Механизм подавления агрегации белков α-кристаллином

Ханова, Елена Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизм подавления агрегации белков α-кристаллином
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизм подавления агрегации белков α-кристаллином"

На правах рукописи

/ы-

Ханова Елена Анатольевна МЕХАНИЗМ ПОДАВЛЕНИЯ АГРЕГАЦИИ БЕЛКОВ ОС-КРИСТАЛЛ ИНОМ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории ферментных систем Института биохимии им. А.Н. Баха РАМ

Научный руководитель:

доктор биологических наук К.А. Маркосян

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н.П. Юрина кандидат биологических наук Л.В. Белоусова

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов

Защита состоится ^е/СС^Ь-/ 2006 г. в 1400 час. на заседании диссертационного сове-га К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «/У» 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Неправильный фолдинг и агрегация белков сопровождаются образованием нерастворимых внутриклеточных структур. В связи с тем, что в основе патогенеза значительной части дегенеративных и нейродегенеративных, так называемых «конформационных» заболеваний человека, лежат изменения вторичной и/или третичной структуры белков, приводящие к формированию нерастворимых агрегатов с различной надмолекулярной организацией, изучению агрегации белков уделяется большое внимание. Проблему агрегации белков приходится учитывать не только в медицине, но и при решении биотехнологических задач, поскольку рекомбинантные белки также часто агрегируют. В физиологических условиях белковые агрегаты не накапливаются в клетках благодаря существованию внутриклеточного механизма «контроля качества» ("quality control") белков, который осуществляется в результате совместного действия шаперонов и протеиназ.

а-Кристаллин, основной белок хрусталика глаза млекопитающих, являясь представителем семейства малых белков теплового шока, обладает шапероноподобной активностью, способен к образованию устойчивых растворимых комплексов с денатурированными белками и, таким образом, подавляет их агрегацию, В хрусталике а-кристаллин обеспечивает защиту р- и у-кристаллинов от ультрафиолетового облучения и окислительного стресса, повреждающих эти кристаллины и приводящих к развитию катаракты. Образование а/у и а/р комплексов в хрусталике глаза играет важную роль в поддержании его прозрачности и светопреломляющих свойств. Повышенная экспрессия а-кристаплина обнаруживается также во многих тканях в условиях стресса и при различных патологиях. В связи с обнаружением того, что а-кристаллин in vitro обладает шапероноподобной активностью, появились многочисленные работы по изучению его влияния на денатурацию и агрегацию различных белков и ферментов. Было установлено, что шапероноподобная активность а-кристаплина зависит от многих факторов, включая температуру инкубации, скорость нагревания и концентрацию. Показано также, что подавление тепловой агрегации белков а-кристаллином является результатом гидрофобных взаимодействий и при повышении температуры шапероноподобная активность а-кристаллина возрастает. Тем не менее, несмотря на многочисленные исследования по взаимодействию а-кристаллина с белковыми субстратами при нагревании, механизм подавления тепловой агрегации белков а-кристаллином остается невыясненным.

Цель работы. Целью настоящей работы является изучение механизма тепловой денатурации и агрегации белков и изучение механизма подавления агрегации белков а-кристаллином. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить кинетику тепловой агрегации Рь-кристаллина из хрусталика глаза быка при 60 °С и агрегацию УФ-облученного Рь-кристаллина при 37 °С.

2. Изучить кинетику тепловой агрегации глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы из мышц кролика.

3. Изучить кинетику тепловой агрегации алкогольдегидрогеназы I из 8ассЬаготусе$ сеге\'шае.

4. Изучить и провести сравнительный анализ влияния а-кристаллина на кинетику тепловой агрегации Рь-кристаллина, глицсральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы I.

5. Исследовать агрегацию магниевой и кальциевой холоформ транскетолазы из 8ассИаготусез сеге\>1$ше в процессе нагревания.

Научная новизна. При анализе данных по кинетике агрегации белков, полученных методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) впервые проведено систематическое рассмотрение графиков зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса (Ли)- Установлен линейный характер начальных участков этих зависимостей, что обеспечивает простой способ оценки размера стартовых агрегатов. Разработан метод определения длительности лаг-периода, на протяжении которого происходит формирование стартовых агрегатов.

На основании изучения кинетики агрегации белков методом ДЛС сформулирован новый механизм агрегации белков, включающий стадии разворачивания белковой молекулы, формирования стартовых агрегатов и роста фрактального агрегата путем слипания стартовых агрегатов.

Установлен механизм подавления агрегации белков в присутствии а-кристаллина. Показано, что агрегация белков подавляется в результате уменьшения размера стартовых агрегатов. Вероятность слипания при соударении таких частиц становится меньше единицы.

Показано, что анализ зависимости гидродинамического радиуса от времени позволяет выявить белки, которые в развернутом состоянии проявляют шапероноподобную активность и, таким образом, защищают себя от агрегации. Примером может служить алкогольдегидрогеназа Г из ЗассЬаготусез сегеугзше.

Результаты, полученные методами ДЛС и ДСК при нагревании ГАФД с постоянной скоростью, позволили установить корреляцию между тепловой агрегацией и денатурацией белков (ГАФД). Методом седиментационного анализа показана диссоциация тетрамерного фермента ГАФД при повышенных температурах.

Практическое значение работы. Понимание процессов формирования белковых агрегатов в клетке открывает новые перспективы в исследовании и лечении так называемых "конформационных" заболеваний. Исследование шапероноподобной активности а-кристаллина может способствовать выяснению его разнообразных функций в различных тканях в норме, в условиях стресса и при различных патологических нарушениях. Результаты исследований механизма агрегации белков и механизма шапероноподобной активности ot-кристаллина можно использовать в работах по поиску химических агентов, которые блокируют агрегацию и модулируют защитное действие а-кристаллина. Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XVII зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005), XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2005), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), на конкурсе аспирантов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН на соискание стипендии имени члена-корреспондента РАН В.Л. Кретовича (2006). Присуждена стипендия имени члена-корреспондента РАН В.Л. Кретовича (2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Объем и структура работы. Работа изложена на./& страницах, содержит 2£рисунков и Л таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (8 глав), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (5 глав), выводов и списка цитируемой литера-туры (^¿источников).

Сокращения, принятые в тексте. АДГ - алкогольдегидрогеназа; ГАФД - глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа; ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние; ДСК дифференциальная сканирующая калориметрия; ДСН - додецилсульфат натрия; ПААГ -полиакриламидный гель; ТК — транскетолаза; DLCA - diffusion-limited cluster-cluster aggregation; RLCA - reaction-limited cluster-cluster aggregation.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Кристаллины (а- и рь-) выделяли из хрусталиков глаза быка согласно методике, описанной ранее [Chiou et al., 1979] совместно с к.б.н. К.О. Мурановым (лаборатория

физико-химических основ рецепции, Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН). Глицсральдегвд-З-фосфат-дегидрогеназа из мышц кролика была любезно предоставлена к.б.н. P.A. Асриянц (отдел биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.II. Белозерского МГУ). Транскетолаза из Saccharomyces cerevisiae была любезно предоставлена к.б.н. О.Н. Соловьевой (отдел биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ). Лиофилизованный препарат дрожжевой АДГ I («Sigma», США), содержащий, по данным ДСК, примесь термолабнльной формы фермента, прогревали при 52 °С в течение 13 мин. При повторном сканировании прогретого образца на кривой теплопоглощения ДСК получали один пик.

Степень чистоты белков, используемых в работе, анализировали методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН.

Калориметрические исследования проводили совместно с к.б.н. С.Ю. Клейменовым (лаборатория молекулярной организации биологических структур, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН) на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре «ДАСМ-4М» (ИБП РАН) при постоянном избыточном давлении 2.2 атм, со скоростью нагревания 1 К/мин. Обратимость теплового перехода проверяли путем сравнения остаточной теплоемкости при повторном прогреве образца.

Кинетику агрегации банков изучали методом ДЛС. Измерения проводили на установке Pliotocor Complex (Photocor Instruments Inc., США) с He-Ne лазером (Coherent, USA, Model 31-2082, 632,8 нм, 10 мВ) в качестве источника света. Температура образцов поддерживалась при помощи PID temperature controller в пределах ±0.1 °С. Автокорреляционные функции измеряли при помощи Photocor-FC в режиме multiple-tau с использованием 288 каналов и логарифмической шкалой времени. Обработку автокорреляционных функций и расчёт размеров гидродинамического радиуса Rh проводили при помощи программы DynaLS (Alango, Израиль).

Эксперименты по скоростной седиментации выполняли совместно с д.б.н. H.A. Чеботаревой (лаборатория молекулярной организации биологических структур, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН) на аналитической ультрацентрифуге «Spinco Е» (Beckman, США), с использованием абсорбционной сканирующей оптической системы при длине волны 280 нм, при 20-45 °С и скоростях вращения ротора от 1000 до 40000 об/мин. Коэффициенты седиментации определяли с использованием программы SEDFIT [Schuck, 2000].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование стабильности а-кристаллнна в процессе нагревания

Все эксперименты по испытанию шапероноподобной активности а-кристаллина проводили при относительно высоких значениях температуры. В связи с этим предварительно было изучено олигомерное состояние а-кристаллина при повышенных температурах. Изменение олигомерного состояния а-кристаллина при нагревании регистрировали методом ДЛС, В физиологических условиях а-кристаллин является высокомолекулярным комплексом (—825 кДа) с размером гидродинамического радиуса ~ 10.5 нм. На рис. 1А и Б показана зависимость интенсивности светорассеяния (/) и гидродинамического радиуса (Ль) а-кристаллина от температуры в интервале от 24 до 76 "С. Нагревание проводили с постоянной скоростью 1 К/мин. Увеличение температуры приводило к небольшому уменьшению интенсивности светорассеяния (кривая 1, рис. 1А) и одновременному уменьшению величины Ль (кривая 1, рис. 1Б), связанному с диссоциацией

а-кристаллина до олигомерных форм меньшего размера. Ль достигает минимального значения (Ль.тт = 8.7 нм) при температуре 54 °С. Дальнейшее повышение температуры до 76 °С приводит к увеличению размера Ль до 13.8 нм, что указывает на агрегацию диссоциированных форм а-кристаллина. Охлаждение а-кристаллина (кривая 2, рис. 1А и Б) сопровождалось небольшим увеличением интенсивности

Рис. 1. Денатурация и агрегация а-кристаллина при нагревании со скоростью 1 К/мин. Интенсивность светорассеяния (А) и гидродинамический радиус (Б) а-кристаллина (1 мг/мл; 40 мМ №-фосфатный буфер, рН 6.8, 100 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА, и 3 мМ N¡»N3) представлены как функции от температуры. Кривая 1 на рис. А и Б соответствует нагреванию с постоянной скоростью (1 К/мин), кривая 2 - охлаждению от 76 до 26 °С в течение 80 мин. (В) Зависимость удельной теплоемкости (С^р) от температуры для исходного препарата а-кристаллина (1 мг/мл; 40 мМ Ка-фосфашый буфер, рН 6.8, 100 мМ КаС1, 1 мМ ЭДТА, и 3 мМ ИаЫз; кривая 1). Кривая 2 на рис. В соответствует повторному нагреванию а-кристаллина сразу после его охлаждения.

Температура (°С)

светорассеяния и увеличением Яь до 15 им. Данные по ДСК для а-кристаллина показали, что белок начинает денатурировать при температуре выше 48 °С (кривая 1, рис. ЗВ). Удельная теплоемкость (С^р) достигала максимальной величины при Т = 63.7 °С. Повторное нагревание образца сразу после его охлаждения (кривая 2 на рис. 1В) показало, что процесс денатурации а-кристаллина обратим на 86%. Таким образом, а-кристаллин обладает самовосстапавливающейся структурой, а присутствие остаточных агрегатов в системе после охлаждения (см. рис. 1А и Б) связано с частичной необратимостью его денатурации. а-Кристаллин стабилен при длительном нагревании и при повышении температуры образуется более динамичная структура белка.

2. Тепловая денатурация н агрегация рь-кристаллииа в отсутствие и в присутствии а-кристаллина

Калориметрияческие исследования показали, что рь-кристаллин денатурирует необратимо. Кривая теплоемкости для рь-кристаплина имеет основной пик с температурным максимумом в области 62.5 °С и небольшое плечо при ~68 °С (рис. 2, кривая 1). Присутствие а-кристаллина не влияет на процесс денатурации Рц-кристаллина (рис. 2, кривая 3).

Согласно данным ДЛС, при агрегации Рь-кристаллина при 60 °С распределение агрегатов по гидродинамическому радиусу (Ль) остается мономодальным до момента преципитации крупных агрегатов (рис. 3). В связи с тем, что метод ДЛС позволяет одновременно регистрировать и изменение интенсивности светорассеяния (/), и значение гидродинамического радиуса (Ли) агрегатов, кинетику агрегации Рь-кристаллина можно охарактеризовать в следующих координатах: время, гидродинамический радиус и интенсивность светорассеяния. На рис. 3 представлен график, полученный для агрегации рь-кристаллина при концентрации 0.4 мг/мл. При значениях времени выше 63 мин, происходит падение интенсивности светорассеяния (данные не показаны) вследствие преципитации агрегатов крупных размеров. Проекции

Температура (°С)

1'нс. 2. Кривые ДСК для Рь-кристаллина (1.5 мг/мл) (кривая 1) и а-кристаллина (1.2 мг/мл) (кривая 2) и их смеси (кривая 3). Условия эксперимента: 40 мМ Ыа-фосфатный буфер, рН 6.8, 100 мМ №01, 1 мМ ЭДТЛ, и 3 мМ №N3. Скорость нагревания 1 К/мин.

3000 2000

Рис. 3. Трехмерный график, демонстрирующий изменение интенсивности светорассеяния и гидродинамического радиуса (Ль) во времени на примере агрегации Рь-кристаллина (0.4 мг/мл) при 60 °С. Ось X -время, ось У - Ль, и ось X - интенсивность светорассеяния. Проекция графика на плоскость ХУ показывает зависимость Кь от времени, на плоскость Х2 - зависимость интенсивности светорассеяния от времени и на плоскость УХ - зависимость интенсивности светорассеяния от Ль. Кривая на проекции ХУ рассчитана по уравнению (1).

кинетической кривой, на плоскость ХУ, Хг, и УЪ дают зависимости Ль от /, 1 от Г, и / от Ль, соответственно. Особый интерес вызывает проекция на плоскость YZ. Анализ характера зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса для агрегации белков впервые проведен нами. График указывает на то, что в момент начального прироста интенсивности светорассеяния в системе присутствуют довольно крупные частицы, которые мы назвали стартовыми агрегатами. Их размер легко определяется по точке пересечения кривой с осью абсцисс. Такой анализ был проведен для разных концентраций рь-кристаллина в интервале от 0.025 до 0.4 мг/мл. На рис. 4А

представлены зависимости I от Ль для указанных концентраций Рь-кристаллина. Эти зависимости имеют линейные участки для выбранного диапазона значений Ль. Размер стартовых агрегатов Ли,о остается постоянным и не зависит от концентрации р^кристаллина. Продолжительность латентной стадии (Д,), во время которой происходит образование стартовых агрегатов, определили из графика зависимости Ль от времени (рис. 4Б). В начальном интервале времени зависимости Ль от I для всех концентраций рь-кристаллина имеют линейный участок. Точка пересечения прямой линии с горизонтальной линией (уровень Лад = 84 нм) соответствует времени латентной стадии (/0). Величина возрастает от 9.5 до 16.7 мин с уменьшением концентрации рь-кристаллина от 0.4 до 0.025 мг/мл. Линейное соотношение зависимостей Ль от времени выполняется до определенного значения времени (**)• При / > мин зависимость Ль от времени описывается степенной функцией:

Л„=Л;[1+л:,(/-0]'"'', (О

600

20 30 I (мин)

Рис. 4. Определение латентной стадии тепловой агрегации Рь-кристаллина. Зависимости

интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса (/?!,) (А) и /?ь от времени (Б), полученные для разных концентраций Рь-кристаллина: (1) 0.025, (2) 0.05, (3) 0.1, (4) 0.2 и (5) 0.4 мг/мл. Пунктирная линия на рис. Б соответствует 7!|,.о = 84 нм.

где — R*и величина /ih при t = t', К\ - константа, dг -фрактальная размерность (структурная

характеристика агрегата). Параметр du полученный для разных концентраций pL-кристаллина, приближался к одному значению, равному 1.8. Для режима агрегации «diffusion-limited cluster-cluster aggregation» (DLCA), при котором скорость агрегации определяется диффузией взаимодействующих частиц, соблюдается универсальная фрактальная размерность (dc) - 1.8 [Weitz and Lin, 1986; van Garderen et al., 1994; Diez-Orrite, 2005;]. Таким образом, можно предположить, что агрегация рь-кристаллина -процесс, представляющий взаимодействие стартовых агрегатов, протекает в режиме DLCA. Это означает, что каждое столкновение частиц приводит к их слипанию. Иначе говоря, вероятность столкновения частиц равна единице.

Анализ зависимости гидродинамического радиуса (/?h) от времени для агрегации белков дает важную информацию о механизме агрегации [Ball et al., 1987; Lin et al., 1989; De Spirito et al., 2006]. В

данном случае для объяснения механизма агрегации белков мы не можем использовать начальные участки зависимостей Ль от времени, так как полный процесс агрегации включает стадию разворачивания молекулы белка и стадию формирования стартового агрегата. Экспериментально полученное увеличение интенсивности светорассеяния связано со вторым этапом агрегации, когда происходит слипание стартовых агрегатов и агрегатов более высокого порядка. Мы предполагаем, что область значений, наблюдаемая после завершения линейной зависимости от времени (а именно, при / > /*), является наиболее важной для объяснения механизма агрегации. Согласно имеющимся данным, степенная зависимость соблюдается также в кинетике тепловой агрегации гликогенфосфорилазы Ь из скелетных мышц кролика и белка оболочки вируса табачной мозаики [Магкоз5|'ап Л а1., 2006].

Д 3000 2500 •=■ 2000 •£• 1500 1000 500

о,

Б зооо

2500 2000 ■3 1500 ^ 1000 500

В 3000*

2500 2000 -Е 1500 ** 1000 500

Г зооо

2500 -~2000 £1500 =<"1000 500 О

Д зооо1

2500 -5- 2000 1500 ** 1000 500 О,

О 20 40 60 80 100120140

/У // / г

О 20 40 60 80 100120140

2 лу'

.0 20 40 60 80 100120140

200 400 600 I(мин)

ппаггЛЛ Ш — • * *

0 20 40 60 80 100120)40

0 20 40 60 80 100120140 * (мин)

Кинетика агрегации рь-кристаллина (0.4 мг/мл) при 60 °С в присутствии а-кристаллина представлена на рис. 5. Концентрация а-кристаллина варьировала в интервале от 0.025 до 0.8 мг/мл. Согласно данным ДЛС в присутствии а-кристаллина наблюдается сложная динамика изменения размера Ль белковых агрегатов во времени. При низкой концентрации а-кристаллина (0.025 мг/мл; рис. 5А) распределение белковых агрегатов по размерам остается унимодальным на протяжении всего измерения, а рост агрегатов значительно замедляется по сравнению с контролем. С увеличением концентрации а-кристаллина > 0.05 мг/мл (рис. 5Б-Г) унимодальный рост агрегатов в

Рис. 5. Влияние а-кристаллина на кинетику агрегации Рь-кристаллина (0.4 мг/мл) при 60 °С. Зависимость гидродинамического радиуса (Ли) от времени (Рис. А-Г), полученная при различных концентрациях а-кристаллина: (А) 0.025, (Б) 0.05, (В) 0.1, (Г) 0.15 и (Д) 0.8 мг/мл. Пунктирные линии соответствуют контролю (агрегация Рь-кристаллина в отсутствие а-кристаллина). Вставка на рис. Г показывает зависимость /?1, от / в растянутом интервале времени. Кривые 1 и 2 относятся к базовым агрегатам и суперагрегатам, соответственно. Начальные участки зависимости Ли от I (рис. А-В) описываются уравнением (2).

определенный момент времени (при / > 25 мин) переходит в бимодальный и регистрируются два типа частиц. В дополнение к базовым агрегатам (кривая 1) в системе образуются агрегаты более крупного размера - суперагрегаты (кривая 2). Суперагрегаты появляются при I > ?ст- В присутствии двукратного избытка а-кристаллина (0.8 мг/мл) расщепления агрегатов на две популяции не происходит и гидродинамический радиус базовых агрегатов при длительной инкубации приближается к предельному значению 18.7 ±0.1 нм (рис. 5Д). Начальные участки зависимостей Яь от времени, полученные в присутствие различных концентраций а-кристаллина в интервале от I = Ц до / = /снь описываются уравнением (2) (сплошные линии на рис. 5А-Г):

К = Rb.0 1 exp

In 2

('-'о)

(2)

(параметр 1гя соответствует интервалу времени, на протяжении которого радиус увеличивается от значения о до значения 2/4,о)- Повышение концентрации а-кристаллина приводит к уменьшению величины /?ь,о и одновременному увеличению параметров to и t2R. Свободный а-кристаплин при этом в системе не обнаруживается. Следовательно, при всех исследуемых концентрациях а-кристаллин включается в состав растущих агрегатов. Уменьшение размера стартовых агрегатов является результатом включения в них а-кристаллина. Такие модифицированные стартовые агрегаты проявляют меньшую вероятность к слипанию. Замедление агрегации pL-кристаллина в присутствии а-кристаллина связано с переходом процесса агрегации из режима «diffusion-limited cluster-cluster aggregation» в режим «reaction-limited cluster-cluster aggregation» (RLCA) (режим, при котором вероятность слипания взаимодействующих частиц при их столкновении становится меньше единицы). На основании этого можно заключить, что защитное действие шаперонов заключается в формировании белковых агрегатов меньшего размера.

2.1. Тепловая агрегация УФ-облученного Ри-кристаллина

Кинетика агрегации УФ-облученного рь-крпсталлина (0.5 мг/мл) при 37 "С показана на рис. 6 Начальный участок зависимости гидродинамического радиуса (/¿ь) от времени

описывается экспоненциальным уравнением (2). Экспоненциальная зависимость Rь от времени типична для агрегации в режиме RLCA. Анализ зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса показан на рис. 6Б. Значение Rh.o при агрегации фотооблученного белка при 37 °С составляло 23 ± 4 нм. При

Рис. 6. Агрегация УФ-облученного рь-кристаллина (0.5 мг/мл) при 37 °С. Зависимость гидродинамического радиуса агрегатов (/?h) от времени (А). Определение размера стартовых агрегатов (/?и,о) Для УФ-облученного Рц-кристаллина при 37 °С (40 мМ Ыа-фосфатный 50 100 150 200 буфер, рН 6.8, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 3 мМ R (нм) NaN3) (Б).

400 300 200 J 00 О

3 2/

1 J\

/А1 • /•1 « ¡11

/ А 1 : ! \ !/> \ ..•s 1,1,1. L V 1

столкновении таких стартовых агрегатов вероятность слипания меньше единицы (не каждое столкновение ведет к слипанию). Этот вывод можно сделать только по результатам метода ДЛС. Таким образом, показано, что при фотооблучении pL-кристаллина происходит уменьшение его стабильности по сравнению с нативным белком, который в данных условиях не агрегирует. Однако агрегация фотооблученного Рь-кристаллина в присутствии а-кристаллина полностью подавляется при 37 °С.

3, Тепловая денатурация и агрегация ГАФД

Анализ данных ДСК показал, что тепловая денатурация ГАФД - необратимый процесс. Кривые теплоемкости ГАФД иллюстрируют четкий тепловой переход (рис. 7). Максимум температурного перехода (Гт) зависит от концентрации белка и увеличивается на 3.5 "С от 60,7 до 64.2 °С с повышением концентрации белка от 0.5 до 3.0 мг/мл (рис. 7). Такая зависимость Тт от концентрации белка характерна для тепловой денатурации олигомерных белков и, предположительно, указывает на присутствие стадии обратимой диссоциации до субъединиц, предшествующей процессу необратимой денатурации [Kurganov et al., 2000; Sanchez-Ruiz, 1992]. Возможно, в процессе нагревания тетрамер молекулы ГАФД (так называемый "димер димеров") диссоциирует до димеров (и далее, вероятно, до

мономеров), до того как произойдет их необратимая денатурация.

Для того, чтобы получить дополнительное доказательство диссоциации ГАФД в процессе нагревания, мы изучили

Рис. 8. Седиментационный анализ ГАФД (0.4 мг/мл; 10 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7.5). (А) Дифференциальное распределение 20 коэффициента седиментации c(s) ГАФД при 20 °С. На вставке показано распределение c(Af).

40 50 60 70 Температура (°С)

Рис 7. Температурная зависимость избыточной теплоемкости (С®р) ГАФД (10 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7.5) при различных концентрациях белка: (1) 0.5, (2) 1.5, и (3) 3.0 мг/мл. Значения С*р получены в расчете на тетрамер ГАФД. Скорость нагревания 1 К/мин.

седиментационное поведение фермента при повышенных температурах. Прежде всего, мы провели седиментационный анализ препарата ГЛФД при 20 °С (рис. 8). Нормированное значение коэффициента седиментации для основного пика распределения c(s) составило S2o,w = 8.19 ± 0.49 S, что соответствует тетрамерной форме ГАФД. Молекулярная масса тетрамера, полученная из распределения с(Л</) (см. вставку на рис. 8), равна 165 ± 17 кДа. Инкубация ГАФД при 45 °С приводит к диссоциации белка (рис. 9). На рис. 9А и Б показано, что при 80 и 90 мин инкубации ГАФД образуются диссоциированные формы фермента со значениями коэффициентов седиментации S2o,w — 3.3 S ± 0.1 и 5.40 i 0.08 S, соответственно.

Следует отметить, что использованный метод ультрацентрифугирования не позволяет в условиях эксперимента регистрировать олигомерное состояние ГАФД при инкубации менее 80 мин. На графике распределения c(s,ffa) наблюдаются два пика: основной пик (84% или 79%) с коэффициентом седиментации .чга.*. = 3.3 ±0.1 S (рис. 9А и Б), соответствующий мономерной форме, и минорный пик (4.3%) с ä2o,w = 5.40 ± 0.08 S, соответствующий димерной форме ГАФД. В случае, когда ГАФД инкубировали при 45 °С в течение 3 и 6 часов (рис. 9В и Г, соответственно), происходило исчезновение мономерной формы фермента, что, вероятно, связано с агрегацией нестабильных мономеров. При более длительной инкубации (6 ч) в

Рис. 9. Диссоциация ГАФД (0.4 мг/мл) при 45 °С. Дифференциальное распределение коэффициента седиментации c(s,f/f0), полученное для прогретого препарата ГАФД при 45 °С в течение 80 мин (А), 90 мин (Б), 3 ч (В) и 6 ч (Г). Измерения, приведены к стандартным условиям и представлены в виде распределения c(s, ). Скорость вращения ротора составляла 30000 об/мин. "'" 2 4 6 8

j , S распределении c(s, ßfa) наблюдался один основной пик

(61% или 73%) с коэффициентом j2o,w = 4.9 ± 0.2 S, соответствующий димерной форме. При

увеличении периода инкубации ГАФД при 45 °С до 14 ч образование агрегатов белка

0.90.6 0.3

o.oL 1.2

0.8

0.4 ■

0.0L 1.2 Г

' 0.8 0.4

o.oL

O.i

0.4 ■

о п _

возрастало. Большие агрегаты ГАФД преципитировали до достижения ротором максимальной скорости вращения (40000 об/мин).

Тепловая агрегация ГАФД (0.4 мг/мл) была изучена методом ДЛС в интервале температур от 37 до 55 °С. На рис. 10 приведены зависимости интенсивности светорассеяния и гидродинамического радиуса от времени (А и Б, соответственно), полученные при различных температурах. Рис. 10В показывает зависимости интенсивности светорассеяния от Ль, полученные при разных температурах.

Рис. 10. Кинетика тепловой агрегации ГАФД (0.4 мг/мл) при различных температурах: (1) 37, (2) 45, (3) 47.5, и (4) 55 °С. Зависимости интенсивности светорассеяния и Ли от времени (А и Б, соответственно). Вставка на рис. Б показывает начальные участки зависимости Ли от времени. Горизонтальная линия соответствует значению Ли,о (Ли.о = 20 нм). (В) Зависимость интенсивности светорассеяния от Ли.

Гидродинамический радиус стартовых агрегатов (Ли,о) остается практически постоянным в интервале температур от 37 до 55 °С (Ли,о ~ 21 нм; 10 мМ Ыа-фосфатный буфер, рН 7.5). Как видно из вставки на рис. 10Б, начальные участки зависимостей Ли от времени линейны. Пунктирная горизонтальная линия на вставке рис. 9Б соответствует значению Ли.о. Значение ?о уменьшается с 50.5 до 2 мин с повышением температуры от 37 до 55 °С.

Показано, что при 55 "С величина Ль.о не зависит от концентрации белка. Зависимость Ли от времени для тепловой агрегации ГАФД при 55 °С при длительной инкубации подчиняется степенному закону со значением ф ~ 1.8, что указывает на выполнение режима агрегации БЬСА. Таким образом, данные ДЛС подтверждают механизм агрегации белка, предложенный в данной работе [КЬапоуа с! а1., 2005; Магкоя.ч1ап й а1., 2006]. Этот механизм включает стадию формирования стартовых агрегатов, и последующее их слипание. Можно предположить, что механизм агрегации ГАФД, включающий образование стартовых агрегатов, реализуется и в физиологических условиях. Интересно отметить, что при 37 °С стартовые агрегаты появляются уже спустя 50 мин от начала инкубации (рис. 10Б). Поскольку стабильность белковой молекулы возрастает в условиях краудинга [СЬеЬ^агеуа сД

50 100 150 200 250 Я(нм)

al., 2004], можно ожидать, что в клетке продолжительность латентной стадии, приводящей к образованию стартовых агрегатов, будет значительно выше.

Исходя из данных ДСК, полученных для ГАФД (0.5 мг/мл), были рассчитаны отношения Q/Qt. Зависимость интенсивности светорассеяния (Г) от температуры были получены в аналогичных условиях. При построении зависимости / от Q/Qt можно проанализировать взаимосвязь между денатурацией и агрегацией фермента.

Рис. 11. Корреляция между тепловой денатурацией и агрегацией ГАФД (0.5 мг/мл). (А) Зависимость отношения Q/Qt (Qt — общая теплота денатурации и Q -теплопоглощение при достижении определенной температуры) от температуры, рассчитанная из данных ДСК. (Б) Зависимость интенсивности светорассеяния при 632.8 нм от температуры для агрегации ГАФД (0.5 мг/мл) при постоянной скорости нагревания (1 К/мин). (В) Построение графика зависимости интенсивности светорассеяния от отношения Q/Qt.

Как видно из рис. 11В, наблюдается строгая корреляция между интенсивностью светорассеяния, характеризующей процесс агрегации, и соотношением Q/Qt, характеризующим долю денатурированного белка. Линейная зависимость интенсивности светорассеяния от соотношения Q/Qt дает предельную величину интенсивности светорассеяния при Q/Qt = 1, которая была бы достигнута при отсутствии преципитации (/цт = 148000 фотоотсчетов/с).

3.1. Влияние а-кристаллина на тепловую денатурацию и агрегацию ГАФД Калориметрическое исследование тепловой денатурации ГАФД в присутствии а-кристаллина методом ДСК показало, что положение максимума на кривых ДСК (7*т) смещается в область более низких температур по мере увеличения концентрации а-кристаллина. Денатурация ГАФД (0.4 мг/мл), зарегистрированная методом ДСК, характеризуется острым пиком температурного перехода с максимумом при 61.6 °С (рис. 12, кривая 1). При концентрации а-кристаллина, равной 0.4 мг/мл, величина Тт снижается до 58.0 °С (рис. 12, кривая 4). Возможно, продукты диссоциации молекулы ГАФД, образующиеся при нагревании белка, взаимодействуют с а-кристаллином, что приводит к

Температура ("С)

&Q,

а s

°t

30 40 50 60 70 Температура (°C)

Рис. 12. Влияние а-кристаллина на тепловую денатурацию ГАФД (0.4 мг/мл, 10 мМ Ыа-фосфашый буфер, рН 7.5). Кривые ДСК получены в отсутствие (кривая 1) и в присутствии а-кристаллина (кривые 2-4). Использованные концентрации а-кристаллина: (1) 0, (2) 0.1, (3) 0.2 и (4) 0.4 мг/мл. Кривая 5 соответствует профилю ДСК а-кристаллина (0.4 мг/мл). Нагревание проводилось с постоянной скоростью (1 К/мин).

уменьшению стабильности ГАФД в присутствии а-кристаллина. Процесс подавления тепловой агрегации ГАФД а-кристаллином был изучен методом ДЛС. На рис. 13 показано влияние а-кристаллина на кинетику агрегации ГАФД при 45 °С. Расчеты гидродинамического радиуса показывают, что в присутствии а-кристаллина формируются агрегаты меньшего размера по сравнению с контролем (рис. 13А-Г; 45 °С). Анализ зависимости Ль от времени, полученные в присутствии а-кристаллина, позволил оценить размер частиц, образующихся в системе в начальный момент времени. Значения

А 2000 1600

— 1200

800 400

D 800

Ü 100 200 300 400 t (мин) •

J о

Л»

О 100 200 300 400 500 t (мин)

g 1000

800

— 600

"S* 400

200 0

£. 400

•; зо * V»

! J. 20 10

• '0 200 400 600 800 1000

1 (мин)

2«) 4(Ю (.1)0 • t (мин) •

200 400 600 800 t (мин)

0 200 400 600 800 1000 I (мин)

0 200 400 600 800 1000 t (мин)

Рис. 13. Влияние а-кристаллина на размер агрегатов, сформировавшихся при нагревании ГАФД (0.4 мг/мл) при 45 "С. Зависимости Ли от времени, полученные в присутствии различных концентраций а-кристаллина: (А) 0.025, (Б) 0.05, (В) 0.1 и (Г) 0.4 мг/мл. Пунктирные линии соответствуют контролю (агрегация в отсутствие а-кристаллина). Вставки показывают начальные участки зависимостей Ль от времени. Сплошные кривые построены согласно уравнению (2).

Ль,о, полученные при агрегации ГАФД в присутствии трех концентраций а-кристаллина (0.025, 0.05 и 0.1 мг/мл), составляли 9.0-9.3 им. Такие значения Ль,о близки к значению Ль.о для самого а-кристаллина при 45 °С (10.1 ± 0.05 нм). Таким образом, при указанных концентрациях а-кристаллина образование стартовых агрегатов, содержащих денатурированные молекулы ГАФД, становится невозможным. В этих условиях денатурированные молекулы ГАФД образуют комплексы с а-кристаллином. Начальные участки зависимостей Rh от времени, полученные в присутствии различных концентраций а-кристаллина 0.025, 0.05 и 0.1 мг/мл, описываются экспоненциальным уравнением (2). Аппроксимация начальных участков зависимостей Ль от времени с помощью уравнения (2) показана на вставках рис. 13А-В. Увеличение параметра í2r характеризует снижение скорости агрегации. Так же как и в случае тепловой агрегации Рь-кристаллина, агрегация ГАФД в присутствии а-кристаллина при концентрациях 0.025-0.1 мг/мл, сопровождается расщеплением популяции агрегатов на два компонента при довольно высоких значениях времени (/ > ¡ыд- При более высоких концентрациях а-кристаллина распределение агрегатов по размерам остается унимодальным на протяжении всего эксперимента (рис. 13Г). Тепловую агрегацию ГАФД в присутствии а-кристаллина изучали также методом ДЛС в режиме нагревания с постоянной скоростью. Кинетика агрегации исследуемых белков не зависела от режима измерения. Агрегация ГАФД в присутствии а-кристаллина приводит к уменьшению размера стартового агрегата. Построение графика зависимости интенсивности светорассеяния от Ль позволило оценить величину стартовых агрегатов (Ль,о) в присутствии различных концентраций а-кристаллина при нагревании фермента с постоянной скоростью. Для агрегации ГАФД в отсутствие а-кристаллина значение Ль,о составляло 22.5 ± 0.8 нм (рис. 14А). С повышением концентрации а-кристаллина от 0.1 до 0.4 мг/мл величина Ль,о уменьшалась от 19.1 ± 0.2 нм до 13.1 ± 0.2 нм (рис. 14Б-Г).

10 12 14 16 13 Л, (ни)

Рис. 14. Графики зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса, построенные для агрегации ГАФД (0.4 мг/мл), при различных концентрациях а-кристаллина: (А) 0, (Б) 0.1, (В) 0.2 и (Г) 0.4 мг/мл.

Изучение влияния а-кристаллина на кинетику тепловой агрегации ГАФД показало, что подавление агрегации ГАФД в присутствии а-кристаллина происходит в результате формирования агрегатов белка меньшего размера. Уменьшение скорости агрегации происходит вследствие включения а-кристаллина в состав стартового агрегата. Вероятность слипания стартовых агрегатов, содержащих а-кристаллин, меньше единицы. Это обстоятельство объясняет переход кинетического режима агрегации ГАФД от режима 01,СА (где зависимость Ль от времени следует степенному закону) к режиму КЬСА (где зависимость Ль от времени подчиняется экспоненциальному закону). 4. Тепловая агрегация транскетолазы из ЗассИаготусея сегеу'тае Тепловую агрегацию ТК изучали методом ДЛС в интервале температур от 30 до 80 °С при постоянной скорости нагревания 1 К/мин. На рис. 14А представлена зависимость интенсивности светорассеяния от температуры для агрегации холоформы ТК, реконструированной из апоформы ТК и кофермента в присутствии ионов магния (кривая 1)

или ионов кальция (кривая 2). Агрегация ТК, вызванная нагреванием, сопровождалась увеличением интенсивности светорассеяния. Прирост интенсивности наблюдался для двух форм холофермента примерно при одинаковых значениях температуры (при Т > 45 °С). Интенсивность светорассеяния при температуре выше 68 °С (для магниевой формы фермента) и 75 СС (для кальциевой формы фермента) уменьшалась вследствие преципитации крупных агрегатов.

На рис. 14 Б и В представлены зависимости гидродинамического радиуса от температуры, соответственно, для магниевой и кальциевой форм

Рис. 15. Агрегация холоформы ТК (0.2 мг/мл, 50 мМ глицил-глициновый буфер, рН 7,6) в режиме увеличения температуры с постоянной скоростью (1 К/мин). (А) Зависимость интенсивности светорассеяния от температуры для магниевой (кривая 1) и кальциевой форм ТК (кривая 2). (Б, В) Зависимости гидродинамического радиуса от температуры: (Б) магниевая и (В) кальциевая форма ТК.

1000000 800000 600000 400000 200000

2500

- 1 -2

2000 1 1500 1000 500

Мв

30 2500,—

2000 1" 1500

ее' 1000

500 &

Са

40 50 60 70

40 50 60 70 Температура (°С)

ТК. В обоих случаях на начальных участках зависимости наблюдается линейный рост агрегатов при увеличении температуры. При высоких значениях температуры, 55 °С для магниевой формы фермента и 60 °С для кальциевой формы, в системе появляются крупные агрегаты, вызванные слипанием исходных частиц (базовых агрегатов).

Построение графика зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса позволило определить размеры стартовых агрегатов. В случае агрегации магниевой формы холофермента ТК, значение Ли,о составило 47.6 ± 2.5 нм. При агрегации кальциевой формы величина Ль,о = 33.3 ± 2.3 нм. Возможно, образование более крупных стартовых агрегатов для магниевой формы можно объяснить более низкой ее стабильностью по сравнению с кальциевой формой.

Из полученных данных видно, что агрегация ТК начинается при Г > 45 °С. По данным ДСК [Евакоуа е1 а1., 2005] денатурация холофермента ТК начинается при более высоких значениях температуры, 57 - 58 °С, с максимумом теплового перехода 61.8 °С для магниевой формы белка и 64 °С для кальциевой формы. Таким образом, можно предположить, что агрегация ТК опережает денатурацию.

5. Тепловая денатурация н агрегация алкогольдегндрогеназы I из Засскаготусет сегеуЫае. Влияние а-крнсталлина

Тепловая денатурация АДГ I была проанализирована методом ДСК. На рис. 16 представлены результаты эксперимента по тепловой денатурации АДГ I в присутствии и в отсутствие а-кристаллина. По данным ДСК АДГ I денатурирует необратимо. Кривая

теплопоглощения фермента в отсутствие а-кристаллина характеризуется наличием основного пика с максимумом при 63 °С. Профили ДСК, полученные для АДГ I, не зависят от присутствия а-кристаллина. Это означает, что а-кристаллин не оказывает заметного влияния на тепловую денатурацию фермента. Кинетика тепловой агрегации АДГ I была изучена при 56 °С методом ДЛС (рис. 16). На начальных участках

Температура (°Q

Рис. 16. Кривые ДСК для АДГ I (1.5 мг/мл), полученные в отсутствие (кривая 1) и в присутствии а-кристаллина (0.5 мг/мл, кривая 2). Условия эксперимента: 50 мМ

Ыа-фосфатный буфер, pli 7.4, 100 мМ NaCl, скорость нагревания 1 К/мин.

10 20 30 40 50 60 70 /(мин)

кинетических кривых при различных концентрациях АДГ I наблюдается отчетливо выраженный лаг-период. Зависимость гидродинамического радиуса от времени при различных концентрациях АДГ I (рис. 17А-Д) характеризуется переходом от унимодального распределения агрегатов к бимодальному распределению. Как и в случае агрегации белков (рь-кристаплина и ГАФД), начальные участки зависимости интенсивности светорассеяния от Яъ линейны (рис. 18). Величина Лк.о не зависит от концентрации АДГ I и составляет 24 ± 1 нм.

Интересно, что начальные участки зависимости от времени при всех концентрациях АДГ I имеют экспоненциальный характер и описываются уравнением (2), использованным нами для анализа агрегации белков в присутствии а-кристаллина. Выполнимость

экспоненциального закона указывает на то, что агрегация АДГ I протекает в кинетическом режиме ИЬСА (в этом режиме вероятность слипания сталкивающихся частиц меньше единицы). Можно предположить, что молекула АДГ содержит внутримолекулярный шаперон, который блокирует собственную агрегацию белка.

Рис. 17. Агрегация АДГ 1 при 56 °С. Зависимости гидродинамического радиуса (Кь) от времени, полученные при различных концентрациях АДГ I: (А) 0.025, (Б) 0.05, (В) 0.1, (Г) 0.2 и (Д) 0.3 мг/мл. Начальные участки зависимости описаны с помощью уравнения (2).

Параметры ¡а и Ьк были рассчитаны с помощью уравнения (2). Величина 1о, характеризующая длительность латентного периода (время, за которое происходит формирование стартовых агрегатов), практически не изменяется при увеличении концентрации белка. Параметр /2к, который можно рассматривать как меру скорости агрегации, уменьшается с повышением концентрации АДГ I.

Добавление а-кристаллина приводит к подавлению тепловой агрегации АДГ I (0.2 мг/мл) при 56 °С. Как видно из рисунка 19, в присутствии а-кристаллина образуются агрегаты меньшего размера. Экспоненциальная зависимость, описываемая уравнением (2) на

начальных участках Ли от времени (рис. 19Б и В), сохраняется. Величина Ггя увеличивается с повышением концентрации а-кристаллина, что свидетельствует о снижении скорости агрегации АДГ I в присутствии шаперона. В присутствии 0.045 мг/мл а-кристаллина процесс тепловой агрегации полностью подавляется; образуются комплексы постоянного размера с Ль около 40 нм. Интересно, что параметр /0 при увеличении концентрации а-кристаллина не увеличивается в отличие от других белков (ГАФД и Р-кристаллина).

Из литературных данных известно, что в аминокислотной последовательности дрожжевой АДГ I содержится гидрофобный участок (УЗОУСНТБЫГАХУНООШРЬРУК, 40-60), который в ферменте, денатурированном

40 80 120 160 200 240

Я, (им)

Рис. 18. Зависимость интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса (Ль), полученная для разных концентраций АДГ в процессе агрегации при 56 °С. Концентрация АДГ составляла: (1) 0.025, (2) 0.05, (3) 0.1, (4) 0.2 и (5) 0.3 мг/мл.

200 400 600 / (мин)

200 400 600 800 /(мин)

Рис. 19. Влияние а-кристаллина на размер агрегатов, образующихся при нагревании АДГ I (0.2 мг/мл) при 56 °С. Зависимость гидродинамического радиуса Ль от времени, полученная в отсутствие а-кристаллина (А) и в присутствии 0.015, 0.03 и 0.045 мг/мл а-кристаллина (Б, В и Г, соответственно). Начальные участки зависимости Ль от времени описаны кривыми, рассчитанными с помощью уравнения (2).

нагреванием, способен связываться с а-кристаллином [Santhoshkumar and Sharma, 2002]. У выделенного пептида 40-60 была обнаружена шапероноподобная активность [Bhattacharyya et al., 2003]. На рис. 20 показана модель пептида Y40-K60, отвечающего за шапероноподобную активность, расположенного в составе субъединицы. Из данных по агрегации АДГ I, приведенных выше, можно заключить, что АДГ 1 довольно устойчива к нагреванию при 56 °С. Кинетика тепловой агрегации АДГ 1 характеризуется длительным лаг-периодом. Помимо этого, унимодальное распределение агрегатов по мере нагревания переходит в бимодальное (расщепление агрегатов на два компонента). Можно предположить, что АДГ I предотвращает собственную агрегацию при нагревании или при воздействии какого-либо денатурирующего агента вследствие экспонирования в

окружающую среду гидрофобной

последовательности Y40-K60

(внутримолекулярного шаперона) после частичного разворачивании белковой молекулы. Исходя из установленного нами механизма защитного действия шаперонов, можно полагать, что благодаря наличию пептида Y40-K60 стартовые агрегаты, образуемые денатурированной АДГ I, характеризуются меньшим размером по сравнению с тем, который бы они имели при отсутствии внутримолекулярного шаперона. Стартовые агрегаты, образуемые денатурированной АДГ I, ведут себя так же, как и стартовые агрегаты, содержащие шаперон: вероятность слипания взаимодействующих частиц при соударении меньше единицы.

На основании полученных данных сформулирован новый механизм агрегации белков и механизм подавления агрегации белков а-кристаллином. На рис. 21 показан механизм агрегации денатурированного белка, включающий стадию формирования стартовых агрегатов, стадию слипания стартовых агрегатов (первичных кластеров) и агрегатов более высокого порядка (рост фрактального агрегата). Такой путь агрегации происходит в режиме DLCA (каждое столкновение приводит к слипанию взаимодействующих частиц) и, в конечном итоге, приводит к появлению структур огромных размеров, склонных к

Рис, 20. Трехмерная структура субъединицы АДГ I из Saccharomyces cerevisiae. Красным цветом обозначен пептидный участок (Y40-K60), обладающий свойствами шаперона. Модель получена Де Болле (X. De Bolle, Departement de Biologie, Facultés Universitaires Notre-Dame de la Paix, Namur, Belgium).

преципитации. В присутствии а-кристаллина агрегация белка подавляется за счет уменьшения размера стартовых агрегатов. Вероятность слипания при соударении таких частиц становится меньше единицы. Таким образом в присутствии а-кристаллина происходит переход процесса агрегации из режима ОЬСА в режим К1.СА,

Рис. 21. Модель, описывающая механизм агрегации белков через стадию образования стартовых агрегатов.

1. С использованием метода динамического лазерного светорассеяния изучена кинетика тепловой агрегации рь-кристаллина из хрусталика глаза быка, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы из мышц кролика, транскетолазы и алкогольдегидрогеназы I из БассЬаготусез сеге\ч.и'ае. Контроль за стадией денатурации белков осуществляли при помощи метода дифференциальной сканирующей калориметрии.

2. Предложен новый механизм агрегации белков, приводящей к образованию аморфных агрегатов. Этот механизм включает стадию образования стартовых агрегатов и следующую за ней стадию слипания стартовых агрегатов, ведущую к образованию крупных агрегатов, склонных к преципитации. Предложен метод оценки размеров стартовых агрегатов. Метод основан на построении графика зависимости интенсивности светорассеянии (7) от гидродинамического радиуса (Ль). Гидродинамический радиус стартовых агрегатов определяется как отрезок, отсекаемый на оси абсцисс линейной зависимостью / от Ль.

3. Проанализирован характер зависимости гидродинамического радиуса от времени для тепловой агрегации Рь-кристаллина и глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы. Распределение частиц по размерам остается унимодальным в ходе агрегации. Начальные участки зависимостей Ль от времени являются линейными. При достаточно больших временах зависимости Ль от времени подчиняются степенной функции с величиной фрактальной размерности агрегатов (Ыс), близкой к 1.8. Сделан вывод, что агрегация

белок

ровшшьш Стартовый белок агрегат

Фрактальный агрегат

ВЫВОДЫ

протекает в режиме «diffusion-limited cluster-cluster aggregation» (кинетический режим, при котором каждое столкновение приводит к слипанию взаимодействующих частиц).

4. С использованием метода аналитического ультрацентрифугирования установлен диссоциативный механизм тепловой денатурации глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы.

5. На примере а-кристаллина (белка, обладающего шапероноподобной активностью) предложен новый механизм подавления агрегации белков шаперонами. Включение а-кристаллина в стартовые агрегаты приводит к уменьшению их размера и снижению вероятности слипания взаимодействующих частиц при их столкновении (переход процесса агрегации в режим «reaction-limited cluster-cluster aggregation»).

6. Показано, что анализ зависимости гидродинамического радиуса от времени позволяет выявить белки, которые в развернутом состоянии проявляют шапероноподобную активность (т.е. защищают себя от агрегации). Примером может служить дрожжевая алкогольдегидрогеназа I.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантами РФФИ, Программой «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и международным фондом 1NTAS.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Н.А. Khanova, К.А. Markossian, B.I. Kurganov, A.M. Samoilov, S.Yu. Kleimenov, D.I. Levitsky, I.K.Yudin, A.C. Timofeeva, K.O. Muranov, and M.A. Ostrovsky. Mechanism of chaperone-like activity. Suppression of thermal aggregation of Pi.-crystallin by a-crystallin. Biochemistry, 2005, v. 44, p. 15480-15487.

2. O.A. Есакова, E.A. Ханова, JI.E. Мешалкина, P. Голбик, Г. Хюбнер, Г.А. Кочетов. Влияние субстратов транскетолазы на реконструкцию и стабильность холофермента. Биохимия 2005, т. 70, N 7, 770-776.

3. К.А. Markossian, B.I. Kurganov, D.I. Levitsky, Н.А. Khanova, N.A. Chebotareva, A.M. Samoilov, T.B. Eronina, N.V. Fedurkina, L.G. Mitskevich, A.V. Merem'yanin, S.Yu. Kleymenov, V.F. Makeeva, V.I. Muronetz, I.N. Naletova, I.N. Shalova, R.A. Asryants, E.V. Schmalhausen, L. Saso, Yu.V. Panyukov, E.N. Dobrov, I.K. Yudin, A.C. Timofeeva, K.O. Muranov, and M.A.Ostrovsky. Mechanism of chaperone-like activity. «Protein Folding: New

Research>. Nova Science Publishers, Inc., New York, USA (Obalinsky, T.R., Ed.), 2006, p. 89171.

4. K.A. Markossian, H.A. Khanova, S.Yu. Kleimenov, D.I. Levitsky, N.A. Chebotareva, R.A. Asiyants, V.l. Muronetz, L. Saso, I.K. Yudin, B.I. Kurganov. Mechanism of thermal aggregation of rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochemistry, 2006, v. 45, p. 13375-13384.

5. E.A. Ханова, А.К.Тимофеева, A.M. Самойлов, K.A. Маркосян, K.O. Муранов,М.А. Островский, Д.И. Левицкий, Б.И. Курганов. Кинетика тепловой агрегации дрожжевой алкогольдегидрогеназы в присутствии а-кристаллина. Материалы Международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки». Тюмень, 2005 г., стр. 80-82.

6. А.К Тимофеева, Е. А. Ханова, К.А. Маркосян, К.О. Муранов, М.А. Островский, Б.И. Курганов. Кинетика тепловой агрегации ß-кристаллина хрусталика глаза быка в присутствии а-кристаллина. Материалы Международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки». Тюмень, 2005 г., стр. 29-32.

7. Е.А. Ханова. Тепловая агрегация дрожжевой алкогольдегидрогеназы. XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2005. Тезисы докладов, стр. 86.

8. Е.А. Ханова, А.К.Тимофеева, A.M. Самойлов. Влияние а-кристаллина на кинетику тепловой агрегации ß-кристаллина. XII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005», Москва, 2005. Тезисы докладов, стр. 239-240.

Заказ № 145/11/06 Подписано в печать 25.10.2006 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

000 "ЦиФР°вичок"'тел' (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 )■ \v\vw. с/г. ги; е-таИ: т/о@с/г. ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ханова, Елена Анатольевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор ^итературы.

1.1. Агрегация белков.

1.2. Общая характеристика белков теплового шока

1.3. Малые белки теплового шока.

1.4. а-Кристаллин: структура, свойства и шапероноподобная функция.

1.4.1. Сравнение структуры а-кристаллина и малых белков теплового шока.

1.4.2. Олигомерная структура а-кристаллина.

1.4.3. Стабильность а-кристаллина.

1.4.4. Шапероноподобная активность а-кристаллина. Подавление агрегации белков а-кристаллицом.

1.5. p-Кристаллин хрусталика глаза быка: структура, термостабилыюсть.

1.5.1. Влияние УФ-облучения на структуру и агрегацию p-кристаллина.

1.6. Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа из мышц кролика: структура, термостабил^ность.

1.7. Транскетолаза из Saccharomyces cerevisiae: структура, термостабил ^ность.

1.8. Алкогольдегидрогеназа I из Saccharomyces cerevisiae: структура, термостабил|>ность.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.1.1. Выделение и очистка а- и Р-кристаллинов.

2.1.2. Глицераль^егид-З-фосфатдегидрогеназа.

2.1.3. Транскетолаза из Saccharomyces cerevisiae.

2.1.4. Очистка а^когольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae.

2.1.5. Рекомбинантный шаперон GroEL.

2.2. Методы.г.

2.2.1. Электрофоретический анализ в ПААГ.

2.2.2. Дифференриальная сканирующая калориметрия (ДСК).

2.2.3. Динамическое лазерное светорассеяние (ДЛС).

2.2.4. Изучение кинетики тепловой агрегации и ассоциации белков методом

ДЛС.,.

2.2.5. Аналитическое ультрацентрифугирование.

2.2.6. Определение активности глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы.

2.2.7. Термоинакгивация глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы.

2.2.8. Определение активности алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae.

2.2.9. УФ-обдучение Р-кристаллина.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Исследование стабильности а-кристаллина в процессе нагревания.

3.2. Тепловая денатурация и агрегация Рь-кристаллина.

3.2.1. Электрофррез препарата Рь-кристаллина в ПААГ.

3.2.2. Седиментационный анализ препарата Рь-кристаллина.

3.2.3. Тепловая денатурация PL-кристалина в отсутствие и в присутствии а-кристаллина.

3.2.4. Кинетика тепловой агрегации Рь-кристаллина.'.

3.2.5. Влияние а-кристаллина на кинетику агрегации Рь-кристаллина.

3.2.6. Агрегация УФ-облученного Р-кристаллина. Влияние а-кристаллина.

3.3. Тепловая денатурация и агрегация глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (ГАФД).

3.3.1. Тепловая денатурация ГАФД.

3.3.2. Седиментационный анализ ГАФД.

3.3.3. Исследование кинетики агрегации ГАФД при различных температурах.

3.3.4. Зависимость кинетики агрегации ГАФД от концентрации белка при 55 °С.

3.3.5. Корреляция между тепловой агрегацией и инактивацией ГАФД.

3.3.6. Корреляция между тепловой денатурацией и агрегацией ГАФД.

3.3.7. Влияние а-кристаллина на тепловую денатурацию ГАФД.

3.3.8. Седиментационный анализ ГАФД в присутствии а-кристаллина.

3.3.9. Влияния а-кристаллина на процесс тепловой инактивации ГАФД.

3.3.10. Влияние а-кристаллина на кинетику тепловой агрегации ГАФД при 45 и

55 °С.

3.3.11. Влияние а-кристаллина на тепловую агрегацию ГАФД при нагревании с постоянной скоростью.

3.3.12 Влияние GroEL на кинетику тепловой агрегации ГАФД при 45 °С.

3.4. Тепловая агрегация транскетолазы из Saccharomyces cerevisiae.

3.4.1. Кинетика агрегации магниевой и кальциевой форм холофермента ТК при нагревании с портоянной скоростью.

3.4.2. Кинетика агрегации магниевой и кальциевой форм холофермента ТК при постоянной температуре.

3.5. Тепловая денатурация и агрегация алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae.

3.5.1. Тепловая денатурация алкогольдегидрогеназы.

3.5.2. Тепловая денатурация алкогольдегидрогеназы в присутствии а-кристаллина.

3.5.3. Кинетика тепловой агрегации алкогольдегидрогеназы.

3.5.4. Влияние а-кристаллина на кинетику агрегации алкогольдегидрогеназы.

3.5.5. Влияние а-кристаллина на тепловую агрегацию АДГ I в режиме нагревания с постоянной скоростью.

3.5.6. Корреляция между тепловой денатурацией и агрегацией АДГ 1.

3.5.7. Моделирование трехмерной структуры АДГ I из Saccharomyces cerevisiae.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизм подавления агрегации белков α-кристаллином"

Неправильный фолдинг и агрегация белков сопровождаются образованием нерастворимых внутриклеточных структур. В связи с тем, что в основе патогенеза значительной части дегенеративных и нейродегенеративных, так называемых «конформационных» заболеваний человека лежат изменения вторичной и/или третичной структуры белков, приводящие к формированию нерастворимых агрегатов с различной надмолекулярной организацией [Fink, 1998; Dobson, 1999; Kopito, 2000; Bucciantini et al., 2002; Bloemendal et al., 2004; Маркосян и Курганов, 2004; Wickner et al., 1999], изучению агрегации белков уделяется большое внимание. Проблему агрегации белков приходится учитывать не только в медицине, но и при решении биотехнологических задач, поскольку рекомбинантные белки также часто агрегируют. В физиологических условиях белковые агрегаты не накапливаются в клетках благодаря существованию внутриклеточного механизма «контроля качества» ("quality control") белков, который осуществляется в результате совместного действия шаперонов и протеиназ [Hammond and Helenius, 1995; Brodsky and McCracken, 1999]. а-Кристаллин, основной белок хрусталика глаза млекопитающих, являясь представителем семейства малых белков теплового шока, обладает шапероноподобной активностью, способен к образованию устойчивых растворимых комплексов с денатурированными белками и, таким образом, подавляет их агрегацию [Putilina, 2003]. В хрусталике а-кристаллин обеспечивает защиту (3- и у-кристаллинов от ультрафиолетового облучения и окислительного стресса, повреждающих эти кристаллины и приводящих к развитию катаракты [Lee, 1998]. Образованиеа/у и а/(3 комплексов в хрусталике глаза играет важную роль в поддержании его прозрачности и светопреломляющих свойств. Повышенная экспрессия а-кристаллина обнаруживается также во многих тканях в условиях стресса и при различных патологиях. В связи с обнаружением того, что а-кристаллин in vitro обладает шапероноподобной активностью, появились многочисленные работы по изучению его влияния на денатурацию и агрегацию различных белков и ферментов[Ноок and Harding, (1998); Boyle and Takemoto, 1994; Horwitz, 1992b; Abgar, 2001; Wang and Spector, 1994; Raman, 1995]. Было установлено, что шапероноподобная активность а-кристаллина зависит от многих факторов, включая температуру инкубации, скорость нагревания и концентрацию [Horwitz, 1992Ь]. Показано также, что подавление тепловой агрегации белков а-кристаллином является результатом гидрофобных взаимодействий [Wang and Spector 1994; Surewicz and Olesen 1995] и при повышении температуры шапероноподобная активность а-кристаллина возрастает [Wang and Spector 1994; Surewicz and Olesen, 1995; Putilina, et. al., 2003; Raman et. al., 1995; Datta and Rao, 1999; Raman and Rao, 1997]. Тем не менее, несмотря на многочисленные исследования по взаимодействию а-кристаллина с белковыми субстратами при нагревании, механизм подавления тепловой агрегации белков а-кристаллином остается невыясненным.

Целью настоящей работы является изучение механизма тепловой денатурации и агрегации белков и изучение механизма подавления агрегации белков а-кристаллином. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить кинетику тепловой агрегации pL-кристаллина из хрусталика глаза быка при 60 °С и агрегацию УФ-облученного Рь-кристаллина при 37 °С.

2. Изучить кинетику тепловой агрегации глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы из мышц кролика.

3. Изучить кинетику агрегации алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae.

4. Изучить и провести сравнительный анализ влияния а-кристаллина на кинетику тепловой агрегации Рь-кристаллина, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы I.

5. Исследовать агрегацию магниевой и кальциевой холоформ транскетолазы из Saccharomyces cerevisiae в процессе нагревания.

Научная новизна и практическое значение.

При анализе данных по кинетике агрегации белков, полученных методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) впервые проведено систематическое рассмотрение графиков зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса (/?ь)- Установлен линейный характер начальных участков этих зависимостей, что обеспечивает простой способ оценки размера стартовых агрегатов. Разработан метод определения длительности лаг-периода, на протяжении которого происходит формирование стартовых агрегатов.

Показано, что анализ зависимости гидродинамического радиуса от времени позволяет выявить белки, которые в развернутом состоянии проявляют шапероноподобную активность (то есть защищают себя от агрегации). Примером может служить алкогольдегидрогеназа I из Saccharomyces cerevisiae.

Понимание процессов формирования белковых агрегатов в клетке открывает новые перспективы в исследовании и лечении так называемых "конформационных" заболеваний. Исследование шапероноподобной активности а-кристаллина может способствовать выяснению его разнообразных функций в различных тканях в норме, в условиях стресса и при различных патологических нарушениях. Результаты исследований механизма агрегации белков и механизма шапероноподобной активности а-кристаллина можно использовать в работах по поиску химических агентов, которые блокируют агрегацию и модулируют защитное действие а-кристаллина.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ханова, Елена Анатольевна

выводы

1. С использованием метода динамического лазерного светорассеяния изучена кинетика тепловой агрегации pL-кристаллина из хрусталика глаза быка, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы из мышц кролика, транскетолазы и алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae. Контроль за стадией денатурации белков осуществляли при помощи метода дифференциальной сканирующей калориметрии.

2. Предложен новый механизм агрегации белков, приводящей к образованию аморфных агрегатов. Этот механизм включает стадию образования стартовых агрегатов и следующую за ней стадию слипания стартовых агрегатов, ведущую к образованию крупных агрегатов, склонных к преципитации. Предложен метод оценки размеров стартовых агрегатов. Метод основан на построении графика зависимости интенсивности светорассеянии (I) от гидродинамического радиуса (Rh). Гидродинамический радиус стартовых агрегатов определяется как отрезок, отсекаемый на оси абсцисс линейной зависимостью / от Rh.

3. Проанализирован характер зависимости гидродинамического радиуса от времени для тепловой агрегации pL-кристаллина и глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы. Распределение частиц по размерам остается унимодальным в ходе агрегации. Начальные участки зависимостей Rh от времени являются линейными. При достаточно больших временах зависимости Rh от времени подчиняются степенной функции с величиной фрактальной размерности агрегатов (d{), близкой к 1.8. Сделан вывод, что агрегация протекает в режиме «diffusion-limited cluster-cluster aggregation» (кинетический режим, при котором каждое столкновение приводит к слипанию взаимодействующих частиц).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Многие белки теплового шока, экспрессируются в клетках в больших количествах в ответ на стресс (тепловой, окислительный или токсический) и представлены несколькими классами. а-Кристаллин, как и многие другие белки теплового шока, проявляет шапероноодобные свойства, включая способность предотвращать преципитацию денатурированных белков и повышать клеточную устойчивость к стрессу.

На основании изучения кинетики агрегации олигомерных белков (Рь-кристаллина из хрусталика глаза, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы из мышц кролика, дрожжевой транскетолазы и алкогольдегидрогеназы) предложен новый способ анализа кинетических кривых тепловой агрегации, который был использован для объяснения механизма агрегации белков.

Согласно данным ДЛС распределение белковых агрегатов по гидродинамическому радиусу (Rh) остается мономодальным до момента преципитации крупных агрегатов. Анализируя данные по кинетике агрегации Рь-кристаллина, мы провели систематический анализ графиков зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса (Rh). На основании анализа подобных графиков установлено, что процесс агрегации включает латентную стадию. Начальный участок зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса линеен и отсекает на оси абсцисс величину, соответствующую значению размеров стартовых агрегатов (/?ь,о)> сформировавшихся на протяжении латентной стадии. Определение размеров стартовых агрегатов для других белков показало, что стартовые агрегаты могут содержать сотни или даже тысячи мономеров денатурированного белка. Продолжительность латентной стадии (to), во время которой происходит формирование стартовых агрегатов, мы определили из графика зависимости Rh от времени. Оказалось, что размер стартовых агрегатов У?к,о остается постоянным и не зависит от концентрации белка в пробе, тогда как, величина /о возрастает с уменьшением концентрации белка. При достаточно больших значениях времени зависимость Rh от времени описывается степенной функцией, где показатель степени - фрактальная размерность (d[), т.е. структурная характеристика агрегата, сформировавшегося в результате неупорядоченных взаимодействий (случайная агрегация). Для кинетики агрегации белков фрактальная размерность близка к 1.8. Это означает, что процесс агрегации протекает в режиме «diffusion-limited cluster-cluster aggregation», т.е. в режиме, при котором скорость взаимодействия частиц лимитируется диффузией. Для этого режима агрегации вероятность слипания сталкивающихся частиц равна единице [Weitz et al., 1985; Weitz and Lin, 1986; Dfez-Orrite, 2005; van Garderen et al., 1994].

Согласно данным ДЛС, в присутствии а-кристаллина популяция агрегатов в ходе нагревания расщепляется на два компонента. Агрегаты первого типа стабильны и их размер не изменяется во времени. Агрегаты второго типа растут при нагревании, достигая крупных размеров, и склонны к преципитации. В присутствии а-кристаллина наблюдается уменьшение размеров стартовых агрегатов и увеличение длительности латентной стадии. Зависимость Rh от времени подчиняется экспоненциальному закону. Выполнение этой закономерности означает резкое изменение кинетического режима агрегации, в результате чего вероятность слипания сталкивающихся частиц становится меньше единицы (так называемый режим «reaction-limited cluster-cluster aggregation»). Мы полагаем, что защитное действие шаперонов заключается в формировании белковых агрегатов меньшего размера.

Агрегация АДГ I по характеру напоминает агрегацию белков в присутствии а-кристаллина: начальные участки зависимостей Rь от времени следуют экспоненциальному закону, и униномодальное распределение агрегатов по размеру меняется в ходе агрегации на бимодальное. Выполнимость экспоненциального закона указывает на то, что агрегация АДГ I протекает в кинетическом режиме, соответствующем режиму «reaction-limited cluster-cluster aggregation» (в этом режиме вероятность слипания сталкивающихся частиц меньше единицы). В случае агрегации АДГ I защитное действие а-кристаллина реализуется при более низких его концентрациях в отличие от агрегации других изученных белков. В присутствии а-кристаллина размер стартовых агрегатов уменьшается. Однако параметр /о при увеличении концентрации шаперона не меняется. Мы предположили, что молекула АДГ I содержит внутримолекулярный шаперон, который блокирует собственную агрегацию белка. Таким образом, анализ агрегации белков методом ДЛС, а именно, измерение гидродинамического радиуса в процессе агрегации, позволяет не только выявить кинетический режим агрегации, но и дает дополнительную информацию о наличии внутримолекулярного шаперона в белковой молекуле.

Ряд авторов полагают, что механизм агрегации белков, наряду со стадией разворачивания белковой молекулы, включает стадию образования ядра агрегата и стадию роста агрегата [Oosawa and Kasai, 1962; Курганов, 2002; Курганов и др., 2002; Wang and Kurganov, 2003]. Этот механизм агрегации белка, протекающий через стадию образования ядер агрегации, обозначен как «nucleation-dcpcndent aggregation». Следует иметь в виду, что, ссли бы рост агрегатов происходил пугем присоединения денатурированных молекул белка к начальному ядру, то их размер приближался бы к предельному значению Я), при довольно больших временах, когда денатурированный белок исчерпан [Speed et al., 1997]. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что нарастание размеров белковых фрегатов протекает во времени непрерывно вплоть до размеров, при которых начинается преципитация агрегатов. Это означает, что механизм агрегации белка посредством стадии нуклеации маловероятен.

Па основании полученных данных нами сформулированы новые представления о механизме агрегации белков и разработан новый механизм подавления агрегации белков шаперонами (на примере а-кристаллина).

Рис. 78. Механизм агрегации белков, протекающей через стадию образования стартовых агрегатов.

На рис. 78 показан общий механизм агрегации денатурированного белка, включающий стадию формирования стартовых агрегатов, стадию слипания стартовых агрегатов (первичных кластеров) и агрегатов более высокого порядка (рост фрактального агрегата). Такой путь агрегации происходит в режиме «diffusion-limited cluster-cluster aggregation» (каждое столкновение приводит к слипанию взаимодействующих частиц) и, в конечном итоге, приводит к появлению относительно рыхлых структур больших размеров, склонных к преципитации (аморфные агрегаты).

На рис. 79 предложен механизм подавления агрегации белков шаперонами. В присутствии шаперона (а-кристаллина) агрегация белка тормозится за счет уменьшения размера стартовых агрегатов. Это происходит в результате включения шаперона в стартовые агрегаты. Вероятность слипания при соударении таких частиц становится белок роваиный Стартовый белок агрегат

Фрактальный агрегат меньше единицы, при этом образуются более компактные агрегаты. Таким образом, в присутствии а-кристаллина происходит переход агрегации из режима «diffusion-limited cluster-cluster aggregation» в режим «reaction-limited cluster-cluster aggregation».

Рис. 79. Механизм подавления агрегации белков а-кристаллином. (7) Относительно низкие концентрации а-кристаллина; (2) относительно высокие концентрации а-кристаллина.

На схеме рис. 79 представлены два пути образования комплексов шаперона с субстратом. В присутствии относительно низких концентраций а-кристаллина образующиеся стартовые агрегаты слипаются в агрегаты более крупного размера, склонные к преципитации. Для этого механизма агрегации наблюдается расщепление агрегатов на две популяции частиц. При относительно высоких концентрациях а-кристаллина образуются комплексы шаперона с белковым субстратом, которые проявляют низкую способность к дальнейшей агрегации.

Фрактальный агрегат а-кристаллина с субстратом

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ханова, Елена Анатольевна, Москва

1. Abgar S., Backmann J., Aerts Т., Vanhoudt J. and Clauwaert J. (2000) The structural differences between bovine lens alphaA- and alphaB-crystallin. Eur. J. Biochem., 267, 5916-5925.

2. Abgar S., Vanhoudt J., Aerts T. and Clauwaert J. (2001) Study of the chaperoning mechanism of bovine lens a-crystallin, a member of the a small heat shock superfamily. Biophys. J. 80,1986-1995.

3. Ajaz M.S., Ma Z., Smith D.L. and Smith J.B. (1997) Size of human lens beta-crystallin aggregates are distinguished by N-terminal truncation of beta Bl. J. Biol. Chem, 272, 11250-11255.

4. Andley U.P, Clark B.A. (1989) The effects of near-UV radiation on human lens beta-crystallins: protein structural changes and the production of 02- and H202. Photochem Photobiol. 7,97-105.

5. Andley U.P., Sawardekar M.A., Burns J.L. (1997) Action spectrum for photocross-linking of human lens proteins. Photochem Photobiol., 65,556-559.

6. Anfinsen C.B. (1973) Principles that govern the folding of protein chains. Science 181,223-230.

7. Augusteyn R.C. (2004) Dissociation is not required for alpha-crystallin's chaperone function. Exp.Eye Res., 79,781-784.

8. Augusteyn R.C., Koretz JF, Schurtenberger P. (1989) The effect of phosphorylation on the structure of a-crystallin. Biochim. Biophys. Acta., 999,293-299.

9. Augusteyn R.C., Stevens A. (1998) Macromolecular structure of the eye lens. Prog Polymer Sci., 23,375-413.

10. Avilov S., Aleksandrova N.A. and Demchenko A. P. (2004) Quaternary structure of a-crystallin is necessary for the binding of unfolded proteins. A surface plasmon resonance study. Prot. Pept. Lett., 11,1-8.

11. Aymard P., Gimel J.C., Nicolai T. and Durand D. (1996) Experimental evidence for a two-step process in the aggregation of beta-lactoglobulin at pH 7. J. Chim. Phys., 93, 987-997.

12. Ball R.C., Weitz D.A., Witten T.A. and Leyvraz F. (1987) Universal kinetics in reaction-limited aggregation. Phys. Rev. Lett., 58,274-277.

13. Banfield M.J., Salvucci M.E., Baker E.N., Smith C.A. (2001) Crystal structure of the NADP(H)-dependent ketose reductase from Bemisia argentifolii at 2.3 A resolution. J. Mol. Biol., 306,239-250.

14. Bateman O.A., Sarra R., van Genesen S.T., Kappe G., Lubsen N.H. and Slingsby C. (2003) The stability of human acidic p-crystallin oligomers and hetero-oligomers. Exp. Eye Res., 77,409-422.

15. Baussay K., Bon L.C., Nicolai Т., Durand D. and Busnel J.P. (2004) Influence of the ionic strength on the heat-induced aggregation of the globular protein beta-lactoglobulin at pH 7. Int. J. Biol. Macromol., 34, 21-28.

16. Becker J. and Craig E.A. (1994) Heat-shock proteins as molecular chaperones. Eur. J. Biochem., 219,11-23.

17. Bellotti V., Mangione P., Stoppini M. (1999) Biological activity and pathological implications of misfolded proteins. Cell. Mol. Life Sci., 55,977- 991.

18. Berbers G.A., Brans A.M., Hoekman W.A, Slingsby C., Bloemendal H. and de Jong W.W. (1983) Aggregation behavior of the bovine beta-crystallin Bp chain studied by limited proteolysis. Biochim. Biophys. Acta., 748,213-219.

19. Berbers G.A., Hoekman W.A., Bloemendal H. de Jong W.W., Kleinschmidt T. and Braunitzer G. (1984) Homology between the primary structures of the major bovine beta-crystallin chains. Eur. J. Biochem., 139,467-479.

20. Berbers G.A.M., Boermann O.C., Bloemendal H. and de Jong W.W. (1982) Primary gene products of bovine beta-crystallin and reassociation behaviour of its aggregates. Eur. J. Biochem., 128,495-502.

21. Bettelheim F.A., Ansari R., Cheng Q.F. and Zigler J.SJr. (1999) The mode of chaperoning of dithiothreitol-denatured alpha-lactalbumin by alpha-crystallin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 261, 292-297.

22. Bhat S.P., Nagineni C.N. (1989) Alpha В subunit of lens specific protein alpha-crystallin is present in other ocular and non-ocular tissues. Biochem. Biophys. Res. Commun., 158,319-325.

23. Bhattacharyya J., Santhoshkumar P. and Sharma K.K. (2003) A peptide sequence — YSGVCHTDLHAWHGDWPLPVK 40-60. —in yeast alcohol dehydrogenase prevents the aggregation of denatured substrate proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun., 307,1-7.

24. Bindels J.G., Koppers A. and Hoenders H.J. (1981) Structural aspects of bovine P-crystallins: Physical characterization including dissociation-association behavior. Exp. Eye Res., 33, 333-343.

25. Bloemendal H., de Jonga W., Jaenicke R., Lubsena N.H., Slingsby C. and Tardieu A. (2004) Ageing and vision: structure, stability and function of lens crystalline, Progr. Biophys. Mol. Biol., 86,407-485.

26. Borges J.C. and Ramos C.H. (2005) Protein folding assisted by chaperones. Protein Pept. Lett., 12,257-261.

27. Borkman RF, Knight G, Obi В. (1996) The molecular chaperone alphacrystallin inhibits UV-induced protein aggregation. Exp Eye Res., 62,141-148.

28. Bova M.P., Ding L.L., Horwitz J. and Fung B.K. (1997) Subunit exchange of aA-crystallin. J. Biol. Chem., 272,29511-29517.

29. Boyle D. and Takemoto L. (1994) Characterization of the alpha-gamma and alpha-beta complex: evidence for an in vivo functional role of alpha-crystallin as a molecular chaperone. Exp. Eye Res., 58,9-16.

30. Braig K., Otwinowski Z., Hedge R., Boisvert D.C., Joachimiak A., Horwich A.L. and Sigler P.B. (1994) The crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL at 2.8 A. Nature, 371,578-586.

31. Brodsky J.L. and McCracken A.A. (1999) ER protein quality control and proteasome-mediated protein degradation. Semin. Cell Dev. Biol, 10,507-513.

32. Brown P.H. and Schuck P. (2006) Macromolecular size-and-shape distributions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Biophys. J., 90,4651-4661.

33. Bucciantini M., Giannoni E., Chiti F., Baroni F., Formigli L., Zurdo J., Taddei N., Ramponi G., Dobson C.M. and Stefani M. (2002) Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature, 416,507-511.

34. Buchner J., Schmidt M., Fuchs M., Jaenicke R., Rudolph R., Schmid F.X., Kiefhaber T. (1991) GroE facilitates refolding of citrate synthase by suppressing aggregation. Biochemistry, 30,1586-1591.

35. Bukau B. and Horwich A.L. (1998) The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell, 92,351-366.

36. Burgio M.R., Kim C.J., Dow C.C. and Koretz J.F. (2000) Correlation between the chaperone-like activity and aggregate size of alpha-crystallin with increasing temperature. Biochem. Biophys. Res. Commun., 268,426-432.

37. Carrell R.W. and Lomas D.A. (1997) Conformational disease. Lancet, 350,134-138.

38. Carrio M.M., and Villaverde A. (2002) Construction and deconstruction of bacterial inclusion bodies. J. BiotechnoL, 96,3-12.

39. Carver J.A. (1999) Probing the Structure and Interactions of Crystallin Proteins by NMR Spectroscopym. Prog. Retin. Eye Research, 18,431-462.

40. Carver J.A., Aquilina J.A. and Truscott R.J. (1994a) On the interaction of a-crystallin with unfolded proteins. Biochim. Biophys. Acta., 1164,24-28.

41. Carver J.A., Aquilina J.A. and Truscott R.J.W. (1994b) A possible chaperone-like quaternary structure for a-crys-tallin. Exp. Eye Res., 59,231-234.

42. Carver J.A., Aquilina J.A., Cooper P.G. and Williams G.A. (1994c) Alpha-crystallin: molecular chaperone and protein surfactant. Biochim. Biophys. Acta., 1204,195-206.

43. Carver J.A., Cooper P.G., Truscott R.J. (1993) 1H-NMR spectroscopy of beta B2-crystallin from bovine eye lens. Conformation of the N- and C-terminal extensions. Eur. J. Biochem., 213,313-320.

44. Chen L., Sigler P.B. (1999) The crystal structure of a GroEL/peptide complex: plasticity as a basis for substrate diversity. Cell, 99,757-768.

45. Chen Y.H., He R.Q., Liu Y., Liu Y., Xue Z.G. (2000) Effect of human neuronal tau on denaturation and reactivation of rabbit muscle D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochem. J., 351,233-240.

46. Chiou S.H., Azari P., Himmel M.E. and Squire P.G. (1979) Isolation and physical characterization of bovine lens crystallins. Int. J. Pept. Protein Res., 13,409-417.

47. Clark J.I. and Huang Q.L. (1996) Modulation of the chaperone-like activity of bovine a-crystallin. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 93,15185-15189.

48. Clark J.I. and Muchowski P.J. (2000) Small heat-shock proteins and their potential role in human disease. Curr. Opin. Struct. Biol., 10,52-59.

49. Cohen F.E. (1999) Protein misfolding and prion diseases, J. Mol. Biol., 293,313- 320.

50. Corrales F.J. and Fersht A.R. (1996) Kinetic significance of GroEL 14 (GroES7) 2 complexes in molecular chaperone activity. Fold. Des., 1,265-273.

51. Cowan-Jacob S.W., Kaufmann M„ Anselmo A.N., Stark W. and Grutter M.G. (2003) Structure of rabbit-muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 59,2218-2227.

52. Creighton Т.Е. (1993) Proteins. Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Co, New York).

53. Das B.K., Liang J.J. and Chakrabarti B. (1997) Heat-induced conformational change and increased chaperone activity of lens alpha-crystallin. Curr. Eye. Res., 16,303-309.

54. Das K.P., Surewicz W.K. 1995 Temperature-induced exposure of hydrophobic surfaces and its effect on the chaperone activity of alphacrystallin. FEBS Lett., 369,321-325.

55. Dasgupta S., Hohman T.C. and Carper D. (1992) Hypertonic stress induces alpha B-crystallin expression. Exp. Eye Res., 54,461-470.

56. Datta S.A. and Rao C.M. (1999) Differential temperature-dependent chaperone-like activity of alphaA- and alphaB-crystallin homoaggregates. J. Biol. Chem., 274, 3477334778.

57. Datta S.A. and Rao C.M. (2000) Packing-induced conformational and functional changes in the subunits of alpha-crystallin. J. Biol. Chem., 275,41004-41010.

58. Davis G.J., Bosron W.F., Stone C.L., Owusu-Dekyi K., Hurley T.D. (1996) X-ray structure of human ЬЗЬЗ alcohol dehydrogenase. The contribution of ionic interactions to coenzyme binding, J. Biol. Chem., 271,17057-17061.

59. De Bolle X., Vinals C., Fastrez J. and Feymans E. (1997) Bivalent cations stabilize yeast alcohol dehydrogenase I. Biochem. J., 323, 409-413.

60. Dean R.T., Fu S., Stocker R., Davies M.J. (1997) Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation. Biochem. J., 324,1-18.

61. Delaye M. and Tardieu A. (1983) Short-range order of crystallin proteins accounts for eye lens transparency. Nature, 302,415-417.

62. Deretic D., Aebersold R.H., Morrison H.D. and Papermaster D.S. (1994) Alpha A- and alpha B-crystallin in the retina. Association with the post-Golgi compartment of frog retinal photoreceptors. J. Biol. Chem. 269, 16853-16861.

63. Derham B.K., Harding J.J. (1999) Alpha-crystallin as a molecular chaperone. Prog. Retin. Eye Res., 18,463- 509.

64. Di'ez-Orrite S., Stoll S. and Schurtenberger P. (2005) Off-lattice Monte Carlo simulations of irreversible and reversible aggregation processes. Soft Matter., 1, 364371.

65. Dobson C., Karplus M. (1999) The fundamentals of protein folding: bringing together theory and experiment. Curr. Opin. Struct. Biol, 9,92-101.

66. Dobson C.M. (1999) Protein misfolding, evolution and disease. Trends Biochem. Sci., 24,329-332.

67. Durand D., Gimel J.C. and Nicolai T. (2002) Aggregation, gelation and phase separation of heat denatured globular proteins. PhysicaA., 304,253-265.

68. Dusa A., Kaylor J., Edridge S., Bodner N. Hong D.P. and Fink A.L. (2006) Characterization of oligomers during alpha-synuclein aggregation using intrinsic tryptophan fluorescence. Biochemistry, 45,2752-2760.

69. Egan R.M., Sable H.Z. (1981) Transketolase kinetics. The slow reconstitution of the holoenzyme is due to rate-limiting dimerization of the subunits. J. Biol. Chem., 256, 4877-4883.

70. Ehrnsperger E., Lilie H., Gaestel M., Buchner J. (1999) The dynamics of hsp25 quaternary structure. Structure and function of different oligomeric species. J. Biol. Chem., 274,14867-14874.

71. Ehrnsperger M., Buchner J., Gaestel M. (1998) Molecular Chaperones in the Life Cycle of Proteins. Structure, Function and Mode of Actioa (Ed. A.L. Fink, Y. Goto. New York, Basel, Hong-Kong.: Marcel Derrker Inc., 533-575

72. Eklund H., Branden C.I. (1987) Alcohol dehydrogenase, in: F. Jurnak, A. McPherson (Eds.), Biological Molecules and Assemblies: Enzymes, 3, Wiley, New York, 73-142.

73. Eklund H., Nordstrom В., Zeppezauer E., Soderlund G., Ohlsson I., Boiwe Т., Soderberg B.O., Tapia 0., Branden C.I., Akeson A. (1976) Three-dimensional structure of horse liver alcohol dehydrogenase at 2-4 A resolution. J. Mol. Biol, 102, 27-59.

74. Ellis R.J. and van der Vies S.M. (1991) Molecular chaperones. Annu. Rev. Biochem., 60,321-347.

75. Esakova O.A., Meshalkina L.E., Golbik R., Hubner G., Kochetov G.A. (2004) Donor substrate regulation of transketolase. Eur. J. Biochem., 271,4189-94.

76. Esakova O.A., Meshalkina L.E., Kochetov G.A. (2005) Effects of transketolase cofactors on its conformation and stability. Life Sciences, 78,8-13.

77. Esposito L., Sica F., Raia C.A., Giordano A., Rossi M., Mazzarella L., Zagari A. (2002) Ciystal structure of the alcohol dehydrogenase from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus at 1.85 Absolution. J. Mol. Biol., 318,463-477.

78. Feil I.K., Malfois M., Hendle J., van der Zandt H., and Svergun D.I. (2001) A Novel Quaternary Structure of the Dimeric a-Crystallin Domain with Chaperone-like Activity. J. Biol. Chem., 276, 12024-12029.

79. Feil I.K., Malfois M., Hendle J., van der Zandt H., Svergun D.J. (2001) A novel quaternary structure of the dimeric alpha-crystallin domain with chaperone-like activity. J. Biol. Chem., 216,12024-12029.

80. Feng J., Smith D.L. and Smith J.B. (2000) Human lens p-ciystallin solubility. J. Biol. Chem., 275,11585-11590.

81. Fink A.L. (1998) Protein aggregation: folding aggregates, inclusion bodies and amyloid. Folding Dis., 3, R9-R23.

82. Fink A.L. (1999) Chaperone-mediated protein folding. Physiol. Rev., 79,425-449.

83. Follmer C., Pereira F.V., DaSilveria N.P. and Carlini C.R. (2004) Jack bean urease (EC 3.5.1.5) aggregation monitored by dynamic and static light scattering. Biophys. Chem., Ill, 79-87.

84. Fruton J. (1972) Molecules and Life Historical Essays on the Interplay of Chemistry and Biology. Wiley-Interscience, New York.

85. Frydman J. (2001) Folding of newly translated proteins in vivo: The role of molecular chaperones. Annu. Rev. Biochem., 70,603-647.

86. Fu X., Zhang X. and Chang Z. (2005) 4,40-Dianilino-l,10-binaphthyl-5,50-sulfonate, a novel molecule having chaperone-like activity, Biochem. Biophys. Res. Commun., 329, 1087-1093.

87. Ganea E. and Harding J.J. (2000) a-Crystallin assists the renaturation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochem. J., 345,467-472.

88. Ganzhorn A. J. and Plapp B.V. (1988) Carboxyl groups near the active site zinc contribute to catalysis in yeast alcohol dehydrogenase. J. Biol. Chem., 263,5446-5454.

89. Garcia-Mata R., Bebok Z., Sorscher E.J. and Sztul E.S. (1999) Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. J. Cell Biol., 146, 1239-1254.

90. Georgopoulos C. (1992) The emergence of the chaperone machines. Trends. Biochem. Sci., 17,295-299.

91. Gething M.-J., Sambrook J. (1992) Protein folding in the cell. Nature, 335,33-45.

92. Giese K.C. and Vierling E. (2002) Changes in oligomerization are essential for the chaperone activity of a small heat shock protein in vivo and in vitro. J. Biol. Chem., 277,46310-46318.

93. Groenen P.J., Merck K.B., de Jong W.W. and Bloemendal H. (1994) Structure and modifications of the junior chaperone alpha-crystallin. From lens transparency to molecular pathology. Eur. J. Biochem., 225,1-19.

94. Gu Y., Verghese S., Mishra R.S., Xu X., Shi Y. and Singh N. (2003) Mutant prion protein-mediated aggregation of normal prion protein in the endoplasmic reticulum: implications for prion propagation and neurotoxicity. J. Neurochem., 84,10-22.

95. Haase-Pettingell C.A. and King J. (1988) Formation of aggregates from a thermolabile in vivo folding intermediate in P22 tailspike maturation. A model for inclusion body formation. J. Biol. Chem., 263,4977-4983.

96. Haley D.A., Horwitz J. and Stewart P.L. (1998) The small heat-shock protein, alphaB-crystallin, has a variable quaternary structure. J. Mol. Biol., 277,27-35.

97. Hammond C. and Helenius A. (1995) Quality control in the secretory pathway. Curr. Opin. Cell. Biol., 7,523-529.

98. Hartl F.U. (1996) Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature, 381, 571— 579.

99. Hartl F.U. and Hayer-Hartl M. (2002) Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. Science, 295, 1852-1858.

100. Haslbeck M. (2002) sHsps and their role in the chaperone network. Cell. Mol. Life Sci., 59, 1649-1657.

101. Hayes J.E. and Velick S.F. (1954) Yeast alcohol dehydrogenase: molecular weight, coenzyme binding, and reaction equilibria. J. Biol. Chem., 207,225-244.

102. He В., Bai J.H. and Zhou H.M. (1997) Comparison of inactivation and unfolding of yeast alcohol dehydrogenase during thermal denaturation. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29,1021-1028.

103. Heinrich P.C., StefTen H., Janser P., and Wiss O. (1972) Studies on the reconstitute of apotransketolase with thiamine pyrophosphate and analogs of the coenzyme. Eur. J. Biochem., 30,533-541.

104. Henbrink P., Van Westreenen H. and Bloemendal H. (1975) Further studies on the polypeptide chains of beta-crystallin. Exp. Eye. Res., 20,541-548.

105. Hendrick J.P., Hartl F.U. (1993) Molecular chaperone functions of heatshock proteins, Annu. Rev. Biochem., 62, 349- 384.

106. Hibbard L.B., Kirk N.J., Borkman R.F. (1985) The in vitro photolysis of whole rat lenses using focused 290 nm laser radiation. Exp. Eye Res., 40,285-295.

107. Hill E.G., Meriwether B.P., Park J.H. (1975) Purification of rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by gelfiltration chromatography. Analyt. Biochem., 63,175-182.

108. Hook D.W., Harding J.J. (1998) Protection of enzymes by alpha-crystallin acting as a molecular chaperone. Int. J. Biol. Macromol., 22,295-306.

109. Horwich A. (2002) Protein aggregation in disease: a role for folding intermediates forming specific multimeric interactions. J. Clin. Invest., 110, 1221-1232.

110. Horwitz J. (1992a) a-Crystallin can function as a molecular chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89,10449-10453.

111. Horwitz J. (2003) Alpha-crystallin. Exp. Eye Res., 76,145-153.

112. Horwitz J., Emmons Т., Takemoto L. (1992b) The ability of lens alpha crystallin to protect against heat-induced aggregation is age-dependent. Curr. Eye Res., 11, 817822.

113. Horwitz J., Huang Q. and Ding L. (2004) The native oligomeric organization of alpha-crystallin, is it necessary for its chaperone function? Exp. Eye Res., 79,817-821.

114. Hott J.L., Borkman R.F. (1993) Concentration dependence of transmission losses in UV-laser irradiated bovine alpha-, beta H-, beta L- and gamma-crystallin solutions. Photochem. Photobiol., 57,312-317.

115. Hurley T.D., Bosron W.F., Hamilton J. A., Amzel L.M. (1991) Structure of human b 1 b 1 alcohol dehydrogenase: catalytic effects of non-active-site substitutions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8149-8153.

116. Hurley T.D., Bosron W.F., Stone C.L., Amzel L.M. (1994) Structures of three human beta alcohol dehydrogenase variants. Correlations with their functional differences. J. Mol. Biol., 239,415-429.

117. Hurtley S.M. and Helenius A. (1989) Protein oligomerization in the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Cell. Biol., 5,277-307.

118. Ichijima H., Iwata S. (1987) Changes of lens crystallins photosensitized with tryptophan metabolites. Ophthalmic Res., 19,157-163.

119. Ingolia T.D., Craig E.A. (1982) Drosophila gene related to the major heat shock-induced gene is transcribed at normal temperatures and not induced by heat shock. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 79,525-529.

120. Jaenicke R. (1991) Protein folding: local structures, domains, subunits, and assemblies. Biochemistry, 30,3147-3161.

121. Jaenicke R. (1995) Folding and association versus misfolding and aggreation of proteins. Philos. Trans. R. Soc. Lond. В Biol. Sci., 348,97-105.

122. Jaenicke R. (1998) Protein self-organization in vitro and in vivo: partitioning between physical biochemistry and cell biology. Biol. Chem., 379,237-243.

123. Jedziniak J.A., Arredondo L.M. and Meys M. (1986) Human lens enzyme alterations with age and cataract: glyceraldehyde-3-Р dehydrogenase and triose phosphate isomerase, Curr. Eye Res., 5,119-26.

124. Jeyasingham M.D., Pratt O.E., Thomson A.D., Shaw G.K. (1986) Reduced stability of rat brain transketolase after conversion to the apo form. J. Neurochem., 47,278-81.

125. Johansson K., El-Ahmad M., Kaiser C., Jornvall H., Eklund H., Hoog J., Ramaswamy S. (2001) Crystal structure of sorbitol dehydrogenase. Chem. Biol. Interact., 130-132, 351-358.

126. Johnston J.A., Dalton M.J., Gurney M.E. and Kopito R.R. (2000) Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12571-12576.

127. Johnston J.A., Ward C.L. and Kopito R.R. (1998) Aggresomes: a cellular response to misfolded proteins. J. Cell Biol., 143,1883-1898.

128. Jornvall H. (1977) The primary structure of yeast alcohol dehydrogenase. Eur. J. Biochem., 72,425-442.

129. Jornvall H., Eklund H., Branden C.L (1978) Subunit conformation of yeast alcohol dehydrogenase. J. Biol. Chem., 253,8414-8419.

130. Julien J.P. (2001) Amyotrophic lateral sclerosis: unfolding the toxicity of the misfolded the SOD1 gene. Cell, 104,581-591.

131. Kane J.F. and Hartley D.L. (1991) Properties of recombinant protein-containing inclusion bodies in Escherichia coli. Bioprocess Technol., 12,121-145.

132. Kappe G., Franck E., Verschuure P., Boelens W.C., Leunissen J.A., de Jong W.W. (2003) The human genome encodes 10 alpha-crystallin-related small heat shock proteins: HspBl-10. Cell Stress Chaperones, 8,53-61.

133. Karlsson A., El-Ahmad M., Johansson K., Shafqat J., Jornvall H., Eklund H., Ramaswamy S. (2003) Tetrameric NAD-dependent alcohol dehydrogenase. Chemico-Biological Interactions, 143-144, 239-245.

134. Kastenschmidt L. L., Kastenschmidt J. and Helmreich E. (1968) Subunit interactions and their relationship to the allosteric properties of rabbit skeletal muscle phosphorylase b. Biochemistry, 7,3590-3607.

135. Kato K., Shinohara H., Goto S., InagumaY., Morishita R., Asano T. (1992) Copurification of small heat shock protein with aB-crystallin from human skeletal muscle. J. Biol. Chem., 267,7718-7725.

136. Kelley M.J., David L.L., Iwasaki N., Wright J., Shearer T.R. (1993) a-Ciystallin chaperone activity is reduced by calpain II in vitro and in selenite cataract. J. Biol. Chem., 268,18844-18849.

137. Kelley W.L., Georgopoulos C. (1992) Chaperones and protein folding. Curr. Opin. Cell Biol., 4,984-991.

138. Kim K.K., Kim R., Kim S.H. (1998) Crystal structure of a small heat shock protein. Nature, 394,595-599.

139. Kim P., Baldwin R.L. (1990) Intermediates in the folding reactions of small proteins. Annu. Rev. Biochem., 59,631-660.

140. Klemenz R., Frohli E., Steiger R.H., Schifer R. and Aoyama A. (1991) Alpha B-crystallin is a small heat shock protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,3652-3656.

141. Kochetov G.A., Philippov P.P. (1970) Calcium: cofactor of transketolase from baker's yeast. Biochem. Biophys. Res. Commun., 38,930-933.

142. Kochetov G.A., Tikhomirova N.K., Philippov P.P. (1975) The binding of thiamine pyrophosphate with transketolase in equilibrium conditions. Biochem. Biophys. Res. Commun., 63,924-930.

143. Kodaka M. (2004) Interpretation of concentration-dependence in aggregation kinetics. Biophys. Chem., 109,325-332.

144. Kopito R.R. (2000) Aggresomes, inclusion bodies and protein aggregation. Trends Cell Biol., 10,524-530.

145. Koretz J.F. (1999) Quaternary structural changes in native bovine alphacrystallin aggregates with temperature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 40, S214.

146. Koretz J.F., Augusteyn R.C. (1988) Electron microscopy of native and reconstituted alpha-crystallin aggregates. Curr. Eye Res., 7,25-30.

147. Korkhin Y., Kalb A.J., Peretz M., Bogin O., Burstein Y., Frolow F. (1999) Oligomeric integrity-the structural key to thermal stability in bacterial alcohol dehydrogenases. Protein Sci., 8,1241-1249.

148. Kovina M.V., Selivanov V.A., Kochevova N.V. and Kochetov G.A. (1997) Kinetic mechanism of active site non-equivalence in transketolase. FEBSLett., 418,11-14.

149. Kuhn H.J., Braslavsky S.E., Schmidt R. (2004) Chemical actinometry (IUPAC Technical Report). Pure and applied chemistry. Chimie pure et appliquee, 76,2105— 2146.

150. Kurganov B.I., Kornilaev B.A., Chebotareva N.A., Malikov V.Ph., Orlov V.N., Lyubarev A.E. and Livanova N.B. (2000) Dissociative mechanism of thermal denaturation of rabbit skeletal muscle glycogen phosphorylase b. Biochemistry, 39, 13144-13152.

151. Kurganov B.I., Lyubarev A.E., Sanchez-Ruiz J.M., Shnyrov V.L. (1997) Analysis of differential scanning calorimetry data for proteins Criteria of validity of one-step mechanism of irreversible protein denaturation. Biophys. Chem., 69,125-35.

152. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227,680-685.

153. Lambert H., Charette S.J., Bernier A.F., Guimond A., Landry J. (1999) Hsp27 multimerization mediated by phosphorylation-sensitive intermolecular interactions at the amino terminus. J. Biol. Chem., 274, 9378-9385.

154. Lampi K.J., Ma Z., Shih M., Shearer T.R., Smith J.B., Smith D.L. and David L.L. (1997) Sequence analysis of betaA3, betaB3, and betaA4 crystallins completes the identification of the major proteins in young human lens. J. Biol. Chem., 272, 22682275.

155. Le W.P., Yan S.X., Li S., Zhong H.N. and Zhou H.M. (1996) Alkaline unfolding and salt-induced folding of yeast alcohol dehydrogenase under high pH conditions. Int. J. Peptide Protein Res., 47,484-490.

156. Lee G. J., Roseman A.M., Saibil H.R. and Vierling E. (1997) A small heat shock protein stably binds heat-denatured model substrates and can maintain a substrate in a folding-competent state, EMBOJ. 16,659-671.

157. Lee J.S., Samejima Т., Liao J.H., Wu S.H., Chiou S.H. (1998) Physiological role of the association complexes of alpha-crystallin and its substrates on the chaperone activity. Biochem. Biophys. Res. Commun., 244,379-383.

158. Lee J.S., Satoh Т., Shinoda H., Samejima Т., Wu S.H. and Chiou S.H. (1997) Effect of heat-induced structural perturbation of secondary and tertiary structures on the chaperone activity of alpha-crystallin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 237, 277-282.

159. Levin I., Meiri G., Peretz M., Burstein Y., Frolow F. (2004) The ternary complex of Pseudomonas aeruginosa alcohol dehydrogenase with NADH and ethylene glycol. Protein Sci., 13,1547-1556.

160. Li C., Heatwole J., Soelaiman S., Shoham M. (1999) Crystal structure of a thermophilic alcohol dehydrogenase substrate complex suggests determinants of substrate specificity and thermostability. Proteins, 37,619-627.

161. Li D.Y., Borkman R.F., Wang R.H., Dillon J. (1990) Mechanisms of photochemically produced turbidity in lens protein solutions. Exp. Eye Res., 51,663-669.

162. Li J. and Wang C.C. (1999) "Half of the sites" binding of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase folding intermediate with GroEL. J. Biol. Chem., 274, 10790-10794.

163. Li J., Lin Z. and Wang C.C. (2001) Aggregated proteins accelerate but do not increase the aggregation of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Specificity of protein aggregation. J. Prot. Chem., 20,155-163.

164. Lin M.Y., Linsday H.M., Weitz D.A., Ball R.C., Klein R. and Meakin P. (1989) Universality of fractal aggregates as probed by light scattering. Proc. R. Soc. Lond. A., 423,71-87.

165. Lin Y.Z., Liang S.J., Zhou J.M., Tsou C.L., Wu P.Q. and Zhou Z.K. (1990) Comparison of inactivation and conformational changes of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase during thermal denaturation. Biochim. Biophys. Acta, 1038, 247-252.

166. Lin Z., Wang C. and Tsou C. (2000) High concentrations of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase stabilize the enzyme against denaturation by low concentrations of GuHCl. Biochim. Biophys. Acta, 1481,283-288.

167. Lindqvist Y., Schneider G., Ermler U., Sundstrom M. (1992) Three-dimensional structure of transketolase, a thiamine diphosphate dependent enzyme, at 2.5 A resolution. EMBOJ., 11,2373-2379.

168. Lubsen N.H., Aarts H.J., Schoenmakers J.G. (1988) The evolution of lenticular proteins: the beta- and gamma-crystallin super gene family. Prog. Biophys. Mol. Biol., 51,47-76.

169. Lyubarev A.E. and Kurganov B.I. (2001) Study of irreversible thermal denaturation of proteins by differential scanning calorimetry. Recent Res. Devel. Biophys. Chem. 2, 141-165.

170. Lyubarev A.E., Kurganov B.I., Orlov V.N., Zhou H.M. (1999) Two-state irreversible thermal denaturation of muscle creatine kinase. Biophys. Chem., 79,199-204.

171. Ma Z., Hanson S.R., Lampi K., David L., Smith D.L. and Smith J.B. (1998) Age-related changes in human lens crystallins identified by HPLC and mass spectrometry. Exp. Eye Res., 67, 21-30.

172. Mach H., Trautman P.A., Thomson J.A., Lewis R.V. and Middaugh C.R. (1990) Inhibition of alpha-crystallin aggregation by gamma-crystallin. J. Biol. Chem., 265, 4844-4848.

173. MacRae Т.Н. (2000) Structure and function of small heat shock/alpha-crystallin proteins: established concepts and emerging ideas. Cell. Mol. Life Sci., 57,899-913.

174. Magonet E., Hayen P., Delforge D., Delaive E., Remacle J. (1992) Importance of the structural zinc atom for the stability of yeast alcohol dehydrogenase. Biochem. J., 287, 361-365.

175. Mahler H.C., Muller R., Friess W., Delille A. and Matheus S. (2005) Induction and analysis of aggregates in a liquid IgGl-antibody formulation, Eur. J. Pharm. Biopharm., 59,407-417.

176. Maiti M., Kono M. and Chakrabarti B. (1988) Heat-induced changes in the conformation of alpha- and beta-crystallins: unique thermal stability of alpha-crystallin. FEBS Lett., 236, 109-114.

177. Mandal K., Dillon J. and Gaillard E.R. (2000) Heat and concentration effects on the small heat shock protein, a-crystallin. Photochem. Photobiol., 71,470-475.

178. Martin J., Langer Т., Boteva R„ Schramel A., Horwich A. L. and Hartl F.-U. (1991) Chaperonin-mediated protein folding at the surface of groEL through a 'molten globule'-like intermediate. Nature, 352,36-42.

179. Mayer M.P. and Bukau В. (2005) Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol. Life Sci., 62,670-684.

180. Mazzola J.L., and Sirover M.A. (2001) Reduction of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity in Alzheimer's disease and in Huntington's disease fibroblasts, J. Neurochem., 76,442-449.

181. Merck K.B., Groenen P.J., Voorter E., de Haard-Hoekman W.A., Horwitz J., Bloemendal H., de Jong W.W. (1993) Structural and functional similarities of bovine a-crystallin and mouse small heat shock protein. J. Biol. Chem., 268,1046-1052.

182. Merlini G., Bellotti V., Andreola A., Palladini G., Obici L., Casarini S. and Perfetti V. (2001) Protein aggregation. Clin. Chem. Lab. Med., 39,1065-1075.

183. Militello V., Casarino C., Emanuele A., Giostra A., Pullara F. and Leone M. (2004) Aggregation kinetics of bovine serum albumin studied by FTIR spectroscopy and light scattering. Biophys. Chem., 107,175-187.

184. Minami Y., Hohfeld J., Ohtsuka K. and Hartl F.U. (1996) Regulation of the heat-shock protein 70 reaction cycle by the mammalian DnaJ homolog, Hsp40. J. Biol. Chem., 271, 19617-19624.

185. Myers J.K. and Oas T.G. (2002) Mechanism of fast protein folding. Annu. Rev. Biochem., 71,783-815.

186. Naletova I.N., Muronetz V.I. and Schmalhausen E.V. (2006) Unfolded, oxidized, and thermoinactivated forms of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase interact with the chaperonin GroEL in different ways. Biochim. Biophys. Acta, 1764, 831-838.

187. Narberhaus F. (2002) Alpha-crystallin-type heat shock proteins: socializing minichaperones in the context of a multichaperone network. Microbiol. Molec. Biol. Rev., 66,64-93.

188. Niederhut M.S., Gibbons B.J., Perez-Miller S., Hurley T.D. (2001) Three-dimensional structures of the three human class I alcohol dehydrogenases. Protein Sci., 10,697-706.

189. Nikkola M, Lindqvist Y, Schneider G. (1994) Refined structure of transketolase from Saccharomyces cerevisiae at 2.0 A resolution. J. Mol. Biol., 238,387-404.

190. Nordling E., Jornvall H., Persson B. (2002) Medium-chain dehydrogenases/reductases (MDR): family characterizations including genome comparisons and active site modelling. Eur. J. Biochem., 269,4267-4276.

191. Oosawa F., Kasai M. (1962) A theory of linear and helical aggregations of macromolecules. J. Mol. Biol., 4,10-21.

192. Ostrovsky M.A., Sergeev Y.V., Atkinson D.B., Soustov L.V., Hejtmancik J.F. (2002) Comparison of ultraviolet induced photo-kinetics for lens-derived and recombinant beta-crystallins. Mol Vis., 8,72-78.

193. Panasenko O.O., Seit-Nebi A., Bukach O.V., Marston S.B. and Gusev N.B. (2002) Structure and properties of avian small heat shock protein with molecular weight 25 kDa. Biochim. Biophys. Acta, 1601,64-74.

194. Perutz M.F. (1997) Amyloid fibrils mutations make enzyme polymerize. Nature, 385, 773-775.

195. Perutz M.F. (1999) Glutamine repeats and neurodegenerative diseases: molecular aspects. Trends Biochem. Sci., 4, 8-63.

196. Photon Correlation and Light Beating Spectroscopy (1974) (Cummins, H. Z. and Pike, E. R., Eds) Plenum, New York.

197. Pierscionek B.K., Augusteyn R.C. (1992) Growth related changes in functional parameters in the bovine lens. Biochim. Biophys. Acta., 1116,283-290.

198. Plaxco K.W. and Dobson C.M. (1996) Time-resolved biophysical methods in the study of protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol., 6,630-636.

199. Pouzot M., Nicolai Т., Durand D. and Benyahia L. (2004) Structure factor and elasticity of a heat-set globular protein gel. Macromolecules, 37,614-620.

200. Prusiner S.B. and Hsiao K.K. (1994) Human prion diseases. Ann. Neurol., 35,385-395.

201. Putilina Т., Skouri-Panet F., Prat K., Lubsen N.H. and Tardieu A. (2003) Subunit exchange demonstrates a differential chaperone activity of calf a-crystallin toward Plow- and individual y-crystallins. J. Biol. Chem., 278, 13747-13756.

202. Radford S.E. (2000) Protein folding: progress made and promises ahead. Trends Biochem. Sci., 25,611-618.

203. Rajaraman K., Raman В., Ramakrishna T. and Rao C.M. (2001) Interaction of human recombinant alphaA- and alphaB-crystallins with early and late unfolding intermediates of citrate synthase on its thermal denaturation. FEBS Lett., 497,118-123.

204. Raman B. and Rao C.M. (1994) Chaperone-like activity and quaternary structure of alpha-crystallin. J. Biol. Chem., 269,27264-27284.

205. Raman B. and Rao C.M. (1997) Chaperone-like activity and temperature-induced structural changes of alpha-crystallin, J. Biol. Chem., 272,23559-23564.

206. Raman В., Ramakrishna T. and Rao C.M. (1995) Rapid refolding studies on the chaperone-like alpha-crystallin. Effect of alpha-crystallin on refolding of beta- and gamma-crystallins. J. Biol. Chem., 270,19888-19921.

207. Ramaswamy S., El Ahmad M., Danielsson O., Jornvall H., Eklund H. (1996) Crystal structure of cod liver class I alcohol dehydrogenase: substrate pocket and structurally variable segments. Protein. Sci., 5,663-671.

208. Ramaswamy S., Kratzer D.A., Hershey A.D., Rogers P.H., Arnone A., Eklund H. and Plapp B.V. (1994) Crystallization and preliminary crystallographic studies of Saccharomyces cerevisiae alcohol dehydrogenase I. J. Mol. Biol., 235,777-779.

209. Rao C.M, Raman В., Ramakrishna Т., Rajaraman K., Ghosh D., Datta S., Trivedi V.D. and Sukhaswami M.B. (1998) Structural perturbation of a-crystallin and its chaperone-like activity. Int. J Biol. Macromol., 22,271-281.

210. Rao P.V., Horwitz J., Zigler J.S., Jr. (1993) Alpha-crystallin, a molecular chaperone, forms a stable complex with carbonic anhydrase upon heat denaturation. Biochem. Biophys. Res. Commun., 190, 786-793.

211. Rao P.V., Huang Q.L., Horwitz J. and Zigler J.S., Jr. (1995) Evidence that alpha-crystallin prevents non-specific protein aggregation in the intact eye lens. Biochim. Biophys. Acta, 1245,439-447.

212. Reddy G.B., Das K.P., Petrash J.M. and Surewicz W.K. (2000) Temperature-dependent chaperone activity and structural properties of human alphaA- and alphaB-crystallins. J. Biol. Chem., 275,4565^1570.

213. Regini J.W., Grossman J.G. (2003) Structural changes of a-crystallin during heatingand comparisons with other small heat shock proteins. Fibre Diffr. Rev., 11,95-101.

214. Ren G., Lin Z., Tsou C. L. and Wang C.C. (2003) Effects of macromolecular crowding on the unfolding and the refolding of D-glyceraldehyde-3-phosophospate dehydrogenase, J. Protein Chem., 22,431-439.

215. Rudolph R., Heider I. and Jaenicke R. (1977) Mechanism of reactivation and refolding of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from yeast after denaturation and dissociation. Eur. J. Biochem., 81,563-570.

216. Sanchez-Ruiz J.M. (1992) Theoretical analysis of Lumry-Eyring models in differential scanning calorimetry. Biophys. J., 61,921-935.

217. Sanghani P.C., Robinson H., Bosron W.F., Hurley T.D. (2002) Human glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase. Structures of apo, binary, and inhibitory ternary complexes. Biochemistry, 41,10778-10786.

218. Santhoshkumar P., Sharma K.K. (2001) Analysis of a-crystallin chaperone function using restriction enzymes and citrate synthase. Mol. Vis., 7, 172-177.

219. Santhoshkumar P., Sharma K.K. (2002) Identification of a region in alcohol dehydrogenase that binds to alpha-crystallin during chaperone action. Biochim. Biophys. Acta, 1598,115-121.

220. Schiene-Fischer C., Habazettl J., Schmid F.X., Fischer G. (2002) The hsp70 chaperone DnaK is a secondary amide peptide bond cis-trans isomerase. Nat. Struct. Biol., 9,419424.

221. Schneider G., Lindqvist Y. (1998) Crystallography and mutagenesis of transketolase: mechanistic implications for enzymatic thiamin catalysis. Biochim. Biophys. Acta., 1385,387-98.

222. Schuck P. (2000) Size distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling. Biophys. J., 78,1606-1619.

223. Schuler J., Frank J., Saenger W. and Georgalis Y. (1999) Thermally induced aggregation of human transferrin receptor studied by light-scattering techniques. Biophys J., 77,1117-1125.

224. Schulze H., Schuler A., Stuber D., Dobeli H., Langen H. and Huber G. (1993) Rat brain glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase interacts with the recombinant cytoplasmic domain of Alzheimer's P-amyloid precursor protein. J. Neurochem., 60,1915-1922.

225. Scopes R.K. and Stoter A. (1982) Purification of all glycolytic enzymes from one muscle extract. Meth. Enzymol., 90,479-490.

226. Selivanov V.A., Kovina M.V., Kochevova N.V., Meshalkina L.E., Kochetov G.A. (2004) Kinetic study of the HI03A mutant yeast transketolase. FEBS Lett., 567, 270274.

227. Sergeev Y.V., Hejtmancik J.F. and Wingfield P.T. (2004) Energetics of domain-domain interactions and entropy driven association of P-crystallins. Biochemistry, 43,415-424.

228. Sharma K.K., Kumar G.S., Murphy A.S., Kester K. (1998) Identification of 1,1 '-bi(4-anilino) naphthalene-5,5'-disulfonic acid binding sequences in alpha-crystallin. J. Biol. Chem., 273,15474-15478.

229. Sharma K.K., Kumar R.S., Kumar G.S., Quinn P.T. (2000) Synthesis and characterization of a peptide Identified as a functional element in aA-crystallin. J Biol Chem., 275,3767-3771.

230. Siezen R.J., Bindels J., Hoenders H.J. (1980) The quaternary structure of bovine a-crystallin. Effects of variations in alkaline pH, ionic strength, temperature and calcium ion concentration. Eur. J. Biochem., Ill, 435-444.

231. Siezen R.J., Bindels J.G., Hoenders H.J. (1979) The interrelationship between monomelic, oligomeric and polymeric alpha-crystallin in the calf lens nucleus. Exp. Eye Res., 28,551-567.

232. Silow M., Tan Y.-J., Fersht A.R. and Oliveberg M. (1999) Formation of short-lived protein aggregates directly from the coil in two-state folding. Biochemistry, 38,1300613012.

233. Slingsby C. and Bateman O.A. (1990) Quaternary interactions in eye lens P-crystallins: Basic and acidic subunits of P-crystallins favor heterologous association. Biochemistry, 29, 6592-6599.

234. Smith D.F., Whitesell L. and Katsanis E. (1998) Molecular chaperones: biology and prospects for pharmacological intervention. Pharmacol. Rev., 50,493-514.

235. Smulders R.H., de Jong W.W. (1997) The hydrophobic probe 4,4V-bis(l-anilino-8-naphthalene sulfonic acid) is specifically photoincorporated into the N-terminal domain of alpha B-crystallin. FEBSLett., 409,101-104.

236. Soti C., Pal С., Papp B. and Csermely P. (2005) Molecular chaperones as regulatory elements of cellular networks. Curr. Opin. Cell Biol. 17,210-215.

237. Sparrer H., Lilie H.and Buchner J. (1996) Dynamics of the GroEL-protein complex: effect of nucleotides and folding mutants. J. Mol. Biol., 258,74-87.

238. Speed M.A., King J. and Wang D.J. (1997) Polymerization mechanism of polypeptide chain aggregation. Biotechnol. Bioeng., 54,333-343.

239. Speed M.A., Wang D.I. and King J. (1996) Specific aggregation of partially folded polypeptide chains: the molecular basis of inclusion body composition. Nat. Biotechnol., 14,1283-1287.

240. Srinivas V., Datta S., Ramakrishna A.T., Rao Ch.M. (2001) Studies on the a-ciystallin target protein binding sites: sequential binding with two target proteins. Mol. Vis., 7, 114-119.

241. Srinivasan A.N., Nagineni C.N. and Bhat S.P. (1992) alpha A-crystallin is expressed in non-ocular tissues. J. Biol. Chem. 267,23337-23341.

242. Stromer Т., Ehrnsperger M., Gaestel M. and Buchner J. (2003) Analysis of the interaction of small heat shock proteins with unfolding proteins. J. Biol. Chem., 278, 18015-18021.

243. Sun T.X., Das B.K., Liang J.J. (1997) Conformational and functional differences between recombinant human lens alphaA- and alphaB-crystallin. J. Biol. Chem., 272, 6220-6225.

244. Sun Y. and. MacRae Т.Н. (2005) The small heat shock proteins and their role in human disease. FEBSJ. 272,2613-2627.

245. Sundstrom M., Lindqvist Y. and Schneider G. (1992) Three-dimensional structure of apotransketolase. Flexible loops at the active site enable со factor binding. FEBS Lett., 313,229-231.

246. Surewicz W.K. and Olesen P.R. (1995) On the thermal stability of alpha-crystallin: a new insight from infrared spectroscopy. Biochemistry, 34,9655-9660.

247. Svensson S., Hoog J.O., Schneider G., Sandalova T. (2000) Crystal structures of mouse class II alcohol dehydrogenase reveal determinants of substrate specificity and catalytic efficiency. J. Mol. Biol., 302,441-453.

248. Thomson J.A., Augusteyn R.C. (1983) A m-crystallin: the native form of the protein? Exp. Eye Res., 37,367-377.

249. Thomson J.A., Augusteyn R.C. (1988) On the structure of alpha-crystallin: The minimum molecular weight. Curr. Eye Res., 7,563-569.

250. Thomson J.A., Augusteyn R.C. (1989) On the structure of a-crystallin: construction of hybrid molecules and homopolymers. Biochim. Biophys. Acta, 994,246-252.

251. Thurston G.M., Sun T.X. and Liang J.N. (1998) Relationship between molecular weight and hydrodynamic radius during heat-induced aggregation of recombinant human aA and aB crystallin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 39, S870.

252. Treweek T.M., Morris A.M. and Carver J.A. (2003) Intracellular protein unfolding and aggregation: the role of small heat-shock chaperone proteins. Aust. J. Chem., 56, 357367.

253. Turoverov K.K., Biktashev A.G., Khaitlina S.Y. and Kuznetsova I.M. (1999) The structure and dynamics of partially folded actin, Biochemistry, 38,6261-6269.

254. Vanhoudt J., Abgar S., Aerts T. and Clauwaert J. (2000b) A small-angle X-ray solution scattering study of bovine a-crystallin. Eur. J. Biochem., 267,3848-3858.

255. Vanhoudt J., Aerts S., Abgar T. and Clauwaert J. (2000a) Native quaternary structure of bovine alpha-crystallin. Biochemistry, 39, 4483-4492.

256. Vanhoudt J., Aerts Т., Abgar S. and Clauwaert J. (1997) Quaternary structure and interaction parameters of bovine a-crystallin: influence of isolation conditions. Progr. Colloid. Polym. Sci., 107, 88-93.

257. Veillon C. and Sitkowsky A.J. (1975) The intrinsic zinc atoms of yeast alcohol dehydrogenase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 67, 1494-1500.

258. Velasco P.T., Lukas T.J., Murthy S.N., Duglas-Tabor Y., Garland D.L. and Lorand L. (1997) Hierarchy of lens proteins requiring protection against heat-induced precipitation by the alpha crystallin chaperone. Exp. Eye Res., 65, 497-505.

259. Wang K. and Kurganov B.I. (2003) Kinetics of heat- and acidification-induced aggregation of firefly luciferase. Biophys. Chem., 106,97-109.

260. Wang K. and Spector A. (1994) The chaperone activity of bovine a-crystallin. Interaction with other lens crystallins in native and denatured states. J. Biol. Chem., 269,13601-13608.

261. Wegele H., Muller L. and Buchner J. (2004) Hsp70 and Hsp90 a relay team for protein folding. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 151,1-44.

262. Weitz D.A., and Lin M.Y. (1986) Dynamic scaling of cluster-mass distributions in kinetic colloid aggregation. Phys. Rev. Lett., 57,2037-2040.

263. Weitz D.A., Huang J.S., Lin M.Y. and Sung J. (1985) Limits of the fractal dimension for irreversible kinetic aggregation of gold colloids. Phys. Rev. Lett., 54,1416-1419.

264. Wetzel R. (1994) Mutations and off-pathway aggregation of proteins. Trends Biotechnol., 12,193-198.

265. Wickner S., Maurizi M.R. and Gottesman S. (1999) Posttranslational quality control: folding, refolding, and degrading proteins. Science, 286,1888-1893.

266. Wistow G., Turnell В., Summers L., et al. (1983) X-ray analysis of the eye lens protein gamma-II crystallin at 1.9 A resolution. J. Mol. Biol., 170,175-202.

267. Wistow G.J. and Piatigorsky J. (1988) Lens crystallins: The evolution and expression of proteins for a highly specialized tissue. Ann. Rev. Biochem., 57,479-504.

268. Wood J.D., Beaujeux T.P. and Shaw P.J. (2003) Protein aggregation in motor neurone disorders. Neuropathol. Appl. Neurobiol., 29,529-545.

269. Xie P., Parsons S.H., Speckhard D.C., Bosron W.F., Hurley T.D. (1997) X-ray structure of human class IV ss alcohol dehydrogenase. Structural basis for substrate specificity. J. Biol. Chem., 272, 18558-18563.

270. Yang Y., Chen R. and Zhou H.M. (1998) Comparison of inactivation and conformational changes of native and apo yeast alcohol dehydrogenase during thermal denaturation. Biochem. Mol. Biol. Int., 45,475-487.

271. Yang Z.N., Bosron W.F., Hurley T.D. (1997) Structure of human xx alcohol dehydrogenase: a glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase. J. Mol. Biol., 265,330-343.

272. Young J.C. and Hartl F.U. (2002) Chaperones and transcriptional regulation by nuclear receptors. Nature Struct. Biol., 9,640-642.

273. Yudin I. K., Nikolaenko G.L., Kosov V.I., Agayan V.A., Anisimov M.A. and Sengers J.V. (1997) Simple photon-correlation spectrometer for research and education. Int. J. Thermophys.,18,1237-1248.

274. Yudin I.K., Nikolaenko G.L., Gorodetskii E.E., Markhashov E.L., Agayan V.A., Anisimov M.A. and Sengers J.V. (1998) Crossover kinetics of asphaltene aggregation in hydrocarbon solutions. PhysicaA., 251,235-244.

275. Zantema A., Verlaan-De Vries M., Maasdam D., Bol S., van der Eb A. (1992) Heat shock protein 27 and alphaB-crystallin can form a complex, which dissociates by heat shock. J. Biol. Chem., 267,12936-12941.

276. Zigler J.S. (1978) Age-related changes in the polypeptide composition of beta-crystallin from bovine lens. Exp. Eye Res., 26,537-546.

277. Zigler J.S., Horwitz J. and Kinoshita J.H. (1980). Human p-ciystallin I. Comparative studies on the pi, P2 and Рз-ciystallins. Exp. Eye Res., 31,41-55.

278. Гусев Н.Б., Богачева H.B., Марстон С.Б. (2002) Структура и свойства малых белков теплового шока (sHsp) и их взаимодействие с белками цитоскелета. Биохимия, 67,613-23.

279. Есакова О.А., Ханова Е.А., Мешалкина JI.E., Голбик Р., Хюбнер Г., Кочетов Г.А. (2005) Влияние субстратов транскетолазы на реконструкцию и стабильность холофермента. Биохимия, 70,770-776.

280. Клюева А.В., Левчук Ю.Н., Набока Ю.Н. (2002) Фотонкореляционная спектроскопия белков. Укр. биохим. лсурп., 74,12-26.

281. Кривандин А.В., Муранов К.О., Островский М.А. (2004а) Рентгеновское малоугловое сследование комплексообразования в расстворах а- и Рь-кристаллинов при нагрегвании.Докл. Академ. Наук, 394,1-4.

282. Кривандин А.В., Муранов К.О., Островский М.А. (2004b) Исследование комплексообразования в расстворах а- и Рь-кристаллинов при 60 °С. Мол. Биол., 38,1-15.

283. Кривандин А.В., Муранов К.О., Потураева И.Д., Полянский Н.Б., Островский М.А. (2006) Исследование комплексообразования а- и Рь-кристаллинов при УФ-облучении. Докл. Академ. Наук, 409,1-5.

284. Курганов Б.И. (2002) Оценка активности молекулярных шалеронов в тест-системах, основанных на подавлении агрегации белков. Успехи биол. химии, 42, 89-138.

285. Курганов Б.И., Рафикова Э.Р., Добров Е.Н (2002) Кинетика тепловой агрегации белка оболочки вируса табачной мазаики. Биохимия, 67,631-640.

286. Любарев А.Е., Курганов Б.И. (2000) Изучение необратимой тепловой денатурации белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Успехи биол. химии, 40,43-84.

287. Маркосян К.А., Курганов Б.И. (2004) Фолдинг, неправильный фолдинг и агрегация белков. Образование телец включения и агресом. Биохимия, 69, 11961212.

288. Панаеенко О.О., Ким М.В., Гусев Н.Б. (2003) Структура и свойства малых белков теплового шока. Успехи биол. химии, 43,59-98.

289. Полторак О.М., Чухрай Е.С., Торшин И.Ю. (1998) Диссоциативная термоинактивация, стабильность и активность олигомерных ферментов (обзор). Биохимия, 63,360-369.

290. Сасо JI., Гриппа Е., Гатто М.Т., Леоне М.Г.,Сильвестрини Б. (2000) Использование метода гельпроникающей хроматографии высокого давления для исследования влияния а-кристаллинов на вызванную нагреванием агрегацию и у-кристаллинов. Биохимия, 65,250-255.

291. Соловьева О.Н. (2002) Выделение и свойства нековалентного комплекса транскетолазы с РНК. Биохимия, 67,804-809.

292. Чеботарева Н.А., Курганов Б.И. и Ливанова Н.Б. (2004) Биохимические эффекты молекулярного краудинга. Биохимия, 69, 1239-1251.

293. Янг И., Жанг К.-Ш., Жоу Х.-М. (1998) Инактивация и конформационные изменения дрожжевой алкогольдегидрогеназы в растворах трифторэтанола. Биохимия, 63, 1307-1311.

294. Янг И., Жоу Х.-М. (2001) Влияние ионов цинка на конформационную стабильность дрожжевой алкогольдегидрогеназы. Биохимия, 66,61-70.

Информация о работе

Ханова, Елена Анатольевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Механизм подавления агрегации белков α-кристаллином - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы