Стрессовые и провоспалительные ответы иммунных клеток: роль систем внутриклеточной сигнализации

Глушкова, Ольга Валентиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Стрессовые и провоспалительные ответы иммунных клеток: роль систем внутриклеточной сигнализации
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Стрессовые и провоспалительные ответы иммунных клеток: роль систем внутриклеточной сигнализации"

На правах рукописи

Глушкова Ольга Валентнповна

СТРЕССОВЫЕ И ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ОТВЕТЫ ИММУННЫХ КЛЕТОК: РОЛЬ СИСТЕМ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ

Биохимия 03.01.04 Биофизика 03.01.02

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

1 5 Ш12015

Пущино - 2015

005570557

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук, лаборатория механизмов рецепции.

Научные консультанты: Новоселова Елена Григорьевна

доктор биологических наук, профессор

Фесенко Евгений Евгеньевич

доктор биологических наук, профессор член-корр. РАН

Официальные оппоненты Соодаева Светлана Кельдебековна

доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией клинической и экспериментальной биофизики Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения «НИИ пульмонологии» Федерального медико-биологического агентства России

Гудков Сергей Владимирович

Музафаров Евгений Назибович

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории изотопных исследований Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой биологии Федерального

государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Тульский государственный университет»

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита диссертации состоится «15» октября 2015 года в 14 ч. 00 мин

на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино Московская область, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Пущинского научного центра РАН.

Автореферат разослан « » 2015 года

Ученый секретарь Диссертационного совета / I л . *

кандидат биологических наук н // ¿/^- 'Х ^

Смолихина Татьяна Ивановна

Введение

Актуальность проблемы. Эволюционный успех млекопитающих связан с их способностью поддерживать и защищать свою внутреннюю среду на фоне изменчивости окружающего мира. Защитные функции в организме выполняют уникальные системы, включая иммунную систему, которая способна быстро формировать свои ответы на внешние воздействия. Иммунная система млекопитающих чрезвычайно сложна, иммунные реакции разнообразны и вариабельны, что связано с функцией защиты базовой стерильности и поддержания гомеостаза. Тем не менее, каждую функцию иммунной системы и иммунный ответ в целом можно описать общей схемой (Мес^коу, 2008, Ос^аагс! & СЬа\у1а, 2013):

Рис. 1. Схема иммунного ответа при стрессах и воспалении.

Этой схемой могут быть описаны и уникальные иммунные ответы организма, активирующиеся при нарушении гомеостаза, будь то изолированная клетка или целый организм, например, при стрессовых и воспалительных реакциях.

Если под действием стрессоров, повреждений или инфекционных агентов происходит нарушение клеточного гомеостаза, система вовлекается в стрессовый ответ для возвращения организма в состояние гомеостаза (Goldstein & Kopin, 2007). Величину отклонений от нормы определяют специализированные сенсоры. На уровне организма сенсорами являются иммунные клетки, эндокринные клетки и сенсорные нейроны, на тканевом уровне -макрофаги, в клеточном гомеостазе сенсорами являются сигнальные белки, которые детектируют нарушения ключевых процессов, таких как фолдинг белков, уровень АФК и доступность питательных веществ. Первой и наиболее мощной линией защиты является врожденный иммунитет, распознающий внешние или внутренние нарушения при помощи инвариантных и плейотропных паттерн-распознающих рецепторов (PRR's) (Kavvai & Akira, 2009), принимающих участие в защите организма при огромном разнообразии внешних сигналов (Bern, 2012). Важнейшим среди PRR's является семейство толл-подобных рецепторов (TLR's), которые играют центральную роль в индукции ответов врожденного иммунитета и развития адаптивных иммунных ответов (Blasius & Beutler, 2010; Kawai & Akira, 2010). Сенсоры, распознав источник стресса или воспаления, запускают сложные

механизмы адаптации, связанные с активацией ключевых сигнальных путей неспецифической защиты с участием ядерного фактора кВ (NF-кВ), митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК), в частности, стресс-активируемых протеинкиназ/киназ N-конца c-Jun (SAPK/JNK) и р38; а также белков теплового шока (HSPs). Это приводит к усиленному синтезу и секреции медиаторов, к которым относятся цитокины. Медиаторы, в свою очередь, воздействуют на эффекторы - клетки или ткани, чувствительные к их действию. В результате эффекторных ответов может произойти или восстановление нормального состояния пораженной клетки или ткани и подавление воспалительных реакций, или гибель клетки. При этом не исключена возможность гибели клеток или клеточных систем при истощении защитного потенциала.

За последнее десятилетие появилось множество работ, посвященных исследованию воспалительных процессов. Анализ результатов этих исследований показывает, что большинство патологий в той или иной степени связано именно с развитием воспалительного процесса. Воспаление рассматривается как неспецифическая реакция организма на экстремальные стимулы, будь то инфекционное заражение, повреждение тканей или стресс, оно традиционно ассоциируется с развитием защитных ответов. Однако иммунным клеткам и тканям приходится расплачиваться тем, что какая-то другая свойственная им функция ослабляется или выключается, что приводит к иммунодепрессии вплоть до иммунного паралича (Medzhitov, 2014). Поэтому проблема исследования молекулярных механизмов регуляции гомеостаза при воспалении и стрессах чрезвычайно актуальна. На сегодняшний день известно, что сенсором грамотрицательных бактерий является рецептор TLR4, который избирательно реагирует на грамотрицательные бактериальные липополисахариды (ЛПС) или липоолигосахариды (Poltorak et al., 1998; Beutler et al., 2001). Кроме того, TLR4 в составе рецепторного комплекса распознает широкий спектр веществ, входящих в состав вирусов и микоплазм, а также активируется при эндогенных сигналах опасности, появляющихся в результате стресса, повреждения или инфицирования организма (Calabrese и др, 2015). В последующий ответ клетки вовлечен целый спектр различных адапторных молекул, способных активировать множество нисходящих киназ и транскрипционных факторов, запускающих эффекторные ответы как в виде воспалительных, так и противовоспалительных реакций. В настоящее время детально описаны сигнальные пути TLR4, вызывающие активацию транскрипционных факторов NF-кВ, FoxOl, АР-1, CREB и IRF (Morris et al., 2015), а также естественные ингибиторы, способные блокировать эти сигнальные пути на межклеточном, мембранном и цитоплазматическом уровнях. Тем не менее, если хронические воспаления, индуцированные компонентами грамположительных бактерий, успешно лечатся антибиотиками, то самая

тяжелая и плохо поддающаяся лечению форма сепсиса вызывается токсинами грамотрицательных бактерий. Известные способы лечения сепсиса не дают гарантий полного выздоровления.

Не менее актуальной является проблема поддержания гомеостаза в клетке при действии стрессовых факторов. В ответ на слабые стрессы клетки способны поддерживать гомеостаз с участием стрессовых сигнальных путей, например, за счет активации белков теплового шока, некоторых стресс-индуцибельных сигнальных белков и транскрипционных факторов. При активации последних происходит накопление различных цитотоксических продуктов, которые и являются маркерами стресса. Стрессовым ответом является реакция клеток на внешние раздражители, такие как тяжелые металлы, тепловой шок, гипоксия и в, том числе, электромагнитные излучения (Nollen & Morimoto, 2002; Santoro, 2000). В соответствии с рекомендацией ВОЗ (WHO Environmental Health Criteria, 1993), микроволны с нетепловыми интенсивностями считаются «слабыми биотропными факторами». В настоящее время предложены многочисленные модели для объяснения того, каким образом слабые электромагнитные поля могут взаимодействовать с биологическими системами. Теоретики предполагают, что связь и передача энергии ЭМИ в клеточные структуры опосредована резонансными взаимодействиями ЭМП с колебаниями ионов, биологических молекул или клеточных структур (Adair, 2002), например, с помощью механизма циклотронного резонанса (Liboffet al., 1987, 2000), магнитного параметрического резонанса (Lednev, 1993, 1996), стохастического резонанса (Бецкий и Лебедева, 2004). В качестве первичного акцептора также рассматривается молекулы воды (Fesenko et al., 1995, Zhadin & Giuliani, 2006). Что касается влияния ЭМИ СВЧ на изолированные клетки, считается, что в этом случае низкое сопротивление мембраны приводит к проникновению поля через мембрану внутрь клетки (Foster, 2000), и ЭМИ взаимодействует с колебаниями клеточных структур, что согласуется с частью теории Фрёлиха (Fröhlich, 1980). Поэтому в качестве первичных мишеней низкоинтенсивных высокочастотных волн предложены мембраны, ионные каналы и мембранные белки, металлопротеины, микротрубочки цитоскелета, меланин, участники сигнальных путей МАРК, NF-кВ, р53, HSP, а также молекула ДНК. Несмотря на отсутствие общепринятой теоретической базы о воздействии нетепловых ЭМИ, в частности, ЭМИ СВЧ, на биологические объекты к настоящему времени накопился большой объем экспериментального материала, свидетельствующего о выраженном биотропном и иммунотропном действии ЭМИ СВЧ. Однако данные о биологических эффектах нетепловых радиоволн чрезвычайно противоречивы. Это связано со сложностью постановки эксперимента в результате необходимости учета большого числа параметров излучений, а также физиологического состояния облучаемого объекта (Belyaev, 2010). Ранее в нашей

лаборатории было обнаружено иммуномодулирующее действие электромагнитного излучения низкоинтенсивного излучения сантиметрового диапазона (Novoselova et al., 1999; Fesenko и др., 1999; Глушкова, канд. дисс., 2002). На основании имеющихся сведений об иммунотропных свойствах низкоинтенсивных электромагнитных излучений полагаем целесообразным изучение эффектов ЭМИ СВЧ в качестве возможного регулятора иммунопатологии. Кроме того, имеется большой пробел в области исследования молекулярных механизмов иммунотропного действия этого вида излучения, его первичных внутриклеточных сенсоров и почти не изучена роль внутриклеточной сигнализации при воздействии ЭМИ СВЧ на организм или изолированные клетки. Неясна роль врожденного иммунитета в реализации стрессовых ответов ЭМИ СВЧ, остаются без ответа и некоторые другие вопросы. Например, может ли характер ответа на ЛИС или на электромагнитное излучение изменяться при фармакологических воздействиях, направленных на активацию или ингибирования различных компонентов этой сигнальной взаимосвязи? Возможна ли корректировка путей поддержания гомеостаза при острых и хронических воспалениях и стрессах?

Ответы на эти вопросы могут быть получены при исследовании молекулярных механизмов нарушения клеточного гомеостаза при развитии стрессовых и воспалительных реакций и поиске адекватных регуляторов иммунопатологии, их сопровождающих. Полагаем, что особое внимание следует обратить на применение специфических агентов, способных с высокой степенью специфичности изменять активность ключевых сенсоров клеточного гомеостаза, к которым относят TLR4, индуцибельные белки теплового шока, а также ключевые участники сигнальных путей неспецифической защиты NF-кВ и МАРК. Цель и основные задачи.

Целью настоящей работы является исследование регуляции молекулярных механизмов гомеостаза при стрессе и воспалении. В рамках этой цели были поставлены следующие задачи:

1. В исследованиях in vitro сравнить защитные ответы иммунных клеток, развивающиеся при нарушении гомеостаза при стрессе (при действии низкоинтенсивных электромагнитных волн), или ответах на бактериальный токсин (липополисахарид из клеточной стенки E.coli).

2. С помощью ингибиторного анализа оценить роль белков теплового шока HSP90, рецепторов TLR4 и сигнальных каскадов NF-кВ, р38 и SAPK/JNK в развитии провоспалительных ответов, вызванных липополисахаридом из клеточной стенки E.coli, и стрессовых ответов, индуцированных низкоинтенсивным ЭМИ СВЧ, в культивируемых макрофагальных клетках линии RAW 264.7.

3. Оценить принципиальную возможность регуляции уровня провоспалительных реакций с использованием ингибиторов ключевых звеньев неспецифической защиты или низкоинтенсивного электромагнитного излучения.

4. Изучить участие сигнальных белков каскадов NF-кВ и SAPK/JNK, белков теплового шока, цитокинов и оксида азота при остром и хроническом септических воспалениях, моделированных введением животным токсина из стенок грамотрицательных бактерий Е. coli.

5. Оценить противовоспалительную эффективность применения ингибиторов TLR4 (антитела к TLR4), сигнального каскада NF-кВ (IKK Inhibitor XII), и HSP90 (гелданамицин) при развитии воспаления у мышей.

6. Исследовать возможность профилактического и противовоспалительного действия низкоинтенсивного электромагнитного излучения сантиметрового диапазона при развитии острого воспаления септической природы у мышей.

Научная новнзна.

В работе содержатся новые сведения о механизмах развития воспалительных и стрессовых ответов, как на уровне клетки, так и на уровне организма.

1. Впервые доказано, что низкоинтенсивное электромагнитное излучение сантиметрового диапазона вызывает развитие стрессовых ответов иммунных клеток, о чем свидетельствует накопление основных медиаторов стресса (TNF-a, IL-1, IL-6, IFN-y) и активация внутриклеточных стресс-индуцибельных сигнальных путей (NF-кВ, SAPK/JNK, р38). Впервые установлено участие ключевых рецепторов врожденного иммунитета - TLR4 и TLR2 - в эффектах ЭМИ СВЧ на иммунные клетки и организм мышей.

2. Впервые установлено, что и бактериальный эндотоксин, и низкоинтенсивное излучение сантиметрового диапазона приводят к увеличению содержания стресс-индуцибельных белков теплового шока HSP72 и HSP90 в иммунных клетках мыши.

3. Впервые проведено сравнительное исследование роли ключевых сенсоров поддержания гомеостаза (рецептор TLR4, сигнальные пути NF-кВ, р38, JNK и белок теплового шока HSP90) в реализации стрессовых и провоспалительных ответов иммунных клеток. Установлено, что основными сенсорами токсина грамотрицательных бактерий являются рецепторы TLR4 и TLR2, а основной вклад в развитие провоспалительных ответов вносит активация классического пути NF-кВ сигнатизации. Главными сенсорами ЭМИ СВЧ в иммунных клетках являются TLR2 и сигнальные белки каскадов р38 и NF-кВ. Именно эти агенты неспецифической защиты клетки предложены в качестве мишеней при регуляции провоспалительных и стрессовых ответов иммунных клеток.

4. В работе содержатся новые сведения об иммунопатогенезе острого и хронического воспаления у мышей, вызванного ЛПС из стенок грамотрицательных бактерий. Результаты исследований доказывают, что острое воспаление стимулирует иммунный ответ клеток, тогда как хронический воспалительный процесс приводит к угнетению иммуногенеза.

5. Впервые установлено, что белок теплового шока ШР90 является мишенью противовоспалительной терапии.

6. Впервые доказано, что фармакологическое снижение активности сигнального каскада

кВ приводит к ослаблению провоспалительных реакций на бактериальный токсин - как на уровне иммунных клеток, так и на уровне организма мышей.

7. Впервые установлено, что профилактическое применение 10-дневного курса ЭМИ СВЧ снижает уровень иммунопатологий, вызванных острым воспалением у мышей. Теоретическая и практическая значимость

Результаты проведенного исследования позволили получить новые представления о молекулярных механизмах поддержания клеточного гомеостаза при стрессовых и воспалительных реакциях. В работе содержатся новые сведения об иммунопатогенезе острого и хронического воспалений, что указывает на необходимость переосмысления общепринятых представлений о механизмах патогенеза сепсиса и поиск на основе этих исследований новых медикаментозных средств терапии. Это открывает новые возможности в лечении и профилактике стрессов и воспалительных заболеваний, а также сопутствующих иммунопатологий. Кроме того, результаты работы вносят существенный вклад в понимание молекулярных механизмов биотропного действия ЭМИ СВЧ и позволяют предположить перспективность использования низкоинтенсивных электромагнитных волн для профилактики и коррекции иммунопатологий, вызванных воспалительными заболеваниями. Положения, выносимые на защиту

1. Установлено, что низкоинтенсивное излучение сантиметрового диапазона обладает слабым стрессовым воздействием на иммунные клетки.

2. Активация рецептора ТЫ14 является определяющей при формировании защитных ответов иммунных клеток на действие бактериального токсина липополисахарида, но не низкоинтенсивного ЭМИ СВЧ.

3. При формировании неспецифических защитных ответов иммунных клеток на стресс и воспаление основная эффекторная функция принадлежит сигнальному каскаду ЫБ-кВ. Активация этого транскрипционного фактора в условиях стресса, вызванного ЭМИ СВЧ, происходит как по классическому, так и по альтернативному сигнальному пути с участием казеинкиназы II.

4. Стресс, вызванный ЭМИ СВЧ, и провоспалительные ответы, индуцированные ЛПС, приводят к активации сигнального пути SAPK/JNK. Хотя JNK-сигнализация является важной составляющей частью неспецифического иммунного ответа, этот сигнальный путь не является определяющим при реализации стрессовых и провоспалительных ответов иммунных клеток. Другой представитель семейства митогенактивированных протеинкиназ -р38 - является одним из основных внутриклеточных сенсоров стресса, вызванного низкоинтенсивными электромагнитными волнами.

5. Белок теплового шока HSP90 является регулятором амплитуды ответов иммунных клеток на ЭМИ СВЧ.

6. Профилактическое применение антител против TLR4 снижает уровень провоспалительных ответов у мышей с острым воспалением септического типа.

7. Белок теплового шока HSP90 является перспективной терапевтической мишенью для коррекции острых воспалений, индуцированных грамотрицательными бактериями.

8. Фармакологическое ингибирование NF-кВ-сигналыюго пути с использованием IKK Inhibitor XII снижает провоспалительные ответы у животных с острым воспалением, вызванным эндотоксином их стенок грамотрицательных бактерий.

9. Применение сантиметровых волн в качестве профилактического средства повышает резистентность организма при развитии острого септического воспаления.

Личный вклад автора.

Автору принадлежат постановка проблемы и решение её в целом, работа с культурами клеток и источниками электромагнитного излучения, планирование и непосредственное участие в проведении экспериментов и обработке результатов, написании статей. Контроль за состоянием животных, исследование продолжительности их жизни и иммунного статуса, выделение иммунных клеток и оценка их функционального состояния осуществлялись совместно с сотрудниками лаборатории механизмов рецепции ИБК РАН Луниным С.М., Новоселовой Т.В., Хреновым М.О., Парфенюк С.Б., Черенковым Д.А. Апробация диссертации

Материалы диссертации были представлены в виде докладов на 2-ом Международном симпозиуме по ЭМП (Родос, Греция, 2002); 7-ой, 10-ой и 11-ой конференциях молодых ученых "Биология - наука 21 го века" (Пущино, Россия, 2003, 2006 и 2007); 6-ом международном конгрессе European Bioelectromagnetics Association (ЕВЕА) (Будапешт, Венгрия, 2003); Международном Конгрессе "Прогрессивные научные технологии для здоровья человека" (Кара-Даг (Крым), Украина, 2003); Ш-ем Съезде биофизиков России (Воронеж, Россия, 2004); 17-ом международном симпозиуме «Electromagnetic Compatibility-2004» (Вроцлав, Польша, 2004); Европейском Международном симпозиуме EUROEM-2004

(Магдебург, Германия, 2004); IX-ом и Х-ом Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, Россия, 2005 и 2006);VIII-om конгрессе Международного общества по адаптивной медицине (ISAM) (Москва, Россия, 2006); Всероссийской конференции молодых ученых «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, Россия, 2006); 2-ом и 5-ом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, Украина, 2006 и 2009); международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», (Пущино Россия, 2009, 2011, 2013); XV-ой международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, Украина, 2007); IV-om Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, Россия, 2012); итоговых конференциях ИБК РАН (Пущино, Россия, 2010, 2011, 2014); 11-ом конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, Россия, 2015). Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 324 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1-я глава), описания материалов и методов (2-я глава), результатов исследования и их обсуждения (3-я глава), заключения, выводов и списка литературы. Библиографический указатель содержит 649 источник литературы. Работа проиллюстрирована 48 рисунками.

Содержание работы

Материалы и методы исследования Лабораторные животные и клеточные линии. В экспериментах in vivo использовали мышей-самцов линии NMRI или BALB/c весом 22-28 г. При исследованиях in vitro использовали изолированные перитонеальпые макрофаги и спленоциты из мышей-самцов линии NMRI или BALB/c, а также клетки макрофагачьной линии RAW 264.7. Индукторы воспаления и специфические ингибиторы. В качестве индуктора воспаления в экспериментах in vivo или воспалительного стресса при исследованиях in vitro применяли ЛПС (Merck). В работе использовали специфические ингибиторы стрессовых и сигнальных белков: гелданамицин (Sigma) - ингибитор HSP90; CLI-095 (InVivoGen)- ингибитор TLR4; ОхРарс (InVivoGen)- ингибитор TLR4 и TLR2; SP600125 (StressGen) - ингибитор JNK; IKK Inhibitor XII (Merck)- ингибитор IKKa/ß; р38 MAP kinase Inhibitor XI (Calbiochem) -ингибитор p38; Casein Kinase II Inhibitor III (Santa Cruz) - ингибитор казеинкиназы II.

Условия облучення ЭМИ СВЧ. Источником ЭМИ СВЧ служил генератор Я2Р-76/2 с диапазоном частот 8.15-18 ГТн, использовали режим качающейся частоты с периодом перестройки 1 сек, средняя плотность потока энергии 1 мкВт/см". Облучение изолированных клеток in vitro (перитонеальные макрофаги, лимфоциты селезенки, клетки линии RAW 264.7) проводили в культуральных флаконах или в 24-луночных планшетах через рупор антенны (размер 25 см х 34 см) на расстоянии 20 см от объекта до основания рупора в течение 1 часа. Контролем служили ложноэкспонированные клетки, содержащиеся в тех же условиях. Облучение животных in vivo проводили в камере из оргстекла размером 25смх25смх40см через рупор антенны на расстоянии 80 см от объекта до основания рупора. Контролем служили животные, содержащиеся в таких же условиях, но при отключенном источнике питания генератора.

Модели острого и хронического воспалення. Хроническое воспаление формировали путем ежедневных инъекций ЛПС в течение 11 дней, увеличивая дозу ЛИС каждые 2 дня, при этом первая доза составляла 25 мкг/100 г веса, последняя - 250 мкг/100 г веса. Острый токсический стресс моделировали путем однократного введения ЛПС в дозе 250 мкг/100 г веса.

Оценка биологических ответов иммунных клеток н организма мышей. Измерение продукции оксида азота производили с использованием реактива Грисса. Концентрацию цитокинов в образцах клеток или в сыворотке крови мышей определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов (Kits) для определения IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IFN-y, TNF-a (все Peprotech, USA). Для определения сигнальных и стрессовых белков применяли электрофорез в 10-15% ПААГ. Специфичность анализа проверяли с помощью иммуноблотинга, используя антитела к HSP25(27), HSP70, HSP90(Bce StressGen Biotechnologies), ph-NF-кВ, ph-SAPK/JNK, ph-IKK, ph-p38, ph-IRF3(Bce Cell Signaling, USA) и TLR4 (SantaCruz, USA). Количественную оценку белковых полос выполняли с использованием программного обеспечения Qapa.

Получение антнтел к TLR4 мыши. Кролики были иммунизированы белком мыши TLR4 (Sigma, USA), 300 мкг/кролика. Была использована классическая схема иммунизации, когда введение антигена проводится с полным и неполным адъювантом в два этапа. Через 14 дней после вторичной иммунизации кровь была собрана и выделена сыворотка. Белки сыворотки осаждали, фракцию IgG получали с помощью очистки на колонке с DEAE-сефадексом. Полученные антитела были сконцентрированы, их токсичность и рабочий титр определены как in vitro (на перитонеальных макрофагах мышей), так и in vivo (на мышах линии NMRI).

Статистический анализ проводили с использованием критерия Стьюдента, однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA) и апостериорных тестов Тьюки (Tukey's post-hoc tests).

Результаты и обсуждение 1. Стрессовые и нровоспалительные ответы иммунных клеток 1.1. Сравнительный анализ ответов иммунных клеток на стресс и

эндотоксин

Объектом in vitro исследований явились одни из главных эффекторных клеток врожденного иммунитета - макрофаги. Эксперименты проводили на макрофагальной линии клеток RAW 264.7. Эти клетки подвергались действию электромагнитного излучения (8.15-18 ГГц, 1 мкВт/см2, 1 час) или классического индуктора воспаления -липополисахарида из стенок E.coli (2,5 мкг/мл). При сравнении эффектов, которые оказывают ЛПС и ЭМИ СВЧ на цитокиновый профиль иммунных клеток и их способность продуцировать оксид азота, было обнаружено, что клетки, как после воздействия ЭМИ СВЧ, так и при культивировании с ЛПС, характеризуются повышенной продукцией ряда провоспалительных цитокинов: TNF-a, IL-1, IL-6 и IFN-y (Рис. 2А и 2Б). При действии каждого из этих факторов показали снижение продукции противовоспалительного цитокина IL-10, а достоверное увеличение продукции оксида азота наблюдали только при действии токсина.

а §-250

J. 5100

с s;

[Ц

1 £ £ о S X I £200

IL-6 11,-10

ф.

Рис. 2. Влияние липополисахарида (А) и ЭМИ СВЧ (Б) на продукцию цитокинов и синтез оксида азота (N0) в клетках макрофагальной линии ИАХУ 264.7. Результаты ИФА с использованием специфических антител к Т№а, 1ЕЫу, 11-1,1Ь-6,11-10 или анализа с использованием реактива Грисса (для N0). п = 8. * - достоверные отличия от контроля (р<0.05). **-достоверные отличия от контроля (р<0.01).

При исследовании состояния сигнальных и стрессовых белков неспецифической защиты

иммунных клеток было обнаружено, что обработка макрофагальных клеток ЛПС

приводит к увеличению концентрации рецепторното белка TLR4 и к активации сигнального каскада NF-кВ, о чем свидетельствуют увеличение фосфорилирования как самого транскрипционного фактора, так и 1КК (Рис. ЗА). Кроме того, были показаны: увеличение экспрессии стрессовых белков HSP72 и HSP90 и активация сигнального каскада SAPK/JNK. Слабые электромагнитные волны вызывали увеличение экспрессии TLR4, однако по-разному влияли на экспрессию индуцибельных белков разных семейств HSP: увеличивалась экспрессия HSP70, снижался уровень синтеза HSP25, и отсутствовало влияние на продукцию HSP90 (Рис. ЗБ). Кроме того, было показано изменение внутриклеточной локализации этих белков: после облучения клеток белок HSP70 преимущественно накапливался в мембране, а его содержание в цитоплазме и цитоскелете снижалось; уменьшалось количество HSP25 в структуре цитоскелета (данные не показаны). ЭМИ СВЧ приводили также к активации NF-кВ (но не IKK), р38 и SAPK/JNK (Рис. ЗБ).

К лпс

100 185 *

__ph-NF-кВ

100 196 *

_ _ ph-JNKl

__ph-JNK2

100 200

8 40

HSP 90

100 277

— HSP 72

100 175 *

__ _ tubulin

К ЭМИ Б

— — TLR4

100 463 1**J

__ph-IKK

100 117

_ ph-NF-кВ

100 239

Рис. 3. Влияние

липополисахарида (А) и ЭМИ СВЧ (Б) на продукцию и активацию стрессовых и сигнальных белков в клетках макрофагальной линии RAW 264.7. Результаты Вестерн-блота с использованием специфических антител к TLR4, HSP72, HSP90 и фосфорилированным формам

участников сигнальных путей NF-кВ (IKK, NF-кВ) и МАРК (JNK и р38). Числовые значения - результат денситометрического измерения количества белка (в % от контроля). Условные обозначения: К контроль, интактные клетки; ЛПС -клетки, культивированные в присутствии ЛПС, ЭМИ СВЧ -облученные клетки. п=4. * достоверные отличия от контроля (р<0.05), ** - достоверные отличия от контроля (р<0. 1).

_ tubulin

Интересно, что при одновременном воздействии на иммунные клетки сверхслабых электромагнитных излучений и эндотоксина наблюдались аддитивные эффекты, что выражалось в усилении синтеза провоспалительных цитокинов (данные не показаны). Таким образом, и при стрессе, вызванном воздействием низкоинтенсивного ЭМИ СВЧ, и при развитии провоспалительного ответа, индуцированным ЛПС, в макрофагах происходит активация неспецифической защиты с участием сигнальных путей врожденного иммунитета - ТЬЯ-4, ОТ-кВ и митоген-активированных протеинкиназ. Общее состояние внутриклеточной сигнализации и цитокинового профиля иммунных клеток после воздействия ЛПС позволяет сделать вывод об индукции классических противовоспалительных реакций. Учитывая активацию стресс-индуцибельных сигнальных белков и увеличение концентрации классических медиаторов стресса в облученных иммунных клетках, можно с уверенностью говорить о стрессовом действии ЭМИ СВЧ.

1.2. Роль стрессовых и сигнальных белков в реализации защитных ответов иммунных клеток при стрессе и воспалении

На следующем этапе работы была исследована индивидуальная роль ключевых участников сигнальных путей неспецифической защиты иммунных клеток при стрессе и воспалении. Для этого активность этих сигнальных или стрессовых белков в иммунных клетках была заблокирована с помощью специфических ингибиторов, как это представлено на Рис.4.

Рис. 4. Использованные ингибиторы сигнальных и стрессовых белков (заштрихованные прямоугольники) и сигнальные пути их белков-мишеней.

1.2.1. Участие Т1Л*2 и ТЬЯ4 в ответах иммунных клеток на стресс и

липополисахарид

В настоящее время известно, что рецептор ТЬЯ4 играет ключевую роль во врожденном иммунитете и является одним из древнейших в системе антибактериальной защиты организма. Он участвует в протекании перинатальных процессов и в патогенезе воспалений, аутоиммунных заболеваний, кардиомиопатий, астм, атеросклероза. Этот рецептор локализован на поверхности моноцитов/макрофагов, миелоидных дендритных клеток, тучных и эпителиальных клеток. Лигандами для ТЫ14 являются не только ЛПС грамотрицательных бактерий, но и некоторые вирусы, таксол, ШРэ, фибриноген, гепарансульфатные фрагменты, гиалуроновая кислота клеток хозяина.

¡t

1 .=

гН

С ais

0.1IS

ни о о

ГГ|

1 х

г I"

гЬ

д.

ЛПС CU-095 1КК

+ЛПС Inhibitor XII +ЛПС

К ЛПС CLI-095 IKK

♦ЛПС Inhibitor XII ♦ЛПС

А-----

100 249 141" 91-

ph-NF-kB

(pes)

100 196 91* ЮГ

100 247 128' 167

100 195 65"

¡Si

100 200 103"

100 500 87"

ph-JNK2 (р54) ph-JNK1 (р46)

ППС CLU095 ГКК

.ЛПС Inhibitor XII +ЛПС

Рисунок 5. Влияние ингибиторов TLR4 (CLI-095) и сигнального пути NF-кВ (IKK Inhibitor XII) на продукцию цитокинов и NO (А) и сигнальных и стрессовых белков (Б) в клетках линии RAW 264.7 при их культивировании с ЛПС.

Условные обозначения: К - контроль, интактные клетки; ЛПС - клетки, культивированные в присутствии ЛПС; CLI-095+ЛПС - клетки, пред-инкубированные с ингибитором TLR4 за 15 минут до добавления ЛПС; IKK Inhibitor XII +ЛПС - клетки, пред-инкубированные с ингибитором IKK за 1 час до добавления ЛПС; * - достоверные отличия от контроля (р<0.05), ** - достоверные отличия от контроля (р<0.01);# - достоверные отличия от группы ЛПС #р < 0.05, ##р < 0.01; л -достоверные отличия от группы IKK Inhibitor XII+ЛПС, лр < 0.05, ллр <0.01.

Активация TLR4 вызывает запуск множества сигнальных путей, приводящих как к гибели, так и к адаптации клетки. Для исследования роли рецептора TLR4 использовали специфический ингибитор внутриклеточного домена этого рецептора, производное циклогексана, CLI-095. Важно, что макрофаги были инкубированы с этим ингибитором за час до развития стресса или воспаления.

На рисунках 5 и 7 представлены результаты по применению ингибиторов рецептора TLR4 и ключевой киназы сигнального пути NF-кВ (IKK) в клетках линии RAW 264.7 при стрессе или действии эндотоксина. Пред-инкубация с ингибитором CLI-095 предотвращала развитие провоспалительной реакции в ответ на ЛПС, что выражалось в снижении концентраций сигнальных белков и всех исследованных цитокинов за исключением IL-1 (Рис.5А и Б). Следовательно, именно рецептор TLR4 является сенсором эндотоксина из грамотрицательных бактерий и активатором воспалительных ответов в иммунных клетках с участием сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK; очевидно, что он регулируется по принципу положительной обратной связи. Именно активация TLR4 обеспечивает накопление таких медиаторов воспаления, как NO, IL-6 и IFN-y 0,25

| 0,2 I

к 0,15 га

I 0.1

§ 0,05 0

rtl

т ITI

++ J- + t

ink

TNF IL-6

ОКонтроль ОЛПС

IL-10 ■ ОхРарс+ЛПС

IFN

Рисунок 6. Влияние ингибитора ТЬК4 и ТЫ*2 (ОхРарс) на продукцию цитокинов и N0 в клетках линии ЯАУУ 264.7 при культивировании с ЛПС.

Условные обозначения: К - контроль, интактные клетки; ЛПС - клетки, культивированные в присутствии ЛПС; ОхРарс+ЛПС - клетки, пред-инкубированные с ингибитором за 15 минут до добавления ЛПС; * - достоверные отличия от контроля (р<0.05), ** - достоверные отличия от контроля (р<0.01); + - достоверные отличия от группы ЛПС +р < 0.05, ++р < 0.01.

Тем не менее, применение ингибитора внутриклеточного доменов ТЬК4 не устраняло чувствительности макрофагальных клеток к действию эндотоксина. Поэтому были проведены дополнительные исследования с использованием ингибитора экстраклеточного домена Т1^4 - ОхРарс, конкурирующего с СЭ14, ЦВР и МЕ>2, - вспомогательными белками, взаимодействующими с бактериальными липидами и блокирующими

сигнализацию и ТЬЯ4. Интересно, что при использовании ингибитора ОхРАРС

наблюдалась почти полная нормализация синтеза провоспалительных цитокинов и оксида азота, что подтверждает тот факт, что ЛПС способен вызывать провоспалительные ответы иммунных клеток не только через 1X114, но и через ТЬЯ2 (Рис. 6).

Несмотря на способность микроволн увеличивать экспрессию 1X114 в иммунных клетках, этот рецептор не являлся определяющим в реализации эффектов ЭМИ СВЧ. Как видно из Рис. 7, ингибирование активности 1ХЯ4 не вызывало изменения направленности и амплитуды эффектов ЭМИ СВЧ ни на уровне активации сигнальных белков, ни при экспрессии стрессовых белков (рис. 7Б), ни на уровне продукции про- и противовоспалительных агентов (Рис. 7А). Тем не менее, этот рецептор принимает участие в активации сигнального пути ЛЖ при ответах иммунных клеток на стресс, вызванный ЭМИ СВЧ.

ill Л I ■ I

к эми

100 463

— --

100 117

. ...

Inhibitor XII *

-ЭМИ +ЭМИ -ЭМИ +ЭМИ

— TLR4

ph-NF-кВ

100 239 59 107 100 200

-ЭМИ ЭМИ-ЭМИ

IKK CLI-095 Inhibitor XII

-ЭМИ -ЭМИ -ЭМИ -ЭМИ -ЭМИ -ЭММ

К IKK CLI-095 Inhibitor XII

ph-JNK2

100 297 50 107 75 50 ___ __ __ _ _ tubulin

Рисунок 7. Влияние ингибиторов TLR4 (CLI-095) и сигнального пути NF-кВ (IKK Inhibitor XII) на продукцию цитокинов и NO (А) и сигнальных и стрессовых белков (Б) в клетках линии RAW 264.7 при стрессе, вызванном ЭМИ СВЧ.

Условные обозначения: - ЭМИ - необлученные клетки, + ЭМИ - клетки, облученные ЭМИ СВЧ. К- контроль, интактные клетки; IKK Inhibitor XII- клетки, пред-инкубированные с ингибитором IKK за 1 час до воздействия ЭМИ СВЧ; CLI-095- клетки, пред-инкубированные с ингибитором TLR4 за 15 минут до воздействия ЭМИ СВЧ; * -достоверные отличия от группы облученных клеток (р<0.05), ** - достоверные отличия от группы облученных клеток (р<0.01), п= 6.

Интересно, что применение ингибитора ОхРАРС, способного подавлять активность как TLR4, так и TLR2, приводило к устранению чувствительности макрофагальных клеток к действию ЭМИ СВЧ. Как видно на Рис. 8, облученные ЭМИ СВЧ клетки линии RAW 264.8, которые были пред-инкубированы до облучения с ингибитором рецепторов TLR4 и TLR2, не способны генерировать цитокиновый ответ, если сравнивать с облученными клетками, которые не подвергались действию ОхРАРС. Более того, если облучение интактных иммунных клеток приводило к увеличению продукции IL-1 и IL-6, то воздействие ЭМИ СВЧ на клетки с заблокированной активностью TLR4 и TLR2 вызывало снижение концентрации этих цитокинов по сравнению с контрольным уровнем. Уровень синтеза оксида азота в иммунных клетках не отличался от контрольного уровня ни при действии ОхРАРС, ни при облучении клеток ЭМИ СВЧ (данные не показаны). Иными словами, рецептор TLR2 является одним из сенсоров низкоинтенсивного электромагнитного излучения на клетку.

0,5

0,45 *

| 0,4

! 0,35

□ Контроль пЭМИ иОхРарс 0ОхРарс+ЭМИ

Рисунок 8. Влияние ингибитора ТЫ*4 и ТЬИ2 (ОхРАРС) на продукцию цитокинов в клетках линии КА\¥ 264.7 при стрессе, вызванном ЭМИ СВЧ.

Условные обозначения: К - контроль, интактные клетки; ЭМИ - клетки, облученные в течение 1 часа ЭМИ СВЧ; ОхРарс - клетки, инкубированные с ингибитором; ОхРАРС+ЭМИ - клетки, пред-инкубированные с ингибитором за 15 минут до облучения; * - достоверные отличия от контроля (р<0.05), ** - достоверные отличия от контроля (р<0.01); + -достоверные отличия от группы ЛИС +р < 0.05. п=8.

Таким образом, активация ТЬК4 является определяющей при формировании защитных ответов иммунных клеток на действие бактериального липополисахарида, но не низкоинтенсивного ЭМИ СВЧ. Рецептор ТЬР2 вовлечен в ответы иммунных клеток и при стрессе, вызванном ЭМИ СВЧ, и при воспалении, вызванном грамотрицательными бактериями.

1.2.2. Роль сигиалыюго пути NF-кВ в формировании стрессовых и провоспалнтельных ответов иммунных клеток

Дальнейшие исследования модуляции стрессовых и воспалительных ответов иммунных клеток были проведены с использованием ингибитора канонического сигнального пути NF-кВ, а точнее киназного комплекса, активация которого приводит к фосфорилированию транскрипционного фактора NF-кВ и переносу его в ядро. Как показано на Рис. 4, дальнейшие этапы приводят к активации генов про-воспалительного ответа. В работе был использован IKK Inhibitor XII, селективный, АТФ-конкурирующий ингибитор IKK1, IKK2, IKK3. Пред-инкубация макрофагальных клеток с IKK Inhibitor XII подавляла чувствительность клеток к действию ЛПС, что проявилось как на уровне активации сигнальной трансдукции, так и на уровне продукции всех исследованных цитокинов и оксида азота (Рис. 5). Применение этого ингибитора оказалось более эффективным для ослабления чувствительности иммунных клеток к действию липополисахарида, чем применение ингибитора рецептора TLR4 - CLI095. В облученных макрофагах с предварительно заблокированной активностью классического пути NF-кВ-каскада ЭМИ СВЧ оказывало активирующее действие только на фосфорилирование JNK и, что удивительно, NF-кВ (рис. 7Б). В остальном эти клетки оставались нечувствительными к действию излучения - как на уровне сигнальных белков, так и на уровне синтеза цитокинов и оксида азота (рис. 7А и 7Б). Тот факт, что применение ЭМИ СВЧ приводило к достоверному увеличению фосфорилирования транскрипционного фактора NF-кВ на фоне заблокированной активности главного киназного комплекса классического сигнального пути - IKK (рис. 7Б), потребовало дополнительных исследований механизмов активации сигнального пути NF-кВ в иммунных клетках под действием микроволн. Так как при каноническом пути NF-кВ-сигнализации именно активация 1КК обеспечивает переход этого комплекса в ядро, мы предположили, что ЭМИ СВЧ вызывает запуск альтернативного пути NF-кВ-сигнализации. Известно, что инициация NF-кВ-сигналыюго пути при воздействии ионизирующего излучения не требует участия IKK, а деградация 1кВ и активация NF-кВ происходит при участии казеинкиназы II (CKII) (Kato et al., 2003), как это показано на рисунке 4. Для проверки этой гипотезы мы заблокировали активность CKII в клетках линии RAW 264.7 с использованием CKII Inhibitor III. Как видно из Рис. 9, в клетках со сниженной активностью CKII микроволны не вызывали увеличения продукции главных медиаторов стресса - про-воспалительных цитокинов (рис. 9А), и TLR4 (Рис. 9Б). Тем не менее, микроволны приводили к достоверному увеличению

содержания всех исследованных стрессовых белков и активации сигнальных путей №-кВ, р38, ЖК и ЖБЗ в иммунных клетках с заблокированной активностью СКП (рис. 9Б). Это позволяет сделать вывод о том, что эффекты ЭМИ СВЧ на иммунные клетки опосредованы не только классической, но и СКП-зависимой активацией ОТ-кВ. СКП является регулятором ЭМИ СВЧ-опосредованной активации сигнального пути ЫР-кВ и вносит существенный вклад в выполнение эффекторной функции макрофагов, опосредуя гиперпродукцию про-воспалительных цитокинов при стрессе, вызванном ЭМИ СВЧ.

-эни +эми -эми +эми К СКП Inh III

-ЭМИ *ЭМИ -ЭМИ +ЭМИ

К CKII Inh III

Рисунок 9. Влияние ингибитора CKII (CKII Inhibitor

III) на продукцию цитокинов (А) и сигнальных и

стрессовых белков (Б) в клетках линии RAW 264.7

при стрессе, вызванном ЭМИ СВЧ.

Условные обозначения: - ЭМИ - необлученные клетки, + ЭМИ - клетки, облученные ЭМИ СВЧ. К - контроль, интактные клетки; CKII Inh III - клетки, пред-инкубированные с ингибитором CKII за 1 час до воздействия ЭМИ СВЧ; * - достоверные отличия от группы облученных клеток (р<0.05), ** - достоверные отличия от группы облученных клеток (р<0.01), п=8.

К CKII Inh III

-ЭМИ +ЭМИ -ЭМИ +ЭМИ

100 188 143 140 *

_ __ _ ph-NF-кВ

100 189 27 96

* ' '

--- ph-IKK

100 140 26 80

ph-JNK

100 182 30

118

ph-p38

100 373 56 218

100 152 20 80

* *

100 132 48 127 *

100 124 36 120 *

«штт

ph-IRF3

бАРОН

Таким образом, при реализации неспецифических защитных ответов иммунных клеток на стресс и бактериальный токсин основная эффекторная функция принадлежит сигнальному каскаду М^кВ. Активация этого транскрипционного фактора в условиях стресса, вызванного ЭМИ СВЧ, происходит как по классическому, так и по альтернативному сигнальному пути с участием казеинкиназы 2.

1.2.3. Роль стресс-индуцибельных протеинкиназ ЛЧК и р38 в защитных ответах клетки при стрессе и действии эндотоксина

На следующем этапе работы была исследована роль сигнального каскада ЗАРКЯЫК при формировании неспецифических ответов клетки на стресс и эндотоксин. Для этого мы использовали специфический ингибитор этого сигнального пути - 5Р600125. При воздействии ЛПС на макрофаги с заблокированной активностью сигнального пути БАРКУЖК было обнаружено снижение ЛПС-вызванной активации всех сигнальных белков (Рис. 10Б) и гиперпродукции Т№а, 1Ь-6 и №N7, но не N0 и 1Ы (Рис. 10А). Ингибитор сигнального пути вАРК/ЛМК снижал уровень провоспалительных ответов иммунных клеток на ЛПС, но не устранял их полностью.

f ...

1T1

гН

фф

I о 0.0'

К ЛПС SP600125 С + ЛПС

— — — - TLR4

100 249 106"

•• — — ph-NF-kB <р65)

100 196 139

HSP90

100 шаон 247 83"

— HSP72

100 195 24"

ph-JNK2 (р54) ph-JNK1 (р46)

100 200 24" 100 500 100"

Рисунок 10. Влияние ингибитора JNK (SP600125) на продукцию цитокинов (А) и сигнальных и стрессовых белков (Б) в клетках линии RAW 264.7, культивированных с ЛПС.

Условные обозначения: К - контроль, интактные клетки; ЛПС - клетки, культивированные в присутствии ЛПС; SP600125 - клетки, пред-инкубированные с ингибитором INK за 1 час до добавления ЛПС; * - достоверные отличия от контроля (р<0.05), ** - достоверные отличия от контроля (р<0.01); #р < 0.05, ##р < 0.01 - достоверные отличия от группы ЛПС, п=8.

Исследование возможности модуляции ответов иммунных клеток на ЭМИ СВЧ с помощью SP600125 выявило способность этого ингибитора устранять стимулирующее действие ЭМИ СВЧ на продукцию TLR4, TNFa и IL-6 (Рис. 11 А). Однако применение этого ингибитора не отменяло эффект активации NF-кВ-сигнализации под действием микроволн: в облученных

клетках с заблокированной активностью JNK наблюдалось увеличение фосфорилирования NF-кВ, провоспачительных цитокинов IL-1 и IFN-y и снижение продукции противовоспалительного цитокина IL-10 по сравнению с необлученными макрофагальными клетками (Рис. 11А и Б).

Для изучения роли другого стресс-индуцибельного представителя семейства МАРК - р38 - в формировании ответов иммунных клеток на ЭМИ СВЧ мы использовали специфический ингибитор активности этого белка - р38 Inhibitor XI. Было обнаружено, что в макрофагах линии RAW 264.7 с заблокированной активностью р38 облучение ЭМИ СВЧ вызывает небольшую активацию NF-кВ и JNK (Рис. 11 Б), однако в этом случае не наблюдали стимулирующего действия микроволн ни на продукцию про-воспалительных цитокинов (Рис. НА), ни на экспрессию рецепторного белка TLR4 (Рис. 11 Б). Иными словами, иммунные клетки с заблокированной активностью р38 отличаются отсутствием эффекторных ответов на стрессовое воздействие ЭМИ СВЧ.

Со.« S

т-

pLpiH-^n

** | О-«» **

1 -| ?: I _

I I - I I I

p38

К SP60125 mh XI g

- ЭМИ .Эми ЭМИ -ЭМИ -ЭМИ -ЭМИ

— ————— — TLR4

100 463 354 323 200 118

ph-IKK

100 117 149 '

ph-NF-кВ

-ЭМИ+ЭМИ -ЭМИ *эми -эми+эми

К SP600125 p38 InhXI

-ЭМИ+ЭМИ -ЭМИ +ЗМИ -ЭМИ +ЭМИ

К SP600125 p38 Inh XI

100 239 143 232 52 1 36

100 297 103 42 34 100

ph-JNK2

Рисунок 11. Влияние ингибиторов сигнальных путей МАРК JNK (SP600125) и р38 (р38 Inhibitor XI) на продукцию цитокинов (А) и сигнальных белков (Б) в клетках линии RAW 264.7 при стрессе, вызванном ЭМИ СВЧ. Условные обозначения: - ЭМИ -необлученные клетки, + ЭМИ - клетки, облученные ЭМИ СВЧ. К - контроль, интактные клетки; SP600125 - клетки, пред-инкубированные с ингибитором JNK за 1 час до воздействия ЭМИ СВЧ; р38 Inh XII - клетки, пред-инкубированные с ингибитором р38 за 1 час до воздействия ЭМИ СВЧ; * - достоверные отличия от группы облученных клеток (р<0.05), ** - достоверные отличия от группы облученных клеток (р<0.01), п=8.

Таким образом, можно утверждать, что стресс, вызванный ЭМИ СВЧ, и провоспалительный

ответ, индуцированный ЛПС, приводят к активации сигнального пути SAPK/JNK. Хотя

JNK-сигнализация является важной составляющей частью неспецифического иммунного

ответа, этот сигнальный путь не является определяющим при реализации стрессовых и провоспалительных ответов иммунных клеток. Другой представитель МАРК - р38 -является одним из основных внутриклеточных сенсоров стресса, вызванного низкоинтенсивными электромагнитными волнами.

1.2.4. Роль белка теплового шока 90 в поддержании гомеостаза иммунных

клеток при стрессе

Уникальность белков семейства HSP90 состоит в том, что субстратами для них являются гормоны и сигнальные белки - по этой причине HSP90's способны регулировать большое число сигнальных путей. В работе использовали специфический ингибитор HSP90, гелданамицин (ГА), который с высокой аффинностью соединяется с АТФ-связывающим сайтом HSP90, подавляет активность этого белка, предотвращая созревание различных цитозольных сигнальных белков, ингибирует их активность и влияет на их стабильность. В настоящей работе ГА был использован при исследовании участия белка теплового шока HSP90 в формировании стрессовых ответов иммунных клеток на ЭМИ СВЧ. Эффекты низкоинтенсивных электромагнитных волн на продукцию белков теплового шока, некоторых цитокинов и оксида азота в изолированных макрофагах и лимфоцитах мыши были исследованы в условиях in vitro. Предварительная обработка клеток ГА не устраняла полностью эффекты ЭМИ СВЧ: в этом случае продукция NO, IL-la, и IL-6 была достоверно повышена по сравнению с клетками, облученными без предварительной инкубации с ГА (Рис. 12Б). Облучение клеток, предварительно обработанных ГА, не приводило к активации сигнального пути NF-кВ и увеличению концентрации TLR4 в лимфоцитах селезенки мышей по сравнению с облученными интактными клетками (Рис. 12А). Сниженная активность HSP90 не влияла на способность ЭМИ СВЧ стимулировать SAPK/JNK-сигнализацию в лимфоцитах мышей. В облученных клетках со сниженной активностью HSP90 наблюдалась активация экспрессии HSP70 и его релокализация в мембранные структуры, угнетение продукции HSP25 и увеличение его содержания в цитоплазме и в цитоскелете (данные не показаны).

Снижение общего количества HSP90 в облученных клетках, обработанных ГА, наряду с существенным повышением их иммуногенности и усилением продукции провоспалительных цитокинов и оксида азота, свидетельствует о снижении защитного потенциала клетки.

К ЭМИ ГА ГА +ЭМИ

НЭР25

250

100 37 110 29"

НЗР72

* ЭСП* 701*Л

100 404 260 792

100 80 115 6.4

НЭРЭО

*л

— — ЫР-кВ

рЬМР-кВ

N0 Т^ 11.-1 о ГА □ ЭМИ

11.-6 И-10 IГА+ЭМИ

1-кВ Т1_К4

100 920* 20* 860*Л(Р54) ----¡иЬиПп

Рисунок 12. Влияние гелданамицина и облучения ЭМИ СВЧ (8,15-18 ГГц, 1 м кВт/см2, 1 час) на состояние внутриклеточной сигнализации (А) и на продукцию цитокинов и оксида азота в иммунных клетках мышей (Б).

Условные обозначения: К- контроль, интактные клетки; ЭМИ - облученные иммунные клетки; ГА- иммунные клетки, инкубированные с ГА; ГА+ЭМИ - клетки, инкубированные с гелданамицином за час до облучения ЭМИ СВЧ. * - достоверные отличия от контроля (р<0.05), ** - достоверные отличия от контроля (р<0.01); л -достоверные отличия от группы ГА (р<0.05), АЛ -достоверные отличия от группы ГА (р<0.01).

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что Н5Р90 обеспечивает адекватную защиту иммунокомпетентных клеток от стрессового влияния ЭМИ СВЧ, чье воздействие на изолированные иммунокомпетентные клетки со сниженной активностью защитных белков из семейства НБР90 может спровоцировать патологические нарушения функционирования иммунной клетки.

2. Состояние защитных систем организма млекопитающих при стрессе или воспалении. Способы регуляции их активности 2.1. Провоспалительные ответы при остром и хроническом воспалении у

мышей

В рамках настоящей работы серия экспериментов in vivo была проведена для оценки воспалительных ответов организма в условиях хронической и острой интоксикации мышей линии NMRI липополисахаридом. Острый стресс формировали внутрибрюшинным введением высокой дозы ЛПС (250 мг/100 г веса тела). При моделировании хронической формы воспаления ЛПС вводили ежедневно в течение 11 дней, при этом дозу токсина постепенно увеличивали в пределах от 25 до 250 мг/100 г веса тела.

к 300 = о

я ^

es 200

= § iso

NO IL-1 IL-2 IL-« IL-10 TNF IFN Рисунок 13. Концентрация цитокинов в сыворотке крови, синтез NO макрофагами мышей (панель А) и продукция сигнальных и стрессовых белков в спленоцитах (панель Б) у мышей с острым воспалением, вызванным инъекцией ЛПС.

Измерения проводили через 6 час после введения ЛПС (250 мкг/100 г веса). Каждое значение есть среднее от 3-4-х независимых экспериментов, все измерения проводили индивидуально для каждого животного в 6-ти повторах. Условные обозначения: К - контроль, животные, получающие инъекции физиологического раствора, ОС -введение ЛПС. достоверное отличие от контроля:* -, р< 0,05; ** -р<0,01.

К ОС

TLR4

NF-KB

100 197

- ph-NF-кВ

100 301*

ph-IKK

100 161*

— — ph-JNK

100 976 *

ШЩЩ. HSP72

100 987*

HSP90

100 160*

, ч_ tubulin

Сравнительно более заметные изменения продукции защитных молекул были отмечены при остром воспалении. Показано, что при введении эндотоксина наблюдается резкое увеличение концентрации провоспалительных цитокинов в плазме крови и синтеза оксида азота макрофагами мышей (Рис. 13А). Острое воспаление вызывало также повышение экспрессии белков теплового шока НБР70 и ШР90, рецепторного белка ТЬЯ4 и активацию сигнальных путей №-кВ и ЗАРКЯЫК (Рис. 13Б). Следует отметить, что через 6 часов и даже через 10 дней после однократного введения ЛПС мы обнаружили дисбаланс работы

иммунной системы у мышей, перенесших острое воспаление. Если через 6 часов после инициации острого воспаления иммунная система находилась в состоянии гиперактивации (рис. 13), то через 10 дней после введения ЛПС была обнаружено усиление компенсаторной секреции противовоспалительного цитокина 1Ь-10. Скорость секреции 1Ь-10 и его концентрация в крови нарастала с параллельным снижением содержания медиаторов воспаления и белков теплового шока (данные не показаны).

При моделировании хронического воспаления была прослежена динамика изменения продукции Н8Р70, Н8Р90, про-воспалительных цитокинов, противовоспалительного цитокина 11,-10 и N0 в течение 11-ти дней после начала введения токсина (Рис. 14А и Б). Уровень экспрессии Н5Р70 и ШР90 был гораздо выше при остром процессе, чем на конечном этапе хронического воздействия. Была отмечена корреляция уровней продукции провоспалительных цитокинов и N0 и белков теплового шока. Полученные результаты показали, что при повторяющемся введении увеличивающихся доз эндотоксина в клетках организма снижается способность отвечать на стресс высоким уровнем продукции белков теплового шока и про-воспалительных цитокинов, а также снижением противовоспалительного потенциала иммунных клеток. На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что хроническое воспаление в конечном итоге приводит к развитию «иммунного паралича».

Рисунок 14. Динамика изменения продукции провоспалительных (на примере 1Ь-6 и ТОТ-а) и противовоспалительных (11-10) цитокинов (панель А) и белков теплового шока (панель Б) в иммунных клетках при хроническом воспалении у мышей.

Достоверное отличие от контроля:* -, р< 0,05; ** - р<0,01.

Таким образом, острое воспаление, вызванное у мышей инъекцией ЛПС, характеризуется мобилизацией всех звеньев неспецифического иммунного ответа и приводит к активации как провоспалительных ответов, так и компенсирующих их противовоспалительных реакций. Хроническое воспаление характеризуется ослаблением защитного потенциала

900

250

01 23456789 10 11 время, дни

клеток иммунной системы, которое выражается в постепенном снижении способности клеток продуцировать белки теплового шока, оксид азота и цитокины.

2.2. Исследование возможности регуляции провоспалительных ответов у

мышей при остром воспалении, индуцированном эндотоксином

На следующем этапе работы была исследована возможность регуляции in vivo провоспалительных иммунных ответов с использованием специфических ингибиторов ключевых сенсоров и медиаторов воспаления.

2.2.1. Антитела к ТЬИ4 снижают чувствительность мышей к ЛПС при остром и хроническом воспалении

На первом этапе была исследована возможность модуляции стрессовых ответов клетки на уровне рецептора, связывающего эндотоксин.

К ОС AT

+ос Б

- — TLR4

100 447* 211Л

- —--NF-KB

TNF IL-1 IL-6 IL-10

□ контроль

□ СЮ

Рисунок 15. Влияние инъекции антител к ТЬЯ4 на концентрацию цитокинов в сыворотке крови, синтез N0 макрофагами мышей (панель А) и продукцию сигнальных и стрессовых белков в снленоцитах (панель Б) у мышей с острым воспалением, вызванным ЛПС. Условные обозначения: К - контроль, мыши получившие инъекцию физиологического раствора; ОС - животные после инъекции ЛПС (250 мкг/мышь); АТ+ОС - мыши, получившие инъекцию раствора антител к ТЬЯ4 (25 мкг/мышь) за 1 час до индукции острого стресса. Измерения проводились через 6 час после введения ЛПС. Каждое значение есть среднее от 3-4-х независимых экспериментов, все измерения проводили индивидуально для каждого животного в 6-ти повторах. Контроль - животные, получающие инъекции физиологического раствора. * - достоверное отличие от группы контроль, р< 0,05; л - р < 0.05 - достоверные отличия от группы ОС.

100 161* 98 л

HSP90

100 161* 150

HSP72

100 490 258Л

tubulin

Подход, который использовали для снижения уровня токсических реакций, заключался в попытке регуляции связи эндотоксина со специфическим рецептором, TLR4. Путем иммунизации кролика контрольным пептидом (TLR4 мыши) были получены поликлональные антитела к рецептору и выделена фракция иммуноглобулинов IgG. Выделенная «антисыворотка» обладала высоким титром связывания с TLR4 рецептором. Антитела к рецептору TLR4 были эффективны при их профилактическом введении - они заметно снижали амплитуду токсических реакций у мышей при остром воспалении. Это выражалось в снижении концентрации провоспалительных цитокинов (Рис. 15А) в плазме крови, а также в уменьшении экспрессии стресс-индуцибельных белков теплового шока и рецепторного белка TLR4, и в снижении активации сигнального пути NF-кВ в иммунных клетках мышей (Рис. 15Б). Кроме того, терапия с использованием антител к TLR4 также достоверно уменьшала синдром снижения массы тела животных с хроническим воспалением, вызванным пролонгированным введением ЛПС с возрастающей дозой (данные не показаны). Таким образом, использование методики блокирования связи бактериального токсина со специфическим рецептором TLR4 представляет собой перспективное направление профилактики развития иммунного дисбаланса при остром или хроническом системном воспалении.

2.2.2. Исследование противовоспалительных свойств ингибитора HSP90

Возможность модуляции провоспалительных ответов с использованием специфического ингибитора HSP90 была исследована у мышей-самцов NMR1 при остром воспалении, вызванном ЛПС.

300

400 -

350 -

200 -

250 -

150

100

IL-1 IL-2 IL-6 IL-10 TNF IFN NO

+ *

Рисунок 16. Влияние

гелданамицина и ЛПС на концентрацию цитокинов 11-1, 11-6, 11-10, ТОТ-а, №N-7 в сыворотке крови и продукцию оксида азота (N0) макрофагами мышей. Условные обозначения: по оси ординат - концентрация цитокинов и продукция N0, в % от контроля. Темные столбики - мыши с острым воспалением, прозрачные столбики -здоровые животные после инъекции ГА, заштрихованные столбики -мыши с острым воспалением и инъекцией ГА. *- отличие от контроля, р< 0,05; + - отличие от группы ЛПС, р< 0,05.

Острое воспаление индуцировали инъекцией ЛПС (250 мкг/ 100 г веса мышей), введение гелданамицина (25 мкг на 100 г веса) и ЛПС проводили одновременно. Было установлено, что введение гелданамицина приводит к уменьшению общей интоксикации организма при остром воспалении, вызванном эндотоксином. Так, было обнаружено снижение концентрации цитокинов ШР-а, 1РЫ-у, 1Ь-1, 1Ь-10 в сыворотке крови животных с острым воспалением, получавших гелданамицин, а также нормализацию функциональной активности перитонеальных макрофагов, продуцирующих оксид азота (Рис. 16). Изучение экспрессии рецепторного белка ТП14, а также белков двух сигнальных каскадов ОТ-кВ и БАРКУЖК, показало, что механизмы защитного действия ГА реализуются на уровне подавления экспрессии Т1П4 рецептора, обеспечивающего связывание эндотоксина с клеткой, а также за счет снижения активации сигнальных каскадов №-кВ и 8АРК/ЛЧК (Рис. 17).

К ЛПС ГА ГА+ ЛПС

Т1_К4

100 447 207 113

—- - - I ^-кВ

100 197 194 145

— - - - 1-кВ

100 181 122 108

- - - рЬ-^-кВ

100 301 131 265

— — рЬ-1КК

100 161 62 30

— — - —« рИ^К

Рисунок 17. Влияние инъекций гелданамицина и липополисахарида на состояние внутриклеточной сигнализации иммунных клеток мышей. Условные обозначения: группы мышей: К - контроль; ЛПС - животные, находящиеся в состоянии острого токсического стресса; ГА - здоровые животные после инъекции гелданамицина; ГА+ЛПС - мыши с острым токсическим стрессом и инъекцией гелданамицина; цифры под полосками белков -результаты денситометрии. * - различия достоверны по сравнению с контролем (животные, получившие инъекцию физиологического раствора), р<0,05. А - различия достоверны по сравнению с группой животных, получивших инъекцию ЛПС, п=4.

100 1676 2384 1047

На основе полученных результатов можно предположить, что Н5Р90 играет критическую роль в патогенезе воспаления, вызванного эндотоксином, так как угнетение активности этого стрессового белка приводит к снижению уровня провоспалительного ответа клетки. Во-первых, это происходит на рецепторном уровне - провоспалительный ответ клетки может быть снижен за счет уменьшения экспрессии специфического рецептора ТЬЯ4, во-вторых, на уровне передачи сигнала через каскады ОТ-кВ и ЗАРКДЫК, прямо или опосредовано снижая гиперэкспрессию и фосфорилирование ключевых участников этих путей. И, наконец, блокирование активности НБР90 приводит к некоторому снижению ответа клетки на действие эндотоксина за счет снижения фосфорилирования ОТ-кВ, что

уменьшает вероятность транслокации этого фактора транскрипции в ядро. Все это, как следствие, приводит к снижению общей интоксикации у мышей при остром токсическом стрессе, вызванным введением ЛПС.

Все изложенное позволяет рассматривать ШР90 как возможную терапевтическую мишень при острых воспалениях, индуцированных грамотрицательными бактериями, и указывает на целесообразность поиска новых низкотоксичных ингибиторов активности белка теплового шока НБРЭО.

2.2.3. Регуляция воспалительных ответов у мышей с использованием ингибитора сигнального пути NF-kB

В этой части работы в исследованиях in vivo было изучено противовоспалительное действие синтетического ингибитора ключевого киназного комплекса сигнального пути NF-кВ - IKK Inhibitor XII, который селективно блокирует АТФ-связывающий сайт IKK-1 и IKK-2.

К ОС IKKInhXII Б +ОС

tlr4

0.6 ' 0,5

2 0.4

§■ 0,3

•г [ti

¿J

tnf □ Контроль

il-1 □ ОС

100 309- 21*"

—> HSP72

100 339* 139я UCDQ А

horsu

100 429* 86л

ph-IKK

100 439* 39*л

-- ph-NF-кВ

100 356* 642* 136' 248*а ph-SAPK/JNK

100

—. —- •а— GAPDH

q 100 356* 136«

I IKK Ilih XII + ОС

Рнс.18. Влияние инъекции ингибитора сигнального пути NF-кВ и последующего введения ЛПС (250 мкг/100 г веса) на концентрацию цитокинов в сыворотке крови (А), экспрессию HSP72 и фосфорилирование IKK, NF-кВ, SAPK/JNK в спленоцитах мышей (Б).

Условные обозначения: К - контроль (животные, получившие инъекцию физиологического раствора); ОС - животные, получившие инъекцию ЛПС, IKK Inh XII + ОС - мыши, получившие инъекцию раствора IKK Inhibitor XII (20 мкг/мышь) за 1 час до формирования острого воспаления. * - различия достоверны по сравнению с контролем, р<0,05. А -различия достоверны по сравнению с группой животных, получивших инъекцию ЛПС, п=8.

Было продемонстрировано, что мыши, получившие инъекцию ингибитора IKK (20 мг/кг) за 1 час до введения ЛПС (группа «IKK Inhibitor + ОС»), отличались от животных с острым воспалением (группа «ОС») существенным снижением активации ключевых белков сигнальных путей NF-кВ и SAPK/JNK в иммунных клетках (Рис. 18Б). Кроме того, наблюдалось понижение уровня экспрессии рецепторного белка TLR4, белков теплового шока HSP72 и HSP90 в спленоцитах (Рис. 18Б) и концентрации в сыворотке крови основных медиаторов воспаления - провоспалительных цитокинов IL-1, IFN-y, TNF-a - у мышей группы «IKK Inhibitor + ОС» по сравнению с животными из группы «ОС» (Рис. 18 А).

Таким образом, было показано, что фармакологическое ингибирование NF-кВ-сигнального пути с использованием IKK Inhibitor XII снижает провоспалительные ответы у животных с острым воспалением, вызванным эндотоксином их стенок грамотрицательных бактерий.

2.2.4. ЭМИ СВЧ как регулятор воспалительных ответов у мышей

В этой части работы оценивалась эффективность применения 10-дневного курса ЭМИ СВЧ для защиты организма от последствий острого воспаления, вызванного введением липополисахарида из клеточной стенки Е. coli. Показано, что 10-дневное фракционированное облучение мышей, стартующее после введения ЛПС, влияло на количество иммунокомпетентных клеток (Рис. 19А), цитокин-продуцирующую активность иммунных клеток и концентрацию цитокинов в сыворотке крови (Рис. 19В). При этом наблюдалось угнетение продукции индуцибельных белков теплового шока HSP27 и HSP90 в иммунных клетках облученных мышей по сравнению с необлученной группой. Это является неблагоприятным фактором при иммуносупрессии, к которой приводит острое воспаление (Рис. 19Б). Все вышесказанное указывает на отсутствие иммунотерапевтического действия ЭМИ СВЧ на животных с острым воспалительным процессом.

Интересно, что использование ЭМИ СВЧ в качестве профилактического средства повышало резистентность организма при развитии острого воспаления, способствуя нормализации количества иммунных клеток (Рис. 20А), снижению синтеза провоспалительных цитокинов иммунными клетками и уменьшению их содержания в сыворотке крови (Рис. 20В). На этом фоне благоприятным представляется существенное повышения в макрофагах облученных мышей синтеза оксида азота, который, как известно, способен предотвращать ЛПС-индуцированный апоптоз и обладает прямой антибактериальной активностью (данные не показаны).

200 -

s *

g § 150

2 Q. 1 1 100

50 -

к ос oc R +ЭМИ --- - HSP27

100 137 102

- г---HSP90

100 359* 115*

HSP72

макрофаги спленоциты тимоциты □ контроль о ОС иОС+ЭМИ

юо 93 139

tubulin

0,5

с 2

= 0,4 of

I 0,3 -] р. Р

| 0,2 -х о

0,1 о

TNF IFN IL-1 IL-2 IL-6 IL-10

□ контроль ПОС иОС+ЭМИ

Рис.19. Влияние инъекции ЛПС (250 мкг/100 г веса) и последующего облучения ЭМИ

СВЧ (8,15-18 ГГц, 1 мкВт/см2, 1 час/день в течение 10 дней) на количество

иммунокомпетентных клеток (А), экспрессию белков теплового шока HSP27, HSP72 и

HSP90a спленоцитами мышей (Б) и концентрацию цитокинов в сыворотке крови (В).

Условные обозначения: К - контроль (животные, получившие инъекцию физиологического раствора); ОС - животные, получившие инъекцию ЛПС, ОС+ЭМИ - животные, получившие инъекцию ЛПС и затем облученные. * - различия достоверны по сравнению с контролем, р<0,05. л - различия достоверны по сравнению с группой животных, получивших инъекцию ЛПС, п=8.

Вероятно, эти эффекты связаны со способностью ЭМИ СВЧ стимулировать экспрессию индуцибельных белков теплового шока, обладающих противовоспалительным действием (Рис. 20Б). Известно, что защитное действие HSP's при эндотоксическом шоке особенно высоко в том случае, если организм к моменту инфицирования уже обладал повышенным уровнем экспрессии этих защитных белков. Имеется большое количество работ, подтверждающих, что предварительная индукция HSP70 с помощью тепловых и нетепловых стрессов способствует повышению сопротивляемости организма к действию

ЛПС, церулина и других агентов, вызывающих эндотоксический шок. В отличие от описанных выше способов повышения экспрессии ГОРб, применение низкоинтенсивного ЭМИ СВЧ практически не вызывает побочных эффектов, так как не обладает ни токсическим, ни генотоксическим, ни мутагенным действием.

200

5 R '

К ОС ЭМИ С +ОС

IHSP72

100 150* 261"*

tubulin

макрофаги □ контроль

спленоциты тимоциты □ ос «ос+эми

TNF IFN IL-1 IL-2 IL-6 IL-10 □ контроль ПОС «ОС+ЭМИ

Рис.20. Влияние предварительного облучения ЭМИ СВЧ (8,15-18 ГГц, 1 мкВт/см2, I час/день в течение 10 дней) и последующего введения ЛПС (250 мкг/100 г веса) на количество иммунокомпетентных клеток (А), экспрессию белков теплового шока HSP27, HSP72 и HSP90« (Б) спленоцитами мышей и концентрацию цитокинов в сыворотке крови (В).

Условные обозначения: К - контроль (животные, получившие инъекцию физиологического раствора); ОС - животные, получившие инъекцию ЛПС, ЭМИ+ОС - облученные животные, получившие инъекцию ЛПС после курса ЭМИ СВЧ. * - различия достоверны по сравнению с контролем, р<0,05. л - различия достоверны по сравнению с группой животных, получивших инъекцию ЛПС, п=8.

Таким образом, несмотря на отсутствие лечебного эффекта ЭМИ СВЧ при остром воспалении, вызванном токсином грамотрицательных бактерий, применение сантиметровых волн в качестве профилактического средства при риске бактериального заражения может служить перспективным направлением современной медицины.

Заключение

В работе были изучены и описаны механизмы развития неспецифических защитных ответов на стресс, вызванный низкоинтенсивными электромагнитными излучениями, и на воспаление, индуцированное бактериальным эндотоксином - как на уровне иммунных клеток, так и на уровне организма мышей. Настоящим исследованием было доказано, что ответы иммунных клеток на низкоинтенсивное электромагнитное излучение сантиметрового диапазона можно отнести к стрессовым реакциям клетки, что подтверждалось активацией стресс-индуцибельных сигнальных путей внутриклеточной сигнализации и накоплением классических маркеров стресса в облученных клетках. В работе получены новые сведения об участии стрессовых и сигнальных белков в регуляции стрессовых и провоспалительных ответов в иммунных клетках мышей.

Рис. 21. Особенности иммунного ответа при стрессе, вызванном ЭМИ СВЧ, и воспалении, индуцированном бактериальным эндотоксином.

Было доказано, что и воспалительные, и стрессовые ответы, независимо от природы

вызывающего их сигнала, развиваются как адаптивная реакция, направленная на

восстановление гомеостаза. Там не менее, были выявлены особенности неспецифических

защитных ответов на низкоинтенсивное излучение и на ЛПС грамотрицательных бактерий

(Рис. 21). Во-первых, были обнаружены отличия на уровне сенсоров стресса и воспаления.

Во-вторых, показаны различия на уровне активации неспецифических сигнальных путей при

стрессе и воспалении и обнаружена альтернативная стимуляция сигнального каскада ОТ-кВ

при ответах иммунных клеток на ЭМИ СВЧ. В-третьих, эффекторным ответом иммунной

клетки и организма в целом на слабое излучение являлась адаптация, усиление иммуногенности и противовирусной устойчивости, в то время как иммунный дисбаланс, соответствующий иммунодепрессии, наблюдался в течение длительного времени после контакта иммунных клеток или организма мышей с бактериальным токсином. Использование ингибиторного анализа выявило наличие компенсаторной активации альтернативной неспецифической сигнализации в условиях блокирования каждого из ключевых сигнальных путей защитного ответа иммунных клеток на ЭМИ СВЧ.

Полученные экспериментатьные доказательства роли ключевых рецепторных, сигнальных и стрессовых белков (ТЬК4 и Т1.Я2, ПСКв, р38, СКП, ЯЛРКЛМК, ШР90) в патогенезе воспалительных ответов иммунных клеток позволили разработать новые стратегии коррекции иммунопатологии при системном воспалении у мышей. В ходе дальнейших исследований было показано, во-первых, что применение антителотерапии с использованием поликлональных антител к рецептору ТЪ114 способствует снижению развития провоспалительных реакций у мышей как при остром, так и при хроническом воспатении. Во-вторых, было установлено, что фармакологическое ингибирование сигн&тьного пути Т^-кВ также является перспективным направлением коррекции иммунного дисбаланса при остром воспалении у мышей. В-третьих, были получены доказательства, позволившие рассматривать белок теплового шока Н5Р90а как возможную терапевтическую мишень при острых токсических стрессах, индуцированных эндотоксином. Кроме того, в настоящей работе продемонстрированы молекулярные механизмы защитного действия ЭМИ СВЧ при развитии острого воспаления у мышей, что позволяет рекомендовать применение сантиметровых волн в качестве профилактического средства при риске бактериального заражения.

Резюмируя все вышеизложенное, можно утверждать, что настоящая работа вносит существенный вклад в современное понимание механизмов развития стрессовых и воспалительных ответов в иммунных клетках и функционирования системы врожденного иммунного ответа в целом.

Выводы

1. Стресс, вызванный воздействием низкоинтенсивного ЭМИ СВЧ, и воспаление, индуцированное ЛПС, вызывают активацию сигнальных путей врожденного иммунитета.

2. Активация рецептора ТЬЯ-4 является ключевым звеном при формировании защитных ответов иммунных клеток на действие бактериального токсина, но не низкоинтенсивного ЭМИ СВЧ. Рецептор ТЬЯ-2 вовлечен в ответы иммунных клеток и при стрессе, вызванном

ЭМИ СВЧ, и при воспалении, вызванном токсином грамотрицательных бактерий.

3. В реализации неспецифических защитных ответов иммунных клеток на стресс и воспаление основная эффекторная функция принадлежит сигнальному каскаду ОТ-кВ. Активация этого транскрипционного фактора в условиях стресса, вызванного ЭМИ СВЧ, происходит как по классическому, так и по альтернативному сигнальному пути с участием казеинкиназы 2.

4. Стресс, вызванный ЭМИ СВЧ, и воспаление, индуцированное эндотоксином, приводят к активации сигнальных путей ЯАРКШК. и р38. Установлено, что р38 является одним из основных внутриклеточных сенсоров стресса, вызванного низкоинтенсивными электромагнитными волнами.

5. Показано, что белок теплового шока ШР90а участвует в поддержании стабильности реакций врожденного иммунного ответа на низкоинтенсивное электромагнитное излучение СВЧ-диапазона и является ключевым регулятором в патогенезе провоспалительного ответа, вызванного эндотоксином.

6. Установлено, что ингибирование экспрессии ПЯР90а снижает общую интоксикацию организма мышей при остром воспалении, вызванном эндотоксином, что позволяет рассматривать НХР90а как терапевтическую мишень при острых воспалениях, индуцированных токсином грамотрицательных бактерий.

7. Установлено, что острое системное воспатение, вызванное эндотоксином, характеризуется мобилизацией всех звеньев неспецифического иммунного ответа и приводит к активации как провоспалительных ответов, так и компенсирующих их противовоспалительных реакций. Хроническое воспатение характеризуется ослаблением защитного потенциата клеток иммунной системы, которое выражается в постепенном снижении способности клеток продуцировать белки теплового шока, оксид азота и цитокины.

8. Терапия с использованием антител к рецептору ТЬЯ4 у животных с хроническим воспалением снижает ЛПС-индуцированную гиперпродукцию провоспалительных цитокинов, стресс-индуцибельных белков теплового шока ШР70 и ШР90 и рецепторного белка ТЬ114, а также уменьшает синдром снижения массы тела.

9. Ингибирование активности 1ККа/р снижает уровень воспалительных реакций у животных с острым воспалением, вызванным эндотоксином из стенок грамотрицательных бактерий.

10. Профилактическое применение курса облучения ЭМИ СВЧ повышает резистентность организма при развитии острого воспаления, вызванного эндотоксином, что указывает на перспективность применения сантиметровых волн в качестве профилактического средства при риске бактериального заражения.

Список публикаций по теме диссертации Публикации в рецензируемых журналах

1. Novoselova, E.G. The Tumor Necrosis Factor Production in Cells of Tumor-Bearing Mice After Total-Body Microwave Irradiation and Antioxidant Diet and microwave radiation / E.G. Novoselova, V.B. Ogay, O.V. Sorokina, O.V. Glushkova, O.A. Sinotova, E.E. Fesenko // Electromagnetic in Biology and Medicine. - 2004. - V. 23 (2). - P. 177 -190.

2. Синотова, O.A. Сравнение эффектов электромагнитного излучения КВЧ- и СВЧ-диапазонов на продукцию фактора некроза опухолей в клетках мышей / O.A. Синотова, Е.Г. Новоселова, О.В. Глушкова, Е.Е. Фесенко // Биофизика. - 2004. - № 49 (3). - С. 545-550.

3. Новоселова, Е.Г. Стрессовый ответ клетки на воздействие сверхслабого электромагнитного излучения / Е.Г. Новоселова, О.В. Глушкова, O.A. Синотова, Е.Е. Фесенко // Доклады Академии Наук. - 2005. - № 401 (1). - С. 95-98.

4. Глушкова, О.В. Иммунные ответы организма при токсических стрессах / О.В. Глушкова, Е.Г. Новоселова, Д.А. Черенков, Т.В. Новоселова, Е.Е. Фесенко // Медицинская иммунология. - 2005. - №7(2-3). - С. 219-220.

5. Черенков, Д.А. Влияние низкоинтенсивного электромагнитного излучения разных частотных диапазонов на систему клеточного иммунитета млекопитающих (мышей) / Д.А. Черенков, О.В. Глушкова, Е.Г. Новоселова, В.И. Юсупов, В.М. Чудновский, Е.Е. Фесенко // Медицинская иммунология. - 2005. -№ 7 (2-3). - С. 330.

6. Новоселова, Е.Г. Продукция белков теплового шока, цитокинов и оксида азота при токсическом стрессе / Е.Г. Новоселова, О.В. Глушкова, Д.А. Черенков, С.Б. Парфенюк, Т.В. Новоселова, И.В. Гужова, Б.А. Маргулис, Е.Е. Фесенко // Биохимия. - 2006. - № 71 (4). - С. 471-480.

7. Глушкова, О.В. Иммунокорректирующее действие низкоинтенсивных неионизирующих излучений при эндотоксическом шоке / О.В. Глушкова, Е.Г. Новоселова, Д.А. Черенков, Т.В. Новоселова, М.О. Хренов, С.М. Лунин, С.Б. Парфенюк, Е.Е. Фесенко // Медицинская иммунология. - 2006. - № 8 (2-3). - С. 130-132.

8. Хренов, М.О. Роль транскрипционных факторов в ответе изолированных лимфоцитов мышей на действие низкоинтенсивного электромагнитного и лазерного излучений / М.О. Хренов, Д.А. Черенков, О.В. Глушкова, Т.В. Новоселова, С.М. Лунин, С.Б. Парфенюк, Е.А. Лысенко, Е.Г. Новоселова, Е.Е. Фесенко // Биофизика. - 2007. - № 52 (5). - С. 888-892.

9. Глушкова, О.В. Влияние ЭМИ СВЧ на состояние иммунной системы мышей при эндотоксическом шоке / О.В. Глушкова, Е.Г. Новоселова, Д.В. Черенков, Т.В. Новоселова, С.М. Лунин, М.О. Хренов, С.Б. Парфенюк, Е.Е. Фесенко. // Биофизика. - 2007. - № 52 (5). -С. 938-946.

10. Новоселова, Е.Г. Защитный эффект низкоинтенсивного лазерного излучения в условиях острого токсического стресса / Е.Г. Новоселова, О.В. Глушкова, М.О. Хренов, Д.А. Черенков, С.М. Лунин, Т.В. Новоселова, В.М. Чудновский, В.И. Юсупов, Е.Е. Фесенко // Биофизика. - 2007. - № 52 (1). - С. 137-140.

11. Новоселова, Е.Г. Гелданамицин снижает уровень стрессового ответа, индуцированного низкоинтенсивным лазерным излучением / Е.Г. Новоселова, О.В. Глушкова, М.О. Хренов, Т.В. Новоселова, С.М. Лунин, Д.А. Черенков, Е.Е. Фесенко // Доклады Академии наук. - 2007. - № 4. - С. 564 -567.

12. Глушкова, О.В. Роль белков теплового шока БТШ90 в ответах иммунных клеток на электромагнитное излучение сверхвысоких частот/ О.В. Глушкова, Е.Г. Новоселова, М.О. Хренов, Т.В. Новоселова, Д.А. Черенков, С.М. Лунин, Е.Е. Фесенко // Биофизика. - 2008. -№53(1).-С. 93-99.

13. Новоселова, Е.Г. Участие рецептора TLR4 в формировании стрессового ответа лимфоцитов / Е.Г. Новоселова, М.О. Хренов, Д.А. Черенков, О.В. Глушкова, Т.В. Новоселова, С.М. Лунин, Е.А. Лысенко, Е.Е. Фесенко // Биофизика. - 2008. - № 53(3). - С. 457-461.

14. Новоселова, Т.В. Влияние гелданамицина на экспрессию сигнальных белков и белков теплового шока в нормальных лимфоцитах мышей / Т.В. Новоселова, Д.А. Черенков, М.О. Хренов, О.В. Глушкова, С.М. Лунин, Е.Г. Новоселова, Е.Е. Фесенко // Цитология. - 2008. -№50(7).-С. 629-635.

15. Novoselova, E.G. Naturally occuring antioxidants nutrients reduce inflammatory response in mice / E.G. Novoselova, S.M. Lunin, T.V. Novoselova, M.O. Khrenov, O.V. Glushkova, N.V. Avkhacheva, V.G. Safronova, E.E. Fesenko // European Journal of Pharmacology. - 2009. - № 615.-P. 234-240.

16. Черенков, Д.А. Роль протеинкиназы SAPK/JNK в ответах клетки на воздействие низкоинтенсивных неионизирующих излучений / Д.А. Черенков, Е.Г. Новоселова, М.О. Хренов, О.В. Глушкова, С.М. Лунин, Т.В. Новоселова, Е.Е. Фесенко // Биофизика. - 2009. -№ 54 (2). - С. 256-259.

17. Глушкова, О.В. Роль белка теплового шока hsp 90 в формировании защитных ответов при остром токсическом стрессе / О.В. Глушкова, Т.В. Новоселова, М.О. Хренов, С.Б. Парфенюк, С.М. Лунин, Е.Е. Фесенко, Е.Г. Новоселова // Биохимия. - 2010. - № 75 (6). -С. 789-795.

18. Хренов, М.О. Экспрессия стрессовых и сигнальных белков макрафагальными клетками линии RAW 264.7 при токсическом стрессе / М.О. Хренов, С.Б. Парфенюк, О.В. Глушкова, Т.В. Новоселова, С.М. Лунин, Е.Г. Новоселова // Цитология. - 2011. - № 53 (9).

-С. 718.

19. Новоселова, Т.В. Способы регулирования активности сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK при остром воспалснии у мышей / Т.В. Новоселова, О.В. Глушкова, М.О. Хренов, С.М. Лунин, С.Б. Парфенюк, Е.Г. Новоселова // Цитология. - 2011. - № 53 (9). - С. 712.

20. Lunin, S.M. Thymus hormones regulate activity of RAW 264.7 macrophage cells: Inhibitory analysis and a role of signal cascades / S.M. Lunin, O.V. Glushkova, T.V. Novoselova, M.O. Khrenov, E.E. Fesenko, E.G. Novoselova // Expert Opinion On Therapeutic Targets. - 2011. -Vol. 15 (12).-P. 1337-1346.

21. Glushkova, O.V. Inhibitors of TLR-4, NF-кВ, and SAPK/JNK signaling reduce the toxic effect of lipopolysaccharide on RAW 264.7 cells / O.V. Glushkova, S.B. Parfenyuk, M.O. Khrenov, T.V. Novoselova, S.M Lunin., Fesenko E.E., Novoselova E.G. // J Immunotoxicol. -2013.-Vol. 10(2).-P. 133-140.

22. Новоселова, Т.В. Влияние in vitro и in vivo ряда ингибиторов сигнальных каскадов на продукцию цитокинов и сигнальных белков в макрофагах RAW 264.7 и в лимфоцитах мышей / Т.В. Новоселова, О.В. Глушкова, С.Б. Парфенюк, М.О. Хренов, С.М Лунин., Т.П. Смолихина, Е.Е. Фесенко, Е.Г. Новоселова // Биофизика. - 2014. -X» 59(1). - С. 112 - 117.

23. Novoselova, E.G. Anti-inflammatory effects of IKK Inhibitor XII, thymulin, and fat-soluble antioxidants in LPS-treated mice / E.G. Novoselova, M.O. Khrenov, O.V. Glushkova, S.M. Lunin, S.B. Parfenyuk, T.V. Novoselova, E.E. Fesenko // Mediators of Inflammation. - 2014. - 2014724838.

24. Glushkova, O.V. The role of the NF-кВ, SAPK/JNK, and TLR4 signalling pathways in the responses of RAW 264.7 cells to extremely low-intensity microwaves / O.V. Glushkova, M.O. Khrenov, T.V. Novoselova, S.M. Lunin, S.B. Parfenyuk, S.I. Alekseev, E.E. Fessenko, E.G. Novoselova // Int J Radiat Biol. - 2015. - Vol. 91(4) - P. 321 - 328.

25. Lunin, S.M. Modulation of inflammatory response in mice with severe autoimmune disease by thymic peptide thymulin and an inhibitor of NF-kappaB signaling / S.M. Lunin, M.O. Khrenov, T.V. Novoselova, S.B. Parfenyuk, O.V. Glushkova, E.E. Fesenko, E.G. Novoselova // Int Immunopharmacol. - 2015. - № 25(2). - P. 260-266.

26. Глушкова, О.В. Роль протеинкиназы СК2 в стрессовом ответе макрофагов RAW 264.7 /

0.В. Глушкова, М.О. Хренов, Т.В. Новоселова, С.М. Лунин, Е.Е. Фесенко, Е. Г. Новоселова //Доклады Академии наук. - 2015.-№ 462 (6). - С. 7 -7 .

Статьи в сборниках

1. Новоселова, Е.Г. Участие сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK в регуляции

ответа клетки на стресс / Е.Г. Новоселова, М.О. Хренов, О.В. Глушкова, Т.В. Новоселова, С.М. Лунин // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» / Под ред. В.П. Зинченко и др. - Пущино, 2009. - № 2. - С. 474-478.

2. Парфенюк, С.Б. Роль некоторых сигнальных каскадов и TLR4 рецептора в стрессовом ответе клеток RAW 264.7 на действие токсинов разной природы / С.Б. Парфенюк, О.В. Глушкова, М.О. Хренов, Т.В. Новоселова, С.М. Лунин, Е.Г. Новоселова // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» / Под ред. В.П. Зинченко и др. - Пущино, 2011. -№2. - С. 601-606.

3. Хренов, М.О. Роль сигнального каскада NF-кВ при защите животных in vivo от острого токсического стресса / М.О. Хренов, О.В. Глушкова, Т.В. Новоселова, С.Б. Парфенюк, С.М. Лунин, Е.Г. Новоселова // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» / Под ред. В.П. Зинченко и др. - Пущино, 2013. - №2. - С. 616-621.

Тезисы докладов

1. Glushkova, O.V. The biological effects of high-frequency electromagnetic waves / O.V. Glushkova, O.A. Sinotova, E.G. Novoselova // 2nd International workshop on biological effects of EMFs: Proceedings. - Rhodes, Greece, 2002. - № 2. - P. 1032.

2. Глушкова, О.В. Влияние слабых электромагнитных волн на экспрессию БТШ 72 при опухолевом росте у мышей / О.В. Глушкова, О.В. Сорокина // 7-ая конференция молодых ученых "Биология - наука 21го века": Тезисы. - Пущино, 2003. - С. 15.

3. Glushkova, O.V. Stress proteins as the mediators of high-frequency electromagnetic wave effects / O.V. Glushkova, E.G. Novoselova // 6th International Congress of the European Bioelectromagnetics Association (EBEA): Proceedings. - Budapest, Hungary, 2003. - P.107.

4. Новоселова, Е.Г. Перспективы использования сверхслабых электромагнитных излучений для коррекции иммунодефицитных состояний у млекопитающих. / Е.Г. Новоселова, О.А. Синотова, О.В. Глушкова, В.Б. Огай, Е.Е. Фесенко // Международный Конгресс "Прогрессивные научные технологии для здоровья человека": Тезисы. - Кара-Даг (Крым), Украина, 2003. - С. 111- 113.

5. Новоселова, Е.Г. Иммуномодулирующие эффекты низкоинтенсивных электромагнитных излучений / Е.Г. Новоселова, О.В. Глушкова, Д.А. Черенков, О.А. Синотова, Е.Е. Фесенко // III Съезд биофизиков России: Тезисы. - Воронеж, 2004. - С. 693694.

6. Glushkova, O.V. Extremely low-intensity electromagnetic microwaves as corrector of mammals immunopathology / O.V.Glushkova, E.G. Novoselova // 17th International Wroclaw

Symposium and Exhibition on Electromagnetic Compatibility: Proceedings. - Wroclaw, Poland, 2004.-C. 67-69.

7. Sinotova, O.A. Differential effects of centimeter and millimeter waves on antibody production in mice / O.A. Sinotova, E.G. Novoselova, O.V. Glushkova // 17th International Wroclaw Symposium and Exhibition on Electromagnetic Compatibility: Proceedings. - Wroclaw, Poland, 2004.-C. 70- 73.

8. Glushkova, O.V. Correction of immunopathology by low-intensity electromagnrtic microwaves / O.V Glushkova., E.G. Novoselova // Euro Electromagnetics (EUROEM): Proceedings. - Magdeburg, Germany, 2004. - P. 46-47.

9. Glushkova, O.V. Stress cellular response induced by weak microwave irradiation / O.V. Glushkova, E.G. Novoselova, O.A. Sinotova // Euro Electromagnetics (EUROEM): Proceedings. - Magdeburg, Germany, 2004. - P. 45.

10. Sinotova, O.A. Cytokines and nitric oxide production in immune cells / O.A. Sinotova, E.G. Novoselova, O.V. Glushkova // Euro Electromagnetics (EUROEM): Proceedings. - Magdeburg, Germany, 2004. - P. 45-46.

11. Glushkova, O.V. The role of heat shock protein 70 in adaptation to nonionizing radiation / O.V. Glushkova, M.O. Khrenov, D.A. Cherenkov, T.V. Novoselova, S.M. Lunin, E.G. Novoselova // VIII world congress of international society for adaptive medicine (ISAM): Proceedings. - Moscow, Russia, 2006. - P. 101-102.

12. Novoselova, T.V. Comparative study of immune cell functions in acute and chronic models of toxic stress / T.V. Novoselova, M.O. Khrenov, S.M. Lunin, D.A. Cherenkov, O.V. Glushkova, E.G. Novoselova // VIII world congress of international society for adaptive medicine (ISAM): Proceedings. - Moscow, Russia, 2006. - P. 121.

13. Новоселова, T.B. Исследование продукции цитокинов и оксида азота при токсическом стрессе / Т.В. Новоселова, С.М. Лунин, М.О. Хренов, О.В. Глушкова, Д.А. Черенков, С.Б. Парфенюк // 10-ая конференция молодых ученых "Биология - наука 21 го века": Тезисы. - Пущино, 2006. - С. 116.

14. Новоселова, Т.В. Роль цитокинов и оксида азота в развитии окислительного стресса, индуцированного эндотоксином / Т.В. Новоселова, О.В. Глушкова, С.М. Лунин, М.О. Хренов, Д.А. Черенков, Е.Г. Новоселова // Всероссийская конференция молодых ученых и II школа им. Академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты»: Тезисы. - Москва, 2006. - С. 182-184.

15. Хренов, М.О. Защитная роль антиоксидантов при окислительном эндотоксическом стрессе / М.О. Хренов, О.В. Глушкова, Д.А. Черенков, Т.В. Новоселова, С.М. Лунин // Всероссийская конференция молодых ученых и II школа им. Академика Н.М. Эммануэля

«Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты»: Тезисы. - Москва, 2006. - С. 201-202.

16. Новоселова, Е.Г. Окислительный стресс при хронических воспалениях: снижение токсического повреждения путем антиоксидантной защиты / Е.Г. Новоселова, О.В. Глушкова, Д.А. Черенков, Т.В. Новоселова, С.М. Лунин, М.О. Хренов // Второй международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии»: Тезисы. - Судак, Крым, Украина, 2006. - С. 136-137.

17. Новоселова, Е.Г. Антиоксиданты и токсический стресс: участие белков теплового шока, цитокинов и оксида азота / Е.Г. Новоселова, О.В. Глушкова, С.М. Лунин, Т.В. Новоселова, М.О. Хренов, Д.А. Черенков, Е.Е. Фесенко // XIV Международная конференция «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии»: Сборник материалов.- Украина, 2006 - С. 408-410.

18. Новоселова, Е.Г. Участие гелданамицина в регуляции стрессового ответа клетки и в экспрессии некоторых сигнальных белков / Е.Г. Новоселова, О.В. Глушкова, С.М. Лунин, Т.В. Новоселова, М.О. Хренов, Д.А. Черенков, Е.А. Лысенко, Е.Е. Фесенко // XV международная конференция и дискуссионный научный клуб «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии»: Тезисы. - Ялта-Гурзуф, Украина, 2007. - С. 304-306.

19. Хренов, М.О. Участие NF-кВ и SAPK/JNK в ответе лимфоцитов мышей на действие низкоинтенсивного электромагнитного и лазерного излучений / М.О. Хренов, Д.А. Черенков, О.В. Глушкова, Е.А. Лысенко, Т.В. Новоселова, С.М. Лунин, Е.Г. Новоселова // 11-я международная конференция молодых ученых "Биология - наука 21го века": Тезисы. -Пущино, 2007.-С. 22.

20. Лысенко, Е.А. Влияние тимусных гормонов на продукцию беков теплового шока при остром токсическом стрессе / Е.А. Лысенко, С.М. Лунин, М.О. Хренов, Д.А. Черенков, О.В. Глушкова, Т.В. Новоселова // 11-я международная конференция молодых ученых "Биология - наука 21го века": Тезисы. - Пущино, 2007. - С. 260 - 261.

21. Новоселова, Т.В. Экспрессия белков теплового шока и сигнальных белков в лимфоцитах мышей при действии гелданамицина / Т.В. Новоселова, Д.А. Черенков, М.О. Хренов, О.В. Глушкова, С.М. Лунин, Е.Е. Фесенко, Е.Г. Новоселова // 11-я международная конференция молодых ученых "Биология - наука 21-го века": Тезисы. - Пущино, 2007. - С. 153.

22. Новоселова, Е.Г. Исследование молекулярных механизмов функционирования защитных систем клетки при системном воспалительном синдроме и сепсисе у мышей. Поиск новых направлений лечения / Е.Г. Новоселова, С.М. Лунин, М.О. Хренов, Т.В. Новоселова, О.В. Глушкова, С.Б. Парфенюк // Фундаментальные науки - медицине.

Доклады на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы в 2008 году: Тезисы. - Москва, 2008. - С. 36-37.

23. Глушкова, О.В. Защитные антистрессовые эффекты слабых электромагнитных волн / О.В. Глушкова // Пятый международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии»: Тезисы. - Судак, Крым, Украина, 2009. - С. 81.

24. Новоселова, Е.Г. Исследование молекулярных механизмов функционирования защитных систем клетки при системном воспалительном синдроме и сепсисе у мышей. Поиск новых направлений лечения / Е.Г. Новоселова, О.В. Глушкова, С.М. Лунин, М.О. Хренов, Т.В. Новоселова, С.Б. Парфенюк // Фундаментальные науки - медицине. Доклады на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы в 2010 году: Тезисы. -Москва, 2010,- С. 22-24.

25. Новоселова, Е.Г. Роль сигнальных каскадов в ответе клеток на действие in vivo и in vitro сверхслабых электромагнитных волн сантиметрового диапазона / Е.Г. Новоселова, О.В. Глушкова, М.О. Хренов, С.Б. Парфенюк, Т.В. Новоселова, С.М. Лунин, Е.Е. Фесенко // IV Съезд биофизиков России: Тезисы. - Нижний Новгород, 2012. - №3. - С.180.

26. Глушкова, О.В. Роль сигнальных и защитных белков в механизмах адаптации иммунной системы мышей к изменению гравитации / О.В. Глушкова, С.М. Лунин, М.О. Хренов, С.Б. Парфенюк, Т.В. Новоселова, Е.Г. Новоселова // Девятый международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии»: Тезисы. - Судак, Крым, Украина, 2013. - С. 112-113.

27. Новоселова, Е.Г. Стрессовые ответы низкоинтенсивных электромагнитных волн в иммунных клетках / Е.Г. Новоселова, С.М. Лунин, М.О. Хренов, О.В. Глушкова, Т.В. Новоселова, С.Б. Парфенюк // Одиннадцатый международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии»: Тезисы. - Судак, Крым, Россия, 2015. -С. 298.

28. Новоселова, Т.В. Влияние ингибиторов сигнальных каскадов на продукцию цитокинов и сигнальных белков в макрофагах RAW 264.7 и в лимфоцитах мышей / Т.В. Новоселова, О.В. Глушкова, С.Б. Парфенюк, М.О. Хренов, С.М. Лунин, Е.Г. Новоселова // Одиннадцатый международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии»: Тезисы. - Судак, Крым, Россия, 2015. - С. 299.

Список сокращений и обозначений

АФК - активные формы кислорода, ГА - гелданамицин, ИФА - иммуноферментный анализ, ЛПС - липополисахарид,

ЭМИ СВЧ - электромагнитное излучение сверхвысокой частоты, ЭМП - электромагнитное поле,

АР-1 - транскрипционный фактор, активирующий белок -1 CKII - казеинкиназа II,

HSP - белки теплового шока (англ. Heat shock protein), HSP - белок теплового шока (англ Heat Shock Protein), IFN - интерферон (англ. Interferron), IKK - киназа 1кВ (англ. IkappaB kinase), IL - интерлейкин (англ. Interleukin),

IRF - транскрипционный фактор, регулирующий фактор интерферона,

JNK - киназа N-конца c-Jun (англ c-Jun N-terminal kinase),

МАРК - митоген-активируемые протеинкиназы,

NF-kB - ядерный фактор каппа-Би (англ. Nucear Factor),

NO - оксид азота (II),

РАМР - паттерн-распознающие рецепторы,

SAPK - стресс-активируемая протеинкиназа (англ. Stress-activated protein kinase),

TLR - То11-подобный рецептор (англ Toll-like receptor),

TNF - фактор некроза опухолей (англ. Tumor necrosis factor).

Подписано в печать 29.05.2015г. Печать лазерная

Заказ № 5002 Тираж: 100 экз.

Типография «ПхРгтЬ) ИНН 503900523316 142290, Пущино, м-н «АБ», 18а (4967) 75-97-84 www.fix-print.ru