Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние дифтерийного токсина на функциональную активность перитонеальных макрофагов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние дифтерийного токсина на функциональную активность перитонеальных макрофагов"

од

На правах рукописи

Кассем Али Мохамед

ШИЯНИЕ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ

03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 1998

Работа выполнена в Ростовском Государственном медицинском

университете

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Лауреат Государственной премии РФ, Заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент Академии Естествознания, доктор медицинских наук, профессор ШЕПЕЛЕВ А.П.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

Доктор медицинских наук, профессор СИЗЯКИНА Л.П.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Лауреат Государственной премии РФ, доктор биологически наук, профессор ПОВЕРЕННЫЙ A.M.

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник ФРАНЦИЯНЦ Е.М.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Ростоеский научно-исследовательский противочумный инот

Защита состоится1998 г. в 1о_ часов на заседании диссертационного совета Д.063.52.08. по биоло-гичиским наукам в Ростовском Государственном Университете (344006, Г.Ростов-на-дону, ул. Большая садовая 105, ргу, биолого-почвенный факультет, ауд._).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ргу (344006, г.Ростов-на-дону, ул.Пушкинская, 148).

АВТОРЕФЕРАТ РАЗОСЛАН "/3 " 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук.

профессор

БОНДАРЕНКС

ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Дифтерия, несмотря на длительную историю изучения, привлекает к себе большое внимание исследователей. Связано это прежде всего с тем, что период, в течение которого регистрировали лишь спорадические случаи заболевания, сменился резким повышением заболеваемости, преобретшим эпидемический характер.

Среди особенностей дифтерии в настоящее время надо отметить, что болезнь вызывается преимущественно высоко токсигенными штаммами биовара gravis с увеличением числа тяжёлых клинических форм и летальных исходов.

Особенностью гипертоксических форм дифтерии является формирование бактериемии и токсического шока, что, вероятно, является следствием анергии иммунной системы. Вероятно, что данная анергия обусловлена токсическими эффектами дифтерийного токсина (ДТ). Наиболее полно были выяснены биохимические механизмы развития интоксикации, связанные с воздействием экзотоксина на систему биосинтеза белка, в частности с АДФ-рибсзилированием фактора элонгации- 2 (EF-2), прводящим к его инактивации ( Collier, 1967).

Продукция белковых экзотоксинов более характерна для грампо-ложительных бактерий, что рассматривается как защита грамположи-тельных бактерий от фагоцитоза более крупными грамотрицательными бактериями (Домарадский И.В., 1993). Таким образом, изначально токсины выполняют защитную функцию, направленную на выживание бактерий в данной экологической нише.

При внедрении бактерии в макроорганизм её судьба во многом зависит от способности"противостоять фагоцитозу. Вероятно, что экзотоксины должны оказывать подавляющее влияние на функциональную активность фагоцитов. Это положение подтверждают результаты работ, показавшие подавляющий эффект бактериальный экзотоксинов на продукцию нейтрофилами крови активных форм кислорода (АФК) (Шепелев А.П., Антипов А.Ю., Поляков В.М., 1996, Летуновский A.B., 1997). Однако функционально макрофаги значительно отличаются от нейтрофилов и результаты, полученные на модели нейтрофилов, полностью экстраполировать на макрофаги нельзя.

Очевидно, что эффекты дифтерийного токсина в дозе, вызывающей формирование иммунологической толерантности, на клетки макро-

фатального ряда может приблизить к пониманию механизмов токсического действия дифтерийного токсина и формирования иммунологической толерантности при гипертоксических формах дифтерии.

Целью настоящего исследования явилось установление взаимосвязи между свободнорадикалышм окислением, активностью антиокси-дантных ферментов и функциональной активностью макрофагов в условиях иммунологической толерантности, обусловленной дифтерийным токсином.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие экспериментальные аадачи:

1. Определить продукцию активных форм кислорода (АФК), био-цидных кислородных метаболитов и активность антиоксидантных ферментов макрофагов при воздействии экзотоксина С. сЦрМЛе^ае.

2. Определить уровень экспрессии опсониновых рецепторов (Рс к СЗЬ-рецепторов) перитонеальных макрофагов в различные сроки после введения подопытным животным ДТ.

3. Изучить влияние дифтерийного токсина на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов в различные сроки после введения ДТ.

4. Исследовать продукцию макрофагами интерлейкина-1 (ИЛ-1) и фактора некроза опухоли (ФНОа) в супернатантах перитонеальных макрофагов в динамике дифтерийной интоксикации.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований получены новые сведения о биохимических механизмах нарушения функциональной активности макрофагов и развития иммунологической толерантности при дифтерийной интоксикации.

Изучена динамика образования свободнорадикальных форм кислорода и кислородных метаболитов перитонеальными макрофагами под действием дифтерийного токсина.

Впервые показан механизм ингибирования генерации АФК; связанный не только со сниженной экспрессией Рс- и СЗЬ-рецепторов, но й с утратой чувствительности внутриклеточных регуляторов к ак-тивирующиму воздействию ионов кальция.

Установлены особенности состояния системы антиоксидантннх ферментов перитонеальных макрофагов в динамике дифтерийной интоксикации, которые характеризуются разнонаправленным изменением активности взаимосвязанных каскадных ферментов (супероксиддисмута-

аа- каталава; гдутатионпероксидаза- глутатионредуктаза).

Впервые установлена фазность изменений монокинпродуцирующей активности и экспрессии опсониновых рецепторов перитонеальных макрофагов в условиях формирования иммунологической толерантности.

По результатам проведенных исследований на защиту выносятся следующие основные положения:

- экспериментальная интоксикация, обусловленная экзотоксином С.сИрЫЛеНае, вызывает фазные изменения в окислительном метаболизме перитонеальных макрофагов, что выражается нарушением баланса систем генерирования и нейтрализации АФК и их биоцидных метаболитов, характеризующимся разнонаправленными изменениями активности взаимосвязанных антиоксидантных ферментов.

- дифтерийная иммунологическая толерантность развивается на фоне подавления фагоцитарной функции, экспрессии рецепторного аппарата, частичной блокады монокинпродуцирующей активности перитонеальных макрофагов, что свидетельствует о ведущей роли макрофа-гального звена в динамике формирования высокодозовой иммунологической толерантности.

Научно-теоретическая и практическая значимость работы.

На основании результатов собственных исследований и анализа данных литературы представлен материал, раскрывающий некоторые биохимические механизмы формирования нарушений функций макрофа-гального звена иммунной системы, лежащих в основе развития иммунологической толерантности при дифтерийной интоксикации.

Полученные данные о фазности изменений обосновывают необходимость коррекции функциональной активности макрофагов при токсической форме дифтерии препаратами про- и антиоксидантного действия в зависимости от направленности выявленных нарушений.

Апробация работы.

Основные положения работы доложены на 2-й научной сессии РГМУ (Ростов-на-Дону, 1998) и на научной конференции "День Науки студентов, молодых учёных и специалистов РГМУ, Ростов-на-Дону, 1997 , 1998).

Публикация материалов исследования.

По теме диссертации опубликовано 8 работ из них 1 в центральной и 1 в зарубежной печати.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами и 25 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы/включающего 43 отечественных и 77 зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В работе использован препарат ДТ, полученный от АО "Биомед" (Россия), представляющий производственную серию токсина. Содержание экзотоксического компонента в препарате дифтерийного токсина определяли с помощью иммуноферментной тест-системы "Дифтерия-мо-нозкм" (ШяйШ им. И.И.Мечникова).

Ишуногенность препарата ДТ определяли в РИГА сывороток крови, полученных через 3 и 7 суток после введения 1 Dim ДТ, с дифтерийным антитоксиновым диагностикумом (НПО "Синтэко", г. Москва) . Титры AT не превышали 1/2, что свидетельствует о том, что доза 1 Dim вызывает формирование иммунологической толерантности.

Для оценки влияния ДТ на функциональную активность перитоне-альных макрофагов препарат ДТ вводили внутрибрюшинно морским свинкам (самцам массой 250 г, содержавшимся на обычной лабораторной диете при естественном освещении и свободном доступе к воде) в дозе 1,0 Dim, в объёме не превышающем 0,3 мл. Оценку биологической активности ДТ проводили по способу Спирмена-Кербера ( Лакин, 1990). Ва 1 Dim принимали такое количество токсина, которое при однократном внутрибрюшинном введении морским свинкам массой 250 г вызывало гибель 40% животных на 3-й сутки при явлениях поражения надпочечников (Фролов и др., 1990). Животным контрольной группы тем же путём инъицировали соответствующий объём изотонического раствора хлорида натрия. Животных подопытной и контрольной групп забивали декапитацией (в соответсвии с требованиями Приказа N 755 от 12. 08.1977 г. "0 порядке работы с экспериментальными животными") черев 16 мин, 30 мин, 1 час, 1йч, £4ч, 3 и 7 суток с момента введения токсина или физиологического раствора соответственно.

Для получения макрофагов вызывали асептическое воспаление

путем внутрибрютинного введения животным 5 мл пептонной воды за 4 дня до опыта. По истечении этого срока проводили промывание брюшной полости морских свинок 20 мл среды 199 с гепарином (5 ед/мл) и стрептомицином в дозе 100 мкг/мл. Полученный перитонеалышй смыв трехкратно отмывали средой такого же состава, но без гепарина. После подсчета жизнеспособных клеток с трипановым синим суспензию разводили до концентрации 2 млн клеток/мл в среде RPMI 1640 с HEPES, стрептомицином и L-глутамином.

Активности антиоксидантных ферментов определяли в лизатах, полученных обработкой клеточной суспензии тритоном Х-100. Активность каталазы (КАТ) определяли по степени разложения пероксида водорода (Королюк M.Ä. с соавт.,1988). Активность супероксиддис-мутазы (СОД) определяли по величине торможения скорости окисления адреналина в адренохром методом Misra Н.Р., Fridovich I.( 1972). За единицу активности принимали количество СОД, необходимое для 50% ингибирования скорости автоокисления адреналина в условиях определения. Активность глутатионпероксидазы (ГП) определяли по скорости накопления окисленного глутатиона (GSSG) методом Е. Berschneider, J. Ruben, Пат. 210983 ГДР ( по И.А. Переслегиной, 1989 ). Активность глутатионредуктазы (ГР) определяли по накоплению окисленного НАДФ в инкубационной среде ( R. Е. Pinto, W. Bart-ley, 1969 ).

Спонтанную и стимулированную опсонизированным зимозаном и кальциевым ионофором А23187 продукцию АФК исследовали с помошью хемилюминесцентного метода и спектрофотометрического НСТ-теста.

Экспрессию Fe- и СЗЬ-рецепторов на мембране перитонеальных макрофагов исследовали микроскопическим методом ЕА-и ЕАС- розет-кообразования ( Михеенко Т.В .с соавт., 1991 ).

Фагоциторную функцию макрофагов оценивали микроскопически по их способности к захвату ЕА - комплексов эритроцитов барана в присутствии стимуляторов ( Михеенко Т,В. с соавт., 1991). Определяли фагоцитарное число (ФЧ) и фагоцитарный индекс (ФИ).

Продукцию монокинов исследовали в супернатантах монослоя перитонеальных макрофагов после 18-ти часовой инкубации со стимуляторами. Для количественного определения ЙЛ-1 и ФИО использовали тест-системы " Цитокин " ( Санкт-Петербург ).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили при помощи программы "Stadia" на ЭВМ типа IBM PC AT АтБхбб-133.

О достоверности отличий учитываемых показателей контрольной и подопытных групп судили по величине ^критерия Стьюдента после проверки распределения в группах на нормальность. Статистически достоверными считались отличия, соответствующие величине ошибки вероятности р<0,05. Наличие корреляции между признаками оценивали с использованием коэффициентов корреляции (параметрических и непараметрических) , достоверность которых также проверяли с помощью ^критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение.

1. Влияние дифтерийного тоисмиа на продукцию А<ЙК и активность ферментов антионсидантной защита.

Системы продукции и обезвреживания активированных кислородных метаболитов выполняют в макрофагах многочисленные функции, связанные не только с киллерным эффектом в отношении поглощаемых объектов фагоцитоза, но и с индукцией синтеза монокинов, регуляцией активации лимфоцитов.

Черев 15 и 30 минут после введения дифтерийного токсина (рис. 1) происходит снижение показателей НСТ-теста, люминол- и люцигенин-опосредованной хемилюминесценции, что свидетельствует о подавлении как ьне- так и внутриклеточной продукции АФК. При этом происходит значительное снижение коэффициента активации макрофагов как при стимуляции 03, так и при стимуляции А23187. Это указывает на то, что снижение активации макрофагов связано не только с секвестрированием СЗЬ-рецепторов, но и с ингибированием активности ферментов НАДФН-оксидазы и миелопероксидааы.

Через 60 минут и 12 часов показатели спонтанной и стимулированной 03 хемилюминесценции продолжают снижаться, но восстанавливается ответ на А2318? (в люминол-опосредованном ответе), что, вероятно, связано с индукцией синтеза миелопероксидааы.

Через 24 часа наблюдается достоверное повышение показателей люминол- и люцигенин-опосредованной хемилюминесценции и НСТ-теста. Однако в этот срок снижены коэффициенты активации, вероятно, вследствии того, что макрофаги активированы и на повторные стимулы практически не реагируют.

Черев 3-е суток с момента введения токсина наблюдается резкое снижение показателей хемилюминесценции и НСТ-теста. Обращают-на себя внимание два факта:

во-первых, увеличивается коэффициент активации люциге-

г! о "

гуОз

Рис. х . Влияние рф-ерийного токсина на показатели НСТ-теста перитонеальных макрофагов (контроль спонт. - 100 %).

----- ^^ X X V .

ДО) икаал-ч. '

<20 ^гтГ \ffyQ

40 Г ^»паюи^^шайюаМч

-^еоазта/ -члаиши \ № ^г- "«шляпах. "Ч^

Д.т-' - ----

Рис. 2, ■ Влияние дифтерийного токсина на активность супероксвдцисэдтизы и катализы перитонеальных макрофагов (контроль - 100 %).

нин-опосредованной хемилюминесценции на опсонизированный эимозан, что указывает на увеличение резервной активности НАДФН-оксидазы;

во-вторых, изменяется характер люминал-опосредованной хемилюминесценции, стимулированной опсонизированным вимозаном - появляется "быстрая вспышка", характерная для ответа на А23187, что свидетельствует о способности миелопероксидазы активироваться при трансмембранной передачи сигнала (вероятно, включаются Са2+ - механизмы), вызванной контактом макрофага с корпускулярной частицей.

Эта особенность отмечается и на 7-е сутки с момента введения токсина. В этот срок наблюдается повышение показателей не только спонтанной и стимулированной хемилюминесценции, но и коэфициента активации на опсонизированный эимозан.

Таким образом, продукция активированных кислородных метаболитов (АКМ) перитонеальными макрофагами после внутрибрюшинного введения дифтерийного токсина носит фазный характер. В индуктивную фазу иммуногенеза происходит снижение продукции АКМ с резким усилением их образования к концу первых суток. Основными АКМ, вырабатываемыми макрофагами в ответ на карпускулярные раздражители (опсонизированный эимозан) являются супероксидный анион-радикал, перекись водорода, синглетный кислород и гидроксильный радикал, а основным ферментом "респираторного взрыва" - НАДФН-оксидаза.

В продуктивную фазу иммуногенеза, вновь активируется образование АФК, но вместе с АФК при раздражении СЗЬ-рецепторов генерируется и гипогалогенитный ион, т.е. при контакте макрофагов с корпускулярной частицей вместе с НАДФН-оксидазой активируется и ыиелопероксидаза.

Выработка АФК должна сопровождаться и активацией антиокси-дантных ферментов во избежание аутоповреждения макрофагов.

В первые 30 минут после введения токсина активность СОД постепенно увеличивается в 2,3 раза по сравнению с контролем (рис.2)

К 60-й минуте с момента введения токсина активность СОД резко снижается до исходного уровня. Однако, затем вновь активность СОД постепенно возрастала и к 7 суткам превысила активность контроля в 2,6 раза.

Динамика изменения активности катадааы носит противоположный характер.

Через 16 мин после введения ДТ активность каталазы снижается

и достигает своего минимума к 30-й мин с момента введения ДТ. Однако, через 60 мин с момента введения ДТ отмечается резкий всплеск каталазной активности, которая затем постепенно снижается к концу индуктивной фазы иммуногенеза.

В продуктивную фазу иммуногенеза (7 суток) активность ката-лазы восстанавливается до исходного уровня.

Обращает на себя внимание тот факт, что изменения активностей СОД и каталазы в индуктивную фазу иммуногенеза находятся в обратной корреляционной зависимости (г=-0,837, р<0,05).

Следует отметить корреляционную связь между изменениями активности каталазы и коэффициентом ХЯ-ответа на А23187 в динамике дифтерийной интоксикации (г=0,94, р<0,01).

Если каталазе принадлежит ключевая роль в защите клеток от окислительного стресса, вызванного высокими концентрациями перекиси водорода, то другой анткоксидантный фермент - глутатиояпе-роксидаза (ГПО), обладая большим сродством к перекиси водорода, более эффективно работает при низких концентрациях перекиси водорода (Eaton J.М.,1991, Scott M.D. et al.,1991).

Изменения активностей глутатион-зависимых ферментов при действии дифтерийного токсина носят разнонаправленный характер (г=-0,77, р<0,05) (рис.3)..

Через 15 мин после введения ДТ активность ГПО достоверно снижается в 2,8 раза, в то время, как активность ГР достоверно возрастает на 78%. Однако, к 30-й минуте активность ГПО увеличивается в 3,2 раза по сравнению с предыдущим сроком, превысив контрольные значения на 42%. Активность ГР, наоборот, снижается в 3 раза.

К 60-й минуте после введения токсина активность ГПО достигает своего максимального значения, а затем постепенно начинает снижаться и к 4-м суткам составляет лишь 36% от активности, наблюдаемой через 60 мин после введения ДТ.

В эти сроки активность ГР остается достоверно сниженной, но к 4-м суткам активность ГР увеличивается, достоверно превысив контрольные показатели.

Через 7 суток после введения дифтерийного токсина активность глутатионовых ферментов восстанавливается до контрольных значений.

Таким образом, дифтерийный токсин вызывает разнонаправленные

120» ______

\tflV дшха _ __________.

бОг ^шяяаЬьОхзахяявяезь* \ »с ^аасаиаш1 ^кшкиоч. Чь: ¡шйг^-" "хаз .¿я

Рис. 3. Влияние даферийного токсина на активность глутатионовых ферментов перитонеальных макрофагов (контроль - 100 %).

__I \ \

»НГТ\ N. N.

___шакх ягод*. N. ^^^ %

^»■ЗкГ* гззшоч^- тега

Рис Д. Влияние дифтерийного токсина на экспрессию рецепторов на мембране перитонеальных макрсфгов

изменения активностей взаимосвязанных антиоксидаитных ферментов, нарушая сбалансированность функционирования антиоксидантной системы, и, вероятно, это может служить одной из причин развития токсического эффекта ДТ.

2. Влияние дифтерийного токсина на рецепторный аппарат и фагоцитарную функцию пернгонеалышх макрофагов.

Уровень экспрессии Рс-рецепторов на поверхности перитонеаль-ных макрофагов, определяемый методом ЕА-розеткообразования, при введении дифтерийного токсина носит фазный характер (рис. 4). В индуктивную фазу, уже через 15 минут с момента введения ДТ, количество Рс-рецепторов оказалось достоверно сниженным на 19% и оставалось на этом уровне во второй и третий сроки. К 24 часам с момента введения ДТ уровень определяемых Рс-рецепторов постепенно восстанавливался до контрольных значений.

Однако, в продуктивную фазу, через 3-е суток после введения ДТ, уровень Рс-рецепторов вноеь достоверно снижался и через 7 суток с момента введения токсина восстанавливался до контрольных значений.

Изменения экспрессии СЗЬ-рецепторов под действием ДТ соответствовали динамике Рс-рецепторов (г= 0,91, р<0,01).

Влияние дифтерийного токсина на показатели фагоцитарной функции перитонеальных макрофагов (фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса) представлены на рис.5.

Через 15 мин после введения токсина достоверно уменьшилось количество активно фагоцитирующих макрофагов (фагоцитарное число ) как в спонтанном, так и в стимулированном тесте. Количественная оценка поглотительной способности (фагоцитарный индекс) практически не измененилась в спонтанном тесте, но достоверно снизилась в стимулированном как зимозаном, так и ионофором тесте. Это свидетельствует о том, что снижение захвата связано не только с уменьшением количества опсониновых рецепторов не мембране макрофагов и нарушением трансмембранной передачи сигнала, но и с потерей чувствительности внутриклеточных сократительных элементов (микротрубочек, микрофиламентов) к ионам кальция.

Во все следующие сроки эксперимента наблюдается еще большее снижение всех показателей фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов. Обращает внимание, что в сроки, характеризующиеся восстановлением количества экспрессируемых опсониновых рецепторов

на мембране (12 ч, 24ч, 7с), показатели фагоцитоза в ответ на оп-сонизированных зимован не восстанавливаются, а остаются сниженными, как и покаватели фагоцитоза при действии кальциевого ионофо-ра. Вероятно, это свидетельствует о том, что снижение фагоцитарной активности, вызванное дифтерийным токсином, связано прежде всего с нарушением сократительных внутриклеточных элементов, обеспечивающих захват объектов фагоцитоза.

3. Влияние дифтерийного токсина на продукцию ыонокинов пери-тонеалышми макрофагами.

Через 15 мин после введения дифтерийного токсина способность макрофагов спонтанно синтезировать ИЛ-1 достоверно снизилась на 17%. Однако, через 30 мин спонтанная продукция ИЛ-1 достоверно возросла по сравнению с контролем и предыдущим сроком на 28% и 54% соответственно. Также обращает внимание повышенная способность макрофагов синтезировать ИЛ-1 при стимуляции опсонизирован-ным зимозаном и особенно ионофором А23187 - коэффициент активации продукции ИЛ-1 ионофором в этот срок достоверно выше контрольного значения (рис.6).

Через 60 мин после введения токсина показатели секреции ИЛ-1 остаются достоверно более высокими как в спонтанном, так и в стимулированном тесте, однако, с этого момента продукция ИЛ-1 постепенно уменьшается и через 7 суток становится достоверно более низкой в сравнении с контролем.

Таким образом, при введении дифтерийного токсина способность макрофагов продуцировать ИЛ-1 носит волнообразный характер. В первые минуты контакта макрофагов с токсином понижается выработка ИЛ-1, к 30 мин - возрастает, а затем вновь постепенно уменьшается. Интересно, что в момент пика выработки ИЛ-1 изменяется не только количество секретируемого ИЛ-1, но изменяется и механизм активации его продукции. Если интактные макрофаги отвечали только на опсонизированный зимозан и не отвечали на ионофор А23187, что свидетельствует о прерогативной роли рецептор-опосредованных механизмов (инозитолфосфатный механизм), то стимулированные дифтерийным токсином макрофаги способны в большей степени отвечать на ионофор А23187, что, вероятно, свидетельствует о вовлечении "прямых" кальциевых механизмов активации синтеза ИЛ-1.

Представляется интересным отметить, что между изменениями показателей фагоцитоза и продукции ИЛ-1, вывванными влиянием диф-

__1Г л,

~ ю ^

. —Ш \

_ ' 1 на--- \

>А>

¿¡ДОе^МйМкеЛч \ т9г}

»¡аг'чзаа^ььгс 10л

V»

Рис.5. Влияние дочерниного токсина на (фагоцитарное жетз перитонеапьный макрофагов (контроль сдант. - 100 1°).

шг/Н

X х. ^ | \ Ни

_ _______ . .____ .

7-Ок \\tji.

г» С- -

Рис. 6.

терийного токсина, нет какой-либо корреляции, что подтверждает мнение, что фагоцитарная функция и синтез ИЛ-1 разобщены между собой (Kurt-Jones Е.А. et al.s 1986).

Через 15 мин после введения ДТ спонтанная продукция ФНОа снижается, однако, появляется ответ на ионофор А23187. Через 30 мин после введения токсина спонтанная продукция ФНОа продолжает понижаться) однако, в этот срок у макрофагов появляется способность отвечать на опсонизированный аимозан. Это является иллюстрацией того, как в макрофагах происходит "включение" разных механизмов активации. В интактных макрофагах отсутствуют и рецептор-опосредованные и "прямые" кальциевые механизмы активации синтеза ФНОа. Через 15 мин включаются "прямые" кальциевые механизмы активации, что, вероятно, указывает на индукцию протеинкиназы С, которая в этот момент способна активироваться только высокими концентрациями кальция, но не способна активироваться сигналом с цитоплазматической мембраны, а через 30 мин включаются и рецептор-опосредованные механизмы активации синтеза ФНОа, что, вероятно, свидетельствует о способности ПКС активироваться диацилглице-ролом.

Во все последующие сроки макрофаги постепенно понижают спонтанную выработку ФНОа и перестают отвечать на стимулы повышенным синтезом данного монокина. Подавление продукции монокинов, активирующих лимфоциты, согласуется с пррактическим отсутствием антитоксических антител, о чём свидетельствуют результаты наших исследований (максимальные титры антител к концу продуктивной фазы иммуногенеза не превышали 1/2).

При интерпретации полученых данных необходимо учитывать, что с одной стороны, дифтерийный токсин, являясь растворимым антигеном, запускает в макрофагах генетически детерминированную прогро-амму активации, необходимую для формирования иммунного ответа (Учитель И.Я. с соавт., 1976).

С другой стороны, дифтерийный токсин - это клеточный яд, ин-гибирующий синтез белка, что, естественно, вызовет изменения в реализации программы активации макрофагов.

Кроме того, известно, что бактериальные экзотоксины, обладающие АДФ-рибозилтрансферазной активностью, такие как холерный, коклюшный, блокируя ГТФ-связывающий 6-белок, стойко активируют аденилатциклазу, вызывая вначительное повышение уровня внутрикле-

точного цАМФ (Bucklund P.S. et al., 1988).

Дифтерийный токсин также обладает АДФ-рибозилтрансфераэной активностью. Несмотря на то, что в доступной литературе мы не встретили сведений о влиянии ДТ на уровень внутриклеточного цАШ>, допустимо предположить, что дифтерийный токсин обладает данным эффектом.

Если это так, то и в результате реализации детерминированной программы активации и в результате действия токсина в ранние сроки вследствии активации аденилатциклазы в макрофагах повышается концентрация цАШ>. цАШ>, являясь вторичным мессенджером, активирует цАМФ-зависимую протеивкиназу. Протеинкиназа, фосфорилируя белки, изменяет активность ряда ключевых ферментов метаболических путей.

В частности, фосфорилируегся и тем самым ингибируется фосфо-липаза С, что приводит к снижению гидролиза фосфатидилинозитолди-фосфата и уменьшению образования основных вторичных мессенджеров активации макрофагов - инозитолтрифосфата и диацилглицерола. Это приводит к нарушению высвобождения Са2+ из внутриклеточных депо и снижению его цитоплазматической концентрации, а следовательно, бездействию сократительных элементов и, как следствие, к снижению поглотительной способности макрофагов. В то же время, инактивация протеинкиназы С приводит к нарушению самосборки НАДФН-оксидазного комплекса на мембране, что приводит к угнетению продукции супероксидного аниоярадикала и соответственно снижению показателей HCT-теста и хемилюминесценции.

Кроме того, цАШ>-зависимое фосфорилирование ключевых ферментов приводит к подавлению гликолиза и пентозофосфатного пути окисления глюкозы, являющегося в макрофагах основным поставщиком НАДФН - субстрата НАДФН-оксидазы, что также может вносить свой вклад в эффект подавления респираторного взрыва, определяемого хемшооминесценцией и HCT-тестом.

Т.о., в этот срок ревко снижается продукция макрофагами АФК, а, следовательно, и их микробиоцидная активность. Несмотря на то, что до настоящего времени не отвегнута гипотеза о пассивном участии макрофагов в иммуногенезе на растворимый антиген, при котором разрушение антигена не требуется, сниженная продукция АФК может быть объяснима именно с точки зрения предотвращения структурной модификации АГ, столь значительное и стойкое подавление продукции

АФК мы рассматриваем как проявление токсического действия ДТ.

Внутриклеточная утилизация АФК антиоксидантными ферментами в этот срок имеет определенную направленность, выражающуюся в повышенном образовании (активация СОД) и сниженной утилизации (инги-бирование каталазы и ГШ) перекиси водорода, а также в увеличении восстановленного глутатиона (повышение ГР) и уменьшении окисленного глутатиона (снижение ГПО).

Т.о. перекись водорода и восстановленный глутатион, накапливаясь в макрофагах, вероятно, выполняют роль внутриклеточных молекулярных регуляторов, обеспечивая дальнейшие изменения в окислительном метаболизме и выполнение ряда функций к®.

Известно, что окисленный глутатион активирует ПФП, а следовательно, обеспечивает определенный уровень НАДФН, являющегося субстратом "респираторного взрыва" (Шарманов Т,Ш. с соавт., 1985). Следовательно, уменьшение концентрации окисленного глутатиона в первые 15 минут еще в большей степени подавит активность ГШ, что приведет к еще большему снижению выработки АФК, наблюдаемому в следующие сроки эксперимента.

Известно, что перекись водорода в низких концентрациях активирует пролиферацию лимфоцитов, а в высоких - подавляет. Кроме того, перекись водорода приводит к повышению внутриклеточной концентрации кальция, ингибирует супероксиддисмутазу, запускает синтез каталазы (Меньщикова Е.Б. с соавт., 1994).

Повышенный уровень цАМФ в макрофагах, который, вероятно, возникает в первые минуты контакта ингибирует протеинкиназу С, которая являяется активатором экспрессии генов монокинов (Бгш-vald Е. et а1., 1996), поэтому, в этот срок наблюдается снижение спонтанной продукции ИЛ-1. Однако, накапливающаяся перекись водорода создает условия для активации синтееа монокинов. Интересно, что через 30 минут повышается в большей степени синтез ИЛ-1 в ответ на кальциевый ионофор, а не на опсонизированньш зимозан. Вероятно, это может быть связано с нарушениями рецепции (вследствии уменьшения количества рецепторов) и формированием трансмембранной передачи сигнала с последующей активацией протеинкиназы С (из-эа высокой концентрации цАШ>).

Распространено мнение, что преходящее повышение концентрации внутриклеточного цАМФ необходимо для повышения аффинности опсони-новых рецепторов механизмом цАШ-зависимого фосфорилирования. Но

именно этого под действием ДТ и не происходит - на мембране уменьшается количество экспрессируемых СЗЬ- и Рс-рецепторов. По данным литературы, именно в эти сроки происходит необратимое связывание ДТ с рецепторами и транслокацией его через мембрану. Вероятно, этот мембранный механизм транспорта токсина каким-то образом вызывает секвестрирование опсониновых рецепторов. Это, на наш взгляд, отражение токсических эффектов ДТ.

Следствием уменьшения количества рецепторов является снижение показателей фагоцитоза (ФЧ, Ж), т.к. процесс поглощения начинается с адсорбции опсонизированных объектов фагоцитоза на мембране макрофагов посредством связывания с опсониновыми рецепторами, Однако, эффект подавления фагоцитоза объясняется не только уменьшением количества рецепторов, но и, вероятно, нарушениями внутриклеточных сократительных элементов - микротрубочек и микро-филаментов, активируемых ионами кальция, что объясняет отсутствие активации фагоцитоза кальциевым ионофором А23187.

Через 60 мин, вероятно, в результате накопления перекиси водорода в макрофагах изменяется окислительный метаболизм активацией каталавы, ГПО, угнетением СОД и ГР. Таким образом, в этот срок происходит ограничение внутриклеточного образования перекиси водорода и активирование ее обезвреживания.

Несмотря на изменения активностей глутатионовых ферментов в сторону накопления окисленного глутатиона, а, следовательно, и растормаживания пентозофосфатного окисления глюкозы, восстановление способности макрофагов генерировать АФК, а, следовательно, выполнять киллерную функцию, не наступает.

Кроме того, остаются сниженными показатели экспрессии опсониновых рецепторов и показателей фагоцитоза. И на наш взгляд, этот "провал" в активационной программе является отражением токсического действия дифтерийного токсина.

Со временем, к 12 часам с момента введения ДТ, по мере внутриклеточной деградации токсина, вероятно, уменьшаются его эффекты, связанные с активацией аденилатциклазы, но увеличиваются токсические эффекты, связанные с АДФ-рибозшшрованием фактора элонгации ЕР-2 и вызванное этим подавление синтеза белка. Кроме того, начинают проявляться эффекты монокинов, являющихся аутсжринными факторами для макрофагов, синтез которых был увеличен в предыдущие сроки эксперимента.

Вероятно происходит постепенная смена аденилатциклазного механизма активации на кальций-инозитолфосфатный. Это подтверждается данными Андреевой Л.И. (1990), свидетельствующими о снижении к 24 часам концентрации цАМФ в макрофагах при действии коклюшного антигена, в состав которого входит коклюшный токсин, который как и ДТ обладает АДФ-рибозилтрансферазной активностью.

К 12-ти часам отмечается восстановление показателей НОТ-теста, отражающего внутриклеточную продукцию супероксидного анионра-дикала, а к 24-м часам исследования значительно повышаются показатели хемилюминесценции.

Т.о. восстанавливается бактерицидная активность макрофагов, и это, на наш взгляд, объясняется как деградацией токсина и прекращением его аденилатциклазных токсических механизмов, так и активацией продукции АФК монокинами (ШЫ/ ФНО), которые накапливаются вследствии их усиленного синтеза, зарегистрированного нами в ранние сроки эксперимента.

Вместе с тем, столь мощная продукция АФК, наблюдаемая в 24 часа с момента введения ДТ, требует достаточного уровня активности антиоксидантных ферментов, иначе активные формы кислорода могут индуцировать ПОЛ в мембранах макрофагов, что приведет их к аутоповреждению.

И действительно, активность СОД в эти сроки постепенно повышается, но это не подкрепляется синхронным возрастанием активности каталазы - наоборот, активность каталазы резко падает, что, вероятно, приводит к накоплению перекиси водорода внутри клетки. Аналогичный дисбаланс в эти сроки наблюдается и в деятельности глутатионовых антиоксидантных ферментов.

Очевидно, что в результате разнонаправленных изменений в работе ферментов, в норме работающих синхронно, макрофаги попадают в условия окислительного стресса, адаптация к которому затруднена вследствии подавления синтеза белка. В результате, функциональная активность и функциональные резервы макрофагов в эти сроки снижены.

Прежде всего это иллюстрируется нарушением синтеза монокинов (ИЛ-1, ФНО) и отсутствием ответа на стимуляторы. Несмотря на восстановление количества зкспрессируемых Геи СЗЬ-рецепторов (что является подтверждением гипотезы о позитивной регуляции опсонино-вых рецепторов кальциевыми, а не цАШ-зависимыми механизмами),

показатели фагоцитарной функции (ФЧ, ФИ) достоверно снижены. Даже введение кальциевого ионофора, повышающего внутриклеточную концентрацию ионов кальция и активацию сократительных элементов, не восстанавливает фагоцитоз, что, на наш взгляд, является доказательством того, что подавление фагоцитоза под влиянием дифтерийного токсина вызванно нарушениями в системе микротрубочек и мик-рофиламентов.

В продуктивную фазу иммуногенеза, спустя 3 суток с момента контакта макрофагов с антигеном, вновь "включаются" аденилатцик-лазные механизмы, о чем свидетельствуют данные Андреевой И.И. (1990). Однозначно утверждать, что это является детерминированным признаком не представляется возможным, поскольку в данном исследовании использовали коклюшный антиген, содержащий коклюшный токсин.

Создается впечатление, что этот срок является переходным от одного функционального состояния макрофагов к другому и этот период, вероятно, обусловлен повышением активности аденилатциклаэы и возрастанием внутриклеточной концентрации цАМФ. Вероятно, это является результатом действия на макрофаги одного ив эндогенных иммуномодуляторов, реализующего свои эффекты через аденилатцик-лазный механизм.

Несмотря на понижение способности продуцировать АФК, макрофаги приобретают особенность которая делает их похожими на поли-морфноядерные лейкоциты - способность активировать и секретиро-вать миелопероксидазу при контакте с опсонизированным зимозаном, т.е. посредством рецептор-опосредованного инозитолфосфатного механизма активации - которая отсутствовала у макрофагов в индуктивную фазу иммуногенеза.

Вероятно, для деструкции иммунных комплексов и полной элиминации антигена недостаточно активности НАДФН-оксидазы и образования АФК, требуется образование гипогалагенитных ионов, вызывающих более "глубокую" деструкцию белковых молекул.

Кроме того, внутриклеточная утилизация АФК в этот срок такова, что повышается продукция (активация СОД) и снижается утилизация (подавление активности каталаэы) перекиси водорода, что, вероятно, создает определнный "пул" субстрата для функционирования миелопероксидазы.

Через 7 суток после введения ДТ, вероятно, под действием

макрофагактивирующих лимфоцитарных факторов (МАФ), происходит резкая активация образования АФК и гипогалогенитных ионов, увеличивается экспрессия опсониновых рецепторов.

Высокий уровень экспрессии Рс-рецепторов обеспечивает, как минимум две функции. Во-первых, благодаря Рс-рецепторам должен осуществляться захват макрофагами иммунных комплексов. Во-вторых, Рс-рецепторы обладают фосфолипазной Аг-активностью, поэтому, увеличивая высвобождение арахидоната из мембранных фосфолипидов, включают синтез простагландинов, в частности, простатландина Е2, который подавляет пролиферацию лимфоцитов, и тем самым осуществляется регуляция иммуногенеэа по принципу отрицательной обратной связи.

Вместе с тем, продолжают проявляться токсические эффекты ДТ, выражающиеся е подавлении фагоцитарной реакции и синтеза моноки-

ное.

Таким образом, в индуктивную фазу антителогенеза под действием дифтерийного токсина возникают существенные биохимические изменения, обусловленные многогранностью токсического действия дифтерийного токсина.

В течение первых суток происходит нарушение процесса передачи сигнала с мембранных рецепторов макрофагов, связанное с выключением кальциевых механизмов активации, что приводит к значительному подавлениею продукции АФК и разнонаправленному изменению активности антиоксидантных ферментов.

Эта биохимическая перестройка обуславливает существенное подавление экспрессии СЗЬ- и Рс-рецепторов, значительное снижение фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса, неадекватно кратковременное усиление синтеза ИЛ-1, отсутствие индукции синтеза ФНОа.

Это вызывает подавление фагоцитоза, процессинга дифтерийного токсина и презентации антигенных детерминант дифтерийного токсина, что приводит к нарушению активации специфических клонов лимфоцитов.

Следствием этих нарушений является формирование иммунологической толерантности по макрофагальному типу, что приводит, как установлено нами, к подавлению синтеза антител в продуктивную фазу иммуногенеза верифицированному практическим отсутствием специфических антитоксических антител.

ВЫВОДЫ:

1. Экзотоксин С.<Ир1"ЛЬег1ае в дозе, вызывающей развитие иммунологической толерантности, подавляет продукцию перитонеальныыи макрофагами АФК и их биоцидных метаболитов в первые часы и через 3-е суток с последующей активацией через 24 часа и 7 суток после его введения.

2. В перитонеальных макрофагах при введении дифтерийного токсина наблюдаются разнонаправленные изменения активности взаи-мосвязанних антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза- ката-лаза; глутатионпероксидаза- глутатионредуктаза).

3. Дифтерийный токсин влияет на уровень экспрессии СЗЬ- и Кз-рецепторов, уменьшая их количество в течение 1-го часа и на 3-е сутки после введения.

4. Дифтерийный токсин вызывает резкое угнетение показателей фагоцитарной функции - Фй и ФЧ, сопровождающееся отсутствием стимуляции кальциевым ионофором А 23187.

5. Дифторийшй токсин вызывает кратковременное повышение синтеза ИЛ-1 в течение первых 60-ти минут после введения, сменяющееся выраженным угнетением синтеза монокинов (ИЛ-1, ФНОа) в последующие сроки дифтерийной интоксикации.

6. Механизм токсического действия дифтерийного токсина на перитонеальные макрофаги связан с нарушением трансмембранной передачи сигнала и потерей чувствительности внутриклеточных регуляторов к ионам Са2+.

7. Нарушение выработки активных форм кислорода, монокинпро-дукции, рецепторного аппарата, фагоцитоза, приводит к формированию иммунологической толерантности по макрофагальному типу, верифицированной отсутствием синтеза специфических антитоксических антител.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TBE ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние бактериальных экзотоксинов на адгезию и миграцию перитонеальных макрофагов // В мат. 51-й научн. конф. студентов, молодых ученых и специалистов РГМУ. - Ростов-на-Дону 1997.

- С. 106.

2. Влияние бактериальных экзотоксинов на показатели фагоцитоза перитонеальных макрофагов // В мат. 51-й научн. конф. студентов, молодых ученых и специалистов РГМУ. - Ростов-на-Дону 1997.

- С. 106.

3. Влияние бактериальных токсинов на свободнорадикадьные процессы in vivo и in vitro // В мат. VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М. -1997.

- ТЛ,С. 254.

4. Показатели про- и антиоксидантпых систем перитонеальных макрофагов в динамике дифтерийной интоксикации //В мат. II научн. оесси РГМУ. - Ростов-на-Дону, 1998. - С.

5. Влияние дифтерийного токсина на функциональную активность перитонеальных макрофагов //В мат. II научн. сессии РГМУ.

- Ростов-на-Дону, 1998. - С.

6. Влияние дифтерийного токсина на активность антиоксидант-ных ферментов и генерацию активных форм кислорода // В мат.52-й научн. конф. студентов,молодых ученых и специалистов РГМУ. -1998. - С. 14.

7. Влияние дифтерийного токсина на рецепторный аппарат и фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов //В мат. 52-й научн. конф. студентов,молодых ученых и специалистов РГМУ.

- 1998. - С. 14.

8. Effect of bacterial exotoxins on functional activity of peritoneal macrophages // In 4-th Intern. Sympo. on clinical immunology. Amsterdam . - 1997. - P. 19 - 22.