Влияние минорных модификаций первичной структуры на физико-химические свойства и шапероноподобную активность бета-казеина

Коннова, Татьяна Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние минорных модификаций первичной структуры на физико-химические свойства и шапероноподобную активность бета-казеина
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние минорных модификаций первичной структуры на физико-химические свойства и шапероноподобную активность бета-казеина"

На правах рукописи -

Коннова Татьяна Анатольевна

ВЛИЯНИЕ МИНОРНЫХ МОДИФИКАЦИЙ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ШАПЕРОНОПОДОБНУЮ АКТИВНОСТЬ БЕТА-КАЗЕИНА

03.01.02 - биофизика

005056699

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2012

6 ДЕК 2012

005056699

Работа выполнена в лаборатории биофизической химии наносистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук (КИББ КазНЦ РАН) и лаборатории функциональных взаимодействий белков Национального института агрономических исследований (НИАИ), Нант, Франция.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

доктор химических наук, профессор заведующий лабораторией КИББ КазНЦ РАН, г. Казань Юрий Федорович Зуев

профессор, заведующий лабораторией НИАИ, г. Нант, Франция Тома Эртле

доктор биологических наук, профессор МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва Владимир Израилевич Муронец

доктор химических наук, профессор

КФУ, г. Казань

Валерий Виленович Горбачук

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, г. Москва

Защита состоится 24 декабря 2012 г. в II00 часов на заседании диссертационного совета Д002.005.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени канди ата наук, на соискание ученой степени доктора наук при КИББ КазНЦ РАН по адресу: 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, 2/31, а/я №30, тел/факс (843)2927347.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке КазНЦ РАН.

Автореферат разослан «$» ноября 2012 г. Ученый секретарь

диссертационного совета, /

кандидат биологических наук ¿^^ Анастасия Анатольевна Пономарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и ее актуальность. Молекула бета-казеина - одного из основных молочных белков - в отличие от типичных глобулярных белков обладает слабо выраженными элементами вторичной структуры [Creamer et al., 1981; Caessens et al., 1999]. Все полярные и заряженные остатки сконцентрированы на N-конце полипептидной цепи, в то время как остальная ее часть состоит преимущественно из остатков неполярных аминокислот и содержит большое количество пролиновых остатков [Swaisgood, 1992, 1993, 2003]. В первичной последовательности бета-казеина отсутствует цистеин, что исключает возможность образования внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей. Сочетание амфифильного строения и высокой гибкости полипептидной цепи бета-казеина приводит к ассоциации белка в водной среде с образованием наноразмерных коллоидных агрегатов — мицелл [Schmidt, Payens, 1972; Niki et al., 1977; Evans et al., 1979; Swaisgood, 2003].

Бета-казеин является удобной моделью для изучения различных аспектов строения коллоидной системы молока и связанных с ней функций. Строение поверхности коллоидных агрегатов молочных казеинов, где гидрофильные участки перемежаются с гидрофобными, их высокая связывающая способность по отношению к гидрофобным соединениям и возможность адаптации геометрии поверхности под связываемый лиганд определяют ряд функциональных особенностей молока. Кроме того, эти свойства в последние годы вызвали интерес к шапероноподобной функции казеинов [Bhattacharyya, 1999; Morgan et al., 2005; Barzegar et al., 2008; Hassanisadi et al., 2008; Yousefi et al., 2009]. Коллоидные свойства и шапероноподобная активность бета-казеинов имеют прикладное значение, благодаря способности стабилизировать микроэмульсии и эмульсии в пищевой промышленности, что определяет текстуру и вкусовые качества пищевых продуктов.

Одним из возможных подходов получения бета-казеина с новыми физико-химическими и функциональными свойствами является изменение его структуры методами белковой инженерии. Процесс самоорганизации бета-казеина чрезвычайно чувствителен к физико-химическим свойствам среды (полярности и вязкости растворителя, температуре, pH и т.п.), что влияет на размер, структуру и сорбционные свойства его коллоидных агрегатов [Schmidt, 1982; Leclerc, Calmettes, 1997; De Kruif, Grinberg, 2002; Mikheeva et al., 2003; O'Connell et al., 2003]. Кроме того, было показано, что точечное введение цистеиновых остатков в полипептидную цепь этого белка приводит к образованию димерных или олигомерных комплексов и значительно изменяет свойства мицеллярных агрегатов (размер, форму, температуру перехода мономер-мицелла, устойчивость к изменению pH и пр.) [Gaudin et al., 2009; Yousefi et al., 2009]. При этом, вероятно, могут происходить изменения функциональных свойств бета-казеина, в частности, его шапероноподобной активности. К настоящему времени работ по исследованию взаимосвязи структуры и функциональных особенностей бета-казеина немного и нет ясности, в какой степени

структура белка определяет эти свойства.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление вклада структурных особенностей бета-казеина в его ассоциативные, коллоидные и шапероноподобные свойства.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить очищенные препараты рекомбинантного бета-казеина дикого типа и его модифицированных форм, содержащих цистеиновые остатки в различных участках полипептидной цепи белка.

2. Охарактеризовать структуру и процессы самоассоциации рекомбинантных бета-казеинов методами динамического светорассеяния, флуоресценции, кругового дихроизма (КД) и инфракрасной спектроскопии (ИК).

3. Проанализировать влияние температуры и состава растворителя на структуру и свойства бета-казеина.

4. Охарактеризовать шапероноподобную активность природной и рекомбинантных форм бета-казеина по отношению к термо-индуцированной агрегации ряда целевых белков.

Научная новизна работы. Впервые с применением комплекса взаимодополняющих физических методов исследована взаимосвязь структурного состояния рекомбинантных бета-казеинов с цистеиновыми остатками, введенными в различные участки полипептидной цепи белка, с их ассоциативными и шапероноподобными свойствами.

Впервые выполнен всесторонний анализ структурных данных и самоассоциации бета-казеина в смешанном растворителе вода-этанол. Показана корреляция между микрофазным разделением водно-спиртовых растворов, вторичной структурой белка и строением мицелл бета-казеина.

Впервые установлено наличие верхней и нижней границ температурного интервала самоассоциации бета-казеина; при этом увеличение концентрации спирта вызывает понижение как верхней, так и нижней температур мицеллообразования.

Впервые аргументировано, что высокая стабильность вторичной структуры бета-казеина в условиях повышения температуры является кажущейся и обусловлена ограничениями методов разложения спектров КД в приложении к нативно-неупорядоченным белкам.

Впервые исследована шапероноподобная активность бета-казеина в отношении каталитического действия фермента в условиях действия повышенной температуры.

Результаты работы могут бьггь использованы для прогнозирования влияния температуры и состава растворителя на структуру и функции бета-казеина и других нативно неупорядоченных белков, а также для направленного получения белков с новыми физико-химическими свойствами для пищевой промышленности и биотехнологии.

Полученные экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учреждениях биологического, медицинского, биотехнологического, физико-химического профилей, занимающихся исследованием взаимосвязи структуры и функций биомакромолекул, динамики белков в водно-органических средах, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, биофизике, физической и органической химии, и молекулярной биологии в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Исследования проводились в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Межмолекулярные взаимодействия и молекулярная динамика как факторы регуляции функциональной активности белков» (номер госрегистрации №0120.0 803026) и поддержаны грантом правительства Франции для обучения в совместной аспирантуре, грантами РФФИ, а также грантом Президиума РАН (программа «Молекулярная и клеточная биология»). Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на 12-ой Международной школе-конференции молодых ученых: «Биология — наука XXI века» (Пущино, Россия, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), IV Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Казань, Россия, 2009), 34-ом конгрессе FEBS «Life's Molecular Interaction» (Прага, Чехия, 2009), Российской школе-конференции молодых ученых "Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, Россия, 2010), V Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Петрозаводск, Россия, 2011), 3-м Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, Россия, 2011), I Российском симпозиуме по поверхностно-активным веществам «От коллоидных систем к нанохимии» (Казань, Россия, 2011), 36-ом конгрессе FEBS «Biochemistry for Tomorrow's Medicine» (Турин, Италия, 2011), VII Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, Россия, 2011), Конференции молодых ученых в области науки о жизни (Париж, Фракция, 2012); на семинарах лаборатории функциональных взаимодействий белков НИАИ (Нант, Франция, 2008 - 2011).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 17 работ; из них 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. В работе представлено 49 рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 290 источников, из них 271 зарубежных.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили нативный бета-казеин коровьего молока (Lactalis, France), рекомбинантные формы бета-казеина дикого типа и содержащие аминокислотные замены/вставки цистеинового остатка в различных участках полипептидной цепи.

1.1. Приготовление образцов. Белки растворяли в Na-фосфатном буфере 50 мМ, рН 7.4. Стоковые растворы разбавляли буфером и этанолом до получения нужной концентрации белка и спирта.

1.2. Получение рекомбинантных форм бета-казеина. Наработку рекомбинантных форм бета-казеина проводили в бактериальных системах экспрессии. Для этого в штаммы-продуценты E.coli Rosetta (DE3) pLysS и BL21 (DE3) встраивали плазмиды на основе векторов pET21-d (+) и рЕТ32-Ь, содержащих первичные последовательности бета-казеинов дикого типа и модифицированных (Novagen, США). Модификацию первичной последовательности бета-казеина С30 проводили с помощью метода сайт-направленного мутагенеза (QuikChange, Invitrogen, США). Культуры клеток E.coli выращивали в питательных средах LB (Luria-Bertani) [Гловер, 1988] с добавлением соответствующего антибиотика (хлорамфеникола, ампициллина). Индукцию экспрессии рекомбинантных белков бактериальными продуцентами проводили добавлением ИГГГГ (изопропил-p-D-тиогалактозид). После получения клеточных лизатов проводили трехстадийную (анионообменную и две обратно-фазовые) хроматографическую очистку белков методом FPLC с использованием системы Àkta Purifier, оснащенной программным обеспечением Unicom Control (Amersham Biosciences, США).

1.3. Самоассоциация бета-казеина. Гидродинамические диаметры бета-казеина в молекулярном и мицеялярном состояниях определяли методом динамического светорассеяния на приборе Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания). Для расчета радиуса частиц по автокорреляционным кривым использовали метод CONTIN.

Спектры флуоресцентного излучения триптофана записывали в диапазоне длин волн 300 - 400 нм при длине волны возбуждения 295 нм на спектрофлуориметре Hitachi F-4500 (Hitachi, Япония). Спектры корректировали вычитанием спектра рамановского поглощения воды. Значения максимума флуоресценции определяли с использованием программы Peak Fit (Systat Software, Великобритания).

1.4. Вторичная структура бета-казеина. Спектры КД были записаны на

спектрополяриметре Jas.co J-810 (Jas.co Incorporated, США) в дальней УФ области в кюветах Hellma 106-QS с длиной оптического пути 0.02 см. Анализ вторичной структуры белков по спектрам КД был выполнен с использованием алгоритма расчета [Provencher, Glockner, 1981] и программы CONTINLL [Whitmore, Wallace, 2008] с сайта DICHROWEB (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk), базисный набор белков №7 [Janes, 2005; Wallace, Janes, 2009].

Спектры ИК регистрировали на спектрофотометре Tensor 27 (Bruker, Германия), спектральное разрешение 4 см"1, 128 сканов. Для приготовления образцов использовали дейтерированную воду (D20, Aldrich 151882-lOOG, 99.9%). Исследуемые растворы помещали в термостатируемую кювету из CaF2 с толщиной слоя 100 или 10 мкм. Из спектров растворов бета-казеина вычитали спектры соответствующих растворителей, снятые при тех же температурах, и спектры паров атмосферной воды. Сглаживания спектров не производили.

1.5. Определение шапероноподобной активности рекомбинантных бета-казеинов.

1.5.1. Аптиагрегационные свойства бета-казеипа.

Тепловая денатурация алкогольдегидрогеназы и каталазы. Для оценки антиагрегационных свойств бета-казеина использовали тест-систему, основанную на подавлении агрегации модельных белковых субстратов - алкогольдегидрогеназы (АДГ) из лошадиной печени (Sigma Aldrich) и каталазы из коровьей печени (Sigma Aldrich) [Bhattacharyya, Das, 1999]. Кинетику агрегации прослеживали по изменению коэффициента поглощения раствора при 360 им на спектрофотометре Lambda 25 (Perkin Elmer, США). Агрегацию АДГ индуцировали нагреванием реакционной смеси до температуры 48°С, каталазы - до 55°С. Для описания кинетических кривых агрегации использовали уравнение:

Л = A¡im{1 -ехр[-£, (t -t0)]} + ß(t -t0) [Курганов, 2002]. Для количественного описания шапероноподобной активности (Аш) бета-казеинов использовали формулу: Аш =[1-(^ *A,J/(-ki*Anm)]*l00%.

Тепловая денатурация моноклинальных иммуноглобулинов G (IgG). Антиагрегационные свойства бета-казеина оценивали по изменению иммунореактивности моноклональных IgG к бета-лактоглобулину при температурном воздействии. Активные концентрации антител определяли методом непрямого ИФА, общая концентрация белка была измерена методом Bradford [1976].

1.5.2. Ферментативная активность АДГ. Активность АДГ определяли по изменению оптического поглощения реакционной среды при 340 нм. Реакцию инициировали внесением фермента, предварительно проинкубированного при заданной температуре, в реакционную смесь. Активность фермента контролировали по начальной скорости реакции окисления этанола. Все спектрофотометрические измерения осуществляли на приборе Lambda 25 (Perkin Elmer, США).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Получение рекомбинантного бета-казеина. В работе были использованы нативный бета-казеин, рекомбинантный бета-казеин дикого типа и рекомбинантные мугантные формы, содержащие цистеин в начале цепи, в 30-м и 208 положениях, а также двойной мутант С0-208:

♦ t

native b-CN RELEELNVPGEIVESLSSSEESITRINKK ¡sdEKFQS—FPHaaV

VVT b-CN MRELEELNVPGOVESLSSSEESITRINKK ImEKFQS—FPtfeoeV

b-CN«» GC-.vRELEELNVf'GEtVESLSSSi-ESITRINKK ImEKFQS—-FPIkosV

6-CNcm GRELEELNVPGEIVESl-SSSEESITRINKKCssEKFQS—FPItesV

Ь-СМсж GRELEELNVPGEIVESLSSSEESiTRINKK IsaEKFQS-—FPiOwV

ЬСНжя G&RELEEtKIVPGEIVESLgSSeESITRINKK boEKFQS—РРЮмУ

Плазмиды, содержащие первичные последовательности бета-казеинов дикого типа b-CN WT и несущих мутации b-CN СО, b-CN С208, b-CN С0-208 были предоставлены лабораторией функциональных исследований белков Национального института агрономических исследований (Нант, Франция). Модификация бета-казеина заменой изолейцина в 30 положении на цистеин (b-CN С30) была произведена нами в КИББ КазНЦ РАН.

/ » м И" I

1 2 3 4 5 6 7

8 9 10 11 12 13

«цииии»

Рис. 1. Электрофореграмма олигомеризации рекомбинантных бета-казеинов: ЬСИ-СО (А, дорожки 1-6), ЬСК'-СЗО (А, 8-13), ЬСИ-С208 (Б, 1-6) и ЬСЫ-СО-208 (Б, 9-14).

Время инкубации раствора белка при 37°С, рН 7.4:

А: 1-6, 8-13; Б: 1-6; 9-14 - 0, 1, 3, 6, 9, 24 часа

Маркер молекулярного веса (кДа) - дорожки А - 7 и Б - 15

35'

25.

14 *

10 11 12 13 14 15

2.2. Структурные и физико-химические свойства бета-казеина.

2.2.1. Олигомеризация цистеинсодержащих бета-казеинов. Введение цистеиновых остатков в структуру бета-казеина способствует образованию внутри и межмолекулярных дисульфидных связей. Введение цистеина в концевые или центральный участки полипептидной цепи вызывало спонтанную димеризацию бета-

казеина (рис. 1А), а двойная замена в концевых участках приводила к образованию олигомеров и «кольцевой» формы белка (рис. 1Б). Присутствие в растворе некоторого количества олигомеров наблюдали сразу же после растворения рекомбинантных белков. К 24 часам после начала эксперимента практически все мономеры белка переходили в олигомерную форму.

2.2.2. Влияние внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей на процесс самоассоциацни бета-казеина. Для исследования процесса самоассоциации бета-казеина использовали метод динамического светорассеяния. При нагреве растворов нативного и дикого типа бета-казеинов происходил переход из молекулярного состояния со средним гидродинамическим диаметром частиц 7-8 нм в мицеллярное (17-18 нм). Положение мицеллярного перехода на температурной шкале зависело от концентрации бета-казеина (рис. 2А). Способность бета-казеина к мицеллообразованию сохранялась и для модифицированных форм. Для димеров ЬСМ-СО, ЬСЫ-СЗО и ЬСМ-С2()8 отмечено снижение температуры мицеллярного перехода по сравнению с безцистеиновыми формами (рис. 2Б). Олигомеры ЬС1Ч-С0-208 находились в растворе в форме мицеллярных ассоциатов с гидродинамическим диаметром 18-23 нм во всем исследованном температурном интервале. В присутствии редуцирующего агента (меркаптоэтанола) профили изменения размеров частиц цистеинсодержащих белков аналогичны профилям бета-казеина нативного и дикого типа При этом мицеллярные ассоциаты восстановленных форм бета-казеинов,

-Ш-ЬСМ*(0.1 мг/мл -О-ЬС1Ч»*0.2мг/мл -•-ЬОШОЛиЛт -О- ЬСМ пайч» 0.4 |»<мп

Ч £10 О

температура,*С

-»-ЬСЫу*

-о-ьемезо -д-ьсысгов

-V-№N00-208

-•-ьсысо

ЬСЫ гагёуе

температура,"С

Рис. 2. Температурная зависимость гидродинамического диаметра частиц для различных концентраций нативного бета-казеина (А), для олигомерных форм (Б) и мономерных форм (В) модифицированных бета-казеинов (концентрация 0.4 мг/мл).

£10 О

-о-ьсисзо -Д-Ь<ЖС208 ЬСМ С0-20В

»-ьсысо

-а-ЬСМпаВуе

40 60

температура,'С

содержащих цистеин в начале полипептидной цепи, оказывались неустойчивыми к действию повышенных температур (рис. 2В). Таким образом, образование меж- и внутримолекулярных дисульфидных связей, облегчая взаимодействие гидрофобных участков полипептидной цепи, способствует ассоциации бета-казеина.

Аналогичная данным светорассеяния картина для самоассоциации различных форм бета-казеина наблюдалась методом триптофановой флуоресценции. Единственный триптофановый остаток, локализованный в гидрофобной части молекулы бета-казеина, при самоассоциации белка, погружаясь вглубь мицелл, оказывался в менее полярном окружении, что проявлялось в «голубом» сдвиге максимума флуоресценции. При низких температурах значения Хмлх для всех рекомбинантных бета-казеинов в мономерной форме заметно ниже, чем для нативного бета-казеина (рис. ЗА), что может свидетельствовать о более компактной организации их молекул. Наличие или отсутствие мицеллярного перехода для олигомерных форм СО, СЗО и С208 (рис. ЗБ) согласуется с данными светорассеяния. Таким образом, наличие димеров, олигомеров и формы "intra", т.е. формирование внутри- и межмолекулярных связей, оказывает значительное влияние на поведение бета-казеина в процессе самоассоциации.

Рис. 3. Температурная зависимость положения максимума триптофановой флуоресценции рекомбинантного бета-казеина (концентрация 0.4 мг/мл). А - мономерные формы, Б -олигомерные формы

2.2.3. Вторичная структура цистеинсодержащих бета-казеинов. Для

изучения вторичной структуры рекомбинантных бета-казеинов использовали метод спектроскопии кругового дихроизма. Олигомеры и мономеры рекомбинантных бета-казеинов имеют похожие спектры (рис. 4), характерные для неупорядоченной структуры с присутствием небольшой доли других структур.

Разностные спектры показывают, что уменьшение интенсивности сигнала на 198-200 им (и соответственный рост на 222 нм) в ряду WT>C0=C30>C0-2O8>C2O8 (олигомеры) и WT>C0=C0-208>=C30>C208 (мономеры) могут быть обусловлены разрушением спирали типа полипролин II (PPII). Если считать, следуя [Gangnard et al, 2007], что указанные изменения в спектре бета-казеина отражают образование

более упорядоченной и менее гидратированной структуры, то из спектров на рис. 4 следует, что наибольшей структурированностью обладает мутант С208, а наименьшей - ^ЛТ, как в димерной, так и в мономерной формах. Одинаковую степень внутренней упорядоченности имеют димеры СО и СЗО, а среди мономеров - СО, СЗО и С0-208. В

определенной степени, такой вывод флуоресценции для этих белков.

соотносится с положением максимума

1S0 200 210 220 230 240

длина вопны,нм

210 220 230 24Q 250 длина ВОПНЫ,НМ

Рис. 4. Спектры КД для бета-казеина дикого типа и его модифицированных форм (температура 10°С). А - мономерные формы, Б - олигомерные формы.

При повышении температуры в спектрах КД рекомбинантных белков происходит уменьшение интенсивности минимума при 198-200 нм и рост глубины минимума при 222 нм. Наличие изодихроической точки указывает на равновесный переход между двумя состояниями. Разностные спектры между 10°С и 50°С имеют форму, характерную для структуры PPII (рис.5), и свидетельствуют, что повышение температуры сопровождается разрушением участков левой спирали PPII.

В целом, температурные изменения в спектрах КД отражают, преимущественно,

процесс роста упорядоченности вторичной структуры, не связанный, или связанный лишь опосредованно с ассоциацией бета-казеина, и согласуются с известными данными литературы [Gangnard etal., 2007]. Введение точечных замен на цистеины также способствует росту упорядоченности вторичной структуры, при этом наибольшее влияние оказывают замены, затрагивающие гидрофобный домен (рис. 6). Играют ли какую-то роль образующиеся при этом межмолекулярные сшивки — неясно, так вторичной структуры протекают и в

200 220 240

длина волны,нм

Рис. 5. Спектры КД бета-казеина дикого

типа при разных температурах.

как столь же интенсивные изменения мономерной форме.

] —■-bCNwt —— bCNCO I —ьемезо

! -J— bCNC208

j —■—ЬСНС0-20в

оэо со-гов мономеры, Ю'С

Щ а-спирапь _ р-струюто« (Июворот _ 1н1 ^неупорядоченная

СО C30 C0-206 олигомгры, 10°С

Рис. 6. Содержание элементов вторичной структуры в мономерных (А) и олигомерных (Б) формах модифицированных рекомбинантных бета-казеинов.

в водно-этанольных

2.3. Физико-химические свойства бета-казеинов растворах.

2.3.1. Самоассоциация нативного бета-казеина в водно-эганольных растворах. Добавление этанола значительно видоизменяет температурные зависимости мицеллообразования бета-казеина, влияя как на размер ассоциатов, так и на температуру перехода; причем эти эффекты зависят от концентрации белка. В растворах с концентрацией казеина 0.5 мг/мл (рис. 7А) небольшие добавки этанола приводили к уменьшению размера мицелл, слабо влияя на температуру их образова-

| о

-«-bCN-HJEtOH -0-bCN-K).5E(0H —Л— bCN+1 ЕЮН -W-bCN+2EWH

-♦-ьсждаон -a-bCN+ioetoH

200 150

«20 J

—bCN+ОЕЮН -*-bCN+15BOH

-*-bCN+30EtOH -4-bCWMOEtOH -O-bCN*50EIQH

20 30 40 температура,"С

20 30 40 температура,'С

Рис. 7. Температурная зависимость гидродинамического диаметра частиц нативного бета-казеина в растворах с содержанием этанола 0-50% v/v. Концентрация белка 0.5 мг/мл.

ния. При дальнейшем нагреве мицеллы распадались до мономеров; причем температура распада мицелл понижалась с увеличением концентрации спирта Это приводило к сужению температурного интервала существования мицелл, а при концентрации этанола 5 — 10% бета-казеин мицелл не образовывал. При дальнейшем увеличении содержания спирта (рис. 7Б) вновь наблюдалась самоассоциация белка, но температура разрушения мицелл понижалась до 10 - 20°С, а температура мицеллообразования, по-видимому, смещалась в область отрицательных значений.

Повышение концентрации казеина до 2.5 мг/мл (данные не представлены) способствовало большей стабильности мицеллярных структур, и ассоциаты белка существовали во всем диапазоне концентраций спирта. При этом температурные границы образования и распада мицелл изменялись аналогично описанному выше. С

ростом содержания спирта выше 10% наблюдалось прогрессирующее увеличение размера ассоциатов казеина, а при 4050% спирта появлялись частицы размером до 100 - 200 нм. Таким образом, в водных и водно-спиртовых растворах мицеллы казеина существуют в определенном температурном диапазоне, границы которого можно условно обозначить как верхняя и нижняя температуры демицеллизации, которые, в свою очередь, зависят от концентрации белка. Характер изменения положения максимума флуоресценции триптофана (рис. 8) качественно соответствует данным динамического светорассеяния по мицеллообразованию бета-казеина в водных и водно-спиртовых растворах.

2.3.2. Влияние растворителя на вторичную структуру бета-казеина.

Круговой дихроизм. Спектры КД раствора нативного бета-казеина в буфере имеют глубокий минимум при 198 нм и более слабое плечо в области 220 - 240 нм (рис. 9А), характерные для преимущественно неупорядоченных белков [Woody, 1992].

Рис. 9. Спектры КД растворов нативного бета-казеина (0.5 мг/мл) в буфере при различных температурах (А) и в смеси вода-этанол с содержанием спирта 0 - 50% при температуре 10°С (Б).

Наличие и положение изодихроической точки указывает, что нагрев вызывает

температура,°С

Рис. 8. Температурная зависимость положения максимума триптофановой флуоресценции в водно-этанольных (0-50% v/v) растворах бета-казеина. Концентрация белка 0.5 мг/мл.

переход между двумя структурными состояниями: спираль PP1I переходит в неупорядоченную конформацию [Drake et al., 1988; Woody, 1992; Toumadje, Johnson, 1995; Soulages et al., 2002]. Разностный спектр между 10 и 60°С также имеет форму и положение экстремумов, характерные для спирали PPII.

Анализ спектров КД водно-этанольных растворов бета-казеина показал, что с ростом концентрации спирта изменения в спектрах немонотонны, изодихроичная точка отсутствует (рис. 9Б). Разностные спектры малоинтенсивны и по форме соответствуют приросту альфа-спиральной структуры. Начиная с 20% этанола, в спектрах появляются признаки бета-структуры.

В интервале 40-50% этанола вновь начинает превалировать альфа-спиральная структура. Расчет доли вторичных структур, выполненный по спектрам КД (рис. 10), согласуется с проведенным качественным анализом и показывает рост структурированности бета-казеина по мере увеличения содержания этанола, хотя различные элементы вторичной структуры меняются по-разному. Анализ спектров КД бета-казеина в водных и водно-спиртовых растворах при нагреве до 60°С также показывает рост структурированности (данные не приводятся). Ранее авторы [Farrell et al, 2001] интерпретировали температурные изменения спектров КД бета-казеина именно таким образом.

Общий рост упорядоченных структур по мере добавления спирта представляется естественным, поскольку увеличение гидрофобности растворителя должно способствовать образованию внутрибелковых водородных связей. Однако

аналогичное увеличение структурированности при нагреве вызывает сомнения. Анализ температурных зависимостей эллиптичности казеина на длинах волн 222 и 198 нм (рис. 11), соответствующих характеристическим точкам дихроичности альфа-спиралей и неупорядоченных структур, соответственно, показал, что полученные зависимости в пределе высоких температур сходятся к некоторому общему внутри каждой группы данных уровню эллиптичности. Аппроксимация зависимостей при длине волны 222 нм (рис. 11) по модели двух состояний дает значение высокотемпературного предела эллиптичности -5638±378 град*см2/дмоль, весьма близкое величине -5560 град*см2/дмоль, соответствующей эллиптичности дня полностью неупорядоченной структуры [Park et al., 1997].

а-спирапь р-струю>рв неупорядоченная

структура

Рис. 10. Содержание вторичных структур в растворах нативного бета-казеина (0.5 мг/мл) при температуре 10°С. Концентрация этанола О, I, 10, 15, 20, 30, 40 и 50%.

2000

Лл 0 §

-2000

¡5 -4000 »

а. -6000 | .«ХЮ

« ых-нзйон А ЬСМИЕЮН а ЬСМ-ИОЕЮН т ЬС№И5вОН V ЬС1Ч+20£Ю« 4 ьси+зоаан < ЬСНЧСВОН о ЬСМ+50ЕЮН

......

100 -50 О М 100 150 200

температура,°С

Рис. 11. Температурная зависимость эллиптичности при длине волны 222 нм для 0.5 мг/мл растворов бета-казеина в водно-этанольных растворах. Штриховая линия отмечает уровень эллиптичности град*см2/дмоль.

-5560

Таким образом, несмотря на исходно различный уровень вторичных структур, определяемый при низких температурах составом растворителя, нагрев вызывает их разрушение с переходом при достаточно высоких температурах в неупорядоченное состояние. Интересно, что согласно приведенным зависимостям это же состояние должно реализоваться вне зависимости от температуры в растворе с некоторой концентрацией спирта, промежуточной между 30 и 40%.

Инфракрасная спектроскопия. Поскольку существует неопределенность в интерпретации температурных спектров КД бета-казеина, необходимо

привлечение дополнительных структурных методов. Мы провели сравнение изменений в инфракрасных спектрах при нагреве водных и водно-спиртовых растворов нативного бета-казеина с изменениями в спектрах модельных соединений (полипролин и полиаланин), в отношении температурного поведения структуры и гидратированности которых имеются более определенные сведения, чем в отношении бета-казеина. Сопоставление показало, что при нагреве водных растворов бета-казеина имеют место два параллельных процесса: распад элементов спирали РРН с переходом в гидратированную неупорядоченную структуру и дальнейшая дегидратация последней (спектры не приводятся).

Спектральные изменения бета-казеина в смеси вода : этанол (20%) в два раза интенсивнее, чем в буфере (рис. 12А). На разностных температурных спектрах казеина в водно-спиртовом растворе проявляются две однонаправленные компоненты - 1627 и 1680 см"1, что является характерным признаком бета-структуры. Температурная зависимость (рис. 12Б) спектральных изменений бета-казеина на частоте 1627 см"1 указывает на слабую кооперативность плавления бета-структуры с температурой полуперехода 33.6 ± 0.8°С. Зависимость интенсивности поглощения для бета-казеина в буфере показывает значительно более слабые и разнонаправленные изменения. Первоначальный рост и последующий спад обусловлены наложением двух близких компонент - спирали РРН и неупорядоченной, температурная эволюция которых неодинакова. Таким образом, качественный анализ ИК-спектров свидетельствует, что молекула казеина в 20% растворе этанола содержит значительную долю бета-структуры и обладает более компактной конформацией, чем в буфере. При нагреве происходит распад бета-

структуры с образованием неупорядоченной структуры, что подтверждает сделанное ранее заключение в отношении температурной эволюции спектров КД.

I 20-15*0 | 25-1ГС | SMS*C . 35-WG «И5-С ' «-«'С » 5Ö-15-C

„ 0,0008 'S

£ 0,0006 «Ч <0

^ 0,0004-^ а.

j 0.0002

I 0,0000

i -0,0002

с -0,0004

длина волны (см")

15 2025303540455055 температура, 'С

Рис. 12. Характеристика изменений вторичной структуры бета-казеина методом ИК-спектрометрии. А - Температурные разностные спектры растворов бета-казеина в водном буфере (сплошная линия) и в 20% растворе этанола (штриховая линия). Спектры нормированы на интенсивность в максимуме полосы амид 1. Б - Температурные зависимости интенсивности на частоте 1627 см"' в спектрах казеина в водном буфере (светлые символы) и в 20% растворе этанола (темные символы).

—ЬСЫ+ОЕЮН -*-bCN+5E(OH -O-bCN+lOEtOH -T-bCN-H5EtOH

О 20 40 60 80 „ w

температура,*С температура,*С

Рис. 13. Температурная зависимость гидродинамического диаметра частиц рекомбинантного

бета-казеина С0-208 в растворах с содержанием этанола 0-50% v/v. Концентрация казеина

0.5 мг/мл.

2.3.3.Самоассоциация рекомбинантного бета-казеина С0-208 в водно-этанольных растворах. Исследования самоассоциации рекомбинантных бета-казеинов в водно-этанольных растворах было выполнено на двойном мутанте С0-208, который в водной среде имел ярко выраженные отличия по ассоциативным свойствам от других бета-казеинов. В водно-этанольных смесях ЬШ СО-208 сохранял свои

характерные свойства вплоть до 15% содержания этанола. В этих системах во всем изученном интервале температур 5-80°С ЬСЫ С0-208 находился в мицеллярном состоянии, хотя размер мицелл при низких температурах существенно зависел от

содержания этанола (рис. 13А). Дальнейшее повышение содержания спирта приводило к разрушению мицелл при высоких температурах, а при максимальном содержании спирта, 50%, температурный интервал существования мицелл существенно сужался (рис. 13Б).

2.3.4. Модель ассоциации бета-казеина в водно-этанольных растворах. Основываясь на данных литературы о границах концентрационных интервалов различных микроструктур в водно-этанольных растворах [Onori, 1988; D'Angelo et al, 1994; Sato et al, 1999; Wakisaka, Matsuura, 2006], мы предлагаем модель самоассоциации бета-казеина в водно-этанольных растворах. Добавление спирта приводит к образованию клатратных структур, представляющих собой одиночные молекулы спирта, окруженные молекулами воды, что эквивалентно связыванию каждой молекулой спирта 14-20 молекул воды [Sato et al, 1999]. В интервале мольных долей спирта Х2 = 0 - 0.032 (0 - 10% этанола) при низких температурах существует достаточно молекул воды не связанных со спиртом и образующих непрерывную трехмерную сетку водородных связей, для гидратации гидрофобных групп белка, что препятствует его ассоциации (рис. 14). Нагрев ослабляет водородные связи воды и уменьшает энтальпийный вклад гидрофобной гидратации [Привалов, 1987], что приводит к мицеллизации казеина. При дальнейшем росте температуры в этом интервале концентраций растет и доля молекул спирта, участвующих в предпочтительной сольватации белка, что приводит к уменьшению размера мицелл и

их диссоциации. В следующем интервале концентраций 0.032 < Х2 < 0.16 (10 - 40% этанола) вся вода связана со спиртом, образуя комплексы. Понижение температуры увеличивает прочность водородных связей между молекулами растворителя. Как следствие, связывание воды спиртом уменьшает гидратацию гидрофобных групп бета-казеина и вновь способствует его ассоциации.

Растворитель в целом по отношению к белку становится более гидрофобным, что способствует росту упорядоченных структур. В этом диапазоне концентраций нагрев разрушает водно-спиртовую структуру и облегчает взаимодействие молекул воды и этанола с белком, что приводит к распаду мицелл и переходу бета-казеина в мономерное состояние. При Х2 > 0.18 (>50%) дисперсное состояние молекул воды способствует непосредственному взаимодействию спирта и гидрофобных белковых групп, приводя к мономеризации казеина и резкому росту его спиральности.

20 S 16

i 12-

0,00 0,04

0,08 0,12 Х2

0,16 0,20 0,24

Рис. 14. Зависимость среднего гидродинамического диаметра частиц нативного бета-казеина от мольной доли этанола при температурах 5-60°С.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют, что температуро-зависимая ассоциация бета-казеина в водно-этанольных растворах протекает принципиально различным образом в области малых и больших концентраций спирта и может быть объяснена на основе существующих представлений о микрофазном расслоении смешанного водно-спиртового растворителя.

2.4. Влияние внесенных модификаций в структуру бета-казеина на его шапероноподобные свойства.

2.4.1. Влияние на тепловую денатурацию АДГ и каталазы. Для исследования шапероноподобных свойств рекомбинантных бета-казеинов использовали тест-систему, основанную на торможении агрегации АДГ и каталазы, индуцированной тепловым воздействием. Установлено, что все исследованные формы бета-казеина проявляли шапероноподобное действие, ограничивая агрегацию АДГ и каталазы, причем их активность возрастала с ростом молярного соотношения бета-казеин/целевой белок (рис. 15). Молекулярный механизм действия казеинов, очевидно, аналогичен механизму классических шаперонов, когда блокируются

Рис. 15. Зависимость шапероноподобной активности бета-казеинов от молярного соотношения казеинов к белковому субстрату: А - каталаза; Б - АДГ.

экспонированные в растворитель гидрофобные области частично развернутого целевого белка. Бета-казеин, как и малые белки теплового шока, имеет гибкую, слабо упорядоченную структуру с протяженными гидрофобными участками, что может способствовать его взаимодействию с разворачивающимся целевым белком, приводя к формированию стабильных комплексов. Высоко сольватированная полярная область бета-казеина, возможно, является важной в поддержании растворимости комплекса с целевым белком. Очевидно, что отличия исследованных мутантных форм бета-казеина в уровне шапероноподобной активности связаны с различием в их структурной организации и амфифильных свойствах.

2.4.2. Каталитическая активность АДГ в присутствии бета-казеинов. Несмотря на то, что в контроле (буферный раствор) при температуре, превышающей температуру денатурации, АДГ теряла часть активности (рис. 16, вставка), установлено, что в присутствии бета-казеина активность фермента может сохраняться

паИуе

С0-208

СО сзо формы бета-казеина

Рис. 16. Активность АДГ в присутствии

различных форм бета-казеина при 70°С (за

100% принята активность фермента в

отсутствии бета-казеинов при 70°С). На

вставке представлена зависимость У0 от

температуры для АДГ в отсутствии бета-

казеинов.

в более широком диапазоне температур. Однако, этот эффект наблюдался только при малых концентрациях шаперона (рис. 5 16). Увеличение концентрации бета-казеина до 0.4 мг/мл, когда все формы белка находятся в мицеллярном состоянии, приводило к инактивации фермента во всем температурном диапазоне по сравнению с контролем. Вероятно, в мицеллярной форме бета-казеин блокирует активные центры фермента, ингибируя, тем самым, его каталитическое действие. Таким образом, обладая шапероноподобной активностью и препятствуя агрегации АДГ, бета-казеин и его модифицированные формы могут поддерживать активность фермента при температурах выше температуры денатурации.

2.4.3. Антиген-связывающая способность в присутствии бета-казеина. Антиген-связывающая способность антител коррелирует непосредственно с конформационной стабильностью белковой молекулы [1л е( а1, 2005, 2006]. В связи с

этим, ИФА может быть применен для детектирования конформационных

изменений антител, связанных с потерей нативных эпитопов в результате денатурации. Нами была проанализирована иммунореактивность моно-клональных ^О, находящихся как в буферном растворе, так и в растворе исследуемых белков (глобулярных и неупорядоченных) при различных температурных обработках. Присутствие казеинов и белков молочной сыворотки в растворе антител эффективно сохраняло иммунореактивность ^О в диапазоне температур гО-бО^С (рис. 17). Наибольший термо-защитный эффект наблюдался при 100- и 1000-кратных соотношениях белок/^О. При температуре 60-80°С снижение уровня детектируемого коррелировало с ростом температуры. Активных концентраций антител

в во 2

Ж 20 37 41 60 65 Г0 75 60 темпера гура,"С

Рис. 17. Общее количество ^О (%),

потерявших иммунореактивность вследствие

разрушения нативной пространственной

организации. Сравнение различных

концентраций защитного агента - нативного

бета-казеина. 20* - точка без преинкубации

раствора антител.

практически не было зафиксировано при температуре 75-80°С.

Очевидно, потеря ангиген-связывающей способности IgG, последовавшая за воздействием описанных условий, происходит в основном благодаря конформационному разворачиванию молекулы иммуноглобулина. Способность сывороточных белков молока и казеинов стабилизировать антитела может бьггь объяснена различными молекулярными взаимодействиями. Защитный эффект казеинов, возможно, имеет место благодаря наличию протяженных гидрофобных участков в белковой молекуле, которые подобно шаперонам за счет гидрофобных взаимодействий с развернутой молекулой поддерживают конформацию IgG. С другой стороны свойства БСА (64 кДа), вероятно, могут быть обусловлены большой молекулярной массой белка и присутствием достаточно крупных молекул в растворе с антителами, так называемым, краудинг (crowding) эффектом [Chebotareva et al, 2004; Chebotareva, 2007; Jeschke, Uhrmacher, 2008; Miyoshi, Sugimoto, 2008].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из фундаментальных задач биоинженерии и молекулярной биологии является установление связи пространственной организации биомакромолекул с их функциональными свойствами, а также структурой и физико-химическими свойствами индивидуальных растворителей для направленного получения белков с заданными характеристиками.

В настоящей работе дои исследования структуры и агрегационных свойств рекомбинантных и нативного бета-казеинов в водных и водно-этанольных растворах применен комплекс физико-химических методов (динамическое светорассеяние, флуоресцентная и инфракрасная спектроскопии, спектроскопия кругового дихроизма). Исследована шапероноподобная активность бета-казеинов по отношению ктермо-индуцированной агрегации ряда целевых белков.

Обнаружено, что образование внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей, помимо влияния на вторичную структуру, оказывает воздействие на ассоциативные свойства бета-казеина, а также на его способность взаимодействовать с различными белками-субстратами. Точечное введение цистеина в полипептидную цепь бета-казеина способствует росту упорядоченности его вторичной структуры. Наибольшее влияние оказывают замены, затрагивающие гидрофобный домен. Дисульфидные связи, в особенности между гидрофобными участками полипептидной цепи, и, как следствие, димеризация и олигомеризация способствуют самоассоциации рекомбинантных белков.

Показано влияние микрогетерогенносги структуры смешанного растворителя на вторичную структуру белка и его коллоидное состояние. В исследуемом интервале концентраций спирта (0 - 50% v/v) бета-казеин претерпевает переход между различными структурными состояниями. Наблюдаемые переходы коррелируют с изменениями в характере межмолекулярных взаимодействий в бинарном

растворителе. В области низких концентраций спирта основным фактором, определяющим структуру и мицеллообразование бета-казеина, является снижение качества воды как растворителя вследствие образования ее молекулами клатратной структуры вокруг молекул спирта. Клатратная структура раствора препятствует непосредственному взаимодействию молекул белка и спирта. Нагрев разрушает клатраты и способствует мономеризации белка. В области высоких концентраций этанола клатратная структура воды разрушается и уже при низких температурах преобладает непосредственное взаимодействие белка с молекулами спирта, дестабилизирующее мицеллы и вызывающее резкий рост вторичных структур в белке. Полученные результаты способствуют пониманию факторов, управляющих процессами мицеллизации казеинов.

Результаты исследования влияния рекомбинантных бета-казеинов на стабилизацию структуры и модуляцию активности белков-субстратов демонстрируют приобретете этими белками повышенной устойчивости к денатурирующим воздействиям температуры. Кроме того, повышение температурной стабильности ферментов сопровождается изменением их каталитической активности в сторону, как ингибирования, так и активации, что зависит от структуры и концентрации используемого бета-казеина. Результаты, полученные на основе анализа иммунореактивности антител методом непрямого ИФА, демонстрируют способность бета-казеина поддерживать конформацию и сохранять антиген-связывающую способность моноклональных IgG. Обнаруженный эффект согласуется с предыдущими сообщениями о защитном влиянии компонентов молока, замедляющих индуцированную нагреванием денатурацию и агрегацию IgG [Chen, Chang, 1998; Chen et al., 2000; Ando et al.. 2005; Trujillo et al., 2007]. Выявленные механизмы воздействия бета-казеинов на функциональную активность и стабильность белковых субстратов позволяют целенаправленно модифицировать структуру белков в промышленных препаратах с целью повышения их устойчивости и исходной каталитической активности в широком диапазоне температур и рН.

ВЫВОДЫ

1. Структура и ассоциативные свойства модифицированных форм бета-казеина существенно зависят от места локализации введенного цистеинового остатка. Мицеллярные ассоциаты мономерных форм, содержащих цистеин в начале полипептидной цепи, оказываются менее устойчивыми к температурному воздействию, тогда как мицеллы, образованные олигомерными формами модифицированных бета-казеинов сохраняют стабильность при высоких температурах.

2. Точечное введение цистеина способствует росту внутренней упорядоченности белка, при этом наибольшее влияние на вторичную структуру оказывают замены, затрагивающие гидрофобный домен пептидной цепи бета-казеина.

3. Изменения вторичной структуры и ассоциативных свойств бета-казеина в водно-этанольных растворах определяются структурой растворителя, которая зависит от его состава и температуры. Содержание элементов вторичных структур и размеры мицелл бета-казеина коррелируют с концентрационными границами существования различных микрогетерогенных структур в смешанном растворителе. Показано наличие верхней и нижней границ температурного интервала самоассоциации бета-казеина. В отличие от существующего мнения о спирализации бета-казеина при высоких температурах, достоверно установлено, что увеличение температуры приводит к росту содержания неупорядоченной структуры.

4. На модельных системах (тепловая денатурация алкогольдегидрогеназы, катаяазы, иммуноглобулина в) установлено защитное действие бета-казеина, направленное на торможение процесса агрегации и сохранение частичной ферментативной активности целевого белка. Показано, что шапероноподобная активность рекомбинантных бета-казеинов существенно зависит от места локализации цистеинового остатка и структурного состояния белка.

5. Впервые показано, что в условиях температурного стресса все олигомерные формы бета-казеина в молекулярном состоянии проявляют значительный шапероноподобный эффект по отношению к каталитической активности алкогольдегидрогеназы, а в мицеллярной форме этого эффекта не наблюдается.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК

1. Шапероноподобная активность [3-казеина и термостабильность алкогольдегидрогеназы / Н.Л. Захарченко, Т.А. Коннова, Н.Е. Гоголева, Д.А. Файзуллин, Т. Эртле, Ю.Ф. Зуев // Биоорганическая химия. - 2012. - Т. 38, № 2. -С. 223-228.

2. Мицеллообразование бета-казеина в водно-этанольных растворах / Т.А. Коннова,

Д.А. Файзуллин, Т. Эртле, Ю.Ф. Зуев // Доклады Академии Наук. - 2013. - в печати.

Работы, опубликованные в материалах конференций

3. Шапероноподобная активность бета-казеина и влияние модификаций первичной структуры / С.С. Горина, Н. Е. Мухаметшина, Т.А. Коннова, и др. П Тезисы докладов / Пущинского НЦ РАН. - Пущино, 2008. - С. 15-16.

4. Влияние модификации первичной структуры бета-казеина на его шапероноподобную активность / Н.Л. Захарченко, Н. Е. Мухаметшина, Т.А. Коннова, и др. // Сб. трудов / Изд-во Арта - Новосибирск, 2008. - С. 273.

5. Структура и шаперонная активность рекомбинантных форм бета-казеина / Ю.Ф. Зуев, ТА. Коннова, Н.Л. Захарченко, и др. // Тезисы докладов / Изд-во «ФизтехПресс» КФТИ КазНЦ РАН. - Казань, 2009. - С. 72.

6. Структура рекомбинантных мономерных и олигомерных форм бета-казеина / H.JI. Захарченко, Д.А. Файзуллин, Ю.В. Гоголев, Н.Е. Мухаметшина, Т.А. Коннова, Т. Haertle, Ю.Ф. Зуев // Тезисы докладов / Изд-во «ФизтехПресс» КФТИ КазНЦ РАН. -Казань, 2009.-С. 166.

7. Chaperone-like activities and structural properties of different molecular forms of beta-casein / N.E. Mukhametshina, N.L. Zakhartchenko, T.A. Konnova, et al. // Abstracts / Wiley Blackwell, FEBS. - Prague, Czech Republic, 2009. - P. 157.

8. Коннова, T.A. Температуро-зависимая диссоциация мицелл бета-казеина в водно-этанольных растворах / Т.А. Коннова, Ю.Ф. Зуев Н Тезисы докладов / Из-во Казанского государственного университета. — Казань, 2010. — С. 29.

9. Захарченко, Н.Л. Структурные различия природной и рекомбинантной форм бета-казеина. Метод флуоресценции / Н.Л. Захарченко, Т.А. Коннова // Тезисы докладов / Из-во Казанского государственного университета. - Казань, 2010. - С. 22.

10. Konnova, Т.А. Influence of ethanol on beta-casein micellar organization and colloidal stability / T.A. Konnova, D.A. Fayzullin, N.L. Zakhartchenko, et al. // Abstracts / Wiley Blackwell, FEBS. -Torino, Italy, 2011. -P. 113.

11. Взаимосвязь структуры и шапероно-подобной активности бета-казеина / Н.Л. Захарченко, Т.А. Коннова, Н.Е. Гоголева, и др. // Тезисы докладов / Карельского НЦ РАН. - Петрозаводск, 2011. - С. 221.

12. Структурная организация и стабильность мицелл бета-казеина в водно-этанольных растворах / Т.А. Коннова, Д.А. Файзуллин, Н.Л. Захарченко, и др. // Тезисы докладов / Карельского НЦ РАН. — Петрозаводск, 2011. — С. 371.

13. Защитные свойства бета-казеина по отношению к белкам в стрессовых условиях / Н.Л. Захарченко, Т.А. Коннова, Н.Е. Гоголева, и др. // Тезисы докладов / Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского. - Нижний Новгород, 2011.-С. 267.

14. Бета-казеин - природный амфифил: структура, самоассоциация, шапероно-

подобные свойства / Т.А. Коннова, H.JI. Захарченко, Д.А. Файзуллин, и др. // Тезисы докладов / Из-во «Печать-СервисОШ век». - Казань, 2011. - С. 83.

15.Шапероноподобная активность бета-казеина в условиях температурного и химического стрессов / Т.А. Коннова, Н.Л. Захарченко, Н.Е. Гоголева, и др. // Тезисы докладов / Изд-во «ФизтехПресс» КФТИ КазНЦ РАН. - Казань, 2011. - С. 83 - 84.

16. The role of beta-casein micellar network in its chaperone-like activity / T. A. Konnova, N. L. Zakhartchenko, N. E. Gogoleva, et al. // Abstracts / Université Paris Diderot. -Paris, France, 2012. - P. 51.

17. Ферментативная активность липазы Candida Rugosa в присутствии мицелл бета-казеина / Н.Л. Захарченко, Л.Р. Богданова, Т.А. Коннова, Ю.Ф. Зуев // Тезисы докладов / Нижегородского государственного университета им. Н.ИЛобачевского. - Нижний Новгород, 2012. - С. 112.

Подписано в печать 13.11.2012. Форм. бум. 60x80 1/16. Печ. л. 1,5. Тираж 110. Заказ № 1311/1. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Весгфалшса» (ИП Колесов В.Н.) 420111, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние минорных модификаций первичной структуры на физико-химические свойства и шапероноподобную активность бета-казеина"

Молекула бета-казеина - одного из самых распространенных представителей молочных белков - в отличие от типичных глобулярных белков обладает слабо выраженными элементами вторичнойктуры [Creamer et al, 1981; Caessens et al., 1999]. Все полярные и заряженные остатки сконцентрированы на N-конце цепи, в то время как остальная ее часть состоит преимущественно из остатков неполярных аминокислот и содержит большое количество пролиновых остатков [Swaisgood, 1992, 1993, 2003]. В первичной последовательности бета-казеина отсутствует цистеин, что исключает возможность образования внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей. Сочетание амфифильного характера и высокой гибкости полипептидной цепи приводит к ассоциации белка в водной среде с образованием наноразмерных коллоидных агрегатов - мицелл [Schmidt, Payens, 1972; Niki et al, 1977; Evans et al, 1979; Swaisgood, 2003]. Именно коллоидные свойства различных казеинов и бета-казеина в частности определяют многие функциональные свойства молока, например, аккумуляция и перенос ионов металлов и белков.

Бета-казеин является удобной моделью для изучения различных аспектов строения коллоидной системы молока и связанных с ней функций. Свойства бета-казеина, как природного поверхностно-активного вещества, активно используются производителями пищевых продуктов. Имеется множество работ фармакологической направленности в области инженерии молочных белков, целью которых является конструирование белков, выполняющих функции целевой сорбции, концентрирования и доставки продуктов, необходимых для лечения ряда серьезных заболеваний.

Строение поверхности коллоидных агрегатов, где гидрофильные участки перемежаются с гидрофобными, их высокая связывающая способность по отношению к гидрофобным соединениям и возможность адаптации геометрии поверхности под связываемый лиганд в последние годы вызвали интерес к шапероноподобной функции бета-казеина [Bhattacharyya, 1999; Morgan et ah, 2005; Barzegar et ah, 2008; Hassanisadi et ah, 2008; Yousefi et ah, 2009]. Коллоидные свойства и шапероноподобная активность бета-казеинов имеют и коммерческий интерес, благодаря их способности стабилизировать белки, микроэмульсии и эмульсии, что определяет текстуру и вкусовые качества пищевых продуктов.

Одним из возможных подходов для получения бета-казеина с новыми физико-химическими и функциональными свойствами является изменение структуры и амфифильных свойств белковой молекулы и, как следствие, свойств образующихся мицеллярных агрегатов. Процесс самоорганизации природного бета-казеина чрезвычайно чувствителен к физико-химическим свойствам среды (полярности и вязкости растворителя, температуре, рН и т.п.), что влияет на размер, структуру и сорбционные свойства его коллоидных агрегатов [Schmidt, 1982; Leclerc, Calmettes, 1997; De Kruif, Grinberg, 2002; Mikheeva et ah, 2003; O'Connell et ah, 2003]. Кроме того, было показано, что точечное введение цистеиновых остатков в полипептидную цепь этого белка приводит к образованию димерных или олигомерных комплексов и значительно изменяет свойства мицеллярных агрегатов (размер, форму, температуру перехода мономер-мицелла, устойчивость к изменению рН и пр.) [Gaudin et ah, 2009, Yousefi et ah, 2009]. При этом вероятно, могут происходить изменения функциональных свойств бета-казеина, в частности его шапероноподобной активности. Вместе с тем, к настоящему времени работ по исследованию взаимосвязи структурных и функциональных особенностей бета-казеина немного и нет ясности в какой степени структура белка определяет эти свойства.

Таким образом, основной целью настоящей работы было выявление вклада структурных особенностей бета-казеина в его ассоциативные, коллоидные и шапероноподобные свойства. В рамках данного исследования использовалось два способа модифицирования свойств белка: введение тиольной группы, то есть дополнительной ковалентной внутри- или межмолекулярной связи, и варьирование полярности растворителя с помощью внесения различных концентраций этанола в раствор белка.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

3. Проанализировать влияние температуры и состава растворителя на структуру и свойства бета-казеина.

Впервые установлено наличие верхней и нижней границ температурного интервала самоассоциации бета-казеина, при этом увеличение концентрации спирта вызывает понижение как верхней, так и нижней температур мицеллообразования.

Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты уточняют границы коллоидного состояния бета-казеина и дополняют имеющиеся данные о механизмах мицеллообразования белка. Понимание механизмов самоассоциации и взаимодействия бета-казеина с целевыми белками на молекулярном уровне, открывает перспективы для создания белковых препаратов медицинского назначения, исследования и лечения ряда заболеваний, известных как «конформационные болезни». Результаты работы могут быть использованы для прогнозирования влияния температуры и состава растворителя на структуру и функции бета-казеина и других нативно неупорядоченных белков, а также для направленного получения белков с новыми физико-химическими свойствами для пищевой промышленности и биотехнологии.

803026) и поддержаны грантом правительства Франции для обучения в совместной аспирантуре, грантами РФФИ, а также грантом Президиума РАН (программа «Молекулярная и клеточная биология»). Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на 12-ой Международной школе-конференции молодых ученых: «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), IV Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Казань, Россия, 2009), 34-ом конгрессе FEBS «Life's Molecular Interaction» (Прага, Чехия, 2009), Российской школе-конференции молодых ученых "Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, Россия, 2010), V Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Петрозаводск, Россия, 2011), 3-м Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, Россия, 2011), I Российском симпозиуме по поверхностно-активным веществам «От коллоидных систем к нанохимии» (Казань, Россия, 2011), 36-ом конгрессе FEBS «Biochemistry for Tomorrow's Medicine» (Турин, Италия, 2011), VII Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, Россия, 2011), Конференции молодых ученых в области науки о жизни (Париж, Франция, 2012); на семинарах лаборатории функциональных взаимодействий белков НИАИ (Нант, Франция, 2008 - 2011).

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность и глубокую признательность за ценные советы, неоценимую помощь и всестороннюю поддержку при выполнении диссертационной работы научным руководителям - доктору химических наук, профессору Юрию Федоровичу Зуеву и профессору Томашу Эртле.

Особую благодарность автор выражает научному сотруднику лаборатории биофизической химии наносистем КИББ КазНЦ РАН, к.б.н. Джигангиру Асхатовичу Файзуллину за помощь в проведении экспериментов, анализе и обсуждении данных КД-спектрометрии и инфракрасной спектроскопии. Автор выражает глубокую благодарность Наталье Евгеньевне Гоголевой (лаборатория молекулярной биологии КИББ КазНЦ РАН) за внимание к работе, обсуждение результатов, ценные советы и моральную поддержку. Автор благодарит к.б.н. Наталью Леруновну Захарченко (лаборатория биофизической химии наносистем КИББ КазНЦ РАН) за помощь в постановке кинетических исследований и проведении анализа данных.

Автор выражает благодарность всем сотрудникам и аспирантам лабораторий биофизической химии наносистем и молекулярной биологии КИББ КазНЦ РАН, лаборатории функциональных взаимодействий белков Национального института агрономических исследований (Нант, Франция) за теплую рабочую атмосферу.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит 49 рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 290 источников, из них 271 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Коннова, Татьяна Анатольевна

ВЫВОДЫ

4. На модельных системах (тепловая денатурация алкогольдегидрогеназы, каталазы, иммуноглобулина О) установлено защитное действие бета-казеина, направленное на торможение процесса агрегации и сохранение частичной ферментативной активности целевого белка. Показано, что шапероноподобная активность рекомбинантных бета-казеинов существенно зависит от места локализации цистеинового остатка и структурного состояния белка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе для исследования структуры и агрегационных свойств рекомбинантных и нативного бета-казеинов в водных и водно-этанольных растворах применен комплекс физико-химических методов (динамическое светорассеяние, флуоресцентная и инфракрасная спектроскопии, спектроскопия кругового дихроизма). Исследована шапероноподобная активность бета-казеинов по отношению к термо-индуцированной агрегации ряда целевых белков.

Показано влияние микрогетерогенности структуры смешанного растворителя на вторичную структуру белка и его коллоидное состояние. В исследуемом интервале концентраций спирта (0 - 50% v/v) бета-казеин претерпевает переход между различными структурными состояниями. Наблюдаемые переходы коррелируют с изменениями в характере межмолекулярных взаимодействий в бинарном растворителе. В области низких концентраций спирта основным фактором, определяющим структуру

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коннова, Татьяна Анатольевна, Казань

1. Бурштейн, Э.А. Собственная люминесценция белка (природа и применение): Итоги науки и техники. Сер. Биофизика / Э.А. Бурштейн -М.: ВИНИТИ, 1977. Т. 7. - 190 с.

2. Бучаченко, A.JI. Химия на рубеже веков: свершения и прогнозы / A.JI. Бучаченко // Успехи химии. 1999. - Т.68, № 2. - С.85-102.

3. Векшин, H.JI. Флуоресцентная спектроскопия биополимеров / H.JI. Векшин Пущино: Фотон-век, 2006. - 168с.

4. Клонирование ДНК: Методы. / Под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1988. -538 с.

5. Зацепина, Г.Н. Свойства и структура воды / Т.Н. Зацепина Москва: Изд-во Московского университета, 1974. - 167 с.

6. Колесниченко, A.B. Белки низкотемпературного стресса растений / A.B. Колесниченко, В.К. Войников Иркутск: Арт-Пресс, 2003. - 196 с.

7. Курганов, Б.И. Оценка активности молекулярных шаперонов в тест-системах, основанных на подавлении агрегации белков / Б.И. Курганов // Успехи биол. химии. 2002. - Т. 42. - С. 89-138.

8. Курганов, Б.И. Кинетика тепловой агрегации белка оболочки вируса табачной мозаики / Б. И. Курганов, Э. Р. Рафикова, Е. Н. Добров // Биохимия. 2002. - Т. 67(5). - С. 525-533.

9. Курочкина, Л.П. Фолдинг белка в клетке / Л.П. Курочкина, В.В. Месянжинов // Успехи биол. химии. 1996. - Т. 36. - С. 49-86.

10. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрис, Дж. Сэмбрук М.: Мир, 1981.-361 с.

11. Маркосян, К. А. Фолдинг, неправильный фолдинг и агрегация. Образование телец включения и агресом / К. А. Маркосян, Б. И. Курганов // Биохимия. 2004. - Т. 69(9). - С. 971-984.

12. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот:

13. Электрофорез и ультрацентрифугирование: практическое пособие / J1.A. Остерман М.: Наука, 1981. 443 с.

14. Панасенко, О.О. Структура и свойства малых белков теплового шока / О.О. Панасенко, М.В. Ким, Н.Б. Гусев // Успехи биол. химии. 2003. -Т.43.-С. 59-98.

15. Патрушев, Л.И. Искусственные генетические системы / Л.И. Патрушев // М.: Наука, 2004. С. 273-302.

16. Привалов, П.Л. Стабильность белков и гидрофобные взаимодействия / П.Л. Привалов // Биофизика. 1987. Т.32. №.5. С.742-758.

17. Сердюк, И. Методы в молекулярной биофизике: структура, функция, динамика: учеб. пособие / И. Сердюк, Н. Заккаи, Дж. Заккаи. М: КДУ, 2009. - 568 с.

18. Смирнов, А.Н. Супранадмолекулярные комплексы воды / А.Н. Смирнов, А.В. Сыроешкин // Российский химический журнал. 2004. -Т. XLVIII. № 2. - С.125-135.

19. Финкельштейн, А.В. Физика белка: Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями / А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын М.: Книжный дом "Университет", 2002. - 376 с.

20. Эйзенберг, Д. Структура и свойства воды / Д. Эйзенберг, В. Кауцман -Ленинград: Гидрометеоиздат, 1975. 280 с.

21. Small heat shock proteins prevent aggregation of citrate synthase and bind to the N-terminal region which is absent in thermostable forms of citrate synthase / E. Ahrman, N. Gustavsson, C. Hultschig et al. // Extremophiles. -2007.-V. 11.-P. 659-666.

22. АН, E.A. Influence of storage of milk on casein distribution between the micellar and soluble phases and its relations hip to cheese making parameters / E.A. АН, T.A. Anthony, C.C. Gordon // J. Dairy Res. - 1980. -V. 47.-P. 393-400.

23. Clustering and microimmiscibility in alcohol-water mixtures: Evidence frommolecular-dynamics simulations / S.K. Allison, J.P. Fox, J.P. Hargreaves, S.P. Bates // Phys. Rev. B. 2005. - V. B71. - P. 024201.

24. The conformation and aggregation of bovine /?-casein A. I Molecular aspects of thermal aggregation / A. L. Andrews, D. Atkinson, M. T. A. Evans et al. // Biopolymers. 1979. - V. 18.-P. 1105-1121.

25. Effects of whey preparation processes and heat treatment on bovine colostrum antibody activity / K. Ando, M. Koujiya, A. Suzuki et al. // Milchwissenschaft. 2005. - V. 60. - P. 67-71.

26. Arima, S. Structure of beta-casein / S. Arima, R. Niki, K. Takase // J. Dairy Res. 1979. - V. 46(2). - P. 281-282.

27. Direct binding of ethanol to bovine serum albumin: a fluorescent and 13C NMR multiplet relaxation study / N.A. Avdulov, S.V. Chochina, V.A. Daragan et al. // Biochemistry. 1996. - V. 35. - P. 340-347.

28. Banipal, T.S. Thermodynamic study of solvation of some amino acids, diglycine and lysozyme in aqueous and mixed aqueous solutions / T.S. Banipal, G. Singh // Thermochim. Acta. 2004. - V. 412. - P. 63-83.

29. Basha, E. Small heat shock proteins and alpha-crystallins: dynamic proteins with flexible functions / E. Basha, H. O'Neill, E. Vierling // Trends Biochem. Sci. 2012. - V. 37. - P. 106-117.

30. Bech, A.M. Milk protein polymorphism in Danish dairy cattle and the influence of genetic variants on milk yield / A.M. Bech, K.R. Kristiansen // J. Dairy Sci. 1990. - V. 57. - P. 53-63.

31. Bell, S. Health implications of milk containing beta-casein with the A2 genetic variant / S. Bell, G. Grochoski, A. Clarke // Crit Rev Food Sci Nutr. -2006.-V. 46.-P. 93-100.

32. Bellissent-Funel, M.C. Hydration Processes in Biology: Theoretical and Experimental Approaches / M.C. Bellissent-Funel // NATO science series: Life sciences. Editor: M.C. Bellissent-Funel. Amsterdam: IOS Press. -1999.-V. 305.-P. 430.

33. Bellotti, V. Biological activity and pathological implications of misfolded proteins / V. Bellotti, P. Mangione, M. Stoppini // Cell. Mol. Life Sei. -1999.-V. 55.-P. 977-991.

34. Small heat shock protein activity is regulated by variable oligomeric substructure / J.L. Benesch, M. Ayoub, C.V. Robinson, J.A. Aquilina // J. Biol. Chem. 2008. - V. 283. - P. 28513-28517.

35. Berry, G.P. The association of bovine b-casein. The importance of the C-terminal region / G.P. Berry, L.K. Creamer // Biochemistry. 1975. - V. 14, № 16. -P. 3542-3545.

36. Bhattacharyya, J. Molecular chaperone-like properties of an unfolded protein, as-casein / J. Bhattacharyya, K.P. Das // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. P. 15505-15509.

37. Conformational changes of lysozyme in water-ethanol mixtures / A. Bonincontro, A. De Francesco, M. Matzeu et al. // Colloids Surf., B. 1997. -V. 10.-P. 105-111.

38. Bradford, M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding / M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

39. Brinkmann, U. High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product / U. Brinkmann, R.E. Mattes, P. Buckel // Gene. 1989. - V. 85. - P. 109-114.

40. Brule, G. The casein micelle and milk coagulation / G. Brule, J. Lenoir, F. Remeuf // Cheese making: From Science to Quality Assurance, 2nd edn. / Editors: A. Eck, J. Gillis // Paris: Lavoisier Publishing, 2000. pp. 7-40.

41. Brunner, J.R. Milk proteins / J.R. Brunner // Food Proteins / Editors: J.R.

42. Whitaker, S.R. Tannenbaum // Connecticut: AVI Publishing Company, Inc., 1977.-pp. 175-208.

43. Bu, H. Comparison of native and recombinant nonphosphorylated human beta-casein: further evidence for a unique beta-casein folding pattern / H. Bu, S.M. Sood, C.W. Slattery // Arch. Biochem. Biophys. 2003. - V. 415. - P. 213-220.

44. Bu, H. The effect of conserved residue charge reversal on the folding of recombinant non-phosphorylated human b-casein / H. Bu, S.M. Sood, C.W. Slattery // Arch. Biochem. Biophys. 2003. - V. 419. № 2. - P. 244-250.

45. Buchheim, W. On the size of monomers and polymers of beta-casein / W. Buchheim, D.G. Schmidt // J. Dairy Res. 1979. - V. 46(2). - P. 277-280.

46. Buchner, J. Supervising the fold: Functional principles of molecular chaperones / J. Büchner // FASEB J. 1996. - V. 10. - P. 10-19.

47. Byler, D.M. Raman Spectroscopic Study of Casein Structure / D.M. Byler, H.M.Jr. Farrell, H. Susi // J. Dairy Sei. 1988. - V. 71. - P. 2622-2629.

48. Small heat-shock proteins and clusterin: intra- and extracellular molecular chaperones with a common mechanism of action and function? / J.A. Carver, A. Rekas, D.C. Thorn, M.R. Wilson // IUBMB Life. 2003. - V. 55. - P. 661-668.

49. Cassiano, M. M. Study of bovine b-casein at water/lipid interface by molecular modeling / M. M. Cassiano, J. A. G. Areas // J. Mol. Struct. 2001. -V. 539(1-3).-P. 279-288.

50. Cassiano, M. M. Dependence of the interfacial behavior of b-casein on phosphoserine residues / M. M. Cassiano, J. A. G. Arêas // J. Dairy Sei. -2003. -V. 86(12). P. 3876-3880.

51. Cayot, P. Effets des technologies sur la structure des proteines du lait. In: Structure et technofonction des proteines du lait / P. Cayot, D. Lorient // Paris: Arilait Recherches. Techniques et documentation-Lavoisier. 1998. - P. 105203.

52. Chebotareva, N.A. Biochemical Effects of Molecular Crowding / N.A. Chebotareva, B.I. Kurganov, N.B. Livanova // Biochemistry (Moscow, Russ. Fed.). -2004. V. 69. № 11.-P. 1239-1251.

53. Chebotareva, N.A. Effect of Molecular Crowding on the Enzymes of Glycogenolysis / N.A. Chebotareva // Biochemistry (Moscow, Russ. Fed.). -2007. V. 72. № 13. - P. 1478-1490.

54. Cheftel, J.C. Propriétés fonctionnelles des protéines / J.C. Cheftel, J.L. Cuq, D. Lorient // Paris: Les protéines alimentaires. Techniques et documentation-Lavoisier. 1985. - P. 70-79.

55. Chen, C.C. Effect of thermal protectants on the stability of bovine milk immunoglobulin G / C.C. Chen, H.M. Chang // J. Agric. Food Chem. -1998. V. 46. - P. 3570-3576.

56. Chen, C.C. Thermal stability of bovine milk immunoglobulin G (IgG) and the effect of added thermal protectants on the stability / C.C. Chen, Y.Y. Tu, H.M. Chang // J. Food Sei. 2000. - V. 65. - P. 188-193.

57. Chen, L. Food protein-based materials as nutraceutical delivery systems / L. Chen, G.E. Remondetto, M. Subirade // Trends Food Sei. Technol. 2006. -V. 17.-P. 272-283.

58. Chobert, J.-M. Specific limited hydrolysis and phosphorylation of food proteins for improvement of functional and nutritional properties / J.-M. Chobert., M.Z. Sitohy, J.R. Whitaker // J. Am. Oil Chem. Soc. 1987. - V. 64.-P. 1704-1711.

59. Choi, B.K. Cation-exchange purification of mutagenized bovine beta-casein expressed in transgenic mouse milk: its putative Asn68-linked glycan is heterogeneous / B.K. Choi, G.T. Bleck, R. Jimenez-Flores // J. Dairy Sci. -2001 A. V. 84. № 1. - p. 44-49.

60. Choi, B.K. Expression and purification of glycosylated bovine beta-casein (L70S/P71S) in Pichia pastoris / B.K. Choi, R. Jiménez-Flores // J. Agrie. Food Chem. 2001B. - V. 49. № 4. - P. 1761-1766.

61. Cinelli, S. Effect of 1-alcohols on micelle formation and protein folding / S. Cinelli, G. Onori, A. Santucci // Colloids Surf., A. 1999. - V. 160. - P. 3-8.

62. Cinelli, S. Effect of aqueous alcohol solutions on the thermal transition of lysozyme: A calorimetric study / S. Cinelli, G. Onori, A. Santucci // J. Phys. Chem. B. 1997. - V. 101.-P. 8029-8034.

63. Clare, D. A. Bioactive milk peptides: a prospectus / D. A. Clare, H. E. Swaisgood // J. Dairy Sci. 2000. - V. 83. - P. 1187-1195.

64. Creamer, L.K. Secondary structure of bovine aSl- and b-casein in solution / L.K. Creamer, T. Richardson, D.A.D. Parry // Arch. Biochem. Biophys. -1981. V. 211. № 2. - P. 689-696.

65. D'Angelo, M. Self-association of monohydric alcohols in water: Compressibility and infrared absorption measurements / M. D'Angelo, G. Onori, A. Santucci // J. Chem. Phys. 1994. - V. 100. - P. 3107-3114.

66. Dalgleish, D.G. Food emulsions—their structures and structure-forming properties / D.G. Dalgleish // Food Hydrocolloids. 2006. - V. 20. - P. 415422.

67. Dephosphorylation-induced structural changes in beta-casein and its amphiphilic fragment in relation to emulsion properties / M. Darewicz, J. Dziuba, P.W.J.R. Caessens, H. Gruppen // Biochimie. 2000. V. 82. - P. 191-195.

68. Davies, D.T. Variation in the protein composition of bovine casein micelles and serum casein in relation to micellar size and milk temperature / D.T.

69. Davies, A.J.R. Law // J. Dairy Res. 1983. - V. 50. - P. 67-75.

70. The supramolecular organisation of ß-casein: effect on interfacial properties / S. Dauphas, N. Mouhous-Riou, B. Metro et al. // Food Hydrocolloids. -2005. V. 19, No. 3. - P. 387-393.

71. De Gennes, P.G. Polymer solutions near an interface. Adsorption and depletion layers / P.G. De Gennes // Macromolecules. 1981. - V. 14. - P. 1637-1644.

72. De Kruif, C.G. Micellisation of b-casein / C.G. De Kruif, V.Y. Grinberg // Colloids Surf., A. 2002. - V. 210. - P. 183-190.

73. De Kruif, C.G. Casein micelle structure, functions and interactions / C.G. De Kruif, C. Holt // Advanced dairy chemistry, 3rd ed. / Editors: P.F. Fox, P.L.H. McSweeney. New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2003. - V. 1. Proteins.-P. 213-276.

74. Demchenko, A.P. Protein folding with molecular chaperones / A.P. Demchenko // Comments Mol. Cel. Biophys. 1999. - V. 9. - P. 219-260.

75. Dickinson, E. Caseins in emulsions: interfacial properties and interactions / E. Dickinson // Int. Dairy J. 1999. - V. 9. - P. 305-312.

76. Dickinson, E. Interfacial, emulsifying and foaming properties of milk properties / E. Dickinson // Advanced Dairy Chemistry. New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2003. - V. 1. - P. 1229-1260.

77. Effect of pH on antigen-binding activity of IgG from bovine colostrum upon heating / E. Dominguez, M.D. Perez, P. Puyol et al. // J. Dairy Res. 2001. -V. 68.-P. 511-518.

78. Dong, C. Characterization of a Non-electrophoretic Genetic Variant of ß-Casein by Peptide Mapping and Mass Spectrometric Analysis / C. Dong, K.F. Ng-Kwai-Hang // Int. Dairy J. 1998. - V. 8. - P. 967-972

79. Solvent molecules bridge the mechanical unfolding transition state of a protein / L. Dougan, G. Feng, H. Lu, J.M. Fernandez // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2008.-V. 105.-P. 3185-3190.

80. Intrinsic disorder and protein function / A.K. Dunker, C.J. Brown, J.D. Lawson, L.M.Z. Iakoucheva // Biochemistry. 2002. - V. 41. - P. 6573-6582.

81. Dziuba, J. Physico-chemical characteristics of different genetic variants of bovine (3-casein modified covalently by glucose, galactose and lactose / J. Dziuba, M. Darewicz, H. Mioduszewska // Pol. J. Food Nutr. Sci. 1998. -V. 7. №48.-P. 166-171.

82. Ethanol-perturbed amyloidogenic self-assembly of insulin: looking for origins of amyloid strains / W. Dzwolak, S. Grudzielanek, V. Smirnovas et al. // Biochemistry. 2005. - V. 44. - P. 8948-8958.

83. Mimicking phosphorylation of alphaB-crystallin affects its chaperone activity / H. Ecroyd, S. Meehan, J. Horwitz et al. // Biochem. J. 2007. - V. 401.-P. 129-141.

84. Ecroyd, H. Crystallin proteins and amyloid fibrils / H. Ecroyd, J. A. Carver // Cell. Mol. Life Sci. 2009. - V. 66. - P. 62-81.

85. Egashira, K. Low-frequency Raman spectroscopy of ethanol-water binary solution: evidence for self-association of solute and solvent molecules / K. Egashira, N. Nishi // J. Phys. Chem. B. 1998. - V. 102. - P.4054-4057.

86. Ehrnsperger, M. Small Heat-Shock Proteins / M. Ehrnsperger, J. Buchner // Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine. 2002. - V. 5. - P. 2931-2934.

87. Ehrnsperger, M. Structure and function of small heat shock proteins / M. Ehrnsperger, J. Buchner, M. Gaestel // New York: Molecular Chaperones in the Life Cycle of Proteins, 1998. P. 533-575.

88. Nomenclature of Proteins of Cow's Milk: Fifth Revision / W.N. Eigel, J.E. Butler, C.A. Ernstroem et al. //J. Dairy Sci. 1984. -V. 67. - P. 1599-1631.

89. Ellis, R.J. Discovery of molecular chaperones / R.J. Ellis // Cell Stress

90. Chaperones.- 1996.-V. 1(3).-P. 155-160.

91. Cross-linking of adsorbed casein films with transglutaminase / M. . Faergemand, B. S. Murray, E. Dickinson, K. B. Qvist // Int. Dairy J. 1999.1. V. 9(3-6).-P. 343-346.

92. Nomenclature of the proteins of cows' milk-sixth revision / Jr.H.M. Farrell, R. Jimeniz-Flores, G.T. Bleck et al. // J. Dairy Sci. 2004. - V. 87. - P. 1641-1674.

93. Fasman, C. D. Circular Dichroism and the Conformational Analisys of Biomolecules / Editor: C. D. Fasman // New York: Plenum Press, 1996. pp. 738.

94. Feder, M.E. Heat-shock proteins, molecular chaperones and the stressresponse: Evolutionary and ecological physiology / M.E. Feder, G. Hofmann // Annu. Rev. Physiol. 1999. - V. 61. - P. 243-82.

95. Mass spectrometry-based procedure for the identification of ovine casein heterogeneity / P. Ferranti, R. Pizzano, G. Garro et al. // J. Dairy Res. -2001.-V. 68.-P. 35-51.

96. FitzGerald, R.J. Exploitation of casein variants / R.J. FitzGerald // Milk composition, Production and Biotechnology / Editors: R.A.S Welch, D.J.W. Burns, S.R. Davis, A.I. Popay, C.G. Prosser. New York: CAB International, 1997.-V.10.-P. 153-172.

97. Milk proteins, general and historical behavior // Advanced dairy chemistry. 3rd ed. / Editors: P.F. Fox, P.L.H. McSweeney. New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2003. - V. 1 Proteins. - p. 1- 48.

98. Dairy Chemistry and Biochemistry. First edition / Editors: P.F. Fox, P.L.H. McSweeney. New York: Thomson Science, 1998. - P. 396.

99. Fraunfelder, H. The Energy Lanscapes and Motions of Proteins / H. Fraunfelder, S.G. Sligar, P.G. Wolynes // Science. 1991. - V. 254. - P. 1598-1603.

100. Interactions between small heat shock protein subunits and substrate in small heat shock protein-substrate complexes / K.L. Friedrich, K.C. Giese, N.R. Buan, E. Vierling // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - P. 1080-1089.

101. Freeman, B.C. The human cytosolic molecular chaperones hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of normative protein and protein refolding / B.C. Freeman, R.I. Morimoto // EMBO J. 1996. - V.15. № 12. - P. 2969-2979.

102. Frydman, J. Chaperones get in touch: the Hip-Hop connection / J. Frydman, J. Hohfeld // Trends Biochem. Sci. 1997. - V. 22(3). - P. 87-92.

103. Modifications of the charges at the N-terminus of bovine beta-casein: Consequences on its structure and its micellisation / S. Gangnard, Y. Zuev, J.-C. Gaudin et al. // Food Hydrocolloids. 2007. -V. 21. - P. 180-190.

104. Gamier, J. Conformation of beta-casein in solution. Analysis of a thermal transition between 5 and 40 degrees C / J. Gamier // J. Mol. Biol. 1966. - V. 19(2).-P. 586-590.

105. Gamier, J. Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins / J. Gamier, D.J. Osguthorpe, B. Robson // J. Mol. Biol. 1978. - V. 120. - P. 97-120.

106. Engineering of caseins and modulation of their structures and interactions / J.-C. Gaudin, A. Le Pare, B. Castrec et al. // Biotechnol. Adv. 2009. - V. 27. №6.-P. 1124-1131.

107. Giese, K.C. Changes in oligomerization are essential for the chaperone activity of a small heat shock protein in vivo and in vitro / K.C. Giese, E. Vierling // J. Biol. Chem. 2002. - V. 227. - P. 46310^6318.

108. Giese, K.C. Mutants in a small heat shock protein that affect the oligomeric state. Analysis and allele-specific suppression / K.C. Giese, E. Vierling // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - P. 32674-32683.

109. Determination of the phosphorylation level and deamidation susceptibility of equine P-casein / J-M. Girardet, L. Miclo, S. Florent et al. // Proteomics. -2006.-V. 6.-P. 3707-3717.

110. Gobetti, M. Angiotensin I-converting-enzyme-inhibitory and antimicrobial bioactive peptides / M. Gobetti, F. Minervini, C. G. Rizzello // Int. J. Dairy Technol. 2004. - V. 57. - P. 173-188.

111. Graham, E.R.B. On the isolation and conformation of bovine P-casein Al / E.R.B. Graham, G.M. Malcolm, H.A. McKenzie // Int. J. Biol. Macromol. -1984.-V. 6.-P. 155-161.

112. Greenberg, R. Human P-casein: amino acid sequence and identification of phosphorylation sites / R. Greenberg, M. L. Groves, H. J. Dower // J. Biol. Chem. 1984.-V. 259.-P. 5132-5138.

113. Chaperone-like activity of tubulin / S. Guha, T.K. Manna, K.P. Das, B. Bhattacharyya // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 30077-30080.

114. Molecular structure of alcohol-water mixtures / J.H. Guo, Y. Luo, A. Augustsson et al. // Phys. Rev. Lett. 2003. - V. 91. - P. 157401.

115. Han, S.K. Biochemical, molecular and physiological characterization of a new beta-casein variant detected in Korean cattle / S.K. Han, Y.C. Shin, H.D. Byun // Anim. Genet. 2000. - V. 31. - P. 49-51.

116. Hartl, F. U. Molecular chaperones in cellular protein folding / F. U. Hartl // Nature (London). 1996. -V. 381. - P. 571-580.

117. Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins / M. Haslbeck, T. Franzmann, D. Weinfurtner, J. Buchner // Nat. Struct. Mol. Biol. -2005. V. 12.-P. 842-846.

118. Chemometric study of the aggregation of alcohol dehydrogenase and its suppression by beta-caseins: a mechanistic perspective / M. Hassanisadi, A. Barzegar, R. Yousefi et al. // Anal. Chim. Acta. 2008. - V. 613. - P. 40-47.

119. Hegyi, H. Intrinsically disordered proteins display no preference for chaperone binding in vivo / H. Hegyi, P. Tompa // PLoS Comput. Biol. -2008.-V. 4. el000017.

120. Hendrick, J.P. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins / J.P. Hendrick, F.U. Hartl // Annu. Rev. Biochem. 1993. - V. 62. - P. 349-384.

121. Herskovits, T.T. On the conformation of caseins. Optical rotatory properties / T.T. Herskovits // Biochemistry. 1966. - V. 5(3). - P. 1018-1026.

122. Extent of N-terminal methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain length of the penultimate amino acid / P. H. Hirel, M. J. Schmitter, P. Dessen et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86.-P. 8247-8251.

123. Structure and stability of bovine casein micelles / C. Holt, C.B. Anfinsen, J.T. Edsall et al. San Diego: Academic Press. Adv. Prot. Chem., 1992. - V. 43.-P. 63-151.

124. Holt, C. Caseins as rheomorphic proteins: Interpretation of primary and secondary structures of the asl-, beta- and kappa-caseins / C. Holt, L. Sawyer

125. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1993. - V. 89. - P. 2683-2692.

126. Holt, C. Primary and predicted secondary structures of the caseins in relation to their biological functions / C. Holt, L. Sawyer // Protein Eng. 1988. - V. 2(4).-P. 251-259.

127. Home, D. S. Casein structure, self-assembly and gelation / D. S. Home // Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 2002. - V. 7. - P. 456-461.

128. Home, D. S. Steric effects in the coagulation of casein micelles by ethanol / D. S. Home // Biopolymers. 1984. - V. 23. - P. 989-993.

129. Home, D.S. Casein interactions: casting light on black boxes, the structure of dairy products / D. S. Home // Int. Dairy J. 1998. - V. 8. - P. 171-177.

130. Home, D.S. Ethanol stability / D.S. Home // Advanced dairy chemistry. 2nd ed. Editor: P.F. Fox. London: Elsevier Applied Science, 1992. - V. Proteins l.-P. 657-681.

131. Hwang, D.S. Aggregated dnaA protein is dissociated and activated for DNA replication by phospholipase and dnaK protein / D.S. Hwang, E. Crooke, A. Komberg // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - P. 19244-19248

132. Clusterin has chaperone-like activity similar to that of small heat shock proteins / D.T. Humphreys, J.A. Carver, S.B. Easterbrook-Smith, M. R. Wilson // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - P. 6875-6881.

133. Huppertz, T. Biocompatible micro-gel particles from cross-linked casein micelles / T. Huppertz, M.A. Smiddy, C.G. De Kruif // Biomacromolecules. -2007.-V. 8.-P. 1300-1305.

134. Jakob, U. Assisting spontaneity: the role of Hsp90 and small Hsps as molecular chaperones / U. Jakob, J. Buchner // Trends Biochem. Sci. 1994. -V. 19(5).-P. 205-211.

135. Janes, RW. Bioinformatics analyses of circular dichroism protein reference databases / RW. Janes // Bioinformatics. 2005. - V. 21, № 23. - P. 42304238.

136. Jenness, R. Comparative aspects of milk proteins / R. Jenness // J. Dairy Res.- 1979. V. 46.-P. 197-210.

137. Jeschke, M. Multi-resolution Spatial Simulation For Molecular Crowding / M. Jeschke, A.M. Uhrmacher // Proceedings of the Winter Simulation Conference / Editors: S.J. Mason, R.R. Hill, L. Moench, O. Rose. 2008. - P. 1384-1392.

138. Johnson, W.C.Jr. Protein secondary structure and circular dichroism: A practical guide / W.C.Jr. Johnson // Proteins: Struct., Funct., Genet. 1990. -V. 7.-P. 205-214.

139. Johnson, J. L. Protein folding in vivo: unraveling complex pathways / J. L. Johnson, E. A. Craig // Cell (Cambridge). 1997. - V. 90. - P. 201-204.

140. Micellar structure of beta-casein observed by small-angle X-ray scattering / K. Kajiwara, R. Niki, H. Urakawa et al. // Biochim. Biophys. Acta. 1988. -V. 955.-P. 128-134.

141. Kane, J.F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli / J.F. Kane // Curr. Opin. Biotechnol.- 1995. V. 6. № 5. p. 494-500.

142. Novel role for mitochondria: protein kinase Ctheta-dependent oxidative signaling organelles in activation-induced T-cell death / M. Kaminski, M. Kiessling, D. Suss et al. // Mol. Cell. Biol. 2007. - V. 27. - P. 3625-3639.

143. Kane, J.F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli / J.F. Kane //Curr. Opin. Biotechnol.- 1995.-V. 6.-P. 494-500.

144. Kegeles, G. Shell-model for size distribution in micelles / G. Kegeles // J. Phys. Chem. 1979. - V. 83 (13). - P. 1728-1732.

145. Kegeles, G. The critical micelle condition revisited / G. Kegeles // Indian J.

146. Biochem. Biophys. 1991. - V. 29. - P. 97-102.

147. Kelly, S. M. The application of circular dichroism to studies of protein folding and unfolding / S. M. Kelly, N. C. Price // Biochim. Biophys. Acta. -1997.-V. 1338.-P. 161-185.

148. Kelly, S. M. The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function / S. M. Kelly, N. C. Price // Curr. Protein Pept. Sci. -2000.-V. l.-P. 349-384.

149. Kim, S. H. Surface active properties of protein: effects of progressive succinylation on film properties and foam stability of glycinin / S. H. Kim, J. E. Kinsella // J. Food Sci. 1987. - V. 52. - P. 1341-1345.

150. Kim, D. A. Effect of thermal treatment on interfacial properties of lactoglobulin / D. A. Kim, M. Cornec, G. Narsimham // J. Colloid Interface Sci. 2005. - V. 285. - P. 100-109.

151. Kinsella, J.E. Proteins in whey: chemical, physical, and functional properties / J.E. Kinsella, D.M. Whitehead // Adv. Food Nutr. Res. 1989. - V. 33. - P. 343^38.

152. Kumosinski, T.F. Three-dimensional molecular modeling of bovine caseins: an energy-minimized beta-casein structure / T.F. Kumosinski, E.M. Brown, H.M.Jr. Farell // J. Dairy Sci. 1993. - V. 76. - P. 931-945.

153. Kurganov, B.I. Kinetics of Protein Aggregation. Quantitative Estimation of the Chaperone-Like Activity in Test-Systems Based on Suppression of Protein Aggregation / B.I. Kurganov // Biochemistry (Moscow, Russ. Fed.). -2002. V. 67. - P. 409-422.

154. Kurland, C. Errors of heterologous protein expression / C. Kurland, J. Gallant // Curr. Opin. Biotechnol. 1996. - V. 7. - P. 489-493.

155. Kyte, J. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein / J. Kyte, R.F. Doolittle // J. Mol. Biol. 1982. - V. 157. - P. 105132.

156. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd edition ed. / J.

157. R. Lakowicz // New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 1999.

158. Larkin, J. A. Thermodynamic properties of aqueous non-electrolyte mixtures I. Excess enthalpy for water + ethanol at 298.15 to 383.15 K / J.A. Larkin // J. Chem. Thermodyn. 1975. -V. 7. - P. 137-148.

159. Laugesen, M. Ischaemic heart disease, Type 1 diabetes and cow milk A1 B-casein / M. Laugesen, R. Elliot // N. Z. Med. J. 2003. - V. 116. - P. 1-19

160. Leclerc, E. Structure of b-casein micelles / E. Leclerc, P. Calmettes // Physica B (Amsterdam, Neth.). 1997. - V. 241-243. - P. 1141-1143.

161. Li, S.Q. Effects of pulsed electric fields and heat treatment on stability and secondary structure of bovine immunoglobulin G / S.Q. Li, J.A. Bomser, H.Q. Zhang // J. Agric. Food Chem. 2005. - V. 53. - P. 663-670.

162. Stability of bovine immunoglobulins to thermal treatment and processing / E. Li-Chan, A. Kummer, J.N. Losso et al. // Food Res. Int. 1995. - V. 28. -P. 9-16.

163. Li-Chan, E. Enzymic dephosphorylation of bovine casein to improve acid clotting properties and digestibility for infant formula / E. Li-Chan, S. Nakai // J. Dairy Res. 1989. - V. 56(3). - P. 381-390.

164. The effect of heat treatment on bovine immunoglobulins / P. Lindstrom, M. Paulsson, T. Nylander et al. // Milchwissenschaft. 1994. - V. 49. - P. 6771.

165. Livney, Y. D. A study of beta-casein tertiary structure by intramolecular crosslinking and mass spectrometry / Y. D. Livney, A. L. Schwan, D. G. Dalgleish // J. Dairy Sci. 2004. - V. 87(11). - P. 3638-3647.

166. Effect of alcohols on aqueous lysozyme-lysozyme interactions from staticlight-scattering measurements / W. Liu, D. Bratko, J.M. Prausnitz, H.W. Blanch // Biophys. Chem. 2004. - V. 107. - P. 289-298.

167. Lopez-Fandino, R. Functional improvement of milk whey proteins induced by high hydrostatic pressure / R. Lopez-Fandino // Crit. Rev. Food Sci. Nutr.- 2006.-V. 46(4).-P. 351-363.

168. Lubas, B. Proton nuclear magnetic resonance study of the association of monovalent and divalent alcohols with bovine serum albumin / B. Lubas, M. Soltysik-Rasek, I. Lesniewska // Biochemistry. 1979. - V. 18. - P. 49434951.

169. Kinetic and thermodynamic parameters for heat denaturation of bovine milk IgG, IgA and IgM / G. Mainer, L. Sanchez, J.M. Ena, M. Calvo // J. Food Sci.- 1997. V. 62. - P. 1034-1038.

170. Maubois, J.L. Separation, extraction and fractionation of milk protein components / J.L. Maubois // Lait. 1984. -V. 64. - P. 485.

171. McGowen, J. C. Relationship between the solubility of amino acids / J. C. McGowen, A. Mellors // J. Appl. Biochem. 1979. - V. 1. - P. 423-428.

172. McHaourab, H.S. Structure and mechanism of protein stability sensors: chaperone activity of small heat shock proteins / H.S. McHaourab, J.A. Godar, P.L. Stewart // Biochemistry. 2009. - V. 48. - P. 3828-3837.

173. McMahon, D.J. Rethinking casein micelle structure using electron microscopy / D.J. McMahon, W.R. McManus // J. Dairy Sci. 1998. - V. 81. -P. 2985-2993.

174. Meisel, H. Biofunctional peptides from milk proteins. Mineral binding and cytomodulatory effects / H. Meisel, R. J. FitzGerald // Curr. Pharm. Des. -2003.-V. 9.-P. 1289-1295.

175. Meisel, H. Biochemical properties of peptides encrypted in bovine milk protein / H. Meisel // Curr. Med. Chem. 2005. - V. 12. - P. 1905-1919.

176. Mercier, J.C. Primary structure of bovine caseins. A review / J.C. Mercier, F. Grosclaude, B. Ribadeau-Dumas // Milchwissenschaft. 1972. - V. 27.1. P. 402^12.

177. Messens, W. The use of high pressure to modify the functionality of food proteins / W. Messens, J. Van Camp, A. Huyghebaert // Trends Food Sei. Technol. 1997. - V. 8. - P. 107-112.

178. The primary structure of a low-Mr multiphosphorylated variant of ß-casein in equine milk / L. Miclo, J.-M. Girardet, A. S. Egito et al. // Proteomics. -2007.-V. 7.-P. 1327-1335.

179. Thermodynamics of Micellization of Bovine beta-Casein Studied by High-Sensitivity Differential Scanning Calorimetry / L.M. Mikheeva, N.V. Grinberg, V.Ya. Grinberg et al. // Langmuir. 2003. - V. 19. - P. 2913-2921.

180. Miyoshi, D. Molecular crowding effects on structure and stability of DNA /

181. D. Miyoshi, N. Sugimoto // Biochimie. 2008. - V. 90. - P. 1040-1051.

182. Small heat shock proteins, ClpB and the DnaK system form a functional triade in reversing protein aggregation / A. Mogk, E. Deuerling, S. Vorderwulbecke et al. // Mol. Microbiol. 2003A. - V. 50. - P. 585-595.

183. Refolding of substrates bound to small Hsps relies on a disaggregation reaction mediated most efficiently by ClpB/DnaK / A. Mogk, C. Schlieker, K.L. Friedrich et al. // J. Biol. Chem. 2003E. - V. 278. - P. 31033-31042.

184. Casein proteins as molecular chaperones / P.E. Morgan, T.M. Treweek, R.A. Lindner et al. // J. Agric. Food Chem. 2005. - V. 53. - P. 2670-2683.

185. Murphy, J. M. Fractionation of sodium caseinate by ultrafiltration / J. M. Murphy, P. F. Fox // Food Chem. 1991. - V. 39. - P. 27-38.

186. Nakai, S. Chemical and enzymatic modification of milk proteins / S. Nakai,

187. E. Li-Chan // Developments in Dairy Chemistry / Editor: P. F. Fox. // London, Elsevier, 1982. V. 4, Functional Milk Proteins.

188. Nakai, S. Structure modification and functionality of whey proteins: quantitative structure-activity relationship approach / S. Nakai, E. Li-Chan // J. Dairy Sei. 1985. - V. 68. - P. 2763-2772.

189. Netzer, W.J. Protein folding in the cytosol: Chaperonin-dependent andindependent mechanisms / W.J. Netzer, F.U. Hartl // Trends Biochem. Sci. -1998.-V. 23.-P. 68-73.

190. Ng-Kwai-Hang, K.G. Genetic polymorphism of milk proteins / K.G Ng-Kwai-Hang, F. Grosclaude // Advanced Dairy Chemistry. / Editor: P.F. Fox. -London: Elsevier Science Publishers, 1992. P. 405-455.

191. Niki, V. R. On the shape and size of temperature-dependent /?-casein aggregates / Niki, V. R., K. Takase, S. Arima // Milchwissenschaft 1977. -V. 32. - P. 577-582. (In German).

192. Hydrogen Bonding Cluster Formation and Hydrophobic Solute Association in Aqueous Solution of Ethanol / N. Nishi, S. Takahashi, M. Matsumoto et al. // J. Phys. Chem. 1995. - V. 99. - P.462-468.

193. Noelken, M. Conformation of beta-casein B / M. Noelken, M. Reibstein // Arch. Biochem. Biophys. 1968. - V. 123. - P. 397.

194. O'Connell, J.E. Association behavior of b-casein / J.E. O'Connell, V.Y. Grinberg, C.G. De Kruif // J. Colloid Interface Sci. 2003. - V. 258. - P. 3339.

195. Onori, G. Adiabatic compressibility and structure of aqueous solutions of ethyl alcohol / G. Onori // J. Chem. Phys. 1988. - V. 89. - P. 4325^332.

196. Onori, G. Dynamical and structural properties of water/alcohol mixtures / G. Onori, A. Santucci // J. Mol. Liq. 1996. - V. 69. - P. 161-181.

197. Preferential solvation of lysozyme in water/ethanol mixtures / M.G. Ortore, P. Mariani, F. Carsughi et al. // J. Chem. Phys. 2011. - V. 135. - P. 245103.

198. Looking for the best experimental conditions to detail the protein solvation shell in a binary aqueous solvent via small angle scattering / M.G. Ortore, R. Sinibaldi, F. Spinozzi et al. // J. Phys.: Conf. Ser. 2009. - V. 177. - P.012007.

199. Solvation in protein (un)folding of melittin tetramer-monomer transition /

200. C.M. Othon, O. Kwon, M.M. Lin, A.H. Zewail // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.-2009.-V. 106.-P. 12593-12598.

201. Park, S.H. The role of PII conformations in the calculation of peptide fractional helix content / S.H. Park, W. Shalongo, E. Stellwagen // Protein Sci. 1997. - V. 6. - P. 1694-1700.

202. Parodi, R.M. Thermodynamics of unfolding of lysozyme in aqueous alcohol solutions / R.M. Parodi, E. Bianchi, A. Ciferri // J. Biol. Chem. 1973. - V. 248.-P. 4047-4051.

203. Paulsson, M. Thermal Denaturation of Whey Proteins in Mixtures with Caseins Studied by DSC / M. Paulsson, P. Dejmek // J. Dairy Sci. 1990. - V. 73.-P. 590-600.

204. Payens, T. A. J. Casein micelles and micelles of |3- and K-casein / T. A. J. Payens, H. Vreeman // Solution Behaviour of Surfactants / Editors: K. L. Mittal, E. J. Fendler // New York: Plenum Publishing, 1982. V. 1. - P. 543571.

205. Payens, T. A J. Self-association in non-ideal systems. Combined light scattering and sedimentation measurements in (3-casein solutions / T. A J. Payens, J. A Brinkhuis, B. W. Van Markwijk // Biochim. Biophys. Acta. -1969.-V. 175.-P. 434.

206. Phillips, L.G. Structure-function properties of food proteins / L.G. Phillips,

207. D.M. Whitehead, J. Kinsella // Academic Press San Diego, 1994. P. 34-51.

208. Self-assembly of bovine beta-casein below the isoelectric pH /1. Portnaya, E. Ben-Shoshan, U. Cogan et al. // J. Agric. Food Chem. 2008. - V. 56. - P.2192-2198.

209. Pozani, S. Functionality of lupin seed protein isolate in relation to its interfacial behavior / S. Pozani, G. Doxastakis, V. Kiosseoglou // Food Hydrocolloids. 2002. - V. 16. - P. 241-247.

210. Provencher, S.W. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism / S.W. Provencher, J. Glockner // Biochemistry. 1981. -V. 20.-P. 33-37.

211. Qi, P.X. Thermal and Alkaline Denaturation of Bovine (3-Casein / P.X. Qi, E.D. Wickham, H.M.Jr. Farrell // Protein J. 2004. - V. 23. № 6. - P. 389402.

212. Implication of C-Terminal Deletion on the Structure and Stability of Bovine b-casein / P.X. Qi, E.D. Wickham, E.G. Piotrowski et al. // Protein J. 2005. - V. 24. № 7-8. - P. 431-444.

213. Interface characterization and aging of bovine serum albumin stabilized oil-in-water emulsions as revealed by frontsurface fluorescence / V. Rampon, L. Lethuaut, N. Mouhous-Riou, C. Genot // J. Agric. Food Chem. 2001. - V. 49.-P. 4046-4051.

214. Raschke, T.M. Water structure and interactions with protein surfaces / T.M. Raschke // Curr. Opin. Struct. Biol. 2006. - V. 16. - P. 152-159.

215. Ratajczak, E. Distinct activities of Escherichia coli small heat shock proteins IbpA and IbpB promote efficient protein disaggregation / E. Ratajczak, S. Zietkiewicz, K. Liberek // J. Mol. Biol. 2009. - V. 386. - P. 178-189.

216. Primary structure of bovine beta casein. Complete sequence / B. Ribadeau-Dumas, G. Brignon, F. Grosclaude, J.C. Mercier // Eur. J. Biochem. 1972. -V. 25.-P. 505-514.

217. Molecular modeling and genetic engineering of milk proteins / T. Richardson, S. Oh, R. Jimenez-Flores et al. // Advanced dairy chemistry / Editor: P. F. Fox // London, New York: Elsevier Applied Science, 1992. V. 1, Proteins.-P. 545-577.

218. Rollema, H.S. Casein association and micelle formation / H.S. Rollema // Advanced Dairy Chemistry: Proteins. / Editor: P.F. Fox. London: Elsevier Science Publishers, 1992.-P. 111-141.

219. A Molecular Dynamics Study of Aggregation Phenomena in Aqueous n-Propanol / A.B. Roney, B. Space, E.W. Castner et al. // J. Phys. Chem. B. -2004.-V. 108.-P. 7389-7401.

220. Rosenthal, I. Thermal denaturation of immunoglobulins in bovine milk as a heat treatment indicator / I. Rosenthal, S. Bernstein, U. Merin // Milchwissenschaft. 1999. - V. 54. - P. 367-368.

221. Sasahara, K. Effect of ethanol on folding of hen egg-white lysozyme under acidic condition / K. Sasahara, K. Nitta // Proteins. 2006. - V. 63. - P. 127135.

222. Conformational changes in the unfolding process of lysozyme in water and ethanol/water solutions / P. Sassi, G. Onori, A. Giugliarelli et al. // J. Mol. Liq. -2011. V. 159.-P. 112-116.

223. Milk protein structure what can it tell the dairy industry?: A Review / L. Sawyer, P.N. Barlow, M.J. Boland et al. // Int. Dairy J. - 2002. - V. 12. - P. 299-310.

224. Sawyer, L. The secondary structure of milk proteins and their biological function / L. Sawyer, C. Holt // J. Dairy Sei. 1993. - V. 76. - P. 3062 -3078.

225. Schellman, J.A. Destabilization and stabilization of proteins / J.A. Schellman // Q. Rev. Biophys. 2005. - V. 38. - P. 351-361.

226. Schmidt, D.G. Association of caseins and casein micelle structure / D.G. Schmidt // Developments in Dairy Chemistry. London, 1982. V. 1. - P. 61

227. Schmidt, D.G. The evaluation of positive and negative contributions to the second virial coefficient of some milk proteins / D.G. Schmidt, T.A.J. Payens // J. Colloid Interface Sei. 1972. - V. 39. - P. 655-662.

228. Mitochondrial and cytosolic ATP/ADP ratios in rat liver in vivo / W.-D. Schwenke, S. Soboll, H. J. Seitz, H. Sies // Biochem. J. 1981. - V. 200. - P. 405-408.

229. Skowyra, D. The E. coli dnaK gene product, the hsp70 homolog, can reactivate heat-inactivated RNA polymerase in an ATP hydrolysis-dependent manner / D. Skowyra, C. Georgopoulos, M. Zylicz // Cell. 1990. - V. 62(5). -P. 939-944.

230. Shewry, P.R. Disulphide bonds in wheat gluten proteins / P.R. Shewry, A.S. Tatham // J. Cereal Sei. 1997. V. 25. -P. 207-227.

231. Overproduction of bovine b-casein in Escherichia coli and engineering of its main chymosin cleavage site / G. Simons, W. Vandenheuvel, T. Reynen, et al. // Protein Eng. 1993. - V. 6(7). - P. 763-770.

232. Preferential hydration of lysozyme in water/glycerol mixtures: a small-angle neutron scattering study / R. Sinibaldi, M.G. Ortore, F. Spinozzi et al. // J. Chem. Phys. -2007. V. 126.-P. 235101.

233. Sitohy, M. Susceptibility to trypsinolysis of esterified milk proteins / M. Sitohy, J.-M. Chobert, T. Haertle // Int. J. Biol. Macromol. 2001. - V. 28(4).-P. 263-271.

234. Slattery, C.W. Hydrophobic interactions in human casein micelle formation: Beta-casein aggregation / C.W. Slattery, S.M. Sood, P. Chang // J. Dairy Res. -1989.-V. 56.-P. 427-433.

235. Excess entropy in alcohol-water solutions: a simple clustering explanation / A.K. Soper, L. Dougan, J. Crain, J.L. Finney // J. Phys. Chem. 2006. - V. 110.-P. 3472-3476.

236. Temperature-induced extended helix/random coil transitions in a group 1 late embryogenesis-abundant protein from soybean / J. L. Soulages, K. Kim, C. Walters, J. C. Cushman // J. Plant Physiol. 2002. - V. 128. - P. 822-832.

237. Microcalorimetric study of thermal unfolding of lysozyme in water/glycerol mixtures: an analysis by solvent exchange model F./ Spinozzi, M.G. Ortore, R. Sinibaldi et al. // J. Chem. Phys. 2008. - V. 129. - P. 035101.

238. Sreerama, N. Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON, and CDSSTR methods with an expanded reference set / N. Sreerama, R. W. Woody // Anal. Biochem. 2000. - V. 287. - P. 252-260.

239. Sreerama, N. A self-consistent method for the analysis of protein secondary structure from circular dichroism / N. Sreerama, R.W. Woody // Anal. Biochem. 1993. - V. 209. - P. 32^14.

240. Stevenson, E. M. Heat-induced aggregation of whey proteins enhanced by addition of thiolated b-casein / E. M. Stevenson, A. J. R. Law, J. Leaver // J. Agric. Food Chem. 1996. - V. 44(9). - P. 2825-2828.

241. Sundd, M. Alcohol-induced conformational transitions in ervatamin C. An alpha-helix to beta-sheet switchover / M. Sundd, S. Kundu, M.V. Jagannadham // J. Protein Chem. 2000. - V. 19. - P. 169-176.

242. Suresh, S. J. Theory of dielectric constant of aqueous solutions / S. J. Suresh, V.M. Naik // J. Chem. Phys. 2002. - V. 116. - P. 4212-4220.

243. Swaisgood H.E. Chemistry of caseins / H.E. Swaisgood // Advanced Dairy

244. Chemistry. 1992. - V. 1 Proteins. - P. 63-110.

245. Swaisgood, H.E. Review and update of casein chemistry / H.E. Swaisgood // J. Dairy Sci. 1993. - V. 76. - P. 3054-3061.

246. Swaisgood, H.E. Chemistry of caseins / H.E. Swaisgood // Advanced Dairy Chemistry 3rd ed. / Editors: P.F. Fox, P.L.H. McSweeney NY: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2003. - V. 1. Proteins - pp. 139-202.

247. A Raman optical activity study of rheomorphism in caseins, synucleins and tau. New insight into the structure and behaviour of natively unfolded proteins / C. D. Syme, E. W. Blanch, C. Holt et al. // Eur. J. Biochem. 2002. - V. 269.-P. 148-156.

248. Tai, M. A micelle model for the sedimentation behavior of bovine beta-casein / M. Tai, G. Kegeles // Biophys. Chem. 1984. - V. 20(1-2). - P. 8187.

249. A casein variant in cow's milk is atherogenic / K.A. Tailford, C.L. Berry, A.C. Thomas, J.H. Campbell // Atherosclerosis. 2003. - V. 170. - P. 13-19.

250. Handbook of milk composition. International Series. / Editor: S.L. Taylor. -Academic Press, 1995. p. 944.

251. Milk proteins: from expression to food // Food Science and Technology, International Series. / Editors: A. Thompson, M. Boland, H. Singh. Elsevier Inc., 2009.-p. 561.

252. Thurn, A. Structure of casein micelles I. Small angle neutron scattering and light scattering from /?- and ^-casein / A. Thurn, W. Burchard, R. Niki // Colloid Polym. Sci. 1987. - V. - 265. - P. 653-666.

253. Timasheff, S. N. Protein-solvent preferential interactions, protein hydration, and the modulation of biochemical reactions by solvent components / S. N. Timasheff// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002. - V. 99. - P. 9721-9726.

254. Timasheff, S.N. Part B. In Vivo Pathways of Degradation and Strategies for Stabilization / Timasheff, S.N. // Stability of Protein Pharmaceutical. / Editors: T.J. Ahern, M.C. Manning. New York: Plenum, 1992. - p. 265.

255. Tompa, P. Intrinsically unstructured proteins / P. Tompa // Trends Biochem. Sci. 2002. - V. 27. - P. 527-533.

256. Thompson, M.P. a- and 3-caseins / M.P. Thompson // Milk proteins: chemistry and molecular biology / Editors: H.A. McKenzie. New York: Academic Press, 1971.-V. 2.-P. 117-174.

257. Toumadje, A. Systemin has the characteristics of a poly(L-proline) II type helix / A. Toumadje, W. C. Jr. Johnson // J. Am. Chem. Soc. 1995. - V. 117.-P. 7023-7024.

258. Treweek, M.T. Intracellular protein unfolding and aggregation: the role of small heat-shock chaperone proteins / M.T. Treweek, A.M. Morris, J.A. Carver // Aust. J. Chem. 2003. - V. 56. - P. 357-367.

259. Effect of heat and high-pressure treatments on microbiological quality and immunoglobulin G stability of caprine colostrum / A.J. Trujillo, N. Castro, J.M. Quevedo et al. // J. Dairy Sci. 2007. - V. 90(2). - P. 833-839.

260. Tuinier, R. Stability of casein micelles in milk / R. Tuinier, C.G. DeKruif // J. Chem. Phys. 2002. - V. 117. - P. 1290-1295.

261. Uversky, V.N. Conformational constraints for amyloid fibrillation: the importance of being unfolded / N. Uversky, A.L. Fink // Biochim. Biophys. Acta. 2004. - V. 1698.-P. 131-153.

262. Uversky, V.N. Natively unfolded proteins / V.N. Uversky // Unfolded proteins: from denatured to intrinsically disordered. / Editor: T.P. Creamer. -Inc. NY: Nova Science Publishers, 2008. P.23 7-294.

263. Uversky, V.N. What does it mean to be natively unfolded? / N. Uversky // Eur. J. Biochem. 2002. - V. 269. - P. 2-12.

264. Van Hekken, D. L. Functional properties of dephosphorylated bovine whole casein / D. L. Van Hekken, E. D. Strange // J. Dairy Sci. 1993. - V. 76(11). -P. 3384-3391.

265. Van Montfort, R. Structure and function of the small heat shock protein/alpha-crystallin family of molecular chaperones / R. Van Montfort, C.

266. Slingsby, E. Vierling // Adv. Protein Chem. 2001 A. - V. 59. - P. 105-156.

267. Crystal structure and assembly of a eukaryotic small heat shock protein / R.L. Van Montfort, E. Basha, K.L. Friedrich et al. // Nat. Struct. Biol. -2001B. V. 8. - P. 1025-1030.

268. Visser, S. Phenotyping of bovine milk proteins by reversed-phase highperformance liquid chromatography / S. Visser, C. J. Slangen, H.S. Rollema // J. Chromatogr. 1991. -V. 548. - P. 361-370.

269. Wakisaka, A. Phase separation of water-alcohol binary mixtures induced by the microheterogeneity / A. Wakisaka, T. Ohki // Faraday Discuss. 2005. -V. 129.-P. 231-245.

270. Wakisaka, A. Microheterogeneity of ethanol-water binary mixtures observed at the cluster level / A. Wakisaka, K. Matsuura // J. Mol. Liq. -2006.-V. 129.-P. 25-32.

271. Wallace, B.A. Modern techniques for circular dichroism and synchrotron radiation circular dichroism spectroscopy / B.A. Wallace, R.W. Janes // Advances in biomedical spectroscopy. IOS Press, 2009. - V.l. - pp. 244.

272. Protein composition of milk / Editors: P. Walstra, R. Jenness // Dairy Chemistry and Physics / New York: Wiley, 1984. p. 467

273. Westh, P. Intermolecular interactions of lysozyme and small alcohols: A calorimetric investigation / P. Westh, Y. Koga // J. Phys. Chem. B. 1997. -V. 101.-P. 5755 -5758.

274. Proteins of milk // Fundamental of Dairy Chemistry. / Editor: R.M. Whitney. New York: Van Nostrand Reinhold, 1988. - P. 81-169.

275. Whitmore, L. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: methods and reference databases / L. Whitmore, B.A. Wallace

276. Biopolymers. 2008. - V. 89. - P. 392-400.

277. Wilson, M. R. Clusterin is a secreted mammalian chaperone / M. R. Wilson, S. B. Easterbrook-Smith // Trends Biochem. Sci. 2000. - V. 25. - P. 95-98.

278. Proteins of Milk // Fundamental of Dairy Chemistry 3rd ed. / Editors: N.P. Wong, R. Jenness, M. Keeney, E.H. Marth. NY: Van Nostrand Reinhold, 1988.-P. 481^492.

279. Wong, D.W.S. Structures and functionalities of milk proteins / D.W.S. Wong, W.M. Camirand, A.E. Pavlath // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1996. -V. 36.-P. 807-844.

280. Woody, R.W. Circular dichroism and conformation of unordered polypeptides / R.W. Woody // Adv. Biophys. Chem. 1992. - V. 2. - P. 3779.

281. Xie, D. Calorimetric determination of the energetics of the molten globule intermediate in protein folding: apo-alpha-lactalbumin / D. Xie, V. Bhakuni, E. Freire // Biochemistry. 1991. - V. 30(44). - P. 10673-10678.

282. Yan, S. B. Neoglycoproteins: in vitro introduction of glycosyl units at glutamines in beta-casein using transglutaminase / S. B. Yan, F. Wold // Biochemistry. 1984. - V. 23. - P. 3759-3765.

283. Yasar, F. The investigation of the secondary structures of various peptide sequences of b-casein by the multicanonical simulation method / F. Yasar, S. Celik, H. Koksel // Physica A. 2006. - V. 363. - P. 348-358.

284. Yamamoto, T. Infrared studies on thermally-induced conformational changes of ribonuclease A by the methods of difference-spectrum and self-deconvolution / T. Yamamoto, M. Tasumi // Can. J. Spectroscopy. 1988. -V. 33 (5).-P. 133-137.

285. Chaperone-Like Activities of Different Molecular Forms of b-casein. Importance of Polarity of N-Terminal Hydrophilic Domain / R. Yousefi, Yu.Y. Shchutskaya, J. Zimny et al. // Biopolymers. 2009. - V. 91. - P. 623632.

286. Yun, S.-E. Role of beta-caseirrin milk curdling / S.-E. Yun, K. Ohmiya, S. Shimizu // Agric. Biol. Chem. 1982. - V. 46 (2). - P. 443-449.

287. Zhang, C. Molecular dynamics simulation of ethanol/water mixtures for structure and diffusion properties / C. Zhang, X. Yang // Fluid Phase Equilib. -2005. V. 231.-P. 1-10.

Информация о работе

Коннова, Татьяна Анатольевна
кандидата биологических наук
Казань, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Влияние минорных модификаций первичной структуры на физико-химические свойства и шапероноподобную активность бета-казеина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Влияние минорных модификаций первичной структуры на физико-химические свойства и шапероноподобную активность бета-казеина - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы