Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Шапероноподобная активность фактора ингибирования миграции макрофагов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Шапероноподобная активность фактора ингибирования миграции макрофагов"

на правах рукописи

ЧЕРЕПКОВА Оксана Анатольевна

I

ШАПЕРОНОПОДОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ФАКТОРА ИНГИБИРОВАНИЯ МИГРАЦИИ МАКРОФАГОВ

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук Б.Я. Гурвиц

доктор биологических наук, профессор С.С. Шишкин

доктор биологических наук Н.П. Шарова

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «___»_2006 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «_»_2006 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

¿006 А S2.7G

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Молекулярные шапероны обладают способностью защищать белки, утратившие нативную конформацию при стрессорных воздействиях различного характера. Эта способность проявляется при взаимодействии шаперонов с гидрофобными участками развернутых или неправильно свернутых белков, что препятствует связыванию этих белков между собой и последующей агрегации и приводит, в конечном итоге, к сохранению их нативного состояния.

При температурах, превышающих физиологический уровень, в клетках наблюдается активация синтеза молекулярных шаперонов, известных как белки теплового шока (heat shock proteins, HSP). Некоторые из них (HSP70, GroEL) способствуют рефолдингу белков, подвергнутых тепловому повреждению, к нативному состоянию, в то время как другие (а-кристаллин, малые HSP) только тормозят агрегацию белков и стабилизируют их структуру. Белковые агрегаты могут подвергаться солюбилизации и рефолдингу с образованием биологически активной конформации под действием системы шаперонов, входящих в состав мультишаперонной сети. В эту сеть часто вовлекаются ферменты фолдинга (пептидил-пролил-цис-транс изомераза и протеиндисульфидизомераза), различные шапероноподобные белки и пептиды [Puig et al., 1997; Sharma et al., 2000; Manna et al., 2001; Bhattacharyya et al., 2003].

В связи с многообразием и широким спектром действия шаперонов в различных компартментах клетки интерес к ним не ослабевает и список вновь открываемых шапероноподобных белков неуклонно растет. Однако, несмотря на огромное число экспериментов, направленных на изучение защитной роли шаперонов при денатурации и агрегации белков в условиях стресса, молекулярные механизмы действия шаперонов остаются невыясненными.

Все известные в настоящее время шапероны обладают общими свойствами: они имеют гидрофобные домены, экспонированные на поверхности их молекулярных структур, способные узнавать и связывать определенные интермедиаты фолдинга белковых

функциональные особенности, необходимые для характеристики белка как шаперона, не вполне ясны.

В этой связи большой интерес вызывает исследование шапероноподобных свойств термостабильных гидрофобных белков, проявляющих способность к образованию амфипатической вторичной структуры. Одним из таких белков является фактор ингибирования миграции макрофагов (macrophage migration inhibitory factor, MIF), принадлежащий к семейству цитокинов. Около 40 лет назад MTF был идентифицирован как фактор, продуцируемый активированными Т-лимфоцитами, по его способности тормозить миграцию макрофагов in vitro [Bloom and Bennet, 1966]. В последующие годы было показано, что низкомолекулярный высококонсервативный белок MIF (12,5 кДа) широко распространен в биологических объектах разной степени сложности (от бактерий до млекопитающих), его наибольшее количество обнаружено в макрофагах и в различных отделах мозга. Далее MIF был вновь «открыт» как медиатор системного ответа организма на стресс [Bucala, 1996; Donn and Ray, 2004], однако, его участие в биохимических механизмах формирования защитных реакций организма при тепловом шоке ранее не исследовалось, хотя структурно-функциональные характеристики MIF аналогичны многим шапероноподобным белкам.

Целью настоящей работы является изучение шапероноподобных свойств MIF в тест-системе in vitro, основанной на исследовании кинетики тепловой агрегации модельных белковых субстратов. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Выделить MIF из мозга быка в гомогенном состоянии и изучить его физико-химические и ферментативные свойства.

2. Исследовать влияние MIF на кинетику тепловой агрегации белковых субстратов - малатдегидрогеназы (MDH) из сердца свиньи, гликогенфосфорилазы b (Ph b) из скелетных мышц кролика и дрожжевой алкогольдегидрогеназы (ADH) при различных температурах (41-48°С) и концентрациях белков.

3. Исследовать возможность реактивации частично денатурированных белковых субстратов под влиянием МП7.

4. Проанализировать изменения олигомерного состояния белковых субстратов и МП7 при тепловом воздействии.

Научная новизна и практическая ценность работы. Наряду с традиционными представлениями о защите клеток от теплового повреждения с помощью системы, включающей шапероны и ферменты фолдинга, рассмотрена возможность существования пути регуляции, опосредуемого биологическими эффектами низкомолекулярных термостабильных гидрофобных белков, имеющих амфипатическую вторичную структуру.

Показано, что МП7, выделенный из мозга быка с использованием нового оригинального метода, обладает шапероноподобными свойствами. Это подтверждается следующими экспериментальными результатами:

• при исследовании кинетики термоагрегации МЕ)Н и РЬ Ь турбидиметрическим методом продемонстрировано торможение агрегации белковых субстратов под действием МП7;

• обнаружено защитное действие МП7 в процессе термоинактивации частично денатурированных МЕ>Н и РЬ Ь;

• показано, что в зависимости от экспериментальных условий МП7 может как тормозить, так и ускорять агрегацию белков. При температуре, близкой к физиологическому уровню (41,5°С), наблюдается образование легко растворимых агрегатов и стабилизация олигомерной структуры субстрата, что может способствовать ренатурации белка к нативному состоянию после снятия денатурирующего воздействия. Таким образом, в этих условиях МЕР может играть шапероноподобную роль;

• анализ состояния агрегатов с помощью электрофореза в ПААГ в неденатурирующих условиях показывает, что защитное действие МП7 проявляется в торможении роста агрегатов субстратного белка.

Полученные данные позволяют существенно расширить представления о шапероноподобных белках, а также о механизмах регуляции их шаперонной активности. Наличие в молекуле шаперона гидрофильных сайтов способствует лучшему растворению гетероагрегатов, образующихся при тепловом стрессе.

Большой интерес к изучению механизмов действия молекулярных шаперонов вызван не только проблемами, связанными с процессами агрегации при получении рекомбинантных белков, но и с необходимостью разработки эффективных средств защиты клеток в условиях развития патологических состояний в результате нарушения конформации белков. Это направление исследований представляется также весьма перспективным в выявлении защитных реакций организма при температурах среды, близких к физиологически допустимому уровню (41-43°С), что может иметь большое значение в биологии и медицине.

Обладая выраженной стабильностью и способностью к образованию амфифильной вторичной структуры, стресс-индуцируемый белок, MIF, в сочетании с другими белками с аналогичными свойствами может войти в семейство конститутивно экспрессируемых «малых шаперонов», участвующих в адаптации организма к стрессу, на начальных этапах его развития.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на 7-ой Путинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003); на 19-ой конференции Международного нейрохимического общества, ISN (Гонконг, 2003); на Ш Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); на Международном симпозиуме "Молекулярные механизмы регуляции функции клетки" (Тюмень, 2005), на FEBS конгрессе (Будапешт, 2005).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 статей в ведущих российских и зарубежных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, изложения

результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

4

Работа изложена на страницах. Список цитируемой литературы

включает наименования, в том числе на иностранных языках Иллюстративный материал содержит рисунков и таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение MIF из мозга быка. Разработан метод выделения MIF в гомогенном состоянии, включающий гомогенизацию ткани мозга, нагревание гомогената (58°С, 20 мин), высаливание сульфатом аммония, гель-фильтрацию на колонке с Toyopearl HW-55.

Электрофорез. Электрофорез хроматографически очищенных фракций белка проводили в 12%-ном ПААГ в присутствии Ds-Na или в градиентном 515% ПААГ в неденатурирующих условиях. Белок проявляли нитратом серебра.

Кето-енол таутомеразная активность MIF. Ферментативную активность MTF определяли по скорости образования енол-изомера из кето-изомера и-гидроксифенилпирувата, использованного в качестве субстрата [Knox et ah, 1957]. Измеряли увеличение абсорбции при 330 нм при комнатной температуре, используя спектрофотометр Beckman DU-650 (США).

Выделение гликогенфосфорнлазы Ь (Ph b). Ph Ь выделяли по методу Юниса [Yunis et al., 1962]. Выход белка составлял 0,5 мг на 1 г сырой ткани. Концентрацию фосфорилазы Ъ определяли спектрофотометрически, используя коэффициент поглощения 13,2 для 1%-го раствора белка при 280 нм [Soman et al., 1983].

Определение шаперонной активности. Использовали тест-систему, основанную на подавлении тепловой агрегации модельных белковых субстратов. Агрегацию MDH и ADH в 20 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0 и Ph Ъ в 80 мМ Hepes буфере, рН 6,8, содержащем 0,2 мМ ЭДТА, в отсутствие и в присутствии различных концентраций MIF измеряли на спектрофотометре Beckman DU-650 по изменению кажущегося оптического поглощения при 360 нм.

Пробы, полученные после тепловой агрегации, центрифугировали (10000 g, 20 мин). В случае Ph b осадки растворяли как в 4 М мочевине, так и в 80 мМ Hepes буфере, рН 6,8, содержащем 0,2 мМ ЭДТА; в случае MDH и ADH осадки растворяли в 20 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0. Полученные образцы анализировались с помощью электрофореза в ПААГ в нативных и денатурирующих условиях.

Для расчета молярных стехиометрических соотношений (MIF : субстратный белок) использовали значения молекулярных масс субъединиц MDH, Ph b, ADH и MIF - 35, 97,40 и 12 кДа соответственно.

Эксклюзионная хроматография в системе FPLC. Использовали ACTA FPLC систему (Amersham Biosciences, Pharmacia) на Superdex 10/300 347 GL колонке. Образцы MDH инкубировали при 40,5°С в течение 30 минут, центрифугировали при 10000 g в течение 20 минут, затем наносили на колонку. Скорость элюции - 0,5 мл/мин. Профиль элюции детектировали при 280 им.

Ферментативная активность субстратов. Исследование активности Ph b в отсутствие и в присутствии MIF проводили при 30°С в 80 мМ Hepes буфере, рН 6,8, содержащем 0,2 мМ ЭДТА. Значения кажущегося поглощения раствора, содержащего 0,25 М гликоген, 0,1 мкМ Ph b и 1 мМ 5'-АМР, регистрировали при 340 нм. Реакцию инициировали добавлением а-0-глюкозо-1-фосфата (6 мМ). Термоинактивацию Ph b при 42°С в термостате определяли по степени фосфоролиза гликогена. Аликвоты отбирали через определенные интервалы времени.

Активность MDH измеряли по поглощению при 340 нм в 100 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0, содержащем 0,5 мМ оксалоацетат и 0,28 мМ NADH, после инкубации субстрата при 39°С. Аликвоты отбирали из раствора через определенные промежутки времени и измеряли ферментативную активность MDH по степени превращения окг",тто',"ртоТя в малат.

Концентрацию белка определяли по методу Bradford [Bradford, 1976].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение MIF из мозга быка. Был разработан простой оригинальный метод выделения MIF из мозга быка Фракции, содержащие MIF, определяли по таутомеразной активности Выход белка составлял 0,5 мг/мл на 1 г сырой ткани MIF выделялся в гомогенном состоянии При электрофорезе в ПААГ в присутствии Ds-Na проявлялась единственная полоса, соответствующая кажущейся молекулярной массе 12 кДа (Рис 1, дорожка 3) Анализ элюции MIF показал, что его выход в гомогенном состоянии является результатом сорбции на колонке, в основе которой лежат гидрофобные взаимодействия Использование буфера, содержащего 0,2 М КС1 и/или 2 мМ (3-меркаптоэтанола (р-МЕ), приводило к потере гомогенности (Рис. 1, дорожки 1 и 2). 12 3 4

Рис. 1 Электрофорез в 12% ПААГ в присутствии Ds-Na MIF-содержащих фракций, полученных на разных этапах выделения M1F Дорожки 1 и 2 - элюат с колонки Тоуореаг! HW-55 в 20 мМ КН2РО4 буфере, рН 6,8, содержащем 2 мМ Р-МЕ, в присутствии, или в отсутствие 0,2 М КС1 соответственно, 3 - то же в 20 мМ КН2Р04 буфере, рН 6,8, в отсутствие КС1 и р-МЕ, 4 -маркеры молекулярных масс, кДа

Для доказательства идентичности выделенного белка М1Н после электрофореза проводили иммуноблотгинг с использованием Р\Т)Р мембраны (данные не показаны) Пятно, проявляющее иммунореактивность, вырезали и подвергали микросеквенированию В соответствии с банком данных белковых структур полученная И-концевая последовательность (29 шагов) оказалась идентичной структуре М№ мозга теленка: ЬШг-РМРУУНТЫУР КАЗУРБОЬЬБ ЕЫОРЬАдА.

С целью определения молекулярной массы нативного белка проводили электрофорез в неденатурирующих условиях (Рис. 2). Оказалось, что фракции

МШ представляют собой смесь изоформ с различными молекулярными массами от 12 до 480 кДа (12, 48, 60, 120, 168 и 480 кДа - 1, 4, 5, 10, 14, 40 субъединиц соответственно).

480 [- 160 134

Рис. 2. Нативный градиентный (5-15%) электрофорез выделенного белка в ПААГ 1 - изоформы МП7, 2 -маркеры молекулярных масс, кДа

67 45

Была исследована также таутомеразная активность как в отсутствие, так и в

присутствии 2 мМ Р-МЕ при различных температурах (Рис. 3, А и Б). Как видно из — 29 рисунков, в присутствии 2 мМ (3-МЕ при | нагревании до температуры 45°С, а в его

отсутствие - при нагревании до температуры 42°С таутомеразная активность МП7 увеличивается При повышении температуры до 52 - 60°С его активность резко падает, однако, методом кругового дихроизма было показано, что при этих условиях М1Р сохраняет целостность своей вторичной структуры (данные не приведены)

А/А0

А/А,,

20 30 40 Время, мин

1,2 1,0 0,8 0,6

0,4 0,2 0,0

Б

45°С

\52°С

10 20 30 40 50 60 Время, мин

Рис. 3. Таутомеразная активность МП7 в отсутствие (А) и в присутствии (Б) 2 мМ Р-МЕ при различных температурах По оси абсцисс отложено время инкубации, по оси ординат -отношение кажущегося оптического поглощения при 330 нм при повышенной температуре (А) к значению А при 25°С (Ао)

На основании анализа структурно-функциональных свойств стресс-индуцируемого белка, МП7, было предположено, что он может проявлять шалероноподобные свойства в условиях теплового стресса.

Шапероноподобная активность. Использовали тест-систему, основанную на подавлении тепловой агрегации модельных белковых субстратов: МЕ)Н и РЬ Ь. Агрегация белков в присутствии МП7 снижалась по мере увеличения его концентрации (Рис. 4).

МП7 проявляет значительный эффект даже при субстехиометрических концентрациях (Рис. 4 А, кривая 2, соотношение МП7: МЕ)Н составляет 0,2 : 1). Полное торможение агрегации МЕ)Н наблюдалось при соотношении МП7 : МЕЖ -1:1 (Рис. 4 А, кривая 5), а в случае РЬ Ь - при молярном соотношении МП7: РЬ ¿> — 2:1 (Рис. 4 Б, кривая 4). Было показано, что торможение агрегации МЕИ также наблюдается при добавлении в среду 2 мМ р-МЕ (данные не представлены). Это свидетельствует о том, что действие МП7 на агрегацию субстрата не опосредовано образованием З-Э-связей.

При использовании в аналогичных условиях бычьего сывороточного альбумина вместо МП7, эффект торможения агрегации не наблюдался (Рис. 4 В).

Добавление МП7 в конечной концентрации 10 мкг/мл через 12 минут после начала агрегации МЕ)Н приводило к ее полному торможению (Рис. 4 Г, кривая 3). Полученные результаты показывают, что МП7 может связываться с частично развернутой молекулой субстрата. Эта способность присуща многим шаперонам.

Для более детального выявления молекулярного механизма действия МП7 пробы центрифугировали при 10000 g в течение 20 минут и исследовали состояния агрегатов в осадках и супернатантах.

Осадки, растворенные в 4 М мочевине (в случае РЬ Ь), или в 20 мМ Тпэ-НС1 буфере, рН 7,0 (в случае МЕ)Н), подвергали электрофорезу в присутствии

(Рис. 5 А).

ДА 360

5 10 15 20 25 30 Время, мин

20 40 60 80 100 Время, мнн

10 15 20 25 Время, мин

10 15 20 25 30 Время, мин

Рис. 4. Кинетика тепловой агрегации белковых субстратов. А. Агрегация МИН (26 мкг/мл) при 40°С в 20 мМ Тпз-НС1 буфере, рН 7,0, в отсутствие (1) и в присутствии МШ в концентрациях 1,5 мкг/мл (2), 3 мкг/мл (3), 6 мкг/мл (4) и 10 мкг/мл (5). ДА3бо - кажущееся оптическое поглощение при 360 нм. Б. Агрегация РЬ Ъ (130 мкг/мл) при 42°С в 80 мМ Нерев буфере, рН 6,8, содержащем 0,2 мМ ЭДТА, в отсутствие (1) и в присутствии МП-" в концентрациях 1,8 мкг/мл (2), 25,2 мкг/мл (3) и 34 мкг/мл (4). В. Агрегация МОН (26 мкг/мл) в отсутствие (1) и в присутствии бычьего сывороточного альбумина в концентрациях 10 мкг/мл (2) и 20 мкг/мл (3). Г. Агрегация МОН (26 мкг/мл) в отсутствие МИ7 (1), измеренная в трех различных кюветах при 40°С в 20 мМ Тпв-НС1 буфере, рН 7,0. Через 12 минут после начала агрегации был добавлен МП7 в конечных концентрациях 3 мкг/мл (2) и 10 мкг/мл (3).

Анализ электрофореграмм показал, что по мере увеличения концентрации МП7 количество белка в осадках уменьшается, что согласуется с кривыми

агрегации Это свидетельствует о том, что МП7 обладает шалероноподобными свойствами В случае РЪ Ь на конечной стадии агрегации наблюдается образование гетероагрегатов: РЪ Ь и комплекса РЬ Ъ с МШ (Рис 5 А). Последнее наблюдалось и для МОН в случае больших концентраций МИ7 (данные не показаны)

При нативном электрофорезе солюбилизированного осадка МОН, полученного на конечной стадии тепловой агрегации, в отсутствие МШ (Рис. 5 Б, дорожка 1) обнаружена одна полоса с кажущейся молекулярной массой 70 кДа Это свидетельствует о том, что МЛН во время агрегации не распадается на мономеры, а агрегирует в виде димера С помощью электрофореза в неденатурирующих условиях осадка МЛН, полученного после агрегации в присутствии МШ и растворенного в 20 мМ Тш-НС1, рН 7,0, показано, что МОН остается также в виде димера, но интенсивность пятен на электрофореграммах , соответствующих кривой агрегации 2 (Рис 4 А) остается такой же, как в случае контроля (кривая 1) Растворимость осадка в присутствии МШ улучшается, что также подтверждает его шапероноподобную активность

1 2 3 4__5 6 7 8 А

'Г А ^'Ш&ШГ' " 29 !§Р " 67

'«'К,- /¿Г-г/Тя? -

Рис. 5. 50Я-электрофорез в 12% ПААГ солюбилизированных агрегатов А. РЬ Ъ (130 мкг/мл) инкубировали при 42°С в течение 100 минут в отсутствие (дорожка 1) и в присутствии МП7 в концентрации 25,2 мкг/мл (дорожка 2). МОН (26 мкг/мл) инкубировали при 40°С в течение 30 минут в отсутствие (дорожка 3) и в присутствии МТБ в концентрациях 1,5, 3, 6 и 10 мкг/мл (дорожки 4, 5, 6 и 7 соответственно); маркеры молекулярных масс (кДа) (дорожка 8) Б. Нативный электрофорез в 10% ПААГ растворенных осадков после агрегации МОН (26 мкг/мл) в отсутствие МП7 (дорожка 1), маркер молекулярной массы (67 кДа) (дорожка 2)

Для подтверждения того, что в присутствии М№ растворимость денатурированного белка увеличивается, был проведен следующий эксперимент К осадкам МЛН, полученным на конечной стадии тепловой агрегации, были добавлены растворы М1И в разных концентрациях Электрофорез полученных проб в неденатурирующих условиях показал, что по мере увеличения концентрации М1Б растворимость осадка МГ)Н увеличивается (Рис 6) Наибольшая растворимость осадка МОН (26 мкг/мл) была показана при концентрации М№ 30 мкг/мл.

Рис. 6. Нативный электрофорез в 10% ПААГ 1 2 3 4 солюбилизированных осадков МБН (26 мкг/мл),

полученных в результате тепловой агрегации в отсутствие МШ (дорожка 1) и в присутствии М№ в концентрациях 10 мкг/мл и 30 мкг/мл (дорожки 2 и 3 соответственно); маркер молекулярной массы (67 кДа) (дорожка 4)

Полученные результаты могут быть обусловлены способностью МИ7 к образованию амфипатической вторичной структуры, при которой экспонированные наружу гидрофильные сайты М1И обеспечивают лучшую растворимость образовавшихся агрегатов

Для определения олигомерного состояния денатурированного белкового субстрата и его предполагаемого комплекса с МШ была проведена эксюпозионная хроматография МОН в отсутствие и в присутствии МШ с использованием системы БРЬС (Рис 7) Образцы нагревали в течение 30 минут при 40,5°С (Рис 4 А, кривые 1 и 4), затем центрифугировали при 10000 g в течение 20 минут и наносили на колонку При анализе образца, не содержащего МШ, на хроматограмме наблюдалось значительное уменьшение количества белка (Рис 7 А, пунктирная линия) При хроматографии М1Б-содержащего образца наблюдалось смещение пика влево по отношению к пику МОН (Рис 7 А), соответствующему 70 кДа (Рис 7 Б) Эти данные в сочетании с результатами электрофореза показывают, что МШ образует комплекс с МЛН

12

18 16 14 12 10 8 6 4

Э 2 < ^

В <1

6' : J 7 14 1 j А 1

1 ■ J Б

Рис. 7. Эксклюзионная хроматография МБН (26 мкг/мл) в отсутствие (А) и в присутствии М1Р' (Б) на колонке Бирегёех 10/300 ОЬ в системе РРЬС. Сплошной линией (А) показана \ШН в отсутствие МП7 при 1=0, пунктирной - то же через 30 минут с момента начала агрегации при 40,5°С; МОН в присутствии 6 мкг/мл МП1 (Рис. 4 А, кривая 3) после преинкубации при 40,5°С в течение 30 минут (Б). Стрелками показаны места выхода маркеров молекулярных масс.

Чтобы подтвердить присущую MIF шапероноподобную активность, были исследованы кривые агрегации субстратов. С помощью программы Origin Pro 7.0 были рассчитаны Aiim (кажущееся поглощение 20 при t—wo), to (лаг-период), к (константа скорости 1-ого порядка), а также произведение Aim*k, являющееся критерием оценки начальной скорости агрегации (Курганов, 2002).

к, мин"1

14

16 18 Элюат, мл

„ . 4 6 8 10 2.5 5.0 7.5 10

[МП?], мкг/мл [М№], мкг/мл

Рис. 8. Графики зависимости константы скорости 1-ого порядка (к) (А) и произведения

предельного кажущегося оптического поглощения при 1—«» на константу скорости 1-ого

порядка (А|1т'к) (Б) от концентрации М1Р (мкг/мл) в случае тепловой агрегации МВД (26

мкг/мл) при 40,5°С.

При увеличении концентрации МП7 значения к и Аьт'к уменьшаются (Рис. 8).

Исследование изменения биологической активности субстратов в процессе агрегации. Были проведены эксперименты по исследованию падения биологической активности белковых субстратов в процессе агрегации и после снятия денатурирующего воздействия в отсутствие и в присутствии МП7.

У/У„ У/У,

Рис. 9. Кинетика тепловой инактивации МЛН (26 мкг/мл) при 39°С в отсутствие (А) и в присутствии МП7 в концентрации 50 мкг/мл (Б) (сплошная кривая). Восстановление активности фермента при 25°С показано пунктирными линиями при тепловой инактивации в течение 5,10 и 30 минут (кривые 1, 2 и 3 соответственно). По оси абсцисс - время инкубации. По оси ординат - относительная скорость ферментативной реакции (УЛ/0); У0 - значение V в отсутствие МП7.

Было показано, что при инкубации МОЯ (26 мкг/мл) в течение 5-30 минут активность этого субстратного белка в отсутствие МШ (Рис. 9 А) падает в большей степени, чем в его присутствии (Рис. 9 Б). После снятия теплового стресса активность МОИ восстанавливается в незначительной степени, а в присутствии МП7 реактивация фермента в некоторых случаях достигает 100%. Аналогичные результаты были получены и для РЬ Ь при 42°С и 44°С (данные не показаны).

Таким образом, все исследованные характеристики агрегации подтверждают шапероноподобные свойства МП7. Показана его способность не

только тормозить агрегацию модельных белковых субстратов, но и восстанавливать их ферментативную активность.

Усиление агрегации белков в присутствии М1Г. Исследовали агрегацию АОН и РЬ Ъ при температурах 44°С и 48°С в отсутствие и в присутствии МП7 в различных концентрациях (Рис. 10).

Рис. 10. Кинетические кривые агрегации АОН (70 мкг/мл) в отсутствие (1) или в присутствии МП7 в концентрациях 3,3 (2); 4,7 (3) и 10,8 (4) мкг/мл, зарегистрированные по увеличению оптического поглощения при 360 нм при 44°С в 20 мМ Тш-НС1 буфере, рН 7,0 (А). Кинетические кривые агрегации РЬ Ь (130 мкг/мл) в отсутствие (1) или в присутствии МП1 в концентрациях 10,8 (2), 28,8 (3) и 46,8 (4) мкг/мл при 48°С в 80 мМ Нереэ буфере, рН 6,8, содержащем 0,2 мМ ЭДТА (Б).

Показано значительное ускорение агрегации субстратов и увеличение предельного значения кажущегося поглощения при 360 нм при I—»со (А]1т) при субстехиометрических молярных соотношениях МП7 : АОН (0,15 : 1) (кривая 2) и (0,2 : 1) (кривая 3). При соотношении (0,5 : 1) величина А11т возрастает более, чем в 4 раза (кривая 4) (Рис. 10 А).

При этом по мере увеличения концентрации МП7 наблюдается сокращение лаг-периода процесса агрегации, продолжительность которого в отсутствие МП7 составляет около 4,5 минуты (кривая 1) (Рис. 10 А).

При субстехиометрических соотношениях МП7: РЬ Ъ (0,3 : 1) (кривая 2) и (0,8 : 1) (кривая 3) наблюдается значительный активирующий эффект МП7, а

при увеличении концентрации МШ до уровня соотношения МП7: РЬ Ь (1,5 : 1) (кривая 4) величина А^ возрастает в 3,5 раза (Рис. 10 Б).

Полученные результаты отличаются высокой воспроизводимостью в большом числе экспериментов (для АЭН п=9; для РЬ Ь п =7). Важно также отметить, что в отсутствие белковых субстратов МП7 не агрегирует даже при концентрациях, на порядок превышающих те, которые были использованы в указанных экспериментах, а также при инкубации при температуре 60°С в течение 240 мин.

Кроме того, характер кинетики агрегации АОН, проведенной в отсутствие и в присутствии 20 мМ (3-МЕ (Рис. 11), и результат влияния на данный процесс МП7 принципиально не отличались. В этой связи можно полагать, что действие МИ7 на агрегацию субстрата не опосредовано образованием Б-Б-связей.

ААзво

Рис. 11. Кинетические кривые агрегации АБН (70 мкг/мл) в отсутствие (1) или в присутствии МП7 в концентрациях 3,3 (2), 4,7 (3) и 10,8 (4) мкг/мл при 44°С в 20 мМ Тпз-НС1 буффе, рН 7,0, содержащем 20 мМ Р-МЕ.

2 4 6 8 10 12 14 16 18 Время, мин

Для первичного анализа состояния агрегатов после окончания процесса агрегации пробы центрифугировали, осадки солюбилизировали в 20 мМ Тш-НО буфере, рН 7,0, содержащем 4 М мочевину (см. материалы и методы), и подвергали электрофорезу в денатурирующих условиях (Рис. 12).

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 12. Электрофорез в 12% ПААГ в присутствии 0.ч-№ солюбилизированных агрегатов РЪ Ь и АОН после окончания процесса агрегации Дорожки 1 и 4 -исходные препараты РЬ Ь и АОН соответственно Осадки, полученные в результате центрифугирования при 10 ООО g суспензий РЬ Ь (130 мкг/мл) после инкубации при 48°С в течение 25 минут в 80 мМ Нерев буфере, рН 6,8, содержащем

0,2 мМ ЭДТА, в отсутствие (дорожка 2), или в присутствии 46.8 мкг/мл MIF (дорожка 3) Осадки суспензий ADH (70 мкг/мл) после инкубации при 44°С в течение 40 мин в 20 мМ Tns-HCl буфере, рН 7,0. в отсутствие (дорожка 5), или в присутствии 10,8 мкг/мл MIF (дорожка 6) Маркеры молекулярных масс (дорожка 7)

Анализ электрофореграммы показывает, что содержание в осадке Ph Ь (мономер, кажущаяся молекулярная масса 97 кДа) в присутствии MIF существенно возрастает (дорожка 3) по сравнению с пробой, не содержащей MIF (дорожка 2) То же наблюдается при инкубации ADH при 44°С в присутствии MIF (дорожка 6) Важным результатом проведенных экспериментов является обнаружение гетероагрегатов, содержащих как субстратный белок, так и MIF (мономер, 12 кДа) (дорожки 3 и 6)

Результаты электрофореза в ПААГ при неденатурирующих условиях супернатантов проб (10 000 g, 20 мин) после окончания процесса агрегации Ph Ъ и ADH коррелируют с результатами электрофореза в присутствии Ds-Na, приведенными на Рис 12 В супернатанте проб, инкубированных при повышенных температурах в присутствии MIF, содержание Ph b, или ADH значительно меньше по сравнению с аналогичными пробами, не содержащими MIF, в которых процесс агрегации субстратных белков происходил менее интенсивно (рисунок не приведен).

Полученные данные демонстрируют значительное ускорение агрегации модельных белковых субстратов и увеличение предельного значения кажущегося поглощения при 360 нм в присутствии MIF

Для выявления влияния МП7 на процесс агрегации белков при температурах, близких к физиологичекому уровню, была проведена серия экспериментов по исследованию кинетики агрегации белков при 41,5°С в отсутствие или в присутствии МП7. На примере агрегации АОН (Рис. 13) было также продемонстрировано ускорение агрегации в присутствии МП7 при субстехиометрическом молярном соотношении МП?: АОН (0,6 :1).

ДА«о

Ф ^Рис. 13. Кинетические кривые агрегации АОН

(130 мкг/мл) в отсутствие (1) или в О обприсутствии М1Р в концентрации 24 мкг/мл (2)

при 41,5°С в 20 мМ Тга-НС! буфере, рН 7,0.

0,04

0,02 0,00

В данном эксперименте, характеризующемся более мягкими денатурирующими условиями, агрегаты в осадках оказались легко растворимыми в Тпв-НСЛ буфере, не содержащем мочевины.

Анализ нативного электрофореза в ГТААГ проб АОН, инкубированных при 41,5°С в отсутствие или в присутствии МП7 в течение 20 минут (Рис. 14), показал, что супернатант содержит димер и тетрамер АОН (кажущиеся молекулярные массы 80 и 160 кДа соответственно), причем в присутствии МП7 (дорожка 3) содержание этих олигомеров меньше, чем в его отсутствие (дорожка 1).

В растворенном осадке в отсутствие МП7 наблюдаются слабо выраженное пятно, соответствующее тетрамеру АОН, и высокомолекулярные олигомеры, едва проникающие в гель (дорожка 2). В присутствии МП7 (дорожка 4) в осадке обнаруживаются довольно яркие полосы, которые могут соответствовать димеру и тетрамеру АОН, а также высокомолекулярные олигомеры и полоса

М1Р (кажущаяся молекулярная масса 12 кДа), что свидетельствует об образовании гетероолигомеров, содержащих как АОН, так и М№.

2 3

V Ш

— Рис. 14. Электрофорез в неденатурирующих условиях

' —134 проб после окончания процесса агрегации АОН Супернатанты, полученные в результате центрифугирования при 10 000 £ в течение 20 минут • -67 суспензий АОН после инкубации при 41,5°С в 20 мМ Тп5-НС1 буфере, рН 7,0, в отсутствие (дорожка 1), или в присутствии 24 мкг/мл МШ (дорожка 3), осадки тех же проб в отсутствие (дорожка 2), или в присутствии 24 29 мкг/мл М1Р (дорожка 4); маркеры молекулярных масс (дорожка 5).

- 90

• -45

В этом случае высокомолекулярные олигомеры располагаются в области более низких молекулярных масс (дорожка 4) по сравнению с пробой, не содержащей МП7 (дорожка 2).

На основании анализа результатов последнего эксперимента можно сделать важный вывод о том, что при тепловом стрессе в диапазоне температур, близких к физиологическим, несмотря на ускорение агрегации субстратных белков в присутствии МШ, образующиеся агрегаты оказываются легко растворимыми. Это может означать, что после снятия денатурирующего воздействия повышается вероятность ренатурации белка к нативному состоянию. В этом смысле в начале развития процесса агрегации МП7 обратимо связывается с частично денатурированным белком, стабилизируя его структуру

т' г?т><пм-тт/л кониен^^рует 4 ятт^гмионяич^лд гп^то^титтт* Отттт^кО. В

конечном итоге, в случае снятия теплового стресса и возврата системы к нормальному состоянию, М1Г може! шра1ь шаперомшюдионую роль.

Была исследована активность АОН в супернатантах и осадках, солюбилизированных в 20 мМ Тпб-НО буфере, рН 6,8, а также определено

19

содержание белка в этих фракциях. Падение активности АИН в супернатантах после агрегации коррелировало со снижением в них содержания белка.

Анализ кинетических кривых показал высокую степень кооперативности процесса агрегации лабильных белковых субстратов в присутствии МП7. Особенно ярко это проявляется при агрегации АОН при температуре, близкой к физиологическому уровню (Рис. 13). Сигмоидная кривая агрегации в сравнительно коротком промежутке времени (около 15 минут) демонстрирует возрастание величины А]1т в -10 раз под действием МП7 в субстехиометрическом диапазоне концентраций.

Некоторые известные шапероны, в частности

протеиндисульфидизомераза и триггер-фактор (пептидил-пролил-цис-транс изомераза), являющиеся катализаторами фолдинга, а также Н8Р47 при определенных условиях ускоряют агрегацию субстратных белков.

Для решения вопроса о том, как МП7 может функционировать в многокомпонентной шаперонной сети совместно с другими шаперонами требуются дальнейшие исследования.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый оригинальный метод выделения фактора ингибирования миграции макрофагов из мозга быка, основанный, главным образом, на эксюпозионной хроматографии на полимере ТЯК Тоуореаг] Н\У-55.

2. Показано, что фактор ингибирования миграции макрофагов представляет собой смесь гомоолигомерных форм с кажущимися молекулярными массами 12, 48, 60,120,168 и 480 кДа.

3. Обнаружено, что фактор ингибирования миграции макрофагов обладает шапероноподобными свойствами, проявляющимися в способности тормозить тепловую агрегацию модельных белковых субстратов (гликогенфосфорилазы Ь из скелетных мышц кролика и

малатдегидрогеназы из сердца свиньи) в диапазоне температур 40-42°С и различных концентрациях белков.

4. Продемонстрировано защитное действие фактора ингибирования миграции макрофагов в процессе термоинактивации частично денатурированных малатдегидрогеназы и гликогенфосфорилазы Ь, проявляющееся как в торможении падения ферментативной активности при тепловом воздействии, так и в ускорении реактивации ферментов после снятия теплового стресса.

5. Показано образование гетероагрегатов, содержащих белковый субстрат и фактор ингибирования миграции макрофагов. Фактор ингибирования миграции макрофагов проявляет шаперонную активность в форме мономера.

6. На примерах агрегации гликогенфосфорилазы Ъ при 48°С и алкогольдегидрогеназы в диапазоне температур 40-44°С обнаружено значительное ускорение агрегации белков в присутствии фактора ингибирования миграции макрофагов. При температурах, близких к физиологическому уровню, наблюдается стабилизация олигомерной структуры субстрата, торможение роста агрегатов и повышение их растворимости, что может способствовать ренатурации белка к нативному состоянию после снятия денатурирующего воздействия.

7. Выявленные свойства стресс-индуцируемого белка, фактора ингибирования миграции макрофагов, могут свидетельствовать о его защитной роли в условиях теплового стресса.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. Статьи

1. Cherepkova О.А.. Gurvits B.Ya. (2004) Macrophage migration inhibitory factor (MIF): identification of the 30 kDa MIF-related protein in bovine brain. Neurochem. Research. V. 29. No. 7. P. 1391-1396.

2. Cherepkova O.A.. Lyutova E.M., Gurvits B.Ya. (2005) Charge Heterogeneity of Bovine Brain Macrophage Migration Inhibitory Factor. Neurochem. Research. V. 30. No. 1. P. 151-158.

3. Черепкова O.A.. Лютова E.M., Гурвиц Б .Я. (2006) Фактор ингибирования миграции макрофагов; выделение из мозга быка. Биохимия. Т. 71. № 1. С. 90-96.

4. Cherepkova О.А.. Lyutova Е.М., Eronina Т.В., Gurvits B.Ya. (2006) Chaperone-like activity of macrophage migration inhibitory factor. Intern. J. Biochem. Cell Biol. V. 38. No. 1. P. 43-55.

5. Черепкова O.A.. Лютова E.M., Еронина Т.Б., Гурвиц Б.Я. (2006) Ускорение агрегации белков в условиях теплового стресса под влиянием фактора ингибирования миграции макрофагов. Биохимия. Т. 71. № 2 . С. 182-189.

Тезисы.

1. Черепкова О.А.. Гурвиц Б.Я. (2003) Выделение и изучение свойств термостабильного белка мозга - фактора ингибирования миграции макрофагов. 7-ая Пущинская школа - конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". Тез. докл. С. 389.

2. Gurvits B.Ya., Cherepkova О.А.. Klesov R.V. (2003) The brain pool of immunologically active heat-stable proteins in relation to adaptation to heat-shock and other kinds of stress. J. Neurochem. V. 87. Suppl. 1. P. 152. PI 5-03.

3. Gurvits B.Ya., Cherepkova O.A.. Eronina T.B. (2003) Chaperone-like activity of macrophage migration inhibitory factor from bovine brain. J. Neurochem. V. 88. Suppl. 1. P. 60. P23-4.

4. Черепкова O.A.. Еронина Т.Б., Чеботарева H.A., Гурвиц Б.Я. (2004) Термостабильный белок мозга (фактор ингибирования миграции макрофагов) в роли шаперона. III съезд биофизиков. Тез. докл. С. 122-123. 1.106.

5. Черепкова О.А. Лютова Е.М., Еронина Т.Б., Гурвиц Б.Я. (2005) Иммунологически активный белок - фактор ингибирования миграции макрофагов; шаперонная и антишалеронная активности. Международный симпозиум "Молекулярные механизмы регуляции функции клетки". Сборник тезисов. Тюмень. С. 5.

6. Gurvits B.Ya., Cherepkova О.А.. Lyutova E.M., Eronina T.B. (2005) The macrophage migration inhibitory factor exhibits chaperone and anti-chaperone activities. FEBS J. V. 272. Suppl. 1. P. 353.

к исполнению 16/03/2006 Исполнено 17/03/2006

Заказ № 161 Тираж 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www autoreferat ru

aoogft У

S23G

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Черепкова, Оксана Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цели и задачи исследования.

Научная новизна и практическая ценность работы.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. Молекулярные шапероны.

• Семейство ШрбО.

Семейство ШрТО.

Семейство Шр90.

Семейство НзрЮО.

Малые белки теплового шока.

Специализированные шапероны.

Роль белков теплового шока в функционировании живых систем в норме и патологии.

Шапероноподобные белки.

Кальнексин и кальретикулин.

Протендисулъфидизомераза.

Пеп т ид ил -проя ил-ц ис-транс- изомер аз а, триггер фактор.

Антитела как специфические шапероны.

Ускорение агрегации белков.

2. Фактор ингибирования миграции макрофагов.

М№ и глюкокортикоиды.

Структура МН?.

Механизм таутомеразной активности МИ?.

Таутомеразные ингибиторы.

Рецептор МИ?.

М1Р-связывающие белки.

МШ-подобные белки.

Клеточные и тканевые источники МИ?.

Передняя доля гипофиза.

Моноциты/макрофаги.

Т-клетки.

Участие МШ в патогенезе некоторых заболеваний.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы.

Получение экстракта мозга быка.

Гель-фильтрация.

Ч-концевое микросеквенирование.

Кето-енол таутомеразная активностьМИ?.

Электрофорез и иммуноблоттинг.

Обратно-фазовая НРЬС.

Эксклюзионная хроматография в системе ЕРЬС.

Выделение гликогенфосфорилазы Ь из скелетных мышц кролика.

Определение ферментативной активности РЬ Ь и МБИ.

Анализ шапероноподобной активности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Выделение МШ из мозга быка.

Свойства МШ.

Шапероноподобная активность МИ?.

Влияние М1Р на агрегацию модельных белковых субстратов.

Анализ кинетических кривых агрегации.

Предполагаемый механизм действия МШ.

Исследование изменения ферментативной активности субстратов в процессе агрегации.

Усиление агрегации белков в присутствии МП?.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Шапероноподобная активность фактора ингибирования миграции макрофагов"

Актуальность проблемы. Молекулярные шапероны обладают способностью защищать белки, утратившие нативную конформацию при стрессорных воздействиях различного характера. Эта способность проявляется при взаимодействии шаперонов с гидрофобными участками развернутых или неправильно свернутых белков, что препятствует связыванию этих белков между собой и последующей агрегации и приводит, в конечном итоге, к сохранению их нативного состояния.

При температурах, превышающих физиологический уровень, в клетках наблюдается активация синтеза молекулярных шаперонов, известных как белки теплового шока (heat shock proteins, Hsp). Некоторые из них (Hsp70, GroEL) способствуют рефолдингу белков, подвергнутых тепловому повреждению, к нативному состоянию, в то время как другие (а-кристаллин, малые Hsp) только тормозят агрегацию белков и стабилизируют их структуру. Белковые агрегаты могут подвергаться солюбилизации и рефолдингу с образованием биологически активной конформации под действием системы шаперонов, входящих в состав мультишаперонной сети. В эту сеть часто вовлекаются ферменты фолдинга (пептидил-пролил-цис-транс изомераза (peptidyl-prolyl-c/V/r<ms-isomerase, PPI) и протеиндисульфидизомераза (protein disulfideisomerase, PDI)), различные шапероноподобные белки и пептиды [Puig et al., 1997; Sharma et al., 2000; Manna et al., 2001; Bhattacharyya et al., 2003].

В связи с многообразием и широким спектром действия шаперонов в различных компартментах клетки интерес к ним не ослабевает и список вновь открываемых шапероноподобных белков неуклонно растет. Однако, несмотря на огромное число экспериментов, направленных на изучение защитной роли шаперонов при денатурации и агрегации белков в условиях стресса, молекулярные механизмы действия шаперонов остаются невыясненными.

Все известные в настоящее время шапероны обладают общими свойствами: они имеют гидрофобные домены, экспонированные на поверхности их молекулярных структур, способные узнавать и связывать определенные интермедиаты фолдинга белковых субстратов. Однако структурно-функциональные особенности, необходимые для характеристики белка как шаперона, не вполне ясны.

В этой связи большой интерес вызывает исследование шапероноподобных свойств термостабильных гидрофобных белков, проявляющих способность к образованию амфипатической вторичной структуры. Одним из таких белков является фактор ингибирования миграции макрофагов (macrophage migration inhibitory factor, MIF), принадлежащий к семейству цитокинов.

Около 40 лет назад MIF был идентифицирован как фактор, продуцируемый активированными Т-лимфоцитами, по его способности тормозить миграцию макрофагов in vitro [Bloom, Bennet, 1966]. В последующие годы было показано, что низкомолекулярный высококонсервативный белок MIF (12,5 кДа) широко распространен в биологических объектах разной степени сложности (от бактерий до млекопитающих), его наибольшее количество обнаружено в макрофагах и в различных отделах мозга. Далее M1F был вновь "открыт" как медиатор системного ответа организма на стресс [Bucala, 1996; Donn, Ray, 2004], однако, его участие в биохимических механизмах формирования защитных реакций организма при тепловом шоке ранее не исследовалось, хотя структурно-функциональные характеристики MIF аналогичны многим шапероноподобным белкам.

Цели и задачи исследовании. Целью настоящей работы является изучение шапероноподобных свойств M1F в тест-системе in vitro, основанной на исследовании кинетики тепловой агрегации модельных белковых субстратов. В соответствии с этой целыо были поставлены следующие задачи:

1. Выделить МШ из мозга быка в гомогенном состоянии и изучить его физико-химические и ферментативные свойства.

2. Исследовать влияние МИ7 на кинетику тепловой агрегации белковых субстратов - малатдегидрогеназы (МОН) из сердца свиньи, гликогенфосфорилазы Ъ (РЬ Ъ) из скелетных мышц кролика и дрожжевой алкогольдегидрогеназы (АБН) при различных температурах (41-48°С) и концентрациях белков.

3. Исследовать возможность реактивации частично денатурированных белковых субстратов под влиянием МП7.

4. Проанализировать изменения олигомерного состояния белковых субстратов и МШ при тепловом воздействии.

Научная новизна и практическая ценность работы. Наряду с традиционными представлениями о защите клеток от теплового повреждения с помощью системы, включающей шапероны и ферменты фолдинга, рассмотрена возможность существования пути регуляции, опосредуемого биологическими эффектами низкомолекулярных термостабильных гидрофобных белков, имеющих амфипатическую вторичную структуру.

Показано, что МШ, выделенный из мозга быка с использованием нового оригинального метода, обладает шапероноподобными свойствами. Это подтверждается следующими экспериментальными результатами:

• при исследовании кинетики термоагрегации МОН и РЬ А турбидиметрическим методом продемонстрировано торможение агрегации белковых субстратов под действием М1Р;

• обнаружено защитное действие МШ в процессе термоинактивации частично денатурированных МОН и РЬ Ь;

• показано, что в зависимости от экспериментальных условий МШ может, как тормозить, так и ускорять агрегацию белков. При температуре, близкой к физиологическому уровню (41,5°С), наблюдается образование легко растворимых агрегатов и стабилизация олигомерной структуры субстрата, что может способствовать ренатурации белка к нативному состоянию после снятия денатурирующего воздействия. Таким образом, в этих условиях МП7 может играть шапероноподобную роль; • анализ состояния агрегатов с помощью электрофореза в ПААГ в неденатурирующих условиях показывает, что защитное действие МШ проявляется в торможении роста агрегатов субстратного белка. Полученные данные позволяют существенно расширить представления о шапероноподобных белках, а также о механизмах регуляции их шаперонной активности. Наличие в молекуле шаперона гидрофильных сайтов способствует лучшему растворению гетероагрегатов, образующихся при тепловом стрессе.

Большой интерес к изучению механизмов действия молекулярных шаперонов вызван не только проблемами, связанными с процессами агрегации при получении рекомбинантных белков, но и с необходимостью разработки эффективных средств защиты клеток в условиях развития патологических состояний в результате нарушения конформации белков. Это направление исследований представляется также весьма перспективным в выявлении защитных реакций организма при температурах среды, близких к физиологически допустимому уровню (41-43°С), что может иметь большое значение в биологии и медицине.

Обладая выраженной стабильностью и способностью к образованию амфифильной вторичной структуры, стресс-индуцируемый белок, МП7, в сочетании с другими белками с аналогичными свойствами может войти в семейство конститутивно экспрессируемых "малых шаперонов", участвующих в адаптации организма к стрессу, на начальных этапах его развития.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Черепкова, Оксана Анатольевна

выводы

1. Разработан новый оригинальный метод выделения фактора ингибирования миграции макрофагов из мозга быка, основанный, главным образом, на эксклюзионной хроматографии на полимере ТБК Тоуореаг1 Н\У-55.

2. Показано, что фактор ингибирования миграции макрофагов представляет собой смесь гомоолигомерных форм с кажущимися молекулярными массами 12, 48, 60, 120, 168 и 480 кДа.

3. Обнаружено, что фактор ингибирования миграции макрофагов обладает шапероноподобными свойствами, проявляющимися в способности тормозить тепловую агрегацию модельных белковых субстратов (гликогенфосфорилазы Ь из скелетных мышц кролика и малатдегидрогеназы из сердца свиньи) в диапазоне температур 40-42°С и различных концентрациях белков.

4. Продемонстрировано защитное действие фактора ингибирования миграции макрофагов в процессе термоинактивации частично денатурированных малатдегидрогеназы и гликогенфосфорилазы Ъ, проявляющееся как в торможении падения ферментативной активности при тепловом воздействии, так и в ускорении реактивации ферментов после снятия теплового стресса.

5. Показано образование гетероагрегатов, содержащих белковый субстрат и фактор ингибирования миграции макрофагов. Фактор ингибирования миграции макрофагов проявляет шаперонную активность в форме мономера.

6. На примерах агрегации гликогенфосфорилазы Ь при 48°С и алкогольдегидрогеназы в диапазоне температур 40—44°С обнаружено значительное ускорение агрегации белков в присутствии фактора ингибирования миграции макрофагов. При температурах, близких к физиологическому уровню, наблюдается стабилизация олигомерной структуры субстрата, торможение роста агрегатов и повышение их растворимости, что может способствовать ренатурации белка к нативному состоянию после снятия денатурирующего воздействия. Выявленные свойства стресс-индуцируемого белка, фактора ингибирования миграции макрофагов, могут свидетельствовать о его защитной роли в условиях теплового стресса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черепкова, Оксана Анатольевна, Москва

1. Alberto J.L. Macario, M.D., Conway de Macario E. (2005) Sick Chaperones, Cellular Stress, and Disease. N. Engl. J. Med. 353. P. 1489-501.

2. Altboum I., Pick E. (1979) Antigen and mitogen induced production of macrophage migration inhibitory factor in the mouse. Int. Arch. Allergy. Appl. Immunol. 60. P. 29-43.

3. Anfinsen C. B. (1973) Principles that govern the folding of protein chains. Science. 181. P. 223-230.

4. Augusteyn R. C. (2004) a-crystallin: a review of its structure and function. Clin. Exp. Ophtalm. 87 (6). P. 356-366.

5. Bacher M., Metz C.N., Calandra T., Mayer K., Chesney J., Lohoff M., Gemsa D., Donnelly T., Bucala R. (1996) An essential regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in T-cell activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93. P. 7849-7854.

6. Barber A.E., Coyle S.M., Lowry S.F. (1996) Hypercortisolemia increases plasma interleukin-10 concentrations during human endotoxemia a clinical research center study. J. Clin. Endocrinol Metab. 81. P. 3604-3606.

7. Bardwell J.C., Craig E.A. (1984) Major heat shock gene of Drosophila and the Escherichia coli heat-inducible dnaK gene are homologous.

8. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81(3). P. 848-852.

9. Baugh J.A., Donnely S.C. (2003) Macrophage migration inhibitory factor: a neuro endocrine modulator of chronicinflammation. J. Endocrinol. 179(1). P. 15-23.

10. Baumann R., Casaulta C., Simon D., Conus S., Yousefi S., Simon H.U. (2003) Macrophage migration inhibitory factor delays apoptosis in neutrophils by inhibiting the mitochondria-dependent death pathway.

11. FASEBJ. 17(15). P. 2221-2230.

12. Bendrat K., AI-Abed Y., Callaway D.J., Peng T., Calandra T., Metz C.N., Bucala R. (1997) Biochemical and mutational investigations of the enzymatic activity of macrophage migration inhibitory factor. Biochemistry. 36. P. 15356-15361.

13. Bernhagen P. J., Calandra T., Mitchell R.A., Martin S.B., Tracey K.T., Voelter W., Manogue K.R., Cerami A., Bucala R. (1993) MIF is a pituitary-derived cytokine that potentiates lethal endotoxaemia. Nature. 365. P. 756-762.

14. Bernhagen J., Mitchell R.A., Calandra T., Voelter W., Cerami A., Bucala R. (1994) Purification, bioactivity, and secondary structure analysis of mouse and human macrophage migration inhibitory factor (MIF). Biochemistry. 22, P. 144-148.

15. Bernhagen J., Calandra T., Cerami A., Bucala R. (1994) Macrophage migration inhibitory factor is a neuroendocrine mediator of endotoxaemia. Trends Microbiol. 2. P. 198-201.

16. Bernhagen J., Kapurniotu A., Stoeva S., Voelter W. and Bucala R. (1995) in Peptides 1994, ed. Maia, H. L. S. (ESCOM, Leiden), P. 572-573.

17. Bertini R., Bianchi M., Ghezzi P. (1988) Adrenalectomy sensitizes mice to the lethal effects of interleukin 1 and tumor necrosis factor. J. Exp Med. 167. P. 1708-1713.

18. Blond-Elguindi, S., Cwirla S. E., Dower W. J., Lipshutz R. J., Sprang S. R., Sambrook J. F., Gething M. J. (1993) Affinity panning of a library of peptides displayed on bacteriophages reveals the binding specificity of BiP. Cell. 75. P. 717-728.

19. Bloom B.R., Bennett B. (1966) Mechanism of a reaction in vitro associated with delayed-type hypersensitivity. Science. 153. P. 8085.

20. Bole D.G., Hendershot L.M., Kearney J.F. (1986) Posttranslational association of immunoglobulin heavy chain binding protein with nascent heavy chains in nonsecreting and secreting hybridomas. J. Cell Biol. 102 (5). P. 1558-1566.

21. Bose S., Weikl T., Bugl H., Buchner J. (1996) Chaperone function of Hsp90-associated proteins. Science. 21 A. P. 1715-1717.

22. Boston, R. S., Viitanen P. V., Vierling E. (1996) Molecular chaperones and protein folding in plants. Plant Mol. Biol 32. P. 191-222.

23. Bozza M., Kolakowski L.F., Jenkins N.A., Gilbert D.J., Copeland N.G., David J.R., Gerard C. (1995) Structural characterization and chromosomal location of the mouse macrophage migration inhibitory factor gene and pseudogenes. Genomics. 27. P. 412-419.

24. Bradford M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilising the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochemistry. 72. P. 248254.

25. Bruce B. D., Churchich J. (1997) Characterization of the molecular-chaperone function of the heat-shock-cognate-70-interacting protein. Eur. J. Biochem. 245. P. 738-744.

26. Bucala R. (1996) MIF rediscovered: cytokine, pituitary hormone, and glucocorticoid-induced regulator of the immune response. FASEBJ. 10(14). P. 1607-1613.

27. Bukau B., Horwich A.L. (1998) The Hsp70 and Hsp60 Chaperone Machines. Cell. 92. P. 351-366.

28. Calandra T., Bernhagen J., Metz C.N., Spiegel L.A., Bacher M., Donnelly T., Cerami A., Bucala R. (1995) MIF as a glucocorticoid-induced modulator of cytokine production. Nature. 377. P. 68-71.

29. Calandra T., Bernhagen J., Mitchell R., Bucala, R. (1994) The macrophage is an important and previously unrecognized source of macrophage migration inhibitory factor. J. Exp. Med. 179(6). P. 18951902.

30. Calandra T., Roger T. (2003) Macrophage migration inhibitory factor: a regulator of innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 3. P. 791800.

31. Chrousos G.P. (1995) The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New Engl. J. Mod., 332. P. 13511358.

32. Conroy S.E., Sasieni P.D., Amin V., Wang D.Y., Smith P., Fentiman I.S., Latchman D.S. (1998) Antibodies to heat-shock protein 27 are associated with improved survival in patients with breast cancer. Br J Cancer. 77(11). P. 1875-1879.

33. Cunha F.Q., Weiser W.Y., David J.R., Moss D.W., Moncada S., Liew F.Y. (1993) Recombinant migration inhibitory factor induces nitric oxide synthase in murine macrophages. J. Immunol. 150. P. 1908-12.

34. Ding L., Candido E. P. (2000) HSP25, a small heat shock protein associated with dense bodies and M- lines of body wall muscle in Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 275. P. 9510-9517.

35. Donn R.P. and Ray D.W. (2004) Macrophage migration inhibitory factor: molecular, cellular and genetic aspects of a key neuroendocrine molecule. J. Endocrinol. 182(1). P. 1-9.

36. Donnelly S.C. and Bucala, R. (1997) Macrophage migration inhibitory factor: a regulator of glucocorticoid activity with a critical role in inflammatory disease. Mol. Med. Today. 3(11). P. 502-507.

37. Ehrnsperger M., Graber S., Gaestel M., Buchner J. (1997) Binding of non-native protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. EMBOJ. 16. P. 221-229.

38. Ellis R. J. (1990) The molecular chaperone concept. Semin. Cell Biol. LP. 1-9.

39. Ermolenko D.N., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Popov V.O. (2002) Antiperoxidase antibodies enhance refolding of horseradish peroxidase.

40. Biochem Biophys Res Commun. 291(4). P. 959-965.

41. Fantuzzi G., Di Santo E., Sacco S., Benigni F., Ghezzi P. (1995) Role of the hypothalamus-pituitary-adrenal axis in the regulation of TNF production in mice. Effect of stress and inhibition of endogenous glucocorticoids. J. Immunol. 155. P. 3552-3357.

42. Feinstein R.N., Jaroslow B.N., Howard J.B., Faulhaber J.T. (1971) Stabilization of mutant catalase by complex formation with antibody to normal catalase. J. Immunol. 106(5). P. 1316-1322.

43. Ferrero A.P., Diaz A., Jimenez S.A. (1991) Regulation of transforming growth factor-beta 1 gene expression by glucocorticoids in normal human T lymphocytes. J. Clin. Invest. 88. P. 1574-1580.

44. Fingerle-Rowson G., Koch P., Bikoff R., Lin X., Metz Ch.N., Dhabhar F.S., Meinhardt A. and Bucala R. (2003) Regulation of Macrophage Migration Inhibitory Factor Expression by Glucocorticoids in vivo. Amer. J. Pathol. 162(1). P. 47-56.

45. Fink A. L. (1998) The Hsp 70 reaction cycle and its role in protein folding. In: Molecular Chaperones in the Life Cycle of Proteins, edited by A. L. Fink and Y. Goto New York: Dekker,, p. 123-150.

46. Fink A.L. (1999) Chaperone-Mediated Protein Folding. Phys. Rev. 79 (2). P. 746-760.

47. Flaherty K. M., Deluca-Flaherty C. and Mckey D. B. (1990) Three-dimensional structure of the ATPase fragment of a 70K heat-shock protein. Nature. 346. P. 623-628.

48. Flynn G. C., Ponl J., Flocco M. T. and Rothman J. E. (1991) Peptide-binding specificity of the molecular chaperone BiP. Nature. 353. P. 726-730.

49. Frantz A.G. and Wilson J.D. (1992) In: Wilson J.D., Foster D.W. eds. Williams Textbook of Endocrinology. 8th Edition, Saunders, Philadelphia. P. 953.

50. Gallin J.I., Goldstein I.M., Snyderman R. (1992) Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates 2nd ed. Raven, New York. P. 117.

51. Gething M.J., Sambrook J. (1992) Protein folding in the cell. Nature. 355(6355). P. 33-45.

52. Glover J. R., Schirmer E. C., Singer M. A., and Lindquist S. L. (1998) Hsp 104. In: Molecular Chaperones in the Life Cycle of Proteins, ed. A. L. Fink and Y. Goto. New York: Dekker. P. 193— 224.

53. Goldstein I.M., Dowen D.L., Fauci A.S. (1992) In: Gallin J.I., Goldstein I.M., Snyderman R. eds. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates 2nd ed. Raven. New York. P. 1061.

54. Goloubinoff P., Christeller J.T., Gatenby A.A., Lorimer G.H. ( 1989) Reconstitution of active dimeric ribulose bisphosphate carboxylase from an unfoleded state depends on two chaperonin proteins and Mg-ATP. Nature. 342(6252). P. 884-889.

55. Hamilton J.A., Filonzi E.L., Ianches G. (1993) Regulation of macrophage colony- stimulating factor (M-CSF) production in cultured human synovial fibroblasts. Growth Factors. 9. P. 157-165.

56. Hartl, F. U. (1996) Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature 381: 571-579.

57. Hightower, L. E., and S.-M. Leung. (1998) Substrate-binding specificity of the Hsp70 family. In: Molecular Chaperones in the Life Cycle of Proteins, ed. A. L. Fink and Y. Goto. New York: Dekker. P. 151-168.

58. Hogger P., Dreier J., Droste A., Buck F., Sorg C. (1998)1.entification of the integral membrane protein RM3/1 on human monocytes as a glucocorticoid-inducible member of the scavenger receptor cysteinerich family (CD163). J. Immunol. 161. P. 18831890.

59. Hohfeld J., and Jentsch S. (1997) GrpE-like regulation of the Hsc70 chaperone by the anti-apoptotic protein BAG-1. EMBO J. 16. P. 6209- 6216.

60. Hohfeld J., Minami Y., and Hartl F. U. (1995) Hip, a novel cochaperone involved in the eukaryotic Hsc70/Hsp40 reaction cycle. Cell. 83. P. 589-598.

61. Huang G.C., Li Z.Y., Zhou, J.M. (2000) Conformational specificity of trigger factor for the folding intermediates of alphalactalbumin. Biochim. Biophys. Acta. 1480. P. 77-82.

62. Huang G.C., Li Z.Y., Zhou J.M., Fischer G. (2000) Assisted folding of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by trigger factor. Protein Sci. 9. P. 1254-1261.

63. Hudson J.D., Shoaibi M.A., Maestro R., Carnero A., Hannon G.J. and Beach D.H. (1999) A proinflammatory cytokine inhibits p53 tumor suppressor activity. J. Exp. Med. 190(10). P. 1375-1382.

64. Huot, J., Roy, G., Lambert, H., Chretien, P., Landry, J. (1991) Increased survival after treatments with anticancer agents of Chinese hamster cells expressing the human Mr 27,000 heat shock protein, Cancer Res. 51. P. 5245-5252.

65. Ibitayo, A. I., Sladick, J., Tuteja, S., Louis-Jacques, O., Yamada, H., Groblewski, G., Welsh, M., Bitar, K. N. (1999) HSP27 in signal transduction and association with contractile proteins in smooth muscle cells, Am. J. Physiol. 277. P. 445-454.

66. Iwaki T, Kume-Iwaki A, Liem RK, Goldman JE. (1989) Alpha B-crystallin is expressed in non-lenticular tissues and accumulates in Alexander's disease brain. Cell. 57(1). P. 71-78.

67. Jilma B., Stohlawetz P., Pernerstorfer T., Eichler H.G., Mullner C., Kapiotis S. (1998) Glucocorticoids dose-dependently increase plasma levels of granulocyte colony stimulating factor in man. J. Clin. Endocrinol. Metab. 83. P. 1037-1040.

68. Kandror O., Sherman M., Rhode M., Goldberg A.L. (1995) Trigger factor is involved in GroEL-dependent protein degradation in Escherichia coli and promotes binding of GroEL to unfolded proteins. EMBO J. 14. P. 6021-6027.

69. Kim K. K., Kim R., Kim S. H. (1998) Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature. 394. P. 595-599.

70. King R.W., Deshaies R.J., Peters J.-M., Kirschner M.W. (1996) How the proteolysis drives the cell cycle. Science. 274. 1652-1659.

71. Bernhagen J. (2000) Dissection of the enzymatic and immunologic functions of macrophage migration inhibitory factor. Full immunologic activity of N-terminally truncated mutants. Eur. J. Biochem. 267. P. 7183-7192.

72. Koh T. J., Escobedo J. (2004) Cytoskeletal disruption and small heat shock protein translocation immediately after lengthening contractions, Am. J. Physiol. 286. P. 713-722.

73. Krieger DT, Allen W, Rizzo F, Krieger HP (1971) Characterization of the normal temporal pattern of plasma corticosteroid levels. J. Clin. Endocrinol. Metab. 32. P. 266-284.

74. Laskey R.A., Honda B.M., Mills A.D., Finch J.T. (1978) Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275. P. 416-420.

75. LacKey D.C., Sampey A.V., Mitchell R., Bucala R., Santos L., Leech M. (2003) Control of fibroblast-like synoviocyte proliferation by macrophage migration inhibitory factor (MIF). Arthritis Rheum. 48. P. 103-109.

76. Laemmli U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. Nature. 221. P. 680-685.

77. Lee G. J., A. M. Roseman H. R. Saibil and Vierling E. (1997) A small heat shock protein stably binds heat-denatured model substrates and can maintain a substrate in a folding-competent state. EMBOJ. 16. P. 659-671.

78. Leech M., Lacey D.C., Xue J.R., Santos L., Hutchinson P., Wolvetang E. (2003) Macrophage migration inhibitory factor (MIF) regulates p53 in inflammatory arthritis. Arthritis Rheum. 48. P. 1881-1889.

79. Leroux M. R., Melki R., Gordon B., Batelier G., Candido, E. P. (1997) Structure-function studies on small heat shock protein oligomeric assembly and interaction with unfolded polypeptides, J. Biol. Chem. 272. P. 24646-24656.

80. Levine S.J., Larivee P., Logun C., Angus C.W., Shelhamer J.H. (1993) Corticosteroids differentially regulate secretion of IL-6, IL-8, and G-CSF by a human bronchial epithelial cell line. Am. J. Physiol., 265. P. 360-368.

81. Liberek K., Marszalek J., Ang D., Georgopoulos C., Zylicz M. (1991) Escherichia coli DnaJ and GrpE heat shock proteins jointly stimulate ATPase activity of DnaK. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 88(7). P. 2874-2878.

82. Lindner R. A., Kapur, A., Carver, J. A. (1997) The interaction of the molecular chaperone, alpha-crystallin, with molten globule states of bovine alpha-lactalbumin, J. Biol. Chem. 272. P. 27722-27729.

83. Liu D.Y., Yu S.F., Remold H.G., David J.R. (1985) Glycolipid receptor for human migration inhibitory factor: fucose and sialic acid are important for the human monocyte response to migration inhibitory factor. Cell Immunol. 90. P. 539.

84. Lubetsky J.B., Swope M., Dealwis C., Blake P., Lolis E. (1999) Pro-1 of macrophage migration inhibitory factor functions as a catalytic base in the phenylpyruvate tautomerase activity. Biochemistry. 38. P. 7346-7352.

85. Michaeli D., Pinto J.D., Benjamini E. (1969) Immunoenzymology of acetylcholinesterase. II. Effect of antibody on the heat denatured enzyme. Immunochemistry. 6(3). P. 371-378.

86. Miron, T., Vancompernolle, K., Vandekerckhove, J., Wilchek, M., Geiger, B. (1991) A 25-kD inhibitor of actin polymerization is a low molecular mass heat shock protein, J. Cell. Biol. 114. P. 255-261.

87. Mogk A. and Bukau B. (2004) Molecular Chaperones: Structure of a Protein Disaggregase. Curr. Biology. 14. P. 78-80.

88. Morand E.F. (2005) New therapeutic target in inflammatory disease: macrophage migration inhibitory factor. Intern. Med. J. 35. P. 419— 426.

89. Morand E.F., Cooley H., Leech M., Littlejohn G.O. (1996) Advances in the understanding of neuroendocrine function in rheumatic disease. Aust. N. Z. J. Med. 26. P. 543-557.

90. Morand E.F., Leech M., Weedon H., Metz C., Bucala R., Smith M.D. (2002) Macrophage migration inhibitory factor in rheumatoid arthritis: clinical correlations. Rheumatology (Oxford). 41. P. 558— 562.

91. Munck A., Guyre P-M., Holbrook N-J. (1984) Physiological functions of glucocorticoids in stress and their relation to pharmacological actions. Endocrin. Rev. 25. P. 746-752.

92. Nakano T., Watarai H., Liu Y.C., Oyama Y., Mikayama T., Ishizaka K. (1997) High-affinity binding of bioactive glycosylation-inhibiting factor to antigen-primed T cells and natural killer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 24. P. 202.

93. Nathan C.F., Remold H.G., David J.R. (1973) Characterization of a lymphocyte factor which alters macrophage functions. J. Exp. Med. 137. P. 275-290.

94. Naray-Fejes-Toth A., Rosenkranz B., Frolich J.C., Fejes-Toth G. (1988) Glucocorticoid effect on arachidonic acid metabolism in vivo. J. Steroid Biochem. 30. P. 155-159.

95. Nishihira J., Koyama Y., Mizue Y. (1998) Identification of macrophage migration inhibitory factor (MIF) in human vascular endothelial cells and its induction by lipopolysaccharide. Cytokine. 10. P. 199-205.

96. Nishihira J. and Ogata A. (2001) Macrophage migration inhibitory factor as atarget molecule in multiple sclerosis. Curr. Opin. Investig. Drugs. 2(6). P. 778-782.

97. Odh G., Hindemith A., Rosengren A.M., Rosengren E., Rorsman H. (1993) Isolation of a new tautomerase monitored by the conversion of D-dopachrome to 5,6-dihydroxyindole. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2. P. 619-24.

98. Onodera S., Kaneda K., -Mizue Y., Koyama Y., Fujinaga M., Nishihira J. (2000) Macrophage migration inhibitory factor upregulates expression of matrix metalloproteinases in synovial fibroblasts of rheumatoid arthritis. J. Biol Chem. 275. P. 444-450.

99. Oursler M.J., Riggs B.L., Spelsberg T.C. (1993) Glucocorticoid-induced activation of latent transforming growth factor-beta by normal human osteoblast-like cells. Endocrinology. 133. P. 21872196.

100. Orita M., Yamamoto S., Katayama N. and Fujita S. (2002) Macrophage Migration Inhibitory Factor and the Discovery of Tautomerase Inhibitors. Curr. Pharmaceutical. Design. 8. P. 12971317.

101. Panasenko O. O., Seit Nebi,A., Bukach O. V., Marston,S. B., Gusev N. B. (2002) Structure and properties of avian small heat shock protein with molecular weight 25 kDa. Biochim. Biophy. Acta. 1601. P. 64-74.

102. Parsell, D. A., Kowal A. S., Singer M. A., and Lindquist S. (1994) Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hspl04. Nature. 372. P. 475-478.

103. Pelham H.R. (1989) Control of protein exit from the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Cell. Biol. 5. P. 1-23.

104. Plater, M. L., Goode, D., Crabbe, M. J. (1996) Effects of site-directed mutations on the chaperone-like activity of alphaB-crystallin. J. Biol. Chem. 111. P. 28558-28566.

105. Raman C.S., Jemmerson R., Nail B.T. (2000) Antibody-detected folding: kinetics of surface epitope formation are distinct from other folding phases. Protein Sci. 9(1). P. 129-137.

106. Reid K. L. and Fink A. L. (1996) Physical interactions between members of the DnaK chaperone machinery: characterization of the DnaK. GrpE complex. Cell Stress Chaperones. 1. P. 127-137.

107. Rosengren E., Aman P., Thelin S., Hansson C., Ahlfors S., Bjork P., Jacobsson L. and Rorsman H. (1997) The macrophage migration inhibitory factor MIF is a phenylpyruvate tautomerase. FEBS Lett. 417(1). P. 85-88.

108. Rosengren E., Bucala R., Aman P., Jacobsson L., Odh G., Metz C.N., Rorsman H. (1996) The immunoregulatory mediator macrophage migration inhibitory factor (MIF) catalyzes a tautomerization reaction. Mol. Med. 12. P. 143-9.

109. Pratt W. B. (1997) The role of the Hsp90-based chaperone system in signal transduction by nuclear receptors and receptors signaling via MAP kinase. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37. P. 297-326.

110. Sampey A.V., Hall P.H., Mitchell R.A., Metz C.N., Morand E.F. (2001) Regulation of synoviocyte phospholipase A2 and cyclooxygenase 2 by macrophage migration inhibitory factor. Arthritis Rheum. 44. P. 1273-1280.

111. Santos L., Hall P., Metz C., Bucala R., Morand E.F. (2001) Role of macrophage migrat ion inhibitory factor (MIF) in murine antigen-induced arthritis: interaction with glucocorticoids. Clin. Exp. Immunol, 123. P. 309-314.

112. Santos L., Lacey D.C., Yang Y., Leech M., Morand E.F. (2004) Activation of synovial cell p38 MAP kinase by macrophage migration inhibitory factor (MIF). J. Rheumatol. 31. P. 1038-1043.

113. Schonfeld H. J., Schmidt D., Schroder H. and Bukau B. (1995) The DnaK chaperone system of Escherichia coli: quaternary structures and interactions of the DnaK and GrpE components. J. Biol. Chem. 270: 2183-2189.

114. Senthilkumar R., Chaerkady K., Krishna Sharma K. (2002) Identification and Properties of Anti-chaperone-like Peptides Derived from Oxidized Bovine Lens a-Crystallins. Issue. 277 (42), P. 39136-39143.

115. Shimizu T., Abe R., Nakamure H., Suzuki M. and Nishihira J. (1999) High expression of macrophage migration inhibitory factor in human melanoma cells and its role in tumor cell growt hand angiogenesis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 264(3). P. 751-758.

116. Sideraki V., Gilbert H.F. (2000) Mechanism of the antichaperone activity of protein disulfide isomerase: facilitated assembly of large, insoluble aggregates of denatured lysozyme and PDI. Biochemistry. 39(5). P. 1180-1188.

117. Skowyra D., Georgopoulos C., Zylicz M. (1990) The E. coli dnaK gene product, the hsp70 homolog, can reactivate heat-inactivated RNA polymerase in an ATP hydrolysis-dependent manner .Cell. 62 (5). P. 939-944.

118. Solomon B. (2002) Anti-aggregating antibodies, a new approach towards treatment of conformational diseases. Curr Med Chem. 9(19). P. 1737-1749.

119. Solomon B., Koppel R., Frankel D., Hanan-Aharon E. (1997) Disaggregation of Alzheimer beta-amyloid by site-directed mAb. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94(8). P. 4109-4112.

120. Solomon B., Koppel R., Hanan E., Katzav T. (1996) Monoclonal antibodies inhibit in vitro fibrillar aggregation of the Alzheimer beta-amyloid peptide. Proc Natl Acad Sci USA. 93(1). P. 452-455.

121. Sriram M., J. Osipiuk B. Freeman R. Morimoto and Joachimiak A. (1997) Human Hsp70 molecular chaperone binds two calcium ions within the ATPase domain. Structure. 5. P. 403-414.

122. Stamps S.L., Fitzgerald M.C., Whitman C.P. (1998) Characterization of the role of the amino-terminal proline in the enzymatic activity catalyzed by macrophage migration inhibitory factor. Biochemistry. 37. P. 10195.

123. Stamps S.L., Taylor A.B., Wang S.C., Hackert M.L., Whitman C.P. (2000) Mechanism of the phenylpyruvate tautomerase activity of macrophage migration inhibitory factor: properties of the PIG, PI A, Y95F, and N97A mutants. Biochemistry. 39. P. 9671.

124. Stoldt V., Rademacher F., Kehren V., Ernst J. F., Pearce D. A., and Sherman F. (1996) Review: the CCT eukaryotic chaperonin subunits of Saccharomyces cerevisiae and other yeasts. Yeast. 12. P. 523-529.

125. StuderS., Narberhaus F. (2000) Chaperone activity and homo- and hetero-oligomer formation of bacterial small heat shock proteins. J. Biol. Chem. 275. P. 37212-37218.

126. Sugimoto H., Suzuki M., Nakagawa, A., Tanaka I., Nishihira J. (1996) Crystal structure of macrophage migration inhibitory factor from human lymphocyte at 2.1 A resolution. FEBS Lett. 389. P. 145.

127. Sugrobova N.P., Lisovskaja N.P., Kurganov B.I. (1983) Turbidimetric method for determination of glycogen phosphorylase activity and its use for estimation of equilibrium position of enzymic reaction. J. Biochem. Biophys. Methods. 8(4). P. 299-306.

128. Sun H.W., Bemhagen J., Bucala R., Lolis E. (1996) Crystal structure at 2.6-A resolution of human macrophage migration inhibitory factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 23. P.5191.

129. Sun H.W., Dtrnhagen J., Bucala R. and Lolis E. (1996) Crystal structure at 2.6-A resolution of human macrophage migration inhibitory factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93. P. 5191-5196.

130. Suzuki H., Kanagawa H., Nishihira J. (1996) Evidence for the presence of macrophage migration inhibitory factor in murine reproductive organs and early embryos. Immunol. Lett. 51. P. 141.

131. Suzuki M., Sugimoto H., Nakagawa A., Tanaka I., Nishihira J., Sakai M. (1996) Crystal structure of the macrophage migration inhibitory factor from rat liver. Nature Srtuct. Biol. 3. P. 259.

132. Swope M.D., Lolis E. (1999) Macrophage migration inhibitory factor: cytokine, hormone, or enzyme? Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 139. P. 1-32.

133. Takenaka I. M., Leung S. M., Mcandrew S. J., Brown J. P. and Hightower L. E. (1995) Hsc70-binding peptides selected from a phage display peptide library that resemble organellar targeting sequences. J. Biol. Chem. 270. P. 19839-19844.

134. Theriault J. R., Lambert H., Chavez-Zobel A. T., Charest G., Lavigne P., Landry J. (2004) Essential role of the N-terminal WD/EPF motif in the phosphoryIation-activated protective function of mammalian Hsp27.y. Biol. Chem. 234. P. 1236-1241.

135. Thomer M.O., Vance Ml., Horvath E., Kovacs K. (1992) In: J.D. Wilson, D.W. Foster eds. Williams Textbook of Endocrinology, 8th Edition, Saunders, Philadelphia. P. 221.

136. Tissieres A., Mitchell H. K., Tracy U. M. (1974) Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. J. Mol. Biol. 84. P. 389-398.

137. Ungermann C., Neupert W., Cyr D.M. (1994) The role of Hsp70 in conferring unidirectionality on protein translocation into mitochondria. Science. 18. P. 1250-1253.

138. Vedder H., Krieg J.C., Gerlach B., Gemsa D., Bacher M. (2000) Expression and glucocorticoid regulation of macrophage migration inhibitory factor (MIF) in hippocampal and neocortical rat brain cells in culture. Brain Res. 869. P. 25-30.

139. Weiser W.Y., Temple P.A., Witek-Gianotti J.S., Remold H.G., Clark S.C., David J.R. (1989) Molecular cloning of a cDNA encoding a human macrophage migration inhibitory factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 5S. P. 7522-7531.

140. Wistow G.J., Shaughnessy M.P., Lee D.C., Hodin J. and Zelenka P.S. (1993) A macrophage migration inhibitory factor is expressed in the differentiating cells of the eye lens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90(4). P. 1272-1275.

141. Wright S.D., Ramos R.A., Tobias P.S., Ulevitch R.J., Mathison J.C. (1990) CD 14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein. Science. 243. P. 1431.

142. Wu J.Y., Cunha F.Q., Liew F.Y., Weiser W.Y. (1993) IL-10 inhibits the synthesis of migration inhibitory factor and migration inhibitory factor-mediated macrophage activation. J. Immunol. 151. P. 43254332.

143. Yahara I. (1998) Structure and function of the 90-kDa stress protein Hsp90. In: Molecular Chaperones in the Life Cycle of Proteins, edited by A. L. Fink and Y. Goto. New York: Dekker. P. 183-192.

144. Yang Y.H., Hutchinson P., Leech ML, Morand E.F. (1997) Exacerbation of adjuvant arthritis by adrenalectomy is associated with reduced leukocyte lipocortin 1. J. Rheumatol. 24. P. 1758-1764.

145. Yunis A. A., Fischer, E. H., Krebs, E. G. (1962) Comparative studies on glycogen phosphorylase. Purification and properties of rabbit heart phosphorylase. J. Biol. Chem. 237. P. 2809-2815.

146. Zeng F.-Y., Kratzin H., Gabius H.J. (1994) Migration inhibitory ^ factor-binding sarcolectin from human placenta is indistinguishablefrom a subfraction of human serum albumin. Bio. Chem. Hoppe. Seyler. 375. P. 393.

147. Zeiner M., Gebauer M. and Gehring U. (1997) Mammalian protein RAP46: an interaction partner and modulator of 70 kDa heat shock proteins. EMBOJ. 16. P. 5483-5490.

148. Zhang M., Aman P., Grubb A., Panagopoulos I., Hindemith A., Rosengren E., Rorsman H. (1995) Cloning and sequencing of a cDNA encoding rat D-dopachrome tautomerase. FEBS Lett. 373. P.203-210.

149. Zhu X., Zhao X., Burkholder W. F., Gragerov A., Ogata C. M., ^ Ottesman M. E. and Hendrickson W. A. (1996) Structural analysis ofsubstrate binding by the molecular chaperone DnaK. Science. 272. P. 1606-1614.

150. Абрамова Е.Б., Шарова Н.П., Карпов В.Л. (2002) Протеасома: разрушать, чтобы жить. Молекулярная биология. Т. 36. № 5. С. 761-776.

151. Евстигнеева З.Ц., Соловьева H.A., Сидельникова Л.И. (2001) Структура и функции шаперонов и шаперонинов. Прикладная биохимия и микробиология. 37(1). С. 5-18.

152. Ермоленко Д.Н., Жердев A.B., Дзантиев Б.Б. (2004) Антитела как специфические шапероны. Биохимия. 69(11). С. 1515-1521.

153. Курганов Б.И. (2002) Оценка активности молекулярных шаперонов в тест-системах, основанных на подавлении агрегации белков. Успехи биологической химии. 42. С. 89-138.

154. Курочкина Л. П., Месянжинов В. В. (1996) Фолдинг белка в клетке. Успехи биологической химии. С. 49-86.

155. Наградова Н.К. (1996) Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков. Соросовский образовательный журнал. 7. С. 10-18.

156. Наградова Н.К. (2004) Сворачивание белков в клетке: о механизмах его ускорения. Биохимия. 69(8). С. 1021-1037.

157. Панасенко О. О., Ким М. В., Гусев Н. Б. (2003) Структура и свойства малых белков теплового шока, Успехи биол. химии. 43. Р. 59-98.

158. Птицын О.Б. (1998) Сворачивание белков: нуклеация и компактные интермедиаты. Биохимия. (63). С. 435-444.

159. Третьяков О.Ю., Гурвиц Б.Я. (1998) Иммунофилины: С^ молекулярные механизмы действия. Успехи биологическойхимии. XXXVIII. С. 143-165.

160. Уверский В.Н., Финк Ф.Л. (1998) Самоассоциация может структурировать белковые молекулы, находящися в частично свернутых ненативных сосотояниях. Биохимия. (63). С. 541 -548.1. БЛАГОДАРНОСТИ

161. Выражаю признательность доктору Станке Стоевой (Stanka Stoeva) из Института физиологической химии, Тюбингенского университета (Германия) за секвенирование белка (MIF) и масс-спектральный анализ.

162. Я признательна сотрудникам Института биохимии им А.Н. Баха Ерониной Татьяне Борисовне, Рахимбердиевой Марине Генриховне за помощь в проведении экспериментов и за моральную поддержку.

163. Хочу поблагодарить Лютову Елену Михайловну за помощь в проведении экспериментов, а также за моральную поддержку.

164. Работа поддержана грантом Президиума РАН по программе «Молекулярная и клеточная биология» и грантом по программе поддержки ведущих научных школ (813.2003.4).