Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Комплексная система лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Комплексная система лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции"

РГВ йоссийская академия медицинских наук

* и наЧ«но-исследовлтельский институт вакцин

И СЫВОРОТОК имени И.И. МЕЧНИКОВА

Л.ШД41__—_____

На правах рукописи

МАЗУРОВА Изабелла Кокстактиновк?.

КОМПЛЕКСНАЯ СИСТЕМА ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И НАБЛЮДЕНИЯ ЗА ВОЗБУДИТЕЛЕМ ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

03.00.07-кихрсбиологкя

диссертация в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Мос:ва 1993

Работа выполнена в Московском нзучио-ксследогаге.лъсхсм ¡жституте эпидемиологии и микробиологии и\:еии Г.Н.Ггбрччевсксго Российского Государственного Комитета Саюпг<цна£30ра

-доктор медицина их наук, стлршмй научны": сотрудпжс А-П.БАТУРО

-доктор медицилсз1х наук, профессор Н.Н-КОСТЮКОВА

-доктор бяалзшжстшх наух, старший кауч;:ын сспрудияк Е.А.ШМЕЛЕВА

3 едущая организация: Гссударггзеннкй щ:ггг.пуг сичагртимцгл и контроля медицинских биологических иргпсрыгБ имен:-. Л.А.Тарзс&шча.

Защита сссгеатсд'^/^" ^ 19Э2г. Ж' пасоь и"

заседании спаюаякзир паяного ссэтг /[001.2S.01 при Каугао-исследонателъсхсы институте вакцмя и ашдотск имени ИЛ*-Меч;в:ксга Российской Акгдеаик и-щицансгих наук со адресу: 103054,Мосхва, пгр.Мвчкикова,5г.

С диссертаздгй ыохко ознакомиться г библиотеке Научно-иссладоватгльскато института вакцин и сывороток Кмсни К.И.Мечникова Российской Акадоши медициной« наук.

Официальные оппоненты:

Автореферат разослан

1993г.

Ученый секретарь спешдонзирсзакиого созета кандидат медицинских наук

Н.Г.Кудрязцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИК РАБОТЫ

АКТУАЛ»НОСТЬ ПРОБЛМЫ: Проблемы, связанные с дифтерийной инфекцией, продолжают оставаться актуальнкми и в настоящее время. Мингглалып.'е показатели заболеваемости (ПЗ)дифтерией в нашей стране зарегистрировали в 1975 г. В настоящее время в 1990 г. регистрируется ГО - 0.82, в 1991 г.- 1.26 и в 1932 г.- больше 2. Увеличивается абсолютное число погибши от дифтерии.

Еелыпое количество неинмунизированных как среда взросли, так и среди детей, создает опасную ситуацию - при встрече с возбудителем дифтерии возможно возникновение заболевания, тем более, что распространение возбудателя дифтерии можзт происходить "скрыто" при многочисленных транспортных связях и миграции населения (Ковалёва Е.П., и др.,1532; Маркина С.С. и да..,1985).

Эпидешологачсский надзор за дифтерией предполагает изучение заболеваемости не данной уерркторш! в дкнашке, наблюдение за иммунологический статусов ргзлгопп возрастных групп населения, контроль за циркуляцией ьсзбудителя среда населения и изучение его биологических свойств с польн» установления пряэдн распространения заболевания и составления прогноза, раннее выявление больных в очага шййшки как тутчнич о екни, так и лзбераторигаги методами (Фаворо-ва'и др'., 1931).

Эффективное осуществление таглй прогрзхдщ возможно только при, хороао отработанное католической основе. Используемые ::е методы бактериологических наследований для выявлеЕия возбудителя дифтерии не вполне отвечаю! современная трэбовашям к быстроте анзлиза, на-декяоста, сстецпф^шости и чузстттгльпости, они ооладакт радом неудобств,. к, что'сз\ое зашюе, иало ггигодин при массовых обследованиях в очагах пнфзкции. Повтому разработка методов ускоренной .г-боратеркай диагностика при дифтерийной инфекции остается актуально*.

При 'ресзнии этих вопросов ны и сводами из того, что значительнее перегяектавы онергаает развитие молекулярно- биологической нау-:си, биотехнологии, з:х.:упох1г.(а.

Данная работа щ-гдетавляет собой комплекс многолетних исследований, предпринятых ти-уш по изучению биологических свойств С.сИрЬ-Шзг1ае, щгркулиружокх на территории Россгмской Федерации, характеристике ыолэкулярно- генетических особенностей развития и форстро-

вания популяции возбудителя инфекции, взаимодействия его (возбудителя) с ыакрооргаяизмом.

ЦЕПЬ РАБОТЫ: На основе иымушшашчеяап и молекулярно- биологических методов разработать комплексную систему ускоренной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерии, направленных на повышение еффективностя дашиостики и эпидемиологического надзора в борьбе с дифтерийной инфекцией. Получить новые сведения о биологических свойствах СогупеЬа^его.ш сИрМИетчие, циркулирующих на современном этапе, для понимания механизмов их взаимодействия с макрооргазизыад.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: 1. У совершенствовать бактериологическую диагностику дифтерийЕСй инфекции, разработать ускоренные метода диагностики - коагглотинация (КОД), реакция непрям ой гемагглашгаа-' ции (РНГА), ишунофешентный анализ (ИФА) для выявления дифтерийного токсина- Определить использование методов в системе лабораторной диагностики и аттилчадзора.

2.Разработать новую элективную питательную среду для выделения С.сИрЫ&ей-ае и жидкую бульонную среду для их культивирования при определении токсигенныг свойств.

3.Разработать метод ДНК-ДНК гибридизации (вариант- спот) для выявления дифтерийного ^х+-гена или его фрагментов, и оценить возможность применения их в диагностике и наблюдении за возбудителем дифтерии.

4.Изучить биологические свойства С.сИрМЬегХае, циркулирующих на различных территориях и выделенных от больных дифтерией и бактерионосителей с 1984 по 1991 гг.; оценить значимость в тих свойств в эпидемиологии дифтерии.

5.Изучить на экспериментальном и клиническом материале механизмы взаимодействия возбудителя дифтерии и хозяина путем исследования ультра-, антигенной структуры, биологических свойств С.й1рМЬег1ае и иммунологического ответа макрэоргавизма при кратковременном и длительной пгрсистировании возбудителя.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА: Впервые разработан и теоретически обоснован целостный методологический подход в диагностике и наблюдении за возбудителем дифтерии.

Показано, что ускоренные метода диагностики (РНГА, ИФА, спот-гибридазация) на принципиально новом уровне позволяет осуществлять диагностику возбудителя - по выявлению токсина, либо гох+-гена или

его фрагментов. Впервые отработана новая технологическая схема исследования с использованием ускоренных методов диагностики, при которой в ряде случаев опускаются этапы выделения чистых культур.

Высокая чувствительность и специфичность методов, достигнутые использованием высохсочипешшх антител в РИГА и ионоклональных антител к СООН-концевой части В-фрагмента молекулы дифтерийного токсина в ИФА, определяют возможности выявления штаммов C.diphthe-riae с низкой продукцией токсина, не идонткггщируеных традиционным способом в реакции преципитации в агаре, такке позволяют характеризовать продукции токсина каждого штагзда С . diphtherias в любом очаге инфекции.

На способ выявления токсигенных штаммов C.diphtheriae (спот--гибулдазация) получено авторское свидетельство (Ио ¡С16991 от 1.09. 1990 г.). Использование этого метода с ДНК- зондами, комплементарными tox+-reny дифтерийного токснна (tox АВ') и его срагаентак (tox А' и tox В1), позволило выявить нетокснганные итамкн С.diphtherias,

j-

не сущие tox -ген или его фрагменты без их экспрессии, а такзге ток-сигелные шгагош C.ulphtherica с дефектным tox+-rsHcu.

Новые данные при изучении широкого спектра биологических свойств штежоз, ультра-« гншгенно* и генехзчесгс?® структур, поз-Ер.щлл оценить роль этих свойств как в формировании популяции возбудителя, так и з егмдгшгчееком ь зефелмонком процессах. Впервые показано, что антабактарпалыше антигззн опоедэл^гст смену биоваров ¡шрхулирухщих штампов С.diphtherias, степень аируленгаоети которых uosev определять тс--;знпе шшдгмнчес кого н ннфежщозЕого процессов. Впэргие появилась есзксовость изучения ннграпях tox+-reHa или его (Йрзгаэнгов (ДНК-ДНИ гиб'^д>гзаш1я) :: стеденЕ токсгшообраговгяия (вирулентности) шгаыиов C.diphth&riae in vivro (в Шl и РИГА), что создает предпосылок для прогшезировгння распространения впздеми-чески опасных атасов и появления очагов с циркуляцией дтадюз в«сокой стелена вирулентности.

Впервые ещрзделены структуры, ответственные за агглютинации к пцшшгнвге бактер^альпоЯ клетки к егштелпм слизистых еходенх ворст внфекции.

Показана роль некоторых факторов тшунихота (сывороточных и секреторных IgA, специфических антитоксически IgA-антнтел) в защите макрооргакизна от дмтелького персистирования С.diphtheriaе. Низкие показатели IgA в сыворотке крови, SIgA и IgA - ъ слюне сни-

жают барьерные.функции организма.

Изучение изотипическта антител в ИФА позволяет проследить за динамикой 1ёА- антител и выявить группу "риска" по заболевании прибитых детей'. Лечение бактерионосителей антибиотиками является толу-нопатогеяетически необоснованным, что требует иного подхода к этому вопросу.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ: 1 .Усовершенствованные методики бактериологической диагностики, основанные на применении новых питательных сред, кровезаменителей, изменение организации, тактики или техники проведения исследования, ускоряют сроки выдачи результатов анализа, упрощают бактериологическую диагностику и создают предпосылки для сневения как заболеваемости, так и летальности при дифтерийное инфекции (Методические рекомендации, изданные МЗ РСФСР,> 1980; методические указания в приказах Ыо 575 МЗ РСФСР, 1982; Ко 450 МЗ СССР, 1986; методические рекомендации, изданные МЗ СССР, 1988; служебные письма МЗ РСФСР).

2.Разработаны антительный диагностикум для РЯГА и тест- система ИФА для выявления дифтерийного токсина, позволившие на 1-3 дня сократить сроки выдачи ответа и провести ранние мероприятия в очаге дифтерийной инфекции и в клинике (НГД на диагностикум вритроцитарный, дифтерийный, антительный, жидкий, для определения токсина в РИГА, ВФС-42 270 ВС-90, утв. МЗ СССР от 17.12.1990; НТД на тест- систему "Дифтерия- Моиозны" Но 90-87, утв. Минмедбиопромом СССР, 1987г.).

3.Изучена и апробирована новая технологическая схема диагностики с использованием ускоренных методов (ИФА, РИГА, КОА), что упрощает проведение исследований, снижает их стоимость и делает доступными для лабораторий любого уровня. Методы ИФА и РИГА позволяют оценить степень токсиаообразозгния штаммов, выделяемых на.определенной территории, без привлечения трудоемких биологических методов на животных для характеристики очагов дифтерийной инфекции (Методические рекомендации, изданные МЗ РСФСР, 1991).

4.Методом слог- гибридизации, ИФА и РИГА возможно подтверздение принадлезшоетя штамма к вирулентному (по наличию 1;ох+-гена или токсина) при сниженной продукции токсина и при отрицательном результате в традиционной пробе на токсигенность.

Нахоздение 1.ох+-гена или его фрагментов у нетоксигенных штаммов может сигаализировать о формировании на данной территории епи-демически опасных штаммов. Разработанный набор ДНК- зондов ^ох

AB', tox A', tox В') позволяет проследить за миграцией toxT-reHa и его фрагментов на территории РФ. (Авторское свидетельство, 1990; написана НТД для депонирования штаммов E.coli С600 r~m~ (рАВС 124 tos АВ'), E.ooli СбОО т'тп' (pAZ 219 tox А1), E.coli СбОО т'пГ (pSS 6 tox В"), являющихся продуцентами специфических ДНК- зондов, апробация проведена в НИИ профилактической токсикологии и дезинфекции Госкомопкднадзора РФ з 1993 г).

5.Новые данные яра изучении цикличности распространения биовариантов gravis и mitic С.diphtheriaе, их вирулентных свойств (степени токспкос'разопадия) характеризуют эпидеютесютй процесс и могут иметь пр'лшостЕчзскоа значение. Более 6000 стаммоз С.diphtherias, циркулфузедях на различных территориях РФ, собранных и изученных в различные периоды борьбы с дифтерией, составляет коллекцию Лаборатории диагностики дифтерийной инфекции ШИИЗМ ш. Г.Н.Габричевского.

6.Разработанный КФА для оценки антитоксического кшунитета выявляет лзотипические антитоксические аЕтктэла в сыворотке крови, которые более паяно характеризуют особенности иммунного ответа у больных дифтерией и бактерионосителей, чем определение суммарных антител в FIFA или методов Иенсене.

7.ДЕСсертагсюЕп:ая ра5ота выполнена е ржках Всесоюзной л республиканский целевой программы "Дифтерия" (утверадсвэ МЗ СССР 24.10.83.) по разделу I - "Эпидемиологический надзор за дяфгегийпой инфекцией" и по разделу II - "Изученье биологии возбудителя и усовершенствование лабораторной даьгностгии дифтерии" (1982 - 19S0). Всетени, проводаше о 1978 г. к в пределах целевой поограимы, осуществлялись Под руководством автора я при непосрадсгаэнном участки в выполнении (ответстгзншлй исполштаелъ).

Ocr.c^zne экспериментальные результаты, представльяные в диссертации, получены лично автором. Исследования проводились также в соавторстве с сотрудтахямц HJKSM им. Л.Еастера (С.-Петербург), 1ЩММБС км. и.И.Мечникова (?.ОД1)Г Института веруеологси кн. Д.И.Иванов езеого, ВКИЕГеиеттша, лабораторий шзаднадзора за дифтерией, бяо-еми, питательных ерзд, фжзико- етд1чес:жх методов исследования, зелитгсеата отделом 1.ШИ!ВМ ж.:. Г.Н.Габричевского, а также с сотрудникамч лаборатории диагностики дифтерийной инфекции, работающими под руководством диссертанта.

0СН08ШЕ ПОЛОСИЗЖЯ. ОНООЙИЕ НА ЗЩП7:

1. Разработаны методы ускоренной диагностики, выявляющие возбудителя дифтерии со токсину или tox+-reHy. Чувствительность и специфичность КОА, РИГА, ИФА, ДНК-ДНК гибридизации, питательная среда для-первичного посева материала, ускоренная технологическая схема лабораторного исследования обеспечивают повышение эффективности диагностики. Эти методы позволяют проводить наблюдение за возбудителем дифтерии, циркулирующим в настоящее время в очагах дифтерийной инфекции.

2. Популяция C.diphtheriae гетерогенна по антигенному, генетическому составу, по степени экспрессии tox+-reEa; новые знания о биологических Свойствах служат более полному пониманию эволюционно закрепленных саморегулирующихся механизмов циркуляции и формирования' популяции возбудителя дифтерии.

3. Выявленные поверхностные структуры (экстрацеллюлярный материал) у С.diphtherias обеспечивают когезию клеток (агглютинацию) и адгезию на эритроцитах in vitro. ЗЩ-2 оказался ответственным за агглютинацию клеток, сроки его образования коррелировали с адгезивной активностью штаммов, что свидетельствует об ответственности этих структур за прилипание бактериальных клеток к эпителию при колонизации слизистых ротоглотки C.diphtheriae.

4. При дифтерийной инфекции низкие показатели IgA в сыворотках крови и SIgA, IgA -в слюне указывают на сниженную барьерную функцию организма, а такке на роль IgA- системы в патогенезе носительства.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета "Микробиология, эпидемиология, клиника инфекционных заболеваний" МНШЭМ им. Г.Н. Габричевского 12.04.93. (протокол Ко 1 ). Основные положения диссертационной работы доласены: на Всесоюзных и Всероссийских съездах научного общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов, Пленумах и пленарных заседаниях ВОЭМП (гг. Калининград, 1975; Ульяновск, 1977; Волгоград, 1978; Краснодар, 1985; Нальчик, 1386; Алма-Ата, 1989; Н.-Новгород, 1991; Москва, Московское отделение, 1993); на проблемных комиссиях "Микробиология" АМН СССР (гг. Махачкала, 1986; Суздаль, 1988); на рабочих совещаниях - по республиканской программе "Дифтерия", Москва, 1985; по расширенной программе иммунизации ВОЗ, г. Копенгаген, 1986; по состоянию заболеваемости дифтерией, Москва,' Госкомсанэпиднадзор, 1992; на выездных Союзных совещаниях - гг. Кишинев1987; Таллин,

1987, Баку, 19S7; на Республиканской научной конференции "Современное состояние проблемы дифтерийной инфекции", Москва, 19S8; на научных конференциях МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского - юбилейной, 1989, итоговых - 1982, 1985, 1990; на юбилейной конференции • НИИЭМ им. Л. Пзстера, С.- Петербург, 1993; научно- практических конференциях в г. Владк-щрс, 19R8, в г. Новгороде, 1988, в г. Туле, 1989; международной конференции "Дифтерия", г. С.- Петербург, 1993.

ПУБЛИКАЦИИ'ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 51 работа- все в центральной печати, 1 евторскге свидетельство, 5 рацпредложений, б методических рекомендаций и указаний.

ВНЕДРЕНИЕ В ГРАХТМКУ. 1. Методические рекомендации "Бактериологические исследования при дифтерийной инфекции" Утв. КЗ РСФСР, 1980 г. (соэиэстно с Бочковой В.А., Сальниковой Г.П.).

2. Методзмесме рекомендации по приготовлению к использованию агл:-попептпда с зсгеклгам сроком годности, утв. кг Ученом совете • МНИИЭМ им. I .Н. Ггбрпчевского, 19В2 г., опубликованы в приказе ИЗ РСФСР No 575 от 09.1922 г. Апробировании в Московской, Ленинградской, Куйбышевской соластях, Красноярском Къае, Уагадансхой области и др. (Созлзстно с.Маргулис К.Л., Бочковой В.А., Головиной В.В. и др.).

3. Методическая р;:ссмендтгй1 "Бактериологические исследования при дафтерзсйжй птплокекие Но 3 в аргсазе Ко 575 МЗ РСФСР; 1SS2 г. (Соагеоч-во с Вочкссой.В.А., Сгльксадвгй Г.П. к др.).

Методические указания по ба::тсрчолотзской и серологической индикации возбудителя дифтерии ь его токсина - приложение Но 4 к Иракезу Но 450 МЗ РС5СГ, 19С6 г.(Совместно с Сальниковой Г.П., Ксм-баровей С.Ю. и др.).

5. КТД на /сст— систему .гллупоферчентную ковоклональиуга, для определения дифтерийного токсина "Дифмрия- Мэнозигл", ЭПР Ко 90-87, Утв. *иимэдйюпроы СССР, 1987 г. (ccHiecïHO со Ситридовнч В.В., Зайцева E.H.,"Луговой А.З., Дельвигом A.A. и др.). 6„ Ш'Ц на дчытостакум эр^троцйтарпый. антительный, зкидкий, для определения гокетпи б ESTA. ESC-/? 270 ВС--90, утв. МЗ РСФСР, 1990г. (сой.'.эотно с йзбрунс?* A.B.. Баргиковсй Л.Н. и др.). 7. ЧетодЕчеияе реко«?кцац1Ш по лрэ'.ерепото нод^п&роваЕЛОй среды Пизу и кн^каторзс: оумагспс: дисков для иденгицгкхции, биохнмичес-кого тютгровенчя определения токскгенноста дифтерийных микробов, утв. МЗ PCiCP-1988 (совместно с Фельдман Ю.М., Махакевой Л.Г. и др.).

8. Методические рекомендации "Индикация дифтерийного токсина методами иммуноаферыентного анализа и РИГА (Совершенствование лабораторной диагностики дифтерийной инфекции), утв. МЗ РСФСР, 1991 г. (совместно ;с Потемкиной Е.Е., Конбарсвой С.Ю., Кебруном Л.Б. и др).

9. Служебные письма и приказы о неудовлетворительном состоянии бактериологической диагностики, лечебно- профилактических противодифтерийных мероприятий в впидаадзоре по МЗ РСФСР и по областям - Владимирская, Пензенская, Красноярскому Краю, и др. (1981, 1903, 1984, 1986, 1987 гг.).

10. Программа Курсов информации и стажировки бактериологов по диагностике дифтерийной инфекции, каждые 2 года, утв. МЗ РСФСР (1984, 1986, 1988 гг.). Проведено за последние 10 лег более 50 семинаров на территориях бывшего СССР для практических бактериологов, более1 40 лекций на кафедрах- микробиологии, эпидемиологии, иврекционша болезней ЦИУ, Медицинской Академии и др.).

МАТЕРИАЛ) И МЕТОДЫ

Референе- штаммы C.dlphtheriae PW-8, No 665 и др. серологические варианты C.dlphtheriae, и других видов - C.ilavidtim, C.diphthe-roides, С.xerosis, C.holmanni получены в ГйСК им. Л.А. Тарасевича. Изогенные штаммы - от Крыловой Ы.Д., Солодовниховой A.B., продуценты дифтерийных бактериофагов - от Маркиной С.С. Около 6000 штаммов C.dlphtheriae собраны с 53 территориальных зон РФ с 1980 по 1992 гг. Основными районами, за которыми велось длительное наблюдение, являлись Владимирская, Пензенская области. Красноярский, Хабаровский края, некоторые территории Северного Кавказа.

Степень токсинообразования изучена у 3529 штаммов C.dlphtheriae, собранных с 25 территориальных зон РФ в течении 1984-91 .гг. Из этих штаммов 1159 были определены как токсигенные, 2370 - неток-сигенные. 386 токсигенных штаммов относились к варианту gravis, 773 т-оксигекных штамма - к варианту mit is. Среда нетоксигенных штаммов - 1ЮЗ вариантов gravis и 1267 - mitis.

Ультраструктура и адгезивные свойства изучены на 16 штаммах C.dlphtheriae и других представителях рода Corynebaoterium (5 штаммов - tox+- Но 665, 411-1, 1180/15, 2998^, 299810; слаботоксигенные штаммы - No 702, 3752; tox" - No 14894, 411, 1180, 2998; C.diphthe-roides - No 1928, 1911; C.holmanni - No 40115, C.xerosis - No 1042; C.ilavidum - No 764). Антигенная структура изучена у этих не штаы-

мов, шесте с тем группы биоварианта gravis и mitis !йии дополнены 7 штаммами C.diphtheriae No 7359, 692, 907, 666, 658, 14387, 2940, а также изучено 7 пар изогенных штаммов.

Ростовые свойства питательных сред изучены на 18 штаммах, восемь из которых являются референс- штаммами.

Поиск tox+-rena и его фрагментов (tox А и tox В) осуществлен у 259 штаммов: 134 токсигенных (gravis - 61, mitis - 73), 125 неток-сигенных (gravis - 73, mitis - 52).

Бактериологическому обследованию с использованием питательной среды на аыиноггептиде подверглось 554 и 1172 человек (3452 анализа), обследованных по эпидемиологическим показаниям и с профилактической целью соответственно. При сравнении этой срэда со средой Бучина обследовано 653 человека (1306 анализов).

При изучении ускоренных методов диагностики и отработке схем их использования обследовано 105 чел., т.е. 210 проб от больных, дифтерией, ангинами, инфекционным мопонуклеозом и носителей токсигенных C.diphtheriae (г.Москва), 1570 чел. (3140 проЗ) от Сольных неврологического отделения (г.Махачкала) к учадахся школы (г.Ковров) с прсфыактпчэской целью.

Изучение антитоксических IgA, М, G -антител в ВЫ проведено у 16 привитых больных дифтерией детей (39 сыворстс::), 13 привитых больны:: ангиной (26 сывороток) и 12 бактерионосителе? (26 снзсро-ток) на первой и второй - третьей неделе болезни. У всех детей изучено содержание антитоксических антител в слкне в ИГА с антигеншш коммерческим диагностикуыоу.

Исследование уровня иммуноглобулинов сыворотки крови проведено у 61 носителя токсигенных C.diphtheriae (122 сыворски) до и после лечения антибиотиками и у 26 больных сштинами (5£ сывороток). Дети были в возрасте от 3 до 7 лет. В этих не группах изучены SIgA, IgA и IgG слкпы. Всего проведено около 2ООО исследованиЗ.

В работе были использованы 200 морских свинок и 298 кроликов порода "ШИЕПЕЛЛа".

По хо,чу работы в экспериментальных условиях Сею получено и охарактеризовано 780 сыЕороток кролрка антитоксических я антимчк-робных противодифтерийных в динаыике ш.мунизации; 3 серий чистых антител и 7 серий IgC; 25 ссркй антителышх диагностических препаратов, 11 серий антигенных диагностических препаратов, 15 серий антимикробных дифтерийных диагаостакумов.

Для культивирования ксринебактерий использовали среда на основе бульонов Мартена, Лингуда, аминопептида, коммерческую среду Бу-чкна и др.

В работе использованы методы-, эпидемиологический и бактериологический для изучения закономерностей эпидпроцесса и расиифрсви; вспышек дифтерии на территории РФ; иммунох^мическте, сералогачес-кие, генетические, биологические, ыолекулярно- биологические с разработкой собственных и /или/ усовершенствованных методос.

Основные методы исследования: ультратонкие срезы изучали в электронном микроскопе JIM- 1С0В (Japan) при инструментальных увеличениях от 10,000 (х) до 100,000 (х). С целью оценка общего состояния культур перед ультрамикротомяей с каждого бло:а изучали полутонкие срезы в МБИ-6 как в проходящем свете, так и с использо-, ванием фазово- контрастного устройства. Изучение антигенного соста- ■ ва экстрактов нз дифтерийных бактерий и их фракций проводили мзто-дом иимуноэлектрофореза (ГраберП., Буртен П., 1965); дискового электрофореза в полиакриламидном геле (B.J. Davis, 1964; L.Orns-tein, 1964; Сафонов М.П., 1964, 1966; Филиппова Л.М., 1977).

В ИФА пря изучении изотопических антител применяли монокло-нальные антитела (ЫкАт) к СООН- концевой части B-фрагмента молекулы дифтерийного токсина, полученные в Московском НИИВС им. И.И. Мечникова (Свиридов В.В.), конъюгаты получены в ЫНИИЭМ zu. Г.Н.Габричевского (Баталова Т.Н.). Пригодными считали конъюгаты, которые с положительным контролем давали максимальную оптическую плотность (ОП) не менее 0.5 EU-для IgG и IgA, для IgM - не менее 0.3 ЕД; с отрицательным контролем -для IgG - не более 0.1 ЕД, для Igtl и IgA - не более 0.6 ЕД.

Количественное содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови определялось методом простой радиальной кммунодаффузии по Манчинн в модификации ?. Skvazil и J. Radi (1969).

Для сравнения полученных показателей использованы средние геометрические ишуноглобулинов А, К, G (в ЫЕ/мл) и их колебания (X х 2о) у практически здоровых детей разного возраста (Чернохвостова Е.В., Герман Г.П., 1984). Количественное определение содеркания SIgA и IgG (в мг/мл) в слюне проводили методом радиальной иммуно-диффузии по йанчини в модификации Чернохвостозой Е.В., Герман Г.П., (1937). Все разрабатываемые методы описаны в соответствующих разделах работы.

Результаты исследований обработаны методами вариационной статистики (Гублер Е.В., 1970, Налета Ю.С., TapacoR В.В., 1931) по критерию Стьюдента, прогностическая значимость методов оценена (Власов В.В., 1988; Laslo A. et al., 1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДВЗАШ И ИХ СБСУХДЕНИЕ

1. Рк^тг'л ?zmm келгглш^до ДЛЯ ШРЕДЕЛЕЙЯ РАС1Ш>Н0Г0 ЙИТШЯЙП) АНШ"В!Д-Т<ЖСША.

Одним из простых, доступных експресс- методоь, известных по донным литературы при ряде других инфекций, является реакция коаг-глютинацик (РКА), в которой используется уникальный по своим свойствам и высокостандартнай по своей природе естественный твердофазный сорбент, а?сяшый по отношению к антителам,- стафилококк-носитель белка A (Kronwell G.,1973).

Основной проблемой при разработке реакции коагтлгтинацли (КСА) для Б!_"вления дифтерийного токсина явилось получение л подбор имун-ной сыворотки, активно взаимодействующей с банком А. 1 ■ 1 .ПОЛУЧШЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПРСтВОдаНЗШЫХ ЖШОКОтЧЕСКИХ СЫВОРОТОК КРОЛИКА И ИХ ФРАКЦИЙ, РАЗЛИЧНОЙ СТЯ1ЕНИ ОЧИСТКИ. Для конструирования КОАД были пештэны кс:.а;ерчеслте лечебные противодифте-pcr'ïEiie антитоксические оборотки лошади, т.к. имеется кх отечественное производство. Оказалось, что для решения лост&влекннх задач сыворотки лошчди любой очистки не пригодны. ï.k. известна различная степень срсдстБа IgG к белку А в зависимости от его ездоеой принадлежности. IgG лошади относится к слабореагарующим видам (Рощпна Н.Г., 1983, Хазенсон С.Л.,1983, Сперанская З.Н-,1988). Очевидно, потому, что специфическая актительная активность в втей сыворотке находится в Т-глобуляновой фракции (Unien H. et al., 1984). Не исключено, что Т-глобулвнн лошадиных антитоксически сывороток OTjTHiaœrcfl копформацпензтми особенностями ?с-фратмеята, делакпрши их малоафэвз^ыи по отношению к бэлку - (Gocderaar'cd J. et al., 1978). Мы ке вообще использовали сыворотки лет ада, очищенные методом "Дигферм 3", что снимет содеряание ?с-фрагиентов и, соответственно, сродство 1и<7нсгл0булипсв енворотки лопада к балку А. Существенным недостатком явилось таюке присутствие в противодифтерийной антитоксической гкпериммунной сыворотке лоаади большого количества ентишперобнах антител, - следовательно, необходимо было получить высокоактивную антитоксическую енворотку .другого вида

животного, иммуноглобулин которого обладает хорошим аффинитетом к белку А. Наш бшш отработаны схемы иммунизации кроликов различными препаратами - нативнш очиценным не сорбировании.! анатоксином (330 LT/мл), очищенным к адсорбированным дифтерийным анатоксином (60 Li/мл) - препаратом для иммунизации людей (производство ВДИКВС им. И.И. Мечникова, г.Петрозо-Далънее). Применяли цикловую иммунизацию по различиям схемам, неполный адыоваЕТ Фрейкда (НАФ). При разработке схем и доз иммунизации учитывали, что очищенным несорбирован-ным анатокошЗи свойственна относительно невысокая иммуногенность; учитывали так г.в свой опыт получения сыворотки кролика против микробных антигенов дифтерийной клетки и огшт других исследователей, получавших сыворотки против анатоксинов, например, столбнячного (Cohen Н. et al.,1970).

Были изучены три схемы иммунизации. I ^я схема предполагала иммунизацию каждые три дня с 5-7 дневными интервалами с увеличивающимися дозами вводимого внутримышечно анатоксина в объеме 0.5 мл: 1-3-5 Ы/мл; 5-10-10 LI/мл; 10-20-20 Li/мл; 20-40-40 Li/мл; 40-5050 Li/мл. В вжунизации кролики находились до 40-50 дней. П-схема (Cohen Н. et al.,1970) в некоторой модификации предусматривала внутримышечное введение неадсорбированного анатоксина е объеме 1 мл, содеркащего 40 Li/мл, с 1 мл НАФ. После месяца перерыва проводили реиммунизацию дозами адсорбированного анатоксина в 5-10 раз провышагщими дозы первой инъекции в объеме 1 мл (200-400 Li/мл). На иммунизацию затрачивали 35 дней. III-я схема преда сматривала длительную иммунизации только адсорбированным ачатоксиногл, строгое соблюдение цикличности при чередовании внутривенных (в/в) антигенных. к знутрикскиых (в/к) антигенных с НАФ введений при постоянно увеличивающееся дозе анатоксина. I цикл - 1,3,5 Li/мл в объеме 0.5 мл вводили в/з соответственно ежедневно в течении 3-х дней, перерыв 6-7 дней; II цикл состоял из в/в введения 5 ЬГ/мл в объеме 0.5 мл, перерыва в 2-3 дня и новых введений - в/в 5 Li/мл в объеме 0.5 мл и в/к 10 Li/мл в объеме 1 мл с 1 мл НАО, в 6 точек на аивоте. После этого следовал перерыв в 6-7 дней. III,IV,Y,7T циклы повторяли как II, однако, дозы анатоксина как для е/в введения, так и в/к увеличивали на 5 Li/мл в каздом последующем введении (III цикл: 10,10+15; IV цикл: 15,15+20; V цикл: 20,20+25 Li/мл к т.д.). Если было необходимо после контрольных проб в РПГД (с коммерческим анти-геннш диагнсетикуысм) повысить титр антител, то добавляла VII и

VIII циклы. При 6 циклах в иммунизации животные находились 40-50 дней, при Э циклах - 60-75 дней. Более 8 циклов животных не иммунизировали. После иммунизации по любой схеме и контрольных проб через 7-'Ю дней после окончания последнего цикла животных тотально обескровливал!, ¡тсггг.отовляли сыворот:си, которые сохраняли в холодильной камере при -20°С.

III схема иммунизации (длительная, чередукцзя в/в и в/к введения антигена, НАФ) позволила получить втсокотмтрахпме сыворотки от 90% ¿м.:упизировгнных мшотних.

J!o 20 дня тамуказации по всем схемам титры антител были низкими (1:800 -1,11 схемы и 1:6400 -III схема). По I и II схемам иммунизации к 40 дню татры достигав! среднего уровня - 1:12800-1:25600 и далее их уровень не повышался ни по прекращение введения антигена, ни после продолзекия им^уннзацки. По III сг.руе уровень антител к 40 дпзо достигал 1:51200 и далее увеличивался до 1:204820 и выше к 60-70 дням при постоянном стимултгрсгакги кроликов антигеном. При исследовании антител в хршатогрг-Фяческях фракциях сывороток пз разных Бтапах изв.'унизашш показано, что антл-гельная активность ранних сыгсроток (до 20 дня), в основное, связана с мзкроглобулиновой IgSJ"<5paKm;efl. После обработки сывороток цксеннсу наблюдалось падение титра в 4-8 раз, что свидетельствовало о преобладании в ргвиих сиворотках 1вМ-рагтгед. Обработка поздних сызогчсто:: цистеином нэ приводила к сшгасяию титра, антительязя актизность определялась в ?тих сыворотках, в основном, IgG-фракцией. Изучение в РПГА хромато-графачесьлх фракций поздних енвороток подтвердило принадлежзость антитоксических антител к IgG-фракции. Были такие проведены опыты по истощению сывороток стафгшокскковой суспензией,- титры сывороток снижались в 15-30 раз, что подтверждало лрипздлэашост:. антител в гипертл'.уппнх сыворотках кролика к IgQ-фрзкции.

При титровании сывороток в коже кролика оамечэно совпадение высоких титров в ?11ГА (: высокими показателям МК/ыл антитоксических антител. Тэч,"титрам 1:2048CD-1:"2f09S00 "соотвзтствсвало содержание от 200 до 500 iJS/iu; титрам 1:51200-1:102400- от 50 до 100 МЕДм.

При изучении сывороток в РПГА с микроон'г.м антигенами (солевым эхстрактом_из C.diphtheriae) в сыворотках по II схеме гаэлунпзации они не выявлены, в сыворотках по I к III схемам мегшо в некоторых случаях (до 30% кроликов) определить актимикробшле антитела в киэ-ких разведениях (1:100-1:200).

Специфическая и удельная активность сывороток, полученных по III схеме иммунизации была е б раз выше, чем у сывороток, полученным по I и II схемам (t=3.2, при р<0,01).

Сыворотки кроликов подвергали в дальнейшем очистке двумя способами - получали иинуноглобулин G на ДЭАЭ-целлюлозе бач-методом из у-глобулкновой фракции, осажденной сульфатом аммония при 50% насыщении, и аффинной хроматографией на иммунном сорбенте Br-CN-сефарозэ 4В, ковалентно связанной с дифтерийным токсином. В дальнейшем препараты иммуноглобулинов в зависимости от их очистки обозначали как "IgG" и "чистые антитела".

Удельная активность IgG и чистых антител (Табл.1) в 2-10 раз выше удельной активности нативных сывороток. Между собой цо удельной активности они такхе различались - чистые антитела имели более1 высокую удельную активность (р<0,05).

Табл.1. Сравнительная характеристика иммуноглобулинов, полученных из сывороток III и I-II схем иммунизации.

Схема имму- Удельная активность

низации Сыворотки IgG чистые антитела

Т-П 240+4.2 470+8.0 2S00+8.0

III 1140^3.0 4600+3.0 22900+2.6

Коэффициент очистки 2.37-4-9 11.7-20.9

Иммуноспецифическую характеристику сывороток и препаратов из" них получали при постановке реакции диффузионной . преципитации в агаре с дифтерийным токсином или анатоксином, а так хе с дифтерийным микробным антигеном (экстрактом). Выявлены слабые линии преципитации антитоксической сыворотки кролика с дифтерийным микробным антигеном. Никробныэ компоненты в чистых антителах отсутствовали. Выявлены две лиши преципитации с токсином кроличьих сывороток, и одна линия преципитации IgG и чистых антител. Гомогенность последних подтверждена в электрофорезе в ПАДГ.

1.2. РАЗРАБОТКА И ОПЕНКА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ KOAITJDO-ТИНИРУВДСС ДИАГНОСТИКУМОВ (КОАД). КОАД готовили по классической методике по Xromwall'y (1973), используя коммерческий препарат "Стафилококковый реагент" (производство ЛНКИЭЫ им.Пастера). Основное внимание было направлено на отработку сенсибилизации стафилококкового реагента, выбор антительного компонента, аффинного по

отношению к белку А, оценку специфичности и чувствительности КОАД с дифтерийными анатоксином и токсином, воспроизводимости реакции и ее корреляции с классическим тестом на токсигенность - реакцией преципитации в агаре (РП).

Била обнаружена зависимость чувствительности КОАД от количественного содьргакия антитоксических антител в сыворотке кролика, я такте от вида примененных для сенсибилизации стафилококка антител.

Натквнкс сыворотки, содержащие 100-500 МЕ/мл (тктр в РПГА -1:102400-1:51200), позволяли выявлять 0.03-0.02 ЬХ/мл токсина. При сушении титра антитоксически! антител в сыворотке до 5-25 »<Е/ыл чувствительность диагностик умов поши.алась до 0.2-2.0 ЬГ/мл зоксиг.э или анатоксина. Олтшлальная сенснбадисируицая доза нативной сыворотки одного мл 1055 суспензии стафалскоктового реагента составила 0.1 мл, содержащий 10-25 Ш2 антитоксических антител к 1.1-2.7 мг белка.

Обращает внимание тот факт, что КОАД чувствительностью 0.03 ЬХ/мл не выявлял токсин, продуцируемый 1-10 миллиардными взвесями токсигенного референс штамма С.а1рЬ1Ьег1ае. Слабая ПСА регистрировалась пта работе с 20-миллиэрдной взвесью этого ш?а»ыа. Сенсибилизация 1 мл 10? стафг'-локскковоЯ суспензии 0.1 мл иммунной сыворотки с более еысоким содержанием белке - 2.5-3-0 м1 - для лсвышения чувствительности метода часто приводила к спонтанной агглюткащп стафилококкового реагента. Уменьшение количества сыворотки для сенсибилизации сниссло не только содержание белка, но и содерканмг азтител, т.е. вело к уменьшению удельной активности сенскбилизируто-щей дозы ензеротги, что приводило к саитению чувс^ъитмгьпости 1ССАД. Чувствительность реакции повышалась до 0.003-0.002 ЬГ/мл при использовании иммуноглобулина й или чистых антител. Оптимальная доза 1гС составила 1.2 мг белка и 10 МЕ з 0.1 мл, т.е. не отличалась от оптимальной сенсиЗилязирупдей дозы сыворотки, но чувствительность была ьыпе в 10-15 раз у 70$ КОАД, созданши на основе

КОАД при-использовании чистых антител шели чувствительность 0.003-0.002 ЪТ/ил. Оши,'агь.!!ся сенснбилизируздая доза - 0.1 мг белка и 10 МЕ в 0.1 мл чистых ¿нтагтэл. Такой КОАД способен выявлять токсин, продуцируемый 20-»шллиарднсй взвесью токсигенного референс-итамма."Специфичность стафилококковых реагентов оценивали в РКА и в реакции торможения коагтлютккации (РТКА) с анатоксинами (дафтерий-ным и столбнячным), рефзренс-штаммьми (токсигенным и нетоксигенним)

C.diphtheriae, C-hoImamii и микробным дифтерийным антигеном.

Низкую чувствительность и специфичность КОАД на основе иммунной сыворотки возыокно объяснить фиксацией на белке А всего спектра иммуноглобулинов, находящихся в сыворотке, и малой долей иммуноглобулинов "нужной" специфичности. Таким образом, было показано, что только применение специфического иммуноглобулина высокой степени очистки в виде иммунохимически чистых антител, приводило к получению КОАД высокой чувствительности - 0.003-0.002 Ы/мл, стабильности и специфичности.

1.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИНА У ШТАММОВ O.dipntherlae В РКА. КОАД чувствительностью 0.002-0.003 LI/мл был использован для индикации токсина, продуцируемого 20-миллиардкыш взвесями C.diphtheriae. Изучено 27 токскгенных и 25 нетоксигенных штампов C.diphtheriae, 5 штчшов, C.holHtarmi, 3 штамма Staphylococcus зр. Штаммы выращивали на плотной питательной среде и готовили 20-миллиардные взвеси в фосфатно-солевом буфере. В качестве положительного контроля использовали дифтерийный анатоксин. Реакцию проводили на стекле. Результаты учитывали по 4-х плюсовой системе.

Все нзтоксигенные и другие виды микроорганизмов давали отрицательную реакдаю, что подтверждало специфичность стафилококкового реагента. Положительная реакция была выявлена у 21 из 27 токсиген-ных штаммов C.diphtheriae, что состазило 78% по отношению к РП, е которой выявлены токсигенные свойства 27 штаммов. Отрицательные результаты у части токсигенных штаммов мокно объяснить тем, что мы использовали взвеси культур в фосфатно-солевом буфере, выращенные на плотных питательных средах, т.е. малым количеством продуцируемого штаммами токсина. Это обстоятельство побуждало к изучению возможностей подращивания штаммов в жидких питательных средах.

Таким образом, был получен специфический КОАД, по чувствительности превосходящий описанные в литературе (Sophianou D., Bonifas V., 1978; Сперанская В.Н., 1983) в 10-20 раз, что позволяет в 100% случаев идентифицировать нетоксигенные штаммы на 2 суток раньше РП и на одни сутки в 785» случаев - токсигенные штаммы.

2.РАЗРАБОТКА И ГРЙЮШЕ РИГА С ЗРИТРОЦИТДРНЬМ АНТШВЬШМ ДИдГНОСТШЖЗЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ДИФТЕРйШХ) ТОКСИНА.

Обобщение данных литературы позволило сделать вывод с том, что, для решения задач ускоренной диагностик, реакция непрямой (пассив-

ной) гемагглютинации (РИГА) имеет ряд ценных преимуществ при выявлении растворимых антигенов перед всеми другими методами: быстрота постановки, пригодность для массовых обследований, экономичность метода, практическая готовность лечебно-профилактических учережде-ний к внедрению такого метода в комплексную систему диагностики инфекционных заболеваний, большая чувствительность и специфичность по сравнению с преципитационными методами и РКА.

Основная цель при разработке РИГА, которую мы поставили перед собой, - это выбрать такое технологическое решение, которое способствовало бы созданию производственного еритроцитарного знтительнох'о диагностикума с учетом всех положительных и отрицательных моментов при конструировании эритроцитарных диагностику»»в, известных из литературы.

2.1. ТЕОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ ДИАГНОСТИКУМА АНТИТШДОГО ЭРИТР0Щ1ТАРН0Г0 ДИФТЕРИЙНОГО (ДАггЭД)-- Прежние методы конструирования аратроцитарных диагностикумов ухе не позволяют РНГА конкурировать или даке приближаться по чувствительности к радиоиммунологическому или инмунофердентному анализам. Некоторые технологические начальные этапы конструирования остаются, но существенно меняется представление о геыосенситине для повышения чувствительности и специфичности метода.

В работах Млсевдикова A.B. и Райхер И.И.(1979) проблема получения внсокоспецсфичного эритроцитарного дифтерийного диагностикума решалась путем выделения P(ab)2 фратаентов чистых антитоксических антител. Однако, производственного выпуска эритроцитарного даагыос-тикума на основе F(ab ^-фрагментов не было осуществлено, так как методика представлялась достаточно сложной, и результата ее зависели от стандартности процедуры расщепления иммуноглобулинов, которая очень часто приводит к потерям активности антител. Кроме того, было показано (Новикова A.A., Басова H.H., Черкасова В.В и др., 1979). что при изучении токоппооСразозания у части нетаксягенных культур регистрировались лс^яолопо^Етельвие результаты.

Сравнительные опыты сенсибилизации эритроцитов иммуноглобулиналм из сывороток кролика и лошади, полученных нами, одинаково осаждением сульфатом ьмминяя с последующей • очисткой на ДЭлЭ-целлилозе, а так;е чистыми антителами, полученными с иммуносорбента с дифтерийным токсином из Бг-СК-сефарозе, показали, что чувстви-

*Этот раздел выполнен совместно с Жебруком А.Б.и Барашковой Л.Н.

тельпость даагностикума на основе иммуноглобулинов как из сыворотки лошади, так я кролика была в 16-40 раз ниже чувствительности диаг-ностикумов на основе чистых антител (Табл.2).

Разница мезду чувствительностью диагностикумов, приготовленных на основе кроличьих и лошадиных сывороток, практически отсутствует и статистически недостоверна - мезду сравниваемыми данным! с чистыми антителами "1=0.7, и между иммуноглобулинами - 1=0.3.

При испытании иммуноглобулинового диагностикума оказалось, что чувствительность такого препарата недостаточна, чтобы регистрировать токсянообразование у 50$ заведомо токсигенных штаммов, а также наблюдались лсхнополохительные реакции с экстрактами нетоксигенных культур. Хота технология производства иммуноглобулановых препаратов представляется более простой, чеа технология, основанная на исполь-1 зовании чистых антител, тем не менее, на основании недостаточной чувствительности н опасности ложиополокительных реакций диагности-кум из иммуЕоглобулкновых фракций противодифтерийной сыворотки не рекомендован для промышленного внедрения.

Табл.2. Сравнительные данные по эффективности различных сенситянов, используемых для приготовления экспериментальных серий ДАтЭЦ.

Гемосенситины

число сенсибпли- чувствительность диагноста-серий зирущая кумов с дифтерийным анаток-ДАтЭД доза,мкг/мл окном, ЬХ/шх и мкг/мл

Чистые антитела:

-сыворотка кролика 5 50-75

-сыворотка лсяади 8 35-75 иымуноглобулиновая фракция:

-сыворотка Зфолика 3 200-250

-сыворотка левада 4 150-250

0.0008x0.0002

0.0007-0.0002

О.ОЗЭтО.Оа 0.026+0.01

0.047x0-002 0.050+0.002

0.68+0.03 0.54-0.03

Одновреигнно регистрировали лсхшополояительный.результат в 2-х сериях из 8-даагностикумов на основе чистых антител у 30% нетокси-генных штаммов и с микробным антигеном (экстрактом) - до 10 мкг/ыл. Зти антитела были получены с ниауносорбента на основе Вг-СН-сефарозы, ковалептно соединенной в одном случае с дифтерийным концентрированным и очищенным токсином, в другом - с дифтерийным анатоксином.

Известно, что главной причиной, снижающей эффективность метода получения пьмуыосорбента, является сложность приготовления достаточно очищенного антигена. Как длфтерийняй токсин, так 1Г анатоксин содержат большое количество микробных антигенов. Технология получе-

ния этих препаратов в производстве такова, что избежать присутствия микробных антигенов, секретируемых дифтерийным штаммом FS-8, чрезвычайно трудно. Штамм PW-8, несмотря на некоторую серологическую обособленность, выделяет антигены, общие с другими токсигенныш и иетоксигенвыми штаммами C.diphthsriae, что будет обсуздено ниже.

При обработке дифтерийного токсина формалином для получения анатоксина происходят некоторые ковфориадаонные изменения белка, но микробные антигены остаются даие в достаточно очищенных препаратзх коммерческого анатоксина. Об этом свидетельствуют антимикробное антитела, которые были выявлены в сыворотках коммерческих антитоксических лошади и в небольшом количестве - в сыворотках кролика.

Методы сорбции антитоксических антител из сывороток, использующее в качестве лиганда дифтерийный токсин или анатоксин, не гарантирую? получения препаратов, свободных от шссрсбшя антител.

В дальнейшем при конструировании антительного дифтерийного диагностикума мы использовали двойную очистку проткводифтеркйных антитоксических сывороток на иммуносорбентах с анатоксином и с фильтратом нетохсзгенЕого штамма C.diphtheriae.

Сохраняя высокую чувствительность, дкэгпэстикумы, созданные на основе чистых антител, полученных на иммунссорбенте с экстрактом летсксиг?тшсго длфтэтайкого атыша, никогда не давали лакнополозт-■ге.чьных реакций с нетоксгггоЕжпи шташани или полежитехьнкх реакций о микробным антигеном.

Таким образом, основной принцип, на котором построена технологическая схема получения диагностического антительиого противодифтерийного антитоксинного препарата, заключается в том, что из сыворотки кролика (или лсшэдоО выделяли чистые антитела методом сорбцпи - влкзции на иммуносорбенте - очищенном концентрированном .дифтерийном анатоксине, имчобилиповгннсм на циазбромировапней агарозе 4Б, затем полученные антитела очищали адсорбцией на ихмуносорбснте, приготовленном из экстракта нетоксигепаого штамма C.iiphtheriae. Выделенные таким образом антатсла из сивоъоток лошади или кролика принадлежали к иммуноглобулинам с электрофоретической подвижностью, свойственной 7S -антктзлам. Злектрофоретический контроль в ITA л Г подтверждал гомогенность антител. Подбирая сексибшшзнрущие дозы чистых антител для конструирования ДАтЭД, было показано, что они находятся в пределах 50-75 мкг/мл как для антител лосади, так и кролика.

2.2. адкая-готтгдшя среда для культивирования штаммов с.а1рь-№егхае. Следуыцая серия исследований была связана с поиском деления и доступных жидких питательных сред, при культивировании в которых штаммы С.<ИрЬ1;11аг1ае продуцировали бы в течении короткого времени достаточное для иммузохимическпх определений количество токсина.

С этой целыо было изучеио токсинообрасование реферепс-штамма n0 665, коллекционных и выделенных из клинического материала штаммов С.сИрМЬейае в следующих питательных средах: бульонах Мартена, Лкнгуда, Хоттангера, колмерческих бульонах на основе рыбкой пасты, аминопептиде, и тех же бульонах, содеркащих 0.156 агара. Для повышения питательной ценности среды добавляли СКРС или гидролиза? лакт-альбумина. Дет подавления роста сопутствующей мшсрофлоры изучали, добавки 0.235 -го раствора теллурита калия.

Всего было изучено 17 вариантов агаровых (0.1Й) и бульонных сред. Оказалось, что применение агаровых сред на -любой основе невозможно из-за большой вязкости среды и частых случаев спонтанной агглютинации даагностикума в ней.

Оставалось изучить рост и токсинообразоаание у штаммов С. с11рЬйег1ае в средах на бульонах Мартена, Диягуда, на основе амино-пептада и продуктов рыбного происхождения. До засева материала, после 4-х и 20-ти часов инкубирования при 37°С определяли рН среды, содержание аелзза (по методу Виноградовой И.П. и др., 1954) и количество пакощенного токсина в РИГА. В процессе роста и токсиЕООбра-зования идет утилизация железа как в бульоне Мартена, так и в рыбном бульоне. При низкой продукции токсина на среде с ахшнопептидом почти нет изменений показателей содержания железа, хотя исходные данные во всех трех средах показывают достаточное его содержание: в мартеновском бульоне - 710-830 мкг/л, в рыбном бульоне - 610-820 мкг/л, в среде на аминопептиде - 904 мкг/л. В последней почти не изменяется рН среды, в то время как в мартеновском и рыбном бульонах рН среда при исходном значении 7.7-0.2 снижается до 6.3-0-3.

Процесса роста и токсинообразованил у С. йирЬШег!ае проходят практически ва одном уровне в бульоне Мартена, Лингуда и рпбном (Табл.3). Давпае по аминопептиду в таблице не приводятся, т.к. татр токсинообразозания у токсигенных штаммов был очень низким - не превышал 1:8.

Табл.3- Результаты изучения токсинообразования С.<Цр)1'Шег1ае на разных хидких питательных средах в РИГА.

Но Питатель- Кол-во Титры в РНГА Средняя

п/п ная сре- штаммов отриц.1:2 1:4- 1:16- 1:128 . геометр. РП

да на с.а. рез-т 1:8 1:64 и величина

основе - выпе титра, УЕ Х~2п

1 бульона 84 .1 6 57 20 5-3-0.4 +

Мартена 30 •зо - - - - - -

2 бульона 45 7 31 31 7 4.8^0.5 ■+

Лингуда 30 30 - - - - - -

3 рыбного 56 1 6 43 6 4-8^0.4 +

бульона 30 30 - — - —

При статистической обработке результатов разница иеаду результатом на бульоне Мартена и другими бульонами оказалась недостоверной и=1.7), хотя и наблюдается тенденция к увеличению титров РНГА при выращивании С.<Ир.М;11ег1ае на бульоне Мартена. Из всех изученных аадких питательных сред была отобрана среда на рыбном бульоне, которая не сгпз&ла результатов, по была более дешевая, доступная, т.к. основой ее является коммерческий препарат - рыбная пэста, или сухой рыбный булься. Все дальнейшие исследования проводили, выращивая Етаммы С.сИрМ1сг1ае на аэдксй питательной среде, приготовленной на рыбЕом бульоне (3-0 мл) с обязательным добавлением 1 мл СКРС и 0.05 мл 2?~го раствора теллуркта кэлия, минимальное содержание хелеоа - 600 ?л<г на литр среда, рН=7.6-С.2.

Однако, ряд опытов покасзл невозможность использования некоторых серий СКРС из-за неспецифяческой агглютинации, особенно при постановке РКА. Очевидно, СКРС, способствушая большему накоплению токсина, моеэт содержать какие-лдбо иммуноглобулины, реагирующие с токсином в ¡кидкой питательной среде, шш протлвсст24шюкокконце антитела, реагирующие с К0.4Д. Особое ытамание поэтоглу было удзлено подготовке СКРС перед добавлением ее в жидкую питательную среду культивирования сгаммсз. Все серии СКРС проставляли в РИГА с анти-гекшм антитоксическим диггностккумсм для исключения серий, содержащих антитоксические антитела. Сыворотки прогревали 30 мин при

56°С. Кроме того, сыворотки истощали коммерческим стафилококковым реагентом.

г.З- ПОСЕВНАЯ ДОЗА И ВРЕМЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ С-сИрМЬегхае- Существенным в методике постановки РИГА для выяления токсина "у штаммов С.сИр!г1;Ьег1ае является выбор дозы мшфсорганизмов для засева в жидкую питательную среду и время культивирования.

Референс-штамм Ко 665 засевали в среду в разных дозах и изучали процесс токсинообразозания через определенные промежутки времени.

Табл.4. Чувствительность РНГА при изучении различных посевных доз и сроков культивирования референс-штаыма.

n0 Количество Средняя геометрическая величина титра,УЕ(х*2т)

п/п микробных

клеток 3 часа 6 часов 9 часов 18 часов 24 часа

1 10' 1.6*0.3 2.9-0.4 3.9*0.5 6.0*0.6 6.14*1.2

2 108 1.4*0.4 2.7*0.5 4.0*0.4 5.4*0.4 5.6*0.6

3 107 - 2.7*0.5 3.6*0.4 4.0*0.4 4.4*0.9

4 106 - 1.9*0.4 1.9*0.4 3.0*0.8 3.14*1.0

ц 10в - - 1.7*0.4 2.14*0.3 2.4*0.5

6 10* - - - 1.9*0.4 1.0*0.4

7 10э - - - - -

8 ю2 — — — - —

Как видно из Табл.4., при больших посевных дозах (10е—10а) уке через 3 часа можно в низких титрах обнаруживать токсин. При посевных дозах (10*-102) только при дозе 10* можно наблэдать положительную РНГА через 18-20 часов культивирования. Для дальнейшей работы была выбрана посевная доза - Ю'микробных клеток, которая гарантировала положительную реакцию при слабом токсинообразоваыги (0.0010.002 мг/мл) при культивировании штаммов не менее 6 часов, лучшие результаты определялись через 18 часов. Последнее положение - о времени культивирования штаммов для определения их токсигенных свойств, было проверено на 24 штаммах С.й1рМЬег1ае. Показано, что токсинообразование регистрируется в РНГА уг:е через 3 часа после посева культуры в бульон у всех 24 штаммов. В последующие периода

роста титры увеличиваются, достигая максимума через 18 часов и остаются на этом уровне до 48 часов.

Доказательство раннего выявления токсигепных свойств у C.diphtheriae в РНГА представляется особенно важным и свидетельствует о возможности выдачи ускоренного ответа до результатов, полученных классическим методом РП.

2.4.ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РНГА ДЛЯ ОПЕНКИ СТЕПЕНИ ТОКСИНООБРАЗОВАНИЯ. РНГА с антительным дивгностикумом может быть использована для определения степени токсивообрззованчя, т.е. количества токсина, продуцируемого C.diphtheriae (10® в начале стационарной фазы роста) в азщ-кую питательную среду. Степень токсинообразованил была изучена у 539 токсигенных штаммов.

Табл.5-Степень токсинообразовавчя штаммов C.diphtheriae, выделенные от больных дйфтерчэй и бактерионосителей в РНГА.

Количество Тскслген- обратная величина татра

штаммов ность

в РП 2 4 3 16 32 64 128 256

53$ Ь39 18 30 54 9Ь 1ЬО 140 Ь2 7

%% 100 3.2 5-4 9.7 17.2 28.7 25.1 9.4 1-3

Штаммов с титрами 1:2-1:4 насчитывалось 8.б®, с титрами 1:81:32 - 55.6л, с титраш 1:64-1:256- 35.855. Прз сспоставлопш давних, пол.ученвш. в РНГА, с данными, полученидои ±¡j vivo (на морских свинках при определена:! Etom, ED ), при Epyvesn 50 токсигенных, слаботокиггеРЕЫх и нетокекгенных гггалгав C.diphtheriac, mosho было заключить, что татрч 1:¿ - 1:4 показывают низкое содержание токсина - 0.001 Ll/iui. Наши данные- ссглгсу^тся с данными Rappuoli Р.. ег al., (19Ó1)- Еысоковирулзнткый штамм PW-8 вырабатывал 0.4 мг токсина на 1 мл хвдеой среды, по нашим даьгадм, в РНГА, этему соответствовал татр 1:256.

Из всего сказанного следует, что низкими тиарами тсксинообра-зования мокло считать титр в РИГА 1:2-1:4,- сродплмп - 1:8-1:32, высскют - 1:64-1:256. Метод позволяет определить относительное содержание токсина в исследуемых пробах путем укнояения значения чувствительности тест- системы, выраженное в ЬТ/мл, на обратную величину татра исследуемой пробы.

ЗЛШУКОФЕРШЛШ* АНАЛИЗ (Ш) ДЛЯ ДЕТВДИ ДШЕВЖГО ТОКСИпА.

3.1.ВЫБОР АКГИТЕЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ТВЕРДОЙ ФАЗЫ И ДЛЯ КОЯЫОГАЩй. ПоликлоЕалыше антитела (ПкАт) изучены в качестве сенситниов • полистироловых планшетоз и в составе конъагатов с перок-сидазой хрена, а также учтены некоторые разновидовые сочетания (ПкАт антитоксические- кролика и лошади). Почти все варианты ИФА в "поликлональной" постановке обладали высокой чувствительностью и выявляли от 2 до 10 пг дифтерийного токсина. Сенсибилизирующая доза всех ПкАт вне зависимости от вида составляла 5-Ю мкг/мл. Оптимальным "поликловальным'1 вариантом сказалось использование чистых антитоксических антител кролика для сенсибилизации планшетов и чистых антитоксических антител лошади в составе коньюгата. Высокой чувствительностью также обладал вариант, когда использовали одаонпдовыэ' антитела (в качестве сенситина - ?(аЬ)2-фрагментц (антитоксин лошади), в составе коньюгата - чистые антитоксические антитела лошади).

Однако, при изучении токсигенных и нетокспгенньа атаиюз остро встал вопрос о специфичности такой систем. Оказалось, что в 15-20» случаев регистрировали ложаоположитэльЕые результаты при работе с нетоксигенныш штаммами. Очевидно, высокая разрэшащал способность метода И5ЬА позволяэт регистрировать как минимальные количества сывороточных компонентов среды культивирования штампов, так и микробных антигенов С.й1рЬ№ег1ае, несмотря на то, что скзороткп как лошади, так и кролика были подвергнуты различным способам афршной очистки. Надо полагать, что снижения уровня неспецифлческкх реакций можно достигнуть повторной аффинной хроматографией антител, подборой других без сывороточных питательных сред для культивирования штаммов, но все это лишь услэжаяет технологию достижения специфичности, удорожает систему и делает практически непригодным для выявления дифтерийного токсина такой высокочувствительный метод, как ИФА.

Можно было пойти по пути конструирования такого с&ндвич-варианта ИФА, когда дополнительное введение антитела "настраивало" бы метод на тормозящий эффект, и специфичность метода была бы под его контролем. Но для практического здравоохранения 4-х компонентные ИФА трудоемки и дороги. Поэтому огромный интерес для конструирования ддагасеткчеасях систем вызывали моаокг.ональные антитела (МкАт), полученные к прот&кгивным ант^елнш детерминантам. Отчетливые неЕтралкзуетзе свойства выявлены у ?«кАт к .С00Н- ккщевоыу

участку 3-фрагмента ( Свиридов Б.Е., Зайцев Е.М., Титова Н.Г. и др., 1984; Зайцев Е.М.,1936; Науакаша S., Uchida T. et al., 1S83; Zucker D.R., Murphy -J.R., 1984). В дальнейшей работе били использованы MitA? ДТ-12 к СООН- концевой части В- фрагмента молекулы дифтерийного токсина из коллекции Свиридова В.В. и Зайцева Е.М. (ЦНКИВС и.«. И.И.Мечникова), совмостно отработаны условия постановки ИФА, проведение оценки специфичности, подбор положительны! к отрицательных контролэй, отработаны учет и интерпретация результатов, что излез'эно в методических рекомендациях "Индикация дифтерийного токсин? »'етодгшн ИФА и KITA ( Совершенствование лабораторной диагностики дифтерии)".

3.3.ДЕТЕКЦИЯ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА И ВОЗМОЖНОСТЬ ОЦЕНКИ СТЕЛЕМ ТОКСКНООБРАЗОВАНШ. Штзмны выращивали в гздхей среде на основе рыбного бульона, соблюдая условия культивирования, отроботгнные при постгаювке FHTA. Так г.е, как и в РИГА, четко была прослежена возможность выявления токсина в ранние часы культивирования. ИФА позволяет выявить токсин ухе через три часа культжкровгнпя при посевной дозе не менее 10* микробных клеток (при РИГА - 10е), что свидетельствует о еысоксй разрешающей способности метода. Оптимальным временем для активного токсинсобразованил является 13 часоз кнкуСа-цчи при 37°С. Чурстмтельность метод? по ангтокезпту составила 0.00078 - 0.0015 >-кг/мл га 0.0002 - 0.0009 Lí/мл.

Исалг-довсно 265 культур: 42 музейных штамма, 2(6 евгаевыде^ен -них культур C.diphtheríae от больных дифтерией и бактерионосителей, ь качестве коятрэдей были изучены 18 скезанных культур (C.dii'btberiae н другие микроорганизмы).

Как доказал КФА, 90 ÍZ3-9Z) штаммов. екляч&я сданные кулму-ры, продуцировав Т0К0НГ1. В ГП продукция токсина змрэтастрз:ровяьа u 85 (32.4:С) случаях. 175 (56$) шгаммов но резу-птатам КФА :i 179 (67.5$) В P1I токсина но нродуцчроналя. У 7 атг-дюв (4- варианта gravis, 3- rail-is) в ИФА получен положительный результат, в то время как з -PJI- отрэт.стельннй. Лишь после повторных пассаж? (от 2 до 4 раз) на кровавом агаре и жидких питательных гредах в И выявлялась способность этих пта\асз к продукции токсина. Последнее может свидетельствовать, с одной стороны, г. низкой токсинообргзувдеЯ активности дпннш шташоз ггри культивировании на плотней питательной среде, с другой - о более низкой по сравнению о ISA разрешающей способности РП.

Вместе с тем нами выявлен 1 штамм (вариант mitis), характеризуемый в РП как токсигекный, а в ИФА как нетрксигекный.его исследование in vivo дало выраженную реакцию. Причину обнаруженных расхождений результатов проверки токсигенности С.diphtherias в-РП и пробе in vivo, с одной стороны, и в ИФА с МкАт - с другой, можно объяснить тем, что в ИФА использовали МкАт ДТ-12, специфичные к В- фрагменту молекулы токсина, способные взаимодействовать лишь с определенным его зпитопом. Для проявления дерконекротическкх свойств существенное значение имеет сохранность пространственной организации молекулы токсина. В то же время в структуре В- участка, которым токсиа связывается с клеткой, возможны незначительные изменения аминокислотной последовательности (1-2 аминокислоты), что в малой степени или вовсе не влияет на связывание токсина с клеточными рецепторами, ш радикально изменяет характер взаимодействия с парато-пом использушых в ИФА МкАт. Поликлональные сыворотки,содержащие множество различных антител ко всем эпигонам антигена, подобных изменений не выявляю. Отмеченный факт наглядно демонстрирует важность изучевжя молекулярной гетерогенности токсинов, продуцируемых штаммами C.diphtheriae с различными МкАт.

При изучении степени токсинообразования в ИФА у 90 токсигенных штаммов C.diphtheriae обнаружено, что их так же, как и в PIHA, можно подразделить на три условные группы- низкой (титр- 1:2), средней (титры- 1:4-1:16) и высокой (титры- 1:32 и выше) степени токскнооб-разования. Уменьшение титра на одно разведение в оценке груш средней и высоко® степени токсинообразоваЕия в ИФА против РНГА вызвано большей чувствительностью ИФА и соответствует одинаковому количеству токсина в 1 мл жидкой среды при таком варианте оценки результатов (Табл.6.).

Среди изученных штаммов с низкой степенью токсинообразования оказалось- 2.2%, средней степенью - 63.32, с высокой - 34.5%. Табл.6.Степень токсинообразования, определенная у штаммов C.diphtheriae в ИФА.

количество токсигенность величина,обратная титру

штаммов в РП 4 8 1Ь 32 И 1'2Й 256

90 90 Ü 2Ь 24 1Ь 10 2 3

% 100 2.2 8. .8 27.8 26.7 17-8 11.1 2.2 3.4

4.пршенеж узссренш методов дамиостиси

(РИГА И Ш) ДЛЯ ВЫШЛЕШЯ ТСКСЖД. 4.1. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РНГА И ИФА ПРИ ВИЗУАЛЬНОМ М ИНСТРУМЕНТАЛЬНОМ УЧЕТЕ. Проведен сравнительный анализ результатов, полученных при изучении 100 ктаг.:ов C.dlphiheriae в PI7U и ИФА одновременно. Титра РИГА и ИФА определяли визуально, при постановке ИФА измерял! еще • оптическую плотность (ОП), используя фотометр (Х=450 ем). Оказалось, что визуальное и инструментальное определение результатов КФА практически совпадало (Рис.1.).

Рлс.1. Рис.2.

Сравнительная оценка методов определения СТ: рлс.1.- при визуальном и инструментальном учете в ISA, рис.2.- ИФА и РБГА.

Кроуз 7-ш проб все значения распологена в границах нормального рзспредэлония, что указывает на совпадение результатов, полученных при визуальном и инструментальном учете в 9355- В 6-ти случаях результат при инструментальном учете несколько вадз, чем при визуальном г 7! в о,дноы случао - наоборот. На рис.2, представлены подобным образом титры токсинообразовамя тех see 100 стазов, изученных в РИГА и ИйА при визуальном учете результатов. Только в 9% случаев татра ЮА прэйтаэли вврхнп» границу распределения, и в одной пробе - нихнюо границу распределения.

Полученные далнкс позволяют утперадать, что для определения степени токешообразования возможно использовать любой из изученных методов - РКГА или КФА. Последний метод более удобен, т.к. пробы

ставятся в двух лунках, к учет можно проводить как визуально, так и инструментально. Однако, преимущество монет иметь РНГА, т.к. ее использование доступно лаборатории любого уровня.

4.2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РНГА И ИФА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ТОКСИНА В ПЕРВИЧНОМ ПОСЕВЕ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА. Особый интерес представляет воз-мокность использования разработанных методов РНГА и ИФА для выявления дифтерийного токсина в первичном посеве патологического материала. ЧувстБЯтелъность РНГА составляла 1..2х10~э- 4..7х10~* Lí/мл дифтерийного анатоксина, и 1х10~4- Ix10~s Lf/мл дафтерийного токсина, или 20-60 нг по белку. Чувствительность ИФА - 1.-Зх1С-1- 5x.10~s Lf/мл дифтерийного анатоксина, 2. .9х10_й Lí/мл двфгзр^йного токсина( или 4-10 нг по белку. Такой чувствительности достаточно, чтобы выделять самое низкое содержание токсина - 10"3-10~4 Lí/мл, зафиксированное Iouescu M.et al.,(1986).

Впервые били исследованы 210 образцов патологического материала, полученного из ротоглотки (зева и носа) от 105 больных дифтерией, ангинами и инфекционным мснонуклеозом, а так же от носителей токсигенных C.diphtheriae в РНГА и 60 образцов тех же коптшгеитов - в ИФА. Патологический материал засевали з аздкую питательную среду, подращивали в течении 6-18 часов. В 39% случаев результаты, полученные з ЮТА и ИФА, совпадали с клинико-бактериологичесюш диагнозом. Только в одном случае, когда диагноз "дифтерия зева" был подтвержден бактериологически, РНГА показала отрицательный результат. В другом случае у больного с лакунарной ангиной, обследованного на четвертая день заболевания, в материале из носоглотки методом ИФА выявлено наличие дифтерийного токсина в титре 1:4, в РНГА -1:8, бактериология отрицательная. При изучении специфического иммунологического ответа у этого больного, было отмечено нарастание титров противодифтерийных антимикробных антител в сыворотке крови, наличие высоких титрсв противодифтерийных антитоксических и антимикробных антител в слзове (титра 1:40-1:512 соответственно). Подобные системные и локальнзе иммунологические реакции, а также наличие токсина в титре 1:4 в ИД и 1:8 в РПГА не позволили нам исключить диагноз дифтерийной инфекции в данном случае.

Разработашше метода заставляют совершенно по-новому подойти к вопросам ранней диагностики при дафтерийной инфекции.

На представленной схеме (рис.З.) видно, что при современной

28

РисЗ. схш. штеигоюпяесюй диагностики ига

ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИЙ (1,11 2АРИАНШ) и ПРЙ

испальзомйии ускорениях методов - код, ткга, ифа^щД).

и^дит

ысслг2»< здния

сутки

I УЧЁТ РЕЗУЛЬТАТАХ

К«ссад«еши1 ¿юалге ¿4<«*<*> 1

ИТОКСиГСИЖИ нспзеип

пос«» &

ТГйКСЛМТКПО

УЧ£Ш РЕШЬТАт

рочтл »мц 43 Твксигечиме (челгаггасйЧ

УЧЕТРШАЬТШб

е?о~ьк** с 5-ти су*ок.

</*-£.I С/С90 гас

To»ccí^r-lcьu || «гсксигздчде.

(¡НТРСССПл.ЧИе

я» £ ьл;\totrrj

ш

IV

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ

яо индилоции пмссшо д КОА, ригд^ и<ГА.

б-'з "чг.

гибкая в*4- "А4" гелата-ШАГ »ИГА смьл

кок

и-ЭА/ Ригд

Ч!НиИГ

тлет ео»их Ъьчиа*

в»

ггсода*

Ш9ЕВ

и^А Ь 1*л»1ршс

пое*ь ь смдВк^ю

ПО АЮ^СМУ ВАРЦОНТ^

^ ^сле 3 о Сами й

бактериологической диагностике самый ранний ответ может быть получен только в 15-20& случаев на 3-4 сутки, практически это время достигает 4-5 суток, и даже 5-6, если используется транспортная среда (среда обогащения) или плотная питательная среда для первичного посева патологического материала, даюдая рост только через 48 час. Определить отсутствие токсина у изучаемых микроорганизмов (даже дифтерийных) по общепринятым методам возмокао только на 4-е (самый ранний ответ) или на 5-6 сутки. Введение в диагностику РПГА, ИФА позволяет дать ответ о наличии или отсутствии токсина одновременно у .'.щрооргаяазмев или в жидг-ой пробе с патологическим материалом уже на 2-е сутки или на 3-4, в то время как бактериологический ответ появляется только на 5-е или даже на 6-е сутки. Эти методы могут быть использованы как скрининг- тесты при массовых исследованиях по шщдпоказяЕиям и с профилактической целью. Достаточно постановки проб з ИФА в 2-х лунках для зашгачения о наличии или отсутствии токсина, что мсгсот определять тактику дальнейших исследований. Скрининг- тест апробирован при изучении 3140 проб в различных регионах РФ.

Таким образом, чувствительные и специфичные методы (ИФА, РИГА, КОА) позволяют выдать ответ о наличии или отсутствии токсина з исследуемом материале на 1-3 суток раньше традиционных методов. У некоторых слаботоксигенных штаммов продукцию токсина можно уловить только в ИФА или РИГА в апдкой питательной среде, тогда как на плотной питательней среде при постановке менее чувствительной реакции преципитации в агара не всегда возможно выявить токсин. Методы пригодны для определения степени токгашообразования штаммов C.diph-theriae. Отработаны варианты испольЕования этих методоз при диагностике дифтерийной ипфекцяя. Наиболее перспективным вариантом является скрининг-тест.

5.ГИТЛТШЬНАЯ СРЕДА IIA АШШШШЗДЕ С КСПШЪЗСВАЮ©! 0ТХ0Д03 хрози для пер&много посева.

Своевременность противоэпидемических мероприятий при дифтерийной инфекции во многом зависит от качества применяемых при бактериологической диагностике питательных сред. На момент начала исследования из коммерческих сред имелась только одна дифференциально-диагностическая среда Бучина, которая . обладала рядом серьезных недостатков и широко не использовалась. Низкие ингабирухщие свойства ХИНОЗОЛ2, отсутствие отечественных реазстивов при ее изготовле-

ник, хорошей питательной основы - все это привело к тому, что производство этой среды в настоящее время остановлено.

В лабораторной практике использовали среды, приготовленные на коммерческой питательной основе с добавлением крови - кровяной тел-луритовый агар (КТА), ила среда иКлауберг--П". В настоящее время нет ни одаой питательной коммерческой основы для приготовления кровяных сред для первичною посева при исследовании на дифтерию.

В качестве испытуемых основ питательной среды для выделения С.^рМЬеПае изучали как ашдкий ашнопептид с просроченным сроком годности, так и высушенный методом распыления в лаборатории питательных сред МНИИВС им.И.И.Мечникова. Одновременно испытывали смесь гидролкзина с гидролкзатом казеина и аминопептида производства мясокомбинатов гг.С.-Петербурга, Ставрополя.и Армавира, выпускаемые' только для лабораторных нузед. Технологические характеристики новой питательной агаровой основы на аминопептвде для получения питательной среда для внделения С.й1р1^Ьег1ае изучены в производственных условиях ШО "Аллерген". Отрабатывали - условия получения кровяных добавок для кровянпх геллурито^ых сред из .отходов (ьритроцктарная масса) 7-глобулинового производства (производство Сактгри&ЕЫх препаратов при ШШЭМ им.Г-Н.Габричевского), использоза.пч такие коммерческий препарат - черный альбумин. Питательная среда прошла широкую апробацию в практическом здравоохранении.

5.1.КОНСТРУИРОВАНИЕ НОВОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ ОСНОВЫ . ДЛЯ .КУЛЬТИВИРОВАНИЯ С.<ИрЫ;11ег1ае И КРОВЯНЫХ ТЕЛЛУРИТОВЫХ СРЭД ДЛЯ ЮС ВЫДЕЛЕНИЯ. Эффективность питательной основы для культивирования С.41рЫЬаг1ае определялась при сравнении основы ез аминопептиде с вноокоэлекишшми питатыннкш средами - на основе мартеновского агара, сухого питательного агара Д (в настоящее время не производится) и низкоэлективных сред - на основе сухого.питательного агара 1Щ, а также проводили сравнение со средой Бучина.

Было показано, что варианты питательной основы, приготовленной на аминопептиде, превосходили по ростовым свойствам варианты, сконструированные на основе смеси кислотных гидролизатов крови и казеина, последние уступали и по количеству и по размеру Еыроских на них колоний. При этом рост на питательной основе, содержащей ачинопеп-. тид, практически не отличался от роста на контрольной основе - мартеновском агаре с добавлением Л0% СКРС, а в ряде'опытов был лучше.

По-видимому, это объясняется более бедным в количественном отношении аминокислотным составом кислотных гидролизатов, а также дефицитом цистина, играющего вахную роль в метаболизме С.еИрМйегАае. Правильность этих предположений подтверждается тем, что при добавлении к смеси кислотных гидролизатов аминопептида и /или/ щетина свойства указанных вариянтоз улучшались, хотя уступали контрольной среде Мартена и питательной основе на аминопептиде. В паралле^ных опытах было установлено, что варианты, сконструированные на основе жидкого и высушенного ашнозептида, но с одинаковым количественным и качественным составом других ингредиентов, не отличались по ростовым свойствам.

Сконструирован оптимальный вариант питательной основы для культивирования С.й1рМЬег1ае на агякопептиде (1.5$). В случае использования гладкого амкнопаптпда на 100 мл питательной основы добавляли 25 мл якдкого аиянопептида. В качестве факторог роста использовали витаминный препарат ЭКД (экстрзкт кормовых дроааей)-0.5% и Ь-цистин (0.001:?). С целью улучшения элективных свойств и для подавления иягибпругацего действия жирных кислот, образующихся в процессе метаболизма, предложен вариант питательной основы с добавлением активированного угля (0.3/6). В пропись любого из вариантов входили КаС1 (0.4!!) и агар-агар (2.0%). Этот вариант был сравнен с агаром Мартена (Табл.7).

Табл.7.Сравнительная характеристика ростовых свойств испытуемой питательной агзровой основы в сравнении с агаром Мартена.

Питательная агаровая Число Число Ростовые свойства

основа опытов изученных Число колоний по размер

штаммов отнесению к по- колоний севной дозе в мм

Питательная агаровая

основа на ачипопептиде 30 18 85.0+5.4 0.7-0.8

Агар Мартена 30 18 30.0^3.2 0.2-0.3

Агар Мартена с 10% 30 18 82.0-4.8 0.5-0.7

СКРС

На основе аминопептида выявлены лучшие ростовые свойства, чем на агаре Мартена (р<0.01). Добавление 1056 СКРС к агару Мартэкэ сближало показатели. Все выделенные с опытной среды етшлы сохраняли свои первоначальные биологичес;ме свойства, так же как при многократном пассировании на ней штаммов С.сИрЫЛегаае.

Изучая возможность использования новой питательной основы для выделения С.£11рМ1зег1ае при приготовлении кровяных теллуритовых сред, показано, что при приготовлении последних уменьшается количество добавляемой крови в 3 раза по сравнению с использованием в качестве осноаи сухих коммерческих питательных агаров.

На кровяных средах проведены испытания е 3-х районах Мопсов с -кой области. Материал был взят от лиц, подлежавших обследованию по эшшгсказаниям и с профилактической целью (соответственно 554 л 1172 человека). 3452 пробы изучены на средах - КТА и Клауберг II, как на опытной, так и на контрольной (««гртзновоком агаре) основах, ¡{а сравниваемых питательных средах положительные результаты были зарегистрированы в разном числе случаев.

Сравнение кровязой теллуритовой среды на аминопептиде с ком- , мерческой средой Бучина прозедено при обследовании 653 человек, как больных дифтерией, так и бактерионосителей или контактировавших с дифтерийной инфекцией (Табл.8.).

Табл.8.Сравнительная эффективность питательной среды на аминопептиде и среда Бучина.

Питательная Число Выделено Показатель высе- Сроки выявления

среда посевов культур ваемости в % в часах

КТА нз 1306 33 2.53+0.3 24

амквопэптиде

Среда Вучипа 1306 17 1.3+0.25 48 .

высеваемости 1=1.35. отмечено значительное протаущеетго опытной среды. Число выделенных культур С.й1рЪ№ег1ае бшю почти в два раза больше, чем на среде Бучкна. То я:е отмочено и в отношении сроков формирования колоний. Ингибируюте свойства среды Бучша в отношении сопутствущей "-«джрофлорн были выраиены значительно слабее, что чрезвычайно затрудняло 'обнаружение колоний С.11рЬ^ег1ге.

5■ 2.КРОВЕЗАМЕШАИЩЕ ПРЕПАРАТЫ В КТА. Изучены отходы 7-глобулиЕозого производства - вр^трощггарзая масса (ЭРЫ). ЭР?1 была двух видов -после стерильного забора из Диаконов с кровью надосадка для получения 7-глобулина и после центрифугирования ЭРЫ из вскрытых флаконоЕ. Последний продукт был не стерилен к требовал консервирования тел-луритом калая. ЭШ в сочетании с теллуритом калия приобретал свой-

с!ва, способствующие стимуляции роста C.diphtheriae и ингибированию роста S.aureus. В жидком виде этот препарат (ЭРГ- фактор) сохранял свои свойства до 6-10 месяцев при 4°С. Высушенный ЭРГ- фактор во флаконах сохранял свои свойства до 2-х лет. Оптимальное соотношение компонентов и условий сушки ЭРГ- фактсра было установлено путем параллельного изучения 10-ти вариантов с 6-ю тест- штаммами C.diphtheriae и 3-мя тест- ¡тиками S.aureus. Оптимальным является соотношение 0.1 л ЭРЫ и 0.2 г теллурита калия (или 10 мл 255 раствора). Перед внесением теллурита kqje-я в 0.1 л ЭРМ необходимо добавить 0.02 л дистилироваЕной вода. Полученную смесь разливали в 5 флаконов и высушивали. Использовали при приготовлении КТА: 1 фл.ЭРТ-фактора + 200 мл питательной агаровой основы + 2 мл 2% раствора теллурита калия.

В качестве другого кровезаменителя использовал! коммерческий препарат черного альбумина. После изучения оптимальных разведений этого порошка, условий стерилизации, ростовых свойств C.diphtheriae, ингибирующих свойств S.av:reus, била отработана методика применения черного альбумина при выделении C.diphtheriae на КТА.

Пропись новой питательной среды на аиинопептиде (как жидком, так и сухом), а такке методчка использования крсвезамещакида препаратов включены з "Инструкция но бактериологической диагностике" двух приказов МЗ РСФСР No 575 от 1982 г. и Но 450 от 1986т.

В настоящее время совместно с НПО "Аллерген" (г.Ставрополь) производится отработка технологической схемы получения ко?лмерческай сухой питательной среды на аминопептиде и кровезамещаицих препаратов для Еыделеная C.diphtheriae. Составлена научно- техническая документация.

б.дж-дек перидшлуя - аялернатив&я метод днапюсши дкэтернй-ш тт-ада.

Известно, что при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний применяется метод ДНК-ДКК гибридизации, заключающийся в определении в исследуемом материале специфических последовательностей нуклеиновых кислот микроорганизмов с помощью комплементарных этим последовательностям ДНК-зондсв. Внедрение методов ДНК-ДНК гибридизации со спец::фичес}сю.с5 ДНК-зокда^м в практику лабораторной диагностики инфекционных заболеваний не только сокращает время проведения анализа к его себестоимость, но и позволяет обнаружить воз-

будителя непосредственно в клиническом материале без его выделения.

Разработка ДНК-зондов для диагностики возбудителя дифтерийной инфекции была непосредственно связана с изучением конвертирующих дифтерийных бактериофагов методами рестрчкционногс анализа и конструированием штаммок- продуцентов иммунотоксиноз, хозяев химерных репликонов, несущих tox+-reh дифтерийного токскка. Так, стабильные мультикопийнне рексибинсштызе шшзшды, содс-ркащие последовательности всего гена дифтерийного уоусина (tox АВ ига; tox A3'), ь также его структурных генов - tox А (или tox А') и tox В (или coz В'), сконструированные в лабораториях института вирусологи» (руководитель Лаборатории биотехнологии, и.б.н. Гаргез ИМ.) и ВНИИ генетики и селекции промышленных кироорггшизмов (руководитель Лзборатории биохимической генетики профзсеор Яшгобский К.К.), явились основой, для выбора ДНК-зопдов, позволяющих дпййерсхщировсть тсксигькные и нетоксигенные штаммы C.dlphthsriae.

6.1 .СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ЮКСИГЕНШДГ ШТАММОВ C.diphtheriae С , ПОМОЩЬЮ ДНК-ЗОНДА, КОШШЕНГАРНОГО tox^-ГЕНУ ДИССТ5£ИИН0Г0 ТОКСИНА. Гибридная длазмцда ptc^ 4-1- (7-18 т.д.ь.) - вектор рВЙ 322, Еесущй! полноценный tox"1-гэн была Есисльзована. кг?' дш-гзснд при ДНК-ДНК. гибридизации для обнаружения tox+-reHC2 у итаьгоэ C.diphtheriae.

Первый этьп исслэдозашй заключался в шределеьмя. оптЕмедьлкх условий проведения решали табритщзгции о целью использования ее для дифференциации тохеитешшх и-летоксйггенЕпх • штатов C.'liphttic-riae. Был выбрав опот- метод ДНК-ДНК табгадкзацта как ;.:етодетес:м более ираемлсный для диагностических лабораторий практического зра-воохранзния. Лизис клеток, денатурацию ДНК, цредаибредазационную обработку нптроцелжлозного фильтра и реакцию гибридизации с радиоактивном ДНК-зсндон (ДНК плазкгда ptox 4.1., меченная , зг? методом кик- трзнслящгз) проводили в соответствие с общими )>с1:сА:енд9ГС1гэл1 проведения слот- гибридизации." В качеств? контроля использовали немеченную ДНК плазмпда ptox 4.1. Пмдаетельный табрядазевдонняй сигнал наблюдался только в местам вавесекея на фгльтр нёмечензей ДНК плазмиды ptox 4.1. ГлбрЕдазацяоннлй сигнал отсутствовал в местах нанесения на фильтр "лизатез" клеток токсигенного оташа C.diphtheriae УП--В. Выло высказано предположение, что дакний феномен обусловлен отсутствием лизиса клеток - возбудителя дифтерии. Поэтому процедура выращивания к лизиса бактериальных меток были

модифицированы. Так, бактериальные клетки штамма C.diphtheriae PW-8 с цель» воздействия на липидннй компонент клеточной стенки выращивали в среде, содержащий 0.2% реионного детергента Tween-80 (Schiller et al., 1930). ПэцтидоглпкгЕояиЯ остов клеточной стенк:: разрушай? обработкой бактериальных клеток поваленными концентрациями ли-зоцж^а (до 10 мг/мл) и клетки лидировали додецилсульфатом натрия (БобкоЕа М.?., 1987, Roberts M.S. et al., 1987). Модификация первых этапов грогедения спот- гибридизации применительно к штамму C.diphtheriae PW-8 припала к появлению положительного гибрздзгациояного с;ггпал£ в местах нанесения оактериальннх клеток возбудителя.

Вместе с тем, разработана слсдустая модификация метода спот-гибрпдЕз-зцэг. Штамм C.diphtheriae РЯ-8 выращ.гзали на нитрсцеллшоз-ноы мембранном фильтре, помещенном на поверхность питательного агара. Обработку бактериакьвЕХ клеток лизоцгагом и их лизис проводили непосредственно на фильтре, лизис усугубляли инкубацией фильтра, обработанного додецнлеульфатом натрия, в парах кипящей вода. Такая модификация спот-метода ДНК-ДНК гибридизации так не приводила к появлению положительного та^рг^дизапионнсго сигнала в местах зыращи-ззния на фильтре штата C.diphtheriae PW-8. Чувствительность настоящего метода определяли с tzi:pobcee!m количеством бактериальных клеток штамма C.diphtheriae Р7/-8. Полоютелъннй гибридизационннй сигнал наблюдался при нанесении на фильтр лизата инокулята, содержащего пэ менее 104-10s бактериальных клеток. Это количество много меньше, чем количество бактериальных клеток в одной колонии (~Ю7-109). То есть данный метод позеолял проводить ДНК-ДНК гибридизацию с материалом только одной колонии.

Разработанный применительно к возбудтелв дифтерии метод спот-гибридизации был апробирован на 96 штампах, выделенных от больных и бактерионосителей. Предварительно все штаммы были дифференцированы на токсигенЕне к нетоксигенныэ по прдукции токсина в реакции преципитации. Положительный гибрчдизационнкй сигнал давали 52 изученных штамма, гибрлдизацяонный сигнал отсутствовал у остальных 44 штаммов. Результаты ДНК-ДНК гибридизации и реакции преципитации совпадали в 94 случаях. Два штамма No 7 п No 8 дали положительный гибри-дизацкеяный сигнал, но в реакции преципитации били идентифицированы как нетоксигенные. При изучении продукции токсина этими гатакмами с помощью КФА и 111 vivo на моряих свинках било установлено, что эти штамш! не продуцируют токсин и не вызывает некротической реакции.

Было высказано предположение, что в этом случае положительный гиб-ридизационкый сигнал обусловлен наличием в этих стадах нетоксиген-ного профага, родственного конвертирующему бактериофагу, послукив-шему источником 1о2+-гена при конструировать плазмшш ptox 4.1., па вектор pBR 322 фрагмент ДНК конвертирующего бактериофага включает не только последовательности tox+-reHa, но и некоторые нуклео-твдные последователности кориаефага. То есть палокйтелышй гаорида-зационный сигнал в случае штаммов No 7 и Но 8 был связан с "неточным" вырезанием tox+-reHa из конвертирующего бактериофага.

3 дальнейших исследованиях представлялось целесообразным оценить другие рекомбинашные мультикопи^ше пяазмяды, которые несут более "точно вырезанную" область tox+-reHa, как ДНК- зодды.

Таким образам, в результате проведенных экспериментов плазмида. ptox 4.1. была апробирована как ДНК-зонд, позволетний выявлять последовательность tox+-reHa дифтерийного токсина в 532. Разработан спот- метод ДНК-ДНК гибридизации па мембранных фильтрах для обнаружения в бактериальных клетках возбудителя дифтерии специфической последовательности tox+-re:ia. Показана принципиальная возможность использования метода ДНК-ДНК гибридизаций для диф£«р<шциацЕи токси-гсшшх и нетоксигсвЕых штаммов C.diphtherias. Ноишостью метод спот-гибридизации изложен в авторском свидетельстве "Способ нндчка'тпл токсигекных коринебактэрий дифтерии" (No 161Ê991, 01.09.90.).

6.2.ОЦЕНКА ПРОГНОСТИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ ОПЕРАЦИОНКД ХАРАКТЕРИСТИК МЕТОДА ДНК-ДНК ГЛБРИДИЗАЩИ. Представляло определенный натерэс изучение ряда параметров метода ДНК-ДНК габ2ядизацли, позволяете правильно интерпретировать полученные результаты. Для диагностических целей был изучен набер ДЕК- зондов, зыявлясегг хо.\зйементарность к toz+-reHy дафтерзЛюго то^синэ (АЕ) и к его фрагментам {to-jJ и toxB). Это спегифлзеокие ДНК- зонто : рАВС 124 toxAB',. pAZ 21У toxA" (Яш;овский Н.К., ЗдаговсхвЛ ¿.Г.), pSSS toxB' (rajwe)j М.Ы.). Изучены чувствительность, специфичность, грогяостпческая значимость (ПЗ) положительных (ПЗП) и отрицателъшгх 'П20) результатов. Значения этих величин определяли в сравнена; с общепринятым методом выявления токсигенных свойств в РП и в двух вариантах - а) слабый гибрадизационный сигнал условно принимали ьа отрицательный (Табл.9); б) слабый гибридизационзый сигнал условно принимали за положительный (Табл.10).

Значения определяемых параметров варьировали в зависимости от типа применяемых зондов и варианта интерпритации слабого гибридиза-ционного сигнала.

Табл.9. Результаты определения параметров метода ДНК-ДНК гибридизации (в ¡6) с набором ДНК-зондов (вариант а).

Используемый Чувствительность Специфичность

зонд пзп ПЗО

рАВС 124 -ЬохАВ' 97 ' 98 98 97

ьК1 219 гох А' 97 98 98 97

рББ 6 1;ог В' 99 94 95 99

Табл.10. Результаты определения параметров метода ДНК-ДНК зации (в %) с набором ДНК-зондов (вариант б). гибрида-

Используемый Чувствительность Специфичность

зонд ПЗП ПЗО

рАВС 124 1:охАВ' 97 87 90 98

рАг 219 хох А" 97 > 88 82 98

рБЭ б 1;ох В1 97 94 95 98

Установленные в ходе проведения экспериментов значения параметров, характеризующих систему ДНК-ДНК гибридизации как чувствительную, специфичную и прогностически значимую в 97-9835 случаев, особенно при интерпритации слабого гибридкзационного сигнала как отрицательного, позволяет рекомендовать зонды ^х АВ', сох А' и 1;ох В* для диагностических и эпидемиологических исследований.

Использование ДНК-зсндов в диагностике предполагает применение их, в первую очередь, в клинике. Для решения етой задачи в нашей лаборатории проводятся исследования по созеризнствованию ДНК- зондов, замене радиоактивной метки на биотзш-авидиновую систему детекции (Комбарова С.Ю.), совершенствуется набор ДНК-зондов, разрабатываются новые более чувствительные методы молекулярной диагностики (полимеразная цепная реакция), позволяющие сократить время исследования и увеличить чувствительность и специфичность при выявлении 1:ох+-гена путем его амплификации (Заиюш В.Л., Михайлович В.М.).

6.3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАБОРА ДНК-ЗОНДОВ, ВЫЯВЛЯЮ№ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ гох4- гена ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА И ЕГО ФРАГМЕНТОВ. В ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ. Показано, что нетоксигекные штаммы могут нести последовательность, детерминируетцую синтез дифтерийного токсина, выражения этого гена не наблюдалось. Однако, при определенных условиях, очевидно, возможно восстановление гох+-гена и его экспрессии (Сгоаап N. ег а1., 1983). Набором ДНК-зондов проведено изучение содержания полноценного гена, ответственного за синтез дифтерийного токсина, а также "дефектных" генов, содериадих последовательности нуклеиновых кислот в соответствии с частью гох А или ■Ьох В, у 259 токсигешшх и нетоксигенных штаммов С.й1рМ11ег1ае (см.Табл.11.).

Табл.11. гсхт-ген и его фрагменты в популяции С.11рМЬег1ае.

Еиовары штаммов Всего штаммов В т.ч. с деф. геном tox ÁB' tox А' tcxB' % от популяции

gravis mitis 61 73 токе 1 1 нет и г е н + н ы е ■ь 1.5

gravis Eitis 73 52- п е т о к 1 3 1 4 сиге + н п ы е + + + + x 7.2

итого 2Ü7 П 4.0

йнярлйиг» 4 ■нр.тпултгрй'купл штамма биоварканта mixis, которые несут полную последовательность tox+-reEa (АВ), 5 штаммсз (4-nltis и 1 gravis) несут последовательность только одной части tox'-гена, кодирующего фрагмент В дифтерийного токсина. Указанные 9 ш?а\г.:св токсин не продуцируют• Только в одном случае из 134 токекгенпых штаммов наблюдачи отсутствие гкОридизацтснвого сигнала со всеми тремя ДНК-зондами. В другом случае, штамм C.dlplitherir.o Ко 356-87 (gravis) давал положительный результат в КФА с ¡¿кАт к СООН- концевому участку 3- фрагазнта молекулы дифтерийного токсина, положительный сигнал с зондами tox АВ1 и tox Е* и не было сигнала с зондом tox А', что позволяет предполагать, что последовательности нуклеиновых кислот, детерминирующие синтез фрагментов дифтерийного токсина, не только могут независимо существовать, но и экспрее-скрозаться.

Таким образом, прослеживая миграцию tox+-rena или его субъединиц в популяции C.diphtheriae, можно выявить штаммы с "дефектными" генами как среди нетоксигешшх, так и токсигенных, прогнозируя этим Формирование новых токсигенных штаммов. Учитывая возможности экспрессии токсина без оуб'ьединицы А, можно полагать, что нетоксигенныс штэммы с субъединицей В являются эпидемически опасными. Если учесть, что при лизогеннсй конверсии конвертирующие фаги выбирают в первую очередь "мутннтные"'форхы (Croman N. et ai., 1953, 1983), то становится понятной возможность формирования токсигенных штаммов из нетоксигенных, несущих "дефектный" ген, комплементарный фрагментам конвертирующих фагов ß или ч-групп.

В настоящее время проводится работа по патентной защите штаммов E.coli СбОО г~пГ(рАВ0 124 tox AB'), E.ooli 0600 r~ra~(pAZ 219 tox A').E.coli C6C0 r~m~(pSS 6 tox В1),- продуцентов специфических ДНК-зондов, комплементарных tox+-reHy дифтерийного токсина, фрагментам toxA и toxB.

7.5ИС;ЮПЯ£СХ*2 СЗОЙСТЗА C.diphtheriae.

Вопрос о судьбе возбудителя дифтерийной инфекции, о перспективах его крадикации многие годы занимает умы исследователей. Чтобы последовательно решить этот вопрос необходим комплекс знаний, в первую очередь, о тех свойствах C.diphtheriae, которые определяют их существование, возможности изменчивости, объясняют механизмы пополнения популяции токсигенных штаммов.

7.1. ОСОБЕННОСТИ СТВДКР0СК01ШЧЁСК0Й ОРГАНИЗАЦИИ ПОВЕРХНОСТНЫХ СТРУКТУР В СВЯЗИ СИХ ФУНКЦИЕЙ.1При изучении ульграструктуры C.diphlheriae было обращено внимание на корреляцию токсигенноЗ активности клетки с ее тонкой организацией, а также механизму образования поверхностного материала клетки, т.к. известно, что специфичность взаимодействия бактерий с окружаицей средой зависит "но только от строения зслеточной стенки, но и от других ее поверхностных структур" (Кац Л.Н.,1971). Для удобства изложения все штаммы разделены на 4 условные группы: I группа - токсигенные штаммы и

1Электсронпо- микроскопические исследования проведены совместно с Высоцким В.В.

конвертанты C.diphtheriae, вторая группа - слабэтоксигенные штаммы С.diphtherias (токсигенные свойства не всегда выявлялись в РП, в ИФЛ - титры -1:2 - 1:4); III группа - нетоксигенные штаммы C.diphtheriae, IV группа - штаммы других представителей рода СогупеЪас-terium: C.diphtheroides, G.hoimanni, С.xerosis, C.ilavidum.

■ Общий принцип организации клеток изученных штаммов был характерен для всех грастоложителъных мироорганизхюв ь для всего рода коривебактерий. Изучены морфологические признаки, которые поддавались количественному учету и могли бы свидетельствовать о физиологическом состоянии культуры к моменту фиксации - процент делящихся особей, процент клеток, имеющих в цитоплазме гранулы волютина, и состояние нуклеоида. Токсигенные культуры отличались меньшим по сравнению с другими штаммами процентом делящихся особей (5—1036 про-. < тив 10-30%), большим числом клеток, содержащих гранулы волютипа (до 50Z против 30% и менее), л обособленной зоной нуклеоида. Все вто мокет свидетельствовать об ускоренном в сравнении с другими штаммами темпе развития токсигешзых культур, основная масса клеток которых через 18 часов ростаа достигала стадии покоя (зрелости).

У клеток токсигенных штаымоз лучше выявлялась слоистость клеточной стенки. Можно считать, что многосложность стеЕок клеток, обладающей токсигезасй активностью, свидетельствует об пх более сложном антигенном составе, что и было подтв£>рвдено в дальнейшей. У большипства клеток токсигенных штаммов в стенке выявлено до 7 слоев. Толщина стенок у клеток группы I и II (токсигенных и слабо " токсигенных дифтерийный штаммов) колебалась между 19-20 нм. У ¡слеток групп ill и IV (нетоксигеннкх к других представителей рода) с тега: при меньшей дифференциации слоев были толце - 23-25 км у нетсксигенных штаммов к до 32 ид у палочки ГсфлаЕа. Микрокапсула была характерным признаком у штажав с низкой продукцией токсина (II группа) и в TV группе (дкфтерсады и палочка Гофмана). Эти наблюдения противоречат некоторым данным, указывалцам на валхчие кап-сулярного материала у штаммов с ярковырааенэпми токеигеннкми свойствами. Однако, не зная природы наблюдаемой иьсрокапсулы, нет оснований считать, что она соответствуем истинней капсуле.

При культивировании штампов всех 4-х групп как в жидких, так и на твердых питательных средах, был обнаружен поверхностный материал двух типов ЭЦМ-1 и ЭЛМ-2. Этот материал отличался от образований, имеших структуру кристаллической- решетки, состоящей из белков,

продуцируем«! клетками в жидкой среде в стационарной фазе, описанный Kawata Г. & iíasuda К. (1972).

При фазово- контрастной микроскопии в полутонких срезах клетки как токсигенных, так и нетоксигенных штаммов имели тенденцию к агглютинации (когезии), вследствие чего з толще блока они, как правило, располагались кучками, содержавшими до десятка особей, при этом агглютинат ¿слеток был как бы облит тонким чехлом, а вся группа могла принимать вид причудливой капли.

При увеличении от 15 СОО(х) до 120 000(х) при оттененяи препаратов металлом или при негативном окрашивании у всех штаммов (4-х групп) обнаруживали пузыревидные ЭВД довольно правильной (сферической пли полусферической) форм!* размером до 2С0 ни, примыкавшие -непосредственно к клеточной стенке. Формирование этого ОЦМ идет за счет фрагментов мембранного чехла, который, скручиваясь. образует пузыревидное обрамление клеток первого типа (ЭЦМ-")- Она бывают различного размера и свободно пропускают пучок электронов. Ко вторым суткам наиболее крупные из них лизируются.

3IM второго Tima (ЭИй-2) формируются иначе: посредством трансформации слоя, ограниченного поверхностным плотным листком и основным массивом стенки. Локальные утолщения этого слоя могут образовывать либо пузырь:®, заполненные мелкозернистым содерашыым, либо выпуклости, достигаюдае иногда значительных Размеров. Уже на рашшз этапах связь пузырьков со стенкой может утрачиваться, но, оставаясь у поверхности, опи образуют "пенистое" капсулоподобное обрамление бактерий. Слияние соседних пузырей и выпуклостей, а такзе пузырей и выпуклостей соседних клеток приводят к образованию бактериальных конгло:«ератсв. При этсм пузыри, объединявшие соседние клетки, могут достигать сопоставимые с ними размеров, а затем лопаться, опороз-няясь во внешнюю срэду. Таким образом, образующиеся вследствие фрагментации внешнего мембранного чехла пузыри первого типа не имеют тенденции к слиянию и, следовательно, не способствуют агглютинации клеток. Пузыри второго типа проявляют такую тенденцию*) и способствуют клеточной агглютинации. Их образование и исходная локализация под внешним плотна.' листком стенки следует по схеме: накопление мелкозернистого вещества, его выбухание, слияние соседних пузырей и пузырей близлежащих клеток (когезия последних), разрыв и оперокпеппе ЭВД-2 во внешнюю среду.

ОЗрг.зозакие как Э11М-1, так и ЭЦМ-2 резко уменьшается ко вторым

суткам. Оба типа встречаются во всех культурах C.diphtheriae и других представителей рода, выращенных как на твердых, так и на жидких питательных средах, однако, в последнем случае ртот процесс происходит более интенсивно.

Можно предположить, что 315,1-2, способствующий агглютинации клеток, удерживает их на поверхности вукаристичсских клеток. Чтобы проверить это предположение изучены адгезивные свойства штаммов всех представленных четырех групп в реакции прямой гемагглютинации (РТА) при разных фазах роста, на тверды: к кздких питательных средах.

Существенным в етой работе явился подбор услоеий постановки РГА. Мы воспользовались разработанными методами (Костюкова H.H. и ДР. 1985, 1986, 1991; Ермолаев A.B. и др., 1987). Однако, для сох-' ранения поверхностных структур (ЭВМ) штаммы коринебактерий не отш-вали физиологическим раствором, не использовали каких- либо стабилизаторов или детергентов, не проводили трипсинизацшо эритроцитов. По этой причине использовали эритроциты человека (донора (0) группы) и эритроциты морской свинки.

При описанных условиях постановки опытов все коркнебактермн (четыре группы) проявили способность к гемагглвтиьация. Наиболее высокие татрь (от 1:16 до 1:256) выявлены в PTA с перзой группой штампов (токсигекныг и коьвертанты), с III к ГУ гряшеш титры были несколько ниже (разнице статистически не достоверна; при t=1.2 и 1.4 соответственно). Показано, что на вырагенность адгезивных свойств ."икроорганизыов влияют сроки выращивания. Титры в РГА с 1:16 и выае регистрировались практически во всех группах изученных штаммов через 15-20 часов pocia как на плотных, так и па злдких питательных средах; н? вторые и третьи сутки способность к гекагглю-тикации у штаммов резко педаль (t=3.4j. Такш образов, выявлена четкая корреляция сроков образования ЭЦМ-2 и адгезпзной активности штаммов в эти же сроки вцралргвгния.

Зависимости адгезкзной активности от патогенных свойств птам-мов не обнаружено. Итак, учястче ЭЦМ-2 в ггглйтгзгцки ии'ок, зависимость степени гдгезивности от времени выралдаанил штампов, совпадающего со временем формирования ЭЦМ, некоторые механизмы его формирования позволяют назвать ЭЦМ-2 структурами, ответственными за адгезию у коринебактерий, т.е. прилипание бактериальных клеток к опителизо при колонизации C.diphtheriae слизистых ротоглотки.

7.2. АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА С. diphtheria е. Представляет специальный интерес вопрос об антигенном составе штаммов C.diphtheriae, как токсигенных, так и нетоксигенных, а такие их культурально- биохимических и серологических вариантов. Из коринебактерий дифтерии путем обработки солевым раствором в комбинации с замораживанием -оттаивание». получали экстракты, содержащие соматические антигены преимущественно белковой природы, свободные от примесей токсина (Мазурова И.К.,1971- Филлипова Л.М.,1977). Экстракты были активны в реакциях преципитации в геле; методом иммуноэлектрофореза выявлено в штаммах C.diphtheriae до 14 антигенных компонентов, пять из которых явились обг^сги и постоянно присутствующими в экстрактах всех исследованных 25 штатов. В электрофорезе в полиакрнламидном геле обнаружено от 14 до 26 белковых компонентов, из которых у 7 относительная влетро-форетическая подеггхность совпадала для всех штаммов C.diphtheriae, а также выявлены фракции, варьирующие по числу и подвижности для разных штаммов (вариабельные антигена) -рис 4.

4—токечгчнные штаммы —

грэ&ис митис

X—нетокси генные иггаглы-»-митмс

-W1 2 13 А

га №87 <48?4 1М2Г Т79г

05 6Ь5 664 6<И 667663 «92 702 707 7381й37 ШЪ 2Г40 -ил? М70Ь О

045-548 351-0,55

0,40-0,(S 065-0€7

0,1

d,2

0,5

о/,

05 t

V ох 49

^ 2.6 17 :6 16 16 13 15 )<s 16 18 <8 17 16 14 22 13 20 18

число

линий'

Рис.4. Электрофоретэтеские белкогзе спектры различных штатов дифтерийных бактерий.

н — —

и

к». Ч~1

32 9ES t яссэ -

—

сыворотка

Rf Rf

0,95-0,97

булиИ

0,61

10.66-0,99 >пРеал1т-

I бумин

Таким образом, был сделан вывод о сложной антигенной структуре экстрактов дифтерийных бактерий и о наличии в их составе как общих, постоянно присутствующих, так и вариабельных антигенов. Так, токси-генные штаммы оказались более однородными и богатыми набором антигенов; нетоксигенные штаммы разделились на две условные группы -штаммы, близкие по антигенному составу к токсигенвкм, и штаммы, отличающиеся не только от токсигенных, но и между собой по набору и количеству антигеноЕ, т.е. штаммы с больших' набором вариабельных линий.' Нетоксигенные штаммы оказались в 4 раза менее активны в антигенном отношении по сравнению с токсптенныш npii иммунизации животных в равных условиях.

При сравнении белковых спектров C.diphtheriae вариантов gravis и mitis оказалось, что вариант gravis токсигенных штаммов имеет • больший набор антигенов, чем вариант gravis нетокснгенннх штаммов к более активен в антигенном отношении при шедЕПзеции животных; варианты mitis независимо от токсигенных свойств были более однородны. Определенные различия были выявлены у 4-х вариабельных фракций вариантов gravis и mitis.

При изучении антигенной структуры сехш пар генетически родственных штаммов (изогенных- tox- и их tox+ -кшшерталтоь) C.diphtheriae показано, что происходят изменения в наборе антигеЕнкх компо-нентоз экстрактов при фаговой конверсии. Эти изменения затрагивают только вариабельную группу антигенов, изменений в группе общих антигенов для токсигенных и нетокоигенннх штаммов при фаговой конверсии не происходило. Ь токсягевнсм штамме gravis Mo S65 в вдгмуно-электрофорезе в качестве контроля выявлялось Н антигенных компонентов, которые были обозначены условно памсра\£и. С 1-го по 5-й антигенные компоненты встречались во всех штаммах C.diphtheriae, в т.ч. и в изогенных. В вашабелънсЗ части антигенов наблюдались изменения (Табл.12). По-видимому, включение в геном C.diphtheriae tox- фага вызывает не только продукцию токсина, но влйяст и на синтез других антигенов кгетки. Эти данные показизаэт, что передача генетического материала у C.diphthariae возмогла и путем транедукцки.

Данные по изучению антигенной структуры объясняй? периодическую смену циркуляции возбудителя дифтерии различных биоваров, изученную при многолетних наблюдениях. Распространение вариантов gravis и mitis у больных дифтерией без возрастных разделений на тер-

ритории РСФСР показано на рис.5. Однако, у взрослых в 2/3 случаев выявляется вариант mltic, а у детей поровну вариант gravis и mitis до 1983 г. включительно. В 1985 г. удельный вес варианта gravis

Табл.12. Антигенный состав экстрактов корикебактерий дифтерии по Д2НЕНМ имыуноелектрофореза.

No So Антигены Токсигенные

п/п штаммов 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 свойства

i 411 + + + + + + + - + + + + - - -

паса 411-1 + + + + + + + + + + + + + + +

II 1180 + + 4- + + + + + + - - + + + -

пара 1180/15 + + + + + - + + + + + - + 4- г.

III 5/165 + 4- + + + + + + - + 4- + - - -

пара 5/165АВ + + + + + + 4-4-4-4- - + + 4 f

IV 1487 + + + + + + - + - + - + + 4- -

пара 1487АВ + + + + + - -4-4-4- + + + 4- +

V 4530 + + + + + + - 4- 4- - + X + f -

пара 81 4- + + + + + _ _ _ _ + + 4- 4- 4-

VI 7952 + + + + + - --+ + - - 4- 4- -

пара 7952К + + + + + - --+ + - - 4- 4- 4-

VII 7983 + + + + + + - 4- - 4- - + - + -

пара 7983К V + + + + + + + - + - + - 4- 4-

КОНТРОЛЬ-665 + + + + + + + + + + + 4- + 4- 4-

снижен во всех возрастных группах (до 1Ь.55Ь), а в 1987 К вновь

увеличивается до 36.836; у детей - до 5056; в 1989, 1990 и 1991 гг. удельный/вес варианта gravis увеличивается и соответственно среди детей составляет 68.056, 73-855 и 80.256; а среда взрослых - 51.156, 61.356 и 67.756. Удельный вес циркулирующее вариантов почти одинаков в 1980 г. и в 1989 г.; самые резкие различия в удельном весе наблюдали в 1984-85 гг. Такие саморегулирующиеся циклы составляют примерно 8-10 лет. Это явление можно объяснить тем, что, распространяясь, один из вариантов создает иммунитет, который в какой-то мере способствует ограничению циркуляции штаммов этого биовара и готовит благоприятные условия для распространения C.diphtheriae другого варианта с иным антигенным составом.

7.3-ПАТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА C.diphtheriae. Ведущую роль в патогенезе дифтерийного заболевания играет токсин. Его количество определяет, в основном, меру вирулентности и патогенности C.diphtheriae.

Уровень экспрессии гена дифтерийного токсина, локализованного в геноме коринефагов, зависит от ряда параметров - дозы гена, генотипа бактерии-хозяина и состава среды обитания.

Вопрос об уровне токсияообразоваяил циркулирующих, штаммов в настоящее время не может быть праздным. Elue в 60-е года говорили о "сапрофитизации", об утере токсигенных свойств популяции C.dlphthe-riae, в 19S6 г. Жданов B.W.. писал: "если встречи микроба происходят с организмом, полностью вейтрализуюцим действие токыша, то сохранит ли популяция бактерий токсигенный фаг, или отбор приведет превалированию кетоксигеяныл популяций?".

Данные, полученные на кивотных (bd-Q, Dim, Dtk) или в культуре тканей Костюковой H.H.(1970), Сухоруковой Н.Л. (1967), Черкасовой В.В. (1981), говорят об отсутствии "сапрофиаизацгш" к ьыдзлекзш в прошлые годы от 70% до 90£ттаммов возбудителя дифтерии высокой степени патогенности.

Разработанные варианты РПГ1 с антнтельша,! диагностикумом и ИФА i с мокз-слоналъннчи антстелами к С00Н- концевой части В- фрагмента молекулы дифтерийного токсина дали возможность изучить in vitro шталмн 0.diphtheria? по степени токсинообразовашл (СТ)1 собранные от больных и бактерионосителей с-1934 г. на территориях РФ, характеризующихся различным течением эпидемического процесса.

Самые высокие величины обра^тли среднеарифметических тптрсв отепенл токгашообрэзованпя наблюдали у татамиов C.dipjitheribe, выде-ленннх в 1986 г. -44.0, с 1939 г. по 1991 г. -55.3, 58,3 и 53,9 соответственно. Сямые низкие титры (27-0) .чафиксировыщ в 1937 г. (разница статистически достоверна) -рис.5.

В 1937 г. удельный вес штаммов с высокой CT регсстрирсзался только у 14.6% штаммов, в то Еромя как в последние года произошло резкое увеличение удельного веса штаммов высокой CT (в 1990г .43.7%). В 1986, 1987 и 1988 гг. низкие тчтры CT регистрировалась у '0%, 19,3 % И 15 56 штаммов соответственно, а в 1990 г. их было всего Л%.

Целесообразно привести несколько показателей, характеризуемых эгшдпроцесс в эти годы з РФ (Рис.5). 3 1934 г. показатель заболеваемости на 100 тыс. населения (133) составил 0.93, летальности (Л) - 3-2%, в 1936 г. - ИЗ сплкается до 0-5, Л -3.6Й, когдй'зщиепт тяжести заболевания в эти годы бил высоким - 14.5 и '¡2.8 соответственно. В 1987 г. ПЗ - такой же, как и в 1986 г., но регистрируется самый низкий показатель летальности - 1.5% и коэффициент тяжести -9.6. С 1990 г. увеличивается показатель заболеваемости, летальное:»:; и коэффициент тяжести заболевания (ПЗ - 0.82, Л - 3.62, коэф.тядес-

сщн.

af ;i ф/i ТЧТР

19S0 81 № 35 84. S? 36 87 S? 90 9ir

§-gr£v» a(./.) — ЗЗЙола^а^Р^Сг^а^ль

D-rniii* Ы) «c»5 сте.паиь г°кйиг«л>шо<1т-л (ст) v 1 J штаиряоБ

Рдс.5 . Харшиерискжа аиашш С. а.рМ'лепае . зыдзженшес ох ¿олзнж на 2«рритор2Е Pô за период 1930 - 91 si'.

ги - 17.9), вместе с тем, увеличивается СТ штаммов, циркулирующих в последние годы, и удельный вес среди них варианта gravis (до 80" в 1991 г.). Отмечены более высокие показатели СТ у этого биопара, зачтаая с т9СЗ г.

При сравнения средних показателей СТ атэммов, выделенных от Зслъшх а бактерионосителей, оказалось, что в 1986 г. и в 1987 г. эта показатели были выше у штаммсз от бактерионосителей (t=2.l). с 1988 г. наметилась тенденция к выделению штаммов от больных с более высокими показателями СТ (t=1.9, 2.0). Однако, при изучении СТ этаммов, объединенных одниг-л очагом инфекции, 91? очагов с-формирсва-ы однородшмз по СТ ятз^ыами.

При сопоставлеятш тянеста заболевания со СТ C.diphtheriae, заделанных от больных (39 чел.) с различными хлияическкш формами заболевания в 1987- 1990 гг. во ВлядаашрокоЯ области, было установлено влияние фактора вирулентности на тяжесть заболевания. Так, в

1987 г. от больных дифтерией локализованной формы выделены штаммы со среднеарифметическим показателем СТ- 10.8 при среднем показателе по области - 16.0. В 1988 г. и 1990 г. у штаммов от больных с локализованными формами показатель СТ составил 21.7, а при тяжелых формах заболевания в 1988 г. выделены штаммы с показателем СТ 41.6, в 1990 г. - 60.0 (t=2.3).

Отмечено, что при легких локализованных формах заболевания в 70%.выделялись штаммы, CÏ которых была в низких шш средних тлтрзх (от 1:2 до 1:16), при тяжелых формах высевали птеммы средней и высокой СТ (титры от 1:16 до 1:128), не виявлено ни одного штамма при тяжелых формах с низкой СТ. Получешшо данные коррелируют с данными Платоновой Т.В. (1992), показавшей, что проявление действия высоковирулентного штамма ярче насаждается у нспрггьитых детей, Содьныд ■ дифтерией.

Таким образом, изучая вирулентные свойства, структуру хромосомной ДНК циркудирупцих штампов на определенной территории РФ, можно дополнить характеристику эпидемического и иафекнионного процессов и прогнозировать их тяжесть. Так, с.\;эна цирку пирующего в прошлые годы биовара mitis па gravis, увеличение потсэзстеля СТ у штаммов, выделенных от больных дифтерией, г?я2ян«е высокой СТ на тяжесть заболевания, в основном, у непринятых, позволяют прогнозировать Солее тяжелое течение эпидпроцессч на ряде территорий РФ в блязайЕе годы.

8.НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИШ'О ОТВЬТА )ШООРГШ№к.

8.1.ИФА ДЛЯ ОЦЕНКИ АНТИТОКСИЧЕСКОГО Ж^ЩЩ-ТА У ВОШШХ ДИФТЕРИЕЙ К БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ. Определение только еушарных антитоксических антител в РИГА с коммерческим антигенным дизгностикуыом не позволяет выявлять особенности постинфекциопного киунитетг, поетоиу патогенетическое обосьоьание применения ряда лечебных средств для коррекции дефектов иммунитета у больных дифаерией и бгктешоноеите-лей затру,злено.

С целью оценки специфического иммунитета при дифтерийной инфекции был разработан ИФА с использованием ряда коммерческих ингредиентов и МкАт к СООН-кслцевоку участку ¿-фрагмента молекулы дифтерийного токсина. Сорбированное на твердофазном носителе (планшетах) МкЛт позволили сконструировать специфическую систему с использованием дифтерийного анатоксина (без его дополнительной очистки).

Уровень антитоксических антител разных классов определен у

больных локализованной дифгерией с учетом разн^сх сроков бактериовы-делэния (I груша - до 2-х недель, II - 1-3 месяца), у носителей токсигегших С.(11р;-гШег1ае с лратковремекрш (до 2-х недель) бакте-риовылслвнлем (III груша) п у больных ангиной (ГУ группа). При обслелоЕЗБИИ на первой неделе болезяк (Рис.6) уровень антитоксических у о'ольних I и II групп не превышает значение отрицательного контроля и ооотвзтетвует аналогичному показателю яри ангине. Статистически достоверно Е/Лпг он в III груше. В данамгке болезни (на 2-3 неделе.) у больных I группы происходит нарастание антитоксических 1^4 (~ в б раз). У больных II я III групп их нарастания не наблэдазтся._ _

Ед-ОП^ од: - А одЗ V- i I -U. Ж ж

12м| оу- 5-£ ____ 1 1 з _5

V: ГЦ- 1 1 "Г 1 1 i-1 1 1 s I К ■г 1 ,J 1 1

—i-,-1—>-1 1-1 1-

•\«9. 2äi«5.ir.aj. »aej. 1яе3. 2-Ьчеэ.

Рис.6.Содержание антитоксических IgAjIgM.IgQ в сыворотках крови у больных с кратковременкБм(1),ллительшгм (II) бактериовзделением, бактерионосителей (111) и ангинозных (1У)- средние ариф^етич.с доверительными интервалами.

Показатели антитоксических IgM у больных всех групп статистически не различимы как на первой, так и на второй неделях болезни, их диЕамшси от первой ко второй неделе не отмечается.

Уровень антитоксических IgG на первой неделе болезни у больных

I и II групп невысокий ( ниже аналогичного показателя при ангине), в III группе он статистически достоверно выше. На 2-3 неделе у больных I, II группы и бактерионосителей (III группа) происходит статистически достоверное нарастание этих антител. .Антитоксические IgG в III группе на 2-3 педеле достоверно выше, чей у больных I и

II групп. Уровень антитоксических IgA и IgG при ангине в динамике болезни не изменяется.

Таким образом, изучение антитоксических IgC показало, что пер-еой неделе дифтерии у привитых соответствует невысокий уровень, который в период самопроизвольного выздоровления на 2-3 неделе повышается, накопление IgA- антител происходит у больных, у которых отмечено более быстрое освобовдение от возбудителя.

У кратковременных бактерионосителей, в отличии от больных дифтерией, узе на первой неделе болезни определяются более высокие показатели антитоксических IgA и IgG.

Представляло особый интерес к этим данным получить сведения об уровне и динамике антитоксических-антител в секретах етих же групп детей. У Сольных дифтерией с кратковременным бактерковыдеденнем (I гр.) ко 2-3 неделе намечается тенденция к увеличению уровня антитоксических антител в слюне (с 0.78S i().2491 ло 1.055 -0.418), у • больных с длительным бактериовыделением в эти ке сроки их уровень значительно снижен (на 2-3 неделе -0.555 -0.331). S IIl-й группе, уровень антитоксических антител уже кз первой неделе значительно выше (статистически достоверно), чем у больны II-й группы на 2-3 неделе (1.161 -0.564). Нарастания этого урззня не происходит. При ангине уровень антитоксически антител ниже, ь I и III группах, динамики антител не отмечается (на 1-й неделе - 0.506 ¿0.269, на 2-3 неделе -0.499 -0.269).

Таким образом, И®А позволил выявить роль изстилкческчх гзнтител при дифтерийной инфекции. Лрзаще всего показана взаимосвязь длительности персистировзния возбудителя дифтерии и активностью IgA-системы изкроорганисма, которая выражается в накоплении IgA-антител в сыворотке крови к ангитоксачссгах антител в елкне. Нарастание IgG-антител у больных легкими формами дитторгш свидетельствует о вторичном тине иммунологического ответа при самопроизвольном вьздоровлении у привитых, что уточняем данные, полученные при определении суммарна антител. Высокий утювень IgG-антнтел у бактерионосителей уже на 1-й неделе нэолюденля указывает на ьнти-генвое раздражение, а не на заболевание. И дакс неародоогх'тельное обнаружение возбудителя на слизпстлх оболочках ротоглотки у бактерионосителей (до 2-х недель) обуелгшивает дальнейшее нарастание »нтцтсксццеских ________________________________

^Показаны среднеарифметические логарифмы титров с доверительными интервалами.

8.2.СОДЕРЖАНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И СЛХЯЕ БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ. -Полученные данные о некоторой роли IgA- антител в освобождении от возбудителя, побудили изучить показатели иммуноглобулинов в сыворотке крови и секретах бактерионосителей. Показатели иммуноглобулинов А, М, G сыворотки и SIgA, IgA и IgG сллны определены у 61 носителя токсигензнх C.diphtheriae. Бактерионосители по длительности наделения возбудителя были классифицированы по общепринятой-схеме: I группу (19 детей) составила транзиторные носители (однократное выделение возбудителя дифтерии), II группу (32 ребенка) - кратковременные носители (выделение возбудителя до 2-х недель), и III группу (10 детей)- длительные и затяжные носители (выделение возбудителя более 1 мес.).

Кратковременные и длительные (затяжные) бактерионосители подвергались лечении антибиотиками. Оказалось, что практически во Есех грушах "бактерионосителей (Рис.7) регистрируется низкие (ниже границы нормы) показатели IgA: у 26.3? I группы, у 46.9S II,группы и у 22.2% III группы бактерионосителей. После лечения антибиотиками удельный вес низких показателей IgA увеличивается (до 59.4S - II группа и до 33-3% - III группа бактерионосителей).

И □

х. *б ниже границы нормы быше границы нормы

Рис.7. Уделвнна вес (£) показателей уровня нмнуноглобу- . лянов A(I),lt(2), (3) у бактерионосителей гранзеторных (I), храмсаренещшх (П), длительных и затяжных (III) до (а) и после (Б) лечения антибиотикам.

Показатели и IgG превышали верхнюю 1-ранищ' нормы в 26.3% к 21.0% (соответственно и 1^) в I груше, в 9-3% и 21.9%-во II группе и в 22.2% и 11.1%-в III группе бактерионосителей. Удельный вес высоких значений 1$>! во II группе был несколько ниже, чем в 1-й (9-3% и 26.3%, 1=1.5), очевидно потоку, что травзаторное бактерионосительство (I гр.) наблюдалось на фоне хронического тонзиллита или ОРВИ практически у всех детей этой группы. Лечение антибиотиками приводит к снижению показателей всех иммуноглобулинов, особенно

При изучении БХ^к и слюны выявлялась та хе тенденция к спияеншо показателей во всех группах: удельный вес то.иьно нулевых ("О") значений Е1£А. во всех группах был практически одинаков и составил 28.6% ь I группе, 26.3%-во II группе и 22.2&-в 111-й. После; лечения антибиотиками удельный всс "О" значений Б1зА стал еще баньте: 58.6Й-во II группе (1=2.0) и 66.6%-в III группе (1=1.75)- Подобные показатели выявлены цри определена в секретах

Несмотря на большое число "О" янзчгз^ Е1еЛ и Х^А во всех группах бактерионосителей, м" определила срчда еарифич'гггчес:с:е показатели вгох змчуноглсбулиов. Выявлена та хг-тевдеызи ';-:' .сшпекгю средвеаримлетичсскнх показателей .31&» п поело 'лзее^зя антпбде-тиками. Так, во х1-й группг с?гдне8рь»з«<гтйче1;кгз шздзатеде гЦ^А снизились от 0.25-0.03 мл'мл до 0.11 А).От ыг/мл (1£А - от 0.26 -0.03 мг/мл до 0.15 -0.01 иг/ел), в 111-й гууппе, .31^. - от 0.23 ¿0.03 ыг/мл до 0.05 -0.01 мг/мл.

Содержание в елгае не изменясь после .лечения антибиотиками как у кратковременных (II гр-), так и у сотлтшпх носителей (III гр.). Так, во 11-2 группе среднеарифметические показатели 1£С до лечения - 0.62 -0.03 мг/ыл, после лечения - 0.70 -0.03 «гг/мл, в Ш-й группе - 0.49 ¿0.01 мг/мл и 0.26 ¿0.03 иг/мл соответственно. Разница меаду показателями до и ьоелэ лечения, а таксе, мезду II и III групп^н бакуерисноси-хелей' стмиотк^еста не дос-тоБерна.

Такса обраоо,^. покакала недоохаточна." лро£7ш.7м БТ^А и 1£А слюны ь 1&А ежоро^'.я кре-ли у солигт;.^ чют: С^:~'.-рцзпоситзлей зсех групп. Лечение а^тибнокжа^м резко еннгяет' вти показатели. Следовательно, подтверждается роль Т^А -системы одной из вэду-щих в патогенезе аосительетва ьри дифтерийной инфекции, а также необходимость в разработке и применении новых.патогенетически обоснованна средств лечения, альтернативных антибактериальной терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные, полученные на основе современных методов иммунохимии и молекулярной биологии раскрыли по-новому роль биологических свойств, ультра-, антигенной, генетической структур C.diphtheriae, в формировании популяции возбудителя> в течении эпидемического и инфекционного процессов. Возбудитель дпфтерни не утрачивал своих патогенных свойств ни з период низкой искусственной иммунизации населения (Костюкова H.H., 1971), ни в период 80-х и 90-х годов, когда используются современные вакцинирующие препараты.

Поэтому нет оснований для предположений, что на современном этапе разкитня популяции и инфекционного процесса возможна ирадика-цая возбудителя дгфтерии как вида. Саморегулирующиеся механизмы циркуляции и формирования гетерогенной популяции возбудителя дифтерии среди населения отражают эволюцконво закрепленные гибкие механизмы взаимодействия C.dip'atheriae и макроорганизма. Регистрация штаммов с высокой и средней степенью токсигенности в последние годы в 91£ случаев и биовара gravis в 80-85$ случаев, низкий охват населения прививками, увеличение тяжелых клинических форм, социально-экономические взрывы позволяют прогнозировать тяаелое течение эпид-процесса в ближайшие годы.

Совершенно очевидно, что для снижения заболеваемости дифтерией и ликвидации летальности необходимы научные разработки и практические мероприятия, предусматривающие как иммунизацию взрослых и детей, так и повышение эффективности всей системы эпидемиологического надзора. В связи с последним и были разработаны методы, оставляющие комплексную систему диагностики Еозбудителя дифтерии, токсина или tox^-гена, язотипичееких антитоксических антител и наблюдения за биологическими свойствами циркулирующих штаммов, миграцией tox+-reHa или его фрагментов. Стадо возможным в ряде случаев исключить трудоемкий и долговременный этап выделения чистой культуры и использовать упрощенные схемы исследования, скрининг при массовых обследованиях по эпидпоказаниям, что позволяет проводить ранние противоэпидемические мероприятия в очагах дифтерийной инфекции.

Некоторые механизмы взаимодействия микро- и макроорганизма (наличие материальных факторов прилипания C.diphtheriae на слизистых ротоглотки больного и бактерионосителя, состояние иммунной системы, как гуморального системного, так и местного иммунитета) суще-

ственным образом дополнили наши представления о патогенезе бакте рионосительства.

Ранее нашими исследованиями и работа™ других авторов (Бочков В.А., 1983; Шмелева Е.А., 1992) вскрыта роль антимикробного иммуни тета в персистировании возбудителя дифтерии. Показано, что антибак териальные антитела, обладает протектигшаги свойствами. Не мене важную роль играет присутствие антибактериальных и антитоксически антител как в слюне, так и в 'крови больных м бактерионосителей Особую роль играет состояние IgA- системы в защите организма о персистирования возбудителя. Низкое "содержание Slg-i' к Ig4 елкны ряда бальных и бактерионосителей указывает на снигенную барьерну функцию слизистых в месте вегетации возбудителя дифгьрж*. Эти да" ние оифывают возможности для создания иммуншатогенетически обос нованного лечения бактерионосителей.

В№№

1.Разработана комплексная система лабораторной диагностики к наблп

дения за возбудителем -дифтерии. 2.Чистые антитзла.из .высог.отЕтражшл: антитоксических сывороток кро лика, полученане при длительной хаагуннизации дифтерийным анаток сином, язьлись основой при хонструировслвч диагноспжунов как дл КО А, так к дли РИГА,' гнявляешх дифтершйпзй токсин. -Чув?тк:тель ность и специфичность препаратов в.10-100 раз превышала аналоги полученные из ш.элупноглобуллневых фрзкцпй ели' енвороток и соста вила 0.003 - 0.002 ЬГ/ыл в КО» и 0.001- 0.0004 Ы/мл в РНГА. 3.Отработанные услов:тя постановки КОА, -РНГА и Ша, способы культч дарования патологического материала в жидкой, питательной средс учеть к интерпркта?пщ результатов позволяют на приэдидкально но вом уровне проводить диагностику .дифтерийной иилегзде:. - Высока чувствительность и-специфичность,' реакций, хорошая воспроизводи мость результатов,, сохранение-сроков, вядачк, ответа на 1-3 сутс по epassesra с традт(яонны<«"мехольмМ'>Ьл)^с$в«5ная ухязшат в возможности замены последних, в первуа, счередь , Рц, ускоренные методами даалао'стсяка'.' Высокая зузстщтзльность ¡¿этодое позволяв выявлять йт^ммы-O.uiphtherias с низкой продукцией тококна.. 4.Впервне отработана новая, рациональная схема исследования, щ которой опускаются этапы выделения чистой культуры при массови обследованиях по эпидпоказанилм, что. позволяет проводить- ранни

мероприятия в очагах дифтерийной инфекции. Некоторые технические преимущества ИФА (визуальный и инструментальный учет реакции, постановка реакции в двух лунках и др.) выдвигаю? его на первое место среди ускоренных методов диагностики, однако, преимущество может иметь РИГА, т.к. ее использование более доступно лабораториям.

5.Разработаны и апробированы широкой практикой питательная среда на основе ахннопептида для первичного посева материала и заменители дефЕбриЕировашой крови при приготовлении кровяных сред в лабораторных условиях. Эти разработки позволяют проводить идентификацию выросших колоний уже через 24 часа роста,"что сокращает сроки исследования на одни сутки и его себестоимость.

6.Разработан способ РЕдехации токоигенных C.diphtheriae по специфической последовательности tox+-reHa в спот- гибридизации с ДНК-зонда»ш. Способность метода выявлять 104- 10s бактериальных клеток вне зависимости от степени токсинообразсвания C.diphtheriae выдвигает этот метод в разряд ведущих в централизованных лабораториях с контрольными функциями.

7.Впервые показана с помошью метода ДНК-ДНК гибридизации с ДНК-зондами, комплементарными tox+-reHy дифтерийного токсина (tox АВ') и его фрагментам (tox А" и tox В'), миграция tox+-reHa в популяции штаммов C.diphtheriae. 1% нетоксигенных штаммов C.diphtheriae. несли tox"1-ген или его фрагменты без их экспрессии и 1& токсигенных штаммов - дефектный tox+-reH с его экспрессией, что указывает на скрытие возможности популяции в формировании потенциально вирулентных штаммов.

8.С помощью РНГА и ИФА определены патогенные свойства штаммов C.diphtheriae in vitro. Сравнительное изучение показало равновоз-можные свойства этих методов в определении высокой, низкой и средней степени токсинообразования штаммов C.diphtheriae. Установлено, что с 1984 по 1991 гг. циркулируют штаммы C.diphtheriae разной степени токсигенности. С 1988 г. регистрируются штаммы высокой степени токсигенности. Имеются различия в степени токсигенности у биоваров gravis и mitis. Показано, что при тяжелых формах дифтерийной инфекции выделяются высокопатогенные штаммы.

9.Выявлена корреляция токсигенной активности клетки с ее тонкой организацией. Установлены различия в толщине и структурной органи-

зации клеточной стенки C.diphtheriae. Для токсигенных штаммов характерна многослойность, что свидетельствует об их более сложном антигенном составе. Определение белковых спектров у C.diphtheriae выявило наличие обща, консервативных, и вариабельных антигенов. Токсигенные штаммы C.diphtheriae охазались более однородными с большим набором антигенов, нетоксигенные штаммы разделились Hi. две группы - штаммы, близкие по антигенному составу к токсиген-ным, и штаммы, отличающиеся не только от тсксигезтнах, но и иезду собой по набору и количеству антигенов, т.е. штампы с большим набором вариабельных лиаий. Резными методами показано от 5 до 7 общевидовых антигенных компонентов и не менее двух- общеродовых. Более "полноценной" (упорядоченной и активной) оказалась антигенная структура биоварианта gravis у токспгезных штаммов.

10.Поверхностные структуры C.diphtheriae и других видов этого рода содержат вкстрацеллюлярный материал, ответственный за прилипание бактериальных клеток к эпителию при колонизации C.diphtheriae слизистых ротоглотки.

11.Разработанный МФА для оценки антитоксического иммунитета выявляет изотопические антитоксические антстела в. сыворотке крови, которые более полно характеризуют оссбегпоети ишуклого ответа у больных дифтерией и бактергоносэтелгЕ, по сравнению о методами РИГА и Иенсена.

12.Установлена роль I¿Л- систем в патогенезе носительства цг". дифтерийной инфекции. Резкое сшясевие Igk сыворогсл крови м SIgA се:фета у носителей токенгеншх C-diphtiier-iae особенно после лечения антибиотиками ос'оеновывзьт необходимость разработки новых иммунопатогечетических средетз лечезая бактерионосителей.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИСОД>ТАЦ№|

1.Мазурова И.К. Малышева O.K..Вочкова В.А. Филиппова Д.М. Изучение механизма формирования прот^вожкробгнх антител . разлгпгой физпко-хлжчес::ой природы.// Х.ьшкрэб. ,эпнд. .ишуиол., 1974; Ес.7«С. 1С8-112

2.Мазурова К.К. .Малышева O.K. .Зыбгша T.U. йизикс-химичзс;;ая природа аптетоксичсскях к антимикробных антител при различных формах дифтерийной ньфекцги и при иммуш!зацьи.// Материалы конф. по острым детским инфекциям, ШИК5М ьм. Т.К. Габричевского, 1975, т.XVI, С.83-87

3.Бочкова В.А..Фмытоьа Л.?а..Мазурова И.К. 0J антигенной структуре токсигепных и нетокеигенпых дифтерейных микробов.// Материалы конф. по острым детским инфекциям, ИНИИЭМ Нм. Г.Н. Габричевского, 1975, т.XVI, С.65-67. ' '

4.Высоцкий В.Е..Мазурова И.К. Электронно-микроскопическое изучение

8 представителей рода коринебактерий в стационарной фазе развития.- • // Материалы кояй. по остгам детским инфекцигал, МНИИЭМ "им. Г.Н. Габричевского, 1975, т.XVI, С.68-72.

5.Мазурова И.К..Высоцкий В.В..Филиппова Л.М..Зочкова В.А. Некоторые данные о сравнительной характеристике представителей- рода Корине-бактериум при решении вопросов тгксоно.чии нетоксигенных дифтерийных микробов.// Зпид..диагностика и проф. кишечных, респир. и природно-очаговых инф.: сб. науч. работ ШИИЗМ им. Г.Н. Габричевского," 1975, С. 147-149.

6.Высоцкий В.В..Мазурова И.К. Сравнительное электронно-микроскопическое изучение 8 представителей рода Коринебактериуы, выращенных на твердой питательной среде, в стационарной фазе развития.// Z. микроб.,эпэд.,тад!уЕОЛ.,1976, No.9, С.121-126.

7.Пушня В.В..Мебель Е.Д..¡Лапотников А.А.,Сухорукова Н.Л..Мазурова И.К. Клинико-диагностическое значение некоторых иммунологических методов для исследования и диагностики дифтерии зева у взрослых.// Военно-медицинский журнал, 1976. No.10, С.50-52.

8.Мазурова И.К..Филиппова Л.М..Бочксвз В.А.,Применение зритроцитар-Hoi-o диагностикума гз коринебактерий дифтерии для изучения антибактериальных антител при дифтерийной инфекции.// Сб. работ XVI Все-ссюз. съезда мзкроб. и эпидем.,1977, т.2, С.38-40. •

9.Филиппова Л.М.,Мазурова И.К.Долчев Н.В. Характеристика соматических антигенов коринебактерий дифтерии по данным электрофореза в ПАДГе.// Там se С.40-42.

Ю.Высоцкий В.В..Мазурова И.К. К вопросу об экстрацеллолярном материале некоторых представителей рода Коринебактериум (электронно-микроскопический аспект).//Ж.кикроб.,эпид..иммунол.,1977,No.8, С.90 П.Мазурова И.К. Роль прогизсшпсрсбпых антител в пассивной защите организма от дифтерийной инфекции./'/ Острые детские инфекции: сб. науч. трудов МНИИЭМ ш. Г.Н. Габричевского, т.ИХ, 1978, С.26-34.

12.Филиппова Л.М. Долчез Н.И. .Мазурова И.К. Фракционный состаз экс-трзктов коринебактерий дифтерии по данным ионообменной хроматографии и гель- фильтрации.// Микробные антигены (выделение, свойстза, приненение):сб.тр.МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского, т.XX,1978, С. 118-121

13.Филлипова Л.М..Мазурова К.К. Изучение соматических антигенов коринебактерий дифтерии методом электрофореза в ПААГе.// Микробные ^ антигены (вэтелекие, свойстза, применение): Там же С.122-125-14.5очкова В.А. .Мазурова И.К. Антибактериальный иммунитет при дифтерийной инфекции и его роль в патогенезе носительства токсигенных коринебактерий дифтерии.// Проблемы эпид. и клиники инф. болезней: сб. тр. МНИИЭИ им. Г.Н. Габричевского, 1979, т.XXI, С.66-70.

15.Филиппова Л.М. .Мазурова И.К. .Крылова М.Д. Долчев Н.В. Иммунохи-мическое исследование изменений в антигенной структура коринебактерий дифтерии при фаговой tox -конверсии.// Там же, т.XXI, С.78-82.

16.Мазурова И.К..Бочкова В.А..Сальникова Г.П. Бактериологические исследования при дифтерийной инфекции.// Методические рекомендации, М.,1980, МЗ РСФСР.

17.Мазурова И.К..Бочксва В.А.,Сальникова Г.П. и др. Методические указания по бактериологической диагностике дифтерийной инфекции.// Приложение No.3 к приказу No.575 МЗ РСФСР, 1982.

18.Мазурова И.К.«Филиппова Л.М. Иммуносеротипия при дифтерийной инфекции (экспериментальные исследования по антимикробному иммунитету).// Виол, препараты для проф..терапии и диагностики заболеваний: сб. тр. МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, 1983, т.ХХН, С. 139-143-19-Маргулис И.Л..Бочкова В.А..Мазурова И.К.,Головина Н.М..Использование кровезаменителей с истекшим сроком годности б качестве основы

питательной среда для коринебактерий дифтерии.//Эпэд.,микроб. i проф-ка капельн.ивф.:сб.тр.МНИИЭМ им.Г-Н.Габричевского, 1983,С.62-6'

20.Мазурова И.К. .Бочкоза В.А..Маргулис И.Л..Головина Н.Ы. Кровяни; теллуритовые среда на основе аминопептида с истекшим сроком годности для индикации коривебактерий дифтерии.// Лаб. дело, 1985, Ко.8, С. 498-500.

21.Мазурова И.К..Григорян Г.К.,Бочкова В.А. и др. Изучение токсино-обргзования коринебактерий дифтзрии на различных питательных среда: и индикация экзотоксина экспресс- или ускоренными методат-м диагностики.// Тез. докл. V Bcepon. съезда иикр. и эпид.,М., 1985, С.38-40

22.Маргулис И.Л..Бочковг В.А..Мазурова К.К. .и др. Новая питательна) среда для коринебактерий дифтерии.// Там i:e, С.44-45. 23-Бобкова Ч.Г..Маркина С.С..Мазурова И.К. и др. Применение . метод: молекулярно» гибридизации для идентификации токекгенных когтинебак-терий.// Мол. структура бактериальных токсинов и генетический контроль их биосинтеза : Приложение к Тез. I Всеооюз. конф.,М.,¡9ЬЗ. 24.Свиридов В.В, Зайцев Е.М..Дельвиг ¿.а..Мазурова И.К..CeuoEo: Б.Ф. Применение мопоклональвпх антител для определения ДЕ£тернйног1 токсина и его структурой кешонектов.// Хурн. мол. генетики, мюер к вирус., 1986, Ко. 1, С. 30-3i*.

25-Мазурова И.К.,Ко>.!бароза С.Ю.,Сальникова Г.П.,и др. Методически указания по бактериологической п серологической индакацнк возбуди теля дифтерийной интенции и его токсина.//' Приложение No.4' к прика зу Но.450 МЗ СССР, 1986.

2ь.Манвелова H.A. .Баранова Г.В..Мазурова И.К. и.др. Современные по дхода к совераенстзовзтш препаратов к^^нопрсфиактис! да5те рии (обзор).// ИныунопрсфилгктЕка детекгх капельных и ш.' неф. ,сб. тр. МНИДОМ ш. Г.Н. Габричевского, М.,1937, С.5-7.. . £7.Якубович Н.В..Возиков И.О. .Еьгссовс М.А.,Мазурова И.К, н др. Кло нироЕачие структурной части г ев а из C.diplitiicPlae Р?.'-8 к вкспрзсеи его делеционного производного в Е. coli // журн. мол. генетики микр. и вирус.,1°87, По.11, С. 13-18.

28.Мазурова И.К. .Никитин Д.Г. Современные, цзтоды выделения и иден тафакацш возбудителя дифтерит и его токсине.//. Материалы цробл комиссии "Микробиология": сб. н?уч. то. ИЭМ и,!. Н.Ф. Гамалеи AM СССР. 1988, С.119-122.

29.Свиридов В.Б. .Зайцев Е.М. .Луговая А,Э. .Мазурова И.К. и др. Ишу нодиагностика дифтерии при помощи нсбора "ДЕфтерия-Моаозззь;".// Тез докл. Всесоюз. конф.: Совтемен. направления создания кпд. диагнос тикумез, M..1983. С.43.

30.Фельдман Ю.М.,Махгшева Л.Г..Мазурова И.К. и др.. Мотодачесхие ре комендации по применению модафЕлздровэпной ерэдо Пизу и илдЕкаторны бумажных диско j для ид&нг^ЗЁкацЕи, биохимического ютзьрсвания. и ое теделенля ккоигепкости дяфа-ерайньп i-щкробов.// МЗ'СССР, M.. I9S8.

31.Мазурова И.К. Новые подхода в изучении биологии возбудителя да4 теряйко^ иЕфекции.// Имыунобиачоютскае препараты нового поколени и методы их контроля : об. науч.. тр. ИЗМ им. H.ff. Гамалеи АМН СССГ 1983. С.120-123-

32.Комарова С.И. .Мазурова И.К. .Гараев K.M. Характеристика кориае бактерий дифтерии, выделенных в очагах дайгери^лой ипфекщэ:.// Me; реф. куш., 1988. раздел III, No.8. щбп.3062.'

33-Мазурова И.К.,Ко«бароьа С.Ю..Яровая Л.М. и др. Реакция ксагглх ■пшашш для выявления дифтерийного токсина.// Ж. микроб.,стыд. мунол.,1989, No.3, С.68-71.

34.Маргулис И.Л..Головина K.M..Мазурова И.К. и др. Оценка ьффекип ности новой сухой питательной среды для выделения C.diphtlieriae./

Ж. микроб: ,ышд..иммунол., 1989, No.3, С.20-21.

35-Мазурова И.К. .Потемкина Е.Е..Свиридов Е.В.,Зайцев Е.М. Детекция токсина и сценка степени токсинообразования C.dipiitheriae с псмощыо иммуно-ферментлого анализа./Ж.микроб.,эпид. .шмунол., i$33,Но.6,С.66 Зо.Бобкова М. Р. .Косарева С.¡0. .Мазурова И.X. .Маркина С.С.Применение фингерпринтногэ анализа ДНК для дифференциации популяции токсигеп-hüx C.diphthsriae.// микроб.,эпил.,мл!унол. , 1939, Ко.7, С.23-30.

37.Мазурова М.К..Лотэжкм Е.Е. .Комбгрова С.Ю. п др. Бактериологический контроль как элемент эпиднадоооа за дифтерийной инфекцией.// Тезкси Z7TI1 Всесоаз. съезда 1!ЭП, М.,1989- С.79-80. •

38.Маркина С.С. .йгксимсза H.H.,Магурсва И.К. и др. Влияние впиде-г,тслоги?еокого надзора на эпидемический процесс при дифтерии.// Там s:e, С.33-85-

39.Мазурова Ü.K.,Поте--жипа Е.Е.,Яровая Л.М. и др. Ускоренные методы лабораторной диагностики дайтеряйной изйекции./Лйа^'нобиологичеокие пропаратц:еб.науч.тр. МНС1Э.Ч ям.Г.Н.ГабричеЕского, М.,1989, С:77-80

40.И2зуроза Х.К. .Потгмклна Е.Е.;Григорян Г.К. и др. Определение степени токсгтноэбразоваЕля етш.е/ов C.dipiitheriae в реакции непрямой гемагглкмшацан.// Гаг.; as, С.80-35.

41 .Пс?е?:к2ЕД E.K.^азуроьа К.К..Платонова Т.В. и др. Особенности местных тщунслогЕческиг реактай при днфтерЕйнсЯ ннфз!схги у детей.-// Вопр. охраны иат. и детстаа, 1939, No.10, С, 34-38-42.Поте;лкина 2-Е.,Мазурова И.К. .Платонова Т.В. и др. Оценка специфического п?^унитета црч дифтерийной гнфгкцти с поиотчьв ISA.// 1-й Всесоюз. и'-муъ-ол. съезд: тез. докл. ,М., 1989. т.1, С.240. 43-Мэгташ£ С.С..Мазурова И.К..Коркснкова М.И. и др. Н-тога эпидемиологического надзора за дойтерийной инфекцией ьо ЗладилзгрскоЗ области.//. Эпвдпадзор как оснсзз профилактики капельных и кип. янф.; сб. науч. тр. йШ я-'.. Г.Н. Габричевского, М.,1950, C.4S-57. 44.Потемкина 2-Е. ,:.!агугова К.". .Платонова Т.В. и др. Мыиунологичес-... кие аспэктн дзйтерст у детей.//Эпиднадзор как основа проф-ки кап. и каш. квф. ;сб.науч.тр. КНИИЭМ Ен.Г.Н.Габричевского, М., 1990, С.72-79 45-Мазурове И.К.,Ксмбарова С.Ю. .Заикин В.Л. Молекулярно-биологйчэсктс метода в системе зпиднадзора за возбудителем дифте-TKösotS инфекциг.// Тэм se, с.80-86.

4б.Бобкса ¿-Ф. .Бобкова Н.Р.,Гараев M.IÍ. ,Комбарэва С.Ю. .Мазурова И.К. .Глатшина С.С.Способ индикации токсигенных коринебактерий дифтерии.// A.c. Но.1б1б99I os 01.09.90.

47-Мазурова И.К.,Потемкина Е.Е. .Кокбзроза С.Ю. и др. Индикация дифтерийного токсина методом жзмунофзргентного анализа и в реакции непрямой геиагглютннации (совершенствование лаб. диагностики дифтеритной инфекции).//Методические рекомендации, утв.МЗ РСФСР,1991

48.Мазурова К. .Заикин В.Л. .Кривопалова Н.С.и др. глгкроблологччес-кая диагностика бактериальных инфекций: настоящее г будущее.// Тез. докл. VI Бсгрос. съезда НЭП, Н.-Ноегород, С.35-35-

49.Мазурова И.К..Потемкина Е.Е. .Аненкова H.A. и' др. Определение -степени токсинообразованпя - новый эпидемиологический признак при слекенкн за возбудителей дифтерийной инъекции.// Тез. докл. VI Все-рос. съезда МЭП, Н.-Новгород, 1991, т.1..С.36-37-

50.Маркина С.С..Максимова H.W..Мазуроза И.К. и др. Оценка эффективности эпидемиологического падзора за дифтерией.// Там se, С.37-38.

51.Потемкина Е.Е..Мазурова И.К..Платонова Т.В. Локальный иммунитет при бактерионосительстве токсигенпых коринебактерий дифтерии.// Там хв, С.44.