Исследование шаперон-подобной активности α-кристаллина и короткоцепочечных пептидов

Дижевская, Антонина Константиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование шаперон-подобной активности α-кристаллина и короткоцепочечных пептидов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование шаперон-подобной активности α-кристаллина и короткоцепочечных пептидов"

□□34БЭ077

На правах рукописи

ФР-

ДИЖЕВСКАЯ АНТОНИНА КОНСТАНТИНОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ШАПЕРОН-ПОДОБНОЙ АКТИВНОСТИ а-КРИСТАЛЛИНА И КОРОТКОЦЕПОЧЕЧНЫХ ПЕПТИДОВ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

11> 2003

003469077

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в лаборатории физико-химических основ регуляции биологических систем Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор Болдырев Александр Александрович

Кандидат биологических наук Муранов Константин Олегович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Гомазков Олег Александрович

Кандидат биологических наук, доцент Калинина Елена Валентиновна

Ведущая организация: Институт теоретической и

экспериментальной биофизики РАН

Защита состоится 25 мая 2009 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан_апреля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ^(Ъ/Ц, — Медведева М.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. а-Кристаллии, основной белок хрусталика глаза млекопитающих, обладает шаперон-подобпой активностью и подавляет агрегацию дестабилизированных белков в клетках хрусталика, преимущественно Р- и у-кристаллинов. Взаимодействие а-кристаллина с р- и у-кристаллинами в хрусталике глаза играет важную роль в поддержании прозрачности и светопреломляющих свойств этого органа. Агрегация структурных белков является ключевой стадией развития стойкого помутнения хрусталика, или катаракты. Согласно современным патогенетическим воззрениям, катаракта относится к так называемым «конформационным заболеваниям» и возникает при нарушении фолдинга кристаллинов с последующей агрегацией на фоне ослабления шаперон-подобпой функции а-кристаллина в клетках хрусталика (Harding, 1998; Bloemendal et al., 2004). Предотвращение или замедление агрегации цитоплазматических белков в клетках хрусталика является перспективным способом профилактики и консервативного лечения катаракты. Поэтому актуален поиск соединений, подавляющих агрегацию белков или усиливающих защитную активность а-кристаллина. В работах in vitro показано, что короткоцепочечные пептиды способны препятствовать тепловой агрегации белков (La Rosa et al., 2005), усиливать шаперон-подобную активность а-кристаллина (Clark and Huang, 1996) и проявлять собственную шаперон-подобную активность (Sharma et al., 2000; Ghosh et al., 2007). По данным лабораторных и клинических исследований, природные короткоцепочечные пептиды карнозин, N-ацетилкарнозин и пантетин эффективны при профилактике и лечении катаракты различной этиологии (Аветисов и соавт., 2008; Болдырев, 1999, Babizhaev et al., 2002, Clark et al., 1996, Williams and Munday, 2006). Карнозин и его производные относятся к группе гистидин-содержащих дипептидов (ГСД), пантетин - природный тетрапептид, структурный компонент кофермента А. Молекулярные механизмы антикатаракталыюго действия этих соединений не ясны. Предполагают, что в основе действия карпозина и N-ацетилкарнозина лежит способность тормозить процессы свободно-радикального окисления в клетках хрусталика, или (и) снижать уровень

гликирования белков (Babizhaev et al., 2002, Boldyrev, 1999). Мы предположили, что клинический эффект короткоцепочечных пептидов может быть связан с торможением агрегации белков хрусталика. Настоящая работа посвящена исследованию влияния короткоцепочечных пептидов на агрегацию кристаллипов с использованием специально разработанных нами моделей агрегации белков in vitro.

Целыо работы является сравнение шаперон-подобного действия а-кристаллина и природных короткоцепочечных пептидов (карнозина, N-ацетилкарнозина, анзерина и пантетина) на агрегацию кристаллипов, основанное на анализе кинетики агрегации Pi.-кристаллина бычьего хрусталика

Задачи исследования:

1 Разработать экспериментальные модели УФ-индуцированной и тепловой агрегации pL-кристаллина и смеси а- и Рь-кристаллинов;

2 Изучить кинетику тепловой агрегации [i|-кристаллина при 60°С и УФ-индуцированной агрегации pL-кристаллина при 37°С;

3 Охарактеризовать шаперон-подобную активность нативного и УФ-облученного а-кристаллина на основании анализа кинетики агрегации смеси а- и Р[,-кристаллинов;

4 Оценить эффекты короткоцепочечных пептидов на кинетику тепловой и УФ-индуцированной агрегации Рь-кристаллина смесей а- и р^-кристаллинов;

5 Охарактеризовать взаимодействие короткоцепочечных пептидов с кристалликами.

сопровождается уменьшением размеров агрегатов белка. D-пантстин, в отличие от ГСД, дозо-зависимым образом замедляет УФ индуцированную агрегацию смеси а- и Рь-кристаллинов, что связано со специфической модификацией активности а-кристаллина D-пантетином. Показано, что облучение ультрафиолетом усиливает шаперон-подобную активность а-кристаллина по отношению к |}[,-кристаллину в связи с конформационной перестройкой а-кристаллина под действием УФ света.

Практическое значение работы. Обнаруженные нами анти-агрегационные свойства короткоцепочечных пептидов позволяют рекомендовать их для дальнейшего исследования действия на кристаллины хрусталика в условиях in vivo. Выяснение структурио-функционалыюй взаимосвязи короткоцепочечных пептидов в отношении торможения агрегации белков может стать основой для создания нового класса антикатарактальных препаратов-антиагрегантов. Успехи в этом направлении могут стать основой для раскрытия механизмов катарактогенеза на молекулярном уровне и направленного синтеза антикатарактальных препаратов пептидной природы, способных блокировать агрегацию белков хрусталика или/и усиливать шаперон-подобную активность а-кристаллина.

Апробация работы и публикации. Результаты диссертационной работы были доложены на XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2005), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), II Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2007), на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова (2008). По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, среди которых 2 статьи в изданиях, входящих в список ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 44 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 206 отечественных и зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

а- и Рь-Кристаллишл выделяли из хрусталика глаза быка по модифицированному методу Chiou et al. (1979). Кортекс хрусталика подвергали гомогенизации и центрифугированию (30 ООО g 30 мин), затем проводили эксклюзионную хроматографию супернатанта, содержащего смесь растворимых белков, и собирали фракции а- и Р-кристаллинов. Для дополнительной очистки рь-кристаллина проводили эксклюзионную хроматографию (S-кристаллина на колонке с гелем Sephacryl S-200 (Pharmacia, Швеция), в результате которой получали PL-кристаллин с молекулярным весом, равным 35 кДа. Концентрацию а- и Р-кристаллинов определяли по поглощению при 280 нм, используя коэффициенты экстинкции 0,85 см2мг 1 и 2,3 см2мг"' соответственно. Короткоцепочечные пептиды карнозин (Р-аланил L-гистидин, C9H14N4O3, FW - 226), N-ацетилкарпозин (СцИ^^О^ FW - 268) и анзерин ф-аланил-N'-метилгистидин, C10Hi6N4O3 _ FW - 240) производства «Hamari Chemicals Ltd.» (Япония), D-пантетин (C22H42HAS2, FW - 554,7) - «Sigma-Aldrich» (США). Полипептидный состав а- и рь-кристаллина контролировали с помощью электрофореза по методу Laemmli (1970) в 12,5% ПААГ в присутствии ДСН. Для индукции УФ-агрегации раствор рь-кристаллина или смеси а- и Рь-кристаллинов в 40мМ фосфатном буфере (рН 6,8) помещали в кварцевую кювету и облучали при 37°С с помощью лампы ДРШ-1000, снабженной светофильтром УФС-2 (260-310 нм). Суммарная мощность световой энергии поглощенной образцом в указанном диапазоне была определена с помощью оптического спектрометра AvaSpec-2048 (Нидерланды) и составляла 255,6 + 25,5 мкВт. Для индукции тепловой агрегации раствор белков помещали в кювету, термостатируемую при 60°С. Исследуемые пептиды добавляли к раствору белков непосредственно перед индукцией агрегации. Общий объем инкубационной смеси в пробе составлял 0,4 мл. Кинетические кривые агрегации получали, регистрируя светорассеяние раствора белков при X = 405 нм с помощью специально сконструированного нефелометра (рис. 1). Для количественной оценки параметров кривых агрегации использовали метод, разработанный Кургановым (2002).

rvfl

Источник света 405 нм

УФ-лата ДРШ-1000

L-J

Рис. 1. Схема установки для УФ-облучения белков и регистрации процесса агрегации in vitro. Лампа-облучатель снабжена фильтром УФС-2, пропускающим УФ свет в интервале 260-310 нм. Изменение

АЦП

Multikin 4 для Windows

светорассеяния регистрировали при светодиода (405 нм).

раствора помощи

Участок S-образной кривой агрегации после перегиба аппроксимировали уравнением реакции пссвдопсрвого порядка A=A|¡m (1-е"1"(t tn)), получая три параметра, описывающих процесс помутнения раствора: t0 - время лаг-фазы процесса, которое отражает скорость денатурации ßi.-кристаллипа под действием ультрафиолета; k¡ -константа скорости реакции, которая описывает скорость взаимодействия поврежденных молекул друг с другом; Ацт — максимальная мутность инкубационной смеси, отражающая конечный размер агрегатов. Экспериментальные данные обрабатывали с помощью статистического пакета Statistica 6.0 (StatSoft Inc, США). Количество карбонильных групп, образующихся при УФО кристаллинов, определяли методом Levine et al. (1994). Данные представлены в виде средпее+стандартная ошибка. Для оценки достоверности изменений применяли тест Стыодента (достоверность при р < 0,05). Измерения собственной флуоресценции растворов кристаллинов проводили на спектрофлуориметре Hitachi-850 (Япония) при длинах волн возбуждения 295 нм, испускания в интервале 300-400 нм. Для характеристики размеров молекул и агрегатов кристаллинов в растворе применяли метод динамического лазерного светорассеяния (ДЛС). Измерения проводили на установке Zetasizer Nano Series с He-Ne лазером (633 нм), снабженной пакетом программ полидисперсного анализа Dispersion Technology Software 4.2 (Malvern Instrument Ltd, Великобритания), проводящих обработку автокорреляционных функций и расчёт гидродинамического диаметра частиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ кинетических кривых тепловой агрегации Рь-кристаллина. Кинетику тепловой агрегации ри-кристаллина мы исследовали в интервале концентраций 0,2-2,0 мг/мл. Зависимости параметров теоретических кривых агрегации от концентрации приведены на рис. 2.

Рис. 2, А - Кинетические кривые тепловой агрегации ßi-кристаллина при 60"С, А -концентрация белка: 0,2 (1), 0,4 (2), 1,0 (3) и 2,0 мг/мл (4) и параметры кинетики тепловой агрегации ßi.-кристаллина ki (Б), to (В), A|im (Г), полученные при различных концентрациях белка.

Параметры kj и A|irn линейно зависят от концентрации (рис. 2, Б, Г), что согласуется с данными по тепловой агрегации других белков (Курганов, 2002; Wang, Kurganov, 2003). При этом зависимость величины ki от концентрации белка указывает на то, что реакция имеет псевдопервый порядок. Зависимость лаг-периода to от концентрации имеет логарифмический характер (рис. 2, В).

Кинетика тепловой агрегации рь-кристаллина в присутствии а-кристаллина. При анализе кинетических кривых тепловой агрегации Рь-кристаллина (0,5 мг/мл) в присутствии а-кристаллипа (0,025-0,125 мг/мл) установлено, что с увеличением количества а-кристаллина в смеси увеличивается лаг-период агрегации и снижается скорость процесса (рис. 5, А, Б). Полное подавление тепловой агрегации (5ь-кристаллина в течение наблюдаемого периода происходит при массовом соотношении р!.: а, равном 4:1. Уменьшение константы скорости в присутствии а-кристаллипа свидетельствует о снижении скорости процесса взаимодействия белковых агрегатов. Удлинение лаг-фазы обусловлено увеличением количества р^кристаллина, связанного с а-кристаллином и исключенного из процесса агрегации.

3000 г

2500

з 2000

« 1500 1000 500 0

100

200 300 и мин

400

500

Рис. 3 Влияние а-кристаллина па кинетику агрегации Р|,-кристаллина (0,4 мг/мл) при 60°С. Зависимость величины гидродинамического радиуса (Кь) от времени полученная при концентрации а-кристаплина 1 - 0 мг/мл, 2 - 0,075 мг/мл и 3 - 0,15 мг/мл. Кривые I и II относятся к суперагрсгатам и комплексам стартовых агрегатов с а-кристаллином, соответственно.

Механизм шанерон-подобпой активности а-крисгаллина при тепловой агрегации р^-кристаллина. Механизм защитного действия а-кристаллина при тепловой агрегации [Зь-кристаллина был предложен нами в совместной работе с Б.И.Кургановым (лаборатория ферментных систем Института биохимии им. А.Н. Баха РАН) (Тимофеева и соавт., 2005, КЬапоуа е1 а1., 2005, Магкоз81ап с1 а!., 2006). Предложенный механизм включает в себя стадии образования стартовых агрегатов и дальнейшей их ассоциации с образованием агрегатов высшего порядка. Было установлено, что начальные участки зависимостей интенсивности светорассеяния (/) от гидродинамического радиуса частиц (/?/,) линейны. Размер стартовых агрегатов

(Rh,o) можно определить как отрезок, отсекаемый на оси абсцисс линейной зависимостью I от Rh. Размер стартовых агрегатов не зависит от начальной

концентрации белка. Стартовые агрегаты Рь-кристаллина имеют размер 84 ± 4 им.

Линейное соотношение зависимостей Rh от времени выполняется до определенного

значения времени (1ц). При t > t0 зависимость Rh от времени описывается степенной

функцией: Rh=RhltfI +Ki(t-t0)]"di,где Ki - константа, df - фрактальный размер агрегатов. Параметр df полученный для разных концентраций Р[,-кристаллина, приближался к значению 1,8, которое является универсальным для режима агрегации «diffusion-limited cluster-cluster aggregation» (DLCA), при котором скорость агрегации определяется только диффузией взаимодействующих частиц (Weitz and Lin, 1986). В присутствии низких концентраций а-кристаллина (0,025 мг/мл, 1:16 a:pL) размер стартовых агрегатов уменьшается до 31+3 им, при этом распределение белковых агрегатов по размерам остается унимодальным на протяжении всего измерения. С увеличением концентрации а-кристаллина (0,05 мг/мл 1:8 a:pL) размер стартовых агрегатов продолжает

уменьшаться, а унимодальный рост агрегатов в определенный момент времени (при I >

25 мин) переходит в бимодальный и регистрируются два типа частиц (рис. 3). В дополнение к непрерывно растущим во времени агрегатам крупного размера (суперагрегаты) (рис. 3, кривая II) в системе образуются агрегаты конечного размера (рис. 3, кривая I). В присутствии избытка а-кристаллина (0,8 мг/мл, 2:1 a:pi.) расщепления агрегатов на две популяции не происходит, а гидродинамический радиус базовых агрегатов при длительной инкубации приближается к предельному значению. Зависимость Rh от времени t в присутствии a-кристаллина удовлетворяет условиям уравнения: Rh = Rhoexp[K2(t-ta)]l где К2 - константа; что свидетельствует о переключении процесса агрегации в кинетический режим «reaction-limited cluster-cluster aggregation» (RLCA), при котором вероятность слипания агрегатов при столкновении меньше единицы. Таким образом, защитное действие а-кристаллина при тепловой агрегации [ii.-кристаллина связано с формированием стартовых агрегатов меньшего размера и сниженной реакционной способности, чем в отсутствие этого шаперон-подобного белка.

Рис. 4 Анализ кинетики УФ-агрегации р|,-кристаллииа. Зависимости параметров кривых агрегации кристаллипа к; (А) и Ацгг, (Б) от концентрации белка.

Анализ кинетических кривых УФ-агрегации рь-кристаллипа. УФ-

индуцированную агрегацию рь-кристаллина изучали в диапазоне концентраций 0,254,0 мг/мл. На рис. 4 видно, что скорость агрегации растет линейно с увеличением концентрации белка в диапазоне 0,25-1,0 мг/мл, а при более высоких концентрациях начинает снижаться. Р^кристаллин характеризуется значительным поглощением в УФ-В диапазоне (коэффициент экстинкции 2,3 см2мг"'). Уменьшение скорости агрегации при повышении концентрации белка связано с эффектами экранирования одних молекул другими при УФ-облучении, что уменьшает вероятность фотоповреждения и денатурации белка.

Кинетика УФ-агрсгации [1|-кристаллипа в присутствии а-кристаллина. Изучена кинетика УФ-агрегации Р^кристаллина (1 мг/мл) в присутствии а-кристаллина в ряду концентраций 0,06-1 мг/мл. Степень подавления агрегации зависит от концентрации а-кристаллина, как и в случае тепловой агрегации. Полное подавление УФ-агрсгации в наблюдаемом интервале времени происходит при массовом соотношении рь-кристаллина и а-кристаллина, равном 1:1, а при тепловой агрегации - 4:1. Вид зависимостей параметров агрегации Р^кристаллина к,- и от концентрации а-кристаллина представлен на рис. 5, В, Г.

а-кристаллин, мг/мл

0.03 0-01 0.04 0.0« 0.0t 0.07 0.0Я 0.00

а-кристаллин, мгГмл

oj о.з ал ол а-кристаллин, мг/мл

1.00 0.01 0.03 0.03 0.04 О 0S 0.0« 0.07 0.0« 0.00

а-кристаллин, мг/мл

Рис. 5. Зависимости параметров к; и to от концентрации а-кристаллина при тепловой агрегации смеси а- и (Ь.-кристаллинов (А, Б) и УФ-индуцированной агрегации смеси а- и ßi,-кристаллинов (В, Г).

Оценка "экранирующего эффекта" в защитном действии а-крисгаллина.

Проведена экспериментальная оценка светофильтру ющего эффекта а-кристаллина в зависимости от массового соотношения a:ßL (шаперон : субстрат). Данные эксперимента показали, что роль светофильтрующей составляющей в защитном действииа-кристаллина уменьшается при увеличении количества а-кристаллина по отношению к ßL-кристаллипу (рис. 6) При массовом соотношении 1:1 (a:ßi.) «экранирующий механизм» составляет около 30% защитного эффекта а-кристаллина.

Влияние УФ-облучения на шаперон-подобную активность а-кристаллина. а-Кристаллин облучали УФ светом в течение 120 мин при 37°С и регистрировали кривые УФ агрегации смесей ßL- и а-кристаллинов в разных концентрациях.

Свет

кюветы 405 нм

Источник УФ

си)

детекция мутности раствора

а-кристаллин, мг/мл

Рис. 6 «Эффект экрана» в защитном действии а-кристаллипа. А -схема установки для регистрации кинетических кривых УФ-агрсгации, Б - Влияние а-кристаллина на скорость УФ-агрегации р^-кристаллина при условии, что: а-кристаллин находится в передней кювете I как светофильтр (1), а-кристаллин находится в кювете II в смеси с Р|,-кристалином (2).

Для каждой агрегациоиной кривой был проведен анализ завершающей фазы процесса агрегации и рассчитаны параметры кь Ацт и 10. (рис. 7, табл.). При соотношении белков ф:а) 16:1 доминирующая роль в защите от агрегации принадлежит экранирующему эффекту а-кристаллина. Усиление защитной активности

Инкубационная смесь Параметры гривых агрегации

К,, мин"1 Ь,, мин

Ри-кристаллин и нативный а-кристаллин (16:1) 0,084 ± 0,003 18,24 ±0,3

['„-кристоллин и УФ-облученный а-кристаллим (16:1) 0,077 ± 0,001 16,88 ± 0,2

$-кристаллин и нативный а-кристаллим (4:1) 0,066 ± 0,002 24,74 ± 0,2

р!_-кристаллин и УФ-облученный а-кристаллин (4:1) 0,033 ± 0,002 26,10 ±0,1

Время, мин

Рис. 7. Кривые УФ-агрегации: 1 -р|,-кристаллин в присутствии необлученного а-кристаллина (в массовом соотношении 16:1 Р:а), 2 - р^-кристаллин в присутствии облученного а-кристаллина (в массовом соотношении 16:1 р:а), 3 - Р|,-кристаллин в присутствии необлученного а-кристаллина (в массовом соотношении 4:1 Р:а), 4 - р1,-кристаллин в присутствии облученного а-кристаллина (в массовом соотношении 4:1 р:а) В таблице справа указаны параметры кривых УФ-агрсгации Р|,-кристаллина в присутствии необлученного и УФ-облучеиного в течение 120 мин а-кристаллина

облученного а-кристаллнна становится явным при возрастании связывающей роли а-кристаллина по отношению к (5[-кристаллину ф:а) 4:1. Следовательно, УФ-облучение в примененной нами дозе (поглощенная энергия облучения 1,8 Дж) активирует шаперон-подобные свойства а-кристаллина. Известно, что а-кристаллин становится более эффективным шапероном при воздействиях, приводящих к частичной денатурации (впшуав Ы а1., 2003). Мы предполагаем, что УФ в определенных дозах вызывает изменение структуры а-кристаллина, усиливающее его шаперон-подобную активность.

Время, мин х флуоресценции, нм

Рис. 8. Хроматограммы растворов ßi ,-кристаллина (Л) и а-кристаллина (В): сплошная линия -нсоблученный белок; пунктирная линия - облученный УФ светом 30 мин; точечная линия -белок, облученный 60 мин. На врезке (А): 1-стандарты, 2- нсоблученный ßi.-кристаллин; 3- ßi-кристаллин, облученный 30 мин; 4 - ßi.-кристаллин, облученный 60 мин. На врезке (В): 1-стандарты, 2 - нсоблученный а-кристаллин; 3- а-кристаллип, облученный 60 мин; 4- а-кристаллин, облученный 120 мин, Б - спектры флуоресценции (Хс„ = 295 нм) необлучешюго ßi.-кристаллина (1), облученного 30 мин (2) и 60 мин (3). Г- спектр флуоресценции необлучешюго а-кристаллина (1) и а-кристаллина, облученного 60 мин (2) и 120 мин (3).

Влияние короткоцсночечных пептидов на кинетику УФ-агрегации кристаллина. Исследуемые соединения добавляли в инкубационную смесь в виде концентрированного раствора, приготовленного на фосфатном буфере. В таблице 1 представлены параметры кривых УФ-индуцировапной агрегации Рц-кристаллина в присутствии карнозина, М-ацетилкарнозина, и анзерина. Как следует из представленных в таблице 1 данных, М-ацетилкарнозин и анзерин в интервале концентраций 10-20 мМ эффективно тормозят процесс фотоагрегации рь-кристаллипа.

Таблица 1. Изменение параметров кривой УФ-ипдуцированной агрегации р|,-кристаллипа в присутствии гистидин-содсржащих дипептидов.

Инкубационная смесь Концентрация дипептида, мМ Параметры кривых агрегации

ки мин"1 t0, мин Аипи ОЕ

Pl—кристаллин О 0,142 ± 0,003 12,50 ± 0,02 1,08 ± 0,03

pi-кристалл ин + NAC 10 0,118 + 0,002 12,90 ± 0,04 1,08 ± 0,02

20 0,035 + 0,003 19,20 ± 0,01 1,32 ± 0,02

40 0,102 ± 0,002 13,96± 0,05 1,13±0,01

ßL-кристаллин +карнозин 20 0,185 ± 0,004 12,10 ± 0,03 1,06 ± 0,03

40 0,198 + 0,003 11,90 ± 0,02 1,05 + 0,02

pL—кристаллин + анзерин 10 0,058 + 0,002 28,10 ±0,01 1,10 + 0,02

20 0,047 + 0,003 28,30 ± 0,01 1,19 ± 0,02

40 0,042 ± 0,002 33,84 ± 0,02 1,12 ± 0,02

Повышение концентрации NAC до 40 мМ не приводит к дальнейшему усилению защитного эффекта. В то же время карнозин в концентрации 20-40 мМ не замедляет агрегацию Pi-кристаллина, а, напротив, ускоряет ее. Поскольку величина к, характеризует скорость взаимодействия агрегатов, то ее возрастание отражает ускорение образования агрегатов достаточно большого размера. В таблице видно, что NAC и анзерин в определенных концентрациях уменьшают величину к,, то есть препятствуют этому процессу. Различие в эффективности тестируемых ГСД можно объяснить их неодинаковой относительной гидрофобностыо, влияющей на сродство к фотоповрежденному Рь-кристаллину. Относительная гидрофобность ГСД была количественно охарактеризована O'Dowd et al. (1988) на основании времени элюции

различных дипсптидов с помощью обращено-фазной ВЭЖХ, которое составило 2,78±0,01; 3,09±0,01 и 8,46±0,12 мии для карнозина, анзерина и NAC. По-видимому, дипептиды связываются с гидрофобными и экспонированными в раствор участками УФ-поврежденного рь-кристаллина, и, образуя «заплатки», частично блокируют агрегацию. Это предположение согласуется с полученными нами данными по анти-агрегационной активности дипсптидов при действии на р^-кристаллин. В присутствии D-пантетина концентрационно-зависимо уменьшается скорость агрегации ßL-кристаллина (данные не представлены), что позволяет связать уменьшение скорости агрегации с экранирующим эффектом пантетина.

Влияние короткоцепочечных пептидов на разделенную УФ-агрсгацнго ßL-кристаллина. Для выявления стадии, на которой эффективны дипептиды, мы разработали метод разделения во времени процессов УФ-повреждения и агрегации

кристаллинов. рь-Кристаллин

облучали УФ светом при 15°С, а затем прекращали облучение и индуцировали агрегацию, нагревая образец до 37°С. Во время УФ-облучения низкая температура раствора препятствует агрегации белковых молекул, поскольку скорость агрегации зависит от скорости диффузии частиц.

Рис. 9 Кинетика агрегации (37°С) Рькристаллина, предварительно

облученного УФ при низкой температуре (15°С). А - дипептиды добавлены после УФО, Б - дипептиды добавлены перед началом УФО. 1 - ßi.-кристаллин, 2 - ßi.-кристаллин в присутствии 20 мМ NAC, 3 - ß[,-кристаплин в присутствии 20 мМ анзерина.

Нативный ßL-кристаллин не агрегирует при 37°С, поэтому агрегация УФ-облучепного белка свидетельствует о его фотоповреждении. На рис. 9, А показаны кинетические кривые агрегации белка, полученные при добавлении дипептидов перед индукцией агрегации при 37°С. На графике видно, что NAC в концентрации 20 мМ ускоряет агрегацию предварительно облученного Р(,-кристаллина, в то время как анзерин в той же концентрации снижает скорость и увеличивает лаг-фазу процесса агрегации. На рис.9, Б представлены кривые агрегации, полученные при добавлении дипептидов перед началом УФО при 15°С. В этом случае р^кристаллин, облученный в присутствии 20 мМ NAC агрегирует медленнее, чем контрольный белок. Анзерин, как и в первом случае, замедляет скорость и увеличивает лаг-фазу процесса агрегации белка.

Влияпие короткоцепочечных пептидов на кинетику тепловой агрегации ßL-кристаллина. Исследуемые вещества мы добавляли в кювету с раствором ßL-кристаллина при 60°С и анализировали кривые агрегации белка. В таблице 2 показаны

Таблица 2. Изменение параметров кривых тепловой агрегации Рь-кристаллииа в присутствии короткоцепочечных пептидов (20 мМ)

Инкубационная смесь, 60°С Параметры кривых агрегации

kj, мин'1 tg, МИН Alim, ОЕ

PL 0,134 + 0,003 7,86 + 0,11 1,125 ±0,03

ßL + карнозин 0,150 + 0,002 7,10 ±0,14 1,190 ±0,02

ßL + NAC 0,192 + 0,002 7,77 ±0,16 1,058 ±0,02

ßi_+ анзерин 0,161 ± 0,002 6,77 ±0,13 1,200 ±0,02

ßL +пантетин 0,19 + 0,006 8,76 ± 0,09 1,14 + 0,01

параметры кривых тепловой агрегации Р^кристаллина в присутствии КЦП. Как следует из представленных данных, все исследуемые вещества в концентрации 20 мМ действуют с одинаковой направленностью — ускоряют тепловую агрегацию, о чем свидетельствует увеличение к| по сравнению с контролем. Добавление пантетина, в отличие от ГСД, продлевает лаг-фазу агрегации белка.

Влияние короткоцсиочсчнмх пептидов па количество карбонильных групп в Р [-кристалл иие при УФ-облучении. Появление карбонильных групп в аминокислотных остатках белков является маркером окислительной модификации (ВсНсЦ, 81а(ктап, 1997). Известно, что УФ-облучснис вызывает повреждение белка, протекающего по механизму свободно-радикального окисления. В то же время имеются обширные данные по аптирадикалыюй активности ГСД (ВоШугеу, 2006). Данные таблицы 3 показывают, что при освещении раствора р^-кристаллина УФ светом в течение 40 мин количество карбонильных групп повышается, примерно, на порядок. Это свидетельствует о повреждении белка по механизму свободно-радикального окисления. Однако ни Т>)-ацетилкарнозин, ни карнозин, ни анзерин существенного влияния на количество карбонильных групп не оказывали.

Таблица 3. Содержание карбонильных групп в рь-крнсталлине при дсйствииУФ-свега в присутствии гистидин-содсржагцих дипептидов (20мМ)

Образец Количество карбонильных групп (нмоль/мг белка) после УФ-облучения в течение:

0 мин 40 мин

ßi.-кристаллин 0,53±0,13 5,96±0,27

ßu + карнозин 0,52+0,11 5,16±0,25

ßu + NAC 0,51 ±0,14 5,1010,65

ßi+ анзерин 0,52±0,14 5,20±0,45

Это означает, что исследованные дипептиды не предупреждают окислительного повреждения Р[,-кристаллина в используемой нами модели.

Влияние короткоцепочечных пептидов на размеры частиц р^кристаллина при УФ-облучепии. Общим эффектом для активных дипептидов (NAC, анзерин) оказалось их действие на стадии УФ облучения, то есть на стадии формирования агрегирующих частиц. Такое воздействие, вероятно, реализуется посредством единого механизма. Мы предполагаем, что причиной торможения УФ-индуцированной агрегации [V-кристаллииа в присутствии дипептидов может быть встраивание ГСД в

Рис. 10. Распределение частиц но размерам в растворе Р[.-кристаллина при 15°С. 1 - Р[,-кристаллип (сплошная линия); 2 -Р|,-кристаллин + УФ 60 мин (пунктирная линия); 3 - Р/,-кристаллин + 20 мМ >1-ацетилкарнозина + УФ 60 мин (линия точками); 4 - р|,-кристаллин + 20 мМ анзерина + УФ 60 мин (линия штрих-пунктиром).

•2

0.75

5.00

25.00

75.00

Гидродинамический диаметр, нм

поврежденную молекулу []|-кристаллипа. Такое встраивание предупреждает конформационные перестройки в белке, которые приводят к экспонированию наружу молекулы гидрофобных участков, обычно скрытых в глубине молекулы. На рис. 10 представлено распределения частиц по размерам в растворах р^кристаллина: контрольном, облученном УФ, и растворе, облученном УФ в присутствии гистидипсодержащих дипептидов. Гидродинамический диаметр частиц в растворе IV-кристаллина при 15°С варьирует от 2,33 до 15,7 нм, со значением моды 5,62 нм. Такой разброс значений - результат как особенностей метода ДЛС, так и того, что р^ кристаллин в норме образует ассоциаты (Не^тапак й а1., 2004). Добавление дипептидов к нативному Рь-кристаллину не влияет на размеры асеоциатов. УФ облучение рь-кристаллина вызывает образование популяции более крупных частиц, размером порядка 20-50 им, и распределение частиц становится бимодальным. Облучение ультрафиолетом Рь-кристаллина в присутствии дипептидов предотвращает образование таких крупных частиц. Средний диаметр частиц в случае добавки анзерина или М-ацетилкарпозина равен 6,89 и 6,27 нм, соответственно. Полученные данные позволяют заключить, что механизм действия дипептидов связан с уменьшением размеров агрегатов, формирующихся на начальной стадии агрегации УФ-денатурировапного белка. Такой же механизм предложен нами для объяснения шаперон-подобной активности а-кристаллина (Магко$.ч1ап е1 а1., 2006).

Исследование действия короткоцепочечных пептидов па УФ-агрсгацию смеси а- и |!ь-крисгаллипов. Для эксперимента было выбрано соотношение а- и р-кристаллинов 1:16 по массе (0,06:1мг/пробе), и получены совпадающие кривые агрегации для разных ГСД и контроля (данные не представлены), что позволяет говорить об отсутствии специфического влияния ГСД на шаперон-подобную активность а-кристаллипа при физиологических значениях концентрации и температуры. В отличие от ГСД, пантетин дозо-зависимо подавляет УФ-агрсгацию смеси белков (рис. 12, А). Снижение скорости агрегации можно было бы объяснить только светофильтрующим эффектом, однако линейный рост лаг-фазы в присутствии пантетина указывает на специфическое влияние пантетина на активность а-кристаллина. На рис. 12, Б показана зависимость лаг-фазы !.о УФ-агрегации смеси белков от концентрации пантетина. В интервале концентраций 5-25мМ лаг-фаза

Время облучения, мин Пантетин, мМ

Рис. 12. А - шаперон-подобная активность а-кристаплина в присутствии пантетина на модели УФ-агрегации. 1-кривая агрегации р^-кристаллина и а-кристаллина в массовом соотношении 16:1 (контроль), 2-5 - кривые агрегации Р|,-кристаллина и а-кристаллина в присутствии 5, 10, 20,25 мМ пантетина, соответственно. Б - Зависимость параметра 1о (лаг-фазы процесса) от концентрации пантетина при УФ- агрегации р|-кристаплипа

растет линейно, при повышении концентрации до 30 мМ лаг-фаза сокращается, то есть эффект пантетина достигает насыщения. Действие пантетина в смеси а- и рь-кристаллииов по характеру влияния на кинетику агрегации сходно с действием а-кристаллина (увеличение 1о и снижение к|). На основании этих данных мы заключаем, что пантетин активирует шаперон-подобные свойства а-кристаллина.

выводы

1. Разработана экспериментальная модель УФ-индуцированной агрегации белков, позволяющая анализировать кинетику агрегации белков хрусталика.

2. Показано, что константа скорости процесса агрегации Дц-кристаллина, индуцированной как ультрафиолетом, так и повышением температуры, линейно зависит от концентрации белка, что свидетельствует о пссвдопервом порядке реакции. Однако, при УФ-индуцированпой агрегации линейный рост константы скорости характерен только для области низких концентрации белка (0,25-1,00 мг/мл).

3. Дана количественная оценка эффективности а-кристаллина как шаперон-подобного белка на моделях УФ-индуцированной и тепловой агрегации кристаллина. Показано, что шаперон-подобная активность а-кристаллина в отношении агрегации Рь-кристаллина, поврежденного теплом, существенно (примерно в 4 раза) превышает шаперон-подобную активность а-кристаллина в отношении агрегации УФ поврежденного Рь-кристаллипа, что совпадает с полученными ранее данными о тепловой активации а-кристаллина.

4. Показано, что роль светофильтрующей составляющей в защитном действии а-кристаллина уменьшается при росте массового соотношения аф^ При массовом соотношении 1:1 (а:Рь) 30% защитного эффекта а-кристаллина приходится на его экранирующий эффект, тогда как при соотношении 1:8 (а:рь) на экранирующий эффект приходится 93% защитного эффекта а-кристаллина.

5. УФ облучение усиливает шаперон-подобную активность а-кристаллина по отношению к Рь-кристаллину, что, по-видимому, связано с конформационной перестройкой а-кристаллина под действием УФ света.

6. Разработан метод исследования УФ-индуцированной агрегации белков, который позволяет, разделяя во времени процесс повреждения белка й его агрегации, анализировать механизмы влияния шаперон-подобных соединений на агрегацию белков хрусталика.

7. Показано, что М-ацетилкарнозин, анзерин и О-пантетин дозо-зависимым образом замедляют процесс УФ-индуцированной агрегации Р^кристаллина.

8. Торможение УФ-индуцированной агрегации [![-кристаллина в присутствии 14-ацетилкарнозина и анзерина сопровождается существенным снижением размеров агрегатов.

9. Торможение УФ-индуцированной агрегации смеси а- и рь-кристаллинов в присутствии О-пантетина обусловлено как светофильтрующим действием соединения, так и активацией шаперон-подобных свойств а-кристаллина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Тимофеева А.К., Болдырев А.А. Влияние природных гистидин-содержащих дипептидов на manepoi[-подобную активность бычьего а-кристаллина. // Научные труды МБЦ МГУ, 2003, М„ с. 42-46.

2. Тимофеева А.К., Ханова Е.А., Маркосян К.А., Муранов К.О., Островский М.А., Курганов Б.И.. Кинетика тепловой агрегации Р-кристаллина хрусталика глаза быка в присутствии а-кристаллина.// Материалы Международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки», Тюмень, 2005, с. 29-32.

3. Ханова Е.А., Тимофеева А.К., Самойлов A.M., Маркосян К.А., Муранов К.О., Островский М.А., Левицкий Д.И., Курганов Б.И.. Кинетика тепловой агрегации дрожжевой алкогольдегидрогеназы в присутствии а-кристаллина. Н Материалы Международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки», Тюмень, 2005, с. 80-82.

4. Ханова Е.А., Тимофеева А.К., Самойлов A.M. Влияние а-кристаллина на кинетику

тепловой агрегации §-крнстппт\аЛ XII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005», Москва, 2005. Тезисы докладов, с.239-240.

5. Khanova Н.А., Markossian К.А., Kurganov В.I., Samoilov A.M, Kleimenov S.Yu., Levitsky D.I., Yudin I.K., Timofccva A.C., Muranov K.O and Ostrovsky M.A. Mechanism of chaperone-like activity. Suppression of thermal aggregation of pL-crystallin by a-crystallin. II Biochemistry, 2005, v. 44, p. 15480-15487.

6. Markossian K.A., Kurganov B.I., Levitsky D.I.,. Khanova H.A, Chebotareva N.A., Samoilov A.M., Eronina T.B., Fedurkina N.V., Mitskevich L.G., Merem'yanin A.V., Klcymenov S.Yu., Makeeva, V.F., Muronetz V.I., Naletova I.N., Shalova I.N., Asryants R.A., Schmalhausen E.V., Saso L., Panyukov Yu.V., Dobrov E.N., Yudin I.K., Timofceva A.C., Muranov K.O. and Ostrovsky M.A. Mechanism of chaperone-like activity.// Protein Folding: New Research. Nova Science Publishers, Inc., New York, USA (Obalinsky T.R., Ed.), 2006, p. 89-171.

7. Муранов K.O., Дижевская A.K., Болдырев A.A., Карпова О.Е., Шеремет Н.Л., Полунин Г.С., Австисов С.Э., Островский М.А. Поиск шаперон-подобпых антикатарактальных препаратов-аитиагрегантов кристаллинов хрусталика глаза. Сообщение первое. Шаперон-подобное действие дипептида N-ацетилкарнозина: исследование in vitro на модели УФ-индуцированной агрегации р^-кристаллина. // Вестник офтальмологии, 2008, т. 124(2), с.3-6

8. Австисов С.Э., Полунин Г.С., Шеремет Н.Л., Макаров И.А., Федоров А.А., Карпова О.Е., Муранов К.О., Дижевская А.К., Соустов Л.В., Челноков Е.В., Битюрин Н.М., Сапогова Н.В., Немов В.В., Болдырев А.А., Островский М.А. Поиск шаперон-подобных антикатарактальных препаратов-аитиагрегантов кристаллинов хрусталика глаза. Сообщение четвёртое. Изучение воздействия смеси ди- и тетра-пептидов на «пролонгированной» модели ультрафиолст-индуцированной катаракты у крыс. // Вестник офтальмологии, 2008, т.124(2), с.12-16.

9. Дижевская А.К., Полянский Н.Б., Муранов К.О., Болдырев A.A., Островский М.А. Молекулярный механизм действия гистидин-содержащих пептидов на агрегацию ßi,-кристаллипа. // Молекулярная медицина, 2009, (в печати).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

ГСД - гистидии-содержащие дипептиды ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние ДСН - додецилсульфат натрия КЦП - короткоцепочечные пептиды ПААГ- полиакриламидный гель УФ - ультрафиолетовый свет УФО - ультрафиолетовое облучение NAC -N-ацетилкарнозин

DLCA - diffusion-limited cluster-cluster aggregation, диффузионно-ограниченная кластерная агрегация FW - молекулярная масса PBS - фосфатный буфер

RLCA - reaction-limited cluster-cluster aggregation, реакционно-ограниченная кластерная агрегация

Подписано в печать 07.04.2009 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: (495) 785-00-38 www.autoref.webstolica.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дижевская, Антонина Константиновна

Список сокращений

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурные белки хрусталика и системы поддержания их нативности

1.1.1. Особенности строения и функции хрусталика

1.1.2. р-, у- и а-кристаллины

1.1.3. Шаперон-подобная активность а-кристаллина

1.2. Повреиздения и агрегация кристаллинов как первичный механизм катарактогенеза

1.3. Короткоцепочечные пептиды и их антикатаракталыюе действие

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

П.З. Исследование полипептидного состава кристаллинов методом ПААГэлектрофореза

11.4. Индукция ультрафиолетовой и тепловой агрегации pL-кристаллнна и смесей а- и рь-кристаллинов

11.5. Метод анализа экспериментальных кривых агрегации 48 П.6. Определение количества карбонильных групп в Рь-кристаллине

11.7. Исследования растворов кристаллинов методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС).

11.8. Триптофановая флуоресценция.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

III.1. Характеристика моделей агрегации кристаллинов

III. 1.1 Тепловая агрегация

III. 1.1.1. Анализ кинетических кривых тепловой агрегации Д-кристалл ина 54 III. 1.1.2. Кинетика тепловой агрегации Рь-кристаллина в присутствии сскристаллина 57 Ш. 1.1.3. Механизм шаперон-подобной активности а-кристаллина при тепловой агрегации Рь-кристаллина

III. 1.2. УФ-индуцированная агрегация

Ш.1.2.1. Анализ кинетических кривых УФ-агрегации Д.-крисгаллина

III. 1.2.2. Кинетика УФ-агрегации Рь-кристаллина в присутствии а-кристаллина

III. 1.2.3. Оценка "экранирующего эффекта" в защитном действии а-кристаллина

III. 1.2.4. УФ-повреждения pL- и ог-кристаллинов 73 III. 1.2.5. Усиление шаперон-подобного действия or-кристаллина под влиянием УФоблучения 81 III. 1.2.6. Разделение во времени процессов УФ-повреждения и агрегации кристаллинов

III.2. Изучение взаимодействия короткоцепочечных пептидов с кристаллинами

111.2.1. Влияние короткоцепочечных пептидов на кинетику УФ-агрегации pLкристаллина

111.2.2. Влияние короткоцепочечных пептидов на разделенную УФ-агрегацию рькристаллина

111.2.3. Влияние короткоцепочечных пептидов на кинетику тепловой агрегации Plкристаллина

111.2.4. Влияние короткоцепочечных пептидов на количество карбонильных групп в рь-кристаллине при УФ-облучении

111.2.5. Влияние короткоцепочечных пептидов на размеры частиц Рь-кристаллина при УФ-облучении

111.2.6. Исследование действия КЦП на УФ-агрегацию смеси а- и pL-кристаллинов

111.2.7. Влияние пантетина на размеры а-кристаллина

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование шаперон-подобной активности α-кристаллина и короткоцепочечных пептидов"

ос-Кристаллин, структурный белок хрусталика глаза млекопитающих, обладает шаперон-подобной активностью и подавляет агрегацию дестабилизированных белков в хрусталике, преимущественно (3- и у-кристаллинов. Взаимодействие ос-кристаллина с (3- и у-кристаллинами в хрусталике глаза играет важную роль в поддержании прозрачности и светопреломляющих свойств этого органа (Ponce et al., 2006; Takemoto and Sorensen, 2008). Аминокислотные последовательности субъединиц ос-кристаллина гомологичны малым белкам теплового шока. Известно, что ос-кристаллин способен взаимодействовать с поврежденными белками, образуя стабильные водорастворимые комплексы, сохраняя субстраты в фолдинг-компетентном состоянии, и, возможно, осуществляя их рефолдинг (Wang and Spector, 2001).

Хорошо известно, что агрегация белков является ключевой стадией формирования катаракты, или стойкого помутнения хрусталика. Агрегации способствует высокая концентрация кристаллинов в цитоплазме волоконных клеток (400 мг/мл и более), аккумуляция повреждений в белках и практически полное отсутствие обмена белков в центральной области хрусталика. Согласно одной из современных патогенетических концепций, катаракта является «конформационным заболеванием», или следствием нарушения фолдинга кристаллинов при ослаблении шаперон-подобной функции ос-кристаллина в клетках хрусталика, приводящем к агрегации структурных белков (Harding, 1998; Bloemendal et al., 2004; Wang et al., 2008). Шаперонные свойства ос-кристаллина ухудшаются с возрастом, вследствие процессов окисления, гликозилирования и частичного протеолиза, что, по всей видимости, служит основной причиной усиления агрегации белков хрусталика (Derham and Harding 1997; 2002).

Предотвращение или замедление агрегации цитоплазматических белков в клетках хрусталика является перспективным способом профилактики и консервативного лечения катаракты. В настоящее время в медицине в качестве основного средства используется хирургическое лечение катаракты, которое, несмотря на значительный прогресс в последние годы, имеет ряд существенных недостатков. Теоретическая возможность предупредить помутнение хрусталика путем торможения агрегации его структурных белков делает актуальным поиск веществ, действующих как на процесс агрегации белков, так и на защитную активность а-кристаллина.

По данным лабораторных и клинических исследований, короткоцепочечные пептиды карнозин, N-ацетилкарнозин и пантетин эффективны при профилактике и лечении катаракты различной этиологии (Аветисов и соавт., 2008; Болдырев, 1999, Babizhaev et al., 2002, Clark et al., 1996, Williams and Munday, 2006). Молекулярные механизмы действия этих препаратов не ясны. Предполагают, что в основе молекулярного действия карнозина и N-ацетилкарнозина лежит способность тормозить процессы свободно-радикального окисления белков и липидов хрусталика, или (и) снижать уровень гликирования белков. Эффекты пантетина, возможно, связаны с ковалентной модификацией и изменением гидрофильности кристаллинов. Не исключено, что эти дипептиды могут воздействовать и на другие стадии процесса катарактогенеза, в частности, денатурацию и агрегацию кристаллинов.

Карнозин и N-ацетилкарнозин относятся к группе гистидин-содержащих дипептидов (ГСД). Это природные соединения, накапливающиеся в возбудимых тканях позвоночных животных в миллимолярных концентрациях. ГСД in vivo участвуют в регуляции гомеостатических и иммунных процессов. У ГСД выявлен ряд терапевтических свойств, среди которых ранозаживляющие, радиозащитные, противоопухолевые и адаптогенные. Эффекты ГСД связывают с механизмами антирадикальной активности, буферного действия в нейтральной области рН, антигликирующего действия и ряда других (Boldyrev, 2006). Пантетин -природный тетрапептид, компонент кофермента А. Пантетин способен вызывать ковалентную модификацию сульфгидрильных групп белков, образуя смешанные дисульфиды (Brandwein et al., 1981).

В ряде работ in vitro показано, что короткоцепочечные пептиды способны препятствовать тепловой агрегации белков (La Rosa et al., 2005), усиливать шаперон-подобную активность а-кристаллина (Clark and Huang, 1996) или проявлять собственную шаперон-подобную активность (Sharma et al., 2000; Ghosh et al., 2005; 2007). С другой стороны, обнаружено, что определенные низкомолекулярные пептидные фрагменты кристаллинов могут способствовать агрегации Р~ и у-кристаллинов и редуцировать шаперон-подобную активность ос-кристаллина (Santhoshkumar et al, 2008; Udupa, P.E and Sharma, 2005). Общие закономерности действия пептидов на агрегацию кристаллинов не установлены.

Мы предположили, что действие короткоцепочечных пептидов in vivo может быть направлено на процесс агрегации белков хрусталика. Настоящая работа посвящена проверке этой гипотезы с помощью специально разработанных нами моделей агрегации белков in vitro. Поскольку в хрусталике млекопитающих преобладает (З-кристаллин, он выбран в качестве белка-субстрата для модельных исследований шаперон-подобного действия а-кристаллина. Выбор ди- и тетрапептидов для экспериментов обусловлен предположительно неодинаковыми механизмами их действия на разные компоненты шаперон-субстратной системы.

Исследуемая проблема находится на стыке биохимии и медицины, а поэтому представляет интерес как для фундаментальной науки, так и для практической лекарственной терапии и профилактики патологических изменений в хрусталике. Поскольку катаракта является самой распространенной патологией зрения в развитых странах, возможность ее терапевтического лечения весьма актуальна. С другой стороны, изучение процессов агрегации белков и шаперон-подобной активности а-кристаллина будет способствовать выяснению его функций в различных тканях в норме и при патологических нарушениях. Кроме этого, решение проблемы нежелательной агрегации белков важно не только для медицинских задач, связанных с «конформационными заболеваниями», но и биотехнологических задач, связанных с неспецифической агрегацией рекомбинантных белков в клеточных культурах.

Цель и задачи работы Целью настоящей работы было сравнение шаперон-подобного действия а-кристаллина и природных короткоцепочечных пептидов (карнозина, N-ацетилкарнозина, анзерина и пантетина) на агрегацию кристаллинов, основанное на анализе кинетики УФ-агрегации рь-кристаллина бычьего хрусталика.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие практические задачи:

1 Разработать модели УФ-индуцированной и тепловой агрегации Рь-кристаллина и смеси а- и рь-кристаллинов

2 Изучить кинетику тепловой и УФ-индуцированной агрегации Рь-кристаллина и смесей а- и рь-кристаллинов при различных концентрациях белков

3 Охарактеризовать шаперон-подобную активность УФ-облученного и нативного а-кристаллина

4 Оценить эффекты короткоцепочечных пептидов на кинетику УФ-индуцированной агрегации рь-кристаллина смесей а- и pL-кристаллинов

5 Охарактеризовать взаимодействие короткоцепочечных пептидов с кристаллинами

Научная новизна. Настоящая работа представляет собой оригинальное исследование, в котором впервые количественно охарактеризовано влияние различных короткоцепочечных пептидов на кинетику агрегации (3L-кристаллина и смесей а- и pL-кристаллинов, и на основании полученных экспериментальных данных предложен механизм их действия. В работе была использована оригинальная установка для регистрации кинетических кривых агрегации белка при УФ-облучении в режиме реального времени. Установлено, что N-ацетилкарнозин и анзерин дозо-зависимым образом замедляют процесс УФ-агрегации Рь-кристаллина, что сопровождается уменьшением размеров агрегатов белка. D-пантетин, в отличие от ГСД, дозо-зависимым образом замедляет УФ-агрегацию смеси а- и Рь-кристаллинов, что связано со специфической модуляцией активности а-кристаллина D-пантетином. Показано, что УФ-облучение усиливает шаперон-подобную активность а-кристаллина по отношению к рь-кристаллину в связи с конформационной перестройкой а-кристаллина под действием УФ света.

Практическое значение работы. Изучение молекулярных эффектов короткоцепочечных пептидов на взаимодействия между кристаллинами in vitro будет способствовать пониманию тонких механизмов агрегации белков. Успехи в этом направлении могут стать основой для раскрытия механизмов катарактогенеза на молекулярном уровне и направленного синтеза антикатарактальных препаратов пептидной природы, способных блокировать агрегацию или модулировать шаперон-подобную активность а-кристаллина. Выяснение структурно-функциональной связи активности короткоцепочечных пептидов в отношении кинетки агрегации белков может стать отправной точкой для создания препаратов-антиагрегантов.

Апробация работы и публикации. Результаты диссертационной работы были представлены на XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2005),

Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), II Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2007), на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова (2008). По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, среди которых 2 статьи в изданиях, входящих в список ВАК РФ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Дижевская, Антонина Константиновна

выводы

2. Показано, что константа скорости процесса агрегации, индуцированной как ультрафиолетом, так и повышением температуры, линейно зависит от концентрации белка, что свидетельствует о псевдопервом порядке реакции. Однако, при УФ-индуцированной агрегации линейный рост константы скорости характерен только для области низких концентрации белка (0,251,00 мг/мл).

3. Дана количественная оценка эффективности а-кристаллина как шаперон-подобного белка на модели УФ-индуцированной и тепловой агрегации pL-кристаллина. Показано, что шаперон-подобная активность а-кристаллина в отношении агрегации рь-кристаллина, поврежденного теплом существенно (примерно в 4 раза) превышает шаперон-подобную активность а-кристаллина в отношении агрегации УФ поврежденного PL-кристаллина, что совпадает с полученными ранее данными о тепловой активации а-кристаллина.

4. Показано, что роль светофильтрующей составляющей в защитном действии а-кристаллина уменьшается при росте массового соотношения a:pL. При массовом соотношении 1:1 (a:pL) 30% защитного эффекта а-кристаллина приходится на его экранирующий эффект, тогда как при соотношении 1:8 (a:PL) на экранирующий эффект приходится 93% защитного эффекта a-кристаллина.

5. УФ облучение усиливает шаперон-подобную активность а-кристаллина по отношению к рь-кристаллину, что, по-видимому, связано с конформационной перестройкой a-кристаллина под действием УФ света.

6. Разработан метод исследования УФ-индуцированной агрегации белков, который позволяет, разделяя во времени процесс повреждения белка и его агрегации, анализировать механизмы влияния шаперон-подобных соединений на агрегацию белков хрусталика.

7. Показано, что N-ацетилкарнозин, анзерин и D-пантетин дозо-зависимым образом замедляют процесс УФ-индуцированной агрегации (Зь-кристаллина.

8. Торможение УФ-индуцированной агрегации pL-кристаллина в присутствии N-ацетилкарнозина и анзерина сопровождается существенным снижением размеров агрегатов.

9. Торможение УФ-индуцированной агрегации смеси а- и рь-кристаллина в присутствии D-пантетина обусловлено как светофильтрующим действием соединения, так и активацией шаперон-подобных свойств а-кристаллина.

Заключение

Изучение агрегации белков хрусталика как одной из ключевых стадий формирования катаракты представляет собой актуальную проблему современной биомедицины. В работе основной акцент сделан на изучение процесса агрегации кристаллинов на молекулярном уровне.

В диссертации применена разработанная автором модель стресс-индуцированной агрегации белков хрусталика в условиях in vitro, предполагающая онлайн-детекцию помутнения раствора белка при УФ-облучении или нагревании. Данная модель имитирует образование нерастворимых белковых агрегатов в клетках хрусталика при развитии катаракты.

Значительная часть работы посвящена исследованию кинетики агрегации (Зь-кристаллина при различных стрессорных воздействиях и анти-агрегационного действия а-кристаллина как шаперон-подобного белка. С помощью вышеуказанной модели в работе количественно охарактеризована шаперон-подобная активность бычьего а-кристаллина при взаимодействии с его естественным субстратом - (Зь-кристаллином. В условиях УФ-агрегации проведена экспериментальная оценка вклада «УФ-экранирующего эффекта» в защитное действие а-кристаллина. Установлен феномен усиления шаперон-подобной активности а-кристаллина под воздействием УФ-облучения. Предложен механизм действия а-кристаллина, объясняющий подавление тепловой агрегации белков.

В данной работе впервые была исследована способность короткоцепочечных пептидов воздействовать на кинетику УФ-агрегации кристаллинов бычьего хрусталика в условиях in vitro. Показано, что N-ацетилкарнозин, анзерин и D-пантетин, в отличие от карнозина, дозо-зависимым образом замедляют процесс УФ-агрегации [Зь-кристаллина. Установлено, что действие N-ацетилкарнозина и анзерина происходит на начальных этапах фотохимического повреждения рь-кристаллина и сопровождается уменьшением размера белковых агрегатов. Проведенная автором количественная характеристика эффективности действия короткоцепочечных пептидов, подавляющих агрегацию белка, позволяет отобрать вещества, наиболее перспективные для решения практических задач.

Дальнейшим шагом в исследовании анти-агрегационных свойств короткоцепочечных пептидов N-ацетилкарнознна и анзерина, на наш взгляд, может стать изучение механизма их действия методами компьютерного моделирования с целью выявления специфических межмолекулярных взаимодействии эффективных пептидов с кристаллинами. Подобный подход может открыть путь для направленного дизайна и синтеза пептидов-антиагрегантов с шаперон-подобными свойствами. С другой стороны, интересным является исследование эффективности смесей различных пептидов для выяснения возможности потенцирования эффектов при их совместном действии на кристаллины. В этом направлении уже сделаны первые шаги совместно с коллегами из НИИ глазных болезней им Гельмгольца РАМН: был оценен антикатарактальный эффект комбинированного препарата N-ацетилкарнозина и D-пантетина в исследовании in vivo на «пролонгированной» модели ультрафиолет-индуцированной катаракты у крыс и получены обнадеживающие результаты.

С появлением данной работы молено ожидать возрастания интереса исследователей к короткоцепочечным пептидам, в том числе гистидин-содержащим дипептидам, как антпагрегантам белков. Перспективным направлением представляется системное изучение механизмов действия короткоцепочечных пептидов в условиях in situ и in vivo, с целью разработки инновационных технологий терапевтического лечения конформационных заболеваний.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дижевская, Антонина Константиновна, Москва

1. Болдырев, А.А. (1999) Карнозин и защита тканей от окислительного стресса.-М., Диалог-МГУ, 362с.

2. Дижевская А.К., Полянский Н.Б., Муранов К.О., Болдырев А.А., Островский М.А. (2009) Молекулярный механизм действия гистидин-содержащих пептидов на агрегацию pL-кристалина. Молекулярная медицина, (в печати).

3. Деев, А.И. и Бабижаев, М.А. (1997) Возможно ли задержать развитие катаракты? Успехи геронтол., 1:85-88.

4. Зак, П.П., Егорова, Т.С., Розенблюм, Ю.З., Островский, М.А.(2005) Спектральная коррекция зрения научные основы и практические приложения. М., «Научный мир», 454с.

5. Кривандин, А.В., Муранов, К.О., Островский, М.А. (2004) Исследование комплексообразования в растворах ос- и рь-кристаллинов при 60°С. Молекулярная биология, 38(3): 1-15.

6. Кривандин, А.В., Муранов, К.О., Потураева, И.Д., Полянский, Н.Б., Островский, М.А. (2006) Доклады академии наук, 409(4): 1-5.

7. Курганов, Б.И. (2002) Оценка активности молекулярных шаперонов в тест-системах, основанных на подавлении агрегации белков. Успехи биологической химии, 42:89-138.

8. Лакович, Дж. (1986) Основы флуоресцентной спектроскопии. М., Мир, с. 345-385.

9. Мальцев, Э.В. (1988) Хрусталик. М., Медицина, 192 с.

10. Малюгин, Б.Э. (2006) Хирургия катаракты и интраокулярная коррекция афакии: достижения, проблемы и перспективы развития. Вестник офтальмологии, 122(1):37-41.

11. Островский, М.А., Федорович, И.Б., Донцов, А.Е. (1987) Процессы фотоокисления в структурах глаза. Защитная функция хрусталика и защитных пигментов. Биофизика, 32(5): 896-909.

12. Полунин, Г.С., Шеремет H.JL, Карпова, О.Е. (2007) Этиопатогенез и медикаментозное лечение возрастной катаракты. Вестник офтальмологии, 123(4):48-51.

13. Реброва, О., Болдырев, А. А. (1995) Карнозин и родственные соединения ингибируют хемилюминесценцию липопротеинов плазмы крови человека при окислении in vitro. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 119:152-154.

14. Материалы Международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки». Тюмень, с. 29-32.

15. Формазюк, В.Е. и Сергиенко, В.И. (1992) Применение карнозина в медицинской практике. Приоритеты: прошлое и будущее. Биохимия, 57:14041416.

16. Ханова Е.А., Тимофеева А.К., Самойлов A.M. (2005) Влияние акристаллина на кинетику тепловой агрегации (3-кристаллина. XIIмеждународная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2005». Тезисы докладов, с.239-240.

17. Aldini, G., Carini, M., Beretta, G., Bradamante, S., Facino, R.M. (2002) Carnosine is a quencher of 4-hydroxy-nonenal: through what mechanism of reaction? Biochem. Biophys. Res. Commun., 298:699-706.

18. Andley, U.P. (2007) Crystalline in the eye: Function and pathology. Progress in Retinal and Eye Research, 26, 78-98.

19. Andley, U.P., Clark, B.A. (1989) Generation of oxidants in the near-UV photooxidation of human lens alpha-crystallin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.; 30:706-713.

20. Andley, U.P.; Hamilton, P.D., Ravi, N. (2008) Mechanism of Insolubilization by a Single-Point Mutation in alphaA-Crystallin Linked with Hereditary Human Cataracts. Biochemistiy, 47:9697-9706.

21. Andley, U.P., Mathur, S., Griest, T.A., Petrash, J.M. (1996) Cloning, expression, and chaperone-like activity of human alphaA-crystallin. J. Biol. Chem., 271:31973-31980.

22. Anfinsen, С. B. (1973) Principles that govern the folding of protein chains. Science, 181: 223-230.

23. Aquilina JA, Benesch JL, Bateman OA, Slingsby C, Robinson CV., 2003. Polydispersity of a mammalian chaperone: mass spectrometry reveals the population of oligomers in alphaBcrystallin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:10611-10616.

24. Arora, A., Ha, C., Park, C.B. (2004) Inhibition of insulin amyloid formation by small stress molecules. FEBS Letters, 564:121-125.

25. Augusteyn, R.C. (2004) Dissociation is not required for alpha-crystallin's chaperone function. Exp. Eye Res., 79(6):781-784.

26. Augusteyn, R.C.and Koretz, J.F. (1987) A possible structure for alpha-crystallin. FEBS Letters, 28; 222(1): 1-5.

27. Augusteyn, R.C., Muranel, L., Nicola, A., Stevens, A. (2002) Chaperone activity in the lens. Clin. Exp. Optom., 85(2):83-90.

28. Babizhayev, M. A., Deyev, A. I., Yermakova, V. N., Remenshchikov, V.V., Bours, J. (2006) Revival of the Lens Transparency with N-Acetylcarnosine. Curren t Drug Therapy, 1:91-116.

29. Babizhayev, M.A., Deyev, A.I., Yermakova, V.N., Semiletov, Y.A., Davydova, N.G., Goldman, I.M. (2002) Efficacy of N-acetylcarnosine in the treatment of cataracts. Drugs R&D., 3: 87-103.

30. Bateman, O.A., Sarra, R, van Genesen S.T., Kappe, G., Lubsen, N.H, Slingsby, C. (2003) The stability of human acidic beta-crystallin oligomers and hetero-oligomers. Exp. Eye Res., 77:409-422.

31. Becker, J., Craig, E.A (1994) Heat-shock proteins as molecular chaperones. Eur. J. Biochem., 219(1-2): 11-23.

32. Berlett B. S., Stadtman E. R. (1997) Protein Oxidation in Aging, Disease, and Oxidative Stress. J.Biol.Chem., 272(33):20313-20316.

33. Beswick, H. Т., Harding, J. J. (1987) High-molecularweight crystallin aggregate formation resulting from non-enzymic carbamylation of lens crystallins: relevance to cataract formation. Exp. Eye Res., 45:569-78.

34. Bettelheim, F.A, and Paunovic, M. (1979) Light scattering of the normal human lens, I. Application of random density and orientation fluctuationtheory. Biophys. /., 26: 85-100.

35. Bhat, S.P. (2004) Transparency and non-refractive functions of crystallins-a proposal. Exp.Eye Res., 79(6):809-816.

36. Bhat, S. P., Nagineni, C. N. (1989) alpha В subunit of lens-specific protein alpha-crystallin is present in other ocular and non-ocular tissues. Biochem. Biophys. Res. Commun., 158:319-325.

37. Bloemendal, H. (1977) The vertebrate eye lens. Science, 197(4299): 127-138.42 a) Bloemendal, М. and Bloemendal, H. (1995) The isolation of lens crystallins using lens liquid as the solvent. Exp. Eye Res., 61(6):757-761.

38. Bloemendal, H. and de Jong, W.W. (1991). Lens proteins and their genes. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol, 41:259-281.

39. Boldyrev, A.A. (2006) Carnosine and Oxidative Stress in Cells and Tissues. Nova Science Publishers, 297p.

40. Boldyrev, A.A., Dupin, A.M., Bunin A. Ya., Babizhaev, M.A. and Severin, S.E. (1987) The antioxydative properties of carnosine, a natural histidine-containing dipeptide. Biochem. Intern., 15:1105-1113.

41. Boldyrev, A., Abe, H., Stvolinsky, S., Tyulina, O. (1995) Effect of carnosine and relative compounds on generation of free oxygen species: A comparative study. Сотр. Biochem. Physiol., 112B:481-485.

42. Borkman, R.F., Knight, G., Obi, B. (1996) The molecular chaperone alpha-crystallin inhibits UV induced protein aggregation. Exp. Eye Res., 62:141-148.

43. Borkman, R. F., McLaughlin, J. ( 1995) The molecular chaperone function of a-crystallin is impaired by UV photolysis. Photochem. Photobiol., 62:10461051.

44. Brandwein, H. J., Lewicki, J. A., Murad, F. (1981) Reversible Inactivation of Guanylate Cyclase by Mixed Disulfide Formation. J. Biol. Chem., 256(6):2958-2962.

45. Brown, C.E., Antholine, W.E. (1979). Chelation chemistry of carnosine. Evidence that mixed complexes may occur in vivo. J. Phys. Chem., 83:3314-3319.

46. Brownson, C., Hipkiss, A. (2000) Carnosine reacts with a glycated protein. Free Radical Biology & Medicine, 28(10): 1564-1570.

47. Burgio M.R., Bemiett P.M, Koretz J.F. (2001) Heat-induced quaternary transitions in hetero- and homo-polymers of a-crystallin. Molecular Vision, 7:228233.

48. Burgio, R.M., Kim, C. J., Dow C.C., and Koretz, J. F.(2000)Correlation between the Chaperone-like Activity and Aggregate Size of a-Crystallin with Increasing Temperature. Biochem. Biophys. Res. Commun., 268:426-432.

49. Carrell, R.W., Lomas, D.A. (1997) Conformational disease. Lancet, 350:134-138.

50. Carver, J.A., Aquilina, J.A., Truscott, RJ. (1994) A possible chaperone-like quaternary structure for alpha-crystallin. Exp. Eye Res., 59(2):231-234.

51. Carver, J. A., Lindner, R.A. (1998) NMR spectroscopy of alpha-crystallin. Insights into the structure, interactions and chaperone action of small heat-shock proteins. Int. J. Biol. Macromol., 22(3-4): 197-209.

52. Clark, J.I., Livesey, J.C., Steele J.E. (1996) Delay or inhibition of rat lens opacification using pantethine and WR-77913. Exp. Eye Res., 62(l):75-84.

53. Clark, J. and Huang, Q. (1996) Modulation of the chaperone-like activity of bovine a-crystallin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:15185-15189.

54. Dahl, Т.A., Midden, W.R. and Hartman, P.E. (1988) Some prevalent biomolecules as defenses against singlet oxygen damage. Photochem. Photobiol., 47:357-362.

55. Das. В. K., J. J.-N. Liang (1997) Detection and characterization of a-crystallin intermediate with maximal chaperone-like activity. Biochem. Biophys. Res. Commun., 236:370-374.

56. Das, K. P. and W. K. Surewicz (1995) Temperature-induced exposure of hydrophobic surfaces and its effect on the chaperone activity of a-crystallin. FEBS Lett., 369:321-325.

57. Delaye, M., and Tardieu, A. (1983) Short range order of crystallin proteins accounts for eye lens transparency. Nature, 302: 415-417.

58. Delcourt, C., Carrier, I., Ponton-Sanchez A., Lacroux, A., Covacho, M.J., Papoz, L. (2000) Light exposure and the risk of cortical, nuclear and posterior subcapsular cataracts. Arch. Ophtalmol., 118:385-392.

59. Derham, B.K., Harding, J.J. (1997) Effect of aging on the chaperone-like function of human alpha-crystallin assessed by three methods. Biochem J., 328 (Pt 3):763-768.

60. Derham, B.K., Harding, J.J. (2002) Effects of modifications of alpha-crystallin on its chaperone and other properties. Biochem. J., 364, 711-717.

61. Dhir, P., Akhtar, N J., Sun, Т., Liang, J.J. (1999) Photooxidized Products of Recombinant aA-Crystallin and W9F Mutant. Photochem. Photobiol, 69(3):329-335.

62. Diamant, S., Eliahu, N., Rosenthal, D. and Goloubinoff P. (2001) Chemical Chaperones Regulate Molecular Chaperones in Vitro and in Cells under Combined Salt and Heat Stresses. J.Biol.Chem., 276(43):39586-39591.

63. Dillon, J. (1984) Photolytic changes in lens proteins. Curr. Eye.Res., 3:145150.

64. Ecroyd, H., Carver, J.A. (2008) The effect of small molecules in modulating the chaperone activity of aB-crystallin against ordered and disordered protein aggregation. FEBS Journal, 275:935-947.

65. Ellozy, A., Ceger, P., Wang, R.H., Dillon, J. (1996) Effect of the UV modification of a-crystallin on its ability to suppress nonspecific aggregation. Photochem. Photobiol., 64:344-348.

66. Evans, P.; Slingsby, C.; Wallace, B. A. (2008) Association of partially folded lens betaB2-crystallins with the alpha-crystallin molecular chaperone. Biochem. J., 409(3):691-699.

67. Fink, A. L. (1998) Protein aggregation: folding aggregates, inclusion bodies and amyloid. Fold. Des., 3(l):R9-23.

68. Finley, E.L., Busman, M., Dillon, J., Crouch, R.K., Schey, K.L. (1997) Identification of photooxidation sites in bovine a-crystallin. Photochem. Photohiol, 66:635-641.

69. Finley, E. L., Dillon, J., Crouch, R. K., Schey, K. L. (1998) Identification of tryptophan oxidation products in bovine alpha-crystallin. Protein Sci., 7(11):2391-2397.

70. Fisher, D.H., Szulc, M.E. (1997) Reduction of pantethine in rabbit ocular lens homogenate. J. Pharm. Biomed. Anal. 15(5):653-662.

71. Fleschner, C. R. (2006) Connexin 46 and connexin 50 in selenite cataract. Ophthalmic Res., 38:24-28.

72. Friberg, G. Pande, J., Ogun, O., Benedelc, G.B. (1996) Pantethine inhibits the formation of high-Tc protein aggregates in gamma В crystallin solutions. Curr. Eye Res., 15(12): 1182-1190.

73. Fujii N., Uchida H., Saito T. (2004) The damaging effect of UV-C irradiation on lens a-crystallin. Molecular vision, 10:814-820.

74. Fujimori, E. (1982) Crosslinking and blue-fluorescence of photo-oxidized calf-lens alpha-crystallin. Exp. Eye Res., 34(3):381-388.

75. Chiou, S. H., Azari, P., Himmel, M. E., Squire, P. G. (1979) Isolation and physical characterization of bovine lens crystallins. Int. J. Pept. Protein Res., 13:409-417.

76. Goosey, D., Zigler, J.S., Kinoshita, J.H. (1980) Cross-linking of lens crystallins in a photodynamic system: a process mediated by singlet oxygen. Science, 208:1278-1280.

77. Hains, P. G., Truscott, R. J. (2007) Post-Translational Modifications in the Nuclear Region of Young, Aged, and Cataract Human Lenses. J.Proteome.Res., 6(10):3935-3943.

78. Haley D.A., Horwitz, J., Stewart, P.L. (1998) The small heat-shock protein, alphaB-crystallin, has a variable quaternary structure. J. Mol. Biol., 277(l):27-35.

79. Hammond, C., Helenius, A. (1995) Quality control in the secretory pathway. Curr. Opin. Cell. Biol., 7:523-529.

80. Hanson, S.R.A., Hasan, A., Smith, D.L., Smith, J.B. (2000) The major in vivo modifications of the human waterinsoluble lens crystallins are disulfide bonds, deamidation, methionine oxidation and backbone cleavage. Exp. Eye. Res.71: 195-207.

81. Harding, J.J. (1991) Cataract: Biochemistry, Epidemiology and Pharmacology. London: Chapman and Hall.

82. Harding, J.J. (2002) Viewing molecular mechanisms of ageing through a lens. Ageing Res. Rev., 1:465^79.

83. Harding, J.J. (2001) Can drugs or micronutrients prevent cataract? Drugs Aging., 18(7):473-486.

84. Harding, J J. (1998) Cataract, Alzheimer's disease, and other conformational diseases. Curr. Opinion in Ophtalmol.\ 9(1): 10-13.

85. Harrington, V., Srivastava, O. P., Kirk, M. (2007) Proteomic analysis of water insoluble proteins from normal and cataractous human lenses. Mol.Vis., 13:1680-1694.

86. Hipkiss, A.R., Brownson, C., Bertani, M.F., Ruiz, E., Ferro, A. (2002) Reaction of carnosine with aged proteins: another protective process? Ann. N. Y. Acad. Sci., 959:285-294.

87. Hook, D.W.A., Harding, J.J. (1997) Inactivation of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase by sugars, prednisolone 21-hemisuccinate, cyanate and other small molecules. Biochim. Biophys. Acta, 1362:232—242.

88. Hook, D.W.A., Harding, J.J. (2002) The effect of modification of alpha-crystallin by prednisolone-21-hemisuccinate and fructose 6-phosphate on chaperone activity. Dev. Ophthalmol., 35:150-160.

89. Horwitz, J. (2003) Alpha-crystallin. Exp. Eye Res., 76(2):145-153.101 a) Horwitz, J. (2008) Alpha crystallin: The quest for a homogeneous quaternary structure. Exp. Eye Res., 88(2): 190-194.

90. Horwitz, J. (1992) Alpha-crystallin can function as a molecular chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(21): 10449-10453.

91. Horwitz, J., Huang, Q., Ding, L. (2004) The native oligomeric organization of alpha-crystallin, is it necessary for its chaperone function? Exp. Eye Res., 79:817-821.

92. Ingolia, T.D. and Craig, E.A. (1982) Four small Drosophila heat shock proteins are related to each other and to mammalian alpha-crystallin. Proc. Nail. Acad. Sci. USA., 79:2360-2364.

93. Inoue, A.; Sasaki, D.; Satoh, K. (2004) Minimization of photooxidative insult to calf lens protein irradiated with near UV-light in the presence of pigmented glucosides derived from human lens protein Exp. Eye Res., 79:833-837.

94. Itzhaki, R.S. and Gall, D.M. (1964) A microbiuret method for estimation of protein. Anal.Biochem., 9:401-410.

95. Kang, J.H., Kim, K.S., Choi, S.Y., Kwon, H.Y., Won, M.H., Kang T.C. (2002) Protective effects of carnosine, homocarnosine and anserine against peroxyl radical-mediated Cu,Zn-superoxide dismutase modification. Biochim. Biophys. Acta, 1570:89-96.

96. Korlimbinis, A.; Hains, P.G.; Truscott, R.J.; Aquilina,J.A. (2006) 3-Hydroxykynurenine Oxidizes alpha-Crystallin: Potential Role in Cataractogenesis. Biochemistry, 45(6): 1852-1860.

97. Koteiche, H.A., McHaourab, H.S. ( 2003) Mechanism of chaperone function in small heat-shock proteins. Phosphorylation-induced activation of two-mode binding in alphaB-crystallin. J. Biol. Chem., 278:10361-10367.

98. Krivandin, A.V., L'vov, Yu. M., Ostrovsky, M.A., Fedorovich, I.B, Feigin, L.A. (1989) Structural conversions of crystallins under senile cataract and UV-irradiation studied by X-ray diffraction. Exp. Eye Res., 49:853-859.

99. Kuhn H. J., Braslavsky S. E., Schmidt R. (2004) Chemical actinometry (IUPAC Technical Report). Pure and applied chemistry. Chimie pure et appliquee, 76(12):2105-2146.

100. Kyselova, Z.; Stefek, M., Bauer, V. (2004) Pharmacological prevention of diabetic cataract./. Diabetes Complications, 18(2): 129-140.

101. Lampi, K.J., Ma, Z., Hanson, S.R.A., Azuma, M., Shih, M., Shearer, T.R., Smith, D.L., Smith, J.B., David, L.L. (1998) Age-related changes in human lens crystallins identified by two dimensional gel electrophoresis. Exp. Eye Res., 67:3143.

102. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227:680-685.

103. La Rosa, C., Milardi, D., Amato, E., Pappalardo, M. and Grasso, D. (2005) Molecular mechanism of the inhibition of cytochrome с aggregation by Phe-Gly. Archives of Biochemistry and Biophysics, 435:182-189.

104. Lee, J. S., Liao, J. H.; Wu, S. H. and Chiou, S. H. (1997) д-Crystallin acting as a molecular chaperonin against photodamage by UV irradiation. J. Protein Chem., 16:283-289.

105. Levine, R. L., Williams, J. A., Stadtman, E. R. and Shacter, E. (1994). Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins. Methods Enzymol. 233:346-357.

106. Linetsky, M., James, H.L., Ortwerth, B.J. (1996) The generation of superoxide anion by the UVA irradiation of human lens proteins. Exp.Eye.Res., 63(l):67-74.

107. Linetsky, M., Ranson, N., Ortwerth, B.J. (1998) The aggregation in human lens proteins blocks the scavenging of UVA-generated singlet oxygen by ascorbic acid and glutathione. Arch. Biochem. Biophys., 351:180—188.

108. Liu, B.F., Liang, J.J. (2007) Protein-protein interactions among human lens acidic and basic P-crystallins. FEBS Lett., 581(21):3936~3942.

109. Lorand, L. (1988) Transglutaminase mediated crosslinking of proteins and cell aging: the erythrocyte and lens models. Adv. Exp. Med. Biol., 231:79-94.

110. Lou, M. F., Dickerson, J. R., Jr. and Garadi, R. (1990) The role of protein-thiol mixed disulfides in cataractogenesis. Exp. Eye Res., 50:819-826.

111. Ma, Z., Hanson, S.R., Lampi, K.J., David, L.L., Smith, D.L., Smith, J.B. (1998) Age-related changes in human lens crystallins identified by HPLC and mass spectrometry. Exp. Eye Res., 67:21-30.

112. MacRae, Т.Н. (2000) Structure and function of small heat shock/alpha-crystallin proteins: established concepts and emerging ideas. Cell Mol. Life Sci., 57(6):899-913.

113. Manna, Т., Sarkar, Т., Poddar, A., Roychoydhury,M., Das, K.P., Bhattacharyya, B. (2001) Chaperone-like activity of tubulin. Binding and reactivation of unfolded substrate enzymes. J. Biol. Chem., 276(43):39742-39747.

114. McCarty, С. A.; Taylor, H. R. (2002) A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol., 35:21—31.

115. McDermott, M., R. Chiesa, J.Roberts and J. Dillon (1991) Photooxidation of specific residues in alpha-crystallin polypeptides. Biochemistry, 30:8653-8660.

116. McHaourab, H.S., Dodson, E.K., Koteiche, H.A. (2002) Mechanism of chaperone function in small heat shock proteins. Two-mode binding of the excited states of T4 lysozyme mutants by alphaA-crystallin. J. Biol. Chem., 277:4055740566.

117. Mchaourab, H. S., Kumar, M. S; and Koteiche, H.A. (2007). Specificity of aA-crystallin binding to destabilized mutants of pBl-crystallin. FEBS Lett., 581(10):1939—1943.

118. Merck, K.B; De Haard-Hoekman, W.A; Oude Essink, B.B; Bloemendal, H. and De Jong, W.W. (1992) Expression and aggregation of recombinant alpha A-crystallin and its two domains. Biochim. Biophys. Acta, 1130:267-276.

119. Merlini, G., Bellotti, V., Andreola, A., Palladini, G., Obici, L., Casarini, S., Perfetti, V. (2001) Protein aggregation. Clin. Chem. Lab. Med., 39:1065-1075.

120. Miesbauer, L. R., Zhou, X., Yang, Z., Yang, Z., Sun, Y., Smith, D. L. and Smith, J. B. (1994) Post-translational modifications of the water soluble human lens crystallins from young adults. J. Biol. Chem., 269:12494-12502.

121. Muchowski, P. J., and Clark, J. I. (1998) ATP-enhanced molecular chaperone functions of the small heat shock protein human alpha В crystallin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95:1004-1009.

122. Nagaraj, R.H., Oya-Ito, Т., Padayatti, P.S., Kumar, R., Mehta, S., West, K., Levison, В., Sun, J., Crabb, J.W., and Padival, A.K. (2003) Enhancement of

123. Chaperone Function of a-Crystallin by Methylglyoxal Modification. Biochemistry, 42:10746-10755.

124. Narberhaus, F. (2002) R-Crystallin-type heat shock proteins: Socializing minichaperones in the context of a multichaperonc network, Microbiol. Mol. Biol., 66:64-93.

125. Ostrovsky, M. A., Sergeev, Y. V., Atkinson, D. В., Soustov, L. V. and Hejtmancik J. F. (2002) Comparison of ultraviolet induced photo-kinetics for lens-derived and recombinant (3-crystallins. Molecular Vision; 8:72-78.

126. Pegova, A., Abe, H. and Boldyrev, A. (2000). Hydrolysis of carnosine and related compounds by mammalian carnosinases. Сотр. Biochem. Physiol. В Biochem. Mol. Biol. 127(4):443-446.

127. Ponce, A., Sorensen, C., Takemoto, L. (2006) Role of short-range protein interactions in lens opacifications. Molecular Vision, 12:879-884.

128. Putilina, Т., Skouri-Panet, F., Prat, K., Lubsen, N. H. & Tardieu, A. (2003) Subunit exchange demonstrates a differential chaperone activity of calf a-crystallintoward (3-low and individual y-crystallins. J. Biol. Chem., 278: 13747-13756.

129. Raman, В., and Rao, C.M. (1997) Chaperone-like activity and temperature-induced structural changes of alpha-crystallin. J. Biol. Chem., 272:23559-23564.

130. Rao, P.V.; Huang, Q.L.; Horwitz,J.; Zigler, J.S. (1995) Evidence that alpha-crystallin prevents non-specific protein aggregation in the intact eye lens. Biochim.Biophys.Acta, 1245(3):439-447.

131. Rao, G.; Santhoshkumar, P.; Krishna Sharma, K. (2008) Chaperone (3A3/A1102-117 peptide interacting sites in human aB crystallin. Molecular Vision, 14:666-674.

132. Reddy, G.B., Das, K.P., Petrash, J.M. and Surewicz, W.K. (2000) Temperature-dependent chaperone activity and structural properties of human alphaA- and alphaB-crystallins. J Biol Chem., 275(7):4565-4570.

133. Reddy, G.B.; Kumar, P.A.; Kumar, M.S. (2006) Chaperone-like activity and hydrophobicity of alpha-crystallin. IUBMB Life., 58(11):632-641.

134. Rekker, R.F. (1977) The Hydrophobic Fragmental Constant. Elsevier. Amsterdam.

135. Robertson, L J., David L.L., Riviere M.A., Wilmarth, P.A., Muir, M.S., Morton, J.D. (2008) Susceptibility of ovine lens crystallins to proteolytic cleavage during formation of hereditary cataract. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 49:10161022.

136. Saha, S. and Das, K.P. (2004) Relationship between chaperone activity and oligomeric size of recombinant human alphaA- and alphaB-crystallin: a tryptic digestion study. Proteins, 57(3):610-617.

137. Saibil, H. (2000) Molecular chaperones: containers and surfaces for folding, stabilising or unfolding proteins. Curr. Opin. Struct. Biol., 10:251-258.

138. Santhoshkumar, P; Udupa; P.E., Murugesan, R. and Sharma, K.K. (2008) Significance of interactions of low molecular weight crystallin fragments in lens aging and cataract formation. J. Biol. Chem.; 283(13):8477-8485.

139. Sathish HA, Stein RA, Yang G, Mchaourab HS. (2003) Mechanism of chaperone function in small heat-shock proteins. Fluorescence studies of the conformations of T4 lysozyme bound to aB-crystallin. J. Biol. Chem., 278:4421444221.

140. Schauerte, J.A. and Gafni, A. (1995) Photodegradation of tryptophan residues and attenuation of molecular chaperone activity in alpha-crystallin are correlated. Biochem Biophys Res Commun., 212(3):900-905.

141. Seidler, N.W., Shokry, S.S. and Nauth, J. (2001) Properties of a glycation product derived from carnosine,,/. Biochem. Mol. Biol. Biophys., 5:153- 162.

142. Seidler, N.V., Yeargans, G. S., and. Morgan, T. G (2004) Carnosine disaggregates glycated a-crystallin: an in vitro study. Archives of Biochemistiy and Biophysics, 427:110-115.

143. Sergeev, Y„ Wingfield, P., Hope, J. and Hejtmancik, J.F. (1997) The role of C-terminal extension in bB2-crystallin oligomerization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 38:206-209.

144. Shang, F., Gong, X., Palmer, H.J., Nowell T.R., Taylor J., Taylor A. (1997) Age-related Decline in Ubiquitin Conjuction in response to Oxidative Stress in the Lens. Exp.Eye Res., 64:21-30.

145. Sharma, K.K., Kumar, R.S., Kumar, G.S., Quinn, R.T. (2000) Synthesis and characterization of a peptide identified as a functional element in alphaA-crystallin. J. Biol. Chem., 275(6):3767-3771.

146. Sharma, K.K. and Ortwerth, B.J. (1995) Effect of cross-linking on the chaperone-like function of alpha A crystallin. Exp.Eye.Res., 61(4):413-421.

147. Shih, M., David, L.L., Lampi, K.J., Ma, H., Fukiage, C., Azuma, M. and Shearer, T.R. (2001) Proteolysis by m-calpain enhances in vitro light scattering by crystallins from human and bovine lenses. Curr. Eye Res., 22:458-469.

148. Siezen, R.G., Fisch, M.R., Slingsby, C., and Benedek, G. (1985) Opacification of y-crystallin solutions from calf lens in relation to cold cataract formation. Proc. Nad. Acad. Sci. USA., 82:1701-1705.

149. Smulders, R. H., van Boekel, M. A., de Jong, W. W. (1998) Mutations and modifications support a 'pitted-flexiball' model for alpha-crystallin. Int. J.Biol. Macromol., 22:187-196.

150. Spector, A. (1984) Oxidation and Cataract. Ciba Found. Symp., 106:48-64.

151. Spector, A. and Roy, D. (1978) Disulfide-linked high molecular weight protein associated with human cataract. Proc. Natl. Acad. Sci., 75:3244-3248.

152. Speed, M. A., King, J. & Wang, D. J. (1997) Polymerization mechanism of polypeptide chain aggregation. Biotechnol. Bioeng., 54:333-343.

153. Srinivas, V., Raman, В., Rao, K.S., Ramakrishna, Т., Rao, Ch.M.(2003) Structural perturbation and enhancement of the chaperone-like activity of alpha-crystallin by arginine hydrochloride. Protein Sci., 12:1262-1270.

154. Srinivas, V., Raman, В., Rao, K.S., Ramakrishna, T. and Rao, Ch.M. (2005) Arginine hydrochloride enhances the dynamics of subunit assembly and the chaperone-like activity of alpha-crystallin. Molecular Vision, 11:249-255.

155. Srivastava, P., Kirk, C., Srivastava, K. (2004) Characterization of Covalent Multimers of Crystallins in Aging Human Lenses. J. Biol. Chem., 279(12): 1090110909.

156. Stafford M.J. (2001) The histology and biology of the lens. Optometry today, 23-30.

157. Sugiyama, M, Fujii, N., Morimoto, Y., Kurabayashi, S., Vigild, M.E., Nakagawa, Т., Sato, Т., Itoh, K., Mori, К and Fukunaga, T. (2008) Structural Evolution of Human Recombinant rB-Crystallin under UV Irradiation. Biomacromolecules, 9: 431-434.

158. Sun, Y., MacRae, Т.Н. (2005) Small heat shock proteins: molecular structure and chaperone function. Cell MolLife Sci., 62(21):2460-76.

159. Surewicz, W.K., Olesen, P.R. (1995) On the thermal stability of alpha-crystallin: a new insight from infrared spectroscopy. Biochemistry, 34:9655-9660.

160. Takemoto, L. (1996) Increase in the Intramolecular Disulfide Bonding of Alpha-A Crystallin During Aging of the Human Lens Exp. Eye Res., 63:585-590.

161. Takemoto, L., Boyle, D. (1998) The possible role of alpha-crystallins in human senile cataractogenesis. Int. J. Biol. MacromoL, 22(3-4):331-337.

162. Takemoto, L and Sorensen, C.M. (2008) Protein-protein interactions and lens transparency.£x/? Eye Res., 87(6):496-501.

163. Tardieu, A. (1998) alpha-Crystallin quaternary structure and interactive properties control eye lens transparency. Int J Biol Macromol., 22(3-4):211-217.

164. Taylor A. (2004) Function of the ubiquitin proteolytic pathway in the eye. Exp Eye Res., 78(1):1-14.

165. Truscott, R.J.W.(2005) Age-related nuclear cataract-oxidation is the key. Exp Eye Res., 80(5):709-725.

166. Udupa, P.E. and Sharma, K.K. (2005) Effect of oxidized betaB3-crystallin peptide (152-166) on thermal aggregation of bovine lens gamma-crystallins: identification of peptide interacting sites. Exp Eye Res., 80(2): 185-196.

167. Vanhoudt, J., Abgar, S., Aerts, Т., Clauwaert, J. (2000) Native quaternary structure of bovine alpha-crystallin. Biochemistry, 39(15):4483-4492.

168. Vos, M.J., Hagfman, J., Carra, S and Kampinga, H.H. (2008) Structural and functional diversities between members of the human HSPB, HSPH, HSPA, and DNAJ chaperone families. Biochemistry, 47(27):7001-7011.

169. Walrant, P. and R. Santus (1974) N-formyl-kynurenine, a tryptophan photooxidation product, as a photodynamic sensitizer. Photochem. Photobiol., 19:411-417.

170. Wang, K., Kurganov, B.I. (2003) Kinetics of heat- and acidification-induced aggregation of firefly luciferase. Biophysical Chemistry, 106:97-109.

171. Wang, K., Spector, A. (1994) The chaperone activity of bovine alpha-crystallin. J Biol Chem, 269: 13601-13608.

172. Wang, K., Spector, A. (2001) ATP causes small heat shock proteins to release denatured protein. Eur. J. Biochem., 268(24):6335-6345.

173. Wang, S.S.; Wu, J.W.; Yamamoto, S. and Liu, H.S. (2008) Diseases of protein aggregation and the hunt for potential pharmacological agents. Biotechnol. J., 3(2): 165-192.

174. Weitz, D. A., Huang, J. S., Lin, M. Y., Sung, J. (1985) Limits of the fractal dimension for irreversible kinetic aggregation of gold colloids. Phys. Rev. Lett., 54:1416-1419.

175. Williams, D.L. and Munday, P. (2006) The effect of a topical antioxidant formulation including N-acetyl carnosine on canine cataract: a preliminary study. Vet. Ophthalmol. 9(5):311-316.

176. Wistow, G. J. & Piatigorsky, J. (1988) Lens crystallins: The evolution and expression of proteins for a highly specialized tissue. Annu. Rev. Biochem., 57:479-504.

177. Yan, H., Harding, J.J. (2005) Carnosine protects against the inactivation of esterase induced by glycation and a steroid. Biochim. Biophys. Acta, 1741:120-126.

178. Yeargans, G.S. and Seidler, N.W. (2003) Carnosine promotes the heat denaturation of glycated protein. Biochem. Biophys. Res. Commun., 300(1):75-80.

179. Zhang, Z., Smith, D.L., Smith, J.B., (2003). Human beta-crystallins modified by backbone cleavage, deamidation and oxidation are prone to associate.

180. Exp. Eye Res., 77:259-272.

181. Zigler J. S., Horwitz, J. & Kinoshita, J. H. (1980). Human p-crystallin I.

182. Comparative studies on the pi, (32 and P3-crystallins. Exp. Eye Res., 31:41-55.

183. Zigler, J. S. (1978) Age-related changes in the polypeptide composition of beta-crystallin from bovine lens. Exp. Eye Res., 26:537-546.

Информация о работе

Дижевская, Антонина Константиновна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Исследование шаперон-подобной активности α-кристаллина и короткоцепочечных пептидов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы