Молекулярные механизмы шапероноподобного действия амфифильных белков и пептидов

Лютова, Елена Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы шапероноподобного действия амфифильных белков и пептидов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы шапероноподобного действия амфифильных белков и пептидов"

На правах рукописи

ЛЮТОВА Елена Михайловна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ШАПЕРОНОПОДОБНОГО ДЕЙСТВИЯ АМФИФИЛЬНЫХ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ

Специальность 03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2007

003162323

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им А Н Баха РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Б.Я. Гурвиц

доктор биологических наук, профессор С.С. Шишкин

доктор биологических наук Н.П. Шарова

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов

Защита состоится «» ноября 2007 г в № (РР часов на заседании диссертационного совета К 002 247 01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им А Н Баха РАН по адресу 119071, Москва, Ленинский проспект, д 33, корп 2

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу 119071, Москва, Ленинский проспект, д 33, корп 1

Автореферат разослан «У/» 2007 г Ученый секретарь диссертационного __^

совета, кандидат биологических наук Ау^ д ф Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Большой интерес к изучению механизмов действия особого класса белков - «молекулярных шаперонов», основной функцией которых является участие в сворачивании полипептидных цепей в нативную структуру, вызван проблемами, связанными с процессами денатурации и агрегации белков вследствие нарушения их конформации при стрессорных воздействиях различного характера

Молекулярные шапероны обладают способностью взаимодействовать с развернутыми или неправильно свернутыми белками, что препятствует связыванию этих белков между собой и последующей агрегации Подобное взаимодействие приводит в конечном итоге к сохранению или восстановлению нативного состояния белков

Многообразие действия шаперонов велико они участвуют в различных внутриклеточных процессах, в том числе в котрансляционном фолдинге полипептидных цепей при их биосинтезе, транслокации белков через мембраны, включении индивидуальных белков в надмолекулярные структуры, они способствуют также солюбилизации агрегатов белков и их корректному рефолдингу

Исследования последних лет показали, что традиционные представления о сохранении биологически активной конформации белков в денатурирующих условиях не ограничиваются сведениями о защитных свойствах молекулярных шаперонов Процессы фолдинга могут осуществляться под действием системы шаперонов, входящих в состав мультишаперонной сети В эту сеть часто вовлекаются ферменты фолдинга (пептидил-пролил-цис-транс изомераза и протеиндисульфидизомераза) и различные шапероноподобные белки К этим белкам можно отнести тубулин, казеин, фактор ингибирования миграции макрофагов и др [СиЬа е1 а1, 1998, ВЬаИасЬагууа, Бае, 1999, Боига е1 а1, 2000, СЬегеркоуа е1 а1, 2006] Кроме того, оказалось, что пептидные фрагменты известных шаперонов (протеиндисульфидизомеразы и альфа-кристаллина) и их синтетические аналоги проявляют шаперонные свойства [Рищ е1 а1, 1997, БеиегЬг^ е1 а1, 1999, ЗЬагта е1 а1, 2000, Маппа е1 а1, 2001] Было обнаружено также, что шаперонная активность присуща изолированным пептидным фрагментам (и их синтетическим аналогам) молекул некоторых белковых субстратов, в частности, дрожжевой алкогольдегидрогеназы [ВЬаиасЬагууа е1 а1,2003]

Несмотря на огромное число экспериментов, направленных на изучение защитной роли шаперонов, структурно-функциональные особенности, необходимые для характеристики белка как шаперона, не вполне ясны В соответствии с современными представлениями действие шаперонов осуществляется в результате их связывания с гидрофобными участками молекулы белкового субстрата, которые оказываются экспонированными наружу при нарушении пространственной структуры белка в состоянии стресса Однако, наряду с гидрофобными взаимодействиями, в образовании агрегатов участвуют химические связи, аналогичные тем, которые

стабилизируют белковую глобулу (вандерваальсовы силы, электростатические взаимодействия, водородные связи, дисульфидные связи и др ), которые весьма редко учитываются при изучении молекулярных механизмов действия шаперонов

В этой связи большой интерес вызывает исследование шапероноподобных свойств термостабильных гидрофобных белков, проявляющих способность к образованию амфифильной вторичной структуры Представляется целесообразным также исследование защитных функций пептидов и свободных аминокислот, содержащих заряженные боковые группы

Целью данной работы является исследование молекулярных механизмов защитного действия амфифильных белков и пептидов, предотвращающих агрегацию модельных белковых субстратов в состоянии стресса

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи

1 Выделить иммунофилин - низкомолекулярный (12 кДа) цитоплазматический рецептор иммуносупрессора FK506 (FK506-Binding Protein, FKBP12) из мозга быка в гомогенном состоянии

2 Исследовать шапероноподобную активность FKBP12 в тест-системе in vitro, основанной на торможении агрегации рекомбинантного инсулина человека, индуцированной дитиотреитолом (ДТТ)

3 Изучить молекулярные механизмы действия на кинетику агрегации белковых субстратов - малатдегидрогеназы из сердца свиньи (МДГ) и дрожжевой алкогольдегидрогеназы (АДГ) свободных аминокислот, содержащих положительно заряженные боковые группы (Arg, Lys и их аналоги), а также синтетических Arg- и/или Lys-содержащих пептидов -трипептида (Ala-Phe-Lys), дипептида (Arg-Phe) и аналогов пептидного антибиотика грамицидина

4 Проанализировать изменение состояния агрегатов, образовавшихся при тепловом стрессе, после снятия денатурирующего воздействия

Научная новизна и практическое значение работы. Впервые продемонстрированы шапероноподобные свойства иммунофилина FKBP12 из мозга быка При этом применен новый оригинальный метод выделения этого белка в гомогенном состоянии, основанный, главным образом, на обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) С помощью метода динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) показано, что шапероноподобная активность FKBP12 проявляется в концентрационно-зависимом уменьшении интенсивности светорассеяния и размеров (величины гидродинамического радиуса) аморфных агрегатов рекомбинантного инсулина человека

Новые свойства иммунофилина FKBP12 могут расширить представления о его иммунологических функциях, поскольку в механизмах действия иммуносупрессоров участвуют различные белки, биологически активная

структура которых может поддерживаться в присутствии FKBP12 [Snyder, Sabatini, 1995]

С использованием двух модельных систем термоагрегации АДГ и ДТТ-индуцированной агрегации инсулина показана способность свободной аминокислоты аргинина тормозить агрегацию белков в концентрациях, близких к физиологическим (0,1-10 мМ) Подавление агрегации наблюдали и в присутствии коротких Arg- или Lys-содержащих пептидов (Ala-Phe-Lys) и (Arg-Phe) Данные пептиды и аргинин могут быть предложены в качестве эффективных средств для повышения выхода биологически активных белков в биотехнологических процессах

В частности, проблемы, связанные с получением препарата рекомбинантного инсулина биотехнологическим путем и его длительным хранением, остаются в настоящее время актуальными В этой связи весьма перспективным представляется изучение механизмов стабилизации молекулы инсулина и предотвращения его агрегации

Практическое значение защиты инсулина от агрегации трудно переоценить Инсулин, который образует аморфные агрегаты при диссоциации А- и B-цепей в результате восстановления связывающих их S-S-мостиков, является одним из интереснейших объектов исследования Исследования защитной роли шапероноподобных белков, связывающих инсулин и предотвращающих его агрегацию, могут представлять интерес для нейроэндокринологии при разработке новых подходов к терапии некоторых нейродегенеративных заболеваний, в патогенезе которых участвуют факторы, вызывающие дисфункцию инсулина

Что касается аргинина, то учитывая его роль во многих метаболических процессах, участвующих в реализации иммунологических и эндокринных функций организма, способность этой аминокислоты влиять на конформацию белков может иметь большое значение при разработке подходов к терапии таких заболеваний как атеросклероз, диабет, сепсис и злокачественные опухоли

При исследовании синтетических аналогов пептидного антибиотика грамицидина с помощью турбидиметрии и ДЛС показано, что амфифильные пептиды, содержащие 27 и 21 аминокислотных остатков, а также пептиды Ala-Phe-Lys и Arg-Phe при определенных условиях проявляют способность ускорять термоагрегацию МДГ и АДГ Этим свойством обладает и низкомолекулярный (12 кДа) термостабильный белок, выделенный из мозга быка, - фактор ингибирования миграции макрофагов (Macrophage Migration Inhibitory Factor, MIF) Однако, несмотря на значительное увеличение размеров агрегатов, образовавшиеся белковые агрегаты оказывались способными к растворению Предполагается, что в начале развития процесса агрегации (при температурах, близких к физиологически допустимому уровню) эффекторы, обратимо связываясь с развернутым белком, стабилизируют его структуру После снятия денатурирующего воздействия повышается вероятность ренатурации белка В этом смысле исследуемые эффекторы могут играть шапероноподобную роль

Полученные данные, затрагивающие молекулярные механизмы ускорения/подавления агрегации белков с помощью амфифильных низкомолекулярных белков и пептидов, могут дать дополнительную информацию для разработки эффективных добавок с целью оптимизировать процесс фолдинга рекомбинантных белков, а также для создания лекарственных средств, способных предотвращать так называемые «конформационные» заболевания

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на 9-ой Пущинской школе - конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005), на Международном симпозиуме "Молекулярные механизмы регуляции функции клетки" (Тюмень, 2005), на FEBS конгрессе (Будапешт, 2005), на научной конференции "Нейрохимия фундаментальные и прикладные аспекты" (Москва, 2005), на XVIII зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2006), на 21-й Объединенной конференции Международного и Американского Нейрохимических обществ (ISN/ASN) (Мексика, 2007)

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 12 печатных работ, в том числе 6 статей в ведущих российских и зарубежных журналах

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на страницах Список цитируемой литературы содержит наименований, в том числе на иностранных языках Иллюстративный материал содержит рисунков и таблиц

Сокращения, принятые в тексте. АДГ - алкогольдегидрогеназа, МДГ -малатдегидрогеназы, БСА - бычий сывороточный альбумин, ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография, ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние, ДС-Na - додецилсульфат натрия, ДТТ - дитиотреитол, ПААГ -полиакриламидный гель, A|lm - предельное кажущееся поглощение при t—>оо, DEAE - diethylaminoethyl, FKBP - FK506-binding protein, MIF - Macrophage migration inhibitory factor

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение FKBP 12 из мозга быка Разработан оригинальный метод выделения FKBP 12 в гомогенном состоянии, включающий гомогенизацию ткани мозга, полученного на мясокомбинате, нагревание гомогената (58 °С, 20 мин), центрифугирование, ультрафильтрацию, концентрирование, ионообменную хроматографию и обращенно-фазовую ВЭЖХ на аналитической колонке С18 (Aquapore RP 300). Выделенный белок идентифицировали с помощью автоматического N-концевого микросеквенирования по Эдману и масс-спектрального анализа

Определение шаперонной активности. Использовали тест-систему, основанную на подавлении агрегации модельных белковых субстратов Кинетику термоагрегации МДГ и АДГ в 25 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0, и агрегации инсулина, индуцированной ДТТ (20 мМ) при комнатной температуре в 100 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,0, в отсутствие и в присутствии различных концентраций эффекторов изучали методом ДЛС Исследования проводили при помощи установки фотометра рассеянного лазерного света (Photocor Instruments Inc, США), снабженной He-Ne лазером, мощностью 10 мВт и длиной волны падающего света 632 8 нм Исследование динамики флуктуаций интенсивности рассеянного света при прохождении лазерного луча и изменения кажущегося размера наночастиц - гидродинамического радиуса (Rb) в диапазоне от 1 нм до 5 мкм в анализируемой суспензии в отсутствие или в присутствии шапероноподобных белков или пептидов позволяет оценить эффективность их действия Анализ данных проводили с помощью персонального компьютера с использованием программного обеспечения PhotoCor (версии 5 3 3) и DynaLS (версии 2 5 2)

Применяли также турбидиметрический метод (с использованием спектрофотометра Beckman DU-650), позволяющий регистрировать изменение кажущегося оптического поглощения белков в процессе их агрегации при 360 нм Пробы, полученные после тепловой агрегации, центрифугировали (10000 g, 20 мин) Осадки растворяли в 100 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0 Полученные образцы анализировали с помощью электрофореза в ПААГ в нативных и денатурирующих условиях

Для расчета молярных стехиометрических соотношений (эффектор субстратный белок) использовали значения молекулярных масс субъединиц МДГ, АДГ и инсулина - 35, 37 и 3 кДа соответственно

Электрофорез проводили в 12% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДС-Na) или в 10% ПААГ в неденатурирующих условиях Белок проявляли нитратом серебра

Концентрацию белка определяли по методу Bradford

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение и идентификация FKBP12 из мозга быка. После тепловой обработки ткани мозга при 58 °С и последующих центрифугирования, ультрафильтрации, концентрирования и ионообменной хроматографии на DEAE-Toyoperl в частично очищенных низкомолекулярных фракциях выявляли FKBP-подобные белки с помощью иммуноблоттинга с использованием кроличих антител к конъюгату синтетического пептидного фрагмента (30-39) FKBP12 - (NH2SSDFKKGDEL) с овальбумином [Gurvits et al, 1999] Фракции, проявлявшие FKBP-иммунореактивность, объединяли и исследовали на предмет выявления в них активности пептидил-пролил-цис-транс изомеразы, которую измеряли спектрофотометрически с использованием изомер-специфичного протеолиза синтетического модельного пептидного субстрата (Н-сукцинил-А1а-РЬе-Рго-Р11е-нитроанилида) [Fischer et al, 1984] Суммарную

фракцию подвергали дальнейшей очистке с помощью обращен но-фазовой ВЭЖХ. На профиле э л гони и показаны 5 мажорных и 2 минорных пика (Рис. I).

Рис. 1. Обращснио-фазовая ВЭЖХ белков, выделенных с помощью ионообменной хроматографии. По оси ординат; слепа - оптическое поглощение при 214 нм, справа -ШАСржакие щетонитрииа (CK^GN) в эяюирчющем буфере (%), по оси абсцисс - время эшоции (мин).

13ыло установлено, что FKBP выделяется преимущественно во фракции 2. что соответствует ~40% CH.CN в элюирующем буфере. По данным электрофореза в 12% ПЛАГ в присутствии ДС-Na фракция 2 содержит гомогенный белок, которому соответствует молекулярная масса около 12 кДа (Рис. 2).

Для идентификации выделенного белка, фракцию 2 лиофилизировали с помощыо вакуумного концентратора Speedvac и подвергали микросеквенированию по Эдману, В результате секвеппровапия 37 N-конце-вых аминокислотных остатков была получена следующая последовательность: NHi-GVQVETISPG DGRTFPKRGQ TCVVHYTGML EDGKKFD.

Рис. 2. Электрофорез в 12% ГТЛЛГ в присутетиии ДС-Na фракции 2, злтоированной с обращенно-фазовой колонки (см. Рис. 1). Дорожка 1 - фракция 2; дорожка 2 - маркер молекулярной массы - цитохром С (12 к Да).

На основании масс-спектрального анализа было получено точное значение молекулярной массы исследуемого белка (11825,5). В результате поиска белкой, содержащих приведенную выше последовательность, был идентифицирован белок FKBP12 (SwissProt. Р18203),

Многократная хроматография в системе ВЭЖХ в указанных условиях с использованием препаративной колонки С18 позволили выделить FKBP12 в количествах, достаточных для анализа. Л иофилизированный белок, растворенный в 100 мМ Ыа-фосфатном буфере, рН 7,0, использовали для решения поставленных задач.

2. Исследование ш а перин о и од оОп о Й активности РКВРЩ В качестве объекта исследования выбран инсулин, молекула которого состоит из двух пептидных цепей (А и В), поперечно связанных между собой двумя S-S-мостиками. Цепи А и В разделяются при денатурирующем воздействии ДТТ. После диссоциации оепей В-цепь. в состав которой входят гидрофобные аминокислотные остатки, начинает агрегировать. При этом А-иепь не агрегирует и остается в растворе в виде индивидуального пептида.

Кинетику агрегации инсулина в отсутствие и в присутствии FKBP12 в

Ain CH3CN,%

"о 80000

I 60000

:40000

различных концентрациях исследовали с помощью ДЛС Выбор данного метода обусловлен тем, что его применение позволяет регистрировать не только интенсивность светорассеяния агрегатов, но и размеры частиц, образующихся в процессе агрегации

Характер изменения во времени интенсивности светорассеяния (Г) аморфных агрегатов инсулина показывает концентрационно-зависимое торможение агрегации при добавлении в инкубационную смесь РКВР12 (Рис ЗА)

Из рисунка следует, что агрегация субстрата (75 мкмоль) подавляется под действием РКВР12 при молярных субстехиометрических соотношениях РКВР12 инсулин - (0,2 1), (0,4 1) и (0,6 1) соответственно При концентрации РКВР12 45 мкмоль наблюдается заметное увеличение лаг-периода (Рис ЗА, кривая 4) По истечении 60 мин инкубации интенсивность светорассеяния падает более чем в 4 раза в пробах, содержащих 45 мкмоль

РКВР12, по сравнению с контролем Из графика изменения величины гидродинамического радиуса (/?ь) частиц во времени (Рис ЗБ, кривая 4) следует, что в присутствии РКВР12 в

концентрации 45 мкмоль наблюдается заметное снижение размера агрегатов, которое происходит не непрерывно (в контроле), а дискретно По истечении латентного периода (10 мин) образуются стабильные агрегаты, величина /?ь которых сохраняется на уровне 100 нм, а затем - 350 нм в течение длительного времени агрегации Таким образом, торможение агрегации инсулина под действием РКВР12 проявляется не только в снижении интенсивности

светорассеяния и размеров гидродинамического радиуса

частиц, но также в изменении самого характера процесса роста агрегатов В контроле размер Ль составляет 1300 нм через 40 минут инкубации

Результаты, полученные с помощью турбидиметрии, согласуются с данными ДЛС В этом случае также наблюдается концентрационно-зависимое

'20000

1200 1000 I" 800 ^ 600 400 200 0

40 60 80 Время, мин

Б • 1

о 2

. 3

д 4

о . ■

■ ■ ■ ■ ■

5 10

15 20 25 30 35 40 Время, мин

Рис 3 Кинетика агрегации инсулина (0,2 мг/мл) в 100 мМ Ыа-фосфатном буфере, рН 7,0, в отсутствие (1) и присутствии РК.ВР12 в концентрациях 0,2 (2), 0,4 (3) и 0,5 мг/мл (4) А Изменение интенсивности светорассеяния (/)

во времени Б гидродинамического инсулина от времени

Изменение радиуса (Дь)

величины агрегатов

дА360 0 25

подавление агрегации инсулина в присутствии РКВР12 Данные результаты представлены на Рис 4

Наиболее заметное действие РКВР12 было выявлено уже при концентрации 0,4 мг/мл (торможение агрегации на -50%) Результаты свидетельствуют о том, что РКВР12 обладает шапероноподобной активностью, проявляющейся в защите инсулина от агрегации На основании анализа трехмерной структуры РКВР12 сделан вывод о том, что в основе проявления данной активности лежат гидрофобные взаимодействия Гидрофобные аминокислотные остатки

40 60 Время, мин

Рис 4 в 100

Кинетика агрегации инсулина (0,2 мг/мл) мМ Ыа-фосфатном буфере, рН 7,0, в отсутствие (1) и присутствии РКВР12 в концентрациях 0,2 (2), 0,4 (3) и 0,5 мг/мл (4)

сосредоточены в области расположения Р-тяжей, экспонированных наружу

Однако, наряду с гидрофобными взаимодействиями, в образовании агрегатов, а также в стабилизации белковой глобулы участвуют и электростатические связи Для выявления влияния электростатических сил на исследуемые процессы изучали агрегацию белков в присутствии свободных аминокислот, содержащих положительно заряженные боковые группы (Arg, Lys и их аналоги)

3. Исследование влияния аргинина на агрегацию модельных белковых

субстратов. Методом ДЛС изучали кинетику агрегации АДГ при различных концентрациях субстрата при температуре 48 °С в 25 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0 Изменение интенсивности

светорассеяния во времени в отсутствие и в присутствии аргинина представлено на рисунке 5А

Рис. 5 Кинетика термоагрегации АДГ (0,2 мг/мл) в 25 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0, при температуре 48 °С А Изменение интенсивности светорассеяния во времени в отсутствие (1) и в присутствии аргинина 2 мМ (2), или 100 мМ NaCl (3) Б Изменение размера

гидродинамического радиуса агрегатов во времени в отсутствие (1) и в присутствии 2 мМ аргинина (2), или 100 мМ NaCl (3)

40 60 80 Время, мин

5000 4000 J. 3000 * 2000 1000 о

ад? 00 3

40 60 80 Время, мин

100

Интенсивность светорассеяния агрегатов АДГ увеличивается в процессе инкубации и достигает предельного значения при тепловом воздействии в течение 60 минут (Рис 5А, кривая 1) При добавлении аргинина наблюдается концентрационно-зависимое уменьшение интенсивности светорассеяния (данные не показаны) При концентрации аргинина 2 мМ агрегация субстрата полностью подавляется (Рис 5А, кривая 2)

Из графика изменения гидродинамического радиуса (Ль) частиц во времени следует, что при агрегации АДГ в присутствии аргинина величина Ль колеблется в диапазоне 10-20 нм и остается постоянной в течение 100 минут (Рис 5Б, кривая 2)

Формирование агрегатов АДГ в контроле характеризуется сложной динамикой изменения радиусов частиц Для распределения агрегатов при концентрации АДГ 0,2 мг/мл характерен переход от унимодального распределения частиц к бимодальному (Рис 5Б, кривые 1 и Г) Действие аргинина проявляется в торможении образования агрегатов больших размеров

В процессе исследования влияния на процесс агрегации электростатических взаимодействий было показано, что 100 мМ КаС1 оказывал противоположное действие по сравнению с аргинином В аналогичных экспериментальных условиях наблюдалось ускорение процесса агрегации, увеличение интенсивности светорассеяния и величины Ль (Рис 5А и Б, кривые

Исследование кинетики изменения величины Ль от времени при различных концентрациях АДГ (0,15, 0,2 и 0,25 мг/мл) показало, что при концентрации 0,15 мг/мл наблюдается бимодальное

распределение частиц. Наряду с агрегатами с низким значением Ль (Рис 6, кривая 1'), регистрируются агрегаты большого размера (кривая 1) Однако в начальный период агрегации (до 5 минут) кинетика характеризуется

унимодальным распределением частиц При концентрации 0,2 мг/мл время унимодального распределения частиц увеличивается, достигая 10 минут Величина Ль частиц (кривые Г и 2') колеблется в диапазоне 100-350 нм и сохраняется практически на одном уровне в течение всего процесса агрегации, в то время как величина частиц большего размера драматически увеличивается во времени (кривые 1 и 2) При концентрации 0,25 мг/мл в течение по меньшей мере 100 минут наблюдается формирование агрегатов большого размера с мономодальным распределением частиц (кривая 3) Мономодальное распределение частиц было

3500 3000 _ 2500

I. 2000

£1500 1000 500 0

___

40 60 80 100 120 Время, мин

Рис 6 Изменение величины

гидродинамического радиуса (Ль) агрегатов во времени при концентрациях АДГ 0,15 мг/мл (1 и 1'), 0,2 мг/мл (2 и 2') и 0,25 мг/мл (3) при 48 °С в 25 мМ Тш-НС1 буфере, рН 7,0 Вставка показывает распределение Ли от времени в начальный период агрегации

показано также для агрегации АДГ в присутствии 2 мМ аргинина и 100 мМ №С1 (Рис 5 Б)

Можно предположить, что бимодальное распределение агрегатов АДГ в контроле связано с олигомерной структурой препарата фермента

В соответствии с электрофорезом в неденатурирующих условиях препарат фермента АДГ представлен димером и тетрамером, тогда как на электрофорезе в присутствии ДС-Ыа наблюдается полоса гомогенного мономера субстрата с молекулярной массой около 40 кДа (Рис 7А и Б)

Рис 7. Электрофорез в ПААГ в нативных (А) и денатурирующих (Б) условиях Коммерческий препарат АДГ (дорожки 1), маркеры молекулярных масс (дорожки 2) бычий сывороточный альбумин (БСА) - мономер, димер, тример (67, 134 и 201 кДа соответственно) и химотрипсиноген (24 кДа)

: -201 -134

1 2

_67

.24

.67

"о 80000

Появление двух стереотипов агрегатов может быть связано с различными конформационными изменениями в олигомерах в условиях стресса Формирование различных стереотипов популяций агрегатов в результате различных конформационных переходов олигомеров наблюдали у большого числа других белков [ММеИо е1 а1, 2004, Ма^ е1 а1, 2006, ВейеШенп е! а1, 1999]

Кинетика агрегации инсулина. Продемонстрировано торможение кинетики агрегации инсулина (0,2 мг/мл) в 100 мМ Ыа-фосфатном буфере, рН

7,0, в результате действия 8,5 мМ аргинина (Рис 8)

Рис 8 Действие аргинина (8,5 мМ) на кинетику агрегации инсулина (0,2 мг/мл) в 100 мМ Ыа-фосфатном буфере, рН 7,0 Изменения интенсивности светорассеяния (А) и размеров гидродинамического радиуса (Б) агрегатов инсулина во времени в отсутствие (1) и в присутствии аргинина (2)

Показано, что в течение 60 минут процесса агрегации не наблюдается прироста

интенсивности светорассеяния агрегатов инсулина, при

дальнейшей инкубации происходит незначительное увеличение уровня интенсивности (Рис 8А, кривая 2)

При анализе размеров агрегатов выявлено их

40 60 80 Время, мин

3000

2500

? 2000

-С се 1500

1000

500

Б "о"

Л £

ЛЯ"*

Л?"

■ А» 2

. . .КЛАД .А «А К А*4^.....

40 60 80 Время, мин

100 120

ЛА360 0 08

унимодальное распределение во времени в отсутствие (кривая 1) и в присутствии (кривая 2) аргинина Лишь по истечении 60 минут инкубации наблюдалось увеличение значения Rh (Рис 8А)

Результаты, полученные с помощью турбидиметрии, согласуются с данными ДЛС (Рис 9) Аргинин уже в концентрации 0,05 мМ оказывает заметное действие на агрегацию АДГ (Рис 9А, кривая 2), а при концентрации 2 мМ наблюдается почти полное подавление агрегации (кривая 5) При этом происходит значительное увеличение продолжительности лаг-периода

С помощью данного метода было также показано концентрационно-зависимое подавление агрегации инсулина (0,2 мг/мл) в присутствии аргинина (Рис 9Б) Значительный эффект наблюдался при его концентрации, равной 4

мМ, а при концентрации 8,5 мМ -почти полное подавление процесса, что сопровождалось увеличением длительности лаг-периода (кривые 4 и 5) Полученные данные отличаются высокой

воспроизводимостью во многих сериях экспериментов,

выполненных при использовании АДГ и инсулина в качестве субстратов

Таким образом, на двух модельных системах было показано защитное действие аргинина при физиологических концентрациях, направленное на торможение процесса агрегации

На рисунке 10 (А и Б) представлены кинетические

параметры агрегации С помощью программы Origin Pro 7 0 были рассчитаны предельное поглощение при t—»со (Ai,m) и константа скорости 1-ого порядка (к|) по формуле у=А1ш,*(1 -exp(-k*(x-to))) При увеличении концентрации аргинина значения А]1т, и к! уменьшаются Эти характеристики не только подтверждают защитную роль аргинина, но и позволяют оценить концентрацию эффектора, вызывающую максимальное подавление агрегации

Ранее сообщалось, что аргинин обладает защитным действием только в больших концентрациях (0,1-2,0 М), указывая на слабое взаимодействие «аргинин-белок» Данные о действии аргинина в микро- и миллимолярных

15 20 25 30 Время, мин

Рис 9 А. Агрегация АДГ (0 2 мг/мл), зарегистрированная с помощью турбидиметрии при 48 °С в 25 мМ Тиб-НС! буфере, рН 7,0, в отсутствие (I) и присутствии аргинина в концентрациях 0 05 (2), 0 3 (3), I (4), 2 (5) мМ Б Агрегация инсулина (0 2 мг/мл) в 100 мМ Ма-фосфатном буфере, рН 7,0, в отсутствие (1) и присутствии аргинина в концентрациях 0 5 (2), 2 (3), 4 (4), 8 5 (5) мМ

концентрациях при фолдинге и агрегации белков ограничены В наших исследованиях, было показано, что аргинин тормозит агрегацию белков в низких концентрациях (0,1-10 мМ)

06 12 18 [Arg], мг/мл

Рис 10 Графики зависимости предельного кажущегося оптического поглощения (А|1т) (А) и константы скорости 1-го порядка (к[) (Б) от концентрации аргинина при агрегации инсулина (0,2 мг/мл)

0 6 12 18 [Arg], мг/мл

Аргинин имеет уникальную положительно заряженную гуанидиновую боковую группу, которая способна связываться с ароматическими аминокислотными остатками Можно полагать, что в основе образования подобной связи лежат так называемые катион-я взаимодействия между аминогруппами аргинина и обобществленным я-электроным «облаком» внутри ароматического кольца [Burley, Petsko, 1986, Gallivan, Dougherty, 1999, Ahern et al, 2006]

Ароматические аминокислоты входят в состав как АДГ, так и В-цепи инсулина Наблюдаемый защитный эффект аргинина связан с электростатическими взаимодействиями аргинина с гидрофобными аминокислотными остатками молекулы субстрата, которые экспонируются наружу в состоянии стресса Следует отметить также важность гуанидиновой группы, которая принимает участие в увеличении растворимости белков Примером может служить гуанидингидрохлорид

С использованием инсулина в качестве субстрата были исследованы также лизин в концентрациях 10, 20 и 40 мМ При этом наблюдалось концентрационно-зависимое подавление интенсивности светорассеяния Лизин в концентрации 40 мМ приводил к полному торможению агрегации Цитруллин (50 мМ) и гуанидингидрохлорид (20 мМ) не влияли на агрегацию инсулина При использовании АДГ в качестве субстрата лизин (20 мМ), цитруллин (50 мМ) и гуанидингидрохлорид (20 и 250 мМ) не проявляли сколь-нибудь заметного эффекта (данные не приведены)

Большой интерес вызывала также возможность исследования процесса агрегации субстратов в присутствии коротких Arg- и Lys-содержащих амфифильных пептидов

4. Исследование влияния трипептида (Ala-Phe-Lys) и дипептида (Arg-Phe) на термоагрегацию АДГ. С использованием метода ДЛС была изучена термоагрегация АДГ (0,3 мг/мл) при температуре 42 °С в 25 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0, в отсутствие и в присутствии трипептида (Рис 11)

Интенсивность светорассеяния агрегатов АДГ увеличивается во времени, достигая предельного значения после теплового воздействия в течение 50 мин

20 30 Время, мин

800

_ 600

£ 400 о:

200

"Б 1500 ?1200

0 10 20 30 . Время М|

3 ¿¿А

«,0

¿о?оео©°е®о о о о о о © ^о е©1

20 30 Время, мин

300

250

X 200

с о: 150

100

Л4

Рис

20 30 Время, мин

Зависимость интенсивности светорассеяния (А) и значения Яь частиц (Б) при агрегации АДГ (0,3 мг/мл) при 42 °С в 25 мМ Тт-НО буфере, рН 7,0, от времени в отсутствие (1 и Г) и в присутствии трипептида (А1а-РЬе-Ьу5) в концентрациях 1 (2 и 2'), 2 (3 и 3') и 4,5 мМ (4) Вставка показывает значения в присутствии 1 мМ трипептида В Распределение Ль частиц в присутствии трипептида в концентрации 4,5 мМ (4)

(Рис ПА, кривая 1) Трипептид в концентрации 1 мМ ускоряет термоагрегацию АДГ При его концентрации 2 мМ наблюдается резкое усиление агрегации в начальный период (до ~3 мин) до величины интенсивности равной 150000 фотоотсчет/с,

сохраняющейся далее на постоянном уровне (кривая 3) При концентрации 4,5 мМ прослеживается полное

подавление термоагрегации АДГ (кривая 4) При этом не происходит образования

преципитатов, что характерно для многих известных шаперонов

Анализ размеров белковых агрегатов (Рис 11 Б) показал бимодальное распределение их частиц, при котором наблюдаются две популяции в системе образуются малые (кривые Г, 2' и 3') и большие (кривые 1, 2 и 3) агрегаты При концентрации трипептида 2 мМ происходит значительный рост величины Яь частиц (Рис 11Б, кривые 3 и 3'), в то время как интенсивность светорассеяния подавляется (Рис ПА, кривая 3) Вероятно, при увеличении концентрации

трипептида в системе количество частиц, размеры которых растут в процессе агрегации, уменьшается, достигая минимума при его

концентрации 4,5 мМ При этом наблюдается мономодальное распределение частиц малого размера с Ль ~ 130 нм (Рис 11В)

Было изучено также действие на кинетику агрегации АДГ другого эффектора - дипептида (А^-РЬе) для того, чтобы провести сравнение между двумя типами катионов В присутствии дипептида наблюдается картина, аналогичная действию трипептида (данные не показаны) Однако в этом случае добавление дипептида в больших концентрациях (до 35 мМ) не приводит к полному торможению агрегации АДГ, в отличие от действия трипептида,

Рис 12 А Кинетика термоагрегации АДГ (0,3 мг/мл, зарегистрированная с помощью турбидиметрии при 42 °С в 25 мМ Тт-НСЛ буфере, рН 7,0, в отсутствие (1) и присутствии трипептида в концентрациях 1 (2), 2 (3) и 4,5 мМ (4) Б Кинетика термоагрегации в отсутствие (1) и присутствии дипептида в концентрациях 0 5 (2), 2 (3), 4,5 (4), 7 (5), 12 (6) и 18 мМ (7) Вставка показывает агрегацию в отсутствие (1) и в присутствии дипептида при концентрации 2 мМ (кривая 3)

возможно, ввиду структурных особенностей (расположение гидрофобных и гидрофильных аминокислотных остатков в молекулах эффекторов, а также большая гидрофобность

трипептида)

С использованием турбидиметрического метода были получены данные, которые согласуются с результатами ДЛС Наблюдали аналогичное концентрационно-зависимое действие трипептида и дипептида на термоагрегацию АДГ (Рис 12АиБ)

5. Исследование влияния синтетических аналогов пептидного антибиотика грамицидина на агрегацию модельных белковых субстратов. Для данной работы были выбраны амфипатические пептиды, характеризующиеся наличием как гидрофобных, так и гидрофильных остатков Один из синтетических аналогов грамицидина (С1) отличается от своего прототипа наличием дополнительных 5 положительно заряженных С-концевых аминокислотных остатков Для определения вклада в функциональную активность гидрофобного участка данной молекулы, был синтезирован другой пептид (С2), в котором удален гидрофобный кластер (Тгр-ОЬеи-Тгр-БЬеи-Тгр-А1а)

Первичная структура синтетического аналогов грамицидина в 1 Ас-Уа1-С1у-А1а-РЬеи-А1а-РУа1-Уа1-РУа1-Тгр-РЬеи-(Тгр-РЬеи-Тгр-РЬеи-Тгр-А1а)-01у-8ег-С1у-Рго-Ьу5-Ьуз-Ьу5-Агд-Ьу$-Уа1-Су5-СООН

а Ас-Уа1-С1у-А1а-РЬеи-А1а-РУа1-Уа1-РУа1-Тгр-РЬеи-С1у-8ег-С1у-Рго-Ьуз-ЬуБ-Ьуз-А^-Ьуз-УаЬСуз-СООН

Исследовали кинетику агрегации модельного белкового субстрата МДГ турбидиметрическим методом при 48 °С в отсутствие и присутствии пептидов и 02 в различных концентрациях (Рис 13) Показано значительное ускорение агрегации субстрата и увеличение предельного значения кажущегося

поглощения при 360 им. Причем, СI в субсгехиометрическом диапазоне концентраций усиливает агрегацию субстрата в большей степени по сравнению с 02. При увеличении концентрации 01 значение Ан,,, возрастает более, чем в даа раза (кривая 7).

Рис. 13. А. Кинетика агрегации МДГ (0,15 мг/мл) при 48 °С и 25 мМ Тпй-НС! буфере, рН 7,0, в отсутствие (1) л гурясутетакм пептилов С 2 и концентрациях 0,05 (2), 0,! (3) II 0,2 мг/мл (4) и СИ в концентрациях 9 (5), 50 (6), 100 мкг/мл (7), Ь. Шпнстика агрегации АДГ (0,15 мг/мл) при 42 "С в 25 мМ 'ТЧчэ-ИС! буфере, рИ 7,0, в отсутствие (I) н присутствии пептидов 02 в концентрациях 9 (2) и 45 мкг/мл (4) и О! в концентраций 3,6 Ык?Ы~л (3) и 9 мкг/мл (5).

о.оэ

Изучение агрегации АДГ при отсутствие и пептидов 01

кинетики 42 "С в присутствии 02 также показывает ускорение агрегации при субстехиометрических

концентрациях пептидов. В данном случае, подобно экспериментам с использованием МДГ в качестве субстрата, показано, что действие г.ептлда 01 проявляется сильнее, чем 02 (Рис. 13Б). Для первичного анализа состояния агрегатов после окончания

6 9 12 Время, мин

0.00

Б 10 15 20 25 30 35 Время, мин

дАчвп 0.12

Рис. 14. А. Электрофорез и присутствии ДС-К[а а ГГА.АГ рагги-ораинь^ осадков, ¡¡онученных после агрегации МДГ (0,15 мг/мл) при 48 °С. Дорожки: I - в отсутствие пептидов; 2, 3, 4 - в присутствии 02 (0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл и 0,2 мг/мл соответственно); 5 — в присутствии 01 (0,1 мг/мл); 6 - маркеры молекулярных масс (67, 24 и 12 кДа). К. НативйыЙ электрофорез в 11ААГ растворенных осадков после агрегации. Дорожки: 1 в отсутствий пептидов; 2 - в присутствии 02 (0,2 мг/мл); 3 - к присутствии 01 (0,1 мг/мл); 4 - маркеры моиекулярнмх масс (134 и 67 кДа).

процесса агрегации пробы центрифугировали (10 000^, 20 мин), осадки растворяли в 100 мМ Тпэ-НС! буфере, рН 7,0, и подвергали их электрофорезу. Данные электрофореза в денатурирующих условиях (Рис. 14А) показывают, что содержание в осадках МДГ (мономер с молекулярной массой 30 кДа) в присутствии пептидов (дорожки 2-5) существенно возрастает по сравнению с контролем (дорожка 1). Важным результатом проведенных экспериментов является обнаружение гетероагрегатов, содержащих как субстратный белок, так и пептиды, т.е. образуется комплекс субстрат-пептид. По мере усиления агрегации наблюдается увеличение субстратного белка в осадке.

Электрофорез в педенатурирующих условиях (Рис. 14В) показал, что образуются растворимые агрегаты с молекулярной массой около 120 кДа, что соответствует тстрамеру МДГ,

Анализ электрофореграмм осадков АДГ в нативных и денатурирующих условиях показал наличие растворимых агрегатов (Рис. (5 А и Б). При этом по мере усиления процесса агрегации в присутствии пептида наблюдается увеличение содержания белка в осадке. При электрофорезе в присутствии ДС-Ш проявляется полоса мономера АДГ с молекулярной массой около 40 к Да. Так как пептиды использовались в с убстех к ом етрм че с к их концентрациях,, то их проявления на электорфореграмме не наблюдается.

Рис. 15, Электрофорез в присутствии ДС-Na в 12% ПААГ (А) В нативный электрофорез в 10% 11ДАГ (Б) растворе![пых осадков, полученных после агрегации АДГ (0,15 мг/мл) при 42 ЭС. Дорожки: 1 - в отсутствие пептидов; 2 — ч присутствии пептида 02 (45 мкг/мл); 3 - в Присутствии пептида 01 (9 мкг/мл); 4 - маркеры молекулярных масс (201, 134, 67 и 2А кДа).

На шшшном электрофорезе в ПААГ проб АДГ, полученных после термоагрегации, видно, что растворенные осадки в контроле представлены олигомером с молекулярной массой ~ 160 кДа (тетрамер АДГ) и агрегатами большого размера, которые едва входят в гель. Однако в присутствии пептидов, наряду с высокомолекулярными агрегатами, мы видим наличие ярко выраженных полос димера и тетрамера АДГ (молекулярные массы 80 и 160 кДа соответственно).

Аналогичные результаты были получены при растворении агрегатом АДГ в присутствии ди- и трипептида (данные не показаны). Результаты свидетельствуют о том, что ускорение агрегации сопровождается появлением агрегатов большого размера, но они при этом оказываются легко растворимыми. Подобное ускорение агрегации наблюдалась также под действием низкомолекулярного (12 кДа) амфифилыюго белка - фактора

¿А360 0.06

ингибирования миграции макрофагов (Macrophage migration inhibitory factor, М1Г), который выделяется совместно с FKBPI2.

6. Влияние MIF пи кинетику агрегации АДГ. Исследование влияния MIF на агрегацию ЛДГ при 42 °С показало драматическое усиление агрегации в его присутствии (Рис. 16).

Нативный электрофорез в ИААГ(Рис. 17) продемонстрировал содержание в еуперпатанте димера и гетра мер а АДГ (молекулярные массы 80 и 160 кДа соответствен но). В присутствии M1F (дорожка 3) эти олигомеры обнаруживались в меньшем количестве, чем в его отсутствие (дорожка 1).

На электрофоре грамма

растворенного осадка (в отсутствие МIF) наблюдаются пятно, соответствующее тетрамеру АДГ, и высокомолекулярные олигомеры, едва проникающие в гель (дорожка 2). В присутствии MIF (дорожка 4) в осадке обнаруживаются довольно яркие полосы, которые могут соответствовать димеру н тетрамеру АДГ, а также высокомолекулярные олигомеры и полоса MIF (молекулярная масса 12 кДа), что свидетельствует об образовании гете р оо ли гомеров, содержащих как АДГ, так и MF.

6 8 10 12 Время, мин

14 16

i'iit, 16, Кянетическис кривые агрегации АДГ (0,15 мг/мл) в отсутствие (1) или в присутствии M1F в концентрации 25 мкг/мл (2) при 42 °С и 25 мМ Tris-IICl буфере, pH 7,0.

1 2 J 4 5

i f 1« - 160

134

i>0

■aas

■щ 67

ISSyi yL i? ж*

;; 45

'■¡¡§:;; yj'.-l

ÄÄ-

1111 1

1'ис. 17. Электрофорез в н едена тур ируюишх условиях проб мосле окончания процесса агрегации АДГ при 42 "С в 25 мМ Tris-HCI буфере, рН 7,0, последующею центрифуги рован и я (I OOOOg, 20 мш.'.}- Супсрпатаччы в отсутствие (дорожка 1J и в присутствии 25 мкг/мл МП' (дорожка 3); растворенные осадки тех же проб в отсутствие (дорожка 2) и в присутствии VI11 ■' (дорожка 4); маркеры молекулярных масс (дорожка 5).

В этом случае высокомолекулярные олигомеры располагаются р. области более низких молекулярных масс (дорожка 4) по сравнению с пробой, не содержащей МИ7 (дорожка 2).

На основании анализа результатов приведенных экспериментов можно сделать важный вывод о том, что при тепловом стрессе в диапазоне температур, близких к физиологическим, несмотря па ускорение агрегации субстратных

белков в присутствии как пептидов, так и MIF, образующиеся агрегаты оказываются легко растворимыми Это может означать, что после снятия денатурирующего воздействия повышается вероятность ренатурации белка к нативному состоянию В этом смысле в начале развития процесса агрегации MIF или пептиды обратимо связываются с частично денатурированным белком, стабилизируя его структуру Однако в конечном итоге в случае снятия теплового стресса и возврата системы к нормальному состоянию, эти эффекторы могут играть шапероноподобную роль

ВЫВОДЫ

1 С использованием методов динамического лазерного светорассеяния и турбидиметрии изучена кинетика индуцируемой дитиотреитолом агрегации рекомбинантного инсулина человека, а также термоагрегации малатдегидрогеназы из сердца свиньи и дрожжевой алкогольдегидрогеназы в качестве модельных белковых субстратов

2 Разработан новый оригинальный метод выделения из мозга быка цитоплазматического белка — иммунофилина (12 кДа), связывающего иммуносупрессор FK506 (FK506-Binding Protein, FKBP12), основанный, главным образом, на высокоэффективной жидкостной хроматографии Белок идентифицирован по результатам N-концевого микросеквенирования, масс-спектрального анализа и иммуноблоттинга

3 Впервые показано, что FKBP12 обладает шапероноподобными свойствами, проявляющимися в концентрационно-зависимом торможении агрегации инсулина Предполагается, что в основе наблюдаемых эффектов лежат гидрофобные взаимодействия FKBP12 с субстратом

4 В процессе исследования влияния электростатических взаимодействий на кинетику агрегации субстратов показано подавление агрегации алкогольдегидрогеназы и инсулина под действием аргинина (1-10 мМ) Обнаружено перераспределение популяций агрегатов по размерам с преимущественным образованием наночастиц с малым гидродинамическим радиусом, что может свидетельствовать о торможении слипания взаимодействующих частиц в результате включения в них аргинина Подавление термоагрегации алкогольдегидрогеназы наблюдалось и при действии пептидов Ala-Phe-Lys и Arg-Phe

5 На примерах агрегации алкогольдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в присутствии амфифильных синтетических аналогов пептидного антибиотика грамицидина, а также термостабильного белка - фактора ингибирования миграции макрофагов продемонстрированы стабилизация олигомерной структуры субстратов и повышение растворимости аморфных агрегатов Предложена гипотетическая модель, в соответствии с которой, несмотря на ускорение агрегации субстратных белков, на начальных этапах развития теплового стресса амфифильные белки и пептиды могут играть шапероноподобную роль

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

СТАТЬИ

1 Cherepkova О А , Lyutova Е.М., Gurvits В Ya (2005) Charge heterogeneity of bovine brain macrophage migration inhibitory factor Neurochem Research V 30 No 1 P 151-158

2 Черепкова О A , Лютова E.M., Гурвиц Б Я (2006) Фактор ингибирования миграции макрофагов, выделение из мозга быка Биохимия Т 71 №1 С 90-96

3 Cherepkova О А, Lyutova Е.М., Eronma Т В , Gurvits В Ya (2006) Chaperone-like activity of macrophage migration inhibitory factor Intern J Biochem Cell Biol V 38 No 1 P 43-55

4 Черепкова О A, Лютова E.M., Еронина T Б, Гурвиц Б Я (2006) Ускорение агрегации белков в условиях теплового стресса под влиянием фактора ингибирования миграции макрофагов Биохимия Т 71 № 2 С 182-189

5 Лютова Е.М., Казаков А С, Гурвиц Б Я (2007) Шапероноподобная активность цитоплазматического рецептора иммуносупроссора FK506 — иммунофилина FKBP12 из мозга быка Нейрохимия Т 24 № 3 С 208216

6 Lyutova Е.М., Kasakov A S , Gurvits В Ya (2007) Effects of arginme on kinetics of protein aggeregation studied by dynamic laser light scattering and turbidimetry techniques Biotechnol Prog V 23 No 6 P 1380-1387

ТЕЗИСЫ

1 Лютова Е.М., Черепкова О А , Гурвиц Б Я (2005) Фактор ингибирования миграции макрофагов, олигомерная структура в состоянии теплового стресса 9-ая Пущинская школа - конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века" Тез докл С 85

2 Черепкова О А, Лютова Е.М., Еронина Т Б, Гурвиц Б Я (2005) Иммунологически активный белок - фактор ингибирования миграции макрофагов, шаперонная и антишаперонная активности Международный симпозиум "Молекулярные механизмы регуляции функции клетки" Сборник тезисов Тюмень С 5

3 Gurvits BYa, Cherepkova OA, Lyutova E.M., Eronma ТВ (2005) Macrophage migration inhibitory factor exhibits chaperone and anti-chaperone activities FEBS J V 272 Suppl 1 P 353

4 Черепкова О A , Лютова E M., Гурвиц Б Я (2005) Гипофизарный гормон - фактор ингибирования миграции макрофагов обладает шапероноподобными свойствами Научная конференция "Нейрохимия фундаментальные и прикладные аспекты" Тез докл С 129

5 Лютова Е.М., Черепкова О А, Гурвиц Б Я (2006) Стабилизация олигомерной структуры белков в состоянии теплового стресса под влиянием фактора ингибирования миграции макрофагов XVIII зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" Тез докл С 41

6 Lyutova Е.М., Kasakov A S , Gurvits, В Ya. (2007) Chaperone-hke activity of adrenocorticotropic hormone J Neurochem V 102 Suppl 1 P 288

Заказ № 140/10/07 Подписано в печать 10 10 2007 Тираж 100 экз Уел пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 < \ ^f \ www cfr ru , e-mail info@cfr ru

4 '-''/

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лютова, Елена Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цель данной работы.

Научная новизна и практическое значение работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Молекулярные шапероны.

Участие молекулярных шаперонов в фолдинге.

Классификация молекулярных шаперонов.

Малые белки теплового шока.

Роль белков теплового шока в функционировании живых систем в норме и патологии.

Шапероноподобные белки.

Протендисульфидизомераза (PDI).

DsbC.

Пептидил-пролил-цис-транс-изомеразы (PPI).

Семейство FKBP.

PPI в роли шаперонов.

Фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF).

Казеин.

Тубулин.

Кальнексин и кальретикулин.

Антитела как специфические шапероны. а-Синуклеин.

Спектрин.

Пептиды, обладающие шапероноподобной активностью.

Влияние аргинина на агрегацию белков.

Рефолдинг рекомбинантных белков in vivo и in vitro.

Влияние полиаминов на агрегацию белков.

Искусственные шапероны.

Ускорение агрегации белков.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Материалы и методы.

Материалы.

Получение экстракта мозга быка.

Обращенно-фазовая ВЭЖХ.

N-концевое микросеквенирование.

Масс-спектральный анализ.

Электрофорез.

Концентрацию белка.

Динамическое лазерное светорассеяние (ДЛС).

Анализ шапероноподобной активности.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Выделение и идентификация FKBP12.

Исследование шапероноподобной активности FKBP12.

Исследование влияния аргинина на агрегацию модельных белковых субстратов.

Кинетика агрегации АДГ.

Кинетика агрегации инсулина.

Исследование влияния трипептида (Ala-Phe-Lys) и дипептида (Arg-Phe) на термоагрегацию АДГ.

Исследование влияния синтетических аналогов пептидного антибиотика грамицидина на агрегацию модельных белковых субстратов.

Влияние MIF на кинетику агрегации АДГ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы шапероноподобного действия амфифильных белков и пептидов"

Молекулярные шапероны обладают способностью взаимодействовать с развернутыми или неправильно свернутыми белками, что препятствует связыванию этих белков между собой и последующей агрегации. Подобное взаимодействие приводит в конечном итоге к сохранению или восстановлению нативного состояния белков.

Многообразие действия шаперонов велико: они участвуют в различных внутриклеточных процессах, в том числе в котрансляционном фолдинге полипептидных цепей при их биосинтезе, транслокации белков через мембраны, включении индивидуальных белков в надмолекулярные структуры, они способствуют также солюбилизации агрегатов белков и их корректному рефолдингу.

Исследования последних лет показали, что традиционные представления о сохранении биологически активной конформации белков в денатурирующих условиях не ограничиваются сведениями о защитных свойствах молекулярных шаперонов. Процессы фолдинга могут осуществляться под действием системы шаперонов, входящих в состав мультишаперонной сети. В эту сеть часто вовлекаются ферменты фолдинга -пептидил-пролил-цис-транс изомераза (peptidyl-prolyl cys-trans isomerase, PPI) и протеиндисульфидизомераза (protein disulfide isomerase, PDI) и различные шапероноподобные белки. К этим белкам можно отнести тубулин, казеин, фактор ингибирования миграции макрофагов (macrophage migration inhibitory factor, MIF) и др. [Guha et al., 1998; Bhattacharyya, Das, 1999; Souza et al., 2000; Cherepkova et al., 2006]. Кроме того, оказалось, что пептидные фрагменты известных шаперонов (PDI и а-кристаллина) и их синтетические аналоги проявляют шаперонные свойства [Puig et al., 1997; Deuerling et al., 1999; Sharma et al., 2000; Manna et al., 2001]. Было обнаружено также, что шаперонная активность присуща изолированным пептидным фрагментам (и их синтетическим аналогам) молекул некоторых белковых субстратов, в частности, дрожжевой алкогольдегидрогеназы [Bhattacharyya et al., 2003].

Несмотря на огромное число экспериментов, направленных на изучение защитной роли шаперонов, структурно-функциональные особенности, необходимые для характеристики белка как шаперона, не вполне ясны. В соответствии с современными представлениями действие шаперонов осуществляется в результате их связывания с гидрофобными участками молекулы белкового субстрата, которые оказываются экспонированными наружу при нарушении пространственной структуры белка в состоянии стресса. Однако, наряду с гидрофобными взаимодействиями, в образовании агрегатов участвуют химические связи, аналогичные тем, которые стабилизируют белковую глобулу (вандерваальсовы силы, электростатические взаимодействия, водородные связи, дисульфидные связи и др.), что весьма редко учитывается при изучении молекулярных механизмов действия шаперонов.

В этой связи большой интерес вызывает исследование шапероноподобных свойств термостабильных гидрофобных белков, проявляющих способность к образованию амфифильной вторичной структуры. Представляется целесообразным также исследование защитных функций пептидов и свободных аминокислот, содержащих заряженные боковые группы.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Выделить иммунофилин - низкомолекулярный (12 кДа) цитоплазматический рецептор иммуносупрессора FK506 (FK506-Binding Protein, FKBP12) из мозга быка в гомогенном состоянии.

2. Исследовать шапероноподобную активность FKBP12 в тест-системе in vitro, основанной на торможении агрегации рекомбинантного инсулина человека, индуцированной дитиотреитолом (ДТТ).

3. Изучить молекулярные механизмы действия на кинетику агрегации белковых субстратов - малатдегидрогеназы из сердца свиньи (МДГ) и дрожжевой алкогольдегидрогеназы (АДГ) свободных аминокислот, содержащих положительно заряженные боковые группы (Arg, Lys и их аналоги), а также синтетических Arg- и/или Lys-содержащих пептидов - трипептида (Ala-Phe-Lys), дипептида (Arg-Phe) и аналогов пептидного антибиотика грамицидина.

4. Проанализировать изменение состояния агрегатов, образовавшихся при тепловом стрессе, после снятия денатурирующего воздействия.

Научная новизна и практическое значение работы. Впервые продемонстрированы шапероноподобные свойства иммунофилина FKBP12 из мозга быка. При этом применен новый оригинальный метод выделения этого белка в гомогенном состоянии, основанный, главным образом, на обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). С помощью метода динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) показано, что шапероноподобная активность FKBP12 проявляется в концентрационно-зависимом уменьшении интенсивности светорассеяния и размеров (величины гидродинамического радиуса) аморфных агрегатов рекомбинантного инсулина человека.

С использованием двух модельных систем: термоагрегации АДГ и ДТТ-индуцированной агрегации инсулина показана способность свободной аминокислоты аргинина тормозить агрегацию белков в концентрациях, близких к физиологическим (0,1-10 мМ). Подавление агрегации наблюдали и в присутствии коротких Arg- или Lys-содержащих пептидов (Ala-Phe-Lys) и (Arg-Phe). Данные пептиды и аргинин могут быть предложены в качестве эффективных средств для повышения выхода биологически активных белков в биотехнологических процессах.

В частности, проблемы, связанные с получением препарата рекомбинантного инсулина биотехнологическим путем и его длительным хранением, остаются в настоящее время актуальными. В этой связи весьма перспективным представляется изучение механизмов стабилизации молекулы инсулина и предотвращения его агрегации.

Практическое значение защиты инсулина от агрегации трудно переоценить. Инсулин, который образует аморфные агрегаты при диссоциации А- и В-цепей в результате восстановления связывающих их S-S-мостиков, является одним из интереснейших объектов исследования. Исследования защитной роли шапероноподобных белков, связывающих инсулин и предотвращающих его агрегацию, могут представлять интерес для нейроэндокринологии при разработке новых подходов к терапии некоторых нейродегенеративных заболеваний, в патогенезе которых участвуют факторы, вызывающие дисфункцию инсулина.

При исследовании синтетических аналогов пептидного антибиотика грамицидина с помощью турбидиметрии и ДЛС показано, что амфифильные пептиды, содержащие 27 и 21 аминокислотных остатков, а также пептиды Ala-Phe-Lys и Arg-Phe при определенных условиях проявляют способность ускорять термоагрегацию МДГ и АДГ. Этим свойством обладает и низкомолекулярный (12 кДа) термостабильный белок, выделенный из мозга быка, - MIF. Однако, несмотря на значительное увеличение размеров агрегатов, образовавшиеся белковые агрегаты оказывались способными к растворению. Предполагается, что в начале развития процесса агрегации (при температурах, близких к физиологически допустимому уровню) эффекторы, обратимо связываясь с развернутым белком, стабилизируют его структуру. После снятия денатурирующего воздействия повышается вероятность ренатурации белка. В этом смысле исследуемые эффекторы могут играть шапероноподобную роль.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Лютова, Елена Михайловна

выводы

1. С использованием методов динамического лазерного светорассеяния и турбидиметрии изучена кинетика индуцируемой дитиотреитолом агрегации рекомбинантного инсулина человека, а также термоагрегации малатдегидрогеназы из сердца свиньи и дрожжевой алкогольдегидрогеназы в качестве модельных белковых субстратов.

2. Разработан новый оригинальный метод выделения из мозга быка цитоплазматического белка - иммунофилина (12 кДа), связывающего иммуносупрессор FK506 (FK506-Binding Protein, FKBP 12), основанный, главным образом, на высокоэффективной жидкостной хроматографии. Белок идентифицирован по результатам N-концевого микросеквенирования, масс-спектрального анализа и иммуноблоттинга.

3. Впервые показано, что FKBP 12 обладает шапероноподобными свойствами, проявляющимися в концентрационно-зависимом торможении агрегации инсулина. Предполагается, что в основе наблюдаемых эффектов лежат гидрофобные взаимодействия FKBP 12 с субстратом.

4. В процессе исследования влияния электростатических взаимодействий на кинетику агрегации субстратов показано подавление агрегации алкогольдегидрогеназы и инсулина под действием аргинина (1-10 мМ). Обнаружено перераспределение популяций агрегатов по размерам с преимущественным образованием наночастиц с малым гидродинамическим радиусом, что может свидетельствовать о торможении слипания взаимодействующих частиц в результате включения в них аргинина. Подавление термоагрегации алкогольдегидрогеназы наблюдалось и при действии пептидов Ala-Phe-Lys и Arg-Phe. На примерах агрегации алкогольдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в присутствии амфифильных синтетических аналогов пептидного антибиотика грамицидина, а также термостабильного белка - фактора ингибирования миграции макрофагов продемонстрированы стабилизация олигомерной структуры субстратов и повышение растворимости аморфных агрегатов. Предложена гипотетическая модель, в соответствии с которой, несмотря на ускорение агрегации субстратных белков, на начальных этапах развития теплового стресса амфифильные белки и пептиды могут играть шапероноподобную роль.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лютова, Елена Михайловна, Москва

1. Ahern С. A., Eastwood A. L., Lester Н. A., Dougherty D. A., Horn R. (2006) A cation-pi interaction between extracellular TEA and an aromatic residue in potassium channels. J Gen Physiol., 128, 649-657.

2. Arakawa Т., Dix D. В., Chang B. S. (2003) The effects of protein stabilizers on aggregation induced by multiple-stresses. Yakugaku Zasshi, 123,95-96.

3. Arakawa Т., Tsumoto K. (2003) The effects of arginine on refolding of aggregated proteins: not facilitate refolding, but suppress aggregation. Biochem. Biophys. Res. Commun., 304, 148-152.

4. Bardwell J.C., Craig E.A. (1984) Major heat shock gene of Drosophila and the Escherichia coli heat-inducible dnaK gene are homologous. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, P. 848-852.

5. Baugh J.A., Donnely S.C. (2003) Macrophage migration inhibitory factor: a neuro endocrine modulator of chronicinflammation. J. Endocrinol., 179, P. 15-23.

6. Baumann R., Casaulta C., Simon D., Conus S., Yousefi S., Simon H.U. (2003) Macrophage migration inhibitory factor delays apoptosis in neutrophils by inhibiting the mitochondria-dependent death pathway. FASEBJ., 17, P. 2221-2230.

7. Baynes В. M., Wang D. S, and Trout B. L. (2005) Role of arginine in the stabilization of proteins against aggregation. Biochemistry, 44, 49194925.

8. Beissinge M., Buchner J. (1998) How chaperones fold proteins. Biol Chem., 379,245-259.

9. Bendrat K., AI-Abed Y., Callaway D.J., Peng Т., Calandra Т., Metz C.N., Bucala R. (1997) Biochemical and mutational investigations of the enzymatic activity of macrophage migration inhibitory factor. Biochemistry, 36, P. 15356-15361.

10. Bernhagen P. J., Calandra Т., Mitchell R.A., Martin S.B., Tracey K.T., Voelter W., Manogue K.R., Cerami A., Bucala R. (1993) MIF is a pituitary-derived cytokine that potentiates lethal endotoxaemia. Nature, 365. P. 756-762.

11. Bettelheim F.A., Ansari R., Cheng Q.F. and Zigler J.S.Jr. (1999) The mode of chaperoning of dithiothreitol-denatured alpha-lactalbumin by alpha-crystallin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 261, P. 292-297.

12. Bhattacharyya J., Das K. P. (1999) Molecular chaperone-like properties of an unfolded protein, as-Casein J. Biol. Chem., 274, P. 15505-15509.

13. Bhattacharyya J., Padmanabha Udupa E. G., Wang J., Sharma К. K. (2006) Mini-alphaB-crystallin: a functional element of alphaB-crystallin with chaperone-like activity. Biochemistry, 45, 3069-3076.

14. Bhattacharyya M, Ray S, Bhattacharya S, Chakrabarti A. (2004) Chaperone activity and prodan binding at the self-associating domain of erythroid spectrin. JBC, 279, 55080-55088.

15. Bhattacharyya J, Santhoshkumar P, Sharma К. K. (2003) A peptide sequence-YSGVCHTDLHAWHGDWPLPVK 40-60.-in yeast alcoholdehydrogenase prevents the aggregation of denatured substrate proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun., 307, 1-7.

16. Boisvert D.C., Wang J., Otwinowsk Z., Horwich A.L., and Sigle P.B. (1996) The 2.4 A crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL complexed with ATP gamma S. Nat. Struct. Biol., 3, 170-177.

17. Bloom B.R., Bennett B. (1966) Mechanism of a reaction in vitro associated with delayed-type hypersensitivity. Science, 153. P. 80-85.

18. Bole D.G., Hendershot L.M., Kearney J.F. (1986) Posttranslational association of immunoglobulin heavy chain binding protein with nascent heavy chains in nonsecreting and secreting hybridomas. J. Cell. Biol., 102, P. 1558-1566.

19. Bose S., Weikl Т., Bugl H., Buchner J. (1996) Chaperone function of Hsp90-associated proteins. Science, 274, P. 1715-1717.

20. Boston, R. S., Viitanen P. V., Vierling E. (1996) Molecular chaperones and protein folding in plants. Plant Mol. Biol., 32, P. 191-222.

21. Bozza M., Kolakowski L.F., Jenkins N.A., Gilbert D.J., Copeland N.G., David J.R., Gerard C. (1995) Structural characterization and chromosomal location of the mouse macrophage migration inhibitory factor gene and pseudogenes. Genomics, 27, P. 412-419.

22. Bradford M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilising the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochemistry, 72. P. 248-254.

23. Braig K., Otwinowski Z., Hedge R., Boisvert D.C., Joachimiak A., Horwich A.L. and Sigler P.B. (1994) The crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL at 2.8 A. Nature, 371, 578-586.

24. Brinkmann U., Buchner J., and Pastan I. (1992) Independent domain folding of Pseudomonas exotoxin and single-chain immunotoxins: influence of interdomain connections. Proc Natl.Acad. Sci. USA, 89, 3075-3079.

25. Bucala R. (1996) MIF rediscovered: cytokine, pituitary hormone, and glucocorticoid-induced regulator of the immune response. FASEB J., 10, P. 1607-1613.

26. Buchner J., and Rudolph R. (1991) Renaturation, purification and characterization of recombinant Fab-fragments produced in Escherichia coli. Biotechnology, 9,157-162.

27. Bukau В., Horwich A.L. (1998) The Hsp70 and Hsp60 Chaperone Machines. Cell, 92, P. 351-366.

28. Bulleid N. J., Freedman R. B. (1988) Defective co-translational formation of disulphide bonds in protein disulphide-isomerase-deficient microsomes. Nature, 335, 649-651.

29. Burley S. К., Petsko G. A. (1986) Amino-aromatic interactions in proteins. FEBSLett., 203, 139-143.

30. Cai H., Wang C.C. (1995) Chaperone-like activity of protein disulfide isomerase in the refolding of a protein with no disulfide bonds. Eur. J. Biochem., 231, 312-316.

31. Calderwood S. K., Mambula S. S., Gray P. J. Jr., Theriault J. R. (2007) Extracellular heat shock proteins in cell signaling. FEBS Lett., 581, P. 3689-3694.

32. Calnan B. J., Tidor В., Biancalana S., Hudson D., Frankel A. D. (1991) Arginine-mediated RNA recognition: the arginine fork. Science, 252, 1167-1171.

33. Chappie J. P., Grayson C., Hardcastle A. J., Saliba R. S., Van der Spuy J., and Cheetham M. E. (2001) Unfolding retinal dystrophis: a role for molecular chaperones? Trends Mol. Med., 1, 414-421.

34. Chen L., Sigler P.B. (1999) The crystal structure of a GroEL/peptide complex: plasticity as a basis for substrate diversity. Cell, 99, 757-768.

35. Cherepkova O.A., Lyutova E.M., Eronina T.B., Gurvits B.Ya. (2006) Chaperone-like activity of macrophage migration inhibitory factor. Intern. J. Biochem. Cell Biol. 38, P. 43-55.

36. David J. (1966) Delayed hypersensitivity in vitro: its mediation by cell-free substances formed by lymphoid cell-antigen interaction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 56, P. 72-78.

37. Derham В. K., Harding J. J. (2002) Effects of modifications of a-crystallin on its chaperone and other properties. Biochem. J., 364, 711717.

38. Deuerling E., Schulze-Specking A., Tomoyasu Т., Mogk A., Bukau B. (1999) Trigger factor and DnaK cooperate in folding of newly synthesized proteins. Nature, 400, 693-696.

39. Donnelly S.C. and Bucala, R. (1997) Macrophage migration inhibitory factor: a regulator of glucocorticoid activity with a critical role in inflammatory disease. Mol. Med. Today, 3, P. 502-507.

40. Dusa A., Kaylor J., Edridge S., Bodner N., Hong D.P. and Fink A.L. (2006) Characterization of oligomers during alpha-synuclein aggregation using intrinsic tryptophan fluorescence. Biochemistry, 45, 2752-2760.

41. Ehrnsperger M., Graber S., Gaestel M., Buchner J. (1997) Binding of non-native protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. EMBOJ., 16, P. 221-229.

42. Efron D.T., Barbul A., (1998) Modulation of inflammation and immunity by arginine supplements. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care, 6, 531.

43. Ellis R. J. (1990) The molecular chaperone concept. Semin. Cell Biol., 1, P. 1-9.

44. Feinstein R.N., Jaroslow B.N., Howard J.B., Faulhaber J.T. (1971) Stabilization of mutant catalase by complex formation with antibody to normal catalase./ Immunol., 106, P. 1316-1322.

45. Fink A. L. (1998) The Hsp 70 reaction cycle and its role in protein folding. Molecular Chaperones in the Life Cycle of Proteins, P. 123-150.

46. Fink A.L. (1999) Chaperone-mediated protein folding. Physiol Rev., 79, 425-449.

47. Fischer G., Bang H., Berger E., Schellenberger A. (1984) Conformational specificity of chymotrypsin toward proline-containing substrates. Biochim Biophys Acta, 791, 87-97.

48. Flocco M. M., Mowbray S. L. (1994) Planar stacking interactions of arginine and aromatic side-chains in proteins. J. Mol. Biol., 235, 709717.

49. Follmer C., Pereira F.V., DaSilveria N.P. and Carlini C.R. (2004) Jack bean urease (EC 3.5.1.5) aggregation monitored by dynamic and static light scattering. Biophys. Chem., 111, P. 79-87.

50. Freire de Lima C.G., Nascimento,D.O., Soares M.B., Bozza P.T., Castro-Faria-Neto H.C., de Mello F.G., DosReis G.A., Lopes M.F. (2000) Uptake of apoptotic cells drives the growth of a pathogenic trypanosome in macrophages. Nature, 403, 199-203.

51. Futaki S. (2002) Arginine-rich peptides: potential for intracellular delivery of macromolecules and the mystery of the translocation mechanisms. Int. J. Pharm., 245,1-7.

52. Galat A., Lane W.S., Standaert R.F., Schreiber S.L. (1993) A rapamycin-selective 25-kDa immunophilin. Biochemistry, 31, P. 2427-2434.

53. Galkin O., and Vekilov P.G. (2004) Mechanisms of homogeneous nucleation of polymers of sickle cell anemia hemoglobin in the deoxy state. J Mol Biol., 336, 43-59.

54. Gallivan J. P., Dougherty D. A. (1999) Cation-pi interactions in structural biology. Proc Natl Acad Sci USA, 96, 9459-9464.

55. Glover J. R., Schirmer E. C., Singer M. A., and Lindquist S. L. (1998) Hsp 104. Molecular Chaperones in the Life Cycle of Proteins, P. 193224.

56. Guha S., Manna Т. K., Das K. P., Bhattacharyya B. (1998) Chaperone-like activity of tubulin. J. Biol. Chem., 273, P. 30077-30080.

57. Gurvits B. Ya., Tretyakov O. Yu., Galoyan A. A. (1999) Quantitative determination of folding transitions in the immunosuppressor FK506-binding protein with antibodies raised to its peptide fragment. J. Neurochem., 73, P. 154.

58. Gurvits B.Ya., Cherepkova O.A., Klesov R.V. (2003) The brain pool of immunologically active heat-stable proteins in relation to adaptation to heat-shock and other kinds of stress. J. Neurochem., 87, P. 152-153.

59. Gurvits B.Ya., Cherepkova O.A., Eronina T.B. (2003) Chaperone-like activity of macrophage migration inhibitory factor from bovine brain. J. Neurochem., 88, P. 23-24.

60. Hajek P., Koh J. Y., Jones L., Bedwell D. M. (1997) The amino terminus of the Fl-ATPase b-subunit precursor functions as an intramolecular chaperone to facilitate. Mol. Cell. Biol, 17, 7169-7177.

61. Hartl F. U. (1996) Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature, 381, 571-579.

62. Harding M., Galat A., Uehling D., Schriber S.L. (1989) A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase. Nature, 341, P. 758-760.

63. Haslbeck M. (2002) sHsps and their role in the chaperone network. Cell. Mol. Life Sci., 59,1649-1657.

64. Hawkins H.C., Freedman R.B. (1991) The reactivities and ionization properties of the active-site dithiol groups of mammalian protein disulphide-isomerase. Biochem. J., 275, 335-339.

65. Hesterkamp Т., and Bukau B. (1996) The Escherichia coli trigger factor. FEBSLett., 389, 32-34.

66. Hesterkamp Т., Hauser S., Lutcke H., Bukau, B. (1996) Escherichia coli trigger factor is a prolyl isomerase that associates with nascent polypeptide chains. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 93,4437-4441.

67. Huang G. C., Chen J. J., Liu C. P., Zhou J. M. (2002) Chaperone and antichaperone activities of trigger factor. Eur. J. Biochem. 269, 45164523.

68. Huang G. C., Li Z. Y., Zhou J. M., Fischer G. (2000) Assisted folding of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by trigger factor. Protein Sci., 9, P. 1254-1261.

69. Hudson J.D., Shoaibi M.A., Maestro R., Carnero A., Hannon G.J. and Beach D.H. (1999) A proinflammatory cytokine inhibits p53 tumor suppressor activity. J. Exp. Med., 190, P. 1375-1382.

70. Iwaki T, Kume-Iwaki A, Liem RK, Goldman JE. (1989) Alpha B-crystallin is expressed in non-lenticular tissues and accumulates in Alexander's disease brain. Cell, 57, P. 71-78.

71. Jakob U., Buchner J. (1994) Assisting spontaneity: the role of Hsp90 and small Hsps as molecular chaperones. Trends Biochem. Sci., 19,205-211.

72. Jin Y.J., Albers M. W., Lane W. S., Bierer В. E., Schreiber S. L. Burakoff S.J. (1991) Molecular cloning of a membrane-associated human FK506- and rapamycin-binding protein, FKBP-13. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, P. 6677-6681.

73. Kandror O., Sherman M., Moerschell R., Goldberg A.L. (1997) Trigger factor associates with GroEL in vivo and promotes its binding to certain polypeptides. J. Biol. Chem. 272,1730-1734.

74. Kandror O., Sherman M., Rhode M., Goldberg A.L. (1995) Trigger factor is involved in GroEL-dependent protein degradation in Escherichia coli and promotes binding of GroEL to unfolded proteins. EMBOJ., 14, P. 6021-6027.

75. Kelley W. L., Georgopoulos C. (1992) Chaperones and protein folding. Curr. Opin. Cell. Biol., 4, 984-991.

76. Kim К. K., Kim R., Kim S. H. (1998) Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature, 394, P. 595-599.

77. Kim Т. D., Paik S. R., Yang С. H., Kim J. (2000) Structural changes in a-synuclein affect its chaperone-like activity in vitro. Protein Science, 9, 2489-2496.

78. Kim T. D, Paik S. R., Yang С. H. (2002) Structural and functional implications of C-terminal regions of alpha-synuclein. Biochemistry, 41, 13782-13790.

79. Korth C., May В. С. H., Cohen F. E., Pruisner S. B. (2001) Acridine and phenothiazine derivatives as pharmacotherapeutics for prion disease. Proc Natl Acad Sci USA, 98, 9836-9841.

80. Kumar L. V. S., Ramakrishna Т., and Rao С. M. (1999) Structural and functional consequences of the mutation of a conserved arginine residue in aA- and aB-crystallins. J. Biol. Chem., 274,24137-24141.

81. Laemmli U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. Nature, 227, P. 680-685.

82. Laskowska E. (2007) Small heat shock proteins-role in apoptosis, cancerogenesis and diseases associated with protein aggregation. Postery Biochem., 53, 19-26.

83. Loo T. W., and Clarke D. M. (1997) Correction of defective protein kinesis of human P-glycoprotein mutants by substrates and modulars. J. Biol. Chem., 272, 709-712.

84. Lee G. J., A. M. Roseman H. R. Saibil and Vierling E. (1997) A small heat shock protein stably binds heat-denatured model substrates and canmaintain a substrate in a folding-competent state. EMBO J., 16, P. 659671.

85. Leroux M. R., Melki R., Gordon В., Batelier G., Candido, E. P. (1997) Structure-function studies on small heat shock protein oligomeric assembly and interaction with unfolded polypeptides, J. Biol. Chem., 272, P. 24646-24656.

86. Lindner R.A., Treweek T.M., Carver J.A. (2001) The molecular chaperone alpha-crystallin is in kinetic competition with aggregation to stabilize a monomeric molten-globule form of alpha-lactalbumin. Biochem. J., 354, 79-87.

87. Litt M., Kramer P., LaMorticella D. M., Murphey W., Lovrien E. W. and Weleber R. G. (1998) Autosomal dominant congenital cataract associated with a missense mutation in the human a-crystallin gene CRYAA. Hum. Mol. Genet, 7,471-474.

88. Mahler H.C., Muller R., Friess W., Delille A. and Matheus S. (2005) Induction and analysis of aggregates in a liquid IgGl-antibody formulation, Eur. J. Pharm. Biopharm., 59, P 407-417.

89. Majhi P. R., Ganta R. R., Vanam R. P., Seyrek E., Giger K., Dubin P. L. (2006) Electrostatically driven protein aggregation: beta-lactoglobulin at low ionic strength. Langmuir., 22, 9150-9159.

90. Makrides S. C. (1996) Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev., 60,512-538.88

91. Manna Т., Sarkar Т., Poddar A., Roychowdhury M., Das K. P., and Bhattacharyya B. (2001) Chaperone-like activity of tubulin. J. Biol Chem., 276, P. 39742-39747.

92. May В. C., Fafarman А. Т., Hong S. В., Rogers M., Deady L. W., Prusiner S. В., Cohen F. E. (2003) Potent inhibition of scrapie prion replication in cultured cells by bis-acridines. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 100, 3416-3421.

93. Meng F, Park Y, and Zhou H. (2001) Role of proline, glycerol,and heparin as protein folding aids during refolding of rabbit muscle creatine kinase. Int. J. Biochem. Cell Biol, 33, 701-709.

94. Militello V., Casarino C., Emanuele A., Giostra A., Pullara F. and Leone M. (2004) Aggregation kinetics of bovine serum albumin studied by FTIR spectroscopy and light scattering. Biophys. Chem., 107, P. 175187.

95. Mitchell J. В. O., Nandi C. L., McDonald I. K., Thornton J. M., Price S. L. (1994) Amino/aromatic interactions in proteins: is the evidence stacked against hydrogen bonding? J. Mol.Biol, 239, 315-331.

96. Morgan P. E., Treweek Т. M., Lindner R. A., Prince W. E., Carver J. A. (2005) Casein proteins as molecular chaperones. J. Agric. Food Chem., 53,2670-2683.

97. Morr, С. V., and Ha, E. Y. (1993) Whey protein concentrates and isolates: processing and functional properties. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 33,431-476.

98. Murthy J.N., Chen Y., Soldin S.J. (1994) Identification of a 14 kDa FK-506/rapamycin binding immunophilin from calf thymus. Clin. Biochem., 27, P. 357-365.

99. Nagradova N. (2007) Enzymes catalyzing protein folding and their cellular functions. Curr. Protein Pept. Sci., 8, P. 273-282.

100. Nigam S.K., Jin Y.J., Jin M.J., Bush K.T., Bierer B.E., Burakoff S.J. (1993) Localization of the FK506-binding protein, FKBP 13, to the lumen of the endoplasmic reticulum. Biochem. J., 294, P. 511-515.

101. Nishihira J., and Ogata A. (2001) Macrophage migration inhibitory factor as atarget molecule in multiple sclerosis. Curr. Opin. Investig. Drugs., 2, P. 778-782.

102. Okanojo M., Shiraki K., Kudou M., Nishikori S., Takagi M. (2005) Diamines prevent thermal aggregation and inactivation of lysozyme. J. Biosci. Bioeng. 100, 556-561.

103. Padgett С. L., Напек A. P., Lester H. A., Dougherty D. A., Lummis C. R. (2007) Unnatural amino acid mutagenesis of the GABAa receptor binding site residues reveals a novel cation n interaction between GAB A and /?2Tyr97. J. Neurosci., 24, 886-892.

104. Pahl A., Keller U. (1994) Streptomyces chrysomallus FKBP-33 is a novel immunophilin consisting of two FK506 binding domains; its gene is transcriptionally coupled to the FKBP-12 gene. EMBOJ., 13, P. 34723480.

105. Panasenko 0. 0., Seit Nebi,A., Bukach О. V, Marston,S. В., Gusev N. B. (2002) Structure and properties of avian small heat shock protein with molecular weight 25 kDa. Biochim. Biophy. Acta, 1601, P. 64-74.

106. Parsell, D. A., Kowal A. S., Singer M. A., and Lindquist S. (1994) Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hspl04. Nature, 372, P. 475-478.

107. Pelham H.R. (1989) Control of protein exit from the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Cell. Biol., 5, P. 1-23.

108. Pelta J., Livolant F.,Sikorav J.L. (1996) DNA aggregation induced by polyamines and cobalthexamine. J. Biol Chem., 271, 5656-5662.

109. Pellequer J.-L., Zhao В., Kao H.I, Bell C. W, Li K, Li Q. L, Karu A. E, Oberts V. A. (2000) Stabilization of bound polycyclic aromatic hydrocarbons by a pi-cation interaction. J. Mol. Biol., 302, 691-699.

110. Plater, M. L., Goode, D., Crabbe, M. J. (1996) Effects of site-directed mutations on the chaperone-like activity of alphaB-crystallin. J. Biol. Chem., 271, P. 28558-28566.

111. Ponstingel H., Krauhs E., and Little M. (1983) Tubulin amino acid sequence and consequences. J. Submicrosc. Cytol. Pathol., 15, 359-362.

112. Price E.R., Jin M., Lim D., Pati S., Walsh C.T., and McKeon F.D. (1994) Cyclophilin В trafficking through the secretory pathway is altered by binding of cyclosporin A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3931-3935.

113. Puig A., and Gilbert H. F. (1994) Anti-chaperone behavior of BiP during the protein disulfide isomerase-catalyzed refolding of reduced denatured lysozyme. J. Biol. Chem., 269, P. 25889-25896.

114. Puig A., and Gilbert H.F. (1994) Protein disulfide isomerase exhibits chaperone and anti-chaperone activity in the oxidative refolding of lysozyme. J. Biol. Chem., 269, 7764-7771.

115. Puig A., Lyles M.M., Noiva R., Gilbert H.F. (1994) The role of the thiol/disulfide centers and peptide binding site in the chaperone and anti-chaperone activities of protein disulfide isomerase. J. Biol. Chem., 269, 19128-19135.

116. Raman C.S., Jemmerson R., Nail B.T. (2000) Antibody-detected folding: kinetics of surface epitope formation are distinct from other folding phases. Protein Sci., 9, P. 129-137.

117. Raspaud E., Chaperon I., Leforestier A., Livolant F. (1999) Spermine-induced aggregation of DNA, nucleosome, and chromatin. Biophys. J. 77, 1547-1555.

118. Rozov A., Burnashev, N. (1999) Polyamine-dependent facilitation of postsynaptic AMPA receptors counteracts paired-pulse depression. Nature, 401, 594-598.

119. Rudolph R., Opits U., Hesse F., Riebland R., Fischer S. (1992) Reactivation of microbially produce human tissue-type plasminogen activator. Biotechnology International, P. 321-325.

120. Samuel D., Kumar Т.К., Ganesh G., Jayaraman G., Yang P.W., Chang M.M., Trivedi V.D., Wang S.L., Hwang K.C., Chang D.K., and Yu C. (2000) Proline inhibits aggregation during protein refolding. Protein Sci., 9, 344-352.

121. Schreiber S. L., Liu J., Albers M. W., Karmacharya R., Koh E., Martin P.K., Rosen M.K., Standaert R.F., Wandless TJ. (1991) Immunophilin-ligand complexes as probes of intracellular signaling pathways. Transpl. Proceed., 23, P. 2839-2844.

122. Schuler J., Frank J., Saenger W., and Georgalis Y. (1999) Thermally induced aggregation of human transferrin receptor studied by light-scattering techniques. Biophys J.,11,V. 1117-1125.

123. Senthilkumar R., Chaerkady R., Sharma К. K. (2002) Identification and properties of anti-chaperone-like peptides derived from oxidized bovine lens pL-Crystallins. J. Biol. Chem., 277, P. 39136-39143.

124. Sharma К. K. (2000) Synthesis and Characterization of a Peptide Identified as a Functional Element in aA-crystallin. J. Biol. Chem., 275, 3767-3771.

125. Shimizu Т., Abe R., Nakamure H., Suzuki M., and Nishihira J. (1999) High expression of macrophage migration inhibitory factor in human melanoma cells and its role in tumor cell growt hand angiogenesis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 264, P. 751-758.

126. Shiraki K., Kudou M., Fujiwara S., Imanaka Т., Takagi M. (2002) Biophysical effect of amino acids on the prevention of protein aggregation. J. Biochem., 132, 591-595.

127. Shiraki K., Kudou M., Nishikori S., Kitagawa H., Imanaka Т., and Takagi M. (2004) Arginine ethylester prevents thermal inactivation and aggregation of lysozyme. Eur. J. Biochem. Ill, 3242-3247.

128. Shroff N. P., Cherian-Shaw M., Bera S., and Abraham E. C. (2000) Mutation of R116C results in highly oligomerized aA-crystallin with modified structure and defective chaperone-like function. Biochemistry, 39,1420-1426.

129. Sideraki V., and Gilbert H.F. (2000) Mechanism of the antichaperone activity of protein disulfide isomerase: facilitated assembly of large, insoluble aggregates of denatured lysozyme and PDI. Biochemistr, 39, 1180-1188.

130. Snyder S. H., Sabatini D. M. (1995) Immunophilins and the nervous system. Nat. Med., 1, 32-37.

131. Smith, D.F., Whitesell, L., Nair, S.C., Chen, S., Praprprnich, V., and Rimerman, R.A. (1995) Progesterone receptor structure and function altered by geldanamycin, an hsp90-binding agent. Mol. Cell. Biol., 15, 6804-6812.

132. Solomon B. (2002) Anti-aggregating antibodies, a new approach towards treatment of conformational diseases. Curr Med Chem., 9, P. 1737-1749.

133. Solomon В., Koppel R., Frankel D., Hanan-Aharon E. (1997) Disaggregation of Alzheimer beta-amyloid by site-directed mAb. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, P. 4109-4112.

134. Solomon В., Koppel R., Hanan E., Katzav T. (1996) Monoclonal antibodies inhibit in vitro fibrillar aggregation of the Alzheimer beta-amyloid peptide. Proc Natl Acad Sci USA, 93, P. 452-455.

135. Song J.L., Quan H., Wang C.C. (1997) Dependence of the antichaperone activity of protein disulphide isomerase on its chaperone activity. Biochem. J., 328, 841-846.

136. Srinivas V., Raman В., Rao К. S., Ramakrishna Т., Rao С. M. (2003) Structural perturbation and enhancement of the chaperone-like activity of alpha-cry stallin by arginine hydrochloride. Protein Sci., 12, 12621270.

137. Stoller G., Rucknagel K.P., Nierhaus K.H., Schmid F.X., Fischer G., Rahfeld J.U. (1995) A ribosome-associated peptidyl-prolyl cis/trans isomerase identified as the trigger factor. EMBOJ., 14, 4939-4948.

138. Studer S., Narberhaus F. (2000) Chaperone activity and homo- and hetero-oligomer formation of bacterial small heat shock proteins. J. Biol. Chem., 275, P. 37212-37218.

139. Sun F, Li P, Ding Y., Wang L., Bartlam M., Shu C., Shen В., Jianq H., Li S., Rao Z. (2003) Design and structure-based study of new potential FKBP 12 inhibitors. Biophys. J., 85, P. 3194-3201.

140. Sykes, K., Gething, M.J., and Sambrook, J. (1993) Proline isomerases function during heat shock. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5853-5857.

141. Tamarappoo В. K., and Verkman A. S. (1999) Defective aquaporin-2 trafficking in nephrogenic diabetes insipidus and correction by chemical chaperones. J Clin Invest., 101, 2257-2267.

142. Tapan K., Chaudhuri, Subhankar P. (2006) Protein-misfolding diseases and chaperone-based therapeutic approaches. FEBSJ., 273,1331-1349.

143. Theriault J. R., Lambert H., Chavez-Zobel А. Т., Charest G., Lavigne P., Landry J. (2004) Essential role of the N-terminal WD/EPF motif in the phosphorylation-activated protective function of mammalian Hsp27. J. Biol. Chem., 234, P. 1236-1241.

144. Tissieres A, Mitchell H. K., Tracy U. M. (1974) Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. J. Mol. Biol., 84, P. 389-398.

145. Tongl В. C, Barbul A. (2004) Cellular and physiological effects of arginine. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2004, 4, 823-832.

146. Tsumoto K, Ejima D, Kumagai I, Arakawa T. (2003) Practical considerations in refolding proteins from inclusion bodies. Protein Expression Purif., 28, 1-8.

147. Tsumoto K. , Umetsu M, Kumagai I, Ejima D., Philo J. S, Arakawa T. (2004) Role of arginine in protein refolding, solubilization, and purification. Biotechnol. Prog., 20,1301-1308.

148. Umezawa N, Gelman M. A, Haigis M. C., Raines R. T, Gellman S. H. (2002) Translocation of a beta-peptide across cell membranes. J. Am. Chem. Soc., 124, 368-369.

149. Vassilakos A, Cohen-Doyle M. F., Peterson P. A, Jackson M. R, Williams D. B. (1996) The molecular chaperone calnexin facilitates folding and assembly of class I histocompatibility molecules. EMBO J., 15,1495-1506.

150. Vicart P, Caron A, Guicheney P, Li Z, Prevost M. C, Faure A, Chateau D, Chapon F, Tome F, Dupret J. M. (1998) A missensemutation in the aBcrystallin chaperone gene causes a desmin-related myopathy. Nat. Genet., 20, 92-95.

151. Ward L. D., and Timasheff S. N. (1994) Energy transfer studies of the distances between the colchicine, ruthenium red, and bisANS binding sites on calf brain tubulin. Biochemistry, 33, 11891-11899.

152. Welch W. J., and Brown C. R. (1996) Influence of molecular and chemical chaperones on protein folding. Cell Stress Chaperone, 1, 109115.

153. Wistow G.J., Shaughnessy M.P., Lee D.C., Hodin J., and Zelenka P.S. (1993) A macrophage migration inhibitory factor is expressed in the differentiating cells of the eye lens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, P. 1272-1275.

154. Wilson L.K., Benton B.M., Zhou S., Thorner J., Martin G.S. (1995) The yeast immunophilin Fpr3 is a physiological substrate of the tyrosine-specific phosphoprotein phosphatase Ptpl. J. Biol. Chem., 270, P. 25185-25193.

155. Wilson L. K., Dhillon N., Thorner J, Martin G. (1997) Casein kinase II catalyzes tyrosine phosphorylation of the yeast nucleolar immunophilin Fpr3. J. Biol. Chem., 272, P. 12961-12967.

156. Wiuff C., Houen G., (1996) Cation-dependent interactions of calreticulin with denatured and native proteins. Acta Chem Scand., 50, 788-795.

157. Wu G., Morris S. M. Jr. (1998) Arginine metabolism: nitric oxide and beyond. Biochem. J., 336, 1.

158. Yahara I. (1998) Structure and function of the 90-kDa stress protein Hsp90. Molecular Chaperones in the Life Cycle of Proteins, P. 183-192.

159. Yudin I. K., Nikolaenko G.L., Kosov V.I., Agayan V.A., Anisimov M.A. and Sengers J.V. (1997) Simple photon-correlation spectrometer for research and education. Int. J. Thermophys., 18, P. 1237-1248.

160. Zheng W. D, Quan H, Song JL, Yang SL, Wang CC. (1997) Does DsbA have chaperone-like activity? ABB., 337, 326-331.

161. Ермоленко Д.Н., Жердев A.B., Дзантиев Б.Б. (2004) Антитела как специфические шапероны. Биохимия, 69, С. 1515-1521.

162. Курганов Б. И., Топчиева И. Н. (1998) Рефолдинг белков с участием искусственных шаперонов. Биохимия, 63, 491-499.

163. Курочкина JL П., Месянжинов В. В. (1996) Фолдинг белка в клетке. Успехи биологической химии, С. 49-86.

164. Наградова Н.К. (1996) Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков. Соросовский образовательный журнал, 7, С.10-18.

165. Наградова Н.К. (2004) Сворачивание белков в клетке: о механизмах его ускорения. Биохимия, 69, С. 1021-1037.

166. Панасенко О. О., Ким М. В., Гусев Н. Б. (2003) Структура и свойства малых белков теплового шока, Успехи биологической химии, 43, С 59-98.

167. Третьяков О.Ю., Гурвиц Б .Я. (1998) Иммунофилины: молекулярные механизмы действия. Успехи биологической химии, XXXVIII, С. 143-165.

168. Уверский В.Н., Финк Ф.Л. (1998) Самоассоциация может структурировать белковые молекулы, находящися в частично свернутых ненативных состояниях. Биохимия. 63, С. 541-548.

169. Список основных работ, опубликованных по теме диссертации1. СТАТЬИ

170. Cherepkova О.A., Lyutova Е.М., Gurvits B.Ya. (2005) Charge heterogeneity of bovine brain macrophage migration inhibitory factor. Neurochem. Research. V. 30. No. 1. P. 151-158.

171. Черепкова O.A., Лютова E.M., Гурвиц Б.Я. (2006) Фактор ингибированпя миграции макрофагов; выделение из мозга быка. Биохимия. Т. 71. № 1. С. 90-96.

172. Cherepkova О.A., Lyutova Е.М., Eronina Т.В., Gurvits B.Ya. (2006) Chaperone-like activity of macrophage migration inhibitory factor. Intern. J. Biochem. Cell Biol. V. 38. No. 1. P. 43-55.

173. Черепкова O.A., Лютова E.M., Еронина Т.Б., Гурвиц Б .Я. (2006) Ускорение агрегации белков в условиях теплового стресса под влиянием фактора ингибирования миграции макрофагов. Биохимия. Т. 71. №2. С. 182-189.

174. Лютова Е.М., Казаков А.С., Гурвиц Б.Я. (2007) Шапероноподобная активность цитоплазматического рецептора иммуносупроссора FK506 иммунофилина FKBP 12 из мозга быка. Нейрохимия. Т. 24. № 3. С. 208-216.

175. Lyutova Е.М., Kasakov A.S., Gurvits B.Ya. (2007) Effects of arginine on kinetics of protein aggeregation studied by dynamic laser light scattering and turbidimetry techniques. Biotechnol. Prog. V. 23. No. 6. P. 1380-1387.1. ТЕЗИСЫ

176. Лютова Е.М., Черепкова О.А., Гурвиц Б.Я. (2005) Фактор ингибирования миграции макрофагов; олигомерная структура в состоянии теплового стресса. 9-ая Пущинская школа конференция молодых ученых. "Биология - наука XXI века". Тез. докл. С. 85.

177. Gurvits B.Ya., Cherepkova О.А., Lyutova E.M., Eronina T.B. (2005) Macrophage migration inhibitory factor exhibits chaperone and anti-chaperone activities. FEBS J. V. 272. Suppl. 1. P. 353.

178. Черепкова O.A., Лютова E.M., Гурвиц Б.Я. (2005) Гипофизарный гормон фактор ингибирования миграции макрофагов обладает шапероноподобными свойствами. Научная конференция "Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты". Тез. докл. С. 129.

179. Lyutova Е.М., Kasakov A.S., Gurvits, B.Ya. (2007) Chaperone-like activity of adrenocorticotropic hormone. J. Neurochem. V. 102. Suppl. 1. P. 288.1. БЛАГОДАРНОСТИ

180. Выражаю признательность доктору Станке Стоевой (Stanka Stoeva) из Института физиологической химии, Тюбингенского университета (Германия) за секвенирование белка (FKBP) и масс-спектральный анализ.

181. Хочу поблагодарить Черепкову Оксану Анатольевну за помощь в проведении экспериментов, а также за моральную поддержку.

Информация о работе

Лютова, Елена Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Молекулярные механизмы шапероноподобного действия амфифильных белков и пептидов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Молекулярные механизмы шапероноподобного действия амфифильных белков и пептидов ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы шапероноподобного действия амфифильных белков и пептидов"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лютова, Елена Михайловна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы шапероноподобного действия амфифильных белков и пептидов"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Лютова, Елена Михайловна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лютова, Елена Михайловна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы шапероноподобного действия амфифильных белков и пептидов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия