время, анализ олигомерного состояния мутантов выявил, что A-мутант существует в виде крупных олигомеров,
тогда как О-мутант представлен исключительно малыми олигомерами (рис.5). Более того, белок Нвр27 дикого типа, так же как и эндогенный Нзр25, был способен менять степень олигомеризации от крупных олигомеров в норме к преимущественно малым олигомерам при воздействии ТШ (рис.5). Вероятно, мелкие олигомеры Шр25/27 способны проникать в ядро посредством диффузии. По результатам этой части исследования нами был сделан вывод о том, что процесс перераспределения Нзр25/27 в клеточное ядро, регулируемый гиперфосфорилированием, опосредуется изменениями в степени олигомеризации этого белка, а не активацией гипотетического сигнала ядерной транслокации.
А- О-
мутант мутант
ТШ - + - + - + ГФ -+--+ +
Рис. 5: Стресс-нндуцируемое изменение олигомеризации Нзр27, обусловленное гиперфосфорилированием. Результаты нативного электрофореза лизатов клеток, эктопически экспрессирующих Шр27 дикого типа, его А- и Б-мутанты. Крупные олигомеры обозначены стрелкой с большим наконечником, малые - обычной стрелкой. ТШ -предобработка клеток перед лизисом тепловым шоком. ГФ -гиперфосфорилирование белка или его имитация в случае Б-мутанта. «Ъ> - наличие, «-»-отсутствие указанного параметра.
Функциональные последствия стресс-иидуцируемой транслокации белка №р25/27.
Для того, чтобы выяснить, может ли ассоциация белка Няр25/27 с актиновыми фибриллами под воздействием стресса иметь какое-либо функциональное значение, была использована обработка клеток цитохала-
К ТШ 30 60 90
после ТШ, мин.
Рис. 6: Изменения в стабильности актинового цитоскелета и количестве связавшегося с ним Н*р25. Стабильность актинового цитоскелета оценивалась путем подсчета клеток, сохранивших протяженные актиновые фибриллы после обработки цитохалазином Д. Результаты представлены в виде гистограммы. Количество связавшегося с цигоскелетом Нзр25 оценивалось денситометрическим анализом б лотов детергент-нерастворимых фракций цитопластов. Результаты представлены в виде графика. К - контроль; ТШ - тепловой шок.
зинами Б и Д. Эти вещества, будучи добавленными в среду культивирования, в течение 10 мин. разрушали актиновые фибриллы у контрольных клеток, что сопровождалось потерей характерной для клеток формы, их ошариванием и, как следствие, откреплением от субстрата. Напротив, если инкубация с цитохалазинами проводилась сразу же после окончания действия ТШ, когда Нвр25 начинал взаимодействовать с акгиновыми фибриллами, то такие клетки сохраняли значительную часть цитоскелета неразрушенным и значительного ухудшения их морфологии не происходило. По результатам двойного мечения, в клетках, предобработанных ТШ, устойчивые к действию цитохалазина актиновые фибриллы были декорированы белком Нзр25. Как показал количественный анализ, изменение эффективности защиты актинового цитоскелета в процессе восстановления клеток после воздействия ТШ соответствовало изменению в количестве Нзр25, ассоциированного с цитоскелетной фракцией (рис. 6). Полученные данные позволили сделать вывод о том, что ассоциация белка Шр25/27 с акгиновыми фибриллами
является важным фактором, стабилизирующим актиновый цитоскелет во время стрессового воздействия.
К настоящему моменту в литературе не имеется сведений, касающихся возможного функционирования Hsp25/27 в ядре стрессированной клетки. Для исследования возможной роли ядерных гранул, образуемых белком Hsp25 в ядрах клеток под действием стресса, в качестве мест накопления поврежденных ядерных белков in vivo, клетки Rat-1 были трансфицированы репортерным белком ядерной люциферазой, меченой зеленым флуоресцентным белком (N-luc-EGFP). Люциферазная часть белка N-luc-EGFP, является чрезвычайно чувствительным к ТШ ферментом, денатурацию которого можно оценивать при помощи измерения ферментативной активности этого белка в клеточных лизатах, получаемых на разных этапах эксперимента. Визуализация репортера осуществлялась с помощью стабильной части молекулы, образуемой зеленым флуоресцентным белком. ТШ вызывал денатурацию более 95% всего пула N-luc-EGFP и при этом репортер терял диффузное распределение и накапливался в ядрышках и более мелких ядерных центрах. Конфокальная микроскопия продемонстрировала ко-локализацию центров накопления поврежденной N-luc-EGFP и ядерных гранул, образованных белком Hsp25/27. Последующий биохимический анализ показал, что репортер после действия ТШ частично восстанавливает свою активность, что, вероятно, обусловлено работой внутриклеточной шаперонной системы. При этом параллельно происходила усиленная деградация N-luc-EGFP, чувствительная к ингибиторам прсггеасом.
Чтобы выявить роль белка Hsp25 в наблюдаемом in vivo процессе рефолдинга, мы использовали новую клеточную систему. Для изучения были выбраны мышиные фибробласты линии L929. Эти клетки являются удобным объектом для исследования белка Hsp25/27 за счет того, что они не экспрессируют свой собственный эндогенный белок Hsp25 в нормальных условиях культивирования (рис. 7а, верхняя панель). Эктопически экспрессированный в этих клетках человеческий Hsp27 дикого типа под действием ТШ перемещался в ядро с образованием хорошо выраженных ядерных гранул (рис. 16, верхняя панель). При совместной экспрессии Hsp27 с N-luc-EGFP, происходило усиление
а \б \в
восстановление после ТШ, мин.
Рис. 7: Влияние Няр27 н его мутантов на рефолдинг ядерной люциферазы (РМис-ЕСРР) в Ь929 клетках после действия теплового тока, а: клетки, трансфицированные только Н-1ис-ЕСРР; 6: клетки, трансфицированные Ы-1ис-ЕОРР и Нзр27 (дикого типа); «: клеггки, трансфицированные К-1ис-ЕОРР и А-мутантом Нзр27; г: клетки, трансфицированные Л-1ис-ЕОРР и О-мутантом Нзр27. Верхняя панель: иммунофлуоресцентное выявление Нвр27 в клетках после теплового шока. Нижняя панель: графики рефолдинга К-1ис-ЕОКР после действия теплового шока. ТШ - тепловой шок. Маркер - 10 мкм.
эффективности рефолдинга репортера после ТШ в 1.5 раза (рис.7, нижняя панель). Экспрессия А-мутанта Нвр27, с нарушенной ядерной миграцией, не изменяла эффективность рефолдинга (рис. 7в). Таким образом было показано, что защитный эффект белка №р27, оказываемый на инактивацию/рефолдинг ядерного репортерного белка, обусловлен присутствием этого белка в ядре клетки во время и после воздействия стресса, а не связан с его возможной цитоплазмати ческой активностью. Напротив, экспрессия Б-мутанта более эффективно стимулировала рефолдинг Ы-1ис-ЕСРР (рис. 7г). Особенностью ядерной локализации Б-мутанта является то, что этот белок, в отличие от Нзр27 дикого типа, практически не образует ядерных гранул, сохраняя диффузное
распределение (рис. 7г, верхняя панель). Тем самым демонстрируется, что стимуляция рефолдинга белком Hsp27 может осуществляться без образования ядерных гранул. Более того, появление ядерных гранул снижает положительное влияние Hsp25/27 на эффективность рефолдинга. Принимая во внимание то, что параллельно рефолдингу репортер N-luc-EGFP подвергается усиленной протеасомной деградации, и что в ядерных гранулах Hsp25/27 происходит накопление 20S протеасом, можно предположить функционирование ядерных гранул, образуемых Hsp25/27 ядре стрессированной клетки, в качестве центров протеолитической деградации поврежденных белков.
ВЫВОДЫ:
1. Исследована внутриклеточная локализация белка Hsp25/27 в разных типах культивируемых клеток до и после воздействий стрессами различной этиологии. Установлено, что стресс вызывает ассоциацию Hsp25/27 с актиновыми фибриллами и перераспределение этого белка в клеточное ядро с образованием ядерных гранул.
2. Фосфорилирование регулирует стресс-зависимое изменение локализации белка Hsp25/27 путем снижения степени его олигомеризации.
3. Стресс-инду цируемая ассоциация фосфорилированных изоформ белка Hsp25/27 с актиновыми фибриллами стабилизирует актиновый цитоскелет и защищает его от разрушения.
4. Установлен факт ко-локализации поврежденных ядерных белков с ядерными гранулами белка Hsp25/27.
5. Впервые обнаружено, что белок Hsp25/27 усиливает эффективность рефолдинга поврежденных стрессом белков in vivo. Показано, что наиболее активными в этом процессе являются фосфорилированные формы этого белка.
6. Предложена схема внутриклеточного функционирования Hsp25/27 в ответ на стрессовые воздействия и роли фосфорилирования в регуляции функций Hsp25/27.
МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПЕЧАТНЫХ РАБОТАХ:
1. Loktionova S., Kabakov A., Bryantsev A., Ilyinskaya О. Suppression of HSP27 dephosphorylation in ATP-depleted endothelial cells stabilizes actin microfilaments // Abstracts. Molecular chaperones and the heat shock response. Cold Spring Harbor, USA, May 6-10,1998, P. 156.
2. Локтионова C.A., Ильинская О.П., Тарарак Э.М., Брянцев АЛ., Кабаков А.Е. Предобработка тепловым шоком защищает актиновый цитоскелет эндотелиальных клеток во время истощения АТФ: роль белка теплового inoKaHsp27. Бюлл. эксп. биол. мед. 1999,127: 237-240.
3. Bryantsev A.L., Loktionova S.A., Kabakov А.Е. Particles containing both Hsp25 and Hsp70 inside the nuclei of stressed cells: stress granules or foldosomes? // Abstracts. Research conference on biology of molecular chaperones. Acquafredda di Maratea, Italy, May 22-27,1999, P.95.
4. Kabakov A.E., Bryantsev A.L., Loktionova S.A., Ilyinskaya O.P., Kampinga H.H. Compartment-specific responses of heat shock protein 25 (Hsp25) to heat stress in H9c2 myoblasts. // Abstracts. 27th FEBS Meeting. Lisbon, Portugal, 30 June-5 July, 2001, Eur J Biochem 268, suppl. 1, P. 107.
5. Bryantsev A.L., Tararak E.M, Ilyinskaya O.P., Kabakov A.E. Hsc70 and Hsp25 translocated into heat shocked nucleus are involved in degradation of damaged proteins. // Abstracts. Molecular chaperones and the heat shock response. Cold Spring Harbor, USA, May 1-5,2002, P.34.
6. Bryantsev A.L., Tararak E.M., Kabakov A.E. The stress-induced association of phosphorylated Hsp25 with microfilaments stabilizes the actin cytoskeleton: an involvement of the p38 map kinase/Hsp25 pathway in cytoprotection. // Abstracts. 3rd International Conference on Signal Transduction. Dubrovnik, Croatia, May 17-23,2002, P. 66-67.
7. Bryantsev A.L., Loktionova S.A., Ilyinskaya O.P., Tararak E.M., Kampinga H.H., Kabakov A.E. Distribution, phosphorylation, and activities of Hsp25 in heat-stressed H9c2 myoblasts: a functional link to cytoprotection. Cell Stress Chaperones, 2002,7:146-55.
8. Bryantsev A.L., Tararak E.M., Kabakov A.E., Kampinga H.H. Hsp27 acts as chaperone in nuclei of heat-stressed mammalian cells. // Abstracts. 1st International Congress on Stress Responses in Biology and Medicine. Quebec, Canada, September 10-14,2003, P.77.
|4?2l( Р14 32 1
i ' i
i
i
i
i
i
и
\i i
í
i
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Брянцев, Антон Леонидович
ОГЛАВЛЕНИЕ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
ГИПЕРТЕРМИЯ.
ВОЗДЕЙСТВИЕ ТЕПЛОВОГО ШОКА НА КЛЕТО ЧНЫЕ СТРУКТУРЫ И
КОМПАРТМЕНТЫ.ю
Мембраны.ю
Цитоскелет.
Цитозоль и органеллы.
Клеточное ядро.
ВОЗДЕЙСТВИЕ ТЕПЛОВОГО ШОКА НА КЛЕТОЧНЫЕ БЕЛКИ.н
Белковые повреждения в ядре.
Белковые повреждения в цитоплазме.
БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА.
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ШАПЕРОНЫ.
КО-ШАПЕРОНЫ-БЕЛКОВЫЕ МОДУЛЯТОРЫ ШАПЕРОНОВ.
КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СЕМЕЙСТВ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА.
Семейство HSP100.
Семейство HSP90.
Семейство HSP70.
Семейство HSP60.
Семейство малые БТШ (sHSP).
БЕЛОК ТЕПЛОВОГО ШОКА Hsp25/27.
Структура.
О л и гомери зац и я.
Фосфорилирование.зо
Биологические функции.
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БЕЛКОВОЙ ДЕГРАДАЦИИ.
ПРОТЕАСОМНАЯ СИСТЕМА ДЕГРАДАЦИИ БЕЛКОВ.
Внутриклеточная локализация элементов протеасомной системы.
УЧАСТИЕ БТШ В ДЕГРАДАЦИИ КЛЕТО ИНЫХ БЕЛКОВ.
Роль ко-шаперонов в опосредовании протеолиза.
МОДЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ ДЕЙСТВИЯ ТЕПЛОВОГО
ШОКА НА КЛЕТОЧНЫЕ БЕЛКИ IN VIVO.
ЛЮЦИФЕР АЗА КАК ЭКЗОГЕННЫЙ РЕПОРТЕР ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ
ПОВРЕЖДЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ БЕЛКОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ СТРЕССА.
ЗЕЛЕНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК - НОВАЯ РЕПОРТЕРНАЯ СИСТЕМ Asi
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
МАТЕРИАЛЫ.
КЛЕТО ЧНЫЕ КУЛЬ ТУРЫ.
АНТИТЕЛА.,.
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОНСТР УКЦИИ.
ХИМИЧЕСКИЕ РЕАГЕНТЫ.
МЕТОДЫ.
СОЗДАНИЕ СТРЕССОВЫХ УСЛОВИЙ.
ОБРАБОТКИ КЛЕТОК ВЕЩЕСТВАМИ, ВЛИЯЮЩИМИ НА
ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ HSP25.
ТРАНСФЕКЦИЯ КЛЕТОК.
ПОЛУЧЕНИЕ ЦИТОПЛАСТОВ.
ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОК И ЦИТОПЛАСТОВ.
РАДИОИЗОТОПНОЕ МЕЧЕНИЕ И ИММУНОПРЕЦИПИТАЦИЯ.
АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕФОЛДИНГА ПОСЛЕ ТЕПЛОВОГО ШОКА.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ, ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ И
ИММУНОБЛОТГИНГ.
ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ.
ТЕСТИРОВАНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ F-АКТИНА.
КОМПЬЮТЕРНАЯ ОБРАБОТКА ИЗОБРАЖЕНИЙ.
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ.
Изменения внутриклеточной локализации Hsp25, вызванные действием теплового шока и других стрессов.
Стрессы различной этиологии вызывают специфические обратимые изменения во внутриклеточной локализации Hsp25.
Структура стресс-индуцируемых ядерных гранул Hsp25.
РОЛЬ фосфорилирования HSP25 в регуляции его внутриклеточной локализации.
Гиперфосфорилирование и изменение внутриклеточной локализации Hsp25.
Роль фосфорилирования в процессе транспорта Hsp25 в ядро клетки.
Участие фосфорилирования в ассоциации Hsp25 с актиновым цитоскелетом.
Дополнительные факторы для перераспределения Hsp25 в клетке. функциональные последствия стресс-индуцируемого перераспределения
HSP25/27.
Влияние ассоциации Hsp25 с актиновыми фибриллами на их стабильность.
Ядерный Hsp25/27усиливает эффективность рефолдинга поврежденных белков в ядре.
ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ.
Изменения внутриклеточной локализации Hsp25, вызванные действием теплового шока и других стрессов.
Роль фосфорилирования HSP25 в регуляции его внутриклеточной локализации.
Функциональные последствия стресс-индуцируемого перераспределения HSP25/27.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость"
Существование биологических систем, будь то бактерия или сложный многоклеточный организм возможно только в относительно узком диапазоне физико-химических параметров. Такие параметры как, например, температура и химический состав окружающей среды являются чрезвычайно лабильными и при этом оказывают прямое воздействие на жизнедеятельность и выживаемость организмов и их структурных единиц - клеток. Многоклеточные организмы высшего порядка частично решают проблему колебаний условий окружающей среды, создавая свой внутренний гомеостаз. Однако в процессе жизнедеятельности и, особенно, во время патофизиологических состояний организма (например, воспаление, отравление ядовитыми веществами, локальная дисфункция кровотока) возникают ситуации, когда клетки находятся в условиях, далеких от их физиологического оптимума. В мире постоянно меняющихся условий окружающей среды, выживание клеток становится возможным лишь благодаря хорошо отлаженным, отработанным в процессе эволюции молекулярным механизмам внутриклеточной защиты.
Важнейшим компонентом молекулярных механизмов внутриклеточной защиты являются белки теплового шока (БТШ). Название БТШ отражает историю их открытия, когда экспрессия этих белков впервые обнаружилась в клетках, подвергнутых кратковременному воздействию повышенной температуры (Ши^а 1962). Как оказалось впоследствии, БТШ экспрессируются во всех живых организмах от бактерии до человека и вовлечены в механизмы защиты клеток не только от изменений температурных условий, но также от повреждений, вызываемых воздействием свободных радикалов, нарушением энергетического баланса, изменением рН среды, действием токсинов и проч. Более того, многие белки, входящие в семейство БТШ, функционируют в клетках и при нормальных физиологических условиях, осуществляя поддержание других белковых молекул в клетке в функциональном состоянии. БТШ, выполняющие такого рода функцию, получили название молекулярных шаперонов. Таким образом, все молекулярные шапероны являются белками теплового шока, однако не все белки теплового шока -молекулярные шапероны.
Одним из представителей БТШ является белок Нзр25/27. В научной литературе для определения белка человека принято название НБр27, тогда как для гомологичных ему белков крысы и мыши используется аббревиатура Hsp25. Функционирование этого белка в нормальных физиологических условиях представляется неясным, хотя он конститутивно экспрессируется в достаточно больших количествах во многих мышечных тканях, особенно в сердце (Kiemenz et al 1993; Knowlton et al 1998; Scheler et al 1997).
Избирательное увеличение количества белка Hsp25/27 в клетках защищает последние от действия теплого шока (Chretien and Landry 1988; Landry et al 1989), окислительного стресса (Mehlen et al 1995b; Rogalla et al 1999), ишемии/реперфузии (Vander Heide 2002; Loktionova et al 1998; Brar et al 1999), действия некоторых токсических веществ (Huot et al 1991; Garrido et al 1996; Wu and Welsh 1996). Более того, по последним данным Hsp25/27 может блокировать реализацию программы «клеточного самоубийства» - апоптоза (Wagstaff et al 1999; Brar et al 1999; Bruey et al 2000; Charette et al 2000; Garrido et al 1999; Guenal et al 1997), тем самым повышая выживаемость клеток в условиях патофизиологических состояний. Таким образом, было продемонстрировано важное действие белка Hsp25/27 в качестве защитного фактора.
Несмотря на то, что Hsp25/27 явно вовлечен в процессы клеточной защиты, конкретные механизмы его действия остаются нераскрытыми. Некоторые исследователи приводят данные о том, что этот белок способен связываться с различными элементами цитоскелета, особенно с актиновыми фибриллами (Benndorf et al 1994; Loktionova et al 1996; Bryantsev et al 2002). С другой стороны известно, что Hsp25/27 образует под действием стресса крупные внутриклеточные гранулы, локализация которых, по разным сведениям, может быть ядерной (Arrigo et al 1988а; Loktionova et al 1996), околоядерной или цитоплазматической (Collier and Schlesinger 1986; Collier et al 1988). Считается, что такие «стрессовые гранулы» функционируют в качестве комплексов, обладающих шаперонными свойствами (Ehrnsperger et al 1999; Ehrnsperger et al 1997). Действительно, in vitro, в экспериментах с очищенными белками была продемонстрирована способность Hsp25/27 специфически связывать денатурированные белки и частично восстанавливать их поврежденную структуру (производить рефолдинг), на основании чего этот белок был отнесен к категории молекулярных шаперонов (Ehrnsperger et al 1997; Jakob et al 1993; Merck et al 1993a). Тем не менее, имеющаяся к настоящему времени информация о структуре молекулы
Hsp25/27 не предполагает существования нуклеотид-связывающего домена, необходимого молекулярным шаперонам для осуществления рефолдинга. Равно не было опубликовано данных о существовании шаперонной активности Hsp25/27 in vivo, в живой клетке. Таким образом, предположение о функционировании этого белка в роли молекулярного шаперона в клетках в условиях стресса остается недоказанным.
Противоречивыми являются также имеющиеся в литературе сведения об участии фосфорилирования Hsp25/27 в механизмах клеточной защиты. Известно, что тепловой шок и другие стрессы вызывают быстрое фосфорилирование этого белка в клетках (Crete and Landry 1990; Barchowsky et al 1994; Loktionova et al 1996). Внутриклеточный сигнальный процесс, приводящий к фосфорилированию Hsp25/27 достаточно хорошо изучен и киназы, непосредственно фосфорилирующие этот белок, полно охарактеризованы. Однако свойства фосфо-изоформ белка Hsp25/27 остаются не вполне ясными. С одной стороны, в экспериментах in vitro показано, что: 1) за связывание с актиновыми микрофиламентами ответственны нефосфорилированные формы Hsp25/27 и 2) нефосфорилированный Hsp25/27 ингибирует полимеризацию актина (Benndorf et al 1994). С другой стороны, существуют противоречивые данные о том, что индукция фосфорилирования Hsp25/27 in vivo, с помощью химических агентов, вызывает усиление стабильности актинового цитоскелета к актин-деполимеризующим воздействиям (Guay et al 1997). Кроме того, было показано, что во фракции актинового цитоскелета активированных тромбоцитов содержатся фосфорилированные формы Hsp25/27 (Zhu et al 1994). Несмотря на это, до сих пор не установлено четкой взаимосвязи между ассоциацией Hsp25/27 с актиновым цитоскелетом и защитой последнего. Например, в работах, демонстрирующих декорирование актиновых фибрилл белком Hsp25/27, не проводились функциональные тесты и наоборот, в экспериментах, демонстрирующих влияние этого белка на стабильность актиновой сети, не исследовалась его внутриклеточная локализация. Также остается непонятным, почему белок Hsp25/27 в момент стресса подвергается фосфорилированию. По данным экспериментов in vitro, фосфорилирование Hsp25/27 ведет к значительному снижению его шаперонных свойств, (Rogalla et al 1999) тогда, как именно эти свойства Hsp25/27 должны бы быть востребованы клеткой в случае стрессовых условий и в процессе восстановления.
Ситуация еще более усложняется, если учитывать имеющиеся в литературе косвенные предпосылки о том, что найденные в клетке стресс-индуцируемые гранулы состоят из дефосфорилированного Нзр25/27 (Ьокйопоуа е1 а1 1996).
Учитывая все вышеизложенное, целью данной работы явилось исследование поведения белка теплового шока Нзр25/27 в подвергнутых стрессу клетках, для более детального выявления механизмов клеточной защитвы.
Для достижения данной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Выявить изменения внутриклеточного распределения белка Нзр25/27 в ответ на действие стрессов различной этиологии;
2. Исследовать роль фосфорилирования во внутриклеточном перераспределении белка НБр25/27;
3. Изучить функциональные последствия перераспределения белка Нзр25/27.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
А-мутант- Hsp27 человека, с заменами серинов в позициях 15, 78, 82 на аланины
DABCO - диазабицикло-2,2,2-октан
DAPI - 4',6-диаминидино-2-фенилиндол
DMEM - Dulbecco's Modified Essential Medium, среда роста
D-мутант - Hsp27 человека, с заменами серинов в позициях 15, 78, 82 на аспартаты ECL - усиленная хемилюминесценция EDTA - этилендиаминтетраацетат
EGFP - Enhanced Green Fluorescent Protein, усиленный зеленый флуоресцентный белок
EGTA - этиленгликольтетраацетат
ERK - Extracellular Response Kinase, киназа внеклеточных стимулов FBS - эмбриональная телячья сыворотка
GFP - Green Fluorescent Protein, зеленый флуоресцентный белок
G-мутант - Hsp27 человека, с заменами серинов в позициях 15, 78, 82 на глицины
HEPES - гидроксиэтилпиперазин этан сульфонат
Hsc70 - белок теплового шока 70 (конститутивная форма)
HSP - heat shock proteins, белки теплового шока
Hsp25/27 - белок теплового шока 25/27
Hsp70 - белок теплового шока 70 (индуцибельная форма)
MAP - Mitogen Activated Protein, киназы, активируемые митогенами
МАРКАРК- Mitogen Activated Protein Kinase Activated Protein, киназа
MEM - Minimal Essential Medium, среда роста
MKK - MAP Kinase Kinase, киназа MAP киназ
MKKK - MKK Kinase, киназа MKK
N-luc-EGFP - ядерная люцифераза, меченая зеленым флуоресцентным белком PML - Pro-Mielocytic Protein, белок про-миелоцитов PMSF - фенилметилсульфонил фторида РР - протеинфосфатаза
SDS - додецилсульфат (лаурилсульфат) натрия
ТАЕ- трис-ацетат-ЭДТА
Tris - трисоксиметиламинометан
БСА - бычий сывороточный альбумин
БТШ - белки теплового шока
ДМСО- диметилсульфоксид к ДНК - кодирующая ДНК
Till - тепловой шок
ФСБ - фосфатный солевой буфер
Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Брянцев, Антон Леонидович
выводы
1. Исследована внутриклеточная локализация белка Hsp25/27 в разных типах культивируемых клеток до и после стрессов различной этиологии. Установлено, что стресс вызывает ассоциацию этого белка с актиновыми фибриллами и перераспределение в клеточное ядро с образованием ядерных гранул.
2. Фосфорилирование регулирует стресс-зависимое изменение локализации белка Hsp25/27 путем снижения степени его олигомеризации.
3. Стресс-вызванная ассоциация фосфорилированных изоформ белка Hsp25/27 с актиновыми фибриллами, стабилизирует и защищает актиновый цитоскелет от разрушения.
4. Установлена ассоциация поврежденных ядерных белков с ядерными гранулами белка Hsp25/27 in situ.
5. Впервые обнаружено, что белок Hsp25/27 усиливает рефолдинг поврежденных стрессом белков in vivo. Показано, что наиболее активными в этом процессе являются фосфорилированные формы этого белка.
6. Предложена схема внутриклеточного функционирования Hsp25/27 в ответ на стрессовые воздействия и роли фосфорилирования в регуляции функций Hsp25/27.
Выражаю искреннюю благодарность своим научным руководителям Александру Евгеньевичу Кабакову и Эдуарду Михайловичу Тарараку за опеку, необходимую поддержку, формирование моих научных пристрастий и участие в моей научной карьере. Особую благодарность приношу д.б.н. Тер-Аванесяну М.Д. и д.м.н. Ширинскому В.П., безоглядно (и несколько опрометчиво) разрешившим доступ к ресурсам своих лабораторий (лаборатория молекулярной генетики и лаборатория клеточной подвижности соответственно). Ваша помощь была неоценимой.
Свои искренние чувства благодарности адресую Александру Вячеславовичу Воротникову за предоставленную счастливейшую возможность обучиться новым биохимическим методам, постоянную готовность поделиться научным опытом и облегчить горечь разочарований. Спасибо за поддержку!
С теплым чувством благодарю руководителя отдела радиологии и биологии клеточного стресса Гронингенского университета (Нидерланды) Харма Кампингу (Harm Kampinga) за возможность получить неоценимый опыт работы в зарубежной лаборатории и доступ к некоторым достижениям научного прогресса (конфокальный микроскоп). Мне также невозможно не сказать теплые слова в адрес приятно вспоминать людей, работающих вместе со мной в Голландии: Florian Salomons, Bianca Brundel, Willy Lemstra-Wierenga, Alena Jiresova, Bart Kanon и многие другие. Спасибо вам за внимание и гостеприимство.
Глубокую признательность приношу всем сотрудникам моей родной лаборатории молекулярной и клеточной кардиологии за долготерпение и искреннее участие в моей работе: Ильинской Ольге Петровне, Калининой Наталье Игоревне, Антроповой Юлии Георгиевне и Соломатиной Марине Александровне.
Самую глубокую благодарность я приношу членам своей семьи за моральную и вполне материальную помощь, без которой эта работа не была бы завершена.
Огромное спасибо всем сотрудникам всем сотрудникам и аспирантам Института экспериментальной кардиологии, имевшим несчатье попасть в поле моей деятельности, но с большой честью перенесших это испытание: Судомойной Марине, Капчаеву Аскеру, Валуеву Игорю, Фоминову Глебу, Агафонову Михаилу, Крымскому Михаилу, Дуднаковой Татьяне и многим, многим другим. Я ценю вашу помощь, сочувствие и дружеское участие.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В качестве заключения работы наши представления о возможных внутриклеточных механизмах работы белка Нзр25/27 были оформлены в качестве схемы (схема 6). Представленный рисунок достаточно сильно упрощен, поскольку наши представления никоим образом нельзя считать полными и законченными. Лишь дальнейшие скурпулезные исследования, направленные на разгадку механизмов клеточной защиты, позволят дополнить эти знания новыми важными подробностями. ф р 4 р р
Выеокоолигомерный нефосфорилированный
Hsp25/27 ш
Н и зкоол и гом ерн ы й (димерный)гипсрфосфорилнрованнын llsp25/27
Ядерные белки с наставной кои форма иней
Ядерные белки с поврежденной кон формацией О
20 S протеасомный комплекс
Мономер актина
Схема 6: Механизм работы Hsp25/27 в клетке при стрессовом воздействии.
I. Состояние в отсутствие стресса. Hsp25/27 депонирован в цитоплазме в виде крупных олигомеров. Базовое фосфоршшрованис, возможнозадсйствующее альтернативные MAP киназному каскаду пути, не приводит к значительным изменениям в олигомерном статусе Hsp25/27. Протсинфосфатаза 2А (РР2А) поддерживает высокий уровень нсфосфорилированныхизоформ.
II. Начало действия стресса. Активация МАРКА PK-2 через MAP киназный каскад приводит к гиперфоефорилированию и разборке крупных олигомеров Hsp25/27, Димеры/малые олигомеры Hsp25/27 проникают в ядро и ассоциируют с актиновыми филаментами. К этому времени в ядре начинают накапливаться денатурированные белки, а микрофиламенты теряют привычное белковое микроокружение и начинают разрушаться,
III. Продвипугая фаза стресса или период восстановления после окончания стрессового воздействия. В ядре импортированные малоолигомерные формы Hsp25/27 частично дефосфорилируюгся гипотетической фосфаггазой и формируют ядерные гранулы с привлечением 20S протсасом. В ядерных гранулах происходит удаление поврежденных белков путем протеолиза В ну клеоплазме низкоолигомерные формы Hsp25/27 помогают в рефолдинге денатурированных белков, возможно сохраняя их в фолдивг-компетентном состоянии. В цитоплазме фосфорилированные формы Hsp25/27 ассоциированы е актиновыми филаментами и стабилизируют их.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Брянцев, Антон Леонидович, Москва
1. Ahn J.Y., Tanahashi N., Akiyama K., Hisamatsu H., Noda C., Tanaka K., Chung C.H.,
2. Shibmara N., Willy P.J., Mott J.D., and . 1995. Primary structures of two homologous subunits of PA28, a gamma- interferon-inducible protein activator of the 20S proteasome. FEBS Lett 366:37-42.
3. Ali M. and Vedeckis W.V. 1990. Heat shock-induced loss of the glucocorticoidreceptor protein in cultured cells. Receptor 1:121-132.
4. Allen T.D., Cronshaw J.M., Bagley S., Kiseleva E., and Goldberg M.W. 2000. Thenuclear pore complex: mediator of translocation between nucleus and cytoplasm. J Cell Sci 113 ( Pt 10): 1651-1659.
5. Anderson R.L. and Hahn G.M. 1985. Differential effects of hyperthermia on the
6. Na+,K+-ATPase of Chinese hamster ovary cells. Radiat Res 102:314-323.
7. Anfinsen C.B. 1973. Principles that govern the folding of protein chains. Science181:223-230.
8. Anton L.C., Schubert U., Bacik I., Princiotta M.F., Wearsch P.A., Gibbs J., Day P.M.,
9. Realini C., Rechsteiner M.C., Bennink J.R., and Yewdell J.W. 1999. Intracellular localization of proteasomal degradation of a viral antigen. J Cell Biol 146:113-124.
10. Arbabi S. and Maier R.V. 2002. Mitogen-activated protein kinases. Crit Care Med30:S74-S79.
11. Armstrong S.C., Delacey M., and Ganóte C.E. 1999. Phosphorylation state of hsp27and p38 MAPK during preconditioning and protein phosphatase inhibitor protection of rabbit cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol 31:555-567.
12. Arrigo A.P., Suhan J.P., and Welch W.J. 1988a. Dynamic changes in the structure andintracellular locale of the mammalian low-molecular-weight heat shock protein. Mol Cell Biol 8:5059-5071.
13. Arrigo A.P., Tanaka K., Goldberg A.L., and Welch W.J. 1988b. Identity of the 19Sprosome' particle with the large multifunctional protease complex of mammalian cells (the proteasome). Nature 331:192-194.
14. Ashok B.T., Kim E., Mittelman A., and Tiwari R.K. 2001. Proteasome inhibitorsdifferentially affect heat shock protein response in cancer cells. IntJ Mol Med 8:385-390.
15. Attaix D., Combaret L., Pouch M.N., and Taillandier D. 2001. Regulation of proteolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 4:45-49.
16. Barchowsky A., Williams M.E., Benz C.C., and Chepenik K.P. 1994. Oxidantsensitive protein phosphorylation in endothelial cells. Free Radio Biol Med 16:711-111.
17. Bell J., Neilson L., and Pellegrini M. 1988. Effect of heat shock on ribosome synthesisin Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol 8:91-95.
18. Ben Levy R., Leighton I.A., Doza Y.N., Attwood P., Morrice N., Marshall C.J., and
19. Cohen P. 1995. Identification of novel phosphorylation sites required for activation of MAPKAP kinase-2. EMBOJ 14:5920-5930.
20. Bence N.F., Sampat R.M., and Kopito R.R. 2001. Impairment of the ubiquitinproteasome system by protein aggregation. Science 292:1552-1555.
21. Benndorf R., Hayess K., Ryazantsev S., Wieske M., Behlke J., and Lutsch G. 1994.
22. Phosphorylation and supramolecular organization of murine small heat shock protein HSP25 abolish its actin polymerization-inhibiting activity. J Biol Chem 269:20780-20784.
23. Benndorf R., Sun X., Gilmont R.R., Biederman K.J., Molloy M.P., Goodmurphy C.W.,
24. Cheng H., Andrews P.C., and Welsh M.J. 2001. HSP22, a new member of the small heat shock protein superfamily, interacts with mimic of phosphorylated HSP27 ((3D)HSP27). J Biol Chem 216:26753-26761.
25. Bercovich B., Stancovski I., Mayer A., Blumenfeld N., Laszlo A., Schwartz A.L., and
26. Ciechanover A. 1997. Ubiquitin-dependent degradation of certain protein substrates in vitro requires the molecular chaperone Hsc70. J Biol Chem 272:9002-9010.
27. Bergeron M., Ferriero D.M., and Sharp F.R. 1998. Developmental expression of hemeoxygenase-1 (HSP32) in rat brain: an immunocytochemical study. Brain Res Dev Brain Res 105:181-194.
28. Bialojan C. and Takai A. 1988. Inhibitory effect of a marine-sponge toxin, okadaicacid, on protein phosphatases. Specificity and kinetics. Biochem J 256:283-290.
29. Bimston D., Song J., Winchester D., Takayama S., Reed J.C., and Morimoto R.I. 1998.
30. BAG-1, a negative regulator of Hsp70 chaperone activity, uncouples nucleotide hydrolysis from substrate release. EMBOJ 17:6871-6878.
31. Bird T.A., Schule H.D., Delaney P., de R., Sleath P., Dower S.K., and Virca G.D.1994. The interleukin-1 -stimulated protein kinase that phosphorylates heat shock protein hsp27 is activated by MAP kinase. FEBS Lett 338:31-36.
32. Bitar K.N., Kaminski M.S., Hailat N. Cease K.B., and Strahler J.R. 1991. Hsp27 is amediator of sustained smooth muscle contraction in response to bombesin. Biochem Biophys Res Commun 181:1192-1200.
33. Blair O.C., Winward R.T., and Roti R. 1979. The effect of hyperthermia on the proteincontent of HeLa cell nuclei: a flow cytometric analysis. Radiat Res 78:474-484.
34. Bochtler M., Ditzel L., Groll M., Hartmann C., and Huber R. 1999. The proteasome.
35. Annu Rev Biophys Biomol Struct 28:295-317.
36. Boelens W.C., Croes Y., and de J. 2001. Interaction between alphaB-crystallin and thehuman 20S proteasomal subunit C8/alpha7. Biochim Biophys Acta 1544:311319.
37. Bond U. 1988. Heat shock but not other stress inducers leads to the disruption of a subset of snRNPs and inhibition of in vitro splicing in HeLa cells. EMBO J 7:35093518.
38. Bonelli M.A., Alfieri R.R., Poli M., Petronini P.G., and Borghetti A.F. 2001. Heatinduced proteasomic degradation of HSF1 in serum-starved human fibroblasts aging in vitro. Exp Cell Res 267:165-172.
39. Borrelli M.J., Lepock J.R., Frey H.E., Lee Y.J., and Corry P.M. 1996. Excess proteinin nuclei isolated from heat-shocked cells results from a reduced extractability of nuclear proteins. J Cell Physiol 167:369-379.
40. Borrelli M.J., Wong R.S., and Dewey W.C. 1986. A direct correlation betweenhyperthermia-induced membrane blebbing and survival in synchronous G1 CHO cells. J Cell Physiol 126:181-190.
41. Boston R.S., Viitanen P.V., and Vierling E. 1996. Molecular chaperones and proteinfolding in plants. Plant Mol Biol 32:191-222.
42. Brooks P., Fuertes G., Murray R.Z., Bose S., Knecht E., Rechsteiner M.C., Hendil
43. K.B., Tanaka K., Dyson J., and Rivett J. 2000. Subcellular localization ofproteasomes and their regulatory complexes in mammalian cells. Biochem J 346 Pt 1:155-161.
44. Bruey J.M., Ducasse C., Bonniaud P., Ravagnan L., Susin S.A., Diaz-Latoud C.,
45. Gurbuxani S., Arrigo A.P., Kroemer G., Solary E., and Garrido C. 2000. Hsp27 negatively regulates cell death by interacting with cytochrome c. Nat Cell Biol 2:645-652.
46. Brunke M., Tyedmers J., and Zimmermann R. 1996. Protein folding within andprotein transport into mammalian microsomes are differentially affected by photoaffinity labeling of microsomes with 8-azido-ATP. Biochem Biophys Res Commun 218:454-460.
47. Bryantsev A.L., Loktionova S.A., Ilyinskaya O.P., Tararak E.M., Kampinga H.H., and
48. Kabakov A.E. 2002. Distribution, phosphorylation, and activities of Hsp25 in heat-stressed H9c2 myoblasts: a functional link to cytoprotection. Cell Stress Chaperones 7:146-155.
49. Buchner J., Schmidt M., Fuchs M., Jaenicke R., Rudolph R., Schmid F.X., and
50. Kiefhaber T. 1991. GroE facilitates refolding of citrate synthase by suppressing aggregation. Biochemistry 30:1586-1591.
51. Burgman P.W. and Konings A.W. 1992. Heat induced protein denaturation in theparticulate fraction of HeLa S3 cells: effect of thermotolerance. J Cell Physiol 153:88-94.
52. Bush K.T., Goldberg A.L., and Nigam S.K. 1997. Proteasome inhibition leads to aheat-shock response, induction of endoplasmic reticulum chaperones, and thermotolerance. J Biol Chem 272:9086-9092.
53. Caims J., Qin S., Philp R., Tan Y.H., and Guy G.R. 1994. Dephosphorylation of thesmall heat shock protein Hsp27 in vivo by protein phosphatase 2A. J Biol Chem 269:9176-9183.
54. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., and Prasher D.C. 1994. Greenfluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263:802-805.
55. Charette S.J. and Landry J. 2000. The interaction of HSP27 with Daxx identifies apotential regulatory role of HSP27 in Fas-induced apoptosis. Ann N Y Acad Sci 926:126-131.
56. Charette S.J., Lavoie J.N., Lambert H., and Landry J. 2000. Inhibition of Daxxmediated apoptosis by heat shock protein 27. Mol Cell Biol 20:7602-7612.
57. Chen S., Roseman A.M., Hunter A.S., Wood S.P., Burston S.G., Ranson N.A., Clarke
58. A.R., and Saibil H.R. 1994. Location of a folding protein and shape changes in GroEL-GroES complexes imaged by cryo-electron microscopy. Nature 371:261-264.
59. Chen X., Easton D., Oh H.J., Lee-Yoon D.S., Liu X., and Subjeck J. 1996. The 170kDa glucose regulated stress protein is a large HSP70-, HSP110- like protein of the endoplasmic reticulum. FEBS Lett 380:68-72.
60. Chiang H.L., Terlecky S.R., Plant C.P., and Dice J.F. 1989. A role for a 70-kilodaltonheat shock protein in lysosomal degradation of intracellular proteins. Science 246:382-385.
61. Chretien P. and Landry J. 1988 . Enhanced constitutive expression of the 27-kDa heatshock proteins in heat-resistant variants from Chinese hamster cells. J Cell Physiol 137:157-166.
62. Chu G.L., Ross G., Wong R.S., Waiters R., and Dewey W.C. 1993. Content ofnonhistone protein in nuclei after hyperthermic treatment. J Cell Physiol 154:217-221.
63. Ciavarra R.P., Duvall W., and Castora F.J. 1992. Induction of thermotolerance in Tcells protects nuclear DNA topoisomerase I from heat stress. Biochem Biophys Res Commun 186:166-172.
64. Ciocca D.R., Fuqua S.A., Lock L., Toft D.O., Welch W.J., and McGuire W.L. 1992.
65. Response of human breast cancer cells to heat shock and chemotherapeutic drugs. Cancer Res 52:3648-3654.
66. Ciocca D.R., Oesterreich S., Chamness G.C., McGuire W.L., and Fuqua S.A. 1993.
67. Biological and clinical implications of heat shock protein 27,000 (Hsp27): a review. J Natl Cancer Inst 85:1558-1570.
68. Clerk A. and Sugden P.H. 1998. The p38-MAPK inhibitor, SB203580, inhibits cardiacstress-activated protein kinases/c-Jun N-terminal kinases (SAPKs/JNKs). FEBS Lett 426:93-96.
69. Clifton A.D., Young P.R., and Cohen P. 1996. A comparison of the substratespecificity of MAPKAP kinase-2 and MAPKAP kinase-3 and their activation by cytokines and cellular stress. FEBS Lett 392:209-214.
70. Cole A. and Armour E.P. 1988. Ultrastructural study of mitochondrial damage in CHOcells exposed to hyperthermia. RadiatRes 115:421-435.
71. Collier N.C., Heuser J., Levy M.A., and Schlesinger M.J. 1988. Ultrastructural andbiochemical analysis of the stress granule in chicken embryo fibroblasts. J Cell Biol 106:1131-1139.
72. Collier N.C. and Schlesinger M.J. 1986. The dynamic state of heat shock proteins inchicken embryo fibroblasts. J Cell Biol 103:1495-1507.
73. Connell P., Ballinger C.A., Jiang J., Wu Y., Thompson L.J., Hohfeld J., and Patterson
74. C. 2001. The co-chaperone Chip regulates protein triage decisions mediated by heat-shock proteins. Nat Cell Biol 3:93-96.
75. Conti E., Franks N.P., and Brick P. 1996. Crystal structure of firefly luciferase throwslight on a superfamily of adenylate-forming enzymes. Structure 4:287-298.
76. Cormack B.P., Valdivia R.H., and Falkow S. 1996. FACS-optimized mutants of thegreen fluorescent protein (GFP). Gene 173:33-38.
77. Coss R.A., Dewey W.C., and Bamburg J.R. 1982. Effects of hyperthermia on dividing
78. Chinese hamster ovary cells and on microtubules in vitro. Cancer Res 42:10591071.
79. Crete P. and Landry J. 1990. Induction of HSP27 phosphorylation andthermoresistance in Chinese hamster cells by arsenite, cycloheximide, A23187, and EGTA. Radiat Res 121:320-327.
80. Csermely P., Schnaider T., Soti C., Prohaszka Z., and Nardai G. 1998. The 90-kDamolecular chaperone family: structure, function, and clinical applications. A comprehensive review. Pharmacol Ther 79:129-168.
81. Cuesta R., Laroia G., and Schneider R.J. 2000. Chaperone hsp27 inhibits translationduring heat shock by binding eIF4G and facilitating dissociation of cap-initiation complexes. Genes Dev 14:1460-1470.
82. D'Orazi G., Cecchinelli B., Bruno T., Manni I., Higashimoto Y., Saito S., Gostissa M.,
83. Coen S., Marchetti A., Del Sal G., Piaggio G., Fanciulli M., Appella E., and Soddu S. 2002. Homeodomain-interacting protein kinase-2 phosphorylates p53 at Ser 46 and mediates apoptosis. Nat Cell Biol 4:11-19.
84. Desterro J.M., Rodriguez M.S., and Hay R.T. 2000. Regulation of transcription factorsby protein degradation. Cell Mol Life Sci 57:1207-1219.
85. Dick T.P., Ruppert Т., Groettrup M., Kloetzel P.M., Kuehn L., Koszinowski U.H.,
86. Stevanovic S., Schild H., and Rammensee H.G. 1996. Coordinated dual cleavages induced by the proteasome regulator PA28 lead to dominant MHC ligands. Cell 86:253-262.
87. Dickson J. A. and Calderwood S.K. 1979. Effects of hyperglycemia and hyperthermiaon the pH, glycolysis, and respiration of the Yoshida sarcoma in vivo. J Natl Cancer Inst 63:1371-1381.
88. Dimopoulou K. and Thomopoulos G.N. 2000. Ultrastructural studies on the effect ofheat shock treatment on larval salivary gland cells of Drosophila auraria. J Submicrosc Cytol Pathol 32:573-584.
89. Dorion S., Berube J., Huot J., and Landry J. 1999. A short lived protein involved in theheat shock sensing mechanism responsible for stress-activated protein kinase 2 (SAPK2/p38) activation. J Biol Chem 274:37591-37597.
90. Duan H., Lin C.Y., and Mazzone T. 1997. Degradation of macrophage ApoE in anonlysosomal compartment. Regulation by sterols. J Biol Chem 272:3115631162.
91. Dubois M.F., Hovanessian A.G., and Bensaude O. 1991. Heat-shock-induceddenaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J Biol Chem 266:9707-9711.
92. Dul J.L., Davis D.P., Williamson E.K., Stevens F.J., and Argon Y. 2001. Hsp70 andantifibrillogenic peptides promote degradation and inhibit intracellular aggregation of amyloidogenic light chains. J Cell Biol 152:705-716.
93. Duncan R. and Hershey J. W. 1984. Heat shock-induced translational alterations in
94. HeLa cells. Initiation factor modifications and the inhibition of translation. J Biol Chem 259:11882-11889.
95. Duprez E., Saurin A.J., Desterro J.M., Lallemand-Breitenbach V., Howe K., Boddy
96. M.N., Solomon E., de The H., Hay R.T., and Freemont P.S. 1999. SUMO-1 modification of the acute promyelocytic leukaemia protein PML: implications for nuclear localisation. J Cell Sci 112 (Pt 3):381-393.
97. Easton D.P., Kaneko Y., and Subjeck J.R. 2000. The hspl 10 and Grpl 70 stressproteins: newly recognized relatives of the Hsp70s. Cell Stress Chaperones 5:276-290.
98. Ehrnsperger M., Graber S., Gaestel M., and Buchner J. 1997. Binding of non-nativeprotein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. EMBO J 16:221-229.
99. Ehrnsperger M., Lilie H., Gaestel M., and Buchner J. 1999. The dynamics of Hsp25quaternary structure. Structure and function of different oligomeric species. J Biol Chem 274:14867-14874.
100. Ellis R.J. and Hemmingsen S.M. 1989. Molecular chaperones: proteins essential forthe biogenesis of some macromolecular structures. Trends Biochem Sci 14:339342.
101. Ellis R.J. and van der Vies S.M. 1991. Molecular chaperones. Artrtu Rev Biochem60:321-347.
102. Engel K., Kotlyarov A., and Gaestel M. 1998. Leptomycin B-sensitive nuclear exportof MAPKAP kinase 2 is regulated by phosphorylation. EMBO J 17:3363-3371.
103. Evan G.l. and Hancock D.C. 1985. Studies on the interaction of the human c-mycprotein with cell nuclei: p62c-myc as a member of a discrete subset of nuclear proteins. Cell 43:253-261.
104. Fabunmi R.P., Wigley W.C., Thomas P.J., and DeMartino G.N. 2001. Interferongamma regulates accumulation of the proteasome activator PA28 and immunoproteasomes at nuclear PML bodies. J Cell Sci 114:29-36.
105. Fitzgerald J., Lamande S.R., and Bateman J.F. 1999. Proteasomal degradation ofunassembled mutant type I collagen pro-alphal(I) chains. J Biol Chem 274:27392-27398.
106. Freeman B.C. and Morimoto R.I. 1996. The human cytosolic molecular chaperoneshsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native protein and protein refolding. EMBO J 15:2969-2979.
107. Freeman B.C., Myers M.P., Schumacher R., and Morimoto R.I. 1995. Identification ofa regulatory motif in Hsp70 that affects ATPase activity, substrate binding and interaction with HDJ-1. EMBO J 14:2281-2292.
108. Fu L. and Liang J.J. 2002. Detection of protein-protein interactions among lenscrystallins in a mammalian two-hybrid system assay. J Biol Chem 277:42554260.
109. Fuchs L.C., Giulumian A.D., Knoepp L., Pipkin W., Dickinson M., Hayles C., and
110. Brophy C. 2000. Stress causes decrease in vascular relaxation linked with altered phosphorylation of heat shock proteins. Am J Physiol Regal Integr Comp Physiol 279:R492-R498.
111. Gaestel M., Benndorf R., Hayess K., Priemer E., and Engel K. 1992.
112. Dephosphorylation of the small heat shock protein hsp25 by calcium/calmodulin-dependent (type 2B) protein phosphatase. J Biol Chem 267:21607-21611.
113. Gaestel M., Schroder W., Benndorf R., Lippmann C., Buchner K., Hucho F., Erdmann
114. V.A., and Bielka H. 1991. Identification of the phosphorylation sites of the murine small heat shock protein hsp25. J Biol Chem 266:14721-14724.
115. Garrido C., Bruey J.M., Fromentin A., Hammann A., Arrigo A.P., and Solary E. 1999.
116. HSP27 inhibits cytochrome c-dependent activation of procaspase-9. FASEB J 13:2061-2070.
117. Garrido C., Gurbuxani S., Ravagnan L., and Kroemer G. 2001. Heat shock proteins:endogenous modulators of apoptotic cell death. Biochem Biophys Res Commurt 286:433-442.
118. Garrido C., Mehlen P., Fromentin A., Hammann A., Assem M., Arrigo A.P., and
119. Chauffert B. 1996. Inconstant association between 27-kDa heat-shock protein (Hsp27) content and doxorubicin resistance in human colon cancer cells. The doxorubicin-protecting effect of Hsp27. Eur J Biochem 237:653-659.
120. Gattoni R., Mahe D., Mahl P., Fischer N., Mattei M.G., Stevenin J., and Fuchs J.P.1996. The human hnRNP-M proteins: structure and relation with early heat shock-induced splicing arrest and chromosome mapping. Nucleic Acids Res 24:2535-2542.
121. Gebauer M., Melki R., and Gehring U. 1998. The chaperone cofactor Hop/p60interacts with the cytosolic chaperonin- containing TCP-1 and affects its nucleotide exchange and protein folding activities. J Biol Chem 273:2947529480.
122. Gemold M., Knauf U., Gaestel M., Stahl J., and Kloetzel P.M. 1993. Development andtissue-specific distribution of mouse small heat shock protein hsp25. Dev Genet 14:103-111.
123. Geum D., Son G.H., and Kim K. 2002. Phosphorylation-dependent cellularlocalization and thermoprotective role of heat shock protein 25 in hippocampal progenitor cells. J Biol Chem 277:19913-19921.
124. Glickman M.H. andCiechanover A. 2002. Theubiquitin-proteasomeproteolyticpathway: destruction for the sake of construction. Physiol Rev 82:373-428.
125. Glover J.R. and Lindquist S. 1998. Hspl04, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperonesystem that rescues previously aggregated proteins. Cell 94:73-82.
126. Goloubinoff P., Mogk A., Zvi A.P., Tomoyasu T., and Bukau B. 1999. Sequentialmechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl A cad Sci USA 96:13732-13737.
127. Gotoh Y. and Cooper J.A. 1998 . Reactive oxygen species- and dimerization-inducedactivation of apoptosis signal-regulating kinase 1 in tumor necrosis factor-alpha signal transduction. J Biol Chem 273:17477-17482.
128. Gottifredi V. and Prives C. 2001. P53 and PML: new partners in tumor suppression.
129. Trends Cell Biol 11:184-187.
130. Grenert J.P., Johnson B.D., and Toft D.O. 1999. The importance of ATP binding andhydrolysis by hsp90 in formation and function of protein heterocomplexes. J Biol Chem 274:17525-17533.
131. Grimwade D. and Solomon E. 1997. Characterisation of the PML/RAR alpharearrangement associated with t( 15; 17) acute promyelocytic leukaemia. Curr Top Microbiol Immunol 220:81 -112.
132. Groettrup M., Soza A., Eggers M., Kuehn L., Dick T.P., Schild H., Rammensee H.G.,
133. Koszinowski U.H., and Kloetzel P.M. 1996. A role for the proteasome regulator PA28alpha in antigen presentation. Nature 381:166-168.
134. Guay J., Lambert H., Gingras-Breton G., Lavoie J.N., Huot J., and Landry J. 1997.
135. Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. J Cell Sci 110 (Pt 3):357-368.
136. Guenal I., Sidoti-de Fraisse C., Gaumer S., and Mignotte B. 1997. Bcl-2 and Hsp27 actat different levels to suppress programmed cell death. Oncogene 15:347-360.
137. Guo Z. and Cooper L.F. 2000. An N-terminal 33-amino-acid-deletion variant of hsp25retains oligomerization and functional properties. Biochem Biophys Res Commurt 270:183-189.
138. Gusarova V., Caplan A.J., Brodsky J.L., and Fisher E.A. 2001. Apoprotein Bdegradation is promoted by the molecular chaperones hsp90 and hsp70. J Biol Chem 276:24891-24900.
139. Hansen L.K., Houchins J.P., and Leary J.J. 1991. Differential regulation of HSC70,
140. HSP70, HSP90 alpha, and HSP90 beta mRNA expression by mitogen activation and heat shock in human lymphocytes. Exp Cell Res 192:587-596.
141. Hansen R.K., Parra I., Lemieux P., Oesterreich S., Hilsenbeck S.G., and Fuqua S.A.1999. Hsp27 overexpression inhibits doxorubicin-induced apoptosis in human breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat 56:187-196.
142. Hartl F.U., Hlodan R., and Langer T. 1994. Molecular chaperones in protein folding:the art of avoiding sticky situations. Trends Biochem Sci 19:20-25.
143. Heads R.J., Latchman D.S., and Yellon D.M. 1995. Differential stress protein mRNAexpression during early ischaemic preconditioning in the rabbit heart and its relationship to adenosine receptor function. JMol Cell Cardiol 27:2133-2148.
144. Hedges J.C., Dechert M.A., Yamboliev I.A., Martin J.L., Hickey E., Weber L.A., and
145. Gerthoffer W.T. 1999. A role for p38(MAPK)/HSP27 pathway in smooth muscle cell migration. J Biol Chem 274:24211-24219.
146. Heine U., Sverak L., Kondratick J., and Bonar R.A. 1971. The behavior of HeLa-S3cells under the influence of supranormal temperatures. J Ultrastruct Res 34:375-396.
147. Hendrick J. P. and Hartl F.U. 1993. Molecular chaperone functions of heat-shockproteins. Annu Rev Biochem 62:349-384.
148. Hendrick J.P., Langer T., Davis T.A., Hartl F.U., and Wiedmann M. 1993. Control offolding and membrane translocation by binding of the chaperone DnaJ to nascent polypeptides. Proc Natl Acad Sci U S A 90:10216-10220.
149. Henle K.J., Nagle W.A., Moss A.J., and Herman T.S. 1984. Cellular ATP content ofheated Chinese hamster ovary cells. Radiat Res 97:630-633.
150. Herbst R., Schafer U., and Seckler R. 1997. Equilibrium intermediates in the reversibleunfolding of firefly (Photinus pyralis) luciferase. J Biol Chem 272:7099-7105.
151. Hickey E., Brandon S.E., Potter R., Stein G., Stein J., and Weber L.A. 1986. Sequenceand organization of genes encoding the human 27 kDa heat shock protein. Nucleic Acids Res 14:4127-4145.
152. Higashi T., Takechi H., Uemura Y., Kikuchi H., and Nagata K. 1994. Differentialinduction of mRN A species encoding several classes of stress proteins following focal cerebral ischemia in rats. Brain Res 650:239-248.
153. Higashikubo R. and Roti R. 1993. Alterations in nuclear protein mass andmacromolecular synthesis following heat shock. Radiat Res 134:193-201.
154. Hino M., Kurogi K., Okubo M.A., Murata-Hori M., and Hosoya H. 2000. Small heatshock protein 27 (HSP27) associates with tubulin/microtubules in HeLa cells. Biochem Biophys Res Commun 271:164-169.
155. Ho S.C., Chaudhuri S„ Bachhawat A., McDonald K., and Pillai S. 2000. Acceleratedproteasomal degradation of membrane Ig heavy chains. J Immunol 164:47134719.
156. Hoch B., Lutsch G., Schlegel W.P., Stahl J., Wallukat G., Bartel S., Krause E.G.,
157. Benndorf R., and Karczewski P. 1996. HSP25 in isolated perfused rat hearts: localization and response to hyperthermia. Mol Cell Biochem 160-161:231-239.
158. Hohfeld J., Cyr D.M., and Patterson C. 2001. From the cradle to the grave: molecularchaperones that may choose between folding and degradation. EMBO Rep 2:885-890.
159. Hohfeld J. and Jentsch S. 1997. GrpE-like regulation of the hsc70 chaperone by theanti-apoptotic protein BAG-1. EMBO J 16:6209-6216.
160. Hohfeld J., Minami Y., and Hartl F.U. 1995. Hip, a novel cochaperone involved in theeukaryotic Hsc70/Hsp40 reaction cycle. Cell 83:589-598.
161. Hook D.W. and Harding J.J. 1997. Molecular chaperones protect catalase againstthermal stress. Eur J Biochem 247:380-385.
162. Huot J., Houle F., Marceau F., and Landry J. 1997. Oxidative stress-induced actinreorganization mediated by the p38 mitogen-activated protein kinase/heat shock protein 27 pathway in vascular endothelial cells. Circ Res 80:383-392.
163. Huot J., Houle F., Spitz D.R., and Landry J. 1996. HSP27 phosphorylation-mediatedresistance against actin fragmentation and cell death induced by oxidative stress. Cancer Res 56:273-279.
164. Huot J., Lambert H., Lavoie J.N., Guimond A., Houle F., and Landry J. 1995.
165. Characterization of 45-kDa/54-kDa HSP27 kinase, a stress-sensitive kinase which may activate the phosphorylation-dependent protective function of mammalian 27-kDa heat-shock protein HSP27. EurJBiochem 227:416-427.
166. Huot J., Roy G., Lambert H., Chretien P., and Landry J. 1991. Increased survival aftertreatments with anticancer agents of Chinese hamster cells expressing the human Mr 27,000 heat shock protein. Cancer Res 51:5245-5252.
167. Ibitayo A.I., Sladick J., Tuteja S., Louis-Jacques O., Yamada H., Groblewski G.,
168. Welsh M., and Bitar K.N. 1999. HSP27 in signal transduction and association with contractile proteins in smooth muscle cells. Am J Physiol 277:G445-G454.
169. Imamura T., Haruta T., Takata Y., Usui I., Iwata M., Ishihara H., Ishiki M., Ishibashi
170. O., Ueno E., Sasaoka T., and Kobayashi M. 1998. Involvement of heat shock protein 90 in the degradation of mutant insulin receptors by the proteasome. J Biol Chem 273:11183-11188.
171. Inouye S. and Tsuji F.I. 1994. Aequorea green fluorescent protein. Expression of thegene and fluorescence characteristics of the recombinant protein. FEBS Lett 341:277-280.
172. Irmer H. and Hohfeld J. 1997. Characterization of functional domains of the eukaryoticco-chaperone Hip. J Biol Chem 272:2230-2235.
173. Ito H., Kamei K., Iwamoto I., Inaguma Y., Nohara D., and Kato K. 2001.
174. Phosphorylation-induced change of the oligomerization state of alpha B-crystallin. J Biol Chem 276:5346-5352.
175. Izaki K., Kinouchi H., Watanabe K., Owada Y., Okubo A., Itoh H., Kondo H.,
176. Tashima Y., Tamura S., Yoshimoto T., and Mizoi K. 2001. Induction of mitochondrial heat shock protein 60 and 10 mRNAs following transient focal cerebral ischemia in the rat. Brain Res Mol Brain Res 88:14-25.
177. Jaenicke R. 1991. Protein folding: local structures, domains, subunits, and assemblies.
178. Biochemistry 30:3147-3161.
179. Jaenicke R. 1993. What does protein refolding in vitro tell us about protein folding inthe cell? Philos Trans R Soc LondB Biol Sci 339:287-294.
180. Jakob U., Gaestel M., Engel K., and Buchner J. 1993. Small heat shock proteins aremolecular chaperones. J Biol Chem 268:1517-1520.
181. Jakob U., Lilie H., Meyer I., and Buchner J. 1995. Transient interaction of Hsp90 withearly unfolding intermediates of citrate synthase. Implications for heat shock in vivo. J Biol Chem 270:7288-7294.
182. Jans D.A. 1995. The regulation of protein transport to the nucleus by phosphorylation.
183. Biochem J 311 ( Pt 3):705-716.
184. Jantschitsch C., Kindas M., Metze D., Amann G., Micksche M., and Trautinger F.1998. Expression of the small heat shock protein HSP 27 in developing human skin. Br J Dermatol 139:247-253.
185. Johnson B.D., Chadli A., Felts S.J., Bouhouche I., Catelli M.G., and Toft D.O. 2000.
186. Hsp90 chaperone activity requires the full-length protein and interaction among its multiple domains. J Biol Chem 275:32499-32507.
187. Johnson B.D., Schumacher R.J., Ross E.D., and Toft D.O. 1998. Hop modulates
188. Hsp70/Hsp90 interactions in protein folding. J Biol Chem 273:3679-3686.
189. Jorritsma J.B., Kampinga H.H., Scaf A.H., and Konings A.W. 1985. Strand breakrepair, DNA polymerase activity and heat radiosensitization in thermotolerant cells. Int J Hyperthermia 1:131-145.
190. Josefsberg L.B., Galiani D., Dantes A., Amsterdam A., and Dekel N. 2000. Theproteasome is involved in the first metaphase-to-anaphase transition of meiosis in rat oocytes. Biol Reprod 62:1270-1277.
191. Kabakov A.E. and Gabai V.L. 1997. Heat shock proteins and cytoprotection: ATPdeprivated mammalian cells. R.G. Landes company, Austin, Texas, USA.
192. Kampinga H.H. 1993. Thermotolerance in mammalian cells. Protein denaturation andaggregation, and stress proteins. J Cell Sci 104 (Pt 1): 11-17.
193. Kampinga H.H., Brunsting J.F., Stege G.J., Konings A.W., and Landry J. 1994. Cellsoverexpressing Hsp27 show accelerated recovery from heat-induced nuclear protein aggregation. Biochem Biophys Res Commun 204:1170-1177.
194. Kampinga H.H., Jorritsma J.B., and Konings A.W. 1985. Heat-induced alterations in
195. DNA polymerase activity of HeLa cells and of isolated nuclei. Relation to cell survival. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med47:29-40.
196. Kampinga H.H., Luppes J.G., and Konings A.W. 1987. Heat-induced nuclear proteinbinding and its relation to thermal cytotoxicity. Int J Hyperthermia 3:459-465.
197. Kamradt M.C., Chen F., and Cryns V.L. 2001. The small heat shock protein alpha Bcrystallin negatively regulates cytochrome c- and caspase-8-dependent activation of caspase-3 by inhibiting its autoproteolytic maturation. J Biol Chem 276:16059-16063.
198. Kandil E., Kohda K., Ishibashi T., Tanaka K., and Kasahara M. 1997. PA28 subunitsof the mouse proteasome: primary structures and chromosomal localization of the genes. Immunogenetics 46:337-344.
199. Kato К., Goto S., Inaguma Y., Hasegawa K., Morishita R., and Asano T. 1994a.
200. Purification and characterization of a 20-kDa protein that is highly homologous to alpha В crystallin. J Biol Chem 269:15302-15309.
201. Kato K., Hasegawa K., Goto S., and Inaguma Y. 1994b. Dissociation as a result ofphosphorylation of an aggregated form of the small stress protein, hsp27. J Biol Chem 269:11274-11278.
202. Kaye F.J., Modi S., Ivanovska I., Koonin E.V., Thress K., Kubo A., Kornbluth S., and
203. Rose M.D. 2000. A family of ubiquitin-like proteins binds the ATPase domain of Hsp70-like Stch. FEBS Lett 467:348-355.
204. Kim D., Kim S.H., and Li G.C. 1999. Proteasome inhibitors MG132 and lactacystinhyperphosphorylate HSF1 and induce hsp70 and hsp27 expression. Biochem Biophys Res Commun 254:264-268.
205. King K.L., Li A.F., Chau G.Y., Chi C.W., Wu C.W., Huang C.L., and Lui W.Y. 2000.
206. Prognostic significance of heat shock protein-27 expression in hepatocellular carcinoma and its relation to histologic grading and survival. Cancer 88:24642470.
207. Klemenz R., Andres A.C., Frohli E., Schafer R., and Aoyama A. 1993. Expression ofthe murine small heat shock proteins hsp 25 and alpha В crystallin in the absence of stress. J Cell Biol 120:639-645.
208. Kloetzel P.M., Soza A., and Stohwasser R. 1999. The role of the proteasome systemand the proteasome activator PA28 complex in the cellular immune response. Biol Chem 380:293-297.
209. Knauf U., Jakob U., Engel K., Buchner J., and Gaestel M. 1994. Stress- and mitogeninduced phosphorylation of the small heat shock protein Hsp25 by MAPKAP kinase 2 is not essential for chaperone properties and cellular thermoresistance. EMBOJ 13:54-60.
210. Knoepp L., Beall A., Woodrum D., Mondy J.S., Shaver E., Dickinson M., and Brophy
211. C.M. 2000. Cellular stress inhibits vascular smooth muscle relaxation. J Vase Surg 31:343-353.
212. Knowlton A. A. 2001. Mutation of amino acids 566-572 (KKKVLDK) inhibits nuclearaccumulation of heat shock protein 72 after heat shock. J Mol Cell Cardiol 33:49-55.
213. Knowlton A.A., Kapadia S., Torre-Amione G., Durand J.B., Bies R., Young J., and
214. Mann D.L. 1998. Differential expression of heat shock proteins in normal and failing human hearts. J Mol Cell Cardiol 30:811-818.
215. Koegl M., Hoppe Т., Schlenker S., Ulrich H.D., Mayer T.U., and Jentsch S. 1999. Anovel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell 96:635-644.
216. Konings A.W. and Ruifrok A.C. 1985. Role of membrane lipids and membranefluidity in thermosensitivity and thermotolerance of mammalian cells. Radiat Res 102:86-98.
217. Kushnirov V.V., Kryndushkin D.S., Boguta M., Smirnov V.N., and Ter-Avanesyan.2000. Chaperones that cure yeast artificial PSI+. and their prion-specific effects. Curr Biol 10:1443-1446.
218. Kyriakis J.M. and Avruch J. 2001. Mammalian mitogen-activated protein kinase signaltransduction pathways activated by stress and inflammation. Physiol Rev 81:807-869.
219. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural protein during the assembly of head ofbacteriophage T4. Nature 227:680-685.
220. Lambert H., Charette S.J., Bernier A.F., Guimond A., and Landry J. 1999. HSP27multimerization mediated by phosphorylation-sensitive intermolecular interactions at the amino terminus. J Biol Chem 274:9378-9385.
221. Landry J., Chretien P., Lambert H., Hickey E., and Weber L.A. 1989. Heat shockresistance conferred by expression of the human HSP27 gene in rodent cells. J Cell Biol 109:7-15.
222. Landry J. and Huot J. 1995. Modulation of actin dynamics during stress andphysiological stimulation by a signaling pathway involving p38 MAP kinase and heat-shock protein 27. Biochem Cell Biol 73:703-707.
223. Landry J. and Huot J. 1999. Regulation of actin dynamics by stress-activated proteinkinase 2 (SAPK2)-dependent phosphorylation of heat-shock protein of 27 kDa (Hsp27). Biochem Soc Symp 64:79-89.
224. Landry J., Lambert H., Zhou M., Lavoie J.N., Hickey E., Weber L.A., and Anderson
225. C.W. 1992. Human HSP27 is phosphorylated at serines 78 and 82 by heat shock and mitogen-activated kinases that recognize the same amino acid motif as S6 kinase II. J Biol Chem 267:794-803.
226. Laskey R.A., Honda B.M., Mills A.D., and Finch J.T. 1978. Nucleosomes areassembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature 275:416-420.
227. Laszlo A. 1988. Evidence for two states of thermotolerance in mammalian cells. IntJ1. Hyperthermia 4:513-526.
228. Laszlo A. 1992. The effects of hyperthermia on mammalian cell structure and function.1. Cell Prolif25:59-&7.
229. Laszlo A., Wright W., and Roti R. 1992. Initial characterization of heat-induced excessnuclear proteins in HeLa cells. J Cell Physiol 151:519-532.
230. Lavoie J., Chretien P., and Landry J. 1990. Sequence of the Chinese hamster small heatshock protein HSP27. Nucleic Acids Res 18:1637-1637.
231. Lavoie J.N., Gingras B., Tanguay R.M., and Landry J. 1993a. Induction of Chinesehamster HSP27 gene expression in mouse cells confers resistance to heat shock. HSP27 stabilization of the microfilament organization. J Biol Chem 268:34203429.
232. Lavoie J.N., Hickey E., Weber L.A., and Landry J. 1993b. Modulation of actinmicrofilament dynamics and fluid phase pinocytosis by phosphorylation of heat shock protein 27. J Biol Chem 268:24210-24214.
233. Lee D.H. and Goldberg A.L. 1998. Proteasome inhibitors: valuable new tools for cellbiologists. Trends Cell Biol 8:397-403.
234. Lee J.C., Kassis S., Kumar S., Badger A., and Adams J.L. 1999. p38 mitogen-activatedprotein kinase inhibitors—mechanisms and therapeutic potentials. Pharmacol Ther 82:389-397.
235. Leger J.P., Smith F.M., and Currie R.W. 2000. Confocal microscopic localization ofconstitutive and heat shock- induced proteins HSP70 and HSP27 in the rat heart. Circulation 102:1703-1709.
236. Lemieux P., Oesterreich S., Lawrence J.A., Steeg P.S., Hilsenbeck S.G., Harvey J.M.,and Fuqua S.A. 1997. The small heat shock protein hsp27 increases invasiveness but decreases motility of breast cancer cells. Invasion Metastasis 17:113-123.
237. Lepock J.R., Frey H.E., Heynen M.L., Senisterra G.A., and Warters R.L. 2001. Thenuclear matrix is a thermolabile cellular structure. Cell Stress Chaperones 6:136-147.
238. Lewis C.D. and Laemmli U.K. 1982. Higher order metaphase chromosome structure:evidence for metalloprotein interactions. Cell 29:171-181.
239. Li G.C. and Hahn G.M. 1980. A proposed operational model of thermotolerance basedon effects of nutrients and the initial treatment temperature. Cancer Res 40:4501-4508.
240. Li S., Piotrowicz R.S., Levin E.G., Shyy Y.J., and Chien S. 1996. Fluid shear stressinduces the phosphorylation of small heat shock proteins in vascular endothelial cells. Am J Physiol 271:C994-1000.
241. Li Y.M. and Casida J.E. 1992. Cantharidin-binding protein: identification as proteinphosphatase 2A. Proc Natl Acad Sci USA 89:11867-11870.
242. Lindner R.A., Carver J.A., Ehrnsperger M., Buchner J., Esposito G., Behlke J., Lutsch
243. G., Kotlyarov A., and Gaestel M. 2000. Mouse Hsp25, a small shock protein. The role of its C-terminal extension in oligomerization and chaperone action. Eur JBiochem 267:1923-1932.
244. Lindquist S. 1986. The heat-shock response. Annu Rev Biochem 55:1151-1191.
245. Littlewood T.D., Hancock D.C., and Evan G.I. 1987. Characterization of a heat shockinduced insoluble complex in the nuclei of cells. J Cell Sci 88 ( Pt l):65-72.
246. Liu R.Y., Li X., Li L., and Li G.C. 1992. Expression of human hsp70 in rat fibroblastsenhances cell survival and facilitates recovery from translational and transcriptional inhibition following heat shock. Cancer Res 3667-3673.
247. Loktionova S.A., Ilyinskaya O.P., Gabai V.L., and Kabakov A.E. 1996. Distincteffects of heat shock and ATP depletion on distribution and isoform patterns of human Hsp27 in endothelial cells. FEBS Lett 392:100-104.
248. Loktionova S.A., Ilyinskaya O.P., and Kabakov A.E. 1998. Early and delayedtolerance to simulated ischemia in heat- preconditioned endothelial cells: a role for HSP27. Am J Physiol 275:H2147-H2158.
249. Loktionova S.A. and Kabakov A.E. 1998. Protein phosphatase inhibitors and heatpreconditioning prevent Hsp27 dephosphorylation, F-actin disruption and deterioration of morphology in ATP-depleted endothelial cells. FEBS Lett 433:294-300.
250. Luders J., Demand J., and Hohfeld J. 2000. The ubiquitin-related BAG-1 provides alink between the molecular chaperones Hsc70/Hsp70 and the proteasome. J Biol Chem 275:4613-4617.
251. Luders J., Demand J., Schonfelder S., Frien M., Zimmermann R., and Hohfeld J. 1998.
252. Cofactor-induced modulation of the functional specificity of the molecular chaperone Hsc70. Biol Chem 379:1217-1226.
253. Lupas A., Koster A.J., and Baumeister W. 1993. Structural features of 26S and 20Sproteasomes. Enzyme Protein 47:252-273.
254. Luscher B. and Eisenman R.N. 1988. c-myc and c-myb protein degradation: effect ofmetabolic inhibitors and heat shock. Mol Cell Biol 8:2504-2512.
255. Lutsch G., Vetter R., Offhauss U., Wieske M., Grone H.J., Klemenz R., Schimke I.,
256. Stahl J., and Benndorf R. 1997. Abundance and location of the small heat shock proteins HSP25 and alphaB-crystallin in rat and human heart. Circulation 96:3466-3476.
257. Maizels E.T., Peters C.A., Kline M., Cutler R.E., Shanmugam M., and Hunzicker D.1998. Heat-shock protein-25/27 phosphorylation by the delta isoform of protein kinase C. Biochem J 332 ( Pt 3):703-712.
258. Manzerra P. and Brown I.R. 1996. The neuronal stress response: nuclear translocationof heat shock proteins as an indicator of hyperthermic stress. Exp Cell Res 229:35-47.
259. Martin J. 1997. Molecular chaperones and mitochondrial protein folding. J Bioenerg1. Biomembr 29:35-43.
260. Martin J., Horwich A.L., and Hartl F.U. 1992. Prevention of protein denaturationunder heat stress by the chaperonin Hsp60. Science 258:995-998.
261. Martin J., Langer T., Boteva R., Schramel A., Horwich A.L., and Hartl F.U. 1991.
262. Chaperonin-mediated protein folding at the surface of groEL through a 'molten globule'-like intermediate. Nature 352:36-42.
263. McLaughlin M.M., Kumar S., McDonnell P.C., Van Horn S., Lee J.C., Livi G.P., and
264. Young P.R. 1996. Identification of mitogen-activated protein (MAP) kinase-activated protein kinase-3, a novel substrate of CSBP p38 MAP kinase. J Biol Chem 271:8488-8492.
265. Meacham G.C., Patterson C., Zhang W., Younger J.M., and Cyr D.M. 2001. The
266. Hsc70 co-chaperone Chip targets immature CFTR for proteasomal degradation. Nat Cell Biol 3:100-105.
267. Mehlen P., Mehlen A., Godet J., and Arrigo A.P. 1997b. hsp27 as a switch betweendifferentiation and apoptosis in murine embryonic stem cells. J Biol Chem 272:31657-31665.
268. Mehlen P., Preville X., Chareyron P., Briolay J., Klemenz R., and Arrigo A.P. 1995b.
269. Constitutive expression of human hsp27, Drosophila hsp27, or human alpha B-crystallin confers resistance to TNF- and oxidative stress-induced cytotoxicity in stably transfected murine L929 fibroblasts. J Immunol 154:363-374.
270. Mehlen P., Schulze O., and Arrigo A.P. 1996b. Small stress proteins as novelregulators of apoptosis. Heat shock protein 27 blocks Fas/APO-1- and staurosporine-induced cell death. J Biol Chem 271:16510-16514.
271. Meijerman I., Blom W.M., de B., Mulder G J., and Nagelkerke J.F. 1999. Changes of
272. G-actin localisation in the mitotic spindle region or nucleus during mitosis and after heat shock: a histochemical study of G-actin in various cell lines with fluorescent labelled vitamin D-binding protein. Biochim Biophys Acta 1452:1224.
273. Meloche S., Landry J., Huot J., Houle F., Marceau F., and Giasson E. 2000. p38 MAPkinase pathway regulates angiotensin Il-induced contraction of rat vascular smooth muscle. Am J Physiol Heart Circ Physiol 279:H741-H751.
274. Merck K.B., Groenen P.J., Voorter C.E., de Haard-Hoekman W.A., Horwitz J.,
275. Bloemendal H., and de Jong W.W. 1993a. Structural and functional similarities of bovine alpha-crystallin and mouse small heat-shock protein. A family of chaperones. J Biol Chem 268:1046-1052.
276. Merck K.B., Horwitz J., Kersten M., Overkamp P., Gaestel M., Bloemendal H., and de
277. Jong W.W. 1993b. Comparison of the homologous carboxy-terminal domain and tail of alpha-crystallin and small heat shock protein. Mol Biol Rep 18:209215.
278. Michel M.C., Li Y., and Heusch G. 2001. Mitogen-activated protein kinases in dieheart. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 363:245-266.
279. Michels A.A., Kanon B., Bensaude O., and Kampinga H.H. 1999. Heat shock protein
280. Hsp) 40 mutants inhibit Hsp70 in mammalian cells. J Biol Chem 274:3675736763.
281. Michels A.A., Kanon B., Konings A.W., Ohtsuka K., Bensaude O., and Kampinga
282. H.H. 1997. Hsp70 and Hsp40 chaperone activities in the cytoplasm and the nucleus of mammalian cells. J Biol Chem 272:33283-33289.
283. Michels A. A., Nguyen V.T., Konings A.W., Kampinga H.H., and Bensaude O. 1995.
284. Thermostability of a nuclear-targeted luciferase expressed in mammalian cells. Destabilizing influence of the intranuclear microenvironment. EurJBiochem 234:382-389.
285. Minami Y., Hohfeld J., Ohtsuka K., and Hartl F.U. 1996. Regulation of the heat-shockprotein 70 reaction cycle by the mammalian DnaJ homolog, Hsp40. J Biol Chem 271:19617-19624.
286. Minami Y. and Minami M. 1999. Hsc70/Hsp40 chaperone system mediates the Hsp90dependent refolding of firefly luciferase. Genes Cells 4:721-729.
287. Miron T., Vancompernolle K., Vandekerckhove J., Wilchek M., and Geiger B. 1991. A25.kD inhibitor of actin polymerization is a low molecular mass heat shock protein. J Cell Biol 114:255-261.
288. Miron T., Wilchek M., and Geiger B. 1988. Characterization of an inhibitor of actinpolymerization in vinculin- rich fraction of turkey gizzard smooth muscle. Eur J Biochem 178:543-553.
289. Morin J.G. and Hastings J.W. 1971. Energy transfer in a bioluminescent system. J Cell1. Physiol 77:313-318.
290. Motohashi K., Watanabe Y., Yohda M., and Yoshida M. 1999. Heat-inactivatedproteins are rescued by the DnaK.J-GrpE set and ClpB chaperones. Proc Natl AcadSci USA 96:7184-7189.
291. Mounier N. and Arrigo A.P. 2002. Actin cytoskeleton and small heat shock proteins:how do they interact? Cell Stress Chaperones 7:167-176.
292. Murata S., Kawahara H., Tohma S., Yamamoto K., Kasahara M., Nabeshima Y.,
293. Tanaka K., and Chiba T. 1999. Growth retardation in mice lacking the proteasome activator PA28gamma. J Biol Chem 274:38211-38215.
294. Nebreda A.R. and Porras A. 2000. p38 MAP kinases: beyond the stress response.
295. Trends Biochem Sci 25:257-260.
296. New L., Jiang Y., Zhao M., Liu K., Zhu W., Flood L.J., Kato Y., Parry G.C., and Han
297. J. 1998. PRAK, a novel protein kinase regulated by the p38 MAP kinase. EMBOJ 17:3372-3384.
298. Nguyen V.T. and Bensaude 0.1994. Increased thermal aggregation of proteins in
299. ATP-depleted mammalian cells. Eur J Biochem 220:239-246.
300. Nguyen V.T., Morange M., and Bensaude O. 1989. Protein denaturation during heatshock and related stress. Escherichia coli beta-galactosidase and Photinus pyralis luciferase inactivation in mouse cells. J Biol Chem 264:10487-10492.
301. Nishimura R.N., Dwyer B.E., Vinters H.V., De V., and Cole R. 1991. Heat shock incultured neurons and astrocytes: correlation of ultrastructure and heat shock protein synthesis. Neuropathol Appl Neurobiol 17:139-147.
302. Nolan N.L. and Kidwell W.R. 1982. Effect of heat shock on poly(ADP-ribose)synthetase and DNA repair in Drosophila cells. Radiat Res 90:187-203.
303. Nollen E.A., Brunsting J.F., Roelofsen H., Weber L.A., and Kampinga H.H. 1999. Invivo chaperone activity of heat shock protein 70 and thermotolerance. Mol Cell Biol 19:2069-2079.
304. Nollen E.A., Brunsting J.F., Song J., Kampinga H.H., and Morimoto R.I. 2000. Baglfunctions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol Cell Biol 20:1083-1088.
305. Nollen E.A., Salomons F.A., Brunsting J.F., Want J.J., Sibon O.C., and Kampinga
306. H.H. 2001. Dynamic changes in the localization of thermally unfolded nuclear proteins associated with chaperone-dependent protection. ProcNatl Acad Sci U SA 98:12038-12043.
307. Oda K., Ikehara Y., and Omura S. 1996. Lactacystin, an inhibitor of the proteasome,blocks the degradation of a mutant precursor of glycosylphosphatidylinositol-linked protein in a pre-Golgi compartment. Biochem Biophys Res Commun 219:800-805.
308. Oh H.J., Chen X., and Subjeck J.R. 1997. Hspl 10 protects heat-denatured proteins andconfers cellular thermoresistance. J Biol Chem 272:31636-31640.
309. Oh H.J., Easton D., Murawski M., Kaneko Y., and Subjeck J.R. 1999. Thechaperoning activity of hspl 10. Identification of functional domains by use of targeted deletions. J Biol Chem 274:15712-15718.
310. Okubo A., Kinouchi H., Owada Y., Kunizuka H., Itoh H., Izaki K., Kondo H.,
311. Tashima Y., Yoshimoto T., and Mizoi K. 2000. Simultaneous induction of mitochondrial heat shock protein mRNAs in rat forebrain ischemia. Brain Res Mol Brain Res 84:127-134.
312. Ono K. and Han J. 2000. The p38 signal transduction pathway: activation and function.1. Cell Signal 12:1-13.
313. Panasenko O.O., Kim M.V., Marston S.B., and Gusev N.B. 2003. Interaction of thesmall heat shock protein with molecular mass 25 kDa (hsp25) with actin. Eur J Biochem 270:892-901.
314. Parag H.A., Raboy B., and Kulka R.G. 1987. Effect of heat shock on proteindegradation in mammalian cells: involvement of the ubiquitin system. EMBOJ 6:55-61.
315. Park Y.M., Han M.Y., Blackburn R.V., and Lee Y.J. 1998. Overexpression of HSP25reduces the level of TNF alpha-induced oxidative DNA damage biomarker, 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine, in L929 cells. J Cell Physiol 174:27-34.
316. Parsell D.A., Kowal A.S., Singer M.A., and Lindquist S. 1994. Protein disaggregationmediated by heat-shock protein Hsp 104. Nature 372:475-478.
317. Parsell D.A. and Lindquist S. 1993. The function of heat-shock proteins in stresstolerance: degradation and reactivation of damaged proteins. Annu Rev Genet 27:437-496.
318. Parsell D.A., Sanchez Y., Stitzel J.D., and Lindquist S. 1991. Hspl04 is a highlyconserved protein with two essential nucleotide- binding sites. Nature 353:270273.
319. Parsell D.A., Taulien J., and Lindquist S. 1993. The role of heat-shock proteins inthermotolerance. Philos Trans R Soc LondB Biol Sci 339:279-285.
320. Patino M.M., Liu J.J., Glover J.R., and Lindquist S. 1996. Support for the prionhypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science 273:622-626.
321. Paul C., Manero F., Gonin S., Kretz-Remy C., Virot S., and Arrigo A.P. 2002. Hsp27as a negative regulator of cytochrome C release. Mol Cell Biol 22:816-834.
322. Perng M.D., Cairns L., van den I.J., Prescott A., Hutcheson A.M., and Quinlan R.A.1999. Intermediate filament interactions can be altered by HSP27 and alphaB-crystallin. J Cell Sci 112 ( Pt 13):2099-2112.
323. Pinto M., Morange M., and Bensaude O. 1991. Denaturation of proteins during heatshock. In vivo recovery of solubility and activity of reporter enzymes. J Biol Chem 266:13941-13946.
324. Piotrowicz R.S., Hickey E., and Levin E.G. 1998. Heat shock protein 27 kDaexpression and phosphorylation regulates endothelial cell migration. FASEBJ 12:1481-1490.
325. Pirkkala L., Alastalo T.P., Zuo X., Benjamin I.J., and Sistonen L. 2000. Disruption ofheat shock factor 1 reveals an essential role in the ubiquitin proteolytic pathway. Mol Cell Biol 20:2670-2675.
326. Prescott D.M., Myerson D., and Wallace J. 1972. Enucleation of mammalian cells withcytochalasin B. Exp Cell Res 71:480-485.
327. Raboy B., Sharon G., Parag H.A., Shochat Y., and Kulka R.G. 1991. Effect of stresson protein degradation: role of the ubiquitin system. Acta Biol Hung 42:3-20.
328. Raynes D.A. arid Guerriero V., Jr. 1998. Inhibition of Hsp70 ATPase activity andprotein renaturation by a novel Hsp70-binding protein. J Biol Chem 273:3288332888.
329. Reits E.A., Benham A.M., Plougastel B., Neefjes J., and Trowsdale J. 1997. Dynamicsof proteasome distribution in living cells. EMBOJ 16:6087-6094.
330. Rihs H.P., Jans D.A., Fan H., and Peters R. 1991. The rate of nuclear cytoplasmicprotein transport is determined by the casein kinase II site flanking the nuclear localization sequence of the SV40 T-antigen. EMBO J 10:633-639.
331. Ritossa F. 1996. Discovery of the heat shock response. Cell Stress Chaperones 1:9798.
332. Ritossa F.M. 1962. A new puffing pattern induced by a temperature shock and DNP in
333. Drosophila. Experentia 18:571-573.
334. Rivett A.J., Bose S., Brooks P., and Broadfoot K.I. 2001. Regulation of proteasomecomplexes by gamma-interferon and phosphorylation. Biochimie 83:363-366.
335. RoffM., Thompson J., Rodriguez M.S., Jacque J.M., Baleux F., Arenzana S., and Hay
336. R.T. 1996. Role of IkappaBalpha ubiquitination in signal-induced activation of NFkappaB in vivo. J Biol Chem 271:7844-7850.
337. Rogalla T., Ehrnsperger M., Preville X., Kotlyarov A., Lutsch G., Ducasse C., Paul C.,
338. Wieske M., Arrigo A.P., Buchner J., and Gaestel M. 1999. Regulation of Hsp27 oligomerization, chaperone function, and protective activity against oxidative stress/tumor necrosis factor alpha by phosphorylation. J Biol Chem 274:1894718956.
339. Rosette C. and Karin M. 1996. Ultraviolet light and osmotic stress: activation of the
340. JNK cascade through multiple growth factor and cytokine receptors. Science 274:1194-1197.
341. Ross C.A. 1997. Intranuclear neuronal inclusions: a common pathogenic mechanismfor glutamine-repeat neurodegenerative diseases? Neuron 19:1147-1150.
342. Roti Roti, Kampinga H.H., Malyapa R.S., Wright W.D., vanderWaal R.P., and Xu M.1998. Nuclear matrix as a target for hyperthermic killing of cancer cells. Cell Stress Chaperones 3:245-255.
343. Roti Roti and Turkel N. 1994. Heat-induced changes in nuclear-associated proteins innormal and thermotolerant HeLa cells. Radiat Res 139:73-81.
344. Roti Roti, Uygur N., and Higashikubo R. 1986. Nuclear protein following heat shock:protein removal kinetics and cell cycle rearrangements. Radiat Res 107:250261.
345. Roti Roti, Wright W.D., and VanderWaal R. 1997. The nuclear matrix: a target forheat shock effects and a determinant for stress response. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 7:343-360.
346. Rousseau S., Houle F., Landry J., and Huot J. 1997. p38 MAP kinase activation byvascular endothelial growth factor mediates actin reorganization and cell migration in human endothelial cells. Oncogene 15:2169-2177.
347. Rust W., Kingsley K., Petnicki T., Padmanabhan S., Carper S.W., and Plopper G.E.1999. Heat shock protein 27 plays two distinct roles in controlling human breast cancer cell migration on laminin-5. Mol Cell Biol Res Commun 1:196-202.
348. Saibil H. 2000. Molecular chaperones: containers and surfaces for folding, stabilisingor unfolding proteins. Curr Opin Struct Biol 10:251-258.
349. Saitoh M., Nishitoh H., Fujii M., Takeda K., Tobiume K., Sawada Y., Kawabata M.,
350. Miyazono K., and Ichijo H. 1998. Mammalian thioredoxin is a direct inhibitor of apoptosis signal-regulating kinase (ASK) 1. EMBO J 17:2596-2606.
351. Saklatvala J., Kaur P., and Guesdon F. 1991. Phosphorylation of the small heat-shockprotein is regulated by interleukin 1, tumour necrosis factor, growth factors, bradykinin and ATP. BiochemJlll ( Pt 3):635-642.
352. Salituro F.G., Germann U.A., Wilson K.P., Bemis G.W., Fox T., and Su M.S. 1999.1.hibitors of p38 MAP kinase: therapeutic intervention in cytokine-mediated diseases. Curr Med Chem 6:807-823.
353. Salvador-Silva M., Ricard C.S., Agapova O.A., Yang P., and Hernandez M.R. 2001.
354. Expression of small heat shock proteins and intermediate filaments in the human optic nerve head astrocytes exposed to elevated hydrostatic pressure in vitro. JNeurosci Res 66:59-73.
355. Samali A., Robertson J.D., Peterson E., Manero F., van Zeijl L., Paul C., Cotgreave
356. A., Arrigo A.P., and Orrenius S. 2001. Hsp27 protects mitochondria of thermotolerant cells against apoptotic stimuli. Cell Stress Chaperones 6:49-58.
357. Santos B.C., Chevaile A., Kojima R., and Gullans S.R. 1998. Characterization of the
358. Hspl 10/SSE gene family response to hyperosmolality and other stresses. Am J Physiol 274:F1054-F1061.
359. Satoh J. and Kim S.U. 1995. Cytokines and growth factors induce HSP27phosphorylation in human astrocytes. JNeuropathol Exp Neurol 54:504-512.
360. Satoh K., Wakui H., Komatsuda A., Nakamoto Y., Miura A.B., Itoh H., and Tashima
361. Y. 1994. Induction and altered localization of 90-kDa heat-shock protein in rat kidneys with cisplatin-induced acute renal failure. Ren Fail 16:313-323.
362. Satyal S.H., Schmidt E., Kitagawa K., Sondheimer N., Lindquist S., Kramer J.M., and
363. Morimoto R.l. 2000. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA 97:57505755.
364. Schirmer E.C., Glover J.R., Singer M.A., and Lindquist S. 1996. HSPlOO/Clp proteins:a common mechanism explains diverse functions. Trends Biochem Sci 21:289296.
365. Schubert U., Anton L.C., Gibbs J., Norbury C.C., Yewdell J.W., and Bennink J.R.2000. Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes. Nature 404:770-774.
366. Sheth K., De A., Nolan B., Friel J., Duffy A., Ricciardi R., Miller G., and Bankey P.2001. Heat shock protein 27 inhibits apoptosis in human neutrophils. J Surg Res 99:129-133.
367. Spector D.L. 2001. Nuclear domains. J Cell Sci 114:2891-2893.
368. Spiro I. J., Denman D.L., and Dewey W.C. 1982. Effect of hyperthermia on CHO DNApolymerases alpha and beta. Radiat Res 89:134-149.
369. Stege G.J., Li G.C., Li L., Kampinga H.H., and Konings A.W. 1994a. On the role ofhsp72 in heat-induced intranuclear protein aggregation. Int J Hyperthermia 10:659-674.
370. Stege G.J., Li L., Kampinga H.H., Konings A.W., and Li G.C. 1994b. Importance ofthe ATP-binding domain and nucleolar localization domain of HSP72 in the protection of nuclear proteins against heat-induced aggregation. Exp Cell Res 214:279-284.
371. Stokoe D., Engel K., Campbell D.G., Cohen P., and Gaestel M. 1992. Identification of
372. MAPKAP kinase 2 as a major enzyme responsible for the phosphorylation of the small mammalian heat shock proteins. FEBSLett 313:307-313.
373. Tyedmers J., Brunke M., Lechte M., Sandholzer U., Dierks T., Schlotterhose P.,
374. Schmidt B., and Zimmermann R. 1996. Efficient folding of firefly Iuciferase after transport into mammalian microsomes in the absence of luminal chaperones and folding catalysts. J Biol Chem 271:19509-19513.
375. Uozaki H., Horiuchi H., Ishida T., Iijima T., Imamura T., and Machinami R. 1997.
376. W.W. 1998. alpha B-crystallin and hsp25 in neonatal cardiac cells-differences in cellular localization under stress conditions. Eur J Cell Biol 75:38-45.325. van den IJssel P.R., Overkamp P., Knauf U., Gaestel M., and de Jong W.W. 1994.
377. Alpha A-crystallin confers cellular thermoresistance. FEBS Lett 355:54-56.
378. Vander Heide R.S. 2002. Increased expression of HSP27 protects canine myocytesfrom simulated ischemia-reperfiision injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol 282:H935-H941.
379. Vidair C.A. and Dewey W.C. 1986. Evaluation of a role for intracellular Na+, K+,
380. Ca2+, and Mg2+ in hyperthermic cell killing. Radiat Res 105:187-200.
381. Voges D., Zwickl P., and Baumeister W. 1999. The 26S proteasome: a molecularmachine designed for controlled proteolysis. Anrtu Rev Biochem 68:1015-1068.
382. Wagner M., Hermanns I., Bittinger F., and Kirkpatrick C.J. 1999. Induction of stressproteins in human endothelial cells by heavy metal ions and heat shock. Am J Physiol 277:L1026-L1033.
383. Wagstaff M.J., Collaco-Moraes Y., Smith J., de Belleroche J.S., Coffin R.S., and1.tchman D.S. 1999. Protection of neuronal cells from apoptosis by Hsp27 delivered with a herpes simplex virus-based vector. J Biol Chem 274:50615069.
384. Walz J., Erdmann A., Kania M., Typke D., Koster A.J., and Baumeister W. 1998. 26Sproteasome structure revealed by three-dimensional electron microscopy. J Struct Biol 121:19-29.
385. Wang P. and Bitar K.N. 1998. Rho A regulates sustained smooth muscle contractionthrough cytoskeletal reorganization of HSP27. Am J Physiol 275:G1454-G 1462.
386. Wang S. and Hazelrigg T. 1994 . Implications for bed mRNA localization from spatialdistribution of exu protein in Drosophila oogenesis. Nature 369:400-403.
387. Wang T.T., Chiang A.S., Chu J.J., Cheng T.J., Chen T.M., and Lai Y.K. 1998.
388. Concomitant alterations in distribution of 70 kDa heat shock proteins, cytoskeleton and organelles in heat shocked 9L cells. Int J Biochem Cell Biol 30:745-759.
389. Wang X.Y., Chen X., Oh H.J., Repasky E., Kazim L., and Subjeck J. 2000.
390. Characterization of native interaction of hspl 10 with hsp25 and hsc70. FEBS Lett 465:98-102.
391. Ward W.W. and Bokman S.H. 1982. Reversible denaturation of Aequorea greenfluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. Biochemistry 21:4535-4540.
392. Weber-Ban E.U., Reid B.G., Miranker A.D., and Horwich A.L. 1999. Globalunfolding of a substrate protein by the Hspl 00 chaperone ClpA. Nature 401:9093.
393. Wegrzyn R.D., Bapat K., Newnam G.P., Zink A.D., and Chernofif Y.O. 2001.
394. Mechanism of prion loss after Hspl 04 inactivation in yeast. Mol Cell Biol 21:4656-4669.
395. Welch W.J. 1985. Phorbol ester, calcium ionophore, or serum added to quiescent ratembryo fibroblast cells all result in the elevated phosphorylation of two 28,000-dalton mammalian stress proteins. J Biol Chem 260:3058-3062.
396. Westra A. and Dewey W.C. 1971 . Variation in sensitivity to heat shock during thecell-cycle of Chinese hamster cells in vitro. Int J Radial Biol Relat Stud Phys Chem Med 19:467-477.
397. Whitesell L. and Cook P. 1996 . Stable and specific binding of heat shock protein 90by geldanamycin disrupts glucocorticoid receptor function in intact cells. Mol Endocrinol 10:705-712.
398. Wiech H., Buchner J., Zimmermann R., and Jakob U. 1992. Hsp90 chaperones proteinfolding in vitro. Nature 358:169-170.
399. Wigley W.C., Fabunmi R.P., Lee M.G., Marino C.R., Muallem S., DeMartino G.N.,and Thomas P.J. 1999. Dynamic association of proteasomal machinery with the centrosome. J Cell Biol 145:481-490.
400. Will O., Mahler H.C., Arrigo A.P., and Epe B. 1999. Influence of glutathione levelsand heat-shock on the steady-state levels of oxidative DN A base modifications in mammalian cells. Carcinogenesis 20:333-337.
401. Wojcik C., Tanaka K., Paweletz N., Naab U., and Wilk S. 1998. Proteasome activator
402. PA28) subunits, alpha, beta and gamma (Ki antigen) in NT2 neuronal precursor cells and HeLa S3 cells. Eur J Cell Biol 77:151-160.
403. Wong J.W., Shi B., Farboud B., McClaren M., Shibamoto T., Cross C.E., and Isseroff
404. R.R. 2000. Ultraviolet B-mediated phosphorylation of the small heat shock protein HSP27 in human keratinocytes. J Invest Dermatol 115:427-434.
405. Xu Z., Yang S., and Zhu D. 1997. GroE assists refolding of recombinant human prourokinase. JBiochem (Tokyo) 121:331-337.
406. Yamagishi N. Nishihori H., Ishihara K., Ohtsuka K., and Hatayama T. 2000.
407. Modulation of the chaperone activities of Hsc70/Hsp40 by Hspl05alpha and Hspl05beta. Biochem Biophys Res Commun 272:850-855.
408. Yamane M., Hattori H., Sugito K., Hayashi Y., Tohnai I., Ueda M., Nishizawa K., and
409. Ohtsuka K. 1995. Cotranslocation and colocalization of hsp40 (DnaJ) with hsp70 (DnaK) in mammalian cells. Cell Struct Funct 20:157-166.
410. Yamao F. 1999. Ubiquitin system: selectivity and timing of protein destruction. J
411. Biochem (Tokyo) 125:223-229.
412. Yamboliev I.A., Hedges J.C., Mutnick J.L., Adam L.P., and Gerthoffer W.T. 2000.
413. Evidence for modulation of smooth muscle force by the p38 MAP kinase/HS P27 pathway. Am J Physiol Heart Circ Physiol 278: H1899-H1907.
414. Yang F., Moss L.G., and Phillips G.N., Jr. 1996. The molecular structure of greenfluorescent protein. Nat Biotechnol 14:1246-1251.
415. Yatsunami J., Komori A., Ohta T., Suganuma M., Yuspa S.H., and Fujiki H. 1993.
416. Hyperphosphorylation of cytokeratins by okadaic acid class tumor promoters in primary human keratinocytes. Cancer Res 53:992-996.
417. Yew P.R. 2001. Ubiquitin-mediated proteolysis of vertebrate Gl- and S-phaseregulators. J Cell Physiol 187:1-10.
418. Yoshida K., Aki T., Harada K., Shama K.M., Kamoda Y., Suzuki A., and Ohno S.1999. Translocation of HSP27 and MKBP in ischemic heart. Cell Struct Funct 24:181-185.
419. Zantema A., Verlaan D., Maasdam D., Bol S., and Van d. 1992. Heat shock protein 27and alpha B-crystallin can form a complex, which dissociates by heat shock. J Biol Chem 267:12936-12941.
420. Zhou M., Wu X., and Ginsberg H.N. 1996. Evidence that a rapidly turning overprotein, normally degraded by proteasomes, regulates hsp72 gene transcription in HepG2 cells. J Biol Chem 271:24769-24775.
421. Zhu Y., Neill S., Saklatvala J., Tassi L., and Mendelsohn M.E. 1994. Phosphorylated
422. HSP27 associates with the activation-dependent cytoskeleton in human platelets. Blood 84:3715-3723.
-
Брянцев, Антон Леонидович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2003
-
ВАК 03.00.25
- Структура и свойства малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа (hsp25)
- Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию F-актина
- Защита эндотелиальных клеток сосудов челока от повреждения при ишемии in vitro: роль белка теплового шока HSP27
- Стрессовые и провоспалительные ответы иммунных клеток: роль систем внутриклеточной сигнализации
- Изучение структурно-функциональных свойств иммуноглобулино-подобных малекулярных шаперонов
