Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клинико-лабораторное изучение действия дифтерийного токсина на интерфероногенез в условиях сочетанного вирусно-бактериального (дифтерийного) процесса

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Клинико-лабораторное изучение действия дифтерийного токсина на интерфероногенез в условиях сочетанного вирусно-бактериального (дифтерийного) процесса"

■ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ДЕТСКИХ ИНФЕКЦИЙ

РГЯ од

1?..ДЫИ996

На правах рукописи

МАРКИНА Ольга Александровна

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА НА ИНТЕРКРОНОГЕНЕЗ В УСЛОВИЯХ СОЧЕТАШЮГО ВИРУСНО-БАКГЕРИАЛЬНОГО (ДИФТЕРИЙНОГО) ПРОЦЕССА

03.00.06 - вирусология

Автореферат' диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте

детских инфекций Директор института - доктор медицинских наук, профессор Иванова В.В.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Аксенов O.A. доктор медицинских наук, профессор Швалко А.Д.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Исполатова A.B. доктор медицинских наук Яковлева Н.В.

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера

Защита состоится " " _ 1996г.

в " " часов на заседании Диссертационного совета Д.001.46.01 НИИ гриппа РУЛИ (197022, Санкт-Петербург, уд.проф.Попова, 15/17).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИ гриппа РАМН

Автореферат разослан " "_ 1996г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Покровская Е.Е.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В последние годы в России создалась ситуация, характеризующаяся повышением заболеваемооти дифтерией, Основным объяснением этого факта считается резкое увеличение числа непривитых или неправильно иммунизированных против дифтерии детей (Иванова В.В. и соавт.,1995). В то же время известно, что среди детей наблюдается значительное число вкусно-бактериальных ассоциаций, часто отягощающих течение заболевания у ребенка (Пискарева H.A., 1975; Ляшенко Ю.И., Иванов А.И., 1989; Цинзерлинг A.B. и соавт.,1991).

В литературе имеются сведения о сочетании'Гриппа со стафилококковой, пневмококковой, ыенингококковсй, клебсиелезной инфекциями (Мельникова В.Ф.,1975; Байжорматов М.С., 1S89; Коро-линская A.B., 1981; Мурина Е.А.,1988; Барштейн Ю.А., 1988). Во всех этих случаях грипп предшествовал развитию бактериального процесса и утяжелял, его. Гриппозная инфекция, как показано Алексеевой О.И. и соавт. (1980), также отягощала течение коклюша.

В отношении дифтерии, в доступной нам литературе, есть данные о сочетании ее о бактериальными инфекциями, в частности со стафилококковой и стрептококковой ангинаш (Ляшенко Ю.И.,1989). Имеются также сведения о том, что грипп является одним из факторов, стимулирующих эпидемический процесс при дифтерийной инфекции (Фаворова Л.А. и соавт., 1988). Однако отсутствуют исследования по изучению патогенеза таких ассоциаций, что связано, в частности и с тем, что при серьезных научных разработках по эпидемической циркуляции гриппа в 60-80-е годы дифтерия в СССР практически не встречалась.

Изучение сочетания дифтерии с вирусными инфекциями представляет важную проблему, потому что, как известно, основной патогенный фактор Cor.diphtherias - экзотоксин - нарушает функциональное состояние клеток, связываясь с сиотемой НАД и блокируя функцию белка EF-2 - фактора элонгации синтеза белков на рибосоме (Михайлов В.В., 1994; Здановский А.Г.и соавт., 1988). В то же время большинство вирусов, особенно вирус гриппа, оказывают цитопатическоё' действие на организм, являясь одним из мощных иммуносупрессоров (Протасова С.Ф.,1996). В связи с этим интерео представляет изучение действия дифтерийного экзотоксина на репродукцию вирусов в клетке, а также на синтез ряда клеточных защитных белков - интерферонов.

Выявление патогенетических особенностей сочетанного вируо-но-дифтерийного процесса является актуальным в связи о обоснованием как профилактических, так и терапевтических мероприятий, особенно в эпидемический период.

Цель исследования. Изучить роль интерферонов и дифтерийного токсина в патогенезе реопираторно-вирусно-дифтерийной инфекции для обоснования принципов современного лечения дифтерии у детей.

Задачи исследования: 1. Разработать диагностические критерии для установления сочеганной респираторно-вирусно-дифтерий-ной инфекции у детей с различными формами дифтерии.

2. Установить частоту сочетаний локализованной и токсической форм дифтерии с ОРВИ различной этиологии и их прогностическую значимость.

3. Разработать новый метод по определению концентрации интерферона с его дифференцировкой на альфа- и гамма-типы при дифтерийной инфекции.

4. Обосновать значение системы интерферона при различных формах монодифтерии и РВДИ.

5. На основе разработанного теста для выявления в сыворотках больных дифтерией экзотоксина Cor. diphtheriae и специфического иммунного комплекса изучить их взаимоотношение при различных формах дифтерии.

6. Оценить изменение изучаемых параметров в ходе проведения специфического лечения дифтерии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На основе разработанных критериев доказано наличие смешанных респиратарно~в1фусно-дифтерийных инфекций (РВДИ), как при локализованной, так и при токсической формах дифтерии. В зависимости от эпидемической ситуации по гриппу дифтерийный процесс наслаивается:

- во время эпидемии - на грипп, вызванный эпидемическим вирусом;

- вне эпидемического времени, но в период сезонных подъемов ОРВИ - на сочетанные респираторно-вирусные инфекции;

2. Разработан новый высокочувствительный ферментный тест для определения концентрации альфа- и гамма- интерферонов по одному разведению исоледуемого материала. При монодифтерии синтез альфа-интерферона зависел от уровня токсина в крови больных, а синтез гамма-интерферона - от величины образованного

специфического иммунного комплекса. В случае РВДИ не обнаружено конкурентных взаимоотношений в продукции интерферона. Оба его типа образуются за счет совместной стимуляции вирусным возбудителем и дифтерийным экзотоксином.

3. Разработан комплекс тестов по оценке токсинемии при монодифтерийной инфекции и РВДИ, позволяющий выявлять как свободный токсин, так и ранние специфические иммунные комплексы (токсин + антитоксин). На. этой основе установлены 4 этапа инактивации токсина in vivo. В крови больных циркулируют: свободный токсин; токсин, частично инактивированный в иммунном комплексе; слабоавидный иммунный комплекс, легко распадающийся in vitro; и высокоавидный иммунный комплекс. Наблюдается разница в соотношении этих компонентов у больных с монодифтерией и РВДИ в сторону большего содержания свободного токсина и слабоавидных иммунных комплексов при смешанной инфекции.

4. Не обнаружено прямой зависимости между степенью тяжести как локализованной, так и токсической формы дифтерии и уровнем токсина в крови. Максимальные показатели токсина прослеживались при субтоксической и токсической формах 1-ой степени. У больных токсической формой 3-ей степени показатели токсина в крови достоверно снижены. В то же время отмечалась прямая корреляция между степенью токсичности и отношением в крови больных токсина к специфическому иммунному комплексу. Чем выше концентрация токсина в сыворотке крови по отношению к иммунному комплексу, тем выше и степень токсической дифтерии.

5. При РВДИ по сравнению с монодифтерией введение специфической антитоксической противодифтерийной сыворотки чаще оказывалось неэффективным по изучаемым параметрам, но в процессе гемосорбции происходило образование специфического сорбента, который элиминировал циркулирующий в крови свободный токсин.

Научная новизна работы:

1. Впервые разработаны критерии диагностики ОРВИ при дифтерийной инфекции и охарактеризована частота сочетанных реопиратор-но-вирусно-дифтерийных инфекций.

2. На основе разработанного метода количественного определения интерферона с его дифференцировкой на альфа- и гамма-типы показана способность дифтерийного экзотоксина индуцировать образование альфа-интерферона.

3. Впервые при "чистой" и сочетанной с ОРВИ дифтерии показаны различные взаимоотношения между дифтерийным токсином, иммунным комплексом и различными типами интерферонов. Синтез альфа-ИФН находится в прямой зависимости от уровня токсинемии, а гамма-ИФН -от величины вновь образованного специфического иммунного комплекса.

4. Выявлено в организме ребенка преобразование токсина из свободного состояния через этап иммунного комплекса со свободными эпитопами токсина, слайоавидного иммунного комплекса в высоко-авидный. Показаны различные отношения между этими показателями при токсической и локализованной формах дифтерии.

5. Выявлена меньшая эффективность сывороточного лечения при сочетанной с ОРВИ дифтерийной инфекции из-за предварительного расходования комплемента на ИК, состоящий из респираторных вирусов и противовирусных антител.

6. Обнаружено, что выход из межклеточных пространств в кровь изучаемых компонентов осуществляется в следующей последовательности: специфический иммунный комплекс, дифтерийный токсин; затем - противовирусные антитела и гамма-ИФН; последним выходит альфа-ИФН.

Практическая значимость работы.

1. Разработаны диагностические серологические критерии ОРВИ при сочетании о дифтерией.

2. Разработан ферментный количественный метод определения интерферона для оценки интерферонового статуса у больных дифтерией и на его основе показана необходимость использования интерферона и иммуномодулирующих препаратов при лечении дифтерии, особенно протекающей в сочетании о ОРВИ.

3. Разработаны и внедрены в лабораторную практику методы определения дифтерийного токсина и специфического иммунного комплекса в крови бальных для коррекции специфического лечения дифтерии.

Реализация результатов. Материалы диссертации использованы при оформлении 3 заявок на изобретение (И 94005362 от 25.02.94, N 95111749 от 06.07.95), методических рекомендаций "Дифтерия у детей в период плановой иммунизации и эпидемического подъема заболеваемости" (1995), "Методы определения токсинемии у детей с токсическими формами дифтерии" (1995), "Система диагностического мониторинга при различных формах вирусных инфекций" (1996), инфор-

мационного письма "Лабораторное определение токоинемии при дифтерийной инфекции" (1995).

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 15-й и 16-й итоговых научно-практических конференциях НИИДИ (1994,1995), на конференции "Микст-инфекции у детей" (1994), лабораторном обществе СПб (1095).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, 4 находятся в печати.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 169 страницах машинописного текста, включая 33 таблицы и 11 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения и списка литературы. Список литературы содержит 102 отечественные и 117 зарубежных публикаций.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Вирусы. Индикацию интерферона осуществляли с помощью вируса парагриппа (штамм Сендаи), а интерферонозую реакцию лейкоцитов -вирусом болезни Ныокастла (штамм Н). В работе также использовались антигены к вируоам гриппа A(H1N1, H3N2), В, парагриппа 1-3 типов, адено-, герпеса, микоплазме и хламидиям для постановки серологических реакций (РСК и РТГА).

Тканевые культуры. Для определения активности интерферона использовали перевиваемую культуру L-41. Клеточные культуры были получены из института гриппа РАМН.

Определение титров противовирусных антител проводили с помощью РТГА и РСК в соответствии с Методическими указаниями по лабораторным методам диагностики гриппа и других ОРЗ (1995).

Исследование интерфероногенеза у детей проводили в сыворотках крови,больных в одном разведении 1:20 в острый период заболевания и в фазе ранней реконвадесценции. Активность интерферона выявляли в разработанном нами тесте на основе способа определения интерферона методом количественной гемадсорбции (Finter N.B.,1969, Аксенов O.A., 1969).

Для усиления цветности вышедшего из гемолизированных эритроцитов морской овинки гемоглобина использовали 0,06Х-й раствор ор-тофенилендиамина (ОФД) с 37. перекисью водорода. Оценку результатов диагностики проводили спектрофотометрически на аппарате АИФ-Ц-QIC при 490 нм. Титры интерферонов рассчитывали по специ-

ально разработанной нами программе на компьютере 486 IBM с переводом в международные единицы (ME).

Кроме того, в ряде исследований определяли интерферонпроду-цирующую активность лейкоцитов больных in vitro при воздействии на них вируса болезни Ныокастла по методу Соловьева В.Д. и соавт. (1981).

Методы выявления токсина и специфического иммунного комплекса в крови больных проводили в разработанном нами комплемент-ферментном тесте, основанном на сорбции комплемента на иммунный комплекс и учету остаточного комплемента по уровню гемоглобина, вышедшего из лизированных эрмроцитов барана после внесения во все исследуемые пробы гемолитической системы (0,75% взвесь эритроцитов баранов и 10 доз гемолитической сыворотки).

При появлении гемолиза в контрольных пробах все исследуемые материалы центрифугировали, вносили 0,06%-й раствор ортофени-лендиамина с 3% перекисью водорода и производили учет реакции на аппарате "Abbott" при длине волны 692 нм. Контролями в данном методе служили : сыворотка больного без антитоксической сыворотки, антитоксическая сыворотка с комплементом, комплемент в соответствующей дозе и гемолитическая система. Расчет производился по формуле:

Акт. = (А-В):В, где: Акт. - величина токсина или иммунного комплекса

А - величина экстинции в опыте (сыворотка больно-

го+антитоксическая сыворотка); В - величина экстинции в контроле (сыворотка больного) .

Показатель токсина выражался в отрицательных величинах (-) и был в пределах от 0,0 до (-1,0), а показатель иммунного комплекса - в соответствующих положительных величинах от 0,0 до (+1,0).

Метод определения общей токсичности крови (АПО) тест.

Этот метод связан с установленным нами фактом блокирования экзотоксином коринебактерии дифтерии системы оксидазных ферментов (пероксидаза, каталаза и др.). На этой основе был создан оригинальный тест определения токсинемии у больных дифтерией по способности сывороток крови блокировать экзогенно введенную перокси-дазу.

Нативные сыворотки больных в объеме 100 мкл соединялись со 100 мкл экзогенной пероксидазы и инкубировались в течение 40 минут при 37°С. Далее в пробирки добавляли 500 мкл 0,06%-ного раст-

вора ортофенилендиамина в 32.-ной перекиси водорода, реакция останавливали IN серной кислотой. Учет производился также, как и в вышеописанных способах, а токсическую активность рассчитывали по формуле:

токсичность = [М ср. -(А-В)1:М ср., где: токсичность - уровень токсинемии,

М ср. - среднее показателей активности пероксидазы в

контроле при п=5; А - показатель активности пероксидазы в опыте (сыворотка

больного + пероксидаза); В - показатель активности пероксидазы в контроле (сыворотка больного + мединал-вероналовый буфер).

Клинические материалы. В ходе работы были исследованы сыворотки крови 111 больных с локализованными формами дифтерии и 67 -с токсическими формами. У них оценивались уровни антител к респи-раторно-вирусным инфекциям; состояние интерфероногенеза; концентрации токсина и иммунного комплекса; токсин в составе циркулирующих иммунных комплексов - ЦИК, определяемый в лаборатории иммунологии НИИДЙ (эав.лаб.к.м.н. Келезникова Г.Ф.).

Математическая обработка результатов.

Использовали стандартные показатели вариационной статистики (средние значения, среднеквадратичные отклонения, критерий Сть-юдента, показатель хи-квадрат, коэффициент корреляции и др.). Основные математические величины обрабатывались по этим критериям на компьютере 486 IBM по программам STADIA и MEZ0ZAWR.

В части исследований производили математическую обработку результатов с расчетом коэффициентов отношений между величинами. Статистическая обработка их велась по аналогичным критериям.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Особенности сочетания дифтерии с ОРВИ.

Нами были разработаны специальные критерии серологической диагностики ОРВИ у больных с локализованной и токсической формой дифтерии.

Необходимость подобного рода разработки связана с тем, что при проводимых лечебных мероприятиях уровни антител к респираторным вирусам в крови вначительно изменялись и по стандартной схеме с 4-кратной сероконверсией поставить диагноз ОРВИ было невозможно.

Основной принцип диагностики заключался в суммации ряда серологических показателей и постановке комплексного диагноза. Для локализованной дифтерии такими критериями были:

- 8-кратное нарастание титра антител в парных сыворотках;

- 4-кратное увеличение титра антител класса до периода ре-конвалеоценции;

- сероконверсия в двух реакциях (РСК и РТГА);

- увеличение антител к возбудителю одной инфекции выше среднегеометрического титра антител ко воем исследуемым вирусам;

- высокий уровень альфа-интерферона (более 30 МЕ/мл).

Для токсических форм диагностика основывалась на разработке рангового показателя для ряда маркеров, характеризующих наличие респираторной инфекции. К таковым относились :

- максимальный титр противовирусных антител класса к одной из инфекций (исходный ранг +1,0 для титра 1:20, с приращением +2,0 на каждое двукратное увеличение титра);

- при наличии антител класса 1ёМ к нескольким респираторным вирусам в расчет принимали ту инфекцию, антитела к которой были больше с вышеприведенным расчетом ранга;

- сероконверсия антител класса в парных сыворотках, при этом в ранговый расчет брали не кратность оерокояверсии, а тигр антител во второй сыворотке (исходный ранг +1,0 при титре 1:10 с приращением +1,0);

- наличие сероконверсии в двух реакциях - РСК и РТГА (ранг +4,0), при отсутствии таковой - (-4,0);

- наличие стандартной схемы смены антител класса 1ёМ на 1в<3 (ранг выводился из специальной таблицы соотношения титров антител этих классов в этих сыворотках).

Наличие ОРВИ по серологическим показателям подтверждалось при суммарном ранговом показателе 8,0 и более.

Таблица 1.

Группы обследованных больных о локализованной формой дифтерии

Группы Период N Характеристика периода

1 1994 51 - подъем заболеваемости дифтерией - межэпидемический период по гриппу

2 ноябрь 1995 январь 1996 13 - заболеваемости дифтерией сохранялась - эпидемия гриппа НЗЫ2

3 ноябрь 1994 январь 1995 17 - подъем заболеваемости дифтерией - сезонный подъем заболеваемости ОРВИ

4. ноябрь 1990 январь 1991 93 - отсутствие заболеваемости дифтерией - сезонный подъем заболеваемости ОРВИ

5 1990 411 - обычные показатели заболеваемости ОРВИ

6 1995 102 - заболеваемость дифтерией сохранялась

Мы провели анализ частоты смешанной респираторно-вирус-но-дифтерийной инфекции (РВДИ), разделив обследуемых детей по группам (табл.1).

Установлено, что частота сочетания ОРВИ о локализованной формой дифтерии была в пределах 47,1 - 76,4 % в зависимости от различных периодов обследования. В межзпидемический по гриппу сезон (1-й период) частота развития РВДИ составила 47,1%. Обращали на себя внимание 2-й и 3-й периоды. Так, во 2-ом периоде (ноябрь 1995- январь 1996 гг.) сероподтверждение ОРВИ было в 61,5%, причем из них практически в 100% случаев диагностировался грипп А иди В. В то же время, в 3-ем периоде (ноябрь 1994- январь 1995 гг.) больший акцент падал на смешанные респираторные инфекции с присутствием в таких ассоциациях гриппа (суммарно - 53,7%, р<0,01). В контрольном 4-ом периоде наблюдалась стандартная схема распределения инфекций: на долю гриппа А и В выпало 41,3% случаев, инфекции негриппозной этиологии составили 19,8%, смешанные формы наблюдались в 38,4% олучаев.

Нами найдены дополнительные доказательства достоверности сочетания локализованной формы дифтерии о респираторно-вирусной инфекцией.

Во-первых, в группе больных о клиническими проявлениями респираторной инфекции лабораторный диагноз вирусного процесса был в 82,3% случаев. При отсутствии манифестно-выраженной ОРВИ атот показатель не превышал 29,3% (р<0,005).

Во-вторых/"максимальная частота сочетаний дифтерии с ОРВИ наблюдалась в ноябре и декабре 1995 года, то есть во время увеличения заболеваемости острыми респираторно-вирусными инфекциями у детей, когда она достигала 80-75%. В дальнейшем атот показатель снижался с февраля по май до 20-28,5%.

И, в-третьих, во время эпидемии гриппа (2-й период) больший процент диагностики выпадав на долю эпидемического гриппа А (H3N2)- 87,5%, а "в 12,5% была установлена сочетанная инфекция гриппа A (H1N1) и В.

обнаружено, что дифтерия наслаивалаоь на гриппозную инфекцию. В начале заболевания дифтерией при сероподтвержденном гриппе 52;1% детей уже имели титры противогриппозных антител класса IgQ, а нормальный синтез антител с переходом IgM в IgG отмечался лишь в И,IX. Это соответствовало уже текущему респираторно-вируоному процессу.

В отношении токсической дифтерии наличие респираторно-вирус-ного процесса подтверждалось в 54,5% случаев. "Чистая" дифтерия в 84,2% случаев протекала с токсичностью 1-Й-2-Й степени, и лишь в 15,3% - с токсичностью 3-й степени, в то время как при РВДИ 3-я степень токсичности развивалась у 42,8% больных (X -5,1, р<0,05). Такое утяжеление клинической картины наблюдалось в период, предшествовавший эпидемии гриппа. В период эпидемического подъема заболеваемости гриппа заболевание протекало легче и было не столь характерно по ряду клинических симптомов, что совпадало о экспериментальными данными по гриппозно-стафилококковой инфекции (Пи-гаревский В.Е., 1965; Мельникова В.Ф., 1975).

В то же время мы отметили увеличение числа случаев субтокои-ческой дифтерии в группе микст-дифтерии. По сравнению с "чистой" дифтерией, ' где наблюдался всего один больной с субтоксической дифтерией - 6,2%, при микст-инфекции таких больных было 9 - 50% (р<0,01). Нам представлялось лишь одно объяснение этому факту. Сочетание локализованной формы дифтерии с респираторно-вирусной инфекцией, видимо, 'способствовало переходу ее в субтоксическую форму.

- и -

Особенности интерфероногенеза при РВДИ

В связи с обнаруженными нами фактом сочетания дифтерии о ОРВИ, а также - с известными данными о механизме действия интерферона через систему рибосомального синтеза (Baron S., 1991), представлялось важным изучить интерфероногенез при "чистой" и оо-четанной с ОРВИ дифтерией.

Нами было выделено пять эпидемических периодов, по которым мы проводили анализ интерфероногенеза и, в дальнейшем, токсинооб-разования:

1 - ноябрь - декабрь 1994 (подъем заболеваемости дифтерией и

сезонный подъем заболеваемости ОРВИ);

2 - январь - май 1995 (отсутствие заболеваемости ОРВИ);

3 - сентябрь - октябрь 1995 (до появления эпидемии гриппа);

4 - ноябрь - декабрь 1995 (эпидемия гриппа А);

5 - январь 1996 (спад заболеваемости гриппом).

Для дополнительной оценки интерферонового статуса рассчитывали относительные коэффициенты:

- К - отношение уровня альфа-интерферона к уровню гамма-интерферона в крови больных;

- M (альфа) - отношение концентрации альфа-интерферона в крови к уровню альфа-интерферона, вырабатываемого лейкоцитами in vitro (ИРЛ-альфа);

- Q - отношение ИРЛ-альфа у больных в период реконвалесценции к ИРЛ в остром периоде.

Наши исследования показали, что у больных о "чистой" локализованной формой дифтерии экзотоксин являлся стимулятором альфа-интерферона. Так, средние концентрации альфа-интерферона были достаточно высоки во 2-й и 3-й периоды, то есть в то время, когда отсутствовало вмешательство вирусного агента, а показатель К был максимальным - 2,15 и 7,09 соответственно (табл.2).

При более детальном изучении соотношения уровней интерферона и дифтерийного токсина по КФ-тесту доказано, что в группе о умеренным содержанием токсина - (-0,16) показатели альфа-1Ш были максимальными - 28,4 МЕ/мл, а превалирование его над гамма-ИФН (К) составило 4,7. При более выооком содержании токсина концентрации интерферонов существенно снижались, хотя соотношение все же было в пользу альфа-интерферона (К-2,1).

Прослеживалась достоверная корреляция при сопоставлении "чистой" токсической и локализованной дифтерии между образованием альфа- и гамма-ИФН и наличием в крови больных свободного токсина

Таблица 2

Соотношение выработки различных типов интерферонов у. больных о локализованной формой дифтерии оотрыи период"

Периоды Концентрация интерферона (МЕ/мл) у больных в острый период

монодифтерия РВДИ

альфа- гамма- К альфа- гамма- К

1 . 2 3" 4 5 17,6+1,9 24,0+1,8 0,73 12,7*1,1* 5,ЭТО,8 2,15 14,9+1,6* 2,1*0,1 7,09 22,2+2,4* 14,7+1,6 1,51 8,4+0,9 7,4+0,8 1,13 7,3+1,5 10,5+1,5 0,69 12,2+1,3 8,0+0,9 1,52 18,5*2,1 9,5+0,6 1,94 13,8+1,4* 22,0*2,2 0,62 14,8*1,6 16,2*1,9 0,97

Е** 17,1+1,8 7,9+0,9 2,16 8,9+0,9 10,6+1,3 0,83

* - достоверное различие между показателями альфа- и гамма-интерферона (р<0,01); ** - суммарно

и специфического иммунного комплекса. Увеличению средних показателей токсина в крови при токсической дифтерии соответствовал больший уровень альфа-интерферона, равно как большие концентрации специфического иммунного комплекса, имевшие место у части больных, были связаны с большим синтезом гаша-интерферона.

При локализованной РВДИ достоверное снижение альфа-ИФН было в 1-м и 4-м периоде, когда отмечался подъем заболеваемости ОРВИ. В отношении гаша-интерферона титры его были минимальными в ыежэ-пидемический период, а существенное увеличение отмечалось при РВДИ в 4-м периоде - 22,0+2,2 МЕ/МЛ. Это подтверждало наше мнение о том, что локализованная дифтерия наслаивалась на текущий (или уже заканчивающийся) респираторно-вирусный процеоо.

В отношении токсической дифтерии наблюдалось четкое снижение уровня альфа-ИФН в острую фазу заболевания от субтоксической формы к токсической 2-й-З-й степени, в то время как гамма-ИФН увеличивался (коэффициент корреляции 0,88, р<0,05). В период реконва-лесценции эти соотношения изменялись. При 1-й степени токсичности увеличивалось относительное содержание гамма-интерферона и соответственно коэффициент К снижался до 0,55 в противоположность его значению 2,5 в острый период заболевания. При 3-й степени токсичности, наоборот, возрастала активность альфа-интерферона, практически отсутствовал интерферон гамма-типа, а коэффициент К увеличивался до 12,5 (табл.3).

Была изучена интерфероновая реакция лейкоцитов (ИРЛ). При "чистой" локализованной дифтерии в острый период средние показатели ИРЛ составили 20,2+1,9 МЕ/мл, близкие значения обнаруживались и в период реконвалеоценции - 16,9+2,0 МЕ/мл (табл.4).

Таблица 3

Соотношение выработки различных типов интерферонов у больных о токсической формой дифтерии

- Степени токсичное ти Средние концентрации интерферонов (МЕ/мл)

в острый период в период реконвалесценции

альфа- гамма- К альфа- гамма- К

субтоксическая I II III 27,4+3,2 17,6+2,1 14,571,7 15,0+1,8 9,7+1,1 7,0+0,8 11,1+1,3 34,0+5,2 2,8 2,5 1,3 0,44 26,7+3,2 6,2+0,7 18,4Т2,2 23,8+2,8 11,0+1,3 11,2+1,2 8,0+0,9 1,9+0,2 2,4 0,55 2,3 '12,5

Таблица 4

Сравнение ИРЛ у больных с локализованной формой дифтерии в различные эпидемические периоды

П Е Р И 3 Д Ы

1 2 3 4 5 Е**

м о н о д и ф ИРЛ-аль- острый период 53,7+7,6 20,5+2,8 22,8+2,5 13,1+1,4 12,5+1,5 20,2+1,9

мл) период реконв 35,7+4,2 26,9+2,4 12,3+1,6 6,4+0,7 9,7+0,9 16,9+2,0

Ч 0,66 1,31 0,53 0,48 0,77 0,83

е Р и я м острый период 0,32 0,61 0,65 1,69 0,67 0,85

период реконв 0,42 0,46 1,21 1,68 1,03 0,72

р ИРЛ-алъ- острый период 15,0+1,8 11,9+1,3 12,7+1,5 9,9+0,7 10,2+1,2 12,0+1,5*

в Д И (МЕ/ мл период реконв 17,6+1,8 17,4+2,0 22,2+2,5 8,1+0,6 12,8+1,7 17,0+1,9

Ц 1,17 1,46 1,74 0,81 1,25 1,41

М острый период . 0,48 1,02 1,45 1,39 1,45 0,74

период реконв . 0,78 0,34 0,72 2,2 1,5 0,81

* - достоверное отличие от группы монодифтерии - в периодах 1-4 й суммарно (р<0,01); ** - Е - суммарно

При РВДИ в острый период средние показатели ИРЛ среди всех обследованных больных были достоверно ниже, чем в группе детей с "чиотой" дифтерией (12,0+1,5 МЕ/мл). Особенно резким зто снижение было у больных в 4-м периоде, когда средние показатели ИРЛ составили 9,9+0,7 МЕ/мл (р<0,01). К периоду реконвалесценции уровень ИРЛ повышался до 17,0+1,9 МЕ/мл и не отличался от такового при монодифтерии.

При "чиотой"_и сочетанной о ОРВИ токсической дифтерии наблюдалось достоверное снижение ИРЛ по сравнению с такими показателями прилокализованной дифтерии - 15,8+1,2 и 13,7+1,4 МЕ/мл соответственно (р<0,05).

Таким образом, при сочетанной респираторно-вирусно-дифтерий-ной инфекции отмечено снижение выработки в организме интерферона, особенно альфа-типа, по сравнению с монодифтерией.

Некоторые особенности патогенеза локализованной и токсической дифтерии

В ходе выполнения одной из задач исследования мы сравнили уровень токсина в крови у детей с локализованной и токсической формами дифтерии, заболевших в эпидемический и межэпидемический период.

При локализованной форме концентрация токсина у больных с РВДИ в 4-м периоде была больше по сравнению с монодифтерией. Средние показатели составили соответственно (-0,31)+0,030 и (-0,11)+0,014 ОЕ (р<0,001). Уровень специфического иммунного комплекса при микст-инфекции также был выше, чем при монодифтерии -(+0,26)+0,03 и (+0,17)+0,021 0Е(р<0,01).

Во 2-м (межэпидемическом) периоде разницы в уровне токсина между "чистой" дифтерией и РВДИ не отмечалось, но специфический иммунный комплекс в данном случае был больше у больных с моноинфекцией - (+0,25)+0,03 и (+0,10)+0,012 ОЕ соответственно (р<0,001).

В группе больных о токсической дифтерией частота выявления больных с токсином в крови возрастала по мере утяжеления токсических проявлений при дифтерии, однако средний показатель токси-немии (СПТ) был наибольшим при субтоксической дифтерии- (-0,36)+0, 30 и дифтерии 1-й степени-(-0.35)+0,04. При токсической дифтерии 3-ей степени СПТ был существенно ниже-(~0,21)+0,023, Однако эти большие величины наблюдались только среди больных с наличием токсина, в целом же соотношение детей с

наличием токоина и специфического иммунного комплекса увеличивалось по мере утяжеления дифтерии о 2:8 до 5:0. Следовательно, тяжесть токсических проявлений обусловлена повышенным содержанием токсина при отсутствии или меньшей частотой образования специфического иммунного комплекса.

Представляло интерес выяснить пути образования специфического иммунного комплекса при инактивации токоина вводимыми антитоксическими антителами. Известно (Fazekas de St.Groth S., 1958, Семенов Б.Ф. и соавт., 1982, Кульберг С.Я., 1987), что образование иммунного комплекса проходит несколько этапов, включающих частичное образование комплекса со свободными участками антигена (эпи-топами), образование полного, но слабоавидного комплекса и образование высокоавидного комплекса с минимальной константой диссоциации.

При сопоставлении показателей, полученных нами в КФ-тестё с уровнем дифтерийного токсина, выявляемого при разрушении антител в иммунном комплексе - ДТ-ИК - (метод, разработанный Желеэниковой Г.Ф. и Мельниковой A.B., 1995) обнаружено четыре этапа инактивации токсина у больных. Одна группа больных (0) содержала токсин в КФТ, но он отсутствовал в ДТ-ИК; по нашим представлениям в данном случае в крови циркулировал свободный токсин, то есть еще не происходило связывания с антителами. У больных группы (I) наличие токсина в КФТ сопровождалось и наличием токсина в ДТ-ИК; в этом случае в крови циркулировал специфический иммунный комплекс со свободными эпипюпами токсина, способными связываться с антителами и комплементом. У больных группы (II) в реакции КФТ выявлялся иммунный комплекс, который содержал токсин, выявляемый в ДТ-ИК. В этом случае в крови циркулировал слабоавидный иммунный комплекс, в котором антитела и комплемент могли быть вытеснены добавлением гипериммунной АПДС. У больных группы (III) не обнаружено активности в КФ-тесте, но токсин выявлялся после разрушения антител в ДТ-ИК. В данном случае подтверждалось наличие специфического высокоавидного иммунного комплекса.

Эти четыре дифференцирующихся группы отражали этапы инактивации дифтерийного токоина у оболедуемых больных - от свободного токсина до высокоавидного иммунного комплекса (гоксин+антиток-син).

Распределение частоты этих групп для локализованной формы в острой фазе было следующим: 0 - 27,3%, I - 24,2%, II - 36,4% и III - 12,1%. Итак, видно, что наибольший процент при этой форме

дифтерии приходится на слабоавидный иммунный комплекс. Суммарно, полная инактивация токсина наблюдалась в 48,57., а свободный токсин или его эпитопы встречались в 51,5% случаев.

При токсической дифтерии распределение выглядело иначе: группа 0 - 36,4%, I - 31,S%, II - 26,6%, III - 5,3%. Полностью инактивированный токсин в этой группе был только в 31,5%, а свободный токсин или его эпитопы - 67,5% случаев. Следовательно, уже до начала лечения больные с локализованной формой дифтерии с большей частотой инактивируют токсин, чем дети с токсической формой.

При локализованной форме дифтерии мы проследили эти отношения у детей с монодифтерией и РВДИ_(рис.1). Так, свободного токсина при РВДИ было в 4,5 раза больше, чем свободных эпитопов в иммунном комплексе (40,6 и 9,2% соответственно), а при монодифтерии это соотношение было сдвинуто в сторону свободных эпитопов -0,95 (24,9 и 25,6%). Кроме того, при микст-формах обнаруживалась большая концентрация слабоавидного иммунного комплекса по сравнению о монодифтерией, где преобладал высокоавидный иммунный комплекс. Итак, даже до начала лечения обнаруживалась большая способность организма больного инактивировать токсин в условиях монодифтерии по сравнению о РВДИ.

Изменение изучаемых параметров в ходе лечения локализованной и токсической дифтерии

Изучено изменение концентраций токсина, иммунного комплекса, интерферона в процессе лечения больных о локализованной и токсической формами дифтерии.

Введение АПДС больным о локализованной формой "чистой" дифтерии приводило в течение первых 2-х часов к увеличению специфического иммунного комплекса с (+0,26)+0,029 до (+0,33)+0,032 ОЕ (р<0,01) при неизменном показателе токсинемии. При РВДИ происходило увеличение свободного токсина о (-0,21)+0,027 до (-0,41)+0,039 ОЕ одновременно со онижением величины иммунного комплекса, что отражало отсутствие эффекта от проводимого лечения.

При изучении образования интерферона при "чистой" локализованной форме дифтерии оказалось, что введение сыворотки не оказывает влияние на уровни как альфа-ИФН, так и гамма-ИФН.

При РВДИ концентрация альфа-ИФН в крови после лечения резко

ЭТАПЫ ИНАКТИВАЦИИ ТОКСИНАПРИ "ЧИСТОЙ"[ ЛОКАЛИЗОВАННОЙ ДИФТЕРИИ I

ИК(33.4%) /Г

слабоааидный ИК (16.6%)

токсин (24,4%)

элитопы (25.6%)

ЭТАПЫ ИНАКТИВАЦИИ ТОКСИНА ПРИ ЛОКАЛИЗОВАННОЙ ФОРМЕ РВДИ

ИК (20.5%)

слабоавидный ИК (29.7%)

токсин (40.6%)

эпитопы (9.2%)

Риоунок 1. Объяснение см. в тексте с.16.

снижалась с 13,8+2,0 до 6,8+0,9 МЕ/мл (р<0,01). В то же время введение сыворотки стимулировало образование гамма-ИФН, который до лечения был минимален (3,9+0,5 МЕ/мл), а после введения АПДО оказался равным 11,0+2,2 МЕ/мл (р<0,01). Это совпадало о данными Приймяги Л.С. (1972) о том, что введение чужеродного лошадиного гамма-глобулина способствует синтезу гамма-ИФН и, вероятно, обладает обратной связью со снижением выработки альфа-ИФН. Поэтому, в случае РВДИ является целесообразным введение альфа-интерферонов.

При изучении особенностей лечения больных с токсической формой дифтерии нами обнаружено следующее. Во-первых, резко снижался уровень имеющихся у больных противовирусных антител во время проведения интенсивных методов терапии - плазмафереза или гемосорб-ции.

Во-вторых, в значительной части случаев введение больным больших доз А1ЩС не приводило к снижению у них токсина, циркулирующего в крови. Он сорбировался в дальнейшем при проведении ге-мосорбции. Это отражало наши представления о том, что по аналогии о осаждением на сорбент противовирусных антител сорбировались и антитоксические противодифтерийные антитела, создавая при этом естественный иммуносорбент, связывающий свободный токсина из крови.

Установлено, что эффект от проводимой сывороточной терапии при "чистой" токсической дифтерии наблюдался в 75,ОХ, то есть с такой частотой выявлено: исчезновение токсина; образование иммунного комплекса de novo иди увеличение уже имеющегося иммунного комплекса. В 25,0% случаев сывороточная терапия по вышеуказанным маркерам эффекта не дала (рис.2).

0 другой стороны при сочетании токсической дифтерии о ОРВИ положительный эффект АВДС отмечался в 33,3% случаев, а в остальных 66,6% он отсутствовал. Наблюдалось либо увеличение токсина в крови, либо снижение иммунного комплекса, либо замена иммунного комплекса на свободный токсин. Объяснением отсутствия эффекта от сывороточной терапии при микстовых формах может быть более низкий уровень эндогенного комплемента из-за расхода его для образования иммунных комплексов вирусных возбудителей с антителами. Также играет роль снижение концентрации гамма-интерферона после введения АПДО, который стимулировал различные иммунологические реакции, включая и синтез различных белков, участвующих в образовании иммунного комплекса, в том числе и комплемента.

¡¡ИЗМЕНЕНИЕ КФТ ПРИ СЫВОРОТОЧНОЙ ТЕРАПИИI ! " ЧИСТОЙ "ТОКСИЧЕСКОЙ ДИФТЕРИИ !

-30 -40 -20 О 20

показатели КФТ (х100)

40

5С

О 10 20 30 показатели КФТ (х10С)

I 5^3 КфТ лоопвлвчения ' | КФТдолеиемия

Рисунок 2. Объяснение см. в тексте с. 18

ВЫВОДЫ

1. Разработаны диагностические критерии для установления сочетания дифтерии с респираторно-вирусной инфекцией, отличающиеся для токсической формы дифтерии тем, что проводится расчет рангового показателя, включающего отепень замены антител класса на 1В0, уровень антител класса к подтверждаемой инфекции, а также наличие высоких концентраций альфа-интерферона.

2. Установлена высокая частота сочетания локализованной и токсической формы дифтерии о острыми реопираторно-вирусными инфекциями. В эпидемический по гриппу период обе формы дифтерии овяааны с гриппом А, в межапидемический период во время сезонного подъема ОРВИ локализованная дифтерия наслаивается на смешанные респираторно-вирусные инфекции.

3. Показано утяжеление клинической картины как локализованной, тач и токсической формы дифтерии при сочетании с ОРВИ (в межапидемический период). Во время эпидемического подъема гриппа клиничеокая картина респираторно-вирусно-дифтерийной инфекции иная и характеризуется по сравнению с монодифтерией уменьшением отека и появлением нетипичных для дифтерии налетов.

4. Выявлены высокие концентрации альфа-интерферона, индуктором которого является дифтерийный токсин в острой фазе монодифтерии. Гамма-интерферон в крови больных коррелирует с концентрацией специфического иммунного комплекса. При сочетанной респиратор-но-вирусно-дифтерийной инфекции интерферон вырабатывается под воздействием двух отимулов: вируоа и токсина. Сочетание дифтерии о ОРВИ наблюдается на фоне резкого снижения интерфероновой реакции лейкоцитов.

5. Обнаружено, что степень токсичности не находится в прямой зависимости от концентрации токсина в крови, а коррелирует с частотой появления и уровнем специфического иммунного комплекса. В ходе заболевания выявлено преобразование токсина из свободного состояния через этап иммунного комплекса со свободными апитопаыи токсина и слабоавидного иммунного комплекса в высокоавццный. Показана задержка инактивации токсина по этим этапам при токсической форме дифтерии и локализованной, сочетающейся о гриппом или ОРВИ.

6. Установлено, что специфическое лечение антитоксической противодифтерийной сывороткой (АПДС) в случае респирагорно-вирус-ко-дифтерийной инфекции в 65,6% окааывалось неэффективным по определяемым нами параметрам образования токсина и иммунного комплекса, что связано со снижением уровня комплемента в ходе вирусного инфекционного процесса.

7. Показаны различные пути удаления токсина из крови больного при лечении токсической дифтерии. В одном случае введение АПДС непосредственно снижает уровень токсина. В другом - при последовательном проведении сывороточной терапии и гемосорбции токсин удаляется из организма, связываясь с антитоксическими антителами, сорбированными естественным путем на сорбент после введения АДДС.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Заявка N 94005362 от 25.02.94 г. Способ лабораторной диагностики дифтерийной инфекции у детей (соавт.: Аксенов O.A., Си-земов А.Н.).

2. Маркина O.A., Аксенов O.A. "Определение экзотоксина кори-небактерии дифтерии в крови детей при токсических формах заболевания. //Детские инфекции/ Сб.науч.тр.ЮВДИ.- Санкт-Петербург, 1994.- вып.4. - С.72-77.

3. Иванова В.В., Сиземов А.Н., Аксенов O.A., Кветная A.C., Волкова М.О., Маркина O.A., Тихомирова 0.В. Клинико-лабораторные особенности сочетанных форм дифтерии у детей.//Микст-инфекции у детей /Материалы Межрегиональной научно-практической конференции НИИЦИ, Санкт-Петербург, 25-27 октября 1994.- Москва, 1995. - ч.1 - С. 57-68.

4. Аксенов O.A., Маркина O.A., Сиземов А.Н. Новые принципы диагностики токсинемии у детей, больных современными формами дифтерии.// Новые технологии в педиатрии / Материалы конгресса педиатров России, 19-21.04.1995. - С.84-85.

5. Иванова В.В., Сиземов А.Н., Швадко А.Д., Аксенов O.A., Кветная A.C., Железникова Г.Ф., Волкова М.О., Тихомирова 0.В., Сергеев H.A., Маркина O.A., Кошиль EiM., Чупрак В.В., Вознюк Т.И.

Дифтерия у детей на этапе эпидемического подъема заболеваемости.// Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 1995. - N4. - С.35-39.

6. Аксенов O.A., Маркина O.A. Образование различных типов интерферонов при дифтерийной инфекции. //Идеи Пастера в борьбе о инфекциями /Материалы Международного симпозиума, посвященного году Пастера 6-10 июня 1995.- Спб,1995. - С.4.

7. Заявка N 95111749 от 6.07.95 г. Способ определения интерферона в крови детей (соавт.: Аксенов O.A.).

8. Аксенов O.A., Осшхова З.А., Мурина Е.А., Маркина O.A., Курбатова Г.П., Мукомолова А.Л. Сочетанные вирусно-вирусные и ви-русно-бактериальные инфекции у детей // Акт.вопр.клин.,леч. проф. инф. забоя, детей / Сб.науч,тр.СПбША,1996.-С.30-34.