Изучение структурно-функциональных свойств иммуноглобулино-подобных малекулярных шаперонов

Завьялов, Антон Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение структурно-функциональных свойств иммуноглобулино-подобных малекулярных шаперонов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение структурно-функциональных свойств иммуноглобулино-подобных малекулярных шаперонов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

Р Г 6 ОД

На правах рукописи / ЗАВЬЯЛОВ Антон Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ свойств ИММУНОГЛОБУЛИНО-ПОДОБНЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ШАПЕРОНОВ

(03.00.04-Бнохнмня)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-1999

Работа выполнена в Институте инженерной иммунологии Минздрава РФ

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ

Кандидат физико-математических наук И.В. Дудич. Доктор биологических наук, профессор В.П. Завьялов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор химических наук, профессор, профессор С.И. Малекин Доктор биологических наук Д.А. Долгих

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Институт молекулярной биологин им. академика В.А. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится "$£> " й-^СьС^ 2000 г. в '¿А? часов на

заседании специализированного совета по специальности Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу:! 17871, г. Москва,ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан ^СО^лУ- 1999 г.

Ученый секретарь специализированного Совета ИБХ, доктор химических наук

В.А.Несмеянов

О ,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Данная работа посвящена актуальной проблеме - исследованию взаимосвязи между структурой и функцией представителей двух суперсемейств молекулярных шаперонов -периплазматического шаперона CaflM, клонированного из бактериального возбудителя чумы, Yersinia pestis, и малого белка теплового шока, Hsp25 мыши. Изучаемые белки, несмотря на разную распространенность в природе, имеют ряд сходств как в структуре так и в выполняемых функциях. Функционально они относятся к молекулярным шаперонам, по вторичной структуре все они (3-структурные, конформация - иммуноглобулино-подобная.

Как периплазматические молекулярные шапероны так и малые белки теплового шока начали изучаться сравнительно недавно-около 15 лет назад. Несмотря на большой интерес к этим семействам белков и их интенсивное исследование, еще многое в их структуре и функциях остается не изученным. Например, не совсем понятна регуляция экспрессии периплазматических молекулярных шаперонов, не известны детали механизма связывания комплекса шаперон-субъединица с белками-швейцарами, а у малых белков теплового шока плохо изучены не только функции, но и структура. Особый интерес вызывает механизм и специфичность связывания белков шаперонами. Сравнительное изучение двух выбранных суперсемейств шаперонов является эффективным методом поиска ответа на эти вопросы.

Трудно переоценить значение изучаемых белков. Молекулярные шапероны являются белками, выполняющими жизненно важные функции во всех клеточных организмах. Они помогают формированию правильной конформации белков, сборке их в надмолекулярные структуры, транслокации полипептидных цепей через многочисленные биологические мембраны. Исследования последних лет продемонстрировали важную роль молекулярных шаперонов в развитии иммунного ответа. Более того, было высказано предположение, что внутриклеточные шапероны являются важнейшими элементами системы естественного внутриклеточного иммунитета, которая распознает, изолирует и способствует протеолитическому расщеплению неправильно свернутых или неправильно ассоциированных в результате стрессового воздействия на клетку (например, теплового шока или окислительного стресса) или генетических повреждений (например, мутаций или опухолевого перерождения клетки) собственных белков, а также чужеродных белков-продуктов

вирусной или внутриклеточной бактериальной инфекции. Периплазматические молекулярные шапероны и малые белки теплового шока могут иметь большое практическое значение в области медицины и биотехнологии, благодаря своим уникальным свойствам.

Цель и задачи исследования

Непосредственной целью данной работы явилось изучение взаимосвязи между структурой и функцией белков CaflM и Hsp25, наиболее типичных представителей двух различных семейств иммуноглобулино-подобных молекулярных шаперонов.

Основные задачи исследования:

1. Изучение структуры Cafl М с использованием методов спектроскопии.

2. Исследование функциональной роли двух основных отличительных структурных признаков CaflM-подобных периплазматических шаперонов: 1) двух консервативных остатков Cys и 2) дополнительной последовательности (FGL).

3. Исследование структурного и функционального значения межмолекулярной дисульфидной связи в Hsp25 мыши.

4. Изучение возможности применения системы белков caf оперона для повышения уровня секреции рекомбинантных белков.

Научная новизна

Новизна и приоритет результатов настоящей работы подтверждены четырьмя публикациями в международных журналах (с общим рейтингом цитируемости около 12) и одной заявкой на патент (Финляндия).

Впервые с использованием методов спектроскопии была подробно изучена структура периплазматического шаперона CaflM. Доказано существование внутримолекулярной дисульфидной связи в этом белке. Исследовано значение этой дисульфидной связи и дополнительной последовательности FGL для структуры и функции CaflM. Было обнаружено, что как дисульфидная связь так и дополнительная последовательность критичны для функционирования CaflM. Мутант CaflM Cys-»Ala, не способный образовывать дисульфидную связь, потерял способность правильно сворачиваться в периплазме и быстро деградировал. Подобный эффект наблюдался при экспрессии нативного белка в штамме Е. coli, делегированном по периплазматической

дисульфид изомеразе DsbA. В то же время, при восстановлении дисульфидной связи в нативном белке CaflM, общая структура CaflM сохранялась. Наблюдались только локальные изменения в связывающем центре. При этом происходило снижение сродства CaflM к Cafl. Из полученных данных следует вывод о важной роли остатков Cys в корректном сворачивании белка ш vivo при содействии периплазматической дисульфид изомеразы. Делегированный по последовательности FGL мутант dCaflM, напротив, сворачивался в правильную конформацию. Однако, он был функционально не активен и не связывал Cafl в эксперименте in vitro. Был сделан вывод об участии последовательности FGL в связывании Cafl.

Впервые обнаружено, что Hsp25 образует межмолекулярную дисульфидную связь in vivo в условиях окислительного стресса. С помощью ряда методов (спектроскопии, ультрацентрифугирования, гель-фильтрации, экспериментов по исследованию шаперонной активности) изучены изменения конформации и активности Hsp25, вызываемые образованием дисульфидной связи. Окисление Hsp25 было промоделировано in vitro в окислительно-восстановительных буферах глутатиона. Была определена кинетика тиол-дисульфидного обмена Hsp25 с глутатионом и предложен механизм этого процесса. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии значительных изменений в конформации белка при его окислении. Более того, не были обнаружены изменения в шаперонной активности Hsp25. Тем не менее, окисление происходило с высокой скоростью и в относительно мягких окислительных условиях. Эти данные, свидетельствуют о близком расположении реагирующих остатков Cys в олигомерной структуре Hsp25, что согласуется с обнаруженным ранее с помощью дифференциальной адиабатической сканирующей микрокалориметрии (ДАСМ) существованием стабильных димеров в олигомерной структуре белка. Более того, полученные данные позволяют локализовать контактные поверхности между субъединицами в димере. Основываясь на этих экспериментальных данных, совместно с полученными недавно результатами других исследователей, можно сделать вывод о различном способе олигомеризации малых белков теплового шока млекопитающих и бактерий.

Практическая ценность результатов работы

достигается правильное сворачивание секретируемых белков с образованием нативных изомеров дисульфидных связей и нативных изомеров пролиновых остатков. Достижение правильного сворачивания белков критично для их применения в медицине. Так, например, у 80 % пациентов при лечении рекомбинантным человеческим интерфероном а, получаемым из бактериальных телец включения, образуются аутоантитела к этому белку. Поэтому парентеральное введение рекомбинантных белков, полученных из цитоплазмы бактерий, может быть опасно для здоровья больных.

Однако, не все белки могут быть секретированы в растворимом виде в периплазму. Ярким примером является hIL-lß, который застревает во внутренней мембране. Для солюбилизации этого белка был создан фьюз ML-lß с Cafl, который при ко-экспрессии с Cafl M накапливался в растворимом виде в периплазме и детектировался моноклональными антителами к hIL-lß. Кроме того, сходным образом удалось достигнуть солюбилизации двух других, коммерчески ценных белков, hIL-lra и GM-CSF (Петровская JI., ИБХ, Москва), что позволяет сделать вывод о универсальности предложенного подхода. На основе этих результатов была подана заявка на патент в Финляндии.

Апробация работы

Материалы диссертации были представленны на:

Конференции, посвященной памяти академика A.A. Баева (Москва, 1996); Российско-американской конференции «NASA/RSA Science and Technical Advisory Council Research» (Королев, 1996);

13-ом Европейском иммунологическом конгрессе (Амстердам, Нидерланды, 1997);

8-ой ежегодной конференции BioCity (Турку, Финляндия, 1997);

3-ем Международном Конгрессе патофизиологов (Лахти, Финляндия, 1998).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 8 глав, выводов, списка сокращений и списка литературы. Она изложена на 140 страницах, содержит 47 рисунков и фотографий, 4 таблицы и 263 библиографических источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование периплазматического шаперона CaflM из Yersiniapestis

Изучение функционирования белков caf оперона Y. pestis в штаммах Е. coli, изогенных по гену дисульфидизомеразы DsbA, показало, что шаперонная активность CaflM зависит от окислительной/шаперонной активности DsbA. Исследование очищенного CaflM с применением специфичного на гиоловые группы реактива, биотин-малеимида, продемонстрировало существование внутримолекулярной дисульфидной связи в белке CaflM. При помощи твердофазного иммуноферментного анализа было показано, что восстановление дисульфидной связи влияет на способность молекулы CaflM связывать капсульную субъединицу Cafl (Kd=4.77xl0"9 для интактного белка, Kd=3.68xl0"8 для модифицированного белка). Измерения КД и флюоресценции свидетельствуют о том, что дисульфидная связь не играет принципиальной роли в сохранении общей структуры молекулы CaflM, но стабилизирует уникальную структуру связывающего центра. Цистеин 140 в последовательности CaflM расположен недалеко от инвариантного лизина 142, который, вероятно, заякоривает С-концевую карбоксильную группу капсульной субъединицы Cafl. На Рис. 1 показана молекулярная модель комплекса CaflM-Cafl. По данным, полученным с помощью флюоресцентной микроскопии и КД, после восстановления дисульфидной связи уменьшилась жесткость и асимметричность микроокружения остатков триптофана. Принимая во внимание тот факт, что в ß-участке Fl к цистеину 101 примыкает консервативный триптофан 99, можно сделать вывод об уменьшении жесткости связывающего центра после восстановления и алкилирования дисульфидной связи в СаПМ. Полученные данные свидетельствуют о влиянии дисульфидной связи на связывающую способность СаПМ. Возникает предположение, что дисульфидизомераза DsbA контролирует как сворачивание пространственной структуры периплазмагических шаперонов CaflM-подобного семейства, благодаря своей шаперонной активности, так и их связывающую способность через окисление дисульфидных связей. На Рис. 2 показана возможная схема взаимодействия белков, вовлеченных в процесс капсулообразования, а также путь передачи дисульфидной связи от мембрансвязанной дисульфидизомеразы DsbB [253] через дисульфидизомеразу DsbA к СаПМ.

г 'J

С137 у , sU

> О о У

( V" <-Лл/96

(■■

) ■

К. s

К139

Рис. 1. А. Модель пространственной структуры комплекса CaflM (серого цвета) с Cafl (зеленого цвета). Стрелками показаны ß-структурные участки. Показаны также позиции консервативных остатков Cys98 и Cysl37, характерных для FGL (CaflM-подобного) семейства, суперконсервативный Arg20, участвующий в заякоривании С-концевой карбоксильной группы Cafl и Vall26, Vall28, замена которых на аланин приводит к потере шаперонной функции CaflM. Gl-ß-структурный участок, образующий ß-зиппер с С-концевой последовательностью CaflM. AO-ß-участок в дополнительной N-концевой последовательности, FG'l и Fg"l—ß-участки в FGL последовательности. Б. СРК стерео модель части CaflM в области консервативных остатков Cys98 и Cysl37.

ЦИТОПЛАЗМА

Рис. 2. Схема, иллюстрирующая роль белков, образующих дисульфидные связи (Dsb), в образовании Cafl капсулы Y. peslis в клетках К coli. Направление переноса дисульфида показано непрерывной стрелкой, и изменения в CaflM показаны пунктирной линией. Молекулярный шаперон CaflM и капсульная субъединица Cafl секретируются в периплазму в несвернутом востановленном состоянии. Белок DsbA связывает несвернутую депь CaflM и быстро переносит его дисульфид к свернутому белку. Восстановленный DsbA реокисляегся белком DsbB, входящим в состав внутренней мембраны. Правильно свернутый и окисленный молекулярный шаперон связывает несвернутуто цепь капсульной субъединицы Cafl, обеспечивая его правильное сворачивание и предотвращая агтрегацию Cafl в периплазме. Комплекс СаПМ-СаП взаимодействует с белком внешней мембраны-молекулярным ашером Cafl А. CaflM освобождается, тогда как Cafl субъединица транспортируется через внешнюю мембрану на поверхность клетки и формирует там капсулу. Причина, по которой происходит диссоциация CaflM, в настоящее время не ясна, но можно предполагать, что восстановление CaflM белками DsbA или С присводагг к освобождению восстановленной формы CaflM, которая затем возвращается в цикл последующего реокисления.

Передача дисульфидной связи показана сплошными стрелками. Молекулярный шаперон CaflM и капсульная субъединица Cafl секретируются в периплазму в развернутом и восстановленном состоянии. Дисульфидизомераза DsbA связывает развернутую полипептидную цепь CaflM и быстро передает дисульфидную связь сворачивающемуся белку. Восстановленная дисульфидизомераза DsbA, в свою очередь, окисляется мембрансвязанной дисульфидизомеразой DsbB. Правильно свернутый и окисленный молекулярный шаперон CaflM связывает развернутую полипептидную цепь капсульной субъединицы Cafl, при этом он помогает ей правильно свернуться и предотвращает агрегацию субъединиц в периплазме.

Экспериментальные исследования с делегированным мутантом dCaflM продемонстрировали, что FGL последовательность не влияет на правильное сворачивание белка. dCaflM успешно секретировался в периплазму клеток, накапливаясь в высоких концентрациях. Изучение структуры dCaflM с помощью КД и флюоресцентной спектроскопии не выявило существенных различий в конформации и стабильности делегированного и нативного CaflM. Однако, удаление FGL последовательности вело к полному исчезновению функции шаперона, о чем свидетельствовало низкое содержание Cafl в периплазме и отсутствие капсулы на поверхности клеток Е. coli, трансформированных плазмидой, содержащей cqf оперон с мутантным геном dcaflm. Изучение чувствительности пептидной связи Lys-6-Phe-7 к расщеплению трипсином показало, что N-концевая последовательность защищена от протеолиза FGL последовательностью. N-концевая дополнительная последовательность, уникальная для CaflM-подобного семейства, в свою очередь, может быть важна для стабилизации FGL последовательности и формирования правильной топологии связывающего центра. В соответствии с построенной на основании экспериментальных данных модели CaflM FGL последовательность образует два коротких ß-участка (FG' и FG"), которые взаимодействуют с ß-участком АО, образованным N-концевой дополнительной последовательностью. При этом образуется дополнительный субдомен (Рис. 3).

CaflM-подобные шапероны участвуют в сборке простых высокополимерных поверхностных структур. Строительным блоком, образующим полимер, является димер Cafl. Как минимум, два центра необходимы для полимеризации. Субдомен, образованный FGL и N-концевой дополнительной последовательностью, может отвечать за предотвращение преждевременной полимеризации.

Рис. 3.Предсказанные модели трехмерной структуры CaflM (А) и dCaflM (Б). Модели построены на основе координат, полученных для PapD (Brookhaven Protein Data Base, идентификационный номер 3DPA). ß-участки показаны стрелками. Предсказанные ß-участки АО, FG'l и FG"1 N-концевого домена CaflM отсутствуют в PapD. В моделях CaflM и dCaflM указаны позиции Рго-104 и Ие-134, соединенные через дополнительные остатки Arg и Ser в dCaflM. Стрелками показаны пептидные связи, наиболее доступные протеолитическому расщеплению трипсином. Нумерация остатков CaflM модифицирована в соответствии с обнаруженным N-концом зрелого CaflM.

2. Исследование влияния межсубъединичной дисульфидной связи на структурные и функциональные свойства малого белка теплового шока Hsp25

Эксперименты по обработке линии раковых клеток человека МаТи окислительными реагентами показали, что при окислительном стрессе Hsp25 образует межсубъединнчную дисульфидную связь. Сравнительное исследование структуры и стабильности молекул окисленного и восстановленного Hsp25 с применением методов спектроскопии не выявило существенных различий. Гель-фильтрационная хроматография и ультраценрифугирование показали, что при образовании дисульфидной связи не происходят изменения в степени олигомеризации. Тестирование шаперонной активности также не выявило различий между окисленным и восстановленным Hsp25. Однако, дисульфидная связь влияет на чувствительность к денатурации мочевиной. Кроме этого, обнаружено различие в микроокружении остатков триптофана у redHsp25 и oxHsp25, что свидетельствует об изменениях в ядре олигомеров, образованном N-концевыми доменами субъединиц.

Анализы клеточных экстрактов с помощью иммуноблотгинга демонстрируют, что окислительный стресс ведет исключительно к образованию димера Hsp25. Поскольку образование смешанных дисульфидов Hsp25 с другими белками не происходит, можно сделать вывод о неполной доступности реагирующих -SH групп для посторонних белков.

В соответствии с результатами, полученными in vivo, рекомбинантный Hsp25 образовывал межсубъединичный дисульфид (PSSP) в окисленных буферах глутатиона ш vitro. Кинетика образования PSSP имела первый порядок по концентрации GSSG. Константа скорости образования PSSP (к1=20.1±1.4 М"'мин"', реакция второго порядка) была в 3 раза меньше, чем константа реакции GSSG с хорошо доступным цистеином с рКа 8.6. Таким образом, -SH группы в Hsp25 доступны для взаимодействия с GSSG, но при этом некие стерические препятствия и/или электростатическое отталкивание вблизи реагирующего цистеина уменьшают скорость реакции.

Окисление Hsp25 GSSG-ом сопровождается образованием межсубъединичной связи. Казалось бы, что в этом случае скорость реакции должна зависеть от концентрации белка. Однако, полученные результаты свидетельствуют об отсутствии подобной зависимости. Объяснением этого может быть то, что реагирующие цистеины находятся на некотором фиксированном расстоянии друг от друга. При этом концентрация белка не должно влиять на скорость реакции.

Образование РББР зависело от конформации белка. Нативный Нзр25, в основном, образовывал РЗБР, тогда как денатурация белка мочевиной вызывала образование смешанного дисульфида с глутатионом (РЭЗв) (Рис. 4). Температурная денатурация №р25 так же приводила к снижению окисления Нэр25 в РББР. Корреляция образования РББР и конформационных переходов молекулы №р25 свидетельствует о том, что остатки Суэ, образующие РББР, находятся рядом друг с другом только в нативной конформации и дистанция между реагирующими -БН группами изменяется с изменением третичной/четвертичной структуры молекулы.

Мочевина (М)

Рис. 4. Зависимость фракций субъединиц, образующих РББР (квадраты), РЗБО (кружки) и РЭН (треугольники вверх) после окисления восстановленного Нзр25 ОББв-ом, от концентрации мочевины в реакционном буфере.

Реакция образования дисульфидной связи между -БН группами в нековалентном димере №р25 имеет следующий вид:

РБН *~кГ РЭН

рос/-« кз

"И^РЭБР + ОБН (2),

РБН

Где РЗН/РЭН и РЗБО/РБН есть пары субъединиц, образующие нековалентный димер. Полученные данные свидетельствуют о том, что равновесие между тиоловыми и дисульфидными формами Нэр25 при физиологических концентрациях глутатиона определяется на второй стадии реакции (Ур. 2) и образование РЭЗО/РБН слабо зависит от [вЗБв]. Действительно, суммарная фракция субъединиц, образующая смешанные и межсубъединичные БЗ-связи, изменилась только в 2 раза при изменении Я в 500 раз. Примечательно, что одновременное образование смешанного дисульфида с обеими -БЫ группами субъединиц димера (РвЗО/РвБО) не происходит. Восстановленный №р25 образует РЭЭР дасульфид даже при концентрации ОББв в 2000 раз превышающей концентрацию субъединиц Нзр25.

На основании полученных результатов можно предположить, что реагирующие -БН группы остатков цистеина в димерном Нвр25 находятся на достаточно близком расстоянии для образования межмолекулярной дисульфидной связи. После реакции одной из этих -БН групп с молекулой вББО стерические препятствия и электростатическое отталкивание затрудняют проникновение в реакционный ценр другой окисленной или восстановленной молекулы глутатиона. Таким образом, реакция другой молекулы БЭЭС со второй -БН группой не происходит. Влияние стерических и электростатических препятствий в результате образования смешанного дисульфида на тиол/дисульфидный обмен проиллюстрировано на Рис. 5.

FSH PSH PSSG FSH PS SP

""""■■■m™1^"—т* Смшаяы! двульфнД Межвубьадцишйдисудфяд

12 3

Рис. 5. Предполагаемое влияние стерических и электростатических препятствий в результате образования смешаного дисульфида на тиол/дисульфидный обмен. Две субъединицы, образующие димер, показаны черным цветом. Отрицательный суммарный заряд молекулы глутатиона при физиологических значениях pH показан символом 0.

Основные изменения в окислительном статусе Hsp25 происходят в окислительно-восстановительных буферах глутатиона с R ниже 50, что соответствует состоянию клеточного окислительно-восстановительных буфера глутатиона при окислительном стрессе. Интересно, что sHsps выполняют свои функции при различных стрессовых условиях, включая окислительный стресс. После индукции стресса, sHsps могут достигать 1% от общего клеточного белка. Принимая во внимание этот факт, изменения в окислительном состоянии Hsp25 при окислительном стрессе могут играть физиологическую роль. Не исключено, что олигомер sHsps, образующий смешанные дисульфиды с молекулами глутатиона, может функционировать как буфер локальной концентрации восстановленного глутатиона путем выделения молекул GSH при образовании межмолекулярной дисульфидной связи. Интересно, что таким образом sHsps могут защищать частично денатурированные белки, которые они связывают, не только от их неспецифической агрегации, но и от окисления. Образование димерного дисульфида также может бьггь способом регуляции таких функций как ингибирование полимеризации актина, которая основана на активности мономера sHsps. Недавно было обнаружено существование прямой зависимости между внутриклеточным уровнем глутатиона и структурной организацией человеческого Hsp27. Не исключено, что образование смешанного дисульфида с глутатионом может вызывать эти изменения.

3. Изучения возможности использования caf оперона для повышения уровня секреции рекомбинантных белков

Секреторный механизм caf оперона У. pestis был использован для секреции человеческого интерлейкина-lß (hIL-lß) в Е. coli. Были сконструированы три варианта генетических конструкций фьюзов сигнального пептида Cafl и зрелого hIL-lß: 1) фьюз "стык в стык" s pCafl-hIL-1 ß, в котором последняя аминокислота Cafl сигнального пептида соединялась с первой аминокислотой hIL-lß; 2) такой же фьюз, но с мутацией в облати сигнального пептида, Asn(-2)->Asp (s р Cafl (-2)-hIL-1 ß) и 3) фьюз, содержащий в месте соединения три N-концевых аминокислоты зрелого Cafl для сохранения природного сайта расщепления (spCafl(+3AA)-hIL-lß). Наблюдалась высокая продукция всех трех белковых фьюзов (около 20-30% от всего белка клетки). Белковый фьюз "стык в стык" не процессировался, тогда как в оптимальных условиях

процессировалось более 60% двух других фьюзов. Однако при этом подавляющее количество белка накапливалось в нерастворимой форме [Рис. 5, дорожка 5, (белок * р СаЯ(-2)-ЫЬ-1|$ в качестве примера)]. Вариации температуры роста и концентрации индуктора не приводили к существенному повышению процессинга и секреции белка в растворимой форме. Лишь минорное количество зрелого белка было обнаружено в растворимой форме в периплазме [Рис. 5, дорожка 2, (белок зрСаП(-2)-ЫЬ-1(3 в качестве примера)].

t>P

cfcf ¿fcTcf cfc?

«М» . _____

f *

■ф " "Ш ■■ ~~ " *-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

- -+-- + -- + CaflM Т Т Т

Рис. 6. Обработка клеток с проницаемой внешней мембраной трипсином. Иммуноблот фракции нерастворимых белков клеток Е. coli JM105, экспрессирующих'рСаП(-2)-ЫЬ-1р (дорожки 5,8), CIC (дорожки 6, 9), CIC и CaflM (дорожки 7,10) до обработки (дорожки 5, 6, 7) и после обработки (дорожки 8, 9, 10) трипсином анализировался с использованием поликлональных антител к hIL-lß. hIL-lß нанесен в качестве контрольного маркера (дорожка 1). На дорожки 2, 3, 4 были нанесены периплазматические фракции клеток Е. coli JM105, экспрессирующих ,pCafl(-2>hlL-lß; CIC; CIC и CaflM, соответственно, для сравнения уровней hIL-lß-содержащих белков.

Варьирование температуры роста и концентрации индуктора не приводило к существенному усилению процессинга и возрастанию концентрации растворимого hlL-lß. Однако, процессинг зависел от типа культуральной среды. Поскольку процессированный белок расщеплялся трипсином в клетках с проницаемой внешней

мембраной (Рис. 5, дорожки 5 и 8), был сделан вывод о том, что процессированный фьюз каким-то образом застревает на /во внутренней мембране.

Для преодоления этой проблемы был сконструирован фьюз !рСаП(-2)-ЫЬ-1Р-СаП (С1С), комбинирующий сигнальный пептид СаП с мутацией Азп(-2)->Азр, зрелые ЫИр и СаП. Только минорное количество С1С экстрагировалось из клеток осмотическим шоком (Рис. 5, дорожка 3). Также как и !рСаП(-2)-ЫЬ-1Р, С1С расщеплялся трипсином в клетках с проницаемой внешней мембраной (Рис. 5, дорожки 6 и 9). Секвенирование М-конца растворимого в периплазме С1С продемонстрировало точное отщепление сигнального пептида. Ко-экспрессия С1С с белками са/ оперона, СаПМ и СаПА, осуществлялась в двух системах: а) СаПМ и/или СаПА экспрессировались с плазмиды, родственной рАСУС, а С1С экспрессировался с совместимой плазмиды, родственной рТгс99, в) СаПМ и/или СаПА и С1С экспрессировались с соответствующих генов, составляющих единый оперон. В обоих системах при ко-экспрессии С1С с СаПМ примерно в 10 раз возрастала концентрация растворимого в периплазме зрелого С1С (Рис. 5, дорожки .3 и 4). Полученные результаты свидетельствуют о том, что периплазматический молекулярный шаперон способствует экстракции секретируемого белка с поверхности внутренней мембраны, защищает его от деградации и неспецифической агрегации.

Тестирование на содержание С1С в культуральной жидкости (КЖ) клеток, трансформированных плазмидами, экспрессирующими С1С, СаПМ и СаПА, не выявило повышенного уровня С1С. Наоборот, в КЖ этих клеток попадало значительно меньше С1С, чем в КЖ клеток, экспрессирующих только С1С без СаПМ, что свидетельствует о предотвращении лизиса клеток в результате связывания С1С шапероном. С1С также не эскрецировался на поверхность клеток - клетки не агглютинировали эритроциты с иммобилизованными моноклональными антителами к СаП. По-видимому, присутствие гетерологичного белка во фыозе препятствует его секреции на поверхность клетки. Для решения этой проблемы необходимы дополнительные исследования. Тем не менее, облегченная секреция в периплазму клеток, при ко-экспрессии с периплазматическим шапероном, представляет заманчивую перспективу для широкого внедрения этого метода при конструировании штаммов-продуцентов, секретирующих в периплазму гетерологичные белки.

Выводы

1. По данным КД Cafl М является типичным ß-структурным белком. Молекула СаП М имеет сходную с иммуноглобулинами стабильность, характеризующуюся температурой плавления Td=63±l°C и pH денатурации pHd=2.5-3.0.

2. Два консервативных остатка Cys в молекуле СаПМ образуют дисульфидную связь. Эта дисульфидная связь влияет на локальные конформационные свойства белка, однако, при ее восстановлении не меняется общая конформация молекулы и практически не меняется ее стабильность. Восстановление дисульфидной связи ш vitro ведет к снижению сродства СаПМ к СаП, но при этом не элиминирует связывание полностью. Несмотря на то, что эти данные свидетельствуют об отсутствии изменений в структуре и функции СаПМ при восстановлении дисульфидной связи in vitro, мутант СаП М Cys —>А1а не способен сворачиваться в правильную конформацию и быстро деградирует in vivo. Более того, нативный СаПМ практически не накапливается в периплазме клеток, делегированных по дисульфид изомеразе DsbA. Таким образом, можно заключить, что дисульфидная связь/остатки Cys в молекуле СаПМ имеет/ют существенное значение для процесса сворачивания СаПМ in vivo.

3. Последовательность FGL не существенна для поддержания основной конформации СаПМ. Делетированный по последовательность FGL белок накапливается в высоких концентрациях в периплазме клеток. Однако, этот мутант теряет функцию. Логично предположить, что последовательность FGL участвует в функционально важном взаимодействии с молекулами cal оперона.

4. Hsp25 образует межмолекулярную дисульфидную связь in vivo при условиях окислительного стресса. Образование этой дисульфидной связи не ведет к существенным изменениям в структуре Hsp25 и не меняет его шаперонную активность. Окисление Hsp25 in vitro происходит в результате реакции тиол/дисульфидного обмена с глутатионом. Кинетика реакции характеризуется константой скорости второго порядка к=20.1±1.4 М'1 мин"'. Окисление Hsp25 наблюдается уже в достаточно восстановленных окислительно-восстановительных буферах глутатиона. Реагирующие остатки Cys в олигомерной структуре Hsp25 находятся рядом, что подтверждает данные о существовании димеров в олигомере Hsp25 и говорит о симметричном расположении молекул внутри димера.

5. Сигнальный пептид Cafl (Asn->Asp) направляет HL-Iß в секреторные каналы внутренней мембраны Е. coli. Несмотря на правильное отщепление сигнального пептида, ML-lß обнаруживался во фракции нерастворимых белков. Химерный белок, HL-lß, содержащий на N-конце аминокислотной последовательности сигнальный пептид Cafl и на С-конце последовательность зрелого Cafl, также в большей степени ассоциирован с мембранной фракцией. Однако, при ко-эспрессии с CaflM значительное количество белка обнаруживается в периплазме в растворимом виде. Аналогичные результаты были получены с химерными белками, hIL-lra и GM-CSF, слитыми с Cafl (Петровская JI., ИБХ, Москва). Данные экспериментов показывают, что CaflM учавствует в процессе экстракции этих химерных белков с периплазматической поверхности внутренней мембраны клеток, способствует их правильному сворачиванию и предотвращает их протеолитичекую деградацию.

В выполнении данных исследований большую помощь оказали сотрудники отдела молекулярной иммунологии Института инженерной иммунологии, Совместной российско-финской биотехнологической лаборатории (JBL) университета г. Турку, Финляндия, в которых работал автор, а также сотрудники ряда других лабораторий, которые принимали участие в совместных исследованиях на отдельных этапах работы. Автор выражает искреннюю признательность Т.В. Черновской и A.M. Васильеву за предоставление образцов нативного и мутантных форм CaflM, участие в исследовании их функций, Н.В. Батчиковой за обучение методам генной инженерии и сотрудничество в работах по изучению секреции гетерологичных белков с помощью caf оперона. Л.Е. Петровской за участие в совместных исследованиях по использованию caf оперона для секреции гетерологичных белков. Автор благодарит профессора М. Гестела за предоставление образцов рекомбинантного Hsp25 мыши и участие в подготовке совместных исследований для публикаций, Ш. Макинтайр за предоставление плазмид, содержащих гены нативного и мутантного CaflM, Т. Корпела за обсуждение результатов исследований и участие в подготовке статей и заявке на патент. Автор выражает особую признательность И.В. Дудичу за обучение методам спектроскопии и научное руководство диссертационной работой.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Zav'yalov V.P., Chernovskaya T.V., Chapman D.A.G., Kariyshev A.V., Maclntyre S., Zavialov A. V.. Vasiliev A.M., Denesyuk A.I., Zav'yalova G.A., Dudich I.V., Korpela T., Abramov V.M. "Influence of the conserved disulphide bond, exposed to the putative binding pocket, on the structure and function of the immunoglobulin-like molecular chaperone, CaflM, of yersiniapestis", Biochemical Journal v. 324, pp. 571-578, (1997).

2. Zavialov A.V.. Gaestel M., Benndorf R., Zav'yalov V.P., Dudich I.V., Zav'yalova G.A., "Study of an influence of the intersubunit disulphide bond on the structural and functional properties of a molecular chaperone, murine small heat shock protein HSP25", International Journal of Biological Macromolecules, v. 22, pp. 163-173, (1998).

3 Zavialov A.V.. Gaestel M., Korpela T. and Zav'yalov V.P. "Thiol/disulfide exchange between small shock protein 25 and glutathione", Biochimica et Biophysica Acta v. 1388, pp. 123-132,(1998)

4 Chapman D.A., Zavialov A.V.. Chemovskaya T.V., Kariyshev A.V., Zav'yalova G.A., Vasiliev A.M., Dudich I.V., Abramov V.M., Zav'yalov V.P., Maclntyre S. "Structural and functional significance of the FGL sequence of the periplasmic chaperone CaflM of Yersinia pestis.", Journal of Bacteriology, v. 181, pp. 2422-2429,(1999).

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Завьялов, Антон Владимирович

Список сокращений.

Введение.

Часть первая. Обзор литературы.

Глава 1. Молекулярные шапероны.

Глава 2. Структура и функции иммуноглобулин-подобных периплазматических молекулярных шаперонов.

2.1. Функции периплазматических молекулярных шаперонов.

2.2. Первичная и вторичная структуры.

2.3. Трехмерная структура.

Глава 3. Структура и функции а-кристаллин-подобных иммуноглобулин-подобных) малых белков теплового шока.

3.1. Общая характеристика малых белков теплового шока.

3.1.1. Введение.

3.1.2. Семейство зНзрэ.

3.1.3. Экспрессия и регуляция эНзрэ.

3.1.4. Структурные особенности БНзрэ.

3.1.4.1. а-Кристаллин-подобный домен.

3.1.4.2. Вторичная и третичная структуры вНврэ.

3.1.4.3. Четвертичная структура.

3.1.5. Динамическое равновесие и распределение комплексов зНврв в клетках.

3.1.6. Фосфорилирование.

3.1.6.1. Фосфорилируемые остатки.

3.1.6.2. Стимулы.

3.1.6.3. Ферменты и пути метаболизма.

3.2. Функциональные аспекты эНзрз.

3.2.1. зНврв вовлечены в защиту клеток.

3.2.1.1. Термо- и химо-защитная функции.

3.2.1.2. Механизм защиты.

3.2.2. Роль эИзрв в заболеваниях.

3.2.3. БНврэ — молекулярные шапероны.

3.2.3.1. Шаперонная функция в общем.

3.2.3.2. зНэрэ взаимодействуют с денатурированным белком.

3.2.3.3. Субстрат-связывающий центр.

3.2.3.4. эЬ^рв в контексте клеточного шаперонного механизма.

Часть вторая. Собственные результаты.

Глава 1. Материалы и методы.

Глава 2. Результаты исследований влияния консервативной дисульфидной связи, экспонированной в предполагаемом связывающем центре, на структуру и функции иммуноглобулин-подобного периплазматического молекулярного шаперона

CaflM из Yersinia pestis.

Глава 3. Результаты исследования структурного и функционального значения FGL последовательности периплазматического шаперона CaflM из Yersinia pestis.

Глава 4. Обсуждение результатов исследования периплазматического шаперона CaflM из Yersinia pestis.

Глава 5. Результаты исследования эффекта межсубъединичной дисульфидной связи на структурные и функциональные свойства малого белка теплового шока Hsp25.

Глава 6. Результаты исследования тиол/дисульфидного обмена между малым белком теплового шока Hsp25 и глутатионом.

Глава 7. Обсуждение результатов исследования эффекта межсубъединичной дисульфидной связи на структурные и функциональные свойства малого белка теплового шока

Hsp25.

Глава 8. Результаты изучения возможности использования cafl оперона для повышения уровня секреции рекомбинантных белков.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение структурно-функциональных свойств иммуноглобулино-подобных малекулярных шаперонов"

Актуальность проблемы

Данная работа посвящена актуальной проблеме - исследованию взаимосвязи между структурой и функцией представителей двух обширных суперсемейств молекулярных шаперонов - периплазматического шаперона CaflM, клонированного из бактериального возбудителя чумы, Yersinia pestis, и малого белка теплового шока Hsp25 мыши. Изучаемые белки, несмотря на разную распространенность в природе, имеют ряд сходств как в структуре так и в выполняемых функциях. Функционально они относятся к молекулярным шаперонам, по вторичной структуре все они Р-структурные, конформация - иммуноглобулино-подобная.

Как периплазматические молекулярные шапероны так и малые белки теплового шока начали изучаться сравнительно недавно-около 15 лет назад. Несмотря на большой интерес к этим семействам белков и их интенсивное исследование с использованием современных методов, еще многое в их структуре и функциях остается не изученным. Например, не совсем понятна регуляция экспрессии периплазматических молекулярных шаперонов, не известны детали механизма связывания комплекса шаперон-субъединица с белками-швейцарами, а у малых белков теплового шока плохо изучены не только функции, но и структура. Особый интерес вызывает механизм и специфичность связывания белков шаперонами: что собственно узнают шапероны в структуре связываемых белков?

Трудно переоценить значение изучаемых белков. Молекулярные шапероны являются белками, выполняющими жизненно важные функции во всех клеточных организмах. Они помогают формированию правильной конформации белков, сборке их в надмолекулярные структуры, транслокации полипептидных цепей через многочисленные биологические мембраны. Исследования последних лет продемонстрировали важную роль молекулярных шаперонов в развитии иммунного ответа. Более того, было высказано предположение, что внутримолекулярные шапероны являются важнейшими элементами системы естественного внутриклеточного иммунитета, которая распознает, изолирует и способствует протеолитическому расщеплению неправильно свернутых или неправильно ассоциированных в результате стрессового воздействия на клетку (например, теплового шока) или генетических повреждений (например, мутаций или опухолевого перерождения клетки) собственных белков, а также чужеродных белков-продуктов вирусной или внутриклеточной бактериальной инфекции. Периплазматические молекулярные шапероны и малые белки теплового шока могут иметь огромное практическое значение в области медицины и биотехнологии, благодаря своим уникальным свойствам.

Научная новизна

Новизна и приоритет результатов настоящей работы подтверждены четырьмя публикациями в международных журналах (с общим рейтингом цитируемое™ около 12) и одной заявкой на патент (Финляндия).

Впервые с использованием методов спектроскопии была подробно изучена структура периплазматического шаперона CaflM. Доказано существование внутримолекулярной дисульфидной связи в молекуле этого белка. Исследовано значение этой дисульфидной связи и характерной для CaflM-подобного семейства шаперонов дополнительной последовательности FGL для структуры и функций CaflM. Было обнаружено, что как дисульфидная связь так и дополнительная последовательность критичны для функционирования CaflM. Мутант CaflM Cys—>А1а, не способный образовывать дисульфидную связь, потерял способность правильно сворачиваться в периплазме и быстро деградировал. Подобный эффект наблюдался при экспрессии нативного белка в штамме Е. coli, делетированном по периплазматической дисульфид изомеразе DsbA. В то же время, при восстановлении дисульфидной связи в нативном белке CaflM общая структура CaflM сохранялась. Наблюдались только локальные изменения в связывающем центре. При этом происходило снижение сродства CaflM к Cafl. Из полученных данных следует вывод о важной роли остатков Cys в корректном сворачивании белка in vivo при содействии периплазматической дисульфид изомеразы. Делетированный по последовательности FGL мутант dCaflM, напротив, сворачивался в правильную конформацию. Однако, он был функционально не активен и не связывал Cafl в эксперименте in vitro. Был сделан вывод об участии последовательности FGL в связывании Cafl.

Впервые обнаружено, что Hsp25 образует межмолекулярную дисульфидную связь in vivo в условиях окислительного стресса. С помощью ряда методов (спектроскопии, ультрацентрифугирования, гель-фильтрации, экспериментов по исследованию шаперонной активности) изучены изменения конформации и активности Hsp25, вызываемые образованием дисульфидной связи. Окисление Hsp25 было промоделировано in vitro в окислительно-восстановительных буферах глутатиона. Была определена кинетика тиол-дисульфидного обмена Hsp25 с глутатионом и предложен механизм этого процесса. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии значительных изменений в конформации белка при его окислении. Более того, не были обнаружены изменения в шаперонной активности Hsp25. Тем не менее, окисление происходило с высокой скоростью и в относительно мягких окислительных условиях. Эти данные свидетельствуют о близком расположении реагирующих остатков Cys в олигомерной структуре Hsp25, что согласуется с обнаруженным ранее с помощью ДАСМ существованием стабильных димеров в олигомерной структуре белка. Более того, полученные данные позволяют локализовать контактные поверхности между субъединицами в димере. Основываясь на этих экспериментальных данных, совместно с полученными недавно результатами других исследователей, можно сделать вывод о различном способе олигомеризации малых белков теплового шока млекопитающих и бактерий.

Практическая ценность результатов работы

Оперон caf впервые был использован для солюбилизации секретируемых в периплазму рекомбинантных белков. Секреция рекомбинантных белков в периплазму дает большие преимущества. Например, существенно облегчается дальнейшая очистка белков, достигается правильное сворачивание секретируемых белков с образованием нативных изомеров дисульфидных связей и нативных изомеров пролиновых остатков. Достижение правильного сворачивания белков критично для их применения в медицине. Так, например, у 80 % пациентов при лечении рекомбинантным человеческим интерфероном а, получаемым из бактериальных телец включения, образуются аутоантитела к этому белку. Поэтому парентеральное введение рекомбинантных белков, полученных из цитоплазмы бактерий, может быть опасно для здоровья больных.

Однако, не все белки могут быть секретированы в растворимом виде в периплазму. Ярким примером является hIL-l[3, который застревает во внутренней мембране. Для солюбилизации этого белка был создан фьюз hIL-ip с Cafl, который при ко-экспрессии с CaflM накапливался в растворимом виде в периплазме и детектировался моноклональными антителами к hIL-l(3. Кроме того, сходным образом, удалось достигнуть солюбилизации двух других, коммерчески ценных белков, hlL-lra и GM-CSF, что позволяет сделать вывод о универсальности предложенного подхода. На основе этих результатов была подана заявка на патент в Финляндии.

Цель и задачи исследования

Непосредственной целью данной работы явилось изучение взаимосвязи структурных свойств и функций белков CaflM и Hsp25, характерных представителей двух различных семейств молекулярных шаперонов, обладающих рядом сходств как в структуре, так и в функциях.

Основные задачи исследования:

1. Изучение структуры CaflM с использованием методов спектроскопии.

3. Исследование структурного и функционального значения межмолекулярной дисульфидной связи в Hsp25 мыши.

Положения выносимые на защиту

1. CaflM является типичным p-структурным белком. Стабильность молекулы характеризуется температурой плавления Td=63±l°C и рН денатурации pHd=2.5-3.0.

2. Два консервативных остатка Cys в молекуле CaflM образуют дисульфидную связь. Эта дисульфидная связь имеет значение для поддержания локальной структуры белка, однако, при ее восстановлении не меняется общая конформация молекулы и практически не меняется ее стабильность. Восстановление дисульфидной связи in vitro ведет к снижению сродства CaflM к Cafl, но при этом не элиминирует связывание полностью. Дисульфидная связь/остатки Cys в молекуле CaflM имеет/ют значение для процесса сворачивания CaflM in vivo.

3. Последовательность FGL не влияет на общую конформацию CaflM, но важна для его функции.

4. Hsp25 образует межмолекулярную дисульфидную связь in vivo при условиях окислительного стресса. Образование этой дисульфидной связи не ведет к существенным изменениям в структуре Hsp25 и не меняет его шаперонную активность. Окисление Hsp25 происходит in vitro в результате реакции тиол/дисульфидного обмена с глутатионом. Кинетика реакции характеризуется константой скорости второго порядка к=20.1±1.4 М"1 мин"1. Окисление Hsp25 наблюдается уже в достаточно восстановленных окислительно-восстановительных буферах глутатиона. Реагирующие остатки Cys в олигомерной структуре Hsp25 находятся рядом, что соответствует данным о существовании димеров в олигомере Hsp25 и свидетельствует о симметричном расположении молекул внутри димера.

5. CaflM способствует процессу секреции в периплазму (в растворимом виде) рекомбинантных белков, содержащих на N-конце аминокислотной последовательности сигнальный пептид Cafl и на С-конце - последовательность зрелого Cafl.

В выполнении данных исследований большую помощь оказали сотрудники отдела молекулярной иммунологии Института инженерной иммунологии, Совместной российско-финской биотехнологической лаборатории (JBL) университета г. Турку, Финляндия, в которых работал автор, а также сотрудники ряда других лабораторий, которые принимали участие в совместных исследованиях на отдельных этапах работы. Автор выражает искреннюю признательность Т.В. Черновской и A.M. Васильеву за предоставление образцов нативного и мутантных форм CaflM, участие в исследовании их функций, Н.В. Батчиковой за обучение методам генной инженерии и сотрудничество в работах по изучению секреции гетерологичных белков с помощью caf оперона^ JLE. Петровской за' участие в совместных исследованиях по использованию caf оперона для секреции гетерологичных белков. Автор благодарит профессора М. Гестела за предоставление образцов рекомбинантного Hsp25 мыши и участие в подготовке совместных исследований для публикаций, Ш. Макинтайр за предоставление плазмид, содержащих гены нативного и мутантного CaflM, Т. Корпела за обсуждение результатов исследований и участие в подготовке статей и заявке на патент. Автор выражает особую признательность И.В. Дудичу за обучение методам спектроскопии и научное руководство диссертационной работой.

ЧАСТЬ ПЕРВАЯ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Завьялов, Антон Владимирович

выводы

1. По данным КД CaflM является типичным (З-структурным белком. Молекула CaflM имеет сходную с иммуноглобулинами стабильность, характеризующуюся температурой плавления Та=63±1°С и рН денатурации pHd=2.5-3.0.

2. Два консервативных остатка Cys в молекуле CaflM образуют дисульфидную связь. Эта дисульфидная связь влияет на локальные конформационные свойства белка, однако, при ее восстановлении не меняется общая конформация молекулы и практически не меняется ее стабильность. Восстановление дисульфидной связи in vitro ведет к снижению сродства CaflM к Cafl, но при этом не элиминирует связывание полностью. Несмотря на то, что эти данные свидетельствуют об отсутствии изменений в структуре и функции CaflM при восстановлении дисульфидной связи in vitro, мутант Cafl М Cys —»Ala не способен сворачиваться в правильную конформацию и быстро деградирует in vivo. Более того, нативный CaflM практически не накапливается в периплазме клеток, делегированных по дисульфид изомеразе DsbA. Таким образом, можно заключить, что дисульфидная связь/остатки Cys в молекуле CaflM имеет/ют существенное значение для процесса сворачивания CaflM in vivo.

3. Последовательность FGL не существенна для поддержания основной конформации CaflM. Делетированный по последовательность FGL белок накапливается в высоких концентрациях в периплазме клеток. Однако, этот мутант теряет функцию. Логично предположить, что последовательность FGL участвует в функционально важном взаимодействии с молекулами caf оперона.

4. Hsp25 образует межмолекулярную дисульфидную связь in vivo при условиях окислительного стресса. Образование этой дисульфидной связи не ведет к существенным изменениям в структуре Hsp25 и не меняет его шаперонную активность. Окисление Hsp25 in vitro происходит в результате реакции тиол/дисульфидного обмена с глутатионом. Кинетика реакции характеризуется константой скорости второго порядка к=20.1±1.4 М"1 мин"1. Окисление Hsp25 наблюдается уже в достаточно восстановленных окислительно-восстановительных буферах глутатиона. Реагирующие остатки Cys в олигомерной структуре Hsp25 находятся рядом, что подтверждает данные о существовании димеров в олигомере Нэр25 и говорит о симметричном расположении молекул внутри димера.

5. Сигнальный пептид СаП (Азп->Аэр) направляет ЫЬ-1(5 в секреторные каналы внутренней мембраны Е. соП. Несмотря на правильное отщепление сигнального пептида, ЫЬ-1(3 обнаруживался во фракции нерастворимых белков. Химерный белок, содержащий на И-конце аминокислотной последовательности сигнальный пептид СаП и на С-конце последовательность зрелого СаП, также в большей степени ассоциирован с мембранной фракцией. Однако, при ко-эспрессии с СаПМ значительное количество белка обнаруживается в периплазме в растворимом виде. Аналогичные результаты были получены с химерными белками, ЫЬ-1га и ОМ-СЭР, слитыми с СаП. Данные экспериментов показывают, что СаПМ учавствует в процессе экстракции этих химерных белков с периплазматической поверхности внутренней мембраны клеток, способствует их правильному сворачиванию и предотвращает их протеолитичекую деградацию.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Завьялов, Антон Владимирович, Москва

1. Ellis, R. J., The general concept of molecular chaperones, Philos Trans R Soc LondBBiol Sci. 29;339(1289):251-61 (1993).

2. Saibil H, Dong Z, Wood S, auf der Mauer A. Binding of chaperonins Nature, 353:25-26(1991).

3. Roseman, A., Chen, S., White, H., Braig, K., and Saibil, H., The chaperonin ATPase cycle: mechanism of allosteric switching and movements of substrate-binding domains in GroEL., Cell, 87: 241 (1996).

4. Shtilerman, M., Lorimer, G., and Eglander, W., Chaperonin function: folding by forced unfolding, Science, 284:822-825 (1999).

5. Jacob-Dubuisson, F. M., Kuehn, M. and Hultgren, S., A novel secretion apparatus for the assembly of adhesive bacterial pili, Trends Microbiol. 1, 50 (1993).

6. Mooi, F. R., Wouters, C.,Wijfjes A and de Graaf, F. K., Construction and characterization of mutants impaired in the biosynthesis of the K88ab antigen, J. Bacteriol. 150:512-521 (1982).

7. Holmgren, A., Kuehn, M., Branden, C.-I. and Hultgren, S., Conserved immunoglobulin-like features in a family of periplasmic pilus chaperones in bacteria, EMBOJ. //.1617-1622(1992).

8. Kuehn, J., Jacob-Dubuisson F., Dodson, K., Slonim, L., Striker and Hultgren, S., Genetic, biochemical, and structural studies of biogenesis of adhesive pili in bacteria, Methods Enzymol., 236:282-306 (1994).

9. Jones, H., Danese, P., Pinkner, J., Silhavy, T. and Hultgren, S., The chaperone-assisted membrane release and folding pathway is sensed by two signal transduction systems, EMBOJ., /6:6394-6406(1997).

10. Soto, G., Dodson, K., D. Ogg, Liu, C., Heuser, J., Knight, S., Kihlberg, J., Y. Jones and Hultgren S., Periplasmic chaperone recognition motif of subunits mediates quaternary interactions in the pilus, EMBOJ., /7:6155-6167(1998).

11. Kuehn, J., Ogg, D., Kihlberg, J., Slonim, L., Flemmer, K., Bergfors, T. and Hultgren, S., Structural basis of pilus subunit recognition by the PapD chaperone, Science, 262:1234-1240(1993).

12. Dodson, K., Jacob-Dubuisson, F., Striker, R. and Hultgren,S., Outer-membrane PapC molecular usher discriminately recognizes periplasmic chaperone-pilus subunit complexes, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 15;90(8):3670-3674 (1993).

13. Saulino, E., Thanassi, D, Pinkner, J. and Hultgren, S., Ramifications of kinetic partitioning on usher-mediated pilus biogenesis, EMBO J., /7:2177-2185 (1998).

14. Hung, D., Knight, S., Woods, Pinker, J. and Hultgren, S., Molecular basis of two subfamilies of immunoglobulin-like chaperones, EMBOJ. /5:3792-3805 (1996).

15. Holmgren, A. and Branden, C.-I., Crystal structure of chaperone protein PapD reveals an immunoglobulin fold, Nature 342:248-251 (1989).

16. Ryu, S., Kwong, P. D., Truneh, A., Porter, T. G., Arthos, J., Rosenberg, M., Dai, X., Xuong, N, Axel, R., Sweet, R. W. and Hendrickson, W. A., Crystal structure of an HIV-binding recombinant fragment of human CD4, Nature, 348:419-425 (1990).

17. Slonim, L., Picner, J., Branden, C.-I. and Hultgren, S., Interactive surface in the PapD chaperone cleft is conserved in pilus chaperone superfamily and essential in subunit recognition and assembly, EMBOJ. 17:4747-4750 (1992).

18. Normark S., in Microbial Lectins and Agglutinins: Poperties and Biological Activity, D. Mirelman, Ed. (Wiley, New York), pp. 113-143 (1986).

19. Kuehn, M., Ogg, D., Kihlberg, J., Slonim, L., Flemmer, K., Bergfors, T., Hultgren, S., Structural basis of pilus subunit recognition by the PapD chaperone, Science262:1234-1240(1993).

20. Jakob, U. and Buchner, J. Assisting spontaneity: The role of Hsp90 and small Hsps as molecular chaperones, Trends Biochem. Sci. 19:205 (1994).

21. Welch, W. J., Phorbol ester, calcium ionophore or serum added to quiescent rat embryo fibroblast cells all result in the elevated phosphorylation of two 28,000- dalton mammalian stress proteins, J. Biol. Chem. 260:3058 (1985).

22. Landry, J., Chretien, P., Lambert, H. Hickey. E., and Weber, L. A., Heat shock resistance conferred by expression of the human HSP27 gene in rodent cells, J. Cell Biol. 109:1 (1989).

23. Klemenz, R., Frohli, E., Steiger. R. H., Schafer, R., and Aoyama, A., aB-crystallin is a small heat shock protein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3652 (1991).

24. Klemenz, R., Andres, A. C., Frohli, E., Schafer, R., and Aoyama, A., Expression of the murine small heat shock protein hsp25 and aB-crystallin in the absence of stress J. Cell Biol. 120:639 (1993).

25. Inaguma, Y., Shinohara. H., Goto. S. and Kato, K., Translocation and induction of aB-crystallin by heat shock in rat glioma (GA-1) cells. Bioclrem. Biophys. Res. Commun. 182:844(1992).

26. Chiesa, R., McDermott, M. J., Mann, E., and Spector, A. The apparent molecular size of native a-crystallin B in non-lenticular tissues, FEBS Lett. 268:222 (1990).

27. Behlke, J., Lutsch, G., Gaestel, M., and Bielka, H., Supramolecular structure of the recombinant murine small heat shock protein hsp25, FEBS Lett. 288:119 (1991)

28. Lee, G. J., Pokala, N., and Vierling, E. Structure and in vitro molecular chaperone activity of cytosolic small heat shock proteins from pea, J. Biol. Chem. 270:10432 (1995).

29. Arrigo, A.-P., Suhan, J. P., and Welch, W. J., Dynamic changes in the structure and intracellular locale of the mammalian low-molecular-weight heat shock protein, Mol. Cell. Biol. 8:5059 (1988).

30. Collier, N. C., Heuser, J., Levy, M. A., and Schlesinger, M. J., Ultrastructural and biochemical analysis of the stress granules in chicken embryo fibroblasts, J. Cell Biol. 70(5:1131 (1988).

31. Nover, L., Scharf, K. D., and Neumann, D., Cytoplasmic heat shock granules are formed from precursor particles and are associated with a specific set of mRNAs, Mol. Cell. Biol. 9:1298 (1989).

32. Kato, K., Hasegawa, K., Goto, S., and Y. Inaguma, Dissociation as a result of phosphorylation of an aggregated form of the small stress protein, hsp27, J. Biol. Chem. 269:11274 (1994).

33. Mehlen, P. and Arrigo, A.-P., The serum-induced phosphorylation of mammalian hsp27 correlates with changes in its intracellular localization and levels of oligomerization, Eur. J. Biochem. 221:321 (1994).

34. Bhat, S. P. and Nagineni, C. N., aB Subunit of lens-specific protein a-crystallin is present in other ocular and non-ocular tissues, Biochem. Biophys. Res. Commun. 755:319 (1989).

35. Bond, U. and Schlesinger, M. J., Heat-shock proteins and development, Adv. Genet. 24:1-29 (1987).

36. Gaestel, M., Gross, B., Benndorf, R. et ai., Molecular cloning, sequencing and expression in Escherichia coli of the 25-kDa growth-related protein of Ehrlich ascites tumor and its homology to mammalian stress proteins, Eur. J. Biochem. 779:209 (1989).

37. Crete, P. and Landry, J., Induction of HSP27 phosphorylation and thermoresistance in Chinese hamster cells by arsenite, cycloheximide, A23187, and EGTA, Radiat. Res. 727:320 (1990).

38. Pauli, D., Tonka, C. H., Tissieres, A., and Arrigo, A.-P., Tissue-specific expression of the heat shock protein HSP27 during Drosophila melanogaster development, J. Cell Biol. 777:817(1990).

39. Ciocca, D. R., Oesterreich, S., Chamness, G. C., McGuire, W. L., and Fuqua, S, A. W., Biological and clinical implications of heat shock protein 27,000 (Hsp27): A review, J. Natl. Cancer Inst. 55:1558 (1993).

40. Gernold, M., Knauf, U., Gaestel, M., Stahl, J., and Kloetzel, P. M., Development and tissue-specific distribution of mouse small heat shock protein hsp25, Dev. Genet. 14:103 (1993).

41. Arrigo, A.-P. and Landry, J., Expression and function of the low-molecular-weight heat shock proteins, The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones (R. I. Morimoto, ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 1994. p. 335.

42. Waters, E. R., Lee, J. L., and Vierling. E., Evolution, structure and function of the small heat shock proteins in plants, J. Exp. Bot. 47:325 (1996).

43. Tissieres, A., Mitchell, H. K., and Tracy, U. M., Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: Relation to chromosome puffs, J. Mol. Biol 84:389 (1974).

44. Buchner, J. Supervising the fold: Functional principles of molecular chaperones, FASEBJ. 10:10 (1996).

45. Knauf, U., Bielka, H., and Gaestel, M., Over-expression of the small heat shock protein hsp25 inhibits growth of Ehrlich ascites tumor cells, FEBS Lett. 309:2911992).

46. Voorter, C. E., de Haard-Hoekman, W., Merck. K. B., Bloemendal, H., and de long. W. W. Elastase inhibition by the C-terminal domains of a-crystallin and small heat-shock protein, Biochim. Biophys. Acta 1204:43 (1994).

47. Miron, T., Vancompernolle. K., Vandekerckhove. J., Wilchek, M., and Cieiger, B., A 25-kD inhibitor of actin polymerization is a low molecular mass heat shock protein. J. Cell Biol. 114:255 (1991).

48. Lavoie, J. N., Hickey, E., Weber, L. A., and Landry, J., Modulation of actin microfilament dynamics and fluid phase pinocytosis by phosphorylation of shock protein 27, J. Biol. Chem. 268:24210 (1993).

49. Lavoie, J. N., Gingras-Breton, G., Tanguay, R. M., and Landry, J., Induction of Chinese hamster HSP27 gene expression in mouse cells confers resistance to heat shock. HSP27 stabilization of the microfilament organization, J. Biol. Chem. 268:34201993).

50. Nicholl, I. D. and Quinlan, R. A., Chaperone activity of a-crystallins modulates intermediate filament assembly, EMBOJ. 13:945 (1994).

51. Mehlen, P., Schulze-OsthofF, K., and Arrigo, A.-P., Small stress proteins as novel regulators of apoptosis. Heat shock protein 27 blocks Fas/APO-1- and staurosporine-induced cell death, J. Biol. Chem. 277.16510 (1996).

52. Horwitz, J., a-Crystallin can function as a molecular chaperone, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10449(1992).

53. Jakob, U., Gaestel, M., Engel, K., and Buchner, J., Small heat shock proteins are molecular chaperones, J. Biol. Chem. 268.1517 (1993).

54. Lindquist, S. and Craig, E. A., The heat-shock proteins, Annu. Rev. Genet. 22:631 (1988).

55. Vierling, E., The role of heat shock proteins in plants, An mi. Rev. Plant Physiol. Plant Biol. 42:579 (1991).

56. Wotton, D., Freeman, K., and Shore, D., Multimerization of Hsp42p, a novel heat shock protein of Saccharomyces cerevisiae, is dependent on a conserved carboxyl-terminal sequence, J. Biol. Chem. 271:2111 (1996).

57. Kato, K., Goto, S., Inaguma, Y., Hasegawa, K., Morishita, R., and Asano, T., Purification and characterization of a 20-kDa protein that is highly homologous to aB crystallin, J. Biol. Chem. 269:15302 (1994).

58. Allen, S. P., Polazzi, J. O., Gierse, J. K., and Easton, A. M., Two novel heat shock genes encoding proteins produced in response to heterologous protein expression in Escherichia coli, J. Bacteriol. 174:6938 (1992).

59. Chuang, S. E., Burland, V., Plunkett, G., Daniels, D. L., and Blattner, F. R., Sequence analysis of four new heat-shock genes constituting the hslTS/ibpAB and h.slVU operons in Escherichia coli, Gene 134:1 (1993).

60. Lenne, C. and Douce, R., A low molecular weight heat-shock protein is localized to higher plant mitochondria, Plant Phy.siol. 105:1255 (1994).

61. Waters, E. R., The molecular evolution of the small heat-shock proteins in plants, Genetics 141:185 (1995).

62. Plesofsky-Vig, N. and Brambl, R., Gene sequence and analysis of hsp30, a small heat shock protein of Neurospora crassa which associates with mitochondria, J. Biol. Chem. 265:15432 (1990).

63. Beaulieu, J.-F., Arrigo, A.-P., and Tanguay, R. M., Interaction of Drosophila 27 000 M, heat-shock protein with the nucleus of heat-shocked and ecdysone-stimulated culture cells, J. Cell Sci. 92:29 (1989).

64. Zav'yalov, V. P., Zav'yalova, G. A., Denesyuk, A. I., Gaestel, M., and Korpela, T., Structural and functional homology between periplasmic bacterial molecular chaperones and small heat shock proteins, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 11:265 (1995).

65. Caspers, G. J., Leunissen, J. A., and de-Jong, W. W., The expanding small heat -shock protein family, and structure predictions of the conserved a-crystallin domain, J. Mol. Evol. 40:238 (1995).

66. Lee, D. C., Kim, R. Y., and Wistow, G. J., An avian aB-crystallin. Non-lens expression and sequence similarities with both small (HSP27) and large (HSP70) heat shock proteins, J. Mol. Biol. 232:1221 (1993).

67. Petko, L. and Lindquist, S., Hsp26 is not required for growth at high temperatures, nor for thermotolerance, spore development, or germination, Cell 45:885 (1986).

68. Rahman, D. R., Bentley, N. J., and Tuite, M. F., The Saccharomyces serevisiae small heat shock protein Hsp26 inhibits actin polymerisation, Biochem. Soc. Trans. 23:11 (1995).

69. Orlandi, I., Cavadini, P., Popolo, L., and Vai, M., Cloning, sequencing and regulation of a cDNA encoding a small heat-shock protein from Schizosaccharomyces pombe. Biochim. Biophys. Acta 1307:129 (1996).

70. Jang, Y. J., Park, S. K., and Yoo, H. S., Isolation of an HSP12-homologous gene of Schizosaccharomyces pombe suppressing a temperature-sensitive mutant allele of cdc4, Gene 172:125 (1996).

71. Wheeler, J. C. Bieschke. E. T., and Tower, J. Muscle-specific expression of Drosophila hsp70 in response to aging and oxidative stress. Proc. Narl. Acad. Sci. USA 92:10408 (1995).

72. Sandaltzopoulos, R., Mitchelmore. C., Bonte, E., Wall, G.and Becker, P. B., Dual regulation of the Drosophila hsp26 promoter in vitro. Nucleic Acids Res. 23/2479 (1995).

73. Groenen, P. J. T. A., Merck, K. B. de Jong, W. W., and Bloemendal, H., Structure and modifications of the junior chaperone a-crystallin: From lens transparency to molecular pathology, Eur. J. Biochem. 225: 1 (1994).

74. Gaestel, M., Schroder. W., Benndorf, R., Lippmann, C., Buchner, K., Hucho, F, Erdmann, V. A., and Bielka, H., Identification of the phosphorylation sites of murine small heat shock protein hsp25, J. Biol. Chem. 266:14721 (1991).

75. Gaestel, M., Gotthardt. R., and Muller. T., Structure and organisation of a murine gene encoding small heat-shock protein hsp25, Gene 128:219 ( 1993).

76. Ehrnsperger, M., Graber. S., Gaestel, M., and Buchner, J., Binding of nonnative protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation, EMBOJ. 15;16(2):22\-9. (1997).

77. Helm, K. W., LaFayette. P. R, Nagao, R. T., Key, J. L. and Vierling, E., Localization of small heat shock proteins to the higher plant endomembrane system, Mol. Cell. Biol. 13:238 (1993).

78. Helm, K. W., Schmeits, J., and Vierling, E. An endomembrane-localized small heat-shock protein from Arabidopsis thaliana, Plant Physiol. 107:287 (1995).

79. Lee, G. J., Roseman, A. M., Saibil, H. R., and Vierling, E., A small heat shock protein stably binds heat-denatured model substrates and can maintain a substrate in a folding competent state, EMBO J. 16(3):659-11 (1997).

80. Lenne, C., Block, M. A., Garin. J., and Douce, R., Sequence and expression of the mRNA encoding HSP22, the mitochondrial small heat-shock protein in pea leaves, Biochem. J. 577:805 (1995).

81. LaFayette, P. R., Nagao, R. T., O'Grady, K., Vierling, E., and Key, J. L., Molecular characterization of cDNAs encoding low-molecular-weight heat shock proteins of soybean, Plant. Mol. Biol. 30:159 (1996).

82. Chen, Q. and Vierling, E., Analysis of conserved domains identifies a unique structural feature of a chloroplast heat shock protein, Mol. Gen. Genet. 226:425 (1991).

83. Kato, K., Shinohara, H., Kurobe, N., Goto, S., Inaguma, Y., and Ohshima, K., Immunoreactive aA crystallin in rat non-lenticular tissues detected with a sensitive immunoassay method, Biochim. Biophys. Acta 7050:173 (1991).

84. Landry, J., Chretien, P. Laszlo, A., and Lambert, H. Phosphorylation of HSP27 during development and decay of thermotolerance in Chinese hamster cells, J. Cell Physiol. 147:93 (1991).

85. Hickey, E., Brandon, S. E., Potter. R., Stein. G., Stein. J. and Weher, L. A., Sequence and organization of genes encoding the human 27 kDa heat shock protein, Nucleic Acids Res. 14:4121 (1986).

86. Klemenz, R., Frohli, E., Aoyama, A., Hoffmann, S., Simpson, R. J., Moritz, R. L., and Schafer, R, aB crystallin accumulation is a specific response to Ha-ras and v-mos oncogene expression in mouse NIH 3T3 fibroblasts, Mol. Cell. Biol. 77:803 (1991).

87. DasGupta, S., Hohman, T. C., and Carper, D., Hypertonic stress induces aB-crystallin, Exp. Eye Res. 54:461 (1992).

88. Frohli, E., Aoyama, A., and Klemenz, R., Cloning of the mouse hsp25 gene and an extremely conserved hsp25 pseudogene, Gene 128:213 (1993).

89. Edington, B. V. and Hightower, L. E., Induction of a chicken small heat shock (stress) protein: Evidence of multilevel posttranscriptional regulation, Mol. Cell. Biol. 70:4886 (1990).

90. Gotthardt, R, Neininger, A., and Gaestel, M., The anti-cancer drug cisplatin induces H25 in Ehrlich ascites tumor cells by a mechanism different from transcriptional stimulation influencing predominantly H25 translation, Int. J. Cancer 66:190 (1996).

91. Edwards, D. P., Adams, D. J., Savage, N., and McGuire, W. L., Estrogen induced synthesis of specific proteins in human breast cancer cells, Biochem. Biophys. Res. Commun. P3:804 (1980).

92. Fuqua, S. A., Blum-Salingaros, M., and McGuire, W. L., Induction of the estrogen- regulated "24K" protein by heat shock, Cancer Res. 49:4126 (1989).

93. Ciocca, D. R, Adams, D. J., Edwards, D. P., Bjercke, R. J., and McGuire, W. I., Estrogen-induced 24K protein in MCF-7 breast cancer cells is localized in granules, Breast Cancer Res. Treat. 4:261(1984).

94. Mendelsohn, M. E., Zhu, Y., and O'Neill, S., The 29-kDa proteins phosphorylated in thrombin-activated human platelets are forms of the estrogen receptor-related 27-kDa heat shock protein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:11212 (1991).

95. Ciocca, D. R. and Luque, E. H., Immunological evidence for the identity between the hsp27 estrogen-regulated heat shock protein and the p29 estrogen receptor-associated protein in breast and endometrial cancer, Breast Cancer Res. Trear. 20:33 (1991).

96. Tora, L., Gaub, M. P., Mader, S., Dierich, A., Bellard. M., and Chambon, P., Cell-specific activity of a GGTCA half-palindromic oestrogen-responsive element in the chicken ovalbumin gene promoter, EMBOJ. 7:3771 (1988).

97. Ciocca, D. R, Stati, A. O., Fanelli, M. A., and Gaestel, M., Expression of heat shock protein 25,000 in rat uterus during pregnancy and pseudopregnancy, Biol. Reprod. 54:1326 (1996).

98. Thomas, S. R. and Lengyel, J. A., Ecdysteroid-regulated heat-shock gene expression during Drosophila melanogaster development, Dev. Biol. 115:434 (1986).

99. Cohen, R. S. and Meselson, M., Separate regulatory elements for the heat-inducible and ovarian expression of the Drosophila hsp26 gene, Cell 43:131 (1985).

100. Hoffman, E. and Corces, V., Sequences involved in temperature and ecdysteron induced transcription are located in separate regions of a Drosophila melangaster heat shock gene, Mol. Cell. Biol. 6:663 (1986).

101. Ito, H., Hasegawa, K., Inaguma, Y., Kozawa, O., and Kato, K. Enhancemen of stress-induced synthesis of hsp27 and otB crystallin by modulators of the arachidonic acid cascade, J. Cell Physiol. 166:332 (1996).

102. Head, M. W., Corbin. E., and Goldman, J. E., Coordinate and independent regulation of aB-crystallin and HSP27 expression in response to physiological stress, J. Cell. Physiol 759:41 (1994).

103. Wistow, G. J., Domain structure and evolution in a-crystallins and small heat-shock proteins, FEBS Lett. 181:1 (1985).

104. Carver, J. A., Aquilina, J. A., Truscott, R. J. W., and Ralston. G. B., Identification by 'H NMR spectroscopy of flexible C-terminal extensions in bovine lens a-crystallin, FEBS Lett. 377:143 (1992).

105. Carver, J. A., Esposito, G., Schwedersky, G., and Gaestel, M. *HNMR spectroscopy reveals that mouse Hsp25 has a flexible C-terminal extension of 18 amino acids, FEBS Lett. 369:305 (1995).

106. Takemoto, L., Emmons, T., and Horwitz, J., The C-terminal region of a-crystallin: Involvement in protection against heat induced denaturation, Biochem. J. 294:435 (1993).

107. Merck, K. B., Horwitz, J., Kersten, M., Overkamp, P., Gaestel, M., Bloemendal, H., and de Jong, W. W., Comparison of the homologous carboxy-terminal domain and tail of a-crystallin and small heat shock proteins, Mol. Biol. Rep. 75:209 (1993).

108. Wistow, G., Possible tetramer-based quaternary structure for a-crystallins and small heat shock proteins, Exp. Eye Res. 56:129 (1993).

109. Le Breton, E. R. and Carver, J. A., Solution conformation of bovine lens a- and PB2-crystallin terminal extensions, Int. J. Pept. Protein Res. 47:9 (1996).

110. Ifeanyi, F. and Takemoto, L., Differential binding of a-crystallins to bovine lens membrane, Exp. Eye Res. 49:143 (1989).

111. Ifeanyi, F. and Takemoto, L., Involvement of the N-terminal region in a-crystallin lens membrane recognition, Exp. Eye Res. 53:305 (1991).

112. Cenedella, R. J. and Chandrasekher, G., High capacity binding of a-crystallins to various bovine lens membrane preparations, Curr. Eye Res. J2:1025 (1993).

113. Maiti, M., Kono, M., and Chakrabarti, B., Heat-induced changes in the conformation of a- and P-crystallins: Unique thermal stability of a-crystallin. FEBS Lett. 236:109(1988).

114. Walsh, M. T., Sen, A. C., and Chakrabarti, B., Micellar subunit assembly in a three-layer model of oligomeric a-crystallin, J. Biol Chem. 266:20019 (1991).

115. Surewicz, W. K. and Olesen, P. R, On the thermal stability of a-crystallin: A new insight from infrared spectroscopy, Biochemistry 34:9655 (1995).

116. Gesierich, U. and Pfeil, W., The conformational stability of a-crystallin is rather low: Calorirnetric results, FEBS Lett. 393:151 (1996).

117. Kono, M., Sen, A. C., and Chakrabarti, B., Thermodynamics of thermal and a thermal denaturation of y-crystallins: Changes in conformational stability upon glutathion reduction, Biochemistry 29:464 (1990).

118. Santini, S. A., Mordente, A., Meucci, E., Miggiano, G. A. D., and Martorana, G. E., Conformational stability of bovine a-crystallin. Evidence for a destabilizing effect of ascorbate, Biochem. J. 287:107 (1992).

119. Siezen, R. J. and Argos, P., Structural homology of lens crystallins. III. Secondary structure estimation from circular dichroism and prediction from amino acid sequences, Biochim. Biophys. Acta 748:56 (1983).

120. Surewicz, W. K., Mantsch, H. H., and Chapman, D., Determination of protein secondary structure by Fourier transform infrared spectroscopy: A critical assessment, Biochemistry 32:389 (1993).

121. Siezen, R. J., Reflections on the internal primary, secondary and tertiary structure homology of the eye lens proteins a-, 0-, and y-crystallin, FEBS Lett 133:1 (1981).

122. Argos, P. and Siezen, R. J., Structural homology of lens crystallins. A method to detect protein structural similarity from primary sequences, Eur. J. Biochem., 131:143 (1983).

123. Holmgren, A. and Branden, C.-I., Crystal structure of chaperone protein PapD reveals an immunoglobulin fold, Nature 342:248 (1989).

124. Holmgren, A., Kuehn, M. J., Branden, C.-I., and Hultgren, S. J., Conserved immunoglobulin-like features in a family of periplasmatic pilus chaperones in bacteria, EMBOJ. /7:1617(1992).

125. Dudich, I. V., Zav'yalov, V. P., Pfeil, W., Gaestel, M., Zav'yalova, G. A., Denesyuk, A. I., and Korpela, T., Dimer structure as a minimum cooperative subunit of small heat-shock proteins, Biochim. Biophys. Acta 1253:163 (1995).

126. Kim K., Kim R., Kim S.-H., Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature 394:595-599(1998)

127. Tardieu, A., Laporte, D., Licinio, P., Kropp, B. and Delaye, M., Calf lens a-crystallin quaternary structure: A three-layer tetrahedral model, J. Mol. Biol. 192:711 (1986).

128. Andreasi-Bassi, F., Arcovito, G., De Spirito, M. and Mordente, A., Self-similarity properties of a-crystallin supramolecular aggregates, Biophys. J. 69:2720 (1995).

129. Spector, A., Li, L.-K., Augusteyn, R. C., Schneider. A., and Freund, T., a-Crystallin. The isolation and characterization of distinct macromolecular fractions, Biochem. J. 124:337 (1971).

130. Clauwaert, J., Ellerton, H. D., Koretz, J. F., Thomson, K. and Augusteyn, R. C. The effect of temperature on the renaturation of a-crystallin, Curr. Eye Res. 8:397 (1989).

131. Bindels, J. G., Siezen, R. J., and Hoenders, H. J. A model for the architecture of a-crystallin, OpthalmicRes. 77:441 (1979).

132. Siezen, R. J., Coenders, F. G., and Hoenders. H. J., Three classes of sulphydryl group in bovine a-crystallin according to reactivity to various reagents, Biochim. Biophys. Acta 537:456 (1978).

133. Siezen, R. J., Bindels, J. G. and Hoenders, H. J., The quaternary structure of am-crystallin. Effects of variation in alkaline pH, ionic strength, temperature and calcium ion concentration, Eur. J. Biochem. 111:435 (1980).

134. Thomson, J. A. and Augusteyn, R. C., aCrystallin: The native form of the protein Exp. Eye Res. 37:361 (1983).

135. Thomson, J. A. and Augusteyn, R. C., On the structure of a-crystallin. The reversibility of urea dissociation, J. Biol. Chem. 259:4339 (1984).

136. Thomson, J. A .A modelfor multisubunit protein assemblies, PhD Dissertation, University of Melbourne, 1985.

137. Augusteyn, R. C., Hum, T. P., Putilin, T. P., and Thomson, J. A., The location of sulphydryl groups in a-crystallin, Biochim. Biophys. Acta 915:132 (1987).

138. Augusteyn, R. C. and Koretz, J. F., A possible structure for a-crystallin, FEBS Lett. 222:1 (1987).

139. Chen, Q., Osteryoung, K., and Vierling, E., A 21-kDa chloroplast heat shock protein assembles into high molecular weight complexes in vivo and in organelle, J. Biol. Chem. 269:13216(1994).

140. Arrigo, A.-P. and Pauli, D., Characterization of HSP27 and three immunologically related polypeptides during Drosophila development, Exp. Cell. Res. 175:169 (1988).

141. Longoni, S., Lattonen, S., Bullock, G., and Chiesi, M., Cardiac a-crystallin. II. Intracellular localization, Mol. Cell. Biol. 97:121 (1990).

142. Zantema, A., Verlaan-De Vries, M., Maasdam, D., Bol, S., and van der Eb, A., Heat shock protein 27 and aB-crystallin can form a complex, which dissociates by heat shock, J. Biol. Chem. 267:12936 (1992).

143. Kato, K., Shinohara, H., Goto, S., Inaguma, Y., Morishita, R., and Asano, T., Copurification of small heat shock protein with aB crystallin from human skeletal muscle, J. Biol. Chem. 267:1118 (1992).

144. Rossi, J. M. and Lindquist, S., The intracellular location of yeast heat shock protein 26 varies with metabolism, J. Cell. Biol. /05:425 (1989).

145. Arrigo, A.-P., Cellular localization of hsp23 during Drosophila development and following subsequent heat shock, Dev. Biol. 122:39 (1987).

146. Bentley, N. J., Fitch, I. T., and Tuite, M. F., The small heat-shock protein Hsp26 of Saccharomyces cerevisiae assembles into a high molecular weight aggregate, Yeast8:95 (1992).

147. Osteryoung, K. W. and Vierling, E., Dynamics of small heat shock protein distribution within the chloroplasts of higher plants, J. Biol. Chem. 269:28616 (1994).

148. Voorter, C. E., Mulders, J. W., Bloemendal, H., and de Jong, W. W., Some aspects of the phosphorylation of a-crystallin A, Eur. J. Biochem. 160:203 (1986).

149. Chiesa, R., Gawinowicz-Kolks, M. A., Kleiman, N. J., and Spector, A., The phosphorylation sites of the B2 chain of bovine a-crystallin, Biochem. Biophys. Res. Commun. 144:1340 (1987).

150. Kim, Y. J., Shuman J., Sette, M., and Przybyla, A., Nuclear localization and phosphorylation of three 25-kilodalton rat stress proteins, Mol. Cell. Biol. 4:468 (1984).

151. Benndorf, R., Kraft, R., Otto, A., Stahl, J., Bohm, H., and Bielka, H., Purification of the growth-related protein p25 of the Ehrlich ascites tumor and analysis of its isoforms, Biochem. Int. 77:225 (1988).

152. Voorter, C. E., de Haard-Hoekman, W. A., Roersma, E. S., Meyer, H. E., Bloemendal, H., and de Jong, W. W., The in vivo phosphorylation sites of bovine aB-crystallin, FEBSLett. 259:50 (1989).

153. Mann, E., McDermott, M. J., Goldman, J., Chiesa, R., and Spector, A., Phosphorylation of a-crystallin B in Alexander's disease brain, FEBSLett. 294:133 (1991)

154. Chiesa, R., McDermott, M. J., and Spector, A., Differential synthesis and phosphopylation of the a-crystallin A- and B-chains during bovine lens fiber cell differetiation, Curr, Eye Res. 8:151 (1989).

155. Chiesa, R. and Spector, A., The dephosphorylation of lens a-crystallin A chain, Biochem. Biophys. Res. Commun. 162:1494 (1989).

156. Saklatvala, J., Kaur, P., and Guesdon, F., Phosphorylation of the small heat-shock protein is regulated by interleukin-1, tumor necrosis factor, growth factors, bradykinin and ATP, Biochem. J. 277:635 (1991).

157. Zhou, M. Lambert, H., and Landry, J., Transient activation of a distinct serine protein kinase is responsible for 27-kDa heat shock protein phosphorylation in mitogen-stimulated and heat-shocked cells, J. Biol. Chem. 268:35 (1993).

158. Kaur, P., Welch, W. J., and Saklatvala, J., Interleukin 1 and tumour necrosis factor increase phosphorylation of the small heat shock protein. Effects in fibroblasts, Hep G2 and U937 cells, FEBS Lett. 258:269 (1989).

159. Arrigo, A.-P., Tumor necrosis factor a induces the rapid phosphorylation of the mammalian low molecular weight heat shock protien hsp28, Mol. Cell. Biol. 10:1216 (1990).

160. Oesterreich, S., Benndorf, R., and Bielka, H., The expression of the growth-related 25kDa protein (p25) of Ehrlich ascites tumor cells is increased by hyperthermic treatment (heat shock), Biomed. Biochim. Acta 49:219 (1990).

161. Spector, N. L., Ryan, C., Samson, W., Levine. H., Nadler, L. M., and Arrigo, A.-P., Heat shock protien is a unique marker of growth arrest during macrophage differentiation of HL-60 cells, J. Cell. Physiol. 156:6X9 (1993).

162. Minowada, G. and Welch, W., Variation in the expression and/or phosphorylation of the human low moleculhr weight stress protein during in vitro cell differentiauon, J. Biol. Chem. 270:7047(1995).

163. Spector, A., Chiesa, R., Sredy, J., and Garner, W., cAMP-dependent phosphorylation of bovine lens a-crystallin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 52:4712 (1985).

164. Kantorow, M. and Piatigorsky, J., a-Crystallin/small heat shock protein has autokinase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3112 (1994).

165. Stokoe, D., Engel, K., Campbell, D. G., Cohen, P., and Gaestel, M., Identification of MAPKAP kinase 2 as a major enzyme responsible for the phosphorylation of the small mammalian heat shock proteins, FEBS Lett. 313:301 (1992).

166. Stokoe, D., Caudwell, В., Cohen, P. Т., and Cohen, P., The substrate specificity and structure of mitogen-activated protein (MAP) kinase-activated protein kinase-2. Biochem. J. 296:843 (1993).

167. Ludwig, S., Engel, K, Hoftmeyer, A., Sithanandam, G., Palm, D., Gaestel, M., and Rapp, U., 3pK, a novel MAP kinase activated protein kinase is targeted by three MAP kinase pathways, Mol. Cell. Biol. 16(12):66%1-91 (in press, 1996).

168. Freshney, N. W., Rawlinson, L., Guesdon, F., Jones, E., Cowley, S., Hsuan, J., and Saklatvala, J., Interleukin-1 activates a novel protein kinase cascade that resulis in the phosphorylation of Hsp27, Cell 75:1039 (1994).

169. Ben-Levy, R., Leighton, I. A., Doza, Y. N., Attwood, P., Morrice, N. Marshall, C J., and Cohen, P., Identification of novel phosphorylation sites required for activation of MAPKAP kinase 2, EMBOJ. 14:5920 (1995).

170. Kyriakis, J. M. and Avruch, J, Protein kinase cascades activated by stress and inflammatory cytokines, BioEssqys 18:561 (1996).

171. Gaestel, M., Benndorf, R., Hayess, K., Priemer, E., and Engel, K, Dephosphorylation of the small heat shock protein hsp25 by calcium/calmodulin-dependent (type 2B) protein phosphatase, J. Biol. Chem. 267:2X601 (1992).

172. Rollet, E., Lavoie. J. N., Landry, J., and Tanguay, R. M., Expression of Drosophila's 27 kDa heat shock protein into rodent cells confers thermal resistance, Biochein. Biophys. Res. Coirvnun. 185:116 (1992).

173. DeRocher, A. E., Helm, K. W., Lauzon, L. M., and Vierling, E., Expression of a conserved family of cytoplasmic low molecular weight heat shock proteins during heat stress and recovery, Plant Physiol. 96:1038 (1991).

174. DeRocher, A. E. and Vierling, E., Developmental control of small heat shock protein expression during pea seed maturation, Plant J. 5:93 (1994).

175. Susek, R. E. and Lindquist, S. L., hsp26 of Saccharomyces cerevisiae is related to the superfamily of small heat shock proteins but is without a demonstrable function, Mol. Cell. biol. 9:5265 (1989).

176. Hout, J., Houle, F., Spitz, D. R., and Landry, J., HSP27 phosphorylation-mediated resistance against actin fragmentation and cell death induced by oxidative stress, Cancer Res. 56:213 (1996).

177. Oesterreich, S., Weng, C. N., Qiu, M., Hilsenbeck, S. G., Osborne, C. K., and Fuqua, S. A., The small heat shock protein hsp27 is correlated with growth and drug resistance in human breast cancer cell lines, Cancer Res. 53:4443 (1993).

178. Jaenicke, R. and Creighton, T. E., Junior chaperones, Curr. Biol. 3: 234 (1993).

179. Zhu, Y., O'Neill. S., Saklatvala, J., Tassi, L., and Mendelsohn, M. E., Phosphory lated HSP27 associates with the activation-dependent cytoskeleton in human platelets, Blood84:3115 (1994).

180. Kampinga, H. H., Brunsting, J. F., Stege, G. J. J., Konings, A. W. T., and Landry. J., Cells overexpressing Hsp27 show accelerated recovery from heat-induced nuclear protein aggregation, Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:1170 (1994).

181. Stege, G. J. J., Brunsting, J. F., Kampinga, H. H., and Konings, A. W. T., Thermotolerance and nuclear protein aggregation: Protection against initial damage or better recovery? J. Cell. Physiol. 164:519 (1995).

182. Stahl, J., Wobus, A. M., Ihrig, S., Lutsch, G., and Bielka, H., The small heat shock protein hsp25 is accumulated in P 19 embryonal carcinoma cells and embryonic stem cells of line BLC6 during differentiation, Differentiation 51:33 (1992).

183. Zantema, A., de Jong, E., Lardenoije, R., and van der Eb, A. J., The expression of heat shock protein hsp27 and a complexed 22-kilodalton protein is inversely correlated with oncogenicity of adenovirus-transformed cells, J. Virol. 63:3368 (1989).

184. Love, S. and King, R.-J., A 27 kDa heat shock protein that has anomalous prognostic powers in early and advanced breast cancer, Br. J. Cancer 69:143 (1994).

185. Strahler, J. R., Kuick, R., and Hanash, S. M., Diminished phosphorylation of a heat shock protein (HSP 27) in infant acute lymphoblastic leukemia, Biochem. Biophys. Res. Commun. 175:134 (1991).

186. Ciocca, D. R., Fuqua, S. A. W., Lock-Lim, S., Toft, D. O., Welch, W. J., and McGuire, W. L., Response of human breast cancer cells to heat shock and chemotherapeutic drugs, Cancer Res. 52:3648 (1992).

187. Hightower, L. E., Heat shock, stress proteins, chaperones, and proteotoxicity, Cell 66:191 (1991).

188. Hightower, L. E., Cultured animal cells exposed to amino acid analogues or purumycin rapidly synthesize several polypeptides, J. Cell. Physiol. 102:401 (1980).

189. Ananthan, J., Goldberg, A. L., and Voellmy, R., Abnormal proteins serve as eukaryotic stress signals and trigger the activation of heat shock genes, Science 232:522 (1986).

190. Jinn, T. L., Yeh, Y. C., Chen, Y. M., and Lin; C. Y., Stabilization of soluble proteins in vitro by heat shock proteins-enriched ammonium sulfate fraction from soybean seedlings, Plant Cell Physiol 30:463 (1989).

191. Rao, P. V., Horwitz, J., and Zigler, Jr., J. S., Chaperone-like activity of a-crystallin. The effect of NADPH on its interaction with zeta-crystallin, J. Biol Chem. 269:13266 (1994).

192. Wang, K. and Spector, A., a-Crystallin can act as a chaperone under conditions of oxidative stress, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36:311 (1995).

193. Farahbakhsh, Z. T., Huang, Q.-L., Ding, I ,-L., Altenhach. C., Steinhoff, H.-J., Horwitz, J., and Hubbell, W. f., Interaction of a-crystallin with spin-labeled peptides, Biochemistry 34:509 (1995).

194. Das, K. P., Petrash, J. M., and Surewicz, W. K., Conformational properties of substrate proteins bound to a molecular chaperone a-crystallin. J. Biol Chem. 277:10449(1996).

195. Carver, J. A., Guerreiro, N., Nicholls, K. A., and Truscott, R. J. W., On the interaction of a-crystallin with unfolded protein, Biochim. Biophys. Acta 7252:251 (1995).

196. Ganea, E. and Harding, 1. J., Molecular chaperones protect against glycation-induced inactivation of glucose-6-phosphate dehydrogenase, Eur. J. Biochem. 231:181 (1995).

197. Ganea, E. and Harding, J. J., Inhibition of 6-phosphogluconate dehydrogenase by carbamylation and protection by a-crystallin, a chaperone-like protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 222:626 (1996).

198. Raman, B. and Rao, C. M., Chaperone-like activity and quaternary structure of a-crystallin,./. Biol. Chem. 269:21264 (1994).

199. Hook, D. W. and Harding, J. J., a-Crystallin acting as a molecular chaperone protects catalase against steroid-induced inactivation, FEBSlett. 382:281 (1996).

200. Raman, B., Ramakrishna, T., and Rao, C. M., Rapid refolding studies on the chaperone-like a-crystallin. Effect of a-crystallin on refolding of 0- and y-crystallins, J. Biol. Chem. 270:19888 (1995).

201. Smulders, R. H. P. H, Merck, K. B., Aendekerk, J., Horwitz, J., Takemoto, L, Slingsby, C., Bloemendal, H., and de Jong, W. W., The mutation Asp69->Ser affects the chaperone-like activity of a A-crystallin, Eur. J. Biochem. 252:834 (1995).

202. Bardwell, J. C. A., Building bridges: disulphide bond formation in the cell, Mol. Microbiol. J4:199-205 (1994).

203. Maniatis, T., Fritsch, E. F. and Stambrook, J., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).

204. Laemmli U. K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 (1970) 680-685.Laurell, C. B. Anal. Biochem. 10:358361 (1965)

205. Murray, J. S. and Brown, J. C., Measurement of association constants in ELISA. Reactions between solid-phase antibody and fluid-phase biotinylated antigen, Immunol. Methods 127:25-28 (1990)

206. Ito, K, Bassford, J. and Beckwith, J., Protein localization in E. coli: is there a common step in the secretion of periplasmic and outer-membrane proteins?, Cell 24:707-717(1981).

207. Ellman, G.L., Arch. Biochem. Biophys. 82:70-77 (1959).

208. Davis, B. J., Discontinuous electrophoresis, Ann. New York Acad Sci 727:404-427 (1964)

209. Schmid, F. X., in Protein Structure (Creighton, T. E., ed.), 251-285, IRL Press at Oxford Univesity Press, Oxford (1989).

210. Jacob-Dubuisson F., Pinkner J., Xu Z., Striker R., Padmanhaban A., Hultgren S. J., PapD chaperone function in pilus biogenesis depends on oxidant and chaperone-like activities ofDsbA, Proc. Natl. Acad Sci. USA. 22:91(24): 11552-6 (1994).

211. Zapun A., Missiakas D., Raina S., Creighton T. E., Structural and functional characterization of DsbC, a protein involved in disulfide bond formation in Escherichia coli, Biochemistry 18;34(15):5075-89 (1995).

212. Provencher S. W., Glockner J., Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism, Biochemistry 6;20(l):33-7 (1981).

213. Das K.P., Surewicz W.K., Temperature-induced exposure of hydrophobic surfaces and its effect on the chaperone activity of alpha-crystallin, FEBS Lett. 7;369(2-3):321-5 (1995).

214. Gilbert H. F., Thiol/disulfide exchange equilibria and disulfide bond stability, Methods Enzymol. 257:8-28, Review (1995).

215. Bova M. P., Ding L. L., Horwitz J., Fung B. K., Subunit exchange of alpha A-crystallin, J. Biol. Chem. 21;272(47):29S\\-1 (1997).

216. Meister A., Anderson M. E., Glutathione, Annu Rev. Biochem. 52:111-60, Review (1983).

217. Gilbert H. F., Molecular and cellular aspects of thiol-disulfide exchange, Adv. Enzymol. Relat. Areas. Mol. Biol. 63:69-112, Review (1990).

218. Reed P. J., Chem. Res. Toxicol. 3:495-502 (1990).

219. Miron T., Wilchek M., Geiger B., Characterization of an inhibitor of actin polymerization in vinculin-rich fraction of turkey gizzard smooth muscle, Eur. J. Biochem. 15; 178(2):543-53 (1988).

Информация о работе

Завьялов, Антон Владимирович
кандидата химических наук
Москва, 1999
ВАК 03.00.04

Диссертация

Изучение структурно-функциональных свойств иммуноглобулино-подобных малекулярных шаперонов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы