Роль тимусных пептидов в регуляции иммунного гомеостаза в условиях системного воспаления

Лунин, Сергей Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль тимусных пептидов в регуляции иммунного гомеостаза в условиях системного воспаления
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль тимусных пептидов в регуляции иммунного гомеостаза в условиях системного воспаления"

На правах рукописи

Лунин Сергей Михайлович

РОЛЬ ТИМУСНЫХ ПЕПТИДОВ В РЕГУЛЯЦИИ ИММУННОГО ГОМЕОСТАЗА В УСЛОВИЯХ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛЕНИЯ

Биохимия 03.01.04 Биофизика 03.01.02

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

13 ФЕВ 2014

Пущино — 2014

005545036

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биофизики клетки Российской академии наук, лаборатория механизмов рецепции.

Научные консультанты: Новоселова Елена Григорьевна

Фесенко Евгений Евгеньевич

доктор биологических наук, профессор

член-корр. РАН, доктор биологических, наук, профессор

Официальные оппоненты

Годухин Олег Викторович доктор биологических наук, профессор

зам. директора, зав. лабораторией экспериментальной нейробиологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Киселева Нина Михайловна доктор биологических наук

доцент кафедры фармакологии педиатрического факультета Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздрава Российской Федерации

Зякун Анатолий Маркович доктор биологических наук

зав. лабораторией масс-спектрометрического мониторинга Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, лаборатория физико-химических основ регуляции биологических систем

Защита диссертации состоится Щ 2014 года в ч. мин

на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино Московская область, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Пущинского научного центра РАН. Автореферат разослан« » 2014 года

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Смолихина Татьяна Ивановна

Введение

Актуальность и степень разработанности темы. Тимус или вилочковая железа - это центральный орган иммунной системы, в котором предшественники Т-лимфоцитов претерпевают сложнейший процесс дифференцировки и селекции, приводящий, в конечном итоге, к миграции прошедших селекцию и развивших необходимые функциональные механизмы клеток в периферические лимфоидные органы, такие как селезенка, лимфатические узлы, пейеровы бляшки и миндалины (Anderson, 1996). Эпителиальные клетки тимуса секретируют множество факторов, влияющих на незрелые Т-лимфоциты и способствующих различным этапам их созревания: хемокины, цитокины, ростовые факторы, которые создают оптимальные условия для созревания тимоцитов.

Тимус является эндокринным органом, и клетки его эпителия продуцируют ряд пептидных гормонов, которые действуют не только внутри тимуса, но и попадают в систему кровообращения (McClure et al, 1982, Bodey et al, 1997). Нужно отметить, что внетимусные, периферические функции тимусных гормонов стали изучаться относительно недавно (около 10 лет назад), и наша лаборатория явилась одним из пионеров этих исследований (Safieh-Garabedian et al., 2002, Lunin et al., 2008). Ранее, когда тимусные гормоны рассматривались как внутритимусные регуляторы, их терапевтическое применение ограничивалось заболеваниями, связанными с Т-клеточными дисфункциями. Однако исследования, проводимые в последнее время несколькими группами ученых по всему миру, включая нашу лабораторию, показывают, что тимусные гормоны влияют не только на внутритимусное созревание лимфоцитов, как считалось ранее, но также способны регулировать активность зрелых иммунных клеток, в том числе, при воспалительных реакциях (Lunin et al., 2008, Saitoh et al, 2004, Safieh-Garabedian et al., 1994). Ранее мы показали, что разные тимусные гормоны проявляют различные иммуномодулирующие свойства,. В частности, было установлено, что тимопентин оказывает стимулирующее действие на неактивированные иммунные клетки, тогда как тимулин подавляет ответ клеток, активированных эндотоксином (Лунин, канд. дисс., 2008). Вместе с тем, было продемонстрировано взаимодействие некоторых тимусных пептидов и ряда нейроэндокринных систем, что указывает на интеграцию тимуса в нейроэндокринные системы и, в первую очередь, в систему регуляции стрессового ответа, в качестве которой обычно рассматривают гипоталамо-гипофизарно-адреналовую ось (Киселева, 2013; Molinero et al., 2000). Таким образом, тимусные гормоны обладают

гораздо более широким спектром эффектов, чем считалось ранее, и появились указания на существование неописанной ранее системы регуляции иммунного ответа с участием нескольких разных гормонов тимуса, которая, по нашей гипотезе, может быть частью общей нейроэндокринной системы регуляции воспалительных ответов.

Проведенные к настоящему моменту исследования во многом неполны, и не дают ответов на многие важные вопросы. В частности, ограничивается ли влияние тимусных гормонов только лимфоцитарной системой, обеспечивающей адаптивный иммунитет, или же эти эффекты носят более универсальный характер, регулируя также активность клеток врожденного иммунитета. Кроме этого, подавляющее большинство проведенных исследований влияния тимусных пептидов на воспалительные реакции были связаны с острыми краткосрочными ответами иммунных клеток на бактериальные клетки или токсины. Между тем, воспаления являются сложными, часто длительными процессами системного характера, вовлекающими практически все системы организма и, прежде всего, они сопровождаются нарушениями регуляции иммунной системы (Alexander et al., 1994). В качестве примеров можно назвать системные воспалительные синдромы, такие как сепсис, или аутоиммунные заболевания. Терапия воспалений, вызванных инфекциями, направлена, в первую очередь, на уничтожение микроорганизмов. Вместе с тем, другим подходом к терапии различных инфекционных, а также стерильных воспалительных и аутоимунных заболеваний является также подавление «чрезмерных» ответов иммунных клеток (Gilroy et al., 2004, Kortylewski et al., 2007). Цель такой модулирующей терапии состоит в восстановлении баланса между провоспалительными и антивоспалительными медиаторами. Последние исследования показывают, что модуляция иммунного и воспалительного ответа дает значительные преимущества при лечении различных воспалительных заболеваний (Ryan et al., 2002). До сих пор имеется очень мало сведений о роли тимусных пептидов в регуляции таких хронических системных патологий. Поскольку тимусные гормоны интегрированы в нейроэндокринные системы и в систему стрессового ответа, и как показывают наши предварительные данные (Лунин, канд. дисс., 2008), способны модулировать активность зрелых иммунных клеток, представляет интерес изучить их применение для коррекции иммунного дисбаланса в условиях хронических воспалений.

Кроме того, имеется большой пробел в области исследования молекулярных механизмов действия тимусных гормонов на иммунные клетки. До сих пор неизвестны

первичные мишени (рецепторы) этих гормонов, и почти неизучена роль внутриклеточной сигнализации в регуляции активности иммунных клеток тимусными пептидами.

Цель и основные задачи. Целью настоящей работы является исследование регуляции системного воспалительного ответа пептидными гормонами тимуса и изучение эффективности их применения для коррекции воспалительных патологий, связанных с нарушением иммунного гомеостаза. В рамках этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние тимусных пептидов тимулина и тимопоэтина на клетки системы врожденного иммунитета (макрофаги) in vitro в условиях исключения влияния Т-лимфоцитов, с использованием культивируемых макрофагальных клеток линии RAW 264.7. Исследовать молекулярные механизмы возможных эффектов тимусных пептидов с применением ингибиторного анализа, а также путем оценки уровня активации внутриклеточных сигнальных каскадов.

2. Изучить влияние тимопентина in vivo в условиях индуцированного хронического воспаления, вызванного бактериальным токсином и характеризующегося угнетением иммунного статуса животных. Исследовать механизмы действия тимусных пептидов на продукцию цитокинов и белков теплового шока разными популяциями иммунных клеток, а также на цитокиновый профиль в крови.

3. Изучить в условиях in vivo эффективность применения тимусных пептидов тимулина и тимопентина для коррекции иммунного дисбаланса на нескольких моделях аутоиммунных заболеваний, характеризующихся разной степенью тяжести патологических симптомов. Исследовать молекулярные и клеточные механизмы влияния тимусных пептидов путем изменения продукции цитокинов, белков теплового шока и белков нескольких сигнальных каскадов в иммунных клетках. Изучить влияние тимусных пептидов на активность субпопуляций лимфоцитов-хелперов Thl и Thl7, значимых для развития аутоиммунного заболевания.

4. Изучить эффективность использования тимусного пептида тимулина в сочетании с препаратом, блокирующим активность провоспалительного сигнального каскада NF-kB для коррекции иммунного дисбаланса в условиях аутоиммунного воспаления.

5. В рамках поиска возможных мишеней тимусных пептидов с использованием современных методов молекулярного моделирования изучить взаимодействие некоторых тимусных пептидов с различными элементами комплекса Т-клеточного рецептора с

белком главного комплекса гистосовместимости I типа (TCR-MHC I), определить аффинность такого связывания, а также подобрать такую структурную модификацию пептида, для которой аффинность связывания была бы выше, чем у исходного варианта пептида.

Научная новизна.

1) При проведении исследований впервые показано, что в условиях хронического воспаления септического типа, индуцированного эндотоксином и сопровождающегося иммунным дисбалансом, применение тимопентина приводит к торможению иммунодепрессии, развивающейся в процессе хронического воспаления, а также к уменьшению смертности животных. Это выражается:

a) в повышении сниженной в условиях хронической интоксикации продукции цитокинов ИЛ-2 и ИФН-у лимфоцитами селезенки, а также в нормализации продукции ФНО-а и NO перитонеальными макрофагами, и уровня исследованных провоспалительных цитокинов в крови.

b) в нормализации сниженного при токсическом стрессе количества лимфоцитов в тимусе.

c) в увеличении продукции лимфоцитами селезенки индуцибельной формы белка теплового шока БТШ72, который, будучи шаперонным белком, является важным элементом системы защиты клетки от повреждений.

2) Впервые показано, что тимусные пептиды тимулин и тимопентин непосредственно воздействуют на макрофаги в условиях исключения влияния Т лимфоцитов. Тагам образом, регуляторное действие тимусных пептидов касается не только адаптивной иммунной системы, но и клеток врожденного иммунитета. А именно:

a) показано, что пептиды повышали активность нестимулированных макрофагов, что выражалось в увеличении продукции макрофагами провоспалительных цитокинов ФНО-а, ИЛ-6 и ИЛ-1. Установлено, что стимулирующие эффекты тимусных пептидов на продукцию цитокинов, по меньшей мере, частично опосредуются активацией каскадов NF-кВ и SAPK/JNK.

b) ингибирующие эффекты тимусных пептидов на активированные эндотоксином клетки макрофагальной линии RAW 264.7 проявлялись только в сочетании с ингибиторами сигнальной трансдукции. Таким образом, они отличались от ранее

наблюдавшихся эффектов in vivo, где введение тимулина сильно уменьшало ответ клеток на эндотоксин.,

с) влияние тимусных пептидов на макрофагальные клетки зависело от состояния клеток: была показана активация нестимулированных макрофагов и подавление активности ЛПС-стимулированных клеток. Эффекты тимулина были более ингибиторными, а эффекты тимопентина - более стимулирующими.

3) Впервые изучен эффект тимулина и тимопентина в условиях экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ), моделирующего рассеянный склероз:

a) впервые показан двухфазный цитокиновый ответ при ЭАЭ, где первая (более ранняя) фаза характеризовалась повышением уровня цитокинов, продуцируемых субпопуляцией Thl (в частности, ИФН-у), а вторая (более поздняя) характеризовалась повышением уровня цитокинов, продукцируемых клетками Thl7 (в частности, ИЛ-17). Такой характер ответа был позже подтвержден на другой модели ЭАЭ.

b) впервые показан защитный эффект тимулина и тимопентина в условиях ЭАЭ -пептид значительно снижал выраженность симптомов рассеянного склероза. Эффект тимулина (но не тимопентина) сохранялся после отмены введения гормона.

c) механизм защитного эффекта пептидов связан с влиянием на продукцию провоспалительных цитокинов. Тимулин более эффективно предотвращал ответ клеток Thl7, характерный для аутоимунных реакций, тогда как тимопентин снижал «типичный» провоспалительный ответ, обусловленный клетками Thl.

4) Впервые изучена возможность коррекции тяжелой формы рассеянного склероза, характеризующейся серьезной симптоматикой и высокой летальностью, при помощи тимусного пептида тимулина, ингибитора сигнального каскада NF-кВ и комбинированного применения этих двух препаратов.

a) подтвержден двухфазный цитокиновый ответ с первичной активацией клеток Thl и последующей активацией клеток Thl7.

b) показан защитный эффект тимулина и ингибитора каскада NF-kB на симптоматику заболевания, хотя полного излечения не наблюдали.

с) показано высокое сходство эффектов тимулина и ингибитора каскада ОТ-кВ и отсутствие аддитивности их эффектов, что позволяет предполагать одинаковые механизмы действия этих препаратов. 5) Впервые с помощью современных средств компьютерного моделирования продемонстрирована вероятность высокоаффинного взаимодействия тимусного пептида тимопентина с рецепторным комплексом ТСЯ-МНС I. Разработаны модификации пептида, обладающие более высокой аффинностью связывания с указанным рецептором, чем исходный пептид, которые могут стать перспективными лекарственными препаратами.

Теоретическая и практическая значимость

Проведенные экспериментальные и теоретические исследования, касающиеся регуляции иммунного гомеостаза с участием пептидных гормонов тимуса, позволяют расширить и систематизировать общее понимание особенностей разных тимусных пептидов, что весьма важно с точки зрения разработки новых стратегий их применения. Полученные данные об эффективности тимусных пептидов для коррекции патологий воспалительного характера, связанных с иммунным дисбалансом, расширяют представления о терапевтическом потенциале этих соединений, открывая новые возможности для их клинического применения и позволяя подбирать режимы коррекции с учетом особенностей конкретных патологий.

Положения, выносимые на защиту

1. Установлено, что два тимусных пептида, обладающих разными свойствами, тимулин и тимопентин, могут использоваться для коррекции иммунного дисбаланса при системных воспалительных заболеваниях.

2. Показано, что для коррекции патологии, связанной с хроническим воспалительным процессом септической природы и характеризующейся иммунной депрессией, эффективным является применение тимопентина, обладающего иммуностимулирующим эффектом.

3. Установлено, что индуцированный рассеянный склероз характеризуется последовательной активацией различных популяций Т-хелперов, а тимусные пептиды тимулин и тимопентин могут по-разному влиять на разные стадии аутоиммунного воспалительного процесса. Показано, что для коррекции аутоиммунного воспаления при рассеянном склерозе, характеризующегося патологической активацией иммунных клеток,

более эффективным является тимулин, обладающий противовоспалительным эффектом. Доказано, что механизмом действия тимулина в данном случае является блокада сигнального каскада ЫР-кВ.

4. Установлено, что тимусные пептиды тимулин и тимопентин способны влиять на клетки системы врожденного иммунитета (макрофаги) в условиях полного исключения влияния Т-лимфоцитов. Показано, что эффективность пептидов зависит от состояния клеток: был отмечен стимулирующий эффект при воздействии на нестимулированные клетки, и слабый ингибирующий эффект при воздействии на клетки, стимулированные бактериальным токсином.

5. На основании молекулярного моделирования прогнозируется возможность высокоаффинного взаимодействия тимусного пептида тимопентина с рецепторным комплексом Т-клеточного рецептора. Разработаны модификации пептида, обладающие более высокой аффинностью связывания с указанным рецептором, чем исходный пептид, на основе которых могут быть разработаны новые лекарственные препараты.

Апробация диссертации

Положения диссертации обсуждались на следующих научных мероприятиях:

4 Международный междисциплинарный конгресс Нейронаука для медицины и психологии. (Судак, Украина, 2008 г); 5 Международный междисциплинарный конгресс Нейронаука для медицины и психологии. (Судак, Украина, 2009 г); Итоговая конференция ИБК РАН, (Пущино Россия, 2012 г); Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», (Пущино Россия, 2009 г). 7 Международный междисциплинарный конгресс Нейронаука для медицины и психологии. (Судак, Украина, 2011 г); 8 Международный междисциплинарный конгресс Нейронаука для медицины и психологии. (Судак, Украина, 2012 г); 7 Международная конференция по сигнальной трансдукции в лейкоцитах, (Кос, Греция, 2013 г).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 226 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1-я глава), описания материалов и методов (2-я глава), результатов исследования и их обсуждения (3-я глава, 6 подглав), заключения, выводов и списка литературы. Библиографический указатель содержит 440 источников литературы. Работа проиллюстрирована 33 рисунками.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Модели острого и хронического стресса: В экспериментах с моделями острого и хронического стресса использовали мышей-самцов линии NMRI весом 25-30 г. Хроническое воздействие проводили путем ежедневных инъекций ЛПС из Escherichia coli в течение 11 дней, увеличивая дозу ЛПС каждые 2 дня, при этом первая доза составляла 25 мкг/100 г веса, последняя - 250 мкг/100 г веса. Постепенное увеличение дозы вводимого токсина было необходимо для того, чтобы промоделировать прогрессивное размножение бактерий. Острый токсический стресс моделировали путем однократного введения ЛПС в дозе 250 мкг/100 г веса.

Протокол работы с клетками линии RAW 264.7

В каждом из четырех независимых экспериментов отбирали клетки из отдельного пассажа и аликвоты клеток подвергали обработке ингибиторами: 1 мкг/мл CLI-095, или 2.2 мкг/мл SP600125, или 1 мкг/мл IKK Inhibitor XII. В присутствии ингибиторов клетки культивировали 1 час (SP600125 и IKK Inhibitor XII) или 15 минут (CLI-095). Далее добавляли 5 нг/мл тимопентина или 5 нг/мл тимулина, и инкубировали клетки в течение 30 минут. Далее к клеткам добавляли липополисахарид из Е. coli и клетки инкубировали в течение 24 часов при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02. Измерение биологической активности проводили методами иммуноферментного анализа (ELISA) и Вестерн блот анализа. В пределах каждого независимого эксперимента характеристики образцов измеряли параллельно в шести повторах, получая среднее значение. Усредненные значения по четырем экспериментам использовали для определения достоверности различий между группами (п=4).

Протокол исследований с использованием двух моделей ЭАЭ

В настоящей работе использовали две формы экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ), одна из которых характеризовалась в наших условиях более легким течением, заканчиваясь спонтанным выздоровлением (по Mujtaba et al, 2005), а другая характеризовалась более тяжелым течением и высокой вероятностью летального исхода (по Brereton et al, 2009). Далее эти две формы именуются «легкой» и «тяжелой» формой ЭАЭ, соответственно.

Модель «легкой» формы ЭАЭ: 85 самцов мышей линии NZW массой тела 25-30 г и возрастом 3 месяца содержались в стандартных лабораторных условиях.

Для индукции ЭАЭ, 300 мкг бычьего базового пептида миелина эмульгировали в полном адъюванте Фрейнда, содержащем 4 мг/мл убитых нагреванием Mycobacterium tuberculosis. Эмульсию в объеме 20 мкл вводили подкожно в несколько точек вблизи основания хвоста. Сразу после иммунизации (день 0) и через 48 часов внутрибрюшинно вводили 400 нг коклюшного токсина. Мышей проверяли на симптомы ЭАЭ с интервалом через день, и тяжесть заболевания оценивали по следующей шкале: 0 баллов - нет симптомов, 1 балл - потеря тонуса хвоста, 2 балла - шаткая походка, 3 балла - слабость задних лап, 4 балла - паралич задних лап, 5 баллов - паралич всех конечностей или гибель

Введение тимулина и тимопентина: Раствор тимулина готовили из сывороточного тимусного фактора (FTS) с добавлением эквимолярной концентрации ZnCl2. В качестве контроля готовили физиологический раствор, содержащий то же количество ZnCl2. Тимулин вводили в дозе 15 мкг на 100 г веса, начиная со дня 1, с интевалами через сутки, в течение 30 суток. Другой группе мышей вводили по той же схеме такое же количество тимопентина. Также использовался соответствующий по возрасту контроль.

Модель «тяжелой» формы ЭАЭ: 90 самцов мышей линии C57/BL массой тела 2530 г и возрастом 3 месяца содержались в стандартных лабораторных условиях.

Для индукции ЭАЭ, 150 мкг олигоцитарного гликопротеина миелина 35-55 (MOG) эмульгировали в полном адъюванте Фрейнда, содержащем 4 мг/мл убитых нагреванием Mycobacterium tuberculosis. Эмульсию в объеме 20 мкл вводили подкожно в несколько точек вблизи основания хвоста. Сразу после иммунизации (день 0) и через 48 часов внутрибрюшинно вводили 500 нг коклюшного токсина. Мышей проверяли на симптомы ЭАЭ с интервалом через день, и тяжесть заболевания оценивали по указанной выше шкале симптомов.

Введение тимулина и ингибитора IKK Inhibitor XII: Раствор тимулина готовили и вводили, как описано применительно к легкой форме ЭАЭ. Другой группе мышей вводили в дозе 1.8 мг/кг мкг IKK Inhibitor XII по той же схеме. Третьей группе мышей одновременно вводили тимулин и IKK Inhibitor XII в указанных дозах. Также использовали соответствующий по возрасту контроль. Получение и анализ образцов проводили, как описано применительно к легкой форме ЭАЭ.

Измерение биологического ответа иммунных клеток

Измерение продукции оксида азота: Продукцию NO измеряли по концентрации нитритов, являющихся конечным продуктом метаболизма короткоживущего соединения NO. Количество нитритов в супернатантах измеряли с использованием реактива Грисса.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА): Концентрацию цитокинов в образцах клеток или в сыворотке крови мышей определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). В работе использовали соответствующие наборы .для определения цитокинов мыши. После инкубации образцов с комплексом стрептавидин-пероксидаза, наносили по 100 мкл зеленого красителя ABTS. Оптическую плотность измеряли при 405 нм на спектрофотометре для планшетов.

DsNalTAAr электрофорез и Вестерн блот анализ: Электрофорез проводили стандартным методом. После процедуры переноса определение белков на мембране проводили с использованием поликлональных кроличьих антител к соответствующим белкам мыши. В качестве вторичных антител использовали поликлональные козьи биотинилированные антитела к иммуноглобулинам кролика, а затем инкубировали с комплексом, содержащим стрептавидин и пероксидазу хрена. В качестве контроля нагрузки белковых полос использовали моноклональные антитела к бета-тубулину или GAPDH. Для выявления белков использовали хемилюминисцентный коктейль в соответствии с инструкциями изготовителя, экспонируя мембрану на рентгеновской фотопленке. Положение соответствующих белковых полос определяли с использованием на стадии электрофореза маркеров молекулярного веса, а также путем специфического окрашивания антителами во время блотинга. Количественную оценку белковых полос выполняли с использованием программного обеспечения Qapa. Полученные цифровые данные нормировали к соответствующему контролю нагрузки (полосам тубулина) и выражали в относительных единицах, как средние от трех независимых экспериментов.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием критерия Стьюдента, однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA) и апостериорных тестов Тьюки (Tukey's post-hoc tests).

Методы и алгоритмы, использованные при молекулярном моделировании структуры и свойств тимусного гормона тимопентина

Эта часть работы была проведена совместно с сотрудником лаборатории структуры и динамики биомолекулярных систем ИБК РАН Кондратьевым М.С. Для описания конформационной гибкости тимопентина и его модификаций, получения данных о стабильности молекул и комплексов, а также о распределении зарядов использовался метод расчета траекторий молекулярной динамики, реализованный в пакете GROMACS Исходный код программного обеспечения для расчета молекулярной динамики свободно доступен на сайте Simbios NIH National Centre for Biomedical Computing (https://simtk.org/home/zephyr). Также использовалось силовое поле AMBER96 (Ponder & Case, 2003) и визуализатор VMD (Humphrey et al, 1996; Stone et al, 2010). Посадка каждого из лигандов на мишень, с последующим ранжиром по энергиям связывания, была выполнена при помощи пакета Autodock VINA 1.1.2. (Trott & Olson, 2010), а визуализация полученных результатов была сделана в пакете AutoDockTools 1.5.6.RC3 (Morris et al., 2009). Схемы проекций лиганд-рецепторных взаимодействий были отрисованы с помощью пакета LigPlot 1.3.6. (Laskowski & Swindells, 2011), а спектры потенциальной биологической активности каждого из исследованных пептидов были предсказаны с помощью сервера PASS (Poroikov & Filimonov, 2005; Stepanchikova et al, 2003).

Результаты и обсуждение

3.1 Иммуномодулирующие эффекты тимопентина при остром и хроническом воспалениях у мышей

Для изучения эффектов тимопентина при хроническом воспалении использовали пролонгированное введение эндотоксина с прогрессивно увеличивающимися дозами, что моделировало хронический процесс, при котором обычно происходит рост численности микроорганизмов. Как мы показали ранее, для этой модели характерна выраженная депрессия иммунной системы на поздних стадиях.

Влияние тимопентина на количество лимфоцитов в тимусе при остром и хроническом воспалении

Известно, что при разных стрессовых воздействиях наблюдается очень быстрая инволюция тимуса, что может служить маркером неблагоприятного воздействия. По этой причине на первом этапе работы для оценки эффективности однократного и

пролонгированного введения тимопентина в условиях, соответственно, острого и хронического воспаления, индуцированного ЛПС из грамотрицательных бактерий, била произведена оценка клеточности тимуса. Результаты показали, что и острое, и хроническое воспаления сопровождаются значительным снижением числа клеток в ткани тимуса (Рис. 3.1.1). Достоверное снижение скорости опустошения тимуса при введении тимопентина было обнаружено у животных с острым воспалением, а также на 16-й день развития хронического процесса (через 4 дня после отмены введения пептида и ЛПС). Таким образом, показано пролонгированное защитное действие тимопентина - он был эффективен на том этапе развития хронического воспаления, когда его введение было уже отменено.

Рис. 3.1.1. Влияние тимопентина на число клеток в тимусе при остром и хроническом воспалении. Каждое значение - среднее из трех-четырех независимых экспериментов. Контроль - животные, получавшие инъекции физраствора, * - достоверные отличия от контроля (р<0.05). А - достоверные отличия от группы «ЛПС» (р<0.05).

Влияние тимопентина на продукцию медиаторов воспаления иммунокомпетентными клетками

Далее оценивали влияние тимопентина на функциональное состояние перитонеальных макрофагов и лимфоцитов селезенки мышей с острым и хроническим воспалением. На Рис. 3.1.2 показано влияние тимопентина на продукцию оксида азота (N0) перитонеальными макрофагами и ИЛ-2 лимфоцитами селезенки мышей при однократном введении животным сублетальной дозы ЛПС, а также на разных стадиях хронического воспаления. Результаты показали, что при остром воспалении в макрофаг ах происходит резкое увеличение продукции N0, а в процессе развития хронического воспаления клетки утрачивают способность отвечать на токсический стресс высоким

уровнем продукции N0 (Рис. 3.1.2А). При хроническом воспалении введение тимопентина приводило к тому, что продукция оксида азота в макрофагах поддерживалась на достаточно высоком уровне. Для оценки влияния пептида на активность лимфоцитов селезенки, измеряли продукцию интерлейкина-2 (ИЛ-2), являющегося важным маркером активации лимфоцитов. Результаты показали, что острый токсический стресс увеличивает продукцию ИЛ-2 примерно в 1.5 раза. Применение тимопентина не предотвращало увеличения уровня продукции ИЛ-2 в лимфоцитах при однократном введениии сублетальной дозы ЛПС (Рис. 3.1.2В).

Рис. 3.1.2. Влияние тимопентина на продукцию N0 перитонеальными макрофагами (А) и ИЛ-2 лимфоцитами селезенки (В) при остром и хроническом воспалении. Каждое значение - это среднее из трех-четырех независимых экспериментов. Контроль - животные, получавшие инъекции физиологического раствора, * - достоверные отличия от контроля (р<0.05). л - достоверные отличия от группы «ЛПС» (р<0.05).

В условиях хронического воспаления на 4-й и 11-й дни наблюдается угнетение продукции ИЛ-2, причем после отмены введения ЛПС (16 день) уровень продукции ИЛ-2 восстанавливался. В том случае, когда животные получали пептид, уровень продукции ИЛ-2 восстанавливался гораздо раньше - уже на 4-й день продукция ИЛ-2 в лимфоцитах была достоверно выше, чем у животных, не получавших тимопентин. Влияние тимопентина на уровень цитокинов в крови Для оценки общего состояния иммунной системы измеряли концентрацию фактора некроза опухолей-а (ФНО-а), интерферона-у (ИФН-у) и интерлейкина-10 (ИЛ-10) в плазме в крови мышей трех экспериментальных групп. Результаты, представленные на Рис. 3.1.3, показывают, что концентрация всех измеряемых цитокинов резко возрастала при остром

воспалении и на ранних стадиях хронического процесса, но постепенно снижалась на более поздних стадиях хронического воспаления.

А В

Э 0.25 | «

1 о,К ! «.

□ гонтрогъ

оЛПС

вИ>5»Л1Х

1.2 I '

I °"8

? П(5

Рис. 3.1.3. Влияние тимопентина на содержание цитокинов в плазме крови при остром и хроническом токсическом стрессе. А - ИФН-у, В -ФНО-а, С - ИЛ-10. Каждое значение - среднее из трех-четырех независимых экспериментов. * - достоверные отличия от контроля (р<0.05). л - достоверные отличия от группы «ЛПС» (р<0.05).

Введение тимопентина не приводило к сколько-нибудь существенным изменениям концентрации про-воспалительных цитокинов при остром воспалении. Однако в отношении антивоспалительного цитокина ИЛ-10 было показано, что предварительное введение пептида приводит к предотвращению накопления ИЛ-10 в крови в условиях острого воспаления, и к поддержанию его концентрации на уровне, превышающем контрольный, на 16-й день хронического воспалительного процесса. Следует отметить, что такие же эффекты тимопентина наблюдали для ИФН-у (на 11-й день) и ФНО-а (на 16-й день хронического воспаления).

Влияние тимопентина на продукцию БТШ70 лимфоцитами

Чтобы оценить влияние тимопентина на состояние защитной системы клеток в условиях острого и хронического воспалений, измеряли продукцию лимфоцитами селезенки индуцибельной формы белка теплового шока 70 (БТШ72), который экспрессируется в условиях тепловых или иных стрессовых воздействий для защиты внутриклеточных структурных белков. Результаты показали, что при введении сублетальной дозы ЛПС продукция БТШ72 возрастает многократно (приблизительно в 8

раз) (Рис. 3.1.4). Предварительное введение тимопентина в условиях острой интоксикации не вызывало достоверных изменений экспрессии БТШ72, хотя имелась тенденция к еще большей активации синтеза этого белка при использовании пептида и ЛПС. Хроническое введение ЛПС приводило к постепенному снижению продукции БТШ72 со временем, при этом уровень экспрессии белка оставался достоверно повышенным в течение всего периода наблюдений.

|илгеаттз*лпс|

Рис. 3.1.4 Влияние тимопентина на продукцию БТШ72 при остром и хроническом токсическом стрессе. Сверху вниз: мембрана иммуноблота, обработанная антителами к БТШ72, и мембрана для контроля содержания тубулина в образцах. Крайнее левое пятно на мембране - рекомбинантный БТШ72. На диаграмме - результаты измерения количества белка (в % от контроля). Каждое значение на диаграмме есть среднее из трех-четырех независимых экспериментов. * - достоверные отличия от контроля (р<0.05). л -достоверные отличия от группы «ЛПС» (р<0.05).

Введение тимопентина при хроническом воспалении приводило к увеличению экспрессии БТШ72 в сравнении с животными, получавшими только ЛПС, и к более быстрому восстановлению нормального ответа после отмены введения препаратов (16-й день эксперимента).

Влияние тимопентина на выживаемость мышей

Введение тимопентина вызывало достоверное увеличение продолжительности жизни мышей с хронической формой воспаления, индуцированного пролонгированным введением бактериального токсина с возрастающейся дозой.. Так, на 20-й день после отмены препаратов в группе из 20 животных, получавших лечение тимопентином, выжили

75% животных, в то время, как в группе, получавшей только ЛПС, количество выживших животных составляло 60%.

Таким образом, тимусный пептид тимопентин, обладающий иммуностимулирующими свойствами, оказывал защитный эффект в условиях хронического воспаления, характеризующегося угнетенным состоянием иммунной системы. Этот эффект выражался в нормализации продукции воспалительных медиаторов и повышении выживаемости животных.

3.2 Т-лимфоцит-независимая регуляция макрофагальных клеток тимусными пептидами и ее механизмы

Для оценки регуляции клеток врожденного иммунитета (макрофагов) тимусными пептидами в условиях исключения влияния лимфоцитов использовали культивируемые клетки макрофагальной линии RAW 264.7.

Влияние тимулина и тимопентина на продукцию цитокинов нестимулированными макрофагами in vitro

Для анализа влияния тимусных пептидов на активность нестимулированных клеток RAW 264.7 измеряли продукцию ФНО-а, ИЛ-1а, ИЛ-6 и интерферона-гамма (ИФН-гамма) в клетках при воздействии тимопентина и тимулина. Как показано на Рис. 3.2.1 А, обработка клеток тимопентином приводила к значительному увеличению продукции ФНО-а и ИЛ-6 по сравнению с контролем. Культивирование клеток RAW 264.7 с тимулином вызывало аналогичный стимулирующий эффект (Рис. 3.2.1В).

Контроль Тяму.тнн <im) tm+CU-095 tmtSP6001Z5 tm+IKK InhirtOf XII

Рис. 3.2.1. Влияние тимопентина (tp) (А) и тимулина (tm) (В) отдельно и в сочетании с ингибиторами каскадов NF-kB (IKK Inhibitor XII), SAPK/JNK (SP60012S) и TLR4 (CLI-095) на продукцию цитокинов ФНОа, ИЛ1-а, ИФНу и ИЛ-6 клетками RAW 264.7. Средние значения из 4-х независимых экспериментов анализировались на достоверность различий между группами (п=4). * достоверно выше контроля, р<0.05, # достоверно ниже контроля, р<0.05

Влияние тимусных пептидов на нестимулированные клетки, прошедшие предварительную обработку ингибиторами

Для выявления роли сигнальных каскадов NF-кВ, SAPK/JNK и TLR4 в стимулирующих эффектах пептидов измеряли концентрацию ФНО-а, ИЛ-1а, ИЛ-6 и ИФН-гамма в супернатантах макрофагов, прошедших предварительную обработку одним из ингибиторов, а затем культивированных с тимопентином или тимулином. Результаты, представленные на Рис. 3.2.1 А показывают, что стимулирующий эффект тимопентина на продукцию всех исследованных цитокинов полностью блокировался ингибитором каскада NF-кВ и ингибитором каскада SAPK/JNK. Ингибитор каскада TLR4 не влиял на вызванное тимопентином увеличение секреции ФНО-а и ИЛ-1-а, но блокировал вызванное этим пептидом увеличение продукции ИЛ-6. Результаты, представленные на Рис. 3.2.1В показывают, что стимулирующий эффект тимулина на продукцию цитокинов также полностью блокировался ингибиторами каскадов NF-кВ и SAPK/JNK. Ингибитор каскада TLR4 подавлял вызванную тимулином продукцию ИЛ-1-a и ИЛ-6, но не ФНО-а.

Влияние тимулина и тимопентина на клетки, стимулированные ЛПС, в присутствии или в отсуствии ингибиторов

Для оценки влияния ингибиторов сигнальных каскадов на ЛПС-стимулированные макрофаги было проведено измерение секреции двух цитокинов, ИЛ-la и ФНО-a с добавлением ингибиторов сигнальных каскадов в среду культивирования клеток RAW 264.7. Эндотоксин вызвал ожидаемое увеличение продукции ИЛ-la и ФНО-a и, следовательно, клетки RAW 264.7 проявили значительную реакцию на ЛПС, выразившуюся в двух-трехкратном увеличении продукции цитокинов в сравнении с нестимулированными клетками (Рис. 3.2.2А и 3.2.2В). Если ЛПС добавляли в сочетании с ингибитором сигнального каскада NF-кВ, ингибитором сигнального каскада SAPK/JNK или ингибитором каскада TLR4, секреция цитокинов значительно снижалась по сравнению с ЛПС-стимулированными клетками, но оставалась несколько выше, чем в контроле.

Ингибитор TLR4 оказался наименее эффективным для блокирования цитокинового ответа клеток RAW 264.7 на ЛПС.

Рис. 3.2.2. Влияние тимопентина (тп) и тимулина (тм) в сочетании с ингибитором (инг) сигнального каскада NF-кВ (IKK Inhibitor XII), ингибитором сигнального каскада SAPK/JNK (SP600125) или ингибитором каскада TLR4 (CLI-095) на продукцию ФНО-а (А) и ИЛ-1а (Б) в стимулированных ЛПС клетках RAW 264.7. Средние значения из 4-х экспериментов анализировались на достоверность различий между группами (п=4). * достоверное отличие от группы ЛПС+ингибитор, р<0.05

Для анализа влияния тимусных пептидов тимулина и тимопентина на ЛПС-стимулированные макрофаги, измеряли продукцию ИЛ-1-a и ФНО-a в клетках, культивированных с ЛПС в присутствии тимулина или тимопентина. Как показано в Таблице 3.1.1, оба пептида не оказывали или оказывали незначительное влияние на продукцию ИЛ-1-a и ФНО-a в стимулированных ЛПС макрофагах. Однако если пептиды добавлялись к ЛПС-стимулированным макрофагальным клеткам в сочетании с каждым из ингибиторов, пептиды достоверно усиливали эффект ингибиторов. Единственным исключением был сильный эффект ингибитора сигнального каскада SAPK/JNK, который сам по себе снижал вызванную ЛПС продукцию ФНО-a ниже контрольных значений, поэтому модулирующие эффекты тимусных пептидов в данном случае не наблюдались.

Таблица 3.1.1. Влияние тимулина и тимопентина на продукцию цитокинов в стимулированных ЛПС клетках RAW 264.7.

контроль ЛПС Тимопентин+ЛПС Тимулин+ЛПС

ФНО-a 151.4=Ь 9.2 216.7 ± 16* 258.6 ±31* 229.7 ± 13*

ИЛ-1а 110.4 ± 11.1 257.1 ± 18* 239.8 ±28* 224.6 ± 32*

Анализ выполнен методом ELISA. Значения представляют собой средние (нг/мл) ± ст.ош. из четырех независимых экспериментам. Контролем служили клетки, культивированные с соответствующим

количеством PBS в течение соответствующих временных интервалов. * достоверное отличие от контроля, р<0.05

Влияние тимусных пептидов на продукцию БТШ72 клетками

Для анализа состояния защитных систем в иммунных клетках, стимулированных ЛПС, было проведено измерение продукции БТШ72 в лизатах клеток, предварительно культивированных с каждым из тимусных пептидов и/или ЛПС. На Рис. 3.2.3 видно, что ЛПС вызывал примерно двухкратное увеличение продукции БТШ72 в макрофагах, но если клетки культивировались с одним из тимусных пептидов (отдельно или в комбинации с ЛПС), увеличение продукции БТШ72 было значительно более выраженным (шести-семикратным).

бтш72

тубулнв

120 100

ЛЬ

nh 1+1

r£~i

контроль ЛПС III тм+ЛПС та то+ЛПС

Рис. 3.2.3. Влияние тимопентина (тп) и тимулина (тм) на продукцию белка теплового шока БТШ72 нестимулированными и стимулированными ЛПС клетками RAW 264.7. На верхней панели представлены изображения Вестерн-блотов с использованием антител к белку БТШ72. Значения для гистограмм рассчитаны с нормированием к внутреннему контролю (тубулин), и являются результатом денситометрии белковых полос, усредненным по трем независимым экспериментам ± ст.ошибка. * достоверное отличие от контроля, р<0.05

Влияние тимусных пептидов на фосфорилирование белков сигнальных каскадов NF-kB и SAPK/JNK в клетках RAW264.7

Для исследования возможных механизмов влияния макрофагов на тимусные гормоны в нестимулированных и стимулированных клетках RAW 264.7 оценивали активность двух сигнальных каскадов, NF-kB и SAPK/JNK, измеряя фосфорилирование

нескольких белков, входящих в эти каскады. Киназа SAPK/JNK активируется различными стрессовыми факторами, в том числе, провоспалительными цитокинами. Мы оценивапи внутриклеточный уровень активированной (фосфорилированной) формы SAPK/JNK в макрофагальных клетках и показали, что при добавлении только тимопентина происходило увеличение фосфорилирования SAPK/JNK, тогда как тимулин не оказывал существенного эффекта (Рис. 3.2.4С). В стимулированных ЛПС клетках наблюдалось существенное увеличение фосфорилирования SAPK/JNK. При добавлении тимулина в сочетании с ЛПС фосфорилирование SAPK/JNK уменьшалось до контрольных величин. Тимопентин не оказывал блокирующего или аддитивного эффекта на вызванную ЛПС активацию фосфорилирования.

Измеряли внутриклеточный уровень активированных (фосфорилированных) форм IKKa/р и белка RelA из семейства NF-кВ в макрофагальных клетках. Результаты, представленные на Рис. 3.2.4А и 3.2.4В, соответственно, показывают, что введение одного тимопентина оказывало стимулирующий эффект на фосфорилирование IKKa/р и RelA, тогда как тимулин увеличивал фосфорилирование RelA, но не IKKa/(?. Кроме того, введение ЛПС приводило к увеличению фосфорилирования IKKot/p и RelA, а добавление тимулина и тимопентина не оказывало блокирующего или аддитивного эффекта на стимулированные ЛПС макрофагальные клетки.

Таким образом, тимусные пептиды тимулин и тимопентин оказывали прямое действие на активность макрофагальных клеток. Их эффекты зависели от состояния клеток: стимуляция в отношении нестимулированных макрофагов и ингибирование в отношении ЛПС-стимулированных клеток. Эффекты, по меньшей мере, частично были опосредованы действием на каскады NF-кВ и SAPK/JNK.

Ингибирующие эффекты тимусных пептидов на макрофагальные клетки наблюдались только в сочетании с ингибиторами сигнальной трансдукции. В условиях in vivo антивоспалительная эффективность тимусных пептидов, вероятно, зависит от присутствия лимфоцитов.

phlKK

— phNF-fc

тубулнн

тубулин

90-1

80-

а 70-

X 60-

ü 50-

40-

эо-

£ 20-

10-

о4

контроль ЛПС Ti£ ты+ЛПС тп тп+ЛПС

140 . 120 i 100 I 80 i 60 I 40 i 20 О

1*1 ¡h

контроль ЛПС ты тм+ЛПС ш ш+ЛПС

тубулнн

250 | 200

i 150 «1

Ё loo I so о

nil

кгапроаь ЛПС ты tv+ЛПС та тп+ЛПС

Рис. 3.2.4. Влияние тимулина (тм) и тимопентина (тп) на продукцию фосфорилированных (ph) форм IKKa/р (А) и RelA (Б) и SAPK/JNK (С) нестимулированными и стимулированными ЛПС клетками RAW 264.7. На верхней панели представлены результаты Вестерн-блот анализа с использованием соответствующих антител. Значения для гистограмм рассчитаны с нормированием к внутреннему контролю (тубулин), и являются результатом денситометрии белковых полос, усредненным по трем независимым экспериментам ± ст.ошибка. * достоверное отличие от контроля, р<0.05.

3.3 Роль тимусных пептидов в регуляции аутоиммунного воспалительного процесса у мышей с индуцированным рассеянным склерозом

Для исследования регуляции воспалительных ответов тимусными пептидами в условиях аутоиммунного заболевания использовали экспериментальный аутоиммунный

энцефаломиелит (ЭАЭ), аутоиммунную патологию, моделирующую состояние рассеянного склероза.

Развитие ЭАЭ и цитокиновый ответ

Динамика развития этой формы ЭАЭ, вызванной иммунизацией базовым белком миелина, была следующей: признаки патологии впервые появлялись на 14-й день после иммунизации, достигали пика в период между 20-ми и 25-ми сутками и сохранялись до 45-х суток (Рис. 3.3.1). Это соответствовало типичному протеканию ЭАЭ, ранее описанному для данной модели (Ми^аЬа Й а1., 2005). Следует отметить, что в ходе эксперимента ни одна мышь не погибла, и ни у одной не развился паралич всех конечностей.

Известно, что у пациентов с рассеянным склерозом встречаются разные формы заболевания, характеризующися разной иммунопатологией. Эти клинические формы вызываются разными субпопуляциями клеток СБ4+ Т-хелперов (ТЬ), одна из которых секретирует, преимущественно, ИЛ-17 (ТЫ7), а другая - ИФН-гамма (ТЫ). Для изучения роли двух этих субпопуляций лимфоцитов, мы оценили динамику цитокинового ответа путем измерения концентрации в крови провоспалительных цитокинов ИЛ-17, ИЛ-6 (продукцируемых ТЫ7) и ФНО-а и ИФН-гамма (продуцируемых ТЫ) на разных стадиях ЭАЭ, моделирующего рассеянный склероз.

Лечение тнмусными пептидами

ЭАЭ

--о- - ЭАЭ+пи

ЭАЭ+тп

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60

суток после иммунизации

Рис. 3.3.1 Оценка тяжести заболевания у мышей с ЭАЭ в разные моменты времени после иммунизации базовым белком миелина (день 0). Группы животных: нелеченные мыши; мыши, получавшее тимулин (тм) и мыши, получавшие тимопентин (тп). Данные представляют собой среднее ± ст.ошибка но группе из 10 мышей. Клинические признаки ЭАЭ оценивали через день. * достоверное отличие от группы ЭАЭ, р<0.05.

Результаты (Рис. 3.3.2.) показали, что на ранних стадиях заболевания (15 сутки) концентрации цитокинов не отличались от показателей здоровых животных (ФНО-а и ИЛ-17) или были повышены на 30-40% (ИЛ-6 и ИФН-гамма). К 35 суткам, когда симптомы патологии были более выраженными, наблюдали примерно двукратное увеличение концентрации ИЛ-6 и ИФН-гамма. На этой стадии уровень ИЛ-17 был несколько повышен, а концентрация ФНО-а не отличалась от контроля. К 48-му дню, когда симптомы патологии и высокий уровень ИЛ-6 и ИФН-гамма сохранялись, наблюдалось значительное увеличение концентрации ФНО-а и ИЛ-17. К 61-му дню после иммунизации, когда видимые признаки патологии практически исчезали, уровень провоспалительных цитокинов оставался высоким, за исключением ИЛ-17, концентрация которого нормализовалась. Таким образом, показали двухфазный цитокиновый ответ, где ранняя фаза характеризовалась повышением уровня ИЛ-6 и ИФН-гамма в крови, а более поздняя фаза характеризовалась повышением ИЛ-17 и ФНО-а.

в 15 сутга 35 стта 45 сути

а ЭАЗ^ТМ • ЭА^ТЦ

Рис. 3.3.2. Концентрация цитокинов в плазме крови в процессе заболевания в разных группах животных: Нелеченные животные с ЭАЭ, животные, получавшие тимулин (тм), тимопентин (тп) и соответствующие по возрасту контроль. (А) ИФН-гамма, (В) ИЛ-6, (С) ФНО-а, (О) ИЛ-17. Значения представляют собой среднее из пяти независимых экспериментов (пг/мл) ± ст.ошибка. Контролем служили животные, которым вводили физраствор. * достоверное отличие от группы ЭАЭ, р<0.05

Активация сигнального каскада ЫР-кВ и продукции БТШ72 в лимфоцитах селезенки

Учитывая слабый цитокиновый ответ на ЭАЭ на 15-е сутки после иммунизации, анализ активации сигнальных каскадов и продукции белка теплового шока проводили на 35, 48 и 61 сутки. Измеряли внутриклеточную концентрацию фосфорилированной формы 1ККа/(3 и белка Яе1А/р65 из семейства №-кВ на трех стадиях аутоиммунного воспаления. Результаты (Рис. 3.3.ЗА и 3.3.ЗВ) показывают существенное увеличение содержания фосфорилированных форм 1ККа/р и белка Ке1А/р65 на 35-й день после иммунизации. Повышенный уровень фосфорилированной формы 1ККа/р сохранялся в течение 61 суток, тогда как фосфорилирование Яе1А/р65 снизилось до контрольных величн к 48 суткам.

Для анализа системы защиты иммунных клеток в процессе аутоиммунного воспаления, измеряли продукцию БТШ72 в лимфоцитах селезенки мышей с ЭАЭ на разных стадиях заболевания (Рис. З.З.ЗС). Наши данные показывают существенное (2.5-кратное) увеличение продукции БТШ72 на 35 день, с последующим снижением до контрольных величн на более поздних стадиях.

Влияние тимулина и тимопентина на симптоматику рассеянного склероза и цитокиновый ответ

Повторяющиеся инъекции тимулина и тимопентина в течение 30 дней существенно снизили тяжесть заболевания в сравнении с нелеченными животными с ЭАЭ (Рис 3.3.1). Кроме этого, оба пептида задерживали появление первых признаков заболевания на 2-3 дня. Следует отметить, что наблюдение за животными велось в течение 30 дней после отмены введения гормонов, и результаты показали, что защитный эффект тимулина сохранялся после отмены препарата, тогда как эффект тимопентина после прекращения введения пептида не был обнаружен (Рис. 3.3.1).

Что касается цитокинового ответа, то и тимулин, и тимопентин увеличивали

концентрацию ИФН-гамма в сыворотке крови на 15-е сутки после иммунизации.

Интересно, что эта стадия заболевания еще не характеризовалась заметным цитокиновьш

ответом. Вместе с тем, тимулин снижал концентрации ИФН-гамма, ИЛ-6, ИЛ-17 и ФНО-а

на 35, 48 и 61 сутки после иммунизации. Эти изменения уровня цитокинов коррелировали

с видимыми симптомами ЭАЭ в этой группе животных. С другой стороны, тимопентин не

влиял на повышенные концентрации ИФН-гамма, ИЛ-17 и ФНО-а на 35 и 48 сутки после

иммунизации, что в данной группе животных также коррелировало с тяжестью симптомов

ЭАЭ. Однако тимопентнн снижал уровень ИЛ-6 в сыворотке на всех сроках наблюдения. Таким образом, результаты показывают, что тимулин редуцировал как раннюю, так и позднюю фазу цитокинового ответа, тогда как эффект тимопентина был гораздо менее выражен.

Влияние тимулина и тимопентина на сигнальный каскад ЫР-кВ и продукцию белка теплового шока БТШ72 в лимфоцитах селезенки

Ни тимулин, ни тимопентин не снижали фосфорилирование белков 1КК<х/р и ЫБ-кВ у мышей с ЭАЭ на 35 сутки после иммунизации (Рис. 3.3.3). Более того, тимулин несколько увеличивал на данной стадии заболевания фосфорилирование 1ККа/р. Однако оба пептида снижали фосфорилирование 1ККсс/р в лимфоцитах на 48 и 61 сутки. Кроме того, тимулин значительно уменьшал продукцию БТШ72 в лимфоцитах мышей с ЭАЭ на 48 день после иммунизации, а тимопентин снижал продукцию этого белка на 61 день после иммунизации. Таким образом, тимусные гормоны демонстрируют потенциал к снижению аутоиммунной воспалительной реакции на относительно поздних стадиях заболевания через механизмы, включающие как каскад внутриклеточной сигнализации ОТ-кВ, так и защитный белок из семейства БТШ.

контроль ЭАЭ ЭАЭ+ТМ )Л>* ГП

Koiupo.il. ЭАЭ ЭАЭ+ТМ 'МНТП

о'11»"" Ё 150

день 48 лень 61

контроль ЭАЭ ЭАЭ+ТМ ЭАЭ+ТП

день 61

Рис. 3.3.3. Фосфорилирование Яе1А/р65 (А) и 1ККа/(3 (В), а также продукция БТШ72 (С) в лимфоцитах селезенки в процессе развития заболевания в разных группах животных: нелеченные животные с ЭАЭ, животные, получавшие тимулин (тм), тимопентин (тр) и соответствующий по возрасту контроль. Гистограммы показывают количество белка ± ст.ошибка относительно внутреннего контроля по тубулину (не показан), и значения получены в результате денситометрии белковых полос в трех независимых экспериментах. * достоверное отличие от контроля, р<0.05 А достоверное отличие от группы ЭАЭ, р<0.05.

3.4 Регуляция иммунного статуса у мышей с тяжелой формой аутоиммунного воспаления при сочетанием воздействии тимулина и ингибитора сигнального каскада ЫР-кВ

Развитие рассеянного склероза и цитокиновый ответ

Развитие симптоматики у мышей с тяжелой формой ЭАЭ, вызванного иммунизацией гликопротеином из олигодендроцитарного миелина, было следующим: признаки патологии впервые появлялись на уже на 8-й день после иммунизации (в предыдущей модели - на 14-й), и непрерывно нарастали до 21 дня, к которому погибли 75% мышей (Рис. 3.4.1). Это, в целом, соответствовало типичному протеканию ЭАЭ, ранее описанному для данной модели (Вгегект е! а1, 2009). Таким образом, развитие заболевания при использовании этой модели было значительно более быстрым и более тяжелым, в сравнении с описанным в предыдущем разделе.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

суток после иммунизации

Рис. 3.4.1 Оценка тяжести заболевания у мышей с ЭАЭ в разные моменты времени после иммунизации иммунизацией гликопротеином из олигодендроцитарного миелина (день 0). Группы животных: нелеченные мыши (ЭАЭ); получавшие тимулин (ЭАЭ+тм); получавшие ингибитор IKK Inhibitor XII (ЭАЭ+инг); и получавшие тимулин в сочетании с ингибитором (ЭАЭ+тм+инг). Данные представляют собой среднее ± ст.ошибку по группе из 10 мышей. Клинические признаки ЭАЭ оценивали через день. * достоверное отличие от группы ЭАЭ (для всех трех других групп), р<0.05.

Для оценки динамики цитокинового ответа как и в предыдущей серии экспериментов, измеряли концентрацию провоспалительных цитокинов ИЛ-17, ИЛ-6 и ФНО-а и ИФН-гамма в крови на разных стадиях развития ЭАЭ. В отличие от предыдущего эксперимента с учетом тяжести и быстроты развития симптомов этот

эксперимент был более коротким, и количество экспериментальных точек было меньшим (15, 19 и 22 день). Однако, как и в предыдущем случае, наблюдали двухфазный цитокиновый ответ, хотя фазы оказались более короткими. Результаты (Рис. 3.4.2) показывают, что на ранних стадиях заболевания (15 сутки после иммунизации) концентрации трех из четырех изучаемых цитокинов (ИЛ-6, ИФН-гамма и ФНО-а) были повышены на 40-50%. Концентрация ИЛ-17 не отличалась от контрольного уровня. К 19 суткам концентрации трех упомянутых цитокинов увеличились еще больше, до 200-250% от начального уровня. На этой стадии также наблюдалось резкое увеличение уровня ИЛ-17 (более чем в три раза относительно исходного). К 22 суткам у оставшихся в живых мышей уровень цитокинов сохранился, приблизительно, на том же высоком уровне, хотя стоит отметить некоторое снижение концентрации ИЛ-17. Таким образом, цитокиновый ответ имел две фазы: первую - без увеличения уровня ИЛ-17, и вторую - с увеличением уровня ИЛ-17.

Рис. 3.4.2. Концентрация цитокинов в плазме крови в процессе развития заболевания в разных группах животных: Нелеченные животные (ЭАЭ), животные, получавшие тимулин (ТМ), ингибитор (ИНГ), ингибитор и тимулин (ТМ+ИНГ) и соответствующие по возрасту контроль. (А) ИЛ-6, (В) интерферон-гамма, (С) ИЛ-17, (О) ФНО-а. Измерения выполнены в разные периоды после иммунизации (день 0). Значения представляют собой среднее из пяти независимых экспериментов (нг/мл) ± ст.ошибка. Контролем служили животные, которым вводили физраствор. * достоверное отличие от контроля, р<0.05; л достоверное отличие от группы ЭАЭ, р<0.05

3.4.2 Активация сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK и продукции БТШ72 в лимфоцитах селезенки

Анализ активности сигнальных каскадов и продукции белка теплового шока БТШ72, так же как и анализ уровня цитокинов, проводили на 15, 19 и 22 сутки. Измеряли внутриклеточную концентрацию фосфорилированной формы IKKa/р и белка RelA из семейства NF-кВ на трех разных стадиях аутоиммунного воспаления. Наши результаты (Рис. 3.4.3А, В, С) показывают, что на 15 сутки после иммунизации заметно (в 2.5 раза) увеличилось содержание как активной формы IKKa/р, так и активной формы белка RelA. Содержание активированной (фосфорилированной) формы SAPK/JNK не было повышенным. С другой стороны, к 19 суткам наблюдалось резкое и сильное (4-кратное) увеличение фосфорилирования и IKKa/р, и белка RelA, и SAPK/JNK. Интересно, что повышенный уровень активированных форм этих сигнальных белков снизился до контрольных величин к 22 суткам.

Для оценки защитной системы иммунных клеток в процессе аутоиммунного воспаления, измеряли динамику изменения продукции БТШ72, индуцибельной формы белка теплового шока из семейства БТШ70 в лимфоцитах селезенки мышей с ЭАЭ (Рис. 3.4.3D). Результаты показали существенное (3-кратное) увеличение продукции БТШ72 на 19 день, с последующим снижением до двухкратного уровня на более поздних стадиях развития рассеянного склероза.

Влияние тимулина и ингибитора сигнального каскада NF-kB на симптоматику ЭАЭ и цитокиновый ответ

Повторяющиеся через день инъекции тимулина, или ингибитора сигнального

каскада NF-kB IKK Inhibitor XII, или их совместного применения в течение всего периода

эксперимента заметно снижали тяжесть заболевания в сравнении с нелеченными

животными с ЭАЭ (Рис 3.4.1). Следует отметить, что полного излечения не наступало, и

тяжесть заболевания у мышей, подвергавшихся лечению, все же постепенно нарастала,

хотя и медленнее, чем в группе нелеченных животных. У животных, оставшихся в живых к

концу эксперимента, была проведена оценка уровня цитокинов и сигнальных белков.

Что касается продукции цитокинов, то тимулин снижал уровень цитокинового ответа у

мышей с ЭАЭ с разной степень эффективности (Рис. 3.4.2). На начальной стадии он

достаточно эффективно снижал цитокиновый ответ, в некоторых случаях вплоть до

контрольных значений (ИФН-гамма). Однако эффекивность защитного действия на

поздних стадиях развития заболевания (22 день) заметно ослабевала. Ингибитор сигнального каскада NF-кВ оказывал сравнимое с тимулином воздействие на цитокиновый профиль (заметное влияние на начальных стадиях, менее эффективное - на поздней). Более того, по влиянию на повышенный уровень ФНО-а на поздней стадии этот ингибитор оказался несколько эффективнее, чем тимулин. Эффект комбинированного воздействия тимулина и ингибитора IKK Inhibitor XII по влиянию на симптомы и цитокиновый ответ был похожим на результат использования этих агентов по отдельности, по крайней мере, аддитивности их действия не наблюдали. Влияние агентов оказалось сходным как по направлению, так и по амплитуде ответов, а совместное применение двух факторов не давало аддитивного эффекта в плане влияния на сигнальный каскад NF-kB. Тем не менее, нам удалось выявить заметный аддитивный эффект тимулина и ингибитора IKK Inhibitor XII при влиянии на сигнальный каскад SAPK/JNK. В период, когда активация каскада SAPK/JNK была максимальной (19 день), введение факторов по отдельности снижало активацию SAPK вдвое по сравнению с нелеченными животными, тогда как при совместном их применении уровень фосфорилирования SAPK снижался почти до контрольных значений. Также следует отметить, что тимулин и ингибитор снижали уровень продукции индуцируемого белка теплового шока БТШ72 на поздних стадиях заболевания и, вместе с тем, ингибитор несколько увеличивал его продукцию на ранней стадии.

Таким образом, обе формы ЕАЕ характеризовались вовлечением Т-хелперов 1 и 17 типа, которые активировались последовательно. Из двух тимусных пептидов - тимулина и тимопентина - большую эффективность для коррекции аутоиммунной патологии проявлял тимулин, обладающий противовоспалительным эффектом. Схожий с тимулином защитный эффект проявил ингибитор сигнального каскада NF-кВ. Т-хелперы типа 1 были более чувствительными к корректирующему действию тимулина, чем Т-хелперы типа 17. Механизмы иммунокорректирующего действия тимулина, вероятно, задейстуют белки сигнального каскада NF-kB.

контроль ЭАЭ ЭАЭ+ ЭАЭ+ ЭАЭ+ ТМ инг ТМ+инг

контроль ЭАЭ ЭАЭ+ ЭАЭ+ ЭЛЭ+ ТМ инг ТМ+инг

день 22

контроль ЭАЭ ЭАЭ* ЭАЭ+ ЭАЭ+ ТМ инг ТМ+инг

день 15

день 19

контроль ЭАЭ ЭАЭ+ ЭАЭ+ ЭАЭ+ ТМ инг ТМ+ииг

лень 15

день 19

лень 22

день 22

Рис. 3.4.3. Фосфорилирование 1ККа/|3 (А) и Яе1А/рб5 (В), вАРКЛЭДС (С) а также продукция БТШ72 (О) в лимфоцитах селезенки в процессе развития заболевания в разных группах животных: Нелеченные животные (ЭАЭ), животные, получавшие тимулин (тм), ингибитор (инг), тимулин и ингибитор (тм+инг) я одновозрастный контроль. Гистограммы показывают количество белка ± ст.ошибка относительно внутр. контроля по тубулину (не показан), и значения получены в результате денситометрии белковых полос в трех независимых экспериментах. * достоверное отличие от контроля, р<0.05 А достоверное отличие от группы ЭАЭ, р<0.05

3.5 Поиск мишеней тимусного гормона тимопоэтина и разработка новых подходов для коррекции иммунного дисбаланса

В качестве потенциальной мишени для тимопоэтина был выбран мембранный комплекс белков Т-клеточного рецептора (ТКР), взаимодействующий с молекулой главного комплекса гистосовместимости (МНС) человека (HLA-A2) и вирусным пептидом, который служит, в данном случае, примером антигена, презентуемого Т-лимфоциту. Пространственная структура исследованного комплекса взята из Protein Data Bank (код 1А07). Комплекс состоит из пяти субъединиц, из которых нами для расчетов были использован комплекс D+E (по Protein Data Bank), представляющий собой экстраклеточные домены а- и бета-субъединиц рецептора ТКР, соответственно (каждый из которых имеет вариабельные и константные участки). В некоторых расчетах также были учтены субъединица A (HLA-А2) и субъединица С (вирусный белок TAX Т-лимфотропного вируса человека типа 1). (Рисунок 3.5.1).

Рис. 3.5.1 Структура комплекса 1А07, включающего а и бета-цепи Т-клеточного рецептора (D и Е) и МНС (А).

На первом этапе исследования моделировали динамическое поведение «очищенного» комплекса D (остатки с 1 по 121) + Е (остатки с 3 по 246) из структуры 1А07 (МНС с поверхности АПК и ТКР-рецептор с поверхности Т-клетки). Число атомов в целом комплексе составило 4955; учет растворителя был осуществлен в приближении «implicit water» с диэлектрической константой в = 80. До расчета молекулярно-динамической траектории энергию системы минимизировали в течении 1000 шагов при температуре 298К, длина самой траектории составляла 1000 ps. Анализ траектории показал, что макромолекулярный комплекс не разрушается при условиях, моделируемых в нашем расчете, что позволило нам стандартизировать протокол расчета и распространить его на последующие расчеты (Т = 298 К, давление = 1 атм, шаг

= 1 Фс).

Мембранный комплекс белков рецептора Т-клеток (ТКР) способен связывать

широкий набор вариантов пептидов, но далеко не все они проявляют

иммуностимулирующие свойства гормона тимопоэтина. Белок из структуры 1А07, например, кристаллизован с вирусным пептидом TAX, и контакты между Т-клеточным рецептором, вирусным пептидом и молекулой HLA-A2 были описаны в работе (Garboczi et al., 1996). Для изучения же особенностей связывания пептидов, обладающих необходимой нам активностью, за основу был взят известный миметик гормона тимопентин, состоящий из пяти аминокислотных остатков RKDVY. Для поиска новых, более эффективных миметиков тимопоэтина, были использованы следующие модели: известные и применяемые сейчас вещества, такие как тимопентин (ТР5), иммунофан (синтетический гексапептид RKDVYR), тимоген (синтетический дипептид Glu-Trp, EW), а также предлагаемые нами - ацетилированный и амидированный ТР5, только ацетилированный ТР5, а также модификации ТР5, созданные точечными заменами аминокислотных остатков (V4K, V4K Y5R, Y5K, Y5W, Y5F, Y5P, Y5H, V4K-Y5W, V4D-Y5W, V4H-Y5W, V4L-Y5W, V4S-Y5W) и полностью модельные конструкции и короткие пептиды (KKDKKY, KKEKKY, 5-А1а, 5-Gly), направленные на уточнение взаимодействий, лежащих в основе связывания «идеального пептидного миметика» гормона тимопоэтина.

Расчет гибкого докинга тимопентина (и всех остальных моделей) на мишень (!А07) проводился в условиях полной конформационной свободы пептида: в поиске оптимального положения было возможно вращение вокруг всех одинарных связей в остове молекулы. Для дополнительной калибровки метода и обоснования выбора мишени нами был рассчитан докинг тимопентина на целый ряд других белков: 1ЕКВ (энтеропептидаза), 2Z35 (а и бета цепи рецептора Т-клеток), 1LYS (лизоцим). Анализ результатов и ранжир полученных структур по энергии связывания выявил наибольшее сродство ТР5 к мембранному комплексу белков рецептора Т-клеток (ТКР), который и рассматривался как основная мишень.

Полученные энергии сродства для тимопентина с местом связывания на поверхности белков таковы: ТР5 на 1А07 (Еср= -7.1 ккал/моль); ТР5 на 1ЕКВ (Еср = -6.4 ккал/моль); ТР5 на 2Z35 (Еср = -5.7 ккал/моль); ТР5 на 1LYS (Еср = -6.3 ккал/моль). Эти данные подтверждают наше предположение о предпочтительном взаимодействии ТР5 с белковым комплексом 1А07 - миметик располагается в своеобразном «кармане» (Рис. 3.5.2., слева). Расчет же докинга дипептидного миметика тимогена на эту мишень выявил иное место посадки такой малой молекулы, по сравнению с пентапептидом (Рис. 3.5.3), что

может быть объяснено именно малыми размерами лиганда-дипептида, который может равновероятно контактировать с большим числом точек на поверхности мишени.

Рис. 3.5.3. Рассчитанные оптимальные места связывания тимогена и тимопентина на изолированном комплексе 1А07 (без вирусного пептида TAX и субъединицы А). Красным цветом показано наивысшая аффинность связывания для тимогена (справа), синим цветом - для тимопентина (слева).

Иное, чем для исходного миметика, место связывания было выявлено для тимопентина (ТР5) с защищенными N- и С-концами молекулы, которые были, соответственно, ацетилированы и амидированы. Аффинность взаимодействия такого пептида с мишенью была оценена нами в -6.3 ккал/моль, что меньше, чем у исходного миметика ТР5 (-7.1 ккал/моль). Еще меньшей оказалась рассчитанная аффинность ТР5 с одним ацетилированным N-концом (-6.2 ккал/моль). Для планирования «точечного мутагенеза расчетной модели» представлялось важным детально изучить окрестности зоны связывания миметика на поверхности мишени. Для этого комплекс 1А07+ТР5 был проанализирован с помощью пакета LigPlot. Полученная развертка, позволяющая судить о взаимодействиях в рецепторном «кармане» на поверхности субъединиц D+E из 1А07 приведена на Рисунке 3.5.4. На развертке хорошо видно, что остатки Argl, Lys2 и Туг5 участвуют в водородном связывании с заряженным аминокислотным окружением мишени, тогда как остаток Val4 граничит с алифатическими остатками. Первый мутант был предложен нами именно по остатку 4 - представляло интерес оценить эффект от привнесения заряда в позицию 4 пентапептида, причем с этой заменой пентапептид становился в некоторой степени симметричным: Arg-Lys-Asp-Lys-Tyr. Расчет гибкого докинга показал, что мутант тимопентина V4K связывается с белковым комплексом D+E из 1А07 с аффинностью -5.6 ккал/моль, что значительно хуже, чем у исходного ТР5.

Введение же остатка Arg в концевом положении 5 делает молекулу полностью симметричной, однако такая модификация все равно проигрывает по аффинности исходному ТР5 - для двойного мутанта V4K Y5R сродство составляет -6.0 ккал/моль. Установив низкую перспективность создания симметричной молекулы, мы предприняли попытку осуществить частичный скрининг остатков в позициях 5 и 4. Рассчитанные результаты аффинности проверенных нами мутантов тимопентина приведены в Таблице 3.5.1.

Рис. 3.5.4 Описание взаимодействий в контактном «кармане»: предполагаемые зоны связывания в комплексе (D+E комплекса 1А07) + ТР5.

Таблица 3.5.1. Аффинности модификаций ТР5 при посадке на комплекс D+E из 1А07.

Замены Сродство Примечание

(ккал/моль)

(Y5K) -6.0

(Y5W) -7.3 лидер

(Y5F) -6.2

(Y5P) -6.7

(Y5H) -6.4

(V4K-Y5W) -6.4

(V4D-Y5W) -6.8

(V4H-Y5W) -7.0

(V4L-Y5W) -6.8

(V4S-Y5W) -7.1 второе место

Среди полученных результатов обращают на себя внимание варианты с заменами концевого Туг5 на Тгр5 - при таких мутациях аффинность пентапептида становится выше

(-7.3 ккал/моль), чем у исходного ТР5, причем с сохранением исходного места связывания. Для двойных мутантов также получен обнадеживающий результат: молекула с заменами V4S-Y5W, аффинность которой при связывании с белковым комплексом 1А07 оценена в -7.1 ккал/моль, что тождественно сродству исходного ТР5. Развертки соответствующих взаимодействий приведены на Рисунке 3.5.5.

Рис. 3.5.5 Описание взаимодействий в контактном «кармане»: предполагаемые зоны связывания в комплексах 1А07 +Y5W (вверху) и 1А07 + V4S-Y5W (внизу).

Следует отметить, что были также проведены расчеты гибкого докинга двух пентапептидов, состоящих из аланина и из глицина. Места посадки таких молекул на комплекс 1А07 оказались такими же, как и для ТР5, однако аффинности были сильно понижены: -4.8 ккал/моль для 5-Gly и -5.3 ккал/моль для 5-А1а.

Для более полной картины взаимодействий в рецепторном участке комплекса 1А07 мы рассчитали докинг этой молекулы с синтетическим гексапептидом - иммунофаном (RKDVYR), состав которого подобен ТР5, а также с двумя его модификациями: KKDKKY и KKEKKY. Полученные данные приведены в Таблице 3.5.2 - ни одна из рассчитанных величин не превышает сродства тимопентина (ТР5).

Таблица 3.5.2. Рассчитанные аффинности модификаций ТР5 при посадке на комплекс D+E из 1А07.

3 I?*

conipkx-with-YSW-stmctl

compleX'With-V4S-Y5W

Молекулы

Сродство (ккал/моль)

RKDVYR (иммунофан) -6.8 KKDKKY -6.4

KKEKKY -6.2

-6.4

-6.2

Для исследования взаимодействий тимопентина (ТР5) с полным собранным комплексом структуры 1А07 нами была выполнена дополнительная серия расчетов, в которой рецепторами для гибкого докинга ТР5 были выбраны следующие молекулы: комплекс D+E+A, а также комплекс D+E+A+связанный вирусный пептид TAX. Данные расчеты были направлены на выявление предпочтительного места связывания ТР5: на поверхности белка МНС поверхности макрофага (субъединица А) или на поверхности цепи Т-клетки (субъединицы D+E). Полученные нами аффинности ТР5 и всех рассмотренных комплексов приведены в Таблице 3.5.3.

Таблица 3.5.2. Рассчитанные аффинности тимопентина на комплексах из 1А07

Молекулы Сродство (ккал/моль)

ТР5 на D+E -7.1

ТР5 на D+E+A -8.4

ТР5 на D+E+A+вирусный пептид -6.8

TAX

Анализ мест связывания ТР5 с изученными комплексами показал, что при взаимодействии с D+E+A (т. е., в сочетании молекулой МНС), когда в комплексе существует свободная полость, тимопентин, предпочтительно, занимает именно её (с аффинностью -8.4 ккал/моль) (Рисунок 3.5.6), а также для него существует место связывания в «кармане» (с аффинностью -6.8 ккал/моль), что хорошо согласуется с описанной выше топологией посадки ТР5 на D+E (без А, т. е. молекулы МНС).

Рис. 3.5.6. Рассчитанные места связывания ТР5 в комплексе с D+E+A: внутри полости (слева) и в «кармане» на D+E (справа).

Для случая взаимодействия тимопентина и комплекса D+E+A+вирусный пептид TAX расчет выявил предпочтительность связывания ТР5 в «кармане» (с аффинностью -6.8 ккал/моль) - как и в случае с топологией посадки ТР5 на D+E (без субъединицы А). По итогам проведенного анализа мест связывания иммуностимулирующего пептида и

полученных величин аффинности можно сделать следующие заключения: предпочтительной для посадки тимопентина является полость, образованная жёлобом в субъединице А комплекса 1А07, перекрытым сверху субъединицами D+E (Рисунок 3.5.6. слева). В случае недоступности данного места посадки, когда полость уже занята каким-либо другим пептидом, тимопентин, вероятно, садится в «карман» на субъединицах D+E (Рисунок 3.5.7).

Рис. 3.5.7. Рассчитанное место связывания ТР5 в комплексе с D+E+A+вирусный пептид TAX: (тимопентин показан голубым цветом - в «кармане»; вирусный пептид обозначен красной областью).

Подводя итог расчетам гибкого докинга, стоит отметить, что нами выявлены две модификации тимопентина, сродство которых к мишени равно или превышает таковое для ТР5: это Y5W и V4S-Y5W. Для тестирования этих макромолекулярных комплексов на стабильность при моделировании динамического поведения этих систем, были выполнены соответствующие молекулярно-динамические расчеты. Анализ полученных траекторий длиной 1000 ps не выявил разрушений комплексов при температуре 298°К и давлении 1 атм, что свидетельствует об их достаточной стабильности, соизмеримой, по крайней мере, с таковой у исходного ТР5. На заключительном этапе исследования мы рассчитали спектры потенциальной биологической активности (Poroikov & Filimonov, 2005, Stepanchikova et al., 2003) тимопентина и его двух перспективных модификаций. Полученные данные свидетельствуют о высокой вероятности наличия у этих молекул более, чем 22 различных активностей, в том числе у ТР5 присутствуют следующие: ингибитор энтеропептидазы (98%), ингибитор питрилизина (93,4%), ингибитор катепсина Т (92%) и ингибитор щелочной фосфатазы (92%), а также радиопротекторные свойства (84%). Данные для мутанта Y5W таковы: ингибитор питрилизина (97%), ингибитор

энтеропептидазы (95%), ингибитор катепсина Т и пептидный агонист (87%), иммуностимулятор (79%) и гематопоэтическая активность (70%). Прогнозируемые активности модификации V4S-Y5W выглядят так: иммуностимулятор (87%), радиопротектор (86%), лечение метаболических заболеваний (81%) и хемопротектор (71%). Выполненные прогнозы согласуются с нашими представлениями о вероятности сохранения у модификаций тимопентина полезных активностей ТР5 и отсутствия новых ингибиторных свойств или выраженных токсичностей.

Подводя итоги выполненным теоретическим исследованиям, стоит отметить, что на основе современных расчетных методов показана принципиальная возможность связывания тимопентина с комплексом TCR-MHC I, причем с биологической точки зрения возможно связывание тимопентина как вне клетки, на уже занятый рецептор, так и внутри клетки, на еще свободный от презентируемых белков комплекс МНС. Смоделировано и изучено несколько модификаций молекулы тимопентина - миметика гормона тимопоэтина. Все эти варианты обладают разной аффинностью к мишени, белковому комплексу 1А07; особенно выделяются две модификации: Y5W и V4S-Y5W. Эти пептиды, на наш взгляд, следует синтезировать и подвергнуть проверке иммуностимулирующей активности в экспериментах с использованием живых систем.

Заключение

В настоящей работе впервые были систематически изучены и описаны периферические функции 2-х тимусных пептидов и было показано, что они способны модулировать системный воспалительный ответ. Данные о том, что тимусные пептиды являются регуляторами ответа периферических иммунных клеток (как врожденного, так и адаптивного иммунитета), а также данные об интеграции тимусных гормонов в систему регуляции стрессового ответа, подтверждают наши предположения, что эндокринная активность тимуса может входить в качестве периферического звена в гипоталамо-гипофизарно-адреналовую систему. Более того, подтверждаются полученные нами ранее сведения о том, что эндокринная активность тимуса носит сложный характер, и выделяемые им пептидные гормоны обладают разным спектром действия на иммунные клетки и нейроэндокринные системы. Мы показали, что эти особенности тимусных пептидов могут быть успешно использованы для коррекции патологий, связанных с дисбалансом системной регуляции воспалений. При разработке подходов к коррекции

такого рода необходимо учитывать как особенности патологии (состояние иммунной системы), так и спектр действия выбранного тимусного пептида. Наши данные показывают, что для коррекции патологии с чрезмерной активацией иммунной системы, какой является аутоиммунное воспаление, наиболее эффективным является тимусный пептид тимулин. Этот пептид снижает патологическую активность иммунных клеток и улучшает общее состояние организма. С другой стороны, при длительной хронической патологии септического типа, характеризующейся угнетением иммунной системы, более эффективным оказывается пептид тимопентин, обладающий иммуностимулирующими свойствами. Он нормализует угнетенные ответы иммунных клеток, что препятствует развитию тяжелой формы воспаления. Применение тимусных пептидов следует считать более безопасным, чем использование гормонов надпочечников, таких как глюкокортикоиды, которые обладают очень широким спектром действия и, следовательно, большим количеством побочных эффектов. Действие тимусных гормонов направлено на иммунные клетки, и их можно применять, согласно имеющимся данным, даже в больших дозах.

Проведенный нами анализ показывает, что тимусные пептиды могут быть связующим звеном не только между нейроэндокринной и иммунной системами, но также между иммунными и соматическими клетками. На это указывает повсеместная распространенность известных белков-предшественников тимусных пептидов, которые являются внутриядерными белками соматических клеток. Наш анализ показывает, что выход этих ядерных белков из клеток и их расщепление может быть ранним сигналом о различных важных процессах в тканях, требующих реакции иммунной системы. В рамках данной концепции, на основании имеющегося комплекса свойств и сходства аминокислотной последовательности, нами был предложен кандидат на роль пока неизвестного белка-предшественника тимулина.

Также в настоящей работе продемонстрированы некоторые молекулярные механизмы действия тимусных пептидов. Показано, что эти вещества являются эффективными модуляторами сигнального каскада ОТ-кВ - важного пути, на котором сходятся многие пути специфической и неспецифической активации лимфоцитов, и который индуцирует экспрессию генов многих провоспалительных цитокинов. Таким образом, можно предполагать, что одним из механизмов действия этих пептидов может быть изменение порога активации лимфоцитов через модуляцию активности каскада

кВ. Рецепторы данных пептидов пока остаются неизвестными. Однако нами была проведена работа по компьютерному моделированию связывания тимопентина с рецепторным комплексом Т-клеточного рецептора, и показана возможность высокоаффинного связывания, а также разработаны структурные модификации тимопентина, обладающие более высокой аффинностью в отношении этого рецепторного комплекса, которые могут стать основой для создания перспективных лекарственных препаратов.

Выводы

1. На основании оценки in vitro продукции цитокинов (ИЛ-1а, ФНОа, ИЛ-6 и ИФНу), белка теплового шока (БТШ72) и уровня фосфорилирования сигнальных белков каскадов NF-кВ и SAPK/JNK впервые установлено, что тимусные пептиды (тимулин и тимопентин) регулируют не только активность лимфоцитов, но способны стимулировать секреторную активность макрофагов в условиях, исключающих влияние лимфоцитов. Это указывает на прямое участие гормонов тимуса в регуляции не только адаптивного, но и врожденного иммунитета. Установлено, что эффекты тимусных пептидов на макрофаги, по меньшей мере, частично обусловлены воздействием на сигнальные каскады NF-кВ и SAPK/JNK,

2. Впервые установлено, что в условиях хронического воспаления, индуцированного длительным введением эндотоксина и характеризующегося угнетенным состоянием иммунной системы, тимопентин оказывает заметный защитный эффект, выражающийся в нормализации уровней продукции цитокинов ИЛ-2, ИФНу и ФНО-а, а также оксида азота, белка теплового шока БТШ72 и количества клеток в тимусе.

3. С использованием модели рассеянного склероза, не сопровождающегося летальностью, впервые показано, что аутоиммунное воспаление характеризуется двухфазной активацией разных популяций Т-хелперов (Thl и Thl7). На этой модели тимулин более эффективно, чем тимопентин, корректировал ответ клеток Thl7, ассоциированных с аутоиммунным воспалением, и его влияние было более пролонгированным. С другой стороны, тимопентин снижал "типичный" провоспалительный ответ, связанный с популяцией клеток Thl.

4. С использованием модели рассеянного склероза с более серьезной симптоматикой и высокой летальностью подтвержден двухфазный характер цитокинового ответа. Впервые

установлено, что использование тимулина и ингибитора каскада NF-кВ (IKK Inhibitor XII) снижало ранний провоспалительный ответ и улучшало состояние животных. Сходство эффектов тимулина и ингибитора, а также отсутствие аддитивности эффектов указывает на общий механизм их действия через подавление активности каскада NF-kB.

5. Методами молекулярного моделирования продемонстрировано высокоаффинное взаимодействие тимопентина с человеческим рецепторным комплексом Т-клеточный рецептор / белок МНС I. Предсказаны структурные модификации тимопентина, обладающие более высокой аффинностью связывания с указанным рецептором, чем исходный пептид, на основе которых могут быть разработаны новые перспективные лекарственные препараты.

Список публикаций по теме диссертации Публикации в рецензируемых журналах

1. Новоселова Е.Г., О.В. Глушкова, Д.А. Черенков, С.Б. Парфенюк, Т.В. Новоселова, С.М. Лунин. М.О. Хренов, И.В. Гужова, Б.А. Маргупис, Е.Е. Фесенко. Продукция белков теплового шока, цитокинов и оксида азота при токсическом стрессе. Биохимия, 2006, 71, вып. 4, 471-480.

2. Lunin S.M.. Khrenov М.О., Novoselova T.V., Parfenyuk S.B. and Novoselova E.G. Thymulin,a thymic peptide, prevents the overproduction of pro-inflammatory cytokines and heat shock protein Hsp70 in inflammation bearing mice, Immunological Investigations, 2008 37:1-12

3. Глушкова, О.В. Новоселова Е.Г., Хренов М.О., Новоселова Т.В., Черенков Д.А., Лунин С.М.. Фесенко Е.Е.. Роль белков теплового шока БТШ90 в ответах иммунных клеток. Биофизика 2008. Т.53. вып. 1.С. 93-98.

4. Е.Г. Новоселова, М.О. Хренов, Д.А. Черенков, О.В. Глушкова, Т.В. Новоселова, С.М. Лунин. Е.А. Лысенко, Е.Е. Фесенко. Участие рецептора TLR4 в формировании стрессового ответа лимфоцитов. Биофизика. 2008 Т. 53 № 4.

5. Е.Г. Новоселова, С.М. Лунин. М О. Хренов, Д.А. Черенков, Т.В. Новоселова, Е.А. Лысенко, Е.Е. Фесенко. Иммуномодулирующие эффекты тимусного гормона тимопентина. Известия РАН. Серия биологическая 2008 №4. стр. 422-428

6. С.М. Лунин. Т.В. Новоселова, М О. Хренов, О.В. Глушкова, С.Б. Парфенюк, Т.И. Смолихина, Е.Е. Фесенко, Е.Г. Новоселова. Иммуномодулирующие эффекты тимопентина при остром и хроническом воспалениях у мышей. Биофизика, 2009, т.54 вып. 2 с.260-266.

7. Е.Г Новоселова, С.М. Лунин. М.О. Хренов, Т.В. Новоселова, Е.Е. Фесенко, Участие сигнального каскада NF-кВ в реализации анти-воспалительной активности тимусных пептидов // Доклады Академии наук. 2009,428, № 5. С. 707-709.

8. Novoselova EG., Lunin S.M.. Novoselova TV., Khrenov MO., Glushkova OV, Avkhacheva NV, Safronova VG, Fesenko EE. Naturally occuring antioxidants nutrients reduce inflammatory response in mice, European Journal ofPharmacology, 2009, 615,234-240.

9. Lunin SM. Novoselova EG, Thymus hormones as prospective anti-inflammatory agents., Expert Opin Ther Targets., Review. 2010, 14, № 8, 775-786.

10. Глушкова O.B., Е.Г. Новоселова, Т.В. Новоселова, М.О. Хренов, С.Б. Парфенюк, С.М. Лунин. Е.Е. Фесенко. Роль белка теплового шока HSP 90 в формировании защитных ответов при остром токсическом стрессе у мышей. Биохимия, 2010, Т. 75, Вып. 6, 789-795.

11. Lunin SM. Glushkova OV, Khrenov MO, Parfenyuk SB, Novoselova TV, Fesenko EE, Novoselova EG. Thymus peptides regulate activity of RAW 264.7 macrophage cells: inhibitory analysis and a role of signal cascades. Expert Opin Ther Targets. 2011 Dec;15(12):1337-46.

12. Lunin SM. Glushkova OV, Khrenov MO, Novoselova TV, Parfenyuk SB, Fesenko EE, Novoselova EG. Thymic peptides restrain the inflammatory response in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Immunobiology. 2013 Mar;218(3):402-7.

13. Glushkova OV, Parfenyuk SB, Khrenov MO, Novoselova TV, Lunin SM, Fesenko EE, Novoselova EG. Inhibitors of TLR-4, NF-кВ, and SAPK/JNK signaling reduce the toxic effect of lipopolysaccharide on RAW 264.7 cells. J Immunotoxicol. 2013 Apr-Jun;10(2):133-40.

14. Kondratyev MS, Lunin SM. Kabanov AV, Samchenko AA, Komarov VM, Fesenko EE, Novoselova EG. Structural and dynamic properties of thymopoietin mimetics. J Biomol Struct Dyn. 2013 Sep 11. [Epub ahead of print]

15. Новоселова T.B., Глушкова O.B., Парфенюк С.Б., Хренов М.О., Лунин С.М.. Смолихина Т.И., Фесенко Е.Е., Новоселова Е.Г. Влияние in vitro и in vivo ряда ингибиторов сигнальных каскадов на продукцию цитокинов и сигнальных белков в макрофагах raw 264.7 и в лимфоцитах мышей. Биофизика, 2014, том 59, вып. 1, с. 112-117.

Статьи в сборниках

16. Е.Г. Новоселова, О.В. Глушкова, С.М. Лунин. Т.В. Новоселова, М.О. Хренов, Д.А. Черенков, Е.Е. Фесенко. Антиоксиданты и токсический стресс: участие белков теплового шока, цитокинов и оксида азота. Научно-практический журнал ОТКРЫТОЕ ОБРАЗОВАНИЕ, 2006, № 3, 408-410.

17. Лунин С.М.. Глушкова О.В., Хренов М.О., Новоселова Т.В., Новоселова Е.Г., Участие сигнальных каскадов NF-kB и SAPK/JNK в регуляции ответа клетки на стресс, // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (2-4 июня 2009 г.). Сборник статей под ред. В.П. Зинченко, С.С. Колесникова, A.B. Бережного. Том 2. С. 474-478.

18. Хренов М.О., Глушкова О.В., Новоселова Т.В., Парфенюк С.Б., Лунин С.М.. Новоселова Е.Г. Роль сигнального каскада NF-kB при защите животных in vivo от острого токсического стресса. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Сборник статей, т. 2, 616-621. Ред. В.П. Зинченко и др., Пущино 2013.

Тезисы конференций

19. Novoselova T.V., Chrenov М.О., Lunin S.M.. Cherenkov D.A., Glushkova O.V., Novoselova E.G. Comparative study of immune cell function in acute and chronic models of toxic stress. VIII World Congress, Intern. Society for adaptive medicine (ISAM), Moscow, 2006, p. 121-122.

20. Куликов A.B., Новоселова Е.Г., Архипова Л.В., Смирнова Г.Н., Глушкова О.В., Черенков Д.А., Лунин С.М., Клёчкин К.А., Куликова П.А., Сухих Г.Т., Способы торможения возрастной инволюции тимуса у стареющих животных, «Биологические механизмы старения», VII Международный симпозиум, 2006, Харьков, с 48-49.

21. Новоселова Е.Г., Глушкова О.В., Черенков Д.А, Новоселова Т.В., Лунин С.М.. Хренов М.О. Окислительный стресс при острых и хронических воспалениях: снижение токсического повреждения путем антиоксидантной защиты // Нейронаука для медицины и психологии. 2-й Международный междисциплинарный конгресс. Труды конгресса. - Судак: МАКС Пресс. - 2006. -С. 136-137.

22. Новоселова Т.В., Глушкова О.В., Черенков Д.А.,. Лунин С.М.. Хренов М.О., Новоселова Е.Г. Роль цитокинов и оксида азота в развитии стресса, индуцированного эндотоксином. Окисление, окислительный стресс, и антиоксиданты: Всероссийская конференция молодых ученых и 2 школа им. Академика Н.М. Эммануэля. М.: Изд-во РУДН, 2006 С.182-184.

23. Хренов М.О., Глушкова О.В., Черенков Д.А., Новоселова Т.В., Лунин С.М. Защитная роль антиоксидантов при окислительном эндотоксическом стрессе //Окисление, окислительный стресс, и антиоксиданты: Всероссийская конференция молодых ученых и II школа им. академика Н.М. Эмануэля. Доклады и тезисы. - М.: Изд-во РУДН. - 2006. - С. 201 - 202.

24. Новоселова Т.В., Лунин С.М.. Хренов М.О., Глушкова О.В., Черенков Д.А., Парфенюк С.Б., Исследование продукции цитокинов и оксида азота при токсическом стрессе, «Биология наука XXI века», 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, 2006, с 116.

25. Лунин С.М. Роль т имусного гормона тимопентина в регуляции активности иммунокомпетентных клеток и компенсации иммунодепрессивных состояний. В Сб.: «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», 2007, Судак, Крым, стр. 73-74.

26. Lunin S.M.. Novoselova T.V., Khrenov М.О., Novoselova E.G. Endocrine regulation of inflammation: thymic hormone influence on cytokine profile. 8th John Humphrey advanced summer programme in immunology, Moscow, 2007, p 34.

27. Лунин С.М. Влияние пептидов тимуса на регуляцию острого воспалительного процесса у животных. 11-я Пущинская международная конференция молодых ученых, 2007, стр 73-74

28. Лысенко Е.А., Лунин С.М.. Хренов М.О., Черенков Д.А., Глушкова О.В.. Новоселова Т.В. Влияние тимусных гормонов на продукцию беков теплового шока при остром токсическом стрессе // 11-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сб. трудов, 2007. - С.260 - 261.

29. Лунин С.М.. Новоселова Т.В., Хренов М.О., Глушкова О.В., Лысенко Е.А., Новоселова Е.Г. Роль пептидов тимуса в регуляции иммунного ответа // XX съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. Тезисы докладов. - М.: Издательский дом «Русский врач», 2007. - С. 314.

30. Новоселова Е.Г., С.М. Лунин. Т.В. Новоселова, М.О. Хренов, Д.М. Черенков. Исследование молекулярных механизмов функционирования защитных систем клетки при системном воспалительном синдроме и сепсисе у мышей. Поиск новых направлений лечения. Тезисы конференции «Фундаментальные науки - медицине», Москва, 2007, 28-29.

31. Новоселова Е.Г., Хренов М.О., Лысенко Е.А., Новоселова Т.В., Лунин С.М.. Окислительный стресс и система сигнальной трансдукции. Материалы Четвертой крымской конференции «Окислительный стресс и свободно-радикальные патологии», Судак, 2008, стр 39.

32. Е.Г. Новоселова, С.М. Лунин. М.О. Хренов, Т.В. Новоселова, О.В. Глушкова, С.Б. Парфенюк Исследование молекулярных механизмов функционирования защитных систем клетки при системном воспалительном синдроме и сепсисе у мышей. Поиск новых направлений лечения. Тезисы конференции «Фундаментальные науки - медицине», Москва, 2008, 36-37.

33. Лунин С.М. Влияние тимусного гормона тимулина с зависимой от цинка биологической активностью на периферические иммунные клетки, Материалы четвертого международного междисциплинарного конгресса, Судак, 2008 год, стр. 185-187.

34. Новоселова Е.Г., Лунин С.М.. Хренов М.О., Новоселова Т.В., О.В. Глушкова, С.Б. Парфенюк, Д.А. Черенков, С.А. Соодаева, Исследование молекулярных механизмов функционирования защитных систем клетки при системном воспалительном синдроме и сепсисе у мышей. Поиск новых направлений лечения. Тезисы конференции «Фундаментальные науки - медицине», Москва, 2009 стр. 20-22.

35. Лунин С.М.. Тимусный гормон тимопозтин регулирует ответ на хронический стресс, Международный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», Крым, Судак, 2009, стр 147.

36. Е.Г. Новоселова, О.В. Глушкова, С.М. Лунин. М.О. Хренов, Т.В. Новоселова, С.Б. Парфенюк, С.А. Соодаева, Исследование молекулярных механизмов функционирования защитных систем клетки при системном воспалительном синдроме и сепсисе у мышей. Поиск новых направлений лечения. Тезисы конференции «Фундаментальные науки - медицине», Москва, 2010 стр. 22-24.

37. Лунин С.М. Связь нейроэндокринной и иммуномодулирующей активности тимусных гормонов. 7 Международный междисциплинарный конгресс Нейронаука для медицины и психологии, стр. 271272. Судак, Крым, Украина, 3-13 июля 2011 г.

38. Хренов М.О., Парфенюк С.Б., Глушкова О.В., Новоселова Т.В., Лунин С.М.. Новоселова Е.Г. Экспрессия стрессовых и сигнальных белков макрофагальными клетками линии RAW 264.7 при токсическом стрессе, Цитология 2011, 53(9) стр 718

39. Лунин С.М.. Хренов М.О., Влияние тимусного гормона тимулина в условиях экспериментального аутоиммунного воспалительного процесса. 8 Международный междисциплинарный конгресс Нейронаука для медицины и психологии, стр. 255-256. Судак, Крым, Украина, 2-12 июня 2012 г.

40-Lunin SM. Khrenov МО, Novoselova TV, Parfenyuk SB, Novoselova EG. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with thymic peptide thymulin and an inhibitor of NF-kappaB signaling. 7th International Leukocyte Signal Transduction Conference, Kos, Greece, 2013, v 75 p. 29

Список сокращений и обозначений

DMSO - диметилсульфоксид, HSP - белок теплового шока (англ Heat Shock Protein), IkB - ингибирующий фактор для NF-kB (от англ. Inhibitory), IKK - киназа IkB (англ. IkappaB kinase), JNK - киназа N-конца c-Jun (англ c-Jun N-terminal kinase), MBP - базовый белок миелина (англ. myelin basic protein), МНС - главный комплекс гистосовместимости (англ. major histocompatibility complex,), MOG - белок олигодендроцитарного миелина (англ. myelin olygodendrocyte glycoprotein), NF-кВ - ядерный фактор каппа-Би (англ. Nucear Factor), NO - оксид азота (II), SAPK - стресс-активируемая протеинкиназа (англ. Stress-activated proteinkinase), Th - лимфоциты Т-хелперы (англ T-helpers), TLR - Toll-подобный рецептор (англ Toll-like receptor), TNF - фактор некроза опухолей (англ. Tumor necrosis factor), АКТГ - адренокортикотропный гормон, БТШ - белки теплового шока, ИЛ - интерлейкин, ИФА - иммуноферментный анализ, ИФН - интерферон, ЛПС -липополисахарид, НААГ - полиакриламидный гель, ФНО - фактор некроза опухолей, ЭАЭ - экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит

Подписано в печать 27.12.13 г. Печать лазерная

Заказ №4791 Тираж: 75 экз.

Типография «Р1хРппЬ> ИНН 503900523316 142290, Пущино, м-н «АБ», 22 (4967)75-97-84 www.fix-print.ru

Информация о работе

Лунин, Сергей Михайлович
доктора биологических наук
Пущино, 2014
ВАК 03.01.04

Автореферат

Похожие работы