Синтез и некоторые фармакологические свойства низкомолекулярных цинксодержащих иммуноактивных пептидов

Гиесов, Асомуддин Шамсуддинович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Синтез и некоторые фармакологические свойства низкомолекулярных цинксодержащих иммуноактивных пептидов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Синтез и некоторые фармакологические свойства низкомолекулярных цинксодержащих иммуноактивных пептидов"

' г 5 о Л

На правах рукописи

СИНТЕЗ И НЕКОТОРЫЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ! СВОЙСТВА НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЦИНКСОДЕРЖАЩИХ ИМ МУНОАКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ

03.00.04 - Биохимия 14.00.25 - Фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации га соискание ученой степени кандидата биологических наук

Душанбе-1999

Работа выполнена в МП "Занд", Институте химии им. В.И.Никитина АН Республики Таджикистан, Таджикском научно-исследовательском ветеринарном институте.

Научные руководители: академик Академии наук

Республики Таджикистан, доктор медицинских наук, профессор ХАЙДАРОВ К.Х. кандидат химических наук БОБИЕВ Г.М.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Абдуллоев А. доктор медицинских наук ИшонкуловаБЛ.

Ведущая организация - Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова.

Защита состоится " 2000 г. в & часов на

заседании диссертационного совета Д 065.01.06 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктор биологичских наук в Таджикском государственном национальном университете (734025, г.Душанбе, пр.Рудаки,17).

С диссертацией можно ознакомиться а библиотеке Таджикского государственного национального университета.

Автореферат разослан "_"

1999г.

Ученый секректарь диссертационного совета доктор биологческих наук

{ /7ЯХ М(/иьс ] Г7?^> Тй^ыР^и^^7

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема. В последние. годы все большее количество исследований в области биологической химии и фармакологии посвящается поиску вешеств, способных влиять на состояние иммунитета - регуляторов и корргктеров иммунной системы организма. Это связано с тем, что большинство заболеваний человека и животных сопровождается нарушениями нормального функционирования иммунной системы организма. Среди веществ, способных злиять на состояние иммунной системы организма, имеются соединения пептидной, гетероциклической, полисахгрнднон природы. При создании пммуномодулирующих препаратов ведущее место среди сосдиненич пептидной природы принадлежит тимусным гормонам, непосредственно участвующим в процессах регуляции и становления иммунного ответа. К успехам биологической химии в этой области можно отнести выделение и охарактеризовать таких тимусных гормонов, как тимо^ины, тимопоэтины, сывороточный тимусный фактор. При изучении их биологических свойств было показано, что при введении в организм они оказывают иммуномодулирующее действие. Однако их широкое применение в лечебной практике ограничено небольшим содержанием в животных организмах, сложностью выделения и химического синтеза. Поэтому наиболее перспективным является применение для эгой цели низкомолекулярных пептидов, обладающих активностью тимусных гормонов.

Также большое значение для живого организма имеет такой металл, как цинк. При недостатке цинка в организме нарушается обмен белков и нуклеиновых кислот, изменяется обмен метионина, цистеина, пролина, глицина, усиливается выделение почками таурина, цисгеамина и неорганического сульфита, снижается активность таких ферментов, как тимидин-киназа РНК- и ДНК-полимеразы, нарушается синтез ДНК и белка в клетках печени, почек, соединительной ткани. При недостатке цинка в организме у людей отмечается карликовость, гепатомегалия, сплиномегалия, половое недоразвитие, гипогонадизм, изъязвление кожи и выпадение волос, энтеропатический акродерматит и другие заболевания.

3 связи с вышеизложенным поиск путей получения и изучение биологических свойств координационных соединений цинка с нюкомолскулярными иммуноактивнымм пептидами позволит значительно расширить спектр применения последних. Поэтому поиск эффективных методов синтеза низкомолекулярьых пептидов, обладающих активностью тимусных гормонов и координационных

соединений ьч с цинком, а также изучение их биологических свойств с целью дальнейшего применения в качестве лекарственных препаратов является весьма актуальным.

Цель и задачи iiccjic;ioi';4inii. Целыо настоящей работы являлся поиск низкомолекулярных пептидов* обладающих активностью тимусных гормонов, получение координационных соединений нх с пинком, изучение биологических свойств полученных пегггидов и координационных соединений для дальнейшего применения в ветеринарии.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

разработать оптимальные методы получения низкомолекулярш'х пептидов, обладающих активностью тимусных гормонов и нх координационных соединений с ионом Zn2*

- изучить физико-химические и биологические свойства полученных соединений;

разработать способ применения иммунноактивпых цинксодержащих пептидов при профилактике и лечении тсйлсриош . крупного рогатого скота.

Научная новизна. Получен ряд новых триптофан содержащих дииептидов и аналогов фрагментов 32-34 и 32-35 тимопоэтина. Впервые получены координационные соединения тринтофапсодержащнх дииепгндов с ионом Ум**. I Ioküuuio, 41 о координация с ионом Zu2' приводит к усилении* иммуностимулирующей активности исходных дипептндов. Показано, что применение триптофансодержащпх дипептндов, координационных соединений их с ионом Zna* и анаюгои фрагментов 32-34 и 32-35 тимопоэтина, обладающих биологической активностью, с различными вакцинами способствует усилению антителообразования у иммунизированных животных.

Практическая значимости. Предложен способ получения координационных соединений иммуноактнвных пептидов с ионом Zn2*. Разработай способ повышения эффективности лечения и профилактики инфекционных и паразитарных заболеваний крупного рогатого скота. Предложен оптимальный способ применения иммуностимулирующего препарата тимоцин при вакцинопрофилактикс и лечении заболеваний крупного рогатого скота.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международной конференции, посвященной 80-летию со дня рождения одного из основателей Таджикского технического университета Сулейманова A.C. (Душанбе, 1998), республиканской конференции, посвященной 50-летшо ТГНУ "Вклад ученых

биолог.ш n рачвнше биологической науки п Таджикистане" (Душанбе. 199,X), iiiopoii республиканской научно-нракчической конференции "I [роблсмы пчыскання, спнгсча и проичводства препаратов для иегсрипарни (Самарканд, 1999), научной конференции. поспяшеткш 40-лспно химфака и 65-лечню д.х.п., профессора Якубова Х.М. (Душанбе, 1499), конференции, посвященной 80-лстню академика ЛИ Республики Таджикистан Нуманова И.У. (Душанбе, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано II

рабш.

ОГн.см и ещмегура дисссщанпи. Диссертация «пложена па 121 странице машинописно'о чеке га. состоит ич введения. обчора лпгергп vpi.r, обч.ектов и меюдои исследовании. рсчул матов исследовании. заключения, выводов, списка личературы, включающего 186 источников, ич них "9Н очечесч венных и 88 зарубежных авторов.

г. оь'Ы'Лсгм м мктоды ik < лкдоклшш.

2.1. Обьекты исследовании.

Для проведения синтеза нешидоп использовали аминокислоты L-ряда и производные аминокислот. 1$ случае необходимости npoirmo. MiH.ie аминокислот Гч-глп получены но счандаргным методикам.

В качестве обьектоп для изучения биоиогическон акшвносчи иснолкшшши спи i сворованные иепчнды, координационные соединения их с номом /и2*", icoiopi.ie онышым Ж1 точным вводили ьнуфимыпгечно п лидс no.4iti.ix раешоров и разработанный иммуностимулирующим препарат чимоцни. который опытным живошым вподилн ппутргмышечпо п виде 0,0'1%-ного водного раствора.

Для изучения иммуностимулирующем активности полученных соединении использовали 115 телят 5-6 месячного возраста, иммунизированных эк»т«11 npui uitoiciijicpiiujiioii вакциной ВИЭВ и дозе I мл (0.1 млн живых клею;с) на голову.

При ¡пучении острой и .хронической токсичности тимошша использовали 80 белых мышеи, 32 кролика, 16 овец и 16 телят..

Для изучения иммуностимулирующих свойств тимоцшш использовали 75 голов крупного рогатого скога, иммуипчнрованного ассоциированной вакциной прочив рот-, коронанируены.х энтеритов и колибаюерноза л дозе 5 мл на голову и 68 телят 5-6 месячного

возраста,. иммунизированных живой противотейлериозной вакциной.

При изучении влияния TüMomiiia на эффективность лечения пневмоэнтеритоз молодняка крупного рогатого скота использовали 116 больных пневмоэьтср1Гтом телят. В качестве хиынотсраисвтических препаратов использовали

полившшлэтиннлтриметилпипергдол *с йодом (ПВЭНТИ) и регидропекгат, разработанные Институтом химии им.В.И,Никитина АН Республики Таджикистан и Таджикским научно-исследовательским ветеринарным институтом.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Пептиды.

Для защиты еС-амино г. боковых функциональных групп аминокислот при синтезе липе irr плов использовал карбобемзокен (Z-) и бепзильную (Bzl), группы, которые в конце синтеза удаляли каталитическим гидрированием в присутствии 10%-ного палладия на активированном угле, ci- Карбоксильную группу триптофана защищали сложноэфнрной метильной групп эи, которую в копне . синтеза снимали действием карбоната натрия. При синтеза три- и тетрапептидов в качестве временной N -зашитой группы использовали трет-бутнлоксикарботтьиую группу (Вое-), которую на промежуточных стадиях синтеза удаляли обработкой HCl и этилацетатс. Для защиты боковых функциональных групп,об-и о-карбоксильных групп,амино- и гуанидиновои группы аргинина использовали Z- и -Bzl группы, которые удаляли в конце синтеза каталитическими гидрированием.

'Гриптофансодержащие дипепгиды, аналоги фрагментов 32-34 и 32-35 ти.мопоэтина были получены методом активированных (пентафторфепиловых) эфиров, которые получали либо карбодиимидным методом, ' либо с помощью дипенгафторфенилкарбонзта. Промежуточные активированные эфнры в реакцию конденсации с аминокемпонентом вводились без выделения из реакционной смеси и дополнительной очистки. Защищенные пептиды очищены промыванием реакционной смеси кислыми и основными реагентами, а при синтезе триптофансодержпщих дипептидов - колоночной хроматографией на «шасагеле L-100/160. Свободные пептиды были очищены переосжкдением ic метанола эфиром или ацетоном.

2.2.2. Получение координационных соединений.

Реакцию образования координационных соеДйненип дипептнда и иона Zn^* осуществляли взаимодействием разбавленных водных растворов дипептвда и Zn (CHj СОО)ц при pH 6,0, 110-120 С в темноте и без доступа воздуха в течение часа.

2.2.3. Биопогические исследования.

Иммуностимулирующую активность синтезированных пептидов, координационных соединений и тимоцина определяли по усилению антнтелогенсза у молодняка крупного рогатого скота, иммунизированного ассоциированной вакциной против рота-, корспаиирусных энтеритов и колибактзриоза, а также живой протшютсплернозной вакциной.

Для определения титри а;ггнтел к ротавирусу и тейлериям использовали иммуноферментный анализ (ИФА), коронавирусу-реакцию торможения гемагшотинации (Р'ГГА), эшерихии коли-реакнию агглютинации (РА), а также для определения протниотсйлсрийных антител использовали реакцию длительного связывания комплемента (РДСК). ,-л : ; 1

3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ, "

3.1. Синтез пептидов. ■".'•■ ' , г .

На первом этапе работы был синтезирован ряд новых грипгафансодержащих днпептидои: М-Агц-'Ггр-ОН, Н-Азп-'Гф-ОН, Н-Мй- Тгр-ОН, Н- Тф- Тф-ОН.

Для защиты оС -аминогрупп и гуанидиновой группы аргинина была использована Z-гpyппa, которую в конце синтеза удаляли каталитическим гидрирочанием, оС -карбоксильную группу . триптофана защищали сложноэфирной метильной группой, которую в конце синтеза удаляли щелочным гидролизом действием 10%-ного раствора карбоната натрия.

Пептиды были синтезированы методом активированных, эфнров.

В качестве последних были использованы пентафторфениловые эфиры, которые получали карбодиимидным методом с использованием в качестве конденсирующего реагента дицикчогёксилкарбодиимнда и в реакцию конденсации с амино компонентом вводились сразу после отфильтроьывания выпавшей дициклогсксилмочевины. Полученные защищенные пептиды после обычной обработки реакционной смеси кислыми и основными, реагентами, унарнванчя растворителя подвергались деблокированию, которое осуществляли каталитическим гидрированием и обработкой карбонатом натрия. Свободные дипептиды были очищены переосаждением из метанола эфиром или ацетоном. Выход свободных шшегггпдов составил: Н-Аг§-Тгр-ОН-68,6%, Н-Азп-Тф-ОН-76,16%, Н-Ме1- Тф-ОН-73,8%, Н-.Тгр- Тгр-ОН-73,1%.

С целью разработки наиболее оптимального способа получения трнптофансодержащих дипептидов была - изучена возможность их синтеза с использованием остатка -триптофана со

свободными индольной и карбоксильной группами. Для синтеза были выбраны известные дипептвды H-Clu-Trp-OH, H-ile-Trp-OH, H-Asp-Тф-ОИ, H-Val-Trp-OH, обладающие биологической (иегивноегью in vitro в тесте Е-розеткообразования клетки и имеющие известные физико-химические константы.

В этом случае также для защиты функциональных групп аминокислот были использованы Z- и -Bzl группы, удаляемые каталитическим гидрированием.

При синтезе карбоксильный компонент активировали превращением в пентафторфешшовые эфиры с помощью дс'ситафторфсшшкарбоната, триптофан использовали в виде натриевой соли.

Реакцию образования пентафторфениловых эфиров проводили по стандартной методике в этилацетате взаимодействием N-защищенмой аминокислоты и дипентафторфенилкарбоната в течение 30 мин.

Далее ход реакции и обработка реакционной смеси отличались от фаднциоиных. После упаривания отилацегата остаток, . содержащий пентафторфениловый эфир М-защишеиной аминокислоты, трнэтиламмониевую соль пентафторфенола, растворяли в диметилформачиде и к полученному раствору добавляли натриевую соль триптофана. Реакцию конденсации вели при комнатной температуре в течение 3 часов. Защищенный дипептид первоначально очищали обработкой бисульфатом нафия, а затем колоночной хромотографией на силикагеле L-100/160 при элюировании сначала хлороформом, а затем смесью этилацегаг-бензол (3:2). Свободные пептиды очищались переосаждением из метанола эфиром или ацетоном, а в случае необходимое! п-колоночной хроматографией на силикагеле. Выход свободных дипептидов приведен в таблице 1.

Дмпектид Способ получения дипептида

Пентафгорфеннповые эфиры I- пщроксибензотриазоловые эфнри (БобиевГ.М.,1989)

Н-С1и-Тф-ОН H-Val-Тф-ОИ H-Asp-Trp-OH Н-Пе-Тф-ОН 85.4 97.2 97.3 98,0 93,2 89,5 98,0

Как показывают эти данные, выход свободных дипептидов при синтезе разработанным способом превышает выход этих же пептидов, синтезированных другим способом.

Таким образом, применение при синтезе пентафторфениловых эфиров, получаемых с помощью дипентафторфенилкарбоната, позволило получать свободные дипептиды без выделения из реакционной смеси и дополнительной очистки промежуточных активированных эфиров, использовать остаток триптофана без защиты нндольной и карбоксильной групп, что привело к увеличению выхода конечного свободного дипептида. Кроме того, использование колоночной хроматографии для очистки защищенных дипептидов позволило исключить использование ВЭЖХ как метода, требующего специального оборудования.

Другими известными низкомолекулярными пептидами, обладающими иммунологической активностью, являются фрагменты 32-35 и 32-34 молекулы тимопоэтина с последовательностью H-Arg-Lys-Asp-Val-OH и H-Arg-Lys-Asp-OH, соответственно.

С целью получения пептидов, обладающих более высокой биологической активностью, были синтезированы сами эти пептиды и их аналоги H-Arg-Lys-Glu-OH, H-Arg-Lys-Gln-OH, H-Arg-Lys-Asn-ОН и f ¡-Arg-Lys-Asp-Ala-OH.

Синтез трипептидов был проведен методом активированных (пентафторфениловых) эфиров путем ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с С-конца согласно схеме, приведенной на рис.1.

Arg Lys Asp(Glu)

Z Z

Вое - --OPfp Н- cOPfp H- -Z

k"z ;

.-OBzl OBzl OBzl 'OBzl OBzl OBzl OBzl OBzl OH

Пентафторфениловые эфиры получали взаимодействием дипептафторфеиилкарбоната с триэтиламмониевой солью защшценной аминокислоты в этил ацетате и а реакцию конденсации с аминокомпонентом вводили без выделения из реакционной смеси

и дополнительной очистки сразу после упаривания этилацетата. Промежуточные защищенные пептиды подвергались деблокированию для удаления N-защитной группы сразу после обработки реакционной смеси кислыми и основными реагентами.

Трипептиды Н-А^-ЬуБ-С1п-ОН и Н-Лг£-1_уз-Л$п-ОН были получены аналогичным путем за исключением того, что остатки аспарагина и глугамина вводились в реакцию конденсации с Вос-Ьувф-ОРГр в виде натриевой соли. В этом случае защищенные пептиды были очищены промыванием этилацетатом водных растворов солей пептидов с последующей экстракцией этнлацетатом из подкисленных до рН 3,0 водных растворов.

Выход свободных пептидов составил. Н-Л^-ЬуБ-Авр-ОН-59,8%, Н-А^-Ьуз-01и-011-61,2%, Н-Аге-Ьу5-С.1п-011-55,7%, Н-АгВ-Ьу8-А8п-ОН-58,14%.

Синтез тетрапетидов был осуществлен аналогичным путем. Выход пептидов при этом составил: Н-А^-1.у5-А5р-Уа1-ОН- 51,2%, Н-А^-Ьу5-А5р-А1а-ОН-48,4%.

Аминокислотный состав синтезированных пептидов был подтвержден данными аминокислотного анхппа.

3.2. Получение координационных соединений пептидов с ионом 2пг?

С целью расширения спектра биологического действия и увеличения иммунологической активности были получены координационные соединения дипептида Н-Пе-Тгр-ОН с ионом /п2*

Координационные соединения получали путем взаимодействия разбавленных водных растворов дипептида и ггКСЫзСОО^ при рН равном 6,0, 110-120 С в темноте и без доступа кислорода воздуха для предотвращения окисления индолыюй группы триптофана.

Об образовании координационных соединений судили по изменениям УФ-спектров исходного днкеитида и полученных соединений (рис.Я). Как видно из этих данных, у дипептида Н-Ие-Тгр-ОН в области 250-300 им Имеется плечо, у координационного соединения с ионом Ре увеличивается ширина этого плеча до 310 нм, а у координационного соединения с ионом наблюдается максимум поглощения в области 250-290 нм. Поскольку поглощение в этой области характерно для ароматических аминокислот, в частности для остатка триптофана, то предполагается, что данный остаток участвует в образовании координационного соединения.

Исходя из того, что в состав дипептида из аминокислот, содержащих хромоформные группы, входит только остаток триптофана, можно предположить, что в результате взаимодействия с растворителем дипептид принимает конформацию, при которой

ароматическая компонента тршггофана в УФ-спектре дипептида четко не видна. При образовании координационных соединений происходит нарушение этой конформашш, • что приводит к увеличению интенсивности поглощения в области 250-280 нм. Чем выше активность металла, являющиеся комплексообразователем, тем значительнее увеличение интенсивности. Если комплексообразователем является нон Fe2' плечо при 250-290 нм на спектре свободного дипептида превращается в широкую полосу поглощения невысокой интенсивности при 250-310 нм. Если же комплексообразователем является ион Zn2*, из УФ-спектре координационного соединения наблюдается ярко выраженный максимум поглощения при 250-290 нм.

Для проверки предположения о конформациоиных изменениях дипептида Н-11е-Тгр-ОН при взаимодействии с ионом 2пг'были рассчитаны вторые производные УФ-спектров дипептида Н-11е-Тгр-ОН и ею координационного соединения с ионом Znai', графические изображения которых приведены на рис. Э.

Так на второй производной УФ- спектра дипептида Н-Ие-Тгр-ОН четко выделяется ароматическая компонента триптофана - пик при 291 им. 11а второй производной УФ- спектра координационного соединения отмечается увеличение интенсивности пиков лри 260 и 291 им, появление новых пиков при 255, 261,282,285,294 и 299 нм, сдвиг в длинноволновую область на 1,5 им. пиков при 250 и 256 нм. Эти изменения говорят о том, что при взаимодействии дипептида с ионом '¿пг* имеет место перераспределение электронной плотности в остатке триптофана, что происходит, возможно, при образовании координационных соединений с ионом Zn1'.

Исходя из природы лигаида и металл а-комлексоибразователя можно предположить, что при образовании координационных соединении протекают следующие реакции:

Me*' + HL ------->• [MeLf + Нt

[MeL]* - HL --------» МеЦ + H +

где HL = H-Ile-Trp-OH

Исходя из вышеизложенного природы лиганда и иона-комплексообразователя можно предположить, что ион Zn2,4образует ионную связь с карбоксильной группой триптофана и координационную связь с элекгронодонорными атомами пептида.

3.3. Изучение биологической активности полученных соединений.

Иммуностимулирующую активность полученных соединений определяли но усилению антителообразования у телят, иммунизированных противотейлериозной вакциной в дозе I мл (0,1 млн живых клеток) на голову. Через 3-5 дней с начала

X, нм

Рис.2. УФ-спеетры дипсптида Н-11с-Тф-ОН (1), его координационного соединения с ионом Ре*4 <2) и ионом Zns■+ (3).

-2,5 -I-1-1-\--1-1-1--1-!-;-:-!-!

240 250 260 270 280 290 300

Рис.3. Вторые производные УФ-спектров дипептида Н-11е-Тгр-ОН (1) и его координационного соединения с ионом 2па' (2).

-и-

поствакцинальной реакции (через 15-17 дней после иммунизации) животным вводили пептидные препараты в виде водных растворов. Контролем служили иммунизированные телята, которым препараты не вводили. Через 35 дней писле вакцинации в сыворотке крови • животных определяли титр прошвотейлерных антител с помощью РДСК и ИФА.

Полученные • результаты показывают, что существует корреляция между биологической активностью пептчдсв in vitio в тесте Е-розеткообразования клетки и их активностью in vivo при совместном применении с противотейлериозной вакциной.

Применение совместно с вакциной координационного соединения вызывало 4-8 кратное увеличение титра противотейлеринных антител, что свидетельствует об увеличении иммуностимулирующей активности координационного соединения по сравнению с исходным дрпептидом, так как применение дипептида Н-11е-Тгр-ОН вызывало только двухкратное увеличение титра антител.

3.4. Изучение биологических свойств препарата тимоцина.

На основе дипептидов и их координационных соединений, проявивших наибольшую активность, был разработан препарат тимоции, представляющий собой 0,04%-ный водный раствор координационного соединения нчзкомолекулярного

иммуноактивного пептида ионом Zt?*.

Перед изучением фармакологических свойств тимоцина была проведена его проверка на стерильность, которую осуществляли путем высева на различные питательные среды. Результаты этой проверки показали, что способ получения препарата обеспечивает его полную стерильность по отношению к аэробным анаэробным бакт ериям и контаминации грибами.

Острую токсичность тимоцина изучали на белых мышах, кроликах, овцах и телятах по сравнению с физиологическим раствором согласно методическим указаниям по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве, утвержденным Министерством здравоохранения СССР, ВАСХНИЛ и ГУВ Госагропрома СССР в 1987г.

Животные каждого вида была разделены на 4 равноценные группы и препарат им вводили внутримышечно в дозах 5-100 мл/кг живого веса (350-7000 терапевтических доз). При этом у животных учитывали следующие показатели: внешний вид и поведение, состояние шерстяного покрова и видимых слизистых оболочек, отношение к корму, подвижность, ритм и частоту дыхания, время

- i2-

Биологнчсская активность полученных соединений.

Последовательность Дота 'Imp 11|><>111Ш)1сГ|-'н-|М|Г|111.11 in vitro и тсс ic Е-

11С1ГП1ДЯ мкг/кг яш шел ро1сткооб|<акшя-

ння клетки

(Бобнсв Г.М.,

живого 1989)

necn' ГЧГК 1____ИФЛ

H-Glu-Trp-OH 100 1:5-1:40 " l:To()-i:i i00 100

Н-Нс-Тгр-ОН 100 1:5-1:40 1:100-1:1 600 100

ll-Val-Trp-OII 100 1:5-1:20 1:50-1:800 о

H-Asp-Trp-OI 1 100 1:5-1:40 1:60-1:1200 30

H-Arg-Trp-Oil ню 1:5-1:20 1:50-1:801)

H-Asii-Trp-OI 1 100 1:5-1:20 1:50-1:800

H-Mct-Tip-OI 1 100 1:5-1:20 1:50-1:800

н-Trp-Trp-oi; 100 1:5-1:20 1:50-1 800

H-Arg-Lys-Asp-OI 1 100 1:5-1:40 1:100- 1:1600 100

H-Ars- Ly s-Asn-OI I 200 1:5-1:20 1.50-1:50.800

H-Arg-Lys-Cilu-OH 200 1.5-1:40 1:100-1 1200

H-Arp-l.ys-Cilu-OII 200 1:5-1:20 1:50-1 800

H-Arg-l.ys-Asp-Val- 200 l:5-i:40 1:100-1:1 601) 100

I l-Arg-I.ys-Asp-Ala- 200 1:5-1:20 1-50-1:800 0

011

1<011Тр0ЛЬ - 1:5-1:20 1:50-1:800

H-llc-Trp-OH ^Zit2 * 400 1:400-1.800

контроль 1:50-1:200

возникновения н характер интоксикации, тяжесть, обратимость, срок гибели животных или их выздоровлении. 1(аблюденпе «а жпвошымп вели в течение 14 дней.

Результаты исследования показали, что тнмоннн при виуфнмьпиечном введении в дозах 5-11)1) мл/кг (350-7000 терапевтических доз) не вызывал нршпаки» травления у лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Изучение хронической токсичности препарша проводили на белых мышах и кроликах. 11ри л ом учитывали ю же показатели, что при определении острой токсичности. Препарат животным вводили в дозах 5-25 мл/кг (357-1785 терапевтических доз) один раз в сутки в течение 10 дней. Наблюдение за животными вели н течение 25 дней.

В результате опытов было установлено, что шмоцнн у белых мышеи в дозах 5-25 мл/кг (357-1785 и-раневтпчсских доз), у кроликов в дозах 5-10 мл/кг (357-714 терапевтических доз) не вызывал признаков офавления.

При проведении натоморфолотнчсскнх исследований изменений паренхиматозных органов и других систем организма у подопытных животных отмечено не было.

При исследовании функционального состояния сердечнососудистой и дыхательной систем у кроликов режим сокращения сердца в среднем составил 128 ударов в минуту, дыхательных движений- 56, температура тела находилась в пределах 39,2-39,5 С, что является физиологической нормой.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что тимоцин при одно- и многократном введении в организм животных не оказывает повреждающего действия и является практически нетоксичным препаратом.

Результаты изучения стабильности препарата в процессе длительного хранения показали, что такие показатели качества препарата, как внешний вид и цвет, наличие механических примесей, рН водного раствора, стерильность, пирогенность, токсичность находятся в пределах, допускаемых Государственной Фармакопеей СССР, в течение 2 лет. Эти данные позволили установить срок годности препарата равным 2 года.

Влияние тимоцииа на усиление антителообразования и показатели нсспецифическо/í решстетности организма животных изучали при его совместном применении с ассоциированной вакциной против рота-, короиавирусных энтеритов и колибактериоза телят.

Опыт был проведен на 12 стельных коронах, которых разделили на 3 равноценные группы. Животным первой группы вводили вакцину совместно с тимоцнном. второй- только вакцину,животных третьей группы оставили п качестве контроля и не иммунизировали. У опытных и контрольных животных перед прививкой, спустя 14 дней после нее и через 21 день после ревакцинации исследовали кровь на наличие специфических антител, а также на бактерицидную и лизоцимную активность.

Проведенные исследования показали, что до иммунизации в сыворотке крови коров содержались антитела к рогавирусу в титре 2,54), 15 loga, коронавнрусу - 3,0*0,2 loga, эшернхии коли - 1:50*25. После иммунизации титр антител к рогавирусу у животных первой и BTopoi: групп достигал 8,4'-0,25 и 6,5 loga,, коронавнрусу - 9,8 -0,3 и 7,5-0,2 loga , эшернхии коли 1:1800*2(Юи 1:800-400, соответственно. Бактерицидная и лизоци.мная активность сыворотки крови животных всех трех групп до применения препарата составляла 65,0*0,5 и 3,1:0,25%, соответственно. Через 21 день после ревакцинации бактерицидная и лизоци.мная активность сыворотки крови у животных первой и второй групп составляла, соответственно, 80,2^0,8 и 4,9*0,2%, 69,0*0,75 и 3,3*0,05%.

Таким образом, проведенные исследования показали, что применение тимоцина в комплексе с ассоциированной вакциной

-й-

способствует значительному увеличению уровня гуморального иммунного ответа и факторов неспециф.чческой резистентности организма у иммунизированных животных.

После определения наличия у тимоцина иммуностимулирующей активности было изучено его влияние на эффективность лечения пневмоэнтритов телят при его совместном применении с химиотсрапсвтичсскимн препаратами.

Опыт проводили на 52 телятах, разделенных на 13 групп гю 4 головы в каждой. Животным 1-3 групп тимоцин вводили внутримышечно в виде 0,04%-ного раствора в дозах 0,02, 0,03 и 0,05 М'Лт живого веса, соответственно, один раз в сутки в течение 3 дней. Животным 4-6 групп препарат вводили подкожно в тех же дозах и с той же кратностью. Жмьотным 7-9 групп тимоцин вводили внутримышечно с тех же дозах один раз в сутки с течение 6 дней. Животным 10-12 групп тимоцин вводили внутримышечно в тех же дозах один раз в сутки в течение 9 дней. Животным 13 группы (контроль) вводили внутримышечно физиологический раствор в дозе 0,03 мл/кг один раз в сутки в течение 9 дней. Животным всех . групп давали внутрь химиотсрапевтические препараты ПВЭНТИ и регидропектат.

В результате наибольшая эффективность, лечения была достигнута в 7-9 группах. В этих группах она была на 20% выше, чем в контрольной. Больные животные выздоравливали на 6-7 сутки, тогда как в контрольной группе выздоровление наступало на 13-14 сутки. Эффективность лечения не зависела от способа применения тимоцина.

Была определена оптимальная схема применения тимоцина совместно с ассоциированной вакциной против рота-, коронавнрусных энтеритов и колибактерноза. Опыт был проведен на 28 головах крупного рогатого скота, разделенных на 7 равноценных групп. Животным 1-6 групп вводили вакцину в дозе 5 мл на голову. Животным 1- 5 групп подкожно вводили тимоцин в различных дозах и с разной кратностью (таблица 3) Контролем служили животные 6 и 7 групп: животным С группы вводили только вакцину, 7-только тимоцин. У животных всех групп определяли титр специфических антител к рога-, коронавирусу и эшерихии коли.

Результаты исследований проведены в таблице 4. Из таблицы вндно; что однократное применение тимоцина в дозах 0,01, 0,02 и 0,03 мл/кг не оказало существенного влияния на увеличение титра антител. Применение тимоцина в дозе 0,03 мл в течение 3 дней привело к незначительному увеличению титра антител к коронавирусу.

Таблица 3.

Доза и кратность введения тимоцина при комплексном применении с ассоциированной вакциной. -

Группа Доза мл/кг Кратность Длительность

животных применения применения

1 0,01 1 раз в день 1 день

2 0,02 - 1 день

3 0,03 - 1 день

4 0,03 - 3 дня

5 С 0,02 - 5 дней

7 0,02 - 3 дня

Таблица 4.

Титр антител при комплексном и раздельном • применении ассоциированной вакцины и тимоцина._

Группа Животных Титр антител к:

Ротавирусу, 1о§£ Коронавирусу,1о?а эшерихии коли

1 3,020,15 3,5*0,12 1:200*50

Р>0,5 Р>0,5 .

-> 3,0*0,25 3,5*0,14 1:200*50

Р>0,5 Р>0,5

^ 3.240,25 3,840,15 1:200*50

Р>0,1

4 4,810,30 5,040,27 1;400*50

Р>0,05 Р<0,05 Р<0,005

5 4,0*0,25 5,2*0,30 1 ;400*50

Р<0,1 Р<0,05 Р<0,005

6 3,210,15 3,4*0,16 1,200*50

7 - -

Наиболее сильное увеличение титра антител к ротавирусу (50%) отмечалось при применении тимоцина в дозе 0,03 мл в течение 3 дней.

Наиболее сильное увеличение титра шгтител к коронавирусу (55%) отмечалось в 5 группе, где тимоцин применяли в дозе 0,02 мл в течение 5 дней. Применение тимоцина в течение 3-5 дней вызывало двукратное увеличение титра антител к эшерихии коли.

Значительнос увеличение титра антител ко всем вакцинным антителам отмечалои в 4 и 5 группах, в которых тимошш применяли в течение 3-5 дней.

Положительные результаты лабораторных исследований послужили основанием для проведения производственных испытаний тимоцина при лечении больных пневмоэнтеритом телят и комплексном применении с ассоциированной вакциной против рота- короназнрусных энтернтов и колнбактерноза.

Влияние тимоцина на эффективность лечения пневмоэнтеритов изучат в комплексе с химиотерапевтнческими пр Маратами ПВЭНТИ и регидропектатом при лечении 64 больных пневмоэнтерн-ом телчг. Тнмоцин больным телятам опытной грузны (40гол.) вводили подкожно в дозе 0,02-0,03 мл/кг один раз в сутки в течение 5 дней. Животных контрольной группы (24гол.) лечили Т-активиноч, иодинолом и регидратом.

Эффективность лечения в опытной группе составила 94,2% сток выздоровления 7 дней, в контрольной группе эффективность лечения составила 83,4%, а срок выздоровления 12 дней.

Проверку эффективности тимоцина при совместном применении с ассоциированной вакциной проводили на 35 головах крупного рогатого скота. Животных как опытной (20гол.), так и контрольной (15гол.) групп иммунизировали ассоциированной вакциной в дозе 5 мл на голову. Животным опытной груши.; дополнительно вводили тимоцин в дозе 0,03 мл/кг одни раз в сутки в течение 3 дней. У всех животных определяли тигр специфических антител к рота-, коронавирусу и эшерихнн коли. Результаш исследований приведены в таблице 5.

Таблица 5.

Титр специфических антител при комплексном применении ассоциированной вакцины и тимоцина._

Группа Титр антител к:

Животных ротавирусу, 1одь Корочавиру.т, 1о2г. эшерихнн коли

Опытная 5,0*0,2 5,2*0.25 1:400*50

Р<0,05 Р<0.05 Р<0,005

Контрольная 3,4*0,15 3,6*0,18 1:200*50

Из таблицы иидно, что применение тимоцина в комплексе с ассоциированной вакциной поззоляет значительно увеличить антителогенез по отношению к каждому вакцинному антигену: ротавирусу на - 47%, коронавирусу -на 44%, эшерихии коли - на 100%.

-if-

Также было изучено влияние тимоцина на антителегонез при совместном применении с живой противотейлериозной вакциной ВИЭВ.

Опыт был проведем на 20 телятах 2-5 месячного возраста, иммунизированных противотейлериозной вакциной в дозе 1 мл (0,1 мл живых клегок). Тимоцин вводили трехкратно с итервалом через день, внутримышечно после качала поствакцинальной реакции. Опытные телята были разделены на 5 групп по 4 головы в каждой. Животным первой группы тимоцин вводили в дозе 1 мл на 100 кг живой массы тела, второй 2 мл, третьей 3 мл, четвертой 4 мл. Контролем служили телята пятой группы, которым препарат не вводили. У всех животных в сыворотке крови определяли титр противотейлерийных антител спомошыоИФА. . ■ >

У телят первой группы титр антител составлял 1:50^1:200, второй- 1:100*1:800, третьей- 1:400-ЧМ600, четвертой-. 1:200*1:1600, пятой-1:800. Применение тимоцина способствовало 4-8 кратному 1:8()и увеличению титра антител при применении в дозе.З мл на 100 кг живого веса животного.

После получения положительных результатов в экспериментальных условиях были проведены производственные испы тания эффективности тимоцина при совместном применении с противотейлериозной вакциной.

Испытания были проведены на 48 телятах ниже средней уииганносгн 2-5-месячного возраста, иммунизированных -противотейлериозной вакциной, которым тимоцин вводили в дозе 3 -мл на 100 кг живого веса в течение 4 дней с интервалом через день после начала постиакциналыюй реакции. Контролем служили 6 ' телят уииташостч, аналогичной с опытными, которым тимоцин не вводили.

Проверка нашшия антител против тейлсрий в сыворотке крови телят, которым вводили тимоцин, через 35 дней после вакцинации поката, что у 85% телят титр антител составлял 1:400-1:800, а у оставшихся 15% достиг 1:1600. В контрольной группе с сыворотке ' крови 50% телят титр антител составлял 1:50-1:200, у 30%-1:200-1:400, у 20% достиг 1:800.

У телят опытной группы поствакцинальная реакция на введение вакцины прошла без осложнения, вынужденного убоя или падежа животных, продолжительность ее составила 5-7 дней температура тела при этом повышалась до 40,0-41,1°С. В.основном , отмечалось умеренное увеличение предлопаточных лимфатических узлов. В мазках крови обнаруживаюсь до 92 тейлсрий в 100 полях, зрения микроскопа. '

У контрольных телчт длительность поствакцинальной реакции состарила 7-10 дней, температура тела повышалась до 40,1- 41,5°С, отмечалось знач1Ггельное увеличение предлопаточных лимфатических узлов. В мазках крови пораженность эритрошггов тейлериями доходила до 148 паразитов в 100 нолях зрения микроскопа. У 50% телят отмечалось ослабление аппетита.

Применение тимоцина способствовало значительному увеличению уровня гуморального иммунного ответа у иммунчзированных животных (увеличение титра противотейлерийных антител в 4-8 раз), что позволило значительно смягчить течение поствакцинальной реакции и в 1,5-2 раза сократить ее срок.

Полученные результаты экспериментальной и производственной проверки тимоцина позволили рекомендовать данный препарат для широкого применения при вакцинации противотейлсриозной вакциной молодняка крупного рогатого скота с ослабленной резистентностью организма.

ВЫВОДЫ.

1. Изучены различные методы получения нпзкомолекулярных иммуноактивных пептидов, применение которых совместно с традиционными лекарственными препаратами способствует повышению эффективности вакцииопрофплактнки и лечения различных заболеваний сельскохозяйственных животных.

2. Биологическая активность проявляемая пептидами in vitro в тесте Е-розеткооброзования клетки, соответствует таковой, проявляемой пептидами in vivo при совместном применении с живой пр от и d оте Гин-р 11 оз 11 о íi вакциной.

3. При взаимодействии трипофансодержаших дипеитндов с ионом Zn^npoiiCMWiiT образование координационных соединении, в результате чего увеличивается биологическая активность исходного дипептида.

4. Разработанный на основе координационных соединений триптофансодержащих дипептидов с ионом Znz* иммуностимулирующий препарат тимоции сохраняет свои физико-химические и биологические свойства в течение 2 лет.

5. Применение тимоцина совместно с ассоциированной вакциной против рота-, коронавирусных энтеритов и колибактерноза и живой культур алыюп противотейлсриозной вакциной способствует значительному усилению первичного иммунного ответ а у вакцинированных животных.

6. Применение тимоцина совместно с хамнотерапевтическнми препаратами значительно сокращает срок и повышает

эффективность лечения пневмоэнтеритов молодняка крутого рогатого скота.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Бобиев Г.М., Гиесов А.Ш. Удаление защиты -аминогрупп действием УФ- облучения с пептидов, содержащих ароматические аминокислоты// Мат. Межд.науч.-прак. конф., поев. 80-летию со дня рожд. одного из основателей' Таджикского технического университета Сулейманова A.C., Тез.докл.- Душанбе, 1998-С.31.

2. Бобиев Г.М., Нораев Р.Х., Гиесов А.Ш, Исупов С.Д. Усиление гуморального иммунного ответа при вакцинации животных протнвотейлернозной вакциной совместно с иммуностимулирующим препаратом тимоцин// Тр.респ.конф. поев. 50-летию ТГНУ "Вклад ученых биологов в разлитие биологической науки в Таджикистане"-Душанбе 1998-С 11-12.

3. Бобиев Г.М., Сатторов И.Т., Махмудов К., Гиесов А.Ш. Токсические свойства нового иммуностимулирующего препарата ти.чоцнна// Информ. Листок НПИЦентра Республики Таджикистан-Душанбе, 1998 № 67-98-Зс.

4. Бобиев Г.М., Сатторов И.Т., Махмудов К., Гиесов А.Ш., Исупов С.Д. Влияние нового иммуномодулирующего препарата тимоцина на эффективность лечения пневмоэтеритов телят // Информ. Листок НПИ Центра Республики Таджикистан- Душанбе, 1998- № 68-98-Зс.

5. Бобиев Г.М., Сатторов И.Т., Махмудов К., Гиесов А.Ш., Исупов С.Д. Влияние нового иммуномодулятора тимоцина на эффективность вакцпнопрофилактики энтеритов и ко.тибактериоза// Информ. Листок НПИ Центр? Республики Таджикистан- Душанбе, 1998- № 70-98-4с.

6. Бобиев Г.М., Гиесов А.Ш., Исупов С.Д., Юсупов З.Н., Шахматов А.Н. Получение новых цинксодержащих биологически активных соединений // Координационные соединения и аспекты их применения. Сб.науч. тр.- Душанбе, ТГНУ, 1999-стр. 147-150.

7. Бобиев Г.М., Гиесов А.Ш., Исупов С.Д., Шахматов А.Н. Синтез и биологическая активность новых низкомолекулярных пептидов ряда тимознна и тимпоэтина // Рук. Деп. В НПИ Центре Республики Таджикистан-Душанбе , 1999 № 10 (1271)-20с.

8. Бобиев Г.М., Шахматов А.Н., Гиесов A.LLL Исупов С.Д., Хайдаров К.Х. Синтез аналогов фрагмента активного центра тимопоэтина// Известия АН Республики Таджикистан . Отделение физико-математических, химических и геологических наук .- 1999-№ 1-е. 39-42.

9. Исупов С.Д., Гиесов А.Ш., Исследование стабильности препарата тимоцин в процессе длительного ;сранения.//Сб. статей V научно-

практической конференции "Теоретические и практические исследования в медицине".-Душанбе,1999.-С. 110-112.

10. Бобиев Г.М., Нораев Р.Х., Нороз Ш.Х., Гиесов Л.Ш., Исуиов С.Д. Способ стимуляции иммунитета при тейлериозе и иммунизации против тейлсриоза у крупного рогатого скота Заявка на патент Республики Таджикистан № 99000576 от 25.06.9°г.Г1оложителыюс решение.

11. Боблеи Г.М, Сагторов И.Т., Гнесов А.Ш., Исупов С.Д., Махмудов • К. Биологические свойства повою иммуностимулирующего препарата пшоцин . // Проблемы изыскания, синтеза и производства препаратов для ветеринарии. Маг. второй респ. лауч.-нракт. конф.- Самарканд, 1999 -с. 42-45.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гиесов, Асомуддин Шамсуддинович

ВВЕДЕНИЕ.4-6 '

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Выделение и биологические функции тимусных гормонов и поиск ниэнонолекулярннх иммуноактивннх пептидов.7

1.2. Изучение строения и биологических свойств координационных соединений аминокислот, пептидов и лекарственных препаратов с металлами.17

1.3. Роль цинка в живом организме.28

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Объекты и методы исследования.

2.1.1. Объекты исследования.34

2.1.2. Методы исследования.35

2.2. Получение пептидов и их координационных соединений с ионом Ъп .45

2.2.1. Синтез пептидов.45

2.2.2. Получение координационных соединений пептидов с ионом . 57

2.3. Изучение биологической активности полученных соединений и препарата тамоцин.64

2.3.1. Изучение биологической активности полученных соединений.64

2.3.2. Изучение биологических свойств препарата тимоцин .67-83 ЗАКЛЮЧЕНИЕ.84

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Синтез и некоторые фармакологические свойства низкомолекулярных цинксодержащих иммуноактивных пептидов"

Актуальность проблемы. В последние годы все большее количество исследований в области биологической химии и фармакологии посвящается поиску веществ, способных влиять на состояние иммунитета - регуляторов и корректоров иммунной системы организма. Это связано с тем» что большинство заболеваний человека и животных сопровождается нарушениями нормального функционирования иммунной системы организма. Среди веществ, способных влиять на состояние иммунной системы организма ,имеются соединения пептидной, гетероциклической, полисахаридной природы, создании иммуномодулирующих препаратов ведущее место среди соединений пептидной природы принадлежит тимусным гормонам, непосредственно участвующим в процессах регуляции и становления иммунного ответа. К успехам биологической химии в этой области можно отнести выделение и охарактеризование такиЗс тимусных гормонов, как тимозины, тимопоэтины, сывороточный тимусный фактор. При изучении их биологических свойств было показано, что при введении в организм они оказывают иммуномодули-рутощее действие. Однако их широкое применение в лечебной практике ограничено небольшим содержанием в животных организмах, сложностью выделения и химического синтеза. Поэтому наиболее перспективным является применение для этой цели низкомолекулярных пептидов, обладающих активностью тимусных гормонов

Также большое значение для живого организма имеет такой металл, как цинк. При недостатке цинка в организме нарушается мен белков,и нуклеиновых кислот, изменяется обмен метионина, цистеина, пролина, глицина, усиливается выделение почками таурина, цистеамина и еорганического сульфита, снижается активность таких ферментов как тимидин - киназа, РНК- и Д Н К- полимеразы , 5 нарушается синтез ДНК и белка в клетках печени, почек, соединительной ткани. При недостатке цинка в организме у людей отмечается карликовость , гепатомегалйя , сплиномегалия , половое недоразвитие, гипогонадизм ,изъязвление кожи и выпадение волос , энтеропатический акродерматит и другие заболевания.

В связи с вышеизложенным поиск путей получения и изучение биологических свойств координационных соединений цинка с низкомолекулярными иммуноактивными пептидами позволит значительно расширить спектр применения последних. Поэтому поиск эффективных методов синтеза низкомолекулярных пептидов обладающих активностью тимусных гормонов и координатционых соединений их с цинком, а также изучение их биологических свойств с целью дальнейшего применения в качестве лекарственных препаратов является весьма актуальным.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлся поиск низкомолекулярных пептидов, обладающих активностью тимусных гормонов, получение координатцюнных соединений их с трюком, изучение биологических свойств полученных пептидов и координационных соединений для дальнейшего применения в ветеринарии.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

-разработать оптимальные методы получения низкомолекулярных пептидов, обладающих активностью тимусных гормонов и их координатцюнных соединений с ионом ;

• У

-изучить физико-химические и биологические свойства полученных соединений; 6

-разработать способ применения иммуноактивных цинксодержащих пептидов при профилактике и лечении тейлериоза крупного рогатого скота.

Научная новизна. Получен ряд новых триптофансодержащих дипептидов и аналогов фрагментов 32-34 и 32-35 тимопоэтина. Впервые получены координационные соединения триптофансодержащих дипептидов о ионом 2п2+. Показано ,что

• / координация с ионом Хп2+ приводит к усилению иммуностимулирующей активности исходных дипептидов.Показано , что применение триптофансодержащих дипептидов, координационых соединений их с ионом + и аналогов фрагментов 32-34 и 32-35 тимопоэтина обладающих биологической активностью с живой противотейлериозной вакциной способствует усилению антителообразования у иммунизированных животных.

Практическая значимость. Предложен способ получения координационных соединений иммуноактивных пептидов с ионом Ъ^. Разработан способ повышения эфективности лечения и профилактики инфекционных и паразитарных заболеваний крупного рогатого скота. Предложен оптимальный способ применения иммуностимулирущего препарата тимоцин при вакциопрофилактике и лечении тейлериоза крупного рогатого скота.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Выделение и биологические функции тимусных гормонов и поиск низкомолекулярных иммуноактивных пептидов.

Центральная роль тимуса в становлении и регуляции иммунного ответа была установлена только в середине 60-х годов (Петров, 1987). При этом оказалось, что главную роль здесь играют тимусные гормоны,имеющие пептидную природу. В настоящее время существует две теории о пройсхождении тимусных гормонов. По

7 , предположению А.Гольдштейна в тимусе синтезируется несколько факторов участвую-щих в регулировании процессов созревания и дифференцировки Т-кле-ток (Goldstein, 1977). Согласно другой теории (Comsa,1965), в тимусе синтезируется только один фактор, выполняющий все иммунологичес-кие функции тимуса (Морозов, Хавинсон,1981).

Первым биологически активным препаратом, выделенным из тиму-са, была так называемая тимозин фракция 5 (тимозин Ф5), являющаяся смесью полипептидов с молекулярным весом'от 1000 до 15000 дальтон (Rajnavolgul,1986) содержащая более 30 компонентов (Wang et al, 1981) и активная во многих иммунологических тестах (Low et al., 1979).

Тимозин Ф5 частично или полностью восстанавливает иммунную деятельность у животных и людей с онкологическими заболеваниями и имуннодефицитами (Bach et al.,1977;Low al.,1979;Rajnavolgul etal.,1986).

Другая фракция - активный фактор тимуса 6 (АТФ-6 или Т/ активин) содержит пептиды с молекулярной массой от 1500 до 6000 дальтон (Арион,1981,1981), обладает высокой биологической активностью и дает хороший клинический эффект при ряде заболеваний (Арион, 1981;Арион и др. ,1985;Иванушкин и др. , 1981; Лопухин, 1982; Лопухин и др., 1981; Петров, 1987).

Тимозин ai был первым гормоном , выделенным из бычьей, свинной и человеческой тимозин Ф5 (Chen et al., 1993; Moclure et al. , 1982; Low et al. , 1983;Vang, 1981). Оказалось, что этот гормон состоит из 28 аминокислот, имеет блокированную ацетильную N-концевую аминогруппу (рис.1) и молекулярный вес 3108 дальтон (Low et al. , 1989). Тимозина ai в 10-1000 раз более активен, чем тимозин Ф5 и пре-мущественно действует на протимоциты с образованием Т8 хелперных клеток (Ahmed et al. ,1979; Low et el., 1979). Было показано, что тимозина! дейстивителъно синтезируется в тимусе (Friere et al., 1978).

После определения его аминокислотной последовательности тимозин ai сразу был синтезирован в нескольких лабораториях как классическими методами пептидной химии в растворе (Abiko et al. ,1980; Birr et al. ,1979,1979; Felix et al. ,1985; Hooper et al. ,1975; Wang et al. ,1978), так и методами твердофазного синтеза пептидов (Hofman,1962; Wang et al. ,1978,1980). Были разработаны схемы крупномасштабного (до кг) синтеза этого пептида (Felix/et al. ,1985; Нао et al. ,1986; Hooper et al., 1975) классическими методами пептидной химии в растворе. Сообщалось о синтезе тимозина ai методами генной инженерии (Swiderski et al., 1982; Vetzel et al., 1980). При изучении биологической активности синтетического тимозина было показано, что его активность подобна природному тимозина ai и, что ацетильная группа на N-конце пептида не оказывает влияния на его биологическую активность. Сообщалось (Vang,Dloomfield,1987), wo (Asn) аналог тимозина ai также проявляет биологическую

• / активность при дифференциации Т - клеток.

Из тимозин фракции 5 были выделены тимозины as и а? , имеющие изоэлектрические точки равные 3,5 и молекулярные веса 3000 и 2000 дальтон, соответственно (Морозов.Хавинсон,1981). Эти гормоны являются возможными индукторамисупрессорных клеток у мышей и активаторами при индуцировании Т-клеточных маркеров (Low et al. ,1979).Было показано, что тимозин ai супрессирует продукцию у-интерферона in vivo у мышей (Low et al. ,1979) и влияет на протимоциты, которые затем превращаются в лимфоциты с супрессорной функцией (Low et al. ,1979). 9

Сообщалось выделении двух полипептидов,имеющих высокую степень гомологии с тимозином ai названых тимозинами an(Felix et al., 1983) и a22(Haritos et al., 1984). Из тимозин фракций 5 и 5А были выделены тимозины (З3 и р4 (Low.Goldstein. 1982). Тимозин р4 состоит из 43 аминокислотных остатков (рис.1), эти гормоны подобно тимозин Ф5 влияют на стволовые клетки , превращая их в протимоциты (Ни et. al. ,1987), а (34 тимозин также ингибирует миграцию макрофагов (Golgschneider et al., 1981). Тимозин р4 также был обнаружен в селезенке, головном мозге, легких, печени и сердечной мышце у крыс и мышей (Hannapel. ,1982). В 1983 г. тимозин р4 был синтезирован твердофазным методом (Low et al.

1983), идентичность которого натуральному была доказана аминокислотным анализом и триптическим пептидным картированием. Синтетический пептид обладал биологической активностью подобной природному. Абико и Секино (Ablko,Sekino.,1983) сообщали о синтезе дезацетилтимозина (34 и показали, что синтетический пептид увеличивал количество хелперных Т - клеток при инкубации с кровью, взятой у больных с хронической почечной недостаточностью. О твердофазном синтезе этого гормона сообщали также Уанг и др. (Wang et al. ,1981).

Высокогомологичными тимозину р4 по аминокислотной последовательности являются тимозины pg и Р9, выделенные из тимозин фракции 5 (Wang et al. ,1980). Из 38 аминокислотных остатков ти-мозина р8 31 идентичен соответствующим остаткам тимозина (34. Тимозин р9 идентичен тимозину р8, но у него на С-конце имеется добавочный дипептид Ala-Lys (рис.1). Высокогомологичными тимозину р8 являются тимозины Рю, Pio-arg и Pu (Erickson-Viitanen et al.,1983; Horecker,1984; Ruggleri et. al.,1983) (рис.1). Синтетический

10 тимозин р9 увеличивал число периферических Е-розет-кообраэующих клеток, синтетический дезацетилтимозин (Зю увеличивал число периферических Т-клеток и хеллерных Т- клеток у больных с уремией и туберкулезом, но не действовал на супрессорные Т- клетки. Абико и у

Секино (Ablko,Sekino,1983) сообщали о синтезе бычьего тимозина. (38.

Другой гормон, названный сывороточным тимусным фактором, был выделен из свиной (Bach et al., 1975; Imalzumi et al. ,1977) и человеческой (Морозов,Хавинсон,1981) сыворотки крови. С помощью моноклональных антител было доказано присутствие этого гормона в тимусе (Auger et al. ,1982; Jambon et al.,1981). Этот гормон представляет собой нонапептид с последовательностью H-Glu-ALa-Lys-Ser-Gln-Gly- Gly-Ser-Asn-OH, причем аминокислотные последовательности гормонов, выделенных от свинец, телят и человека, идентичны(Ьасоуага, Utermohlen,1993). Было показано,(Dardenne et al. , 1982; Gastinel et al., 1984),что в состав биологически активной формы этого гормона входит цинк. Сывороточный тимусный фактор (тимулин) усиливает генерацию эффекторных Т-клеток и ингибирует контактную чувствительность у мышей (Strachan et al., 1979).

Данный гормон был получен с использованием методов синтеза в растворе (Bach et al , 1978) и твердофазным методом (Strachan et al. , 1979). Было показано, что синтетический сывороточный тимусный фактор (FTS) был способен восстанавливать некоторые Т-клеточные

• / недостатки у тимектомированных мышей (Strachan et al. ,1979).

Тимопоэтины I и II были выделены и охарактеризованы Г.Гольдттейном и др. (Goldstein, 1975Schlesinger,Goldstein, 1975). Они состоят 49 аминокислотных остатков (рис. 2) и отличаются только по двум остаткам - в положениях 1 и 43 (Jambon et al., 1981; Savino et al.,1982; Schlesinger. GolgsteIn,1975).Пepвoнaчaльнo они были идентифицированы в экстрактах тимуса по подавлению нервно-мышечной проводимости у крыс (Goldstein, 1974). Затем было показано, что они индуцируют in vitpo экспрессию некоторых антигенов Т

• / лимфоцитов на поверхности стволовых клеток и усиливают реакции лимфоцитов на митогены (Goldstein, 1975; Savino et al. ,1982). Из бычьей селезенки был выделен еще один гормон, названный тимопоэтином III или спленином (Abiko,Sekino,1981,1982; Abiko et al. , 1979,1980). При изучении его биологической активности оказалось,что он влияет на дифференцировку В-лимфоцитов,а не Т-лимфоцитов (Savino et al., 1982). Он также,как и тимопоятим II состоит из 49 аминокислот ,но отличается от него по двум остаткам в положениях 34 (рис. 2)(Audhua et al., 1981). Однако ^тих малых изменений оказалось достаточно, чтобы изменить специфичность гормона.

О синтезе полных молекул тимопоэтинов сообщали Фуджино и flp.(Fujino et al,1977) ,Близнаков др. Bliznakov et. а1.,1978),Абико и flp.(Abiko.Sekino, 1985,1988;Abiko et al., 1986). Эти же авторы (Abiko.Sekino,1987) сообщали о синтезе Pro l.Gly 2,Ser 43, Leu 47-аналога тимопоэтина II.

Рис. 2. Аминокислотные последовательности тимозинов.

Из тимуса также был выделен полипептид тимарин (Морозов и др. 1977), состоящий из 38 аминокислот и присутствующй в тинозин фракции 5 (Морозов, Хавинсон, 1978). Этот пептид влияет на экспрессию рецепторов Т-лимфоцитов, усиливает реакцию трансплантант против хозяина, продукцию антител, противоопухолевую резистентность, стимулирует репаративные процессы (Морозов, Хавинсон, 1978,1981 ;Морозов и др., 1978).

В последние годы установлено, что под влиянием тимусных гормонов находятся половое созревание

Bezedowskl,SorkIn,1974).CHHTe3 ДНК в соматических клетках (Piantanelli, Fabris,1975), функции гипофиза, надпочечников и. возможно, щитовидной железы (Pierpaoli,Bezedowskl,1975).

Из тимуса также был выделен лимфостимулирущий гормон (LSH), усиливастпий лимфоцитоз (Безвершенко и др., 1974). Тимусом также вырабатывается гомеостатический тимусный гормон (НТН), являющийся гликопептидом и обладающий лимфоцитопоэтическим действием (Милку,Потоп. 1977).

В 1962 г Гофманом (Hofmann, 1962) была высказана идея о том,что в каждой белковой молекуле имеется активный центр небольшой участок молекулы, обладающий биологической активностью целой молекулы. Поэтому проводились интенсивные исследования по определению местоположения активных центров молекул тимусных гормонов.

При разработке схем синтеза тимозина и изучении отдельных пептидных фрагментов его молекулы (Felix et al., 1984,1985; Нао et al.,1987; Krueck,1984),a так же на основе расчета вторичной структуры его молекулы (Birr et al. ,1979) было показано ,что участок 20-24 с последовательностью H-Lys-GLu-Val-Val-Gln-OH является активным центром молекулы тимозина oil. Этот синтезированный

15 фрагмент оказывал дифференцирующее влияние на Т-клетки предшественники костного мозга и крови человека (Мартынов и др.,1986).

Для определения активного центра сывороточного тимусного фактора было синтезировано большое количество его аналогов и фрагментов. В 1978 г. Бач и др.(ВасЬ е1 а1. ,1978) предположили, что гептапептид 3-9 с последовательностью Н-Ьуз-8ег-01п-01у-С1у-8ег-Азп-ОН является ответственным за биологическую активность сывороточного тимусного фактора .

С целью определения наименьшего фрагмента, обладающего биологической активностью, был предпринят синтез сывороточного тимусного фактора и различным его фрагментов (Мартынов и др., 1986; АЫко,8ек1по, 1982; вюЬку е1 а1. ,1983; Ьпшгшт & а1.,1981).

Эти пептиды проверялись на их способность обращать азати-опринчувствительные клетки в ТЪу-1 положительные Е-розеткообразущие клетки. В этих экспериментах было показано, что наиболее коротким фрагментом сывороточного тимусного фактора является пентапептид с последовательностью Н-Ьу8-8ег-01п-01у-01у-ОН (фрагмент 3-7). При исследовании биологической активности пептидов Н-Ьуз-8ег-01п-0Н, Н-Ьуз-8ег-01п-01у-01у-8ег-0Н, Н-Ьуэ-8ег-01п-01у-01у-0Н и Н-Ьу3-8ег-С1п-01у-С1у-0Н в Е-розеткоанализе было определено, что тетрапептид с последовательностю Н-Ьуз-8ег-01п-01у-01у-0Н, представляющий собой фрагмент 3-6 , является ' минимальной достаточной стуктурой для экспрессии восстановления активности Е-розеткообразующих клеток в случае хронической почечной недостаточности.

В исследованиях, проведенных с синтетическим сывороточным тимусным фактором, было показано, что он участвует в моделиро

16 вании киллерной активности (Bardos et al. ,1979). Механизм влияния тимулина на натуральную киллерную активность до настоящего времени еще не изучен, но эти результаты предполагают, натуральные киллерные клетки происходят из Т-клеток.

Блазек и Ленфант (Blassek.Lenfant,1983) описали стимуляторное действие сывороточного тимусного фактора на спонтанный ДНК синтез мышиных тимоцитов и клеток бычьего костного мозга. Эти данные вместе с обнаруженным ранее фактом, что активный комплекс тимулина с цинком селективно транспортирует цинк в тимоциты (Bach, 1981), открывают новые возможности для объяснения молекулярного механизма действия сывороточного тимусного фактора. По мнению авторов, роль таких металлопептидных комплексов может заключаться в том, что они катализируют ферментативные реакции, приводящие к авто или гетеросинтетической активности и поддержке такого синтеза.

В целой серии экспериментов (Abiko,Sekino,1981;Abiko et al. ,1979,1981; Goldstein al.,1979; Rowinski et al. ,1972) было показано,что активным центром тимопоэтина является фрагмент 3236 с последовательностью H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH, названный тимопентином. N-концевые три-и тетрапептиды тимопентина (TP 3 и TP 4) также обладают биологической активностью, свойственной тимопоэтину (Rajnavolgui et al.,1986).

Самыми короткими пептидами, обладающими биологической активностью тимусных гормонов, являются дипептиды, выделенные из тимолиновой фракции экстрактов тимуса, аналогичные дипептиду Н

• /

GIu-Trp-OH и обладающие активностью тимозина а^Дейгин и др., 1987).

Полученные к настоящему времени результаты позволяют надеяться на то, что синтетические пептиды, имитирующие природные

17 тимусные гормоны или их активные центры, будут применяться в медицинской практике в качестве иммунодулирующих препаратов при лечении заболеваний сопровождающихся нарушениями функционирования иммунной системы организма.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гиесов, Асомуддин Шамсуддинович

ВЫВОДЫ

1. Изучены различные методы получения низкомолекулярных иммуноактивных пептидов, применение которых совместно с традиционными лекарственными препаратами способствует повышению эффективности вакцинопрофилактики и лечения сельскохозяйственных животных.

2. Биологическая активность,проявлемая пептидами in vitro в тесте Е-розеткообразования клетки соответствует таковой, проявляемой in vivo при совместном применении с живой противотейлериозной вакциной.

3. При взаимодействии триптофансодержаших дипептидов с ионом Zn2+ происходит образование координационных соединений, в результате чего увеличивается биологическая активность исходного дипептида.

4. Разработанный на основе координационных соединений триптофансодержащих дипептидов с ионом Zn2+ иммуностимулирующий препарат тимоцин сохраняет свои физико-химические и биологические свойства в течение 2 лет

5. Применение тимоцина совместно с ассоциированной вакциной против рота-, коронавирусных антеритов и колибактериоза и живой культуральной противотейлериозной вакциной способствует значительному усилению первичного иммуного ответа у вакцинированных животных.

6. Применение тимоцина совместно с химиотерапевтическими препаратами значительно сокращает срок и повышает эффективность лечения пневмоэнтеритов молодняка крупного рогатого скота.

101

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют об огромном внимании исследователей, проявляемой к низкомолекулярным пептидам, обладающим активностью тимусных гормонов, в частности, аналогам дипептида глутамил-триптофан, обладающего активностью тимозина а^

С целью поиска аналогов дипептида глутамил-триптофан, обладающих более высокой биологической активностью, были синтезированы новые триптофансодержащие дипептиды аргинил-трипто-фан, аспарагинил-триптофан, метионил-триптофан, триптофил-триптофан

Для получения дипептидов был использован способ, который заключается в конденсации активированных пентафторфениловых эфиров N -защищенных ТЧ-концевых аминокислот с метиловым эфиром триптофана.

Промежуточные активированные эфиры были получены карбо-диимидным методом с использованием в качестве конденсирующего реагента дициклогексилкарбодиимида и в реакцию конденсации с аминокомпонентом вводились без выделения из реакционной смеси / сразу после отфильтровывания выпавшей дициклогексилмочевины.

Использованная тактика максимальной защиты позволила очищать полученные защищенные пептиды обычным способом путем обработ-ки реакционной смеси кислыми и основными реагентами и сразу после этого проводить реакцию деблокирования защищенных пептидов.

Вследствие наличия у остатка триптофана легко окисляемой индольной группы при разработке схемы синтеза триптофан-содержащих пептидов необходимо подбирать защитные группы

85 таким образом, чтобы условия их удаления обеспечивали неизменность индолъной группы остатка триптофана. Из литературных данных (Герткович,Кибирев,1987;

Гринтгейн,Виниц,19б7). известно, что индольная группа легко окисляется в кислых условиях и не затрагивается в условиях каталитического гидрирования. Поэтому для защиты а-амино- и гуанидиновой группы аргинина была использована карбобензоксигруппа, которую в конце синтеза удаляли каталическим гидрированием в присутствии 10%-ного Рё/С катализатора, а а-карбоксильную группу триптофана защищали сложноэфирной метальной группой, которую в конце синтеза снимали щелочным гидролизом в мягких условиях обработкой 10%-ным раствором карбоната натрия в течение 1 часа при комнатной температуре.После деблокирования свободные дипептиды были очищены переосажденнем из метанола эфиром или ацетоном. Окончательный выход свободных дипептидов достигал 70-85%.

В данном случае замена 1-гидроксибензотриазода, использованного в работах (Бобиев,199б; Дейгин и др., 1987), на пентафторфенол, не привела к увеличению выхода свободных пептидов, что связано с тем, что ТчГ-концевыми аминокислотами в нашем случае являлись аргинин, метионин, триптофан и аспарагин и реакция конденсации с их участием не всегда проходит с достаточно высоким выходом.

С целью изучения возможности использования при синтезе подобных дипептидов остатка триптофана со свободными индольной и а-карбоксильной группами, был предпринят новый синтез известных депептидов Н-С1и-Тгр-ОН,Н-11е-Тгр-ОН, Н-Азр-Тгр-ОН, Н-Уа1-Тгр-ОН. Обладающих биологическими свойствами тимозина а и имеющих известные физико-химические константы.

Для защиты функциональных групп концевых аминокислот были использованы группы, удаляемые каталическим гидрированием - карбобензоксигруппа (для защиты а-аминогрупп) и бензильная группа (для защиты ш-карбоксильных групп глутаминовой и аспарагиновой кислот), поскольку при их удалении не затрагивается индольная группа С-концевого остатка триптофана (Бобиеви ДР. ,1998)

Применение для синтеза пентафторфениловых эфиров дипентафторфенилкарбоната и остатка триптофана в виде натриевой соли позволило получать конечные свободные дипептиды без выделения из реакционной смеси и дополнительной очистки промежуточных активированных эфиров. Выход свободных дипептидов достигал 80-90%. Путем сравнения физико-химических характеристик получаемых пептидов с известными была определена возможность синтеза пептидов разработанным способом.

Таким образом, применение для синтеза пентафторфениловых эфиров, получаемых с помощью дипентафторфенилкарбоната, позволяет получать конечные свободные дипептиды без выделения из реакционной смеси и дополнительной очистки промежуточных активированных эфиров, использовать остаток триптофана со свободными индольной и а карбоксильной группами, а также исключить использование высокоэффективной жидкостной хроматографии для очистки свободных пептидов как метода, требущего специального оборудования. Все это вместе взятое позволяет значительно упростить процесс синтеза подобных пептидов по сравнению с (Бо-биев,1996;Дейгин и др., 1987).

С помощью подобного подхода были синтезированы фрагменты 32-34 и 32-35 молекулы тимопоатина и их аналоги (Бобиев и др., 1998). Однако в этом случае была использована тактика мак

87 симальной защиты. Применение для зашиты -амино- и боковых функциональных групп карбобензокси- и бензильной групп позволило окончательное деблокирование конечных три- и тетрапепти-дов осуществлять в одну стадию путем каталитического гидрирования в присутствии 10%-ного палладия на активированном угле. Активированные (пентафторфениловые) афиры ^защищенных аминокислот были получены по стандартной' методике взаимодействием дипентафторфенилкарбоната с триатиламмониевой солью И-защищен-ной аминокислоты в этилацетате и в реакцию конденсатцта с ами-нокомпонентом вводились без выделения из реакционной смеси сразу после упаривания этилацетата.

Защищенные ди-, три- и тетрапептиды были отчищены путем обыч-ной обработки реакттаонной смеси кислыми и основными реагентами.

При синтезе пептидов, содержащих С-концевые остатки аспарагина и глутамина ( Н-А^-ЬуБ-Азп-ОН и Н-А^-ЬуБ-СЫ-ОН) последние вводились в реакттаю конденсации с Вос-ЬуБ в виде натриевой соли. В этом случае защищенные конечные пептиды были очщены промыванием этилацетатом водных растворов солей пептидов с последующей экстракцией этилацетатом из подкисленных водных растворов.

Использование тактики максимальной защиты, подобного выбора защитных групп, ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с С-конца позволили проводить синтез пептидов без выделения из

• / реактционной смеси и дополнительной очистки промежуточных активированных эфиров и защищенных пептидов.

В данном случае выход конечных свободных пептидов был выше, чем при использовании п-нигрофениловых (АЬ1ко,8ек1по, 1981;АЫко еХ а!.,1979) и Ы-оксисукцинимидных (Бобиев.1996: Дейгин и др.,1987)

88 активированных эфиров.а также был упрощен процесс очистки свободных пептидов, который осуществляли без использования ВЭЖХ, как в случае Бобиев 1996: Дейгин и др., 1997 и фракционирования на сефадексе.как в работах (АЫко,8ек1по,1981; АЫко ег а1,1979).

С целью расширения спектра действия и увеличения биологической активности низкомолекулярных иммуноактивных пептидов были получены координатщонные соединения их с ионом

Бобиев и др. ,1999),синтез которых вели при рН 6,0, 110-120°С, без доступа воздуха и света. Сравнение УФ-спектров дипептида -11е-Тгр-ОН, его координатщонного соединения с ионами Бе (Бобиев,1999; Бобиев и др.Д997,1998) и Ъи позволило предположить,что при растворении в воде дипептид принимает такую конформацию,при которой ароматическую компоненту триптофана почти не видно. При координации с ионом металла эта конформация нарушается.что приводит к появлению на УФ-спектре координационного соединения максимума поглощения в области 250-290 нм. Отчасти в пользу этого предположения говорят данные А. А. Шевченко и др. (1994), которыми было показано, что при изменении структуры белка происходит изменение интенсивности пиков поглощения, соответствующих ароматическим аминокислотам, во вторых производных УФ-спектров.

Использование метода вторых производных Уф-спектров для исследования низкомолекулярных пептидов в литературе почти не описано. Только в монографии А. П. Демченко (1981) приведены примеры вторых производных спектров трипептидов Н-61у-Тгр-01у-ОН Н-(31у-Р11е-01у-0Н.

Для получения более подробной спектральной информации нами были рассчитаны вторые производные УФ-спектров дипептида Н-Пе

Тгр-ОН и его коордикадакнмх соединений с ионом Zn при д D равном 1 нм. Применение вторых производных УФ-спектров в нашем случае позволило выделить ароматическую компоненту триптофанапик при 291 нм, что соответствует литературным данным (Демченко, 1981; Демченко и др.: 1978; Шевченко и др., 1994). Изменения во второй производной УФ-спектра координационного соединения по сравнению с дипептидом (увеличение интенсивностио пиков при 260 и 291 нм, сдвиг в длиннволновую область пиковпри 250, 256 нм и появление новых пиков при 255,264,269,282,285,294 и 299 нм) позволяют сделать заключение о том,что при взаимодействии дипептида с ионом Zn остатке триптофана происходит перераспределение электронной плотности, что может происходить при участии остатка триптофана в образовании координатпюнных соединений.

Сравнивая полученные результаты с данными литературы (Бобиев,1991; Бобиев и др., 1997,1998; Щербакова, Панкратова, 1991), было сделано предположение, что ион Zn2+ образует ионную связь с карбоксильной группой остатка триптофана, а наиболее вероятными местами координатой будут атом ' кислорода карбоксильной группы остатка триптофана и алектронодонорные атомы пептидной связи.

Исходя из структуры пептида и природы металла-комплексообразователя были предложены возможные реакции образования координаттионных соединений, которые согласуются с реакциями, предложенными для образования координационных соединений иона Си и некоторых ди- и трипептидов (Бобиев и др.,1998; Борисова, 1966; Пороптин и др., 1971; Турсунов и др., 1971). Согласно

90 предложенным реакциям образование координационных соединений может проходить в две стадии. На первой стадии происходит присоединение к иону цинка одной молекулы дипептида с образованием положительно заряженного комплекса. На второй стадии происходит присоединение второй молекулы пептида с образованием нейтрального комплекса.

Изучение иммуностимулирующей активности полученных координатцюнных соединений и исходных дипептидов по усилению антителообразования у иммунизированных животных при совместном применении с противотейлериозной вакциной показало, что после координации с ионом Zn2+ увеличивается иммуностимулирующая активность полученных координационных соединений по сравнению с исходными дипептидами.

Пептиды, не проявившие активности in vitro в тесте Е-розеткообразования клетки (Дейгин и др., 1987), не проявили биологической активности in vivo при совместном применении с противотейлериозной вакциной. Применение координатцюнных соединений данных дипептидов, например дипептида валил-триптофан, вызывало двухкратное увеличение титра противотейлерийных антител. Биологическая активность пептидов,проявляемая in vitro в тесте Е-розеткообразования клетки, соответствует их активности, проявляемой in vivo при совместном применении с противотейлериозной вакциной. Свободные дипептиды H-GIu-Trp-OH и Н-Пе-Тгр-ОН, проявивтие in vitro в тесте Е-розеткообразования клетки 100%-ную биологическую активность, вызывали увеличение титра антител в 2-3 и в 4 раза, соответственно. Применение дипептида H-Asp-Trp-OH, проявившего в тесте Е-розеткообрааования клетки 30% активности дипептида H-GIu-Trp-OH, вызывало увеличение титра

91 противотейлерийных антител на 40-100%. Координационные соединения дипептида Н-Пе-Тгр-ОН с ионом Ъп+ вызывали увеличение титра противотейлерийных антител в 4-8 раз по сравнению с исходным дипептидом. После координации с ионом Хп2+ отмечалось 1,5-2-кратное увеличение иммуностимулирующей активности по сравнению с исходными дипептидами.Полученные результаты согласуются с данными (Бобиев,1999; Бобиев и др., 1997,1998; Крисе и др., 1990; МгаЬе! ег а1.,1992), показывающими, что координация с ионами металлов приводит к усилению специфической биологической активности лиганда. По данным (Бобиев, 1999;Бобиев и др., 1997,1998) при координации с ионом железа происходит двукратное увеличение титра противотейлерийных антител. В нашем случае наблюдается 2-8-кратное увеличение титра антител. Из этого можно заключить, что цинк, как более активный металл, вызывает большее увеличение специфической биологической активности.

Таким образом, координация триптофансодержаших дипептидов с ионом + способствует повышению иммуностимулирующей активности исходных дипептидов, причем это повышение зависит от биологической активности исходного пептида.

После установления высокой иммуностимулирующей активности координационных соединений низкомолекулярных иммуноактивных пептидов, на их основе был разработан препарат тимоцин, представляющий собой 0,04%-ный водный раствор координационного соединения такого пептида с ионом Zn2+.

Проверка стерильности данного препарата, осуществленная путем высева на различные среды (МПА,мПБ,мППБ, среда Сабуро) показала, что данный препарат является стерильным по отношению к аэробным и анаэробным бактериям и контаминации

92 грибами.Изучение стабильности препарата тимоцин в условиях длительного хранения позволило установить его срок годности равным 2 года Исупов и др., 1999)

После этого были изучены токсические свойства тимотцина(Бобиев и др.,1998).Изучение острой токсичности,проведенное на белых мышах кроликах, овцдх и телятах показало, что однократное применение тимоцина белым мышам в доае 15-100мл/кг (1050-7000 терапевтических доз), кроликам -5-го мл/кг (350-1400 терапевтических доз), овцам и телятам в дозах 5-15мл/кг (360-1050 терапевтических доз) не оказывает отрицательного воздействия и не вызывает признаков отравления у лабораторных и сельскохозяйственных животных.

При изучении хронической токсичности было показано, что длительное (в течение 10 суток)применение тимоцина белым мышам в дозах 5-25 мл /кг (357-1785 терапевтических доз) и кроликам в дозах 5-10 мл/кг (357-714 терапевтических доз)не вызывает у них признак овотравления.

При проведении патоморфологических исследований изменений паренхиматозных органов и других систем организма обнаружено не было. При исследовании функтптонадьного состояния сердечнососудистой и дыхательной систем у кроликов режим сокращения сердца в среднем составлял 128 ударов в минуту,дыхательных движений - 56, температура тела подопытных кроликов в период опыта составляла 39,2-39,5°С, что находится в пределах физиологической нормы.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что тимоцин при введении в организм лабораторных и сельскохозяйственных животных (однократном и длительном) не оказывает повреждающего действия, не вызывает побочных явлений

93 месячного и общего характера и, следовательно, является для них практически нетоксичным препаратом.

Исходя из наших данных и данных других исследователей (Бобиев,1999; Бобиев и др., 1997,1998; Добрынина, 1992; Киреева и др., 1978; Крисо и др., 1990; Перелъдин и др., 1979; МгаЬег е1 а1.,1992) координация с ионами металлов не приводит к появлению токсических свойств или их увеличению у биологически активных лигандов. '

О нормальном функционировании иммунной системы организма судят по уровню гуморального и клеточного иммунного ответа и факторов неспецифической резистентности организма. Показателем гуморального иммунного ответа является уровень антител, вырабатываемых организмом на введение антигена, а факторов неспецифической резистентности организма - лизоцимная и бактерицидная активность сыворотки крови.

В связи с этим иммуностимулирующую активность тимоцина оценивали по его влиянию на усиление антителообразования и факторы неспецифической резистентности организма при его совместном применении с ассоциированной гидрооксьалюминиевой формолвакциной против рота-, коронавирусных антеритов и колибактериоза телят (Бобиев и др., 1998).

При этом опытных животных первой группы иммунизировали вакциной совместно с тимоцином, второй - только вакциной, животные третьей группы служили контролем и иммунизации не подвергались.

- /

Проведенные иследования показали, что до иммунизации в сыворотке крови коров содержались антитела к ротавирусу (определяемые иммунофентным анализом) в титре 2.5-+0.15 1о§2, коронавирусу (определяемые реактцюй торможения

• / гемагглютинатцто) в титре 3,0-+0,2 log2 и к эшерихии коли (опеделяемые реакцией аг-глютинации) -1:50-25.

После иммунизации в сыворотке крови животных отмечалось увеличение количества специфических антител. Титр антител к ротавирусу у животных первой и второй групп достигал 8.4-+0.25 и 6.5-+0.2 log2 к коронавирусу - 9,8"+0,3 и 7.5-+0.2 log2 и к эшерихии коли-1:1800-200 и 1:800-100,соответственно. Бактеритцедная и лизоцимная активность сыворотки крови животных первой, второй и третьей групп до иммунизатщи составляла б5,0-+0,5 и 3,1-+0,15%, соответственно. Через 21 день после ревакцинации бактерицидная и лизоцимная активность сыворотки крови у животных первой, второй групп сооставляла, соответственно, 80,2-+0,8, 4,9*0,2 и 69,0-+0,75 и 3.3-+0.05%. При иммунизации только вакциной увеличение титра антител к рота-, коронавирусу и эшерихии коли составляло 2,6, 2,5 и 16 раз, соответственно, при иммунизации вакциной совместно с тимоцином 3,36, 3,27 и 36 раз, соответственно. При иммунизации только вакциной увеличение бактеритцедной и лизоцимной активности составляло 4 и 0,2%, при иммунизациц вактцшой совместно с тимоцином -15,2 и 1,8%,соответственно. Следовательно, применение тимоцина способствует увеличении титра антител к ротавирусу в 1,29 раза, коронавирусу - 1,3 раза, эшерихии коли - 2,25 раза, лизоцимной активности - 1,58 раза, бактерицидной - 1,39 раза по сравнению с группой животных, которых иммунизировали только вакциной.

Таким образом, проведенные исследования показали, что применение тимоцина в комплексе с ассоциированной вакциной способствует увеличению уровня гуморального иммунного ответа и факторов неспецифической резистентности организма, что свиде

95 тельствует о наличии у тимоцита ярко выраженной иммуностимулирующей активности. .

После этого была разработана оптимальная схема совместного применения тимотцина и ассотцшрованной вакцины. Тимоцин применяли в дозах 0,01-0,03 мл/кг живого веса животного один раз в сутки в течение 1-5 дней. Проведенные исследования показали, что однократное применение тимоцина в дозах 0,01, 0,02 и 0,03 мл/кг не оказало существенного влияния на увеличение титраспецифических антител. Применение тимоцина в течение 3 дней в дозе 0,03 мл/кг привело и незначительному увеличению титра специфических антител к коронавирусу (5,0-+0,27 \о%2, контроль 3.4-+0.16 1о§2 Наиболее сильное увеличение титра антител к коронавирусу наблюдалось при применении тимоцина в дозе 0,02 мл/кг в течение 5 дней (5.2-+0.3 1о§2). Наиболее сильное увеличение титра антител к ротавирусу отмечено при применении тимоцина в дозе 0,03 мл/кг в течение 3 дней (4,8±0,3 \og2 , в контроле - 3,2-+0,15 1о§2).Применение тимоцина в дозе 0,3 мл/кг в течение 3 дней и 0,02 мл/кг в течение 5 дней вызывало двукратное увеличение титра специфических антител к эшерехии коли.

Таким образом, наиболее оптимальным является применение тимоцина в дозах 0,02-0,03 мл/кг в течение 3-5 дней совместно с ассоциированной вакциной против рота-, коронавирусных антеритов и колибактериоза телят.

Разработанный оптимальный способ применения тимоцина, также как и тимофера, представляющего собой координатционное соединение триптофансодержащего дипептида с железом (Бобиев,1999), предусматривает 3-5-кратное применение препарата для максимальной стимуляции иммунной системы организма животных при вакцинации.

Производственные испытания эффективности вакцинации при совместном применении тимоцина и ассоциированной вакцины показали, при этом значительно увеличивается антителогенез по отношению к каждому вакциному антигену: ротавирусу - на 47%, коронавирусу - на 44%, эшерхии коли- на 100% После того,как в лабораторных и производственых условиях было показано наличие у тимоцина иммуностимулирующей активности, изучалось его влияние на эфективнность лечения пневмоэнтиритов молодняка крупного рогатого скота (Бобиев и др., 1998).

Тимоцин применяли в комплексе с химиотерапевтическими препаратами ПВЭНТИ и регидропектатом. Тимоцин применяли в дозах 0,02, 0,03 и 0,05 мл/кг живого веса животного один раз в сутки

• ✓ в течение 3, б и 9 дней подкожно или внутримышечно. Контролем служили животные которых лечили только химиотерапевтическими препаратами.

Полученные результаты цоказали, что наибольшая эффективность лечения отмечалась в тех группах животных, в которых тимоцин применяли в дозах 0.02, 0,03 и 0,05 мл/кг один раз в сутки в течение 6 дней. Эффективность лечения в этих группах была на 20% выше, чем в контрольной группе. В этих группах выздоровление больных животных наступало на 6-7 сутки, тогда как больные животные контрольной группы выздоравливали на 13-14 сутки. При этом было установлено, что увеличение эффективности лечения не зависело от способа введения тимоцина -подкожного или внутримышечного.

После установления этого факта были проведены производственные испытания тимоцина при лечении вышеуказанного заболевания.

В опытной группе больных животных тимоцин применяли в комплексе с химиотерапевтическими препаратами ПВЭНТИ и

97 регидропектататом в дозах 0,02-0,03 мл/кг живого веса один раз в сутки в течение 5 дней. Животных контрольной группы лечили с помощью известных препаратов Т-активина, иодинола и регидрата.

Результаты производственных испытаний показали, что в опытной группе эффективность лечения составляла 94,27%, срод лечения-7 дней, в контрольной-83,4 % и 12 дней, соответственно. Таким образом, было показано, что применение тимоцина в комплексе с химиотерапевтическими препаратами способствует повышению эффективности и сокращению срока лечения пневмоэнтеритов молодняка крупного рогатого скота.

Также было изучено влияние тимоцина на антителогенез у молодняка крупного рогатого скота при совместном применении живой культуральной противотейлериозной вакциной (Бобиев и др., 1998). Животных опытной и контрольной групп иммунизировали вакциной в дозе 1 мл (0,1 млн живых клеток) на голову. Тимоцин вводили внутримышечно трехкратно с интервалом через день в дозах 1 мл на 100 кг живого веса животного (1 группа), 2 мл (2 группа),Змл (3 группа), 4мл(4 группа). Контрольной группе иммунизированных животных тимоцин не вводили.

Результаты проведенных исследований показали, что у телят первой группы титр противотейдерийных антител, определяемых иммуноферментным анализом, составлял 1:50-1:200, второй-1:100-1:800,третьей-1:400-1:1600, четвертой-1:200-1:1600, в контрольной группе титр антител состовлял у двух телят 1:501:200, у одного -1:400 и у одного-1: 800. Из этих данных видно, что приминение тимоцина в дозе 1 и 2 мл не оказало сушественного влияния на увеличение титра противотейлерийных антител. Наибольшее увеличение титра антител (2-3 раз) отмечалось при применении тимоцина в дозе 3 мл на 100 кг живого веса животного.

Таким образом, применение тимоцина способствовало значительному увеличению титра специфических антител у молодняка крупного рогатого скота, иммунизированного противотейлериозной вакциной.

После получения положительного результата в акспериментальных условиях были проведены производственные испытания тимоцина при совместном применении с противотейлериозной вакциной.

Результаты этих испытаний показали, что четырехкратное применение тимоцина с интервалом через день в дозе 3 мл на 100 кг живого веса животного вызывало образование специфических противотейлерийных антител у 85 % опытных животных в титре 1:400 -1:800 , у оставшихся 15% титр антител достиг уровня 1:1600. В контрольной группе в сыворотке крови 50% телят титр антител составлял 1:50-1:200, у 30%-1: 200-1:400, 20% - достиг уровня 1: 800.

Поствакцинальная реакция на введение вакцины у телят опытной группы прошла без осложнения , вынужденного убоя падежа животных, продолжительность ее составила 5-7 дней. Температура тела животных при этом повышалась до 40,0-41,1°С. Отмечалось умеренное увеличение в основном предлопаточных лимфатических узлов. В мазках крови обнаруживалось до 92 тейдерий в 100 полях зрения микроскопа.

У телят контрольной группы длительность поствакцинальной реакции составила 7-10 дней, температура тела повышалось до 40,1-41,5°С, отмечалось значительное увеличение лимфатических узлов. В мазках крови пораженность эритроцитов тейлериями дохбдила до 148 паразитов в 100 полях зрения микроскопа. У 50 телят отмечалось ослабление аппетита.

Полученные результаты показывают, что тимоцин обладает такой же или чуть большей иммуностимулирующей активностью по и сравнению с тимофером. Тимоцин вызывает 4-8 краткое увеличение

100

• /

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гиесов, Асомуддин Шамсуддинович, Душанбе

1. Алиева С. В. Изучение влияния некоторых защитных группировок на процесс комплексообразования пептидов с медью: Авто-реф. дис. канд. хим. наук, -м.,1970. -14с.

2. Арион В. Я. Иммунологически активные факторы тимуса//Итоги науки и техники,сер. Иммунология. -М. ,1981. -Т. 9. -С. 10-50.

3. Арион В. Я. Корректция Т-системы иммунитета. Теоретические• /и практические аспекты/ЯТроблемы клинической и экспериментальной фармакологии и побочных действий лекарственных средств. -Тбилиси, 1981.-С. 88-90.

4. Арион В. Я. Т-активин: физико-химическая характеристика и биологическая активность//Сорбционные методы детоксикации в медицине ( тез. докл. 1 Всес. конф.). Харьков, 1982. -С. 216-217.

5. Арион В. Я. , Санина И. R , Бреусов Ю. Н. Молекулярная и функциональная гетерогенность иммунологически активного фактора тимуса Т-активина //Химия и биология иммунорегуляторов. Рига:1. Зинатне, 1985.-С.39-52.

6. Астанина А.Н. Кластеры железа как переносчики электронов в биологических и модельных каталитических системах //IV Межд.симп. по гомогенному .катализу. Тез.докл.-Л. ,1974. -С. 20-21.

7. Балкунова Л. П. Исследование взаимодействия глитрша с хлоридами Мп,Са,2п.Сс1 методом растворимости и характеристика новых твердых фаз: Автореф. дис. канд. хим. наук. Фрунзе, 1977. -22 с,

8. Безвертенко И. А.,Бойко М.Г. ,Лукатова Р.Г. Физико-химические свойства лимфоцетотропного фактора тимуса //Укр. биохим. журн.-1974.- З.-С.358-364.

9. Бедова А.А.Биохимия процессов воспаления и поражения сосудов. Роль нейтрофилов //Биохимия.-1977.-Т.62.-Вып.6.-С.659-668.

10. Белоупова А.К. Биохимические подходы к химиотерапии ра-ка//ЖВХО им.Д.И. Менделеева.-19637.-Т.8.- 4.-С.413.

11. Биологические аспекты координационной химии/. Под ред. Дрширского К.Б.-Киев: Наукова думка, 1979.-206 с.

12. Блохин Н. Н. Перевозчикова Н.И. Химиотерапия опухолевых заболеваний. -М.: Медицина, 1984. -303 с.

13. Бобиев Г.М. Синтез и. структурно-функциональное исследование иммуноактивннх пептидов ряда тимопоатина, тимоэина и бурсина: Автореф.дис.канд. хим.наук.-Душанбе, 1996.-24 с.

14. Бобиев Г. М., Бобиев Х.А., Хайдаров К.Х. Биологические свойства раствора координационного соединения иммуноактивного пептида с ионами металлов // Там же.-С.31. '103

15. Бобиев Г. М., Бобиев Х.А., Гиесов А.Ш., Чориева С.А.Новый подход к синтезу иммуноактивных триптофансодержаших пептидов // Информ. листок НПИЦентра Республики Таджикистан.-Душанбе, 1998.-69-98.-4 с.

16. Бобиев Г.М., Гиесов А.Ш., Исупов С.Д. и др. Получение новых цинксодержаших биологически активных соединений // Координационные соединения и аспекты их применения. Сб. науч. тр.-Душанбе,1999. -С. 147-150.

17. Бобиев Г. М. , Сатторов И. Т. , Гиесов А. Ш. и др. Влияние ново- го иммуномодулируюшего препарата тимоцина на эффективность лечения пневмоэнтеритов телят //Информ. листок НПИЦентра Республики Таджикистан.-Душанбе,1998.-ГчГ 68-98.-3 с.

18. Бобиев Г. М. , Сатторов И. Т., Гиесов А.Ш. и др. Влияние нового иммуномодулятора тимоцина на эффективность вактцинопрофилактики энтеритов и колибактериоза //Информ. листок НПИЦентра Республики Таджикистан.-Душанбе,1998.-1ЧГ 70-98.-4 с.

19. Бобиев Г. М., Сатторов И. Т. , Махмудов К. , Гиесов А. Ш.Токсические свойства нового иммуностимулирущего препарата тимоцина//Информ. листок НПИЦентра Республики Таджикистан. -Душанбе, 1998.-М 67-98.-3 с.

20. Бобиев Г. М. , Сатторов И. Т., Нораев Р.Х. и др. Синтез и иммуногенные свойства комплекса низкомолекулярного104иммуноактивного пептида с железом //Докл. АН Республики Таджикистан. -1997.- Т. XI .-N 1-2.-С.45-48.

21. Бобиев Г. М. , Шахматов А.Н., Гиесов А. Ш. Применение пен-тафторфенидовых эфиров для синтеза новых аналогов тимопентина //Информ. листок НПИЦентра Республики Таджикистан. -Душанбе,1998.-N 72-98.-4 с. . ■

22. Бобиев Г. М. . Шахматов А. Н., Гиесов А. Ш. Синтез новых гексапептидных аналогов тимопентина методом активированных эфиров //Информ. листок НПИЦентра Республики Таджикистан. -Душанбе, 1998.-N 71-98.-3 с. '

23. Борисова А.П. Исследование комплексов меди, образованных некоторыми пептидами: Автореф. дис.канд.хим. наук.-bL, 1966.-15 с.

24. Вииневская Г. П. Спектры ЭПР и парамагнитная релаксация в водных растворах Си2'//Журн. теор. эксп. химии.-197Ö.-T.6.-N 5.-С.698-701.

25. Войнар А.О. Биохимическая роль микроэлементов в организме животных и человека.-М.,1960.

26. Гершкович A.A., Кибирев В.К. Синтез пептидов. Реагенты и методы.-Киев:Наукова думка, 1987.-264 с.

27. Гринпггейн Д. .Винит; М. Химия аминокислот и пептидов.-М. .Мир, 1967.-821 с.

28. Григорьева A.C., Конахович Н. Ф., Крисе Е., Милетин Ю. А.

29. Взаимодействие между трифенилвердазильным радикалом и комплексами меди, железа, алюминия и цинка с N-3-трифторметил-фенилантраниловой кислотой //Коорд. химия.-1985.-Т.П.-N 12.-С.1620.

30. Гуселъ В.А., Маркова И. R Справочник педиатора по клинической фармакологии. -JI. ,Медицина,1990. -С. 68-69.105

31. Дейгин В.И., Коротков A.M., Бобиев Г.М- и др. Выделение и структурно-функциональнное исследование иммуноактивннх пептидов/ЯДитомедамат. Тез. I Всес. конф. по биорегуляторам. -Ленинград, 1987.

32. Дейгин В.И., Коротков А. И., Помогайбо C.B. и др. Синтез и исследование биологической активности иммуноактивных пептидов// VII Всес.симп. по химии белков и пептидов.-Таллин,1987.-С.173.

33. Демченко А. П. Ультрафиолетовая спектроскопия и структура белков.-Киев:Наукова Думка, 1981.-208 с.

34. Исупов С. Д. , Гиесов А. Ш. , . Исследование стабильности препарата тимоцин в процессе длительного хранения. Сб. статей V научно- практической конференции "Теоретические и практические исследования в медицине".-Душанбе, 1999.-C. 110-112.

35. Карлинский В. М. Синдром дефицита цинка Вопросы питания. -1980.-1 2. -С. 10-18.

36. Кассиль Т.Н. Наука о боли.-М.:Наука,1975.-398 с,106

37. Киреева А.Ю.,Бихман Б. И. , Дятлова М.М. О'применении комплексонатов железа//Тез. докл. I Всес. совет, по химии и применению комплексонатов металов. -М. ,1978. -С. 130.

38. Ковальский В. В. Геохимическая экология.-М. ,1974.

39. Коломийцева М. Г., Габович Р. Д. Микроэлементы в медицине. М.,1970.

40. Крисе Е., Волченскова И. И. , Бударин Л. И. , Координатцюнные соединения металлов с лекарствами -новые эффективные терапевтические агенты //Коорд .химия .-1990.-Т. 16.-Вып. 1.-С. 11-21

41. Крылова Л. Ф., Диканская Л. Д., Федотов М. А., Моноциклические комплексы платины (I) и палладия (II) с аминокислотами ряда глицина // Коорд . химия .-1994.-T.20.-N 1.- С .57-59.

42. Лааарис А. Я , Карлинский В. Обмен глинка в животном организме Успехи совр. биол.-1970.-£чГ 2(5).-С.255-275.

43. Леонов В. А. , Дубина Т. Л. Цинк в организме человека и жи- вотных ;Минск, 1971.

44. Лопухин Ю. М. Клинический опыт коррекции иммуной системы фактором тимуса (Т- активином ) // Итоги науки и техники, сер. Иммунология . -М. ,1982 . -Т. 10. -С. 30-44.

45. Лопухин Ю. М. , Петров Р. В. , Ковальчук Л. В., Арион В. Я. Современные представления об иммунодефицитах человека:диаг-ностика и методы корректщи//Иммуннодефицитные состояния и методы их корректен. Тр. 2 МОЛГМИ им. Н. И. Пирогова. -М. ,1981. С. 6-16.

46. Машковский М.Д.Лекарственные средства. -М. .Медицина Л 978.

47. Микроэлементы в питании человека. Докл. комитета экспертов ВОЗ.-Ы 532.-Женева, 1975.-С. 10-16.

48. Милку Ш. М. , Потоп И. Фармакодинамика выработываемых тимусом сходно-гормональных веществ.-Бухарест, 1977.-е. 1-87.

49. Морозов КГ., Хавинсон В. X Выделение, очистка и идентификация имунуномодулирующего полипептида,содержащегося в тимусе телят и человека//Биохимия.-1981.-Т. 46.-Ы• /9.-С.1652-1659.

50. Морозов В. Г. , Хазинсон ЯХ Характеристика и изучение механизма действя фактора тимуса (тимарина)//Докл. АН СССР.-1978.-Т. 240.

51. Морозов В Г., Хавинсон В. X , Ильин Н. Я Влияние низкомолекулярного фактора тимуса на Т-клетки крови человека//Ж. микробиологии, эпидемиологии, иммунологии.-1978.-Т.7.-С. 61-65.

52. Морозов В Г., Хавинсон Я X., Писарев О. А. Выделение из тимуса и изучение природм фактора, стимулирующего иммуногенез// Докл. АН СССР. -1978. -Т. 233. -И 3. -С. 491-494.

53. Никольский Б. П, Пальчевский В. В. Щербакова В. И. Состояние Бе (II) и Бе (III) в водных растворах оксиуксусной,амино108уксусной и акриловой кислот // Взаимодействие в растворах окислительно-восстановительных систем. Под.ред. Б. П Никольского.

54. B.R Падьчевского. -Л. ,ЛГУ, 1977. -С. 57-64.

55. Островская Л. К. Биохимическая роль железа в растениях //

56. Фотосинтез и пигменты как факторы урожая.-Киев,1965.- 0.15.

57. Пададе Д. М.,Ожерельев И. Д. ,Беляева И. R Компдексообразо-вание кобальта (III) с гистидином в инертной атмосфере // Коорд. химия.-1994.-Т.20.- 6.-С.462-465.

58. Пёрельдин Н. Ш. , Ящунский В. Г. Применение комплексонатов железа для предупреждения анемии путных зверей //Тез. докл. I Всес. совещ. по химии и применению комплексонатов металлов.-М, 1978.-С. 144.

59. Петров P.R Иммунология.-м. ,Мэдиг(Ина, 1987.-415 с.• /

60. Петров Р. R Роль гормонов и медиаторов в функтрюнировании иммунной системы // Вестник АМН СССР. 1980.- 8. С. 3-11.

61. Порошин К. Т., Салахутдинов У. И. , Турсунов К М., Щукуров

62. C.Ш. Изучение комплексных соединений меди с некоторыми дипептидами//Докл. АНТадж СОР. -1971. -Т. 14. 1. -С. 37-40.

63. Практическая химия белка.-М.,Мир. 1989.-621 с.

64. Раджабов У. , Юсупов 3. Н , Оффенгенден Е. Я. Координатдаон-ные соединения железа с гистидином в водно-перхлоратных растворах//Координатционные соединения и аспекты их применения:

65. Сб. науч. тр. -Душанбе, 1991. -С. 140-145.

66. Романенко 9. Д. , Бударин Л. И. , Яцимирский К. Б. и др. рН-Потенциометрическое опеределение констант устойчивости комплексов Со (П), Мп (II), и Бе (II) о изадрином//Теор. и эксперим. химия. -1978. -Т. 14. 1.-С.76.

67. Смоляр В. И. Гипо-и гипермикроэлемнтозы. -Киев: Здоровья, 1989.-152 с.• ✓

68. Собиров В. X., Кебец и М. , Порай-Кошиц М. А. , Стручков Ю. Г. Кристаллическая структура биядерного комплекса хлорида меди (И) с у-аминомасляной кислотой//Коорд. химия,-1994 Т. 20.-К 6. -С. 466-470

69. Салахутдинов У. И., Борисова А. II, Савич И. А. Исследование устойчивости и каталитической активности медных комплексов некоторых дипептидов//Докл. АН ТаджСОР.-1968.-Т.П.-К П.-0.34-36.

70. Севрюгина Ю. Ю.,Добрынина Н. А.,Николаева Л.С.,Евсеев А. М. // Глутаминаты 1тинка//Коопл. химия. -1994. -Т. 20. -N-3. -с. 175177.

71. Слюдкин О. П. , Жедонкина А. Г. , Иваненко Я А. О различном взаимодействии хиральных Ь-фениладаниновых комплексов 14(11) и Р1(1У) о фенилаланил-транспортной РНК-синтетаэой// Коорд. химия. -1996.-T.22.-N б.-С. 497-498.

72. Страйер Л. Биохимия, -М. ,Мир,1985. -Т. 2. -С.74.

73. Тайлынов Т. ,Мамедхонов А. Действие микроудобрений цинка на продуктивность хлопчатника//Хлопководство.-1980.-И 2.-С.27-28.

74. Турсунов М. Н., Салахутдинов У. И., Шукуров С. Ш. Цорошин К.Т. Некоторые свойства комплексов, образованных медью с трипептидами//Докл. АН ТаджССР. -1971. -Т. Х1У. ^ 2. -С. 40-43.

75. Уильяме Д. Металлы жизни, -М.,Мир,1975. -236 с.110

76. Хохлов Д. И , Брусов Р. В., Гроховский С. Л. и др. Взаимодействие с ДНК синтетического цинксвязываютего пептида//Мол. биол. -1994. -Т. 28. -Вып. I. -С. 87-95.

77. Худыйбердыев Э. X., Алявия М. К. Координатцюнные соединения железа (!!),(III),меди (II) с пиродоксином,аспарагиновой и п-аминосалициловой кислотами // Коорд. химия. -1984. -Т. 10. 8. С. 1072-1075.

78. Хьюз М. Неорганическая химия биологических процессов. -М.,Мир. 1983.

79. Шевченко А. А. ,Кост О. А., Казанская Н. Ф. Количественый метод оценки структуры и конформационной устойчивости белков по вторым производным УФ-спектров поглощения/Биорган. химия, 1994.-Т. 20. -И 3. -С. 263-267.

80. Шемякина Е. В. Исследование взаимодействия смешанных аммиачных комплексов меди с аргинином или лизином в растворе и коллагена нативных фибрил// Коорд. химия.-1991.-Т. 17.-Вып.6. С. 836-839.'

81. Шемякина Е. В. Образование в растворах смешаных аминокомплексов меди с глутаминовой и аспарагиновой кислотами и ихвзаимодействие о фибриллярным коллагеном // Коорд. химия. -1991 7-Т. 177-Вып. 12.-С. 1689-1691,

82. Школьник М.Я. Микроэлементы в жизни растений. -Л. ,1974.

83. Школьник М.Я Микроэлементы и нуклеиновые кислоты Успехи совр. биол. -1969. -Т. 67. -Вып. I. -С. 3.

84. Щербакова В. И. , Панкратова О. Б. Комплексные соединения железа (III) в водных растворах ди- и трипептидов с, донорными атомами в боковых цепях // Коорд. химия.-1991.-Т. 177-Вып. 3. -С. 344-349.

85. Эйхгорн Г. Неорганическая биохимия.- М. ,Мир,1978.1.l91 .Юнусходжаев A. H. , Муккарамова У. А. Дакимов X X./

86. Смешанные комплексы Со (II), мп (II) Си (II) с придоксином, глугаминовой и аспарагиновой кислотами // Коорд. химия. -1993 .-Т. 19, 47- С.319-321.

87. Юсупов 3. Н.,Виниченко Г. М. Состояние комплексных частиц,образующихся в системе Fe (II) Fe (III) DL-норвадин -вода // Мёжчастичные взаимодействия в растворах. Душанбе. 1997.

88. Якубов X. М. , Винниченко Г. М. , Оффенгенден Е. Я. , Астанина А. Н. Координационные соединения железа с глицином впроцессе жидкофазного окисления цистеина молекулярным• /кислородом//журн. неорган, хим. -1985. -Т.30. -Вып. 8. -0.2018-2022.

89. Якубов X. М., Винниченко Г. м., Оффенгенден Е. Я. , Астанина А. Н. Координационные соединения железа с норвадином//Докл.АН ТаджССР. -1984. -Т. 27. -N 7.-С. 391-394.

90. Якубов X. И., Щербакова В. И., Пальчевпкий R R , Бухаризода Р.А. Глицинатнне комплексы железа//Докл. АН ТаджССР.-1975.-Т. 18.-N 4.-С.36-39.

91. Яцимирский К. В. Введение в бионеорганическая химия. -Киев: Наукова думка, 1976. -143 с.

92. Яцимирский К. Б. , Волченскова И. И., Майданевич Н. Н. и др. Исследования методом ЭПР влияния цисдихлордиаминоплатины (II) на активность железосорных центров мембран митохондрий// Докл.АН ССОР.-1985.-Т.£83. S.-C.391. ,112

93. Ablko T.,Seklno H.Effects of synthetic thymopoietin fragments on low E-rosefcte forming cells of a uremic patient //Спет. Pharm. Bull.-v.29.- 11.-p.3320-3325.• /

94. Ablko T.,Seklno H. Effects of two synthetic serum thyinic factor analogues ang four thymio factor fragments on the low E-rosette forming cells with chronic renal failure // Chem.Pharm. Bull.-1982.-v. 30. -p.4448-4456.

95. Ablko T.,Seklno H. Synthesis of human thymopoietin (LTP) and examination of Itc Immunological effect on the impaired blastogenic response of T-lymphooytes of uremto patients // Chem. Pharm.Bull.-1988.-v.36.N 7.-p.2506-2516.

96. Ablko Т. Sekino H.Synthesis of the nonatetraoontapeptlde corresponding to the entire ami no acid sequence of thymopoietin I and Its effect on the low E-rosette forming cells of a uremic patient //Chem.Pharm. Bull.-1985.-v.33.-p. 1583-1591.

97. Abtko Т., Sekino H.Synthesis of nonatrlacontapeptlde corresponding to the entire amino acid sequence of calf thymosin and effect on the impaired T-oell subsets in patients with lupus nephritis // Chem. Pharm.Bull.-l983.-v.31.-p. 1320-1329.

98. Ablko Т., Sekino H.Synthesis ofm the octadecapeptlde corresponding to positions 32 to 49 of the revised amtno acid sequence of thymopoietin II and its effect failure //Chem. Pharni. Bull. -1982. -v. 30. -p. 3271-3277.

99. Ablko Т., Kumlkawa M., Sektno H. Synthesis and effects of two peptide fragments of thyiropoletin II on E-rosette forming cells in113the uremlo state //Chem.Pharm. Bull. -1979.-v.27.-N 9.-p.2233-2237.

100. Ablko T., Onodera I., Sekino H. Effect of thymopoietin II fragments and their E-rosette forming cells in the uremic state //Chem. Pharm. Bull.-1980.-v.S8.-N 8.-p.2507-2511.

101. Ablko T., Onodera H., Sekino H.Synthesis and Inniumo log leal effects of thymosin c( j and its fragments on Inhibitory factor in minimal changes nephrotio syndrom//Chem. Pharm. Bull. -1980. -v. 28.-p. 3542.

102. Ablko T., Onodera I., Sekino II.//Chem. Pharm. Bull.-1981.-v. 29.-p. 2322.

103. Ahmed A., Wong D.M., Thurman Q. B. et al. Lymphocyte maturation: cell surface markers and immune function induced by T-lymphocyte cell-free products and thymosin polypeptides// N. Y. Aoad. Sol.-1979.-v.333.-p.81-94.

104. Audhua t. , Sohlesinger h. , Goldstein G. Complete amino acid sequences of bovine thymopoietin I II and III closely homologous polypeptides//Bloohemlstry.-1981 .-v.20.-N 21 .-p.6195-6200. '

105. Auger G. , Monier J.C., Dardenne M. et al. Identification of FTS (facteur thymique serique) on thymus ultrathin sections using monoclonal antlbodles//Immunol. Lett.-1982.-v.5.-p.213-216.

106. Bach J. F. The multi-faceted zinc dependency of the immune systern//Immunol. Today. -1981. -v. 2. -p. 225.114

107. Bach J.F., Bach M. A. , Blanot D. et al. Thymic serum factor (FTS)//Bull. Inst. Pasteur.-1978.-v. 76.-p. 325-398.

108. Bach J.F., Dardenne M. , Bach M. A. et al. Isolation, biochemical characterisation and biological activity of a circulating thymic hormone in the mouse and in the human//Ann. N.Y. Acad. Sci.-1975.-v.249.-p. 186210.

109. Bach J.F.,Dardenne M., Pleau J. M. et al. Biochemical characterisation of a serum thymic factor//Nature.-l 977,-v.266.-p.55-56.

110. Bardos R. , Bach J. F. Modulation of mouse natural killer cell activity by the serum thymic factor (FTS)//Soand. J. Immunol. -1982. -v. 16.-p. 321-325.

111. Bardos R.,Carnaud C. .Bach Y. F. Augmentation de lactive n des cellules tueuses (cellules NK) par le facteur thymigue serigue//C. R. hebd. Scand.Acad. Sci. Paris.-1979.-v.289.-p. 1251-1254.

112. Bezodowski H.O., Sorkin E., Thymio involment in female sexual maturatlon/VNatyre. -1974. -v. -249. -p. 356-358. ' ■

113. Birr C. , Stollenwerk U. Synthesis of thymosin a polypeptide of thymus//Angew. Chem. Engl.-1979.-v. 18.-p. 394.

114. Blassek I., Lenfant M. The stimulatory effect of serum thymio factor (FTS) on spontaneous NDA synthesis of mouse thymooytes//Cell. Tissue Kinet.-1983.-v. 16.-p. 247-257.

115. Bliznakov E.G. , Wan Y. , Chang D. , Folkers K. Partial reactivation of impaired immune competence in aged mice by synthetic thymus factors//Blochem. Blophys. Res. Commun.-1978. -v. 80. -p.631115

116. Bottcl S. R., Schneggenburger R.G. Thermogravimetric study of some divalent transition metal chelates of several of several amino aolds//J. Therm. Anal.-1970.-v. 2.-p. 11.

117. Bricas E., Martinez J. ,Blanot D. et al. The serum thymic factor an its synthesls//Peptides. Proc. of the 5th Amer. Pept, Symp./Coodman M. and Meienhofer J. eds.- New York:J. W1 ley and Sons,1977.-p.564-567.

118. Chen J., Low T.L. K. , Goldstein A. L. Isolation and characterisation of a thymosin c( -like polypeptides from human blood//Fed. Proo.-1983.-v. 42.-p. 447.

119. Comsa J. Action of the purified thymus hormon in thymeotomized guinea pigs//Amer. J. Med. Scl.-1965.-v.250.-N l.-p.79-85.

120. Grecu J. , Sandulescu R. , Neamtu M. Comhpeosi mi 1st ai Mn(II), Cu(II) al Sn (II) in amlnoacisi//Rev. Chem. (RSR). -1986. -v.37. -N7.-p.589-595.

121. Dardenne M., Pleau J. -M. , Man N. K., Bach J.F. Structuralstudy of circulating thymic factor: a peptide isolated from pig serum. I. Isolation and purlfloatlon//J. Biol. Chem. -1977. -v. 252-p.8040-8044. '

122. Dardenne M. . Pleau J.-M., Nabarra B. et al.Contribution of zinc and other metalls to the biological activity of the serum thymic factor (FTS)// Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1982.-v.79.-p.5370-5375.

123. Erikson-Vltanen S., Ruggieri S., Natalini f. Horecker B.L. Thymosin a new analog of thymosin in mammalian tissues// Arch. Blochem. Blophys. -1983. -v. 125-p. 407.

124. Felix A. M. , Heimer E. P. , Wang C. T. et al. Synthesis of thymosin by fragment condensation using tert-butui side chain protection/Tint. J. Peptide Protein Res.-1985.-v.24.-p. 130-148.

125. Felix A. M. , Yen E.T.H., Reiser H. etal. Expression of T-oell-activating protein In peripheral lymphooyte subsets// Proc.Nat. Aoad. Sei. USA.-1983.-v. 80.-p. 7424.

126. Folkers K., Yen E.T.H., Reiser H. et al. Current advances on biological active synthetic peptides/Folkers K., Leban J., Sakura et al.//Polypeptide hormones/Beers R.F. and Bassette, eds. -New York: Raven Press, 1962.-p. 149.

127. Friere M. , Crivellaro 0. Isaaks C. et al. Translation of mRNA fromcalf thymus In the wheat germ system: evidence for a precursor of thymosln//Proc. Nat. Acad. Sol. USA. -1978. -v. 75. -P.6007-6011.

128. Fujlno M., Shinagawa S. , Fukuda T. et al. Synthesis of the nonatetracontapeptlde corresponding to the seguence propo sed for thymopioenin II//Ohem. Pharm. Bull. -1977. -v. 25. -p. 1486.

129. Castlnel L. N. , Pleau J. M. , Dardenne M. , Bach J.F.Characterisation of zink binding sites on the nonapeptlde thymulln/ZBioohim. Blophys. Aota. -1984. -v. 97. -p. 147-155.

130. Goldstein G. Isolation of bovine thymin: a polypeptide hormone of the thymus//Nature. -1974. -v. 247. -p. 11-14.

131. Goldstein G. The Isolation of thymopoietin (thymln)//Ann. N. Y. Acad.Scl.-1975.-v. 249.-p.l77-185.117

132. Goldstein A.L., Low T. L. K., KfcAdoo et al. Thymosin. Isolation and seguence analysis of an immunological active thy-mio polypeptlde/VProc. Nat. Acad. Sol. USA. -1977. -v. 74. -p. 725-729.

133. Goldstein G. , Scheid M. P. , Boyse E. A. et al. A synthetic pentapeptlde with biological activity characteristic of the thymic hormone thymopoletln//Sclence.-1979.-v. 204.-p.l309-1310.

134. Gyotoky J., Imalzumi A. , Terada S., Kimoto E. Biological activity of synthetic analog of serum thymic factor// Int.J.Peptide Protein Res.-1983.-v. 21.-p. 135-144.

135. Hannapel E., Daveust S., Horeoker B. L Thymosins and two new peptides isolated from calf homologous tothynosin //Proc.

136. Nat. Acad. Sol. USA.-1982.-v. 79.-p. 1708.

137. Hannapel E. , Xu G.L., Morgan J. et al.Thymosin ubiguons protein im murine and rat tissues //Proc. Nat. Acad. Soi. USA.-1982.-v. 79.-p. 2172-2175.

138. Haritos A. A. , Goodal G.J., Horecker B.L. Study of faoteur fchymique serlque//Proc. Nat. Asad. Sei. USA. -1984. -v.81.-p.121.151 .Hofmman K. Chemistry and function of polypeptide hormones//Ann. Rev. Biochem. 1962,-v. 31.-p. 213-246.118

139. Hooper J.A., McDanlel M. C., Thurman G. B. et al. The purification and properties of bovine thymosin //Ann. N. Y. Acad. Soi.-1975.-v.249.-p.125.

140. Horecker B. L. ln:Thymic hormones and lymphokines/A.L. Goldstein ed. -1984.-p.77.

141. Inflammatory diseases and copper. The metabolic and therapeutic roles of copper and other essential metalloelements in humans/Ed. Sorvenson J. RJ.-Clifton (New Jersey): Human Press.-1982.-622 p.

142. Jantoon B. , Montage P. , Bene M. C. et al. Immunologic localisation of "facteur thymique serique" (FTS) in human thy-mic epithelium//J. Immunol.-1981.-v. 127.-p.2055-2059.

143. Jewur S.S., Kuriacose J.C. Studies on the thermal decomposition of ferric acetate//Thermochim. Acta. -1977. -v. 19V -N 2.-p. 195200.

144. Krueok Doctoral theses.-University of Heidelberg. FRG. 1984.

145. Lacovara I., Utermohlen V. Isolation and assay of a human plasma factor affecting human thymusTderived lymphocytes// Clin. Immunopathol. -1993.-v. 27.-p. 428-432.119

146. Low T. L.K. , Goldstein A.L. Chemical characterisation of thymosin //J. Biol. Chem. -1982. -v. 257. -p. 1000.

147. Low T.L.K., Goldstein A. L. The chemistry and biology of thynosin. II Amino acid sequence analysis of thymosin and polypeptide //J. Biol. Chom.-1979.-v. 254.-p.987.

148. Low T.L.K., McClure J. E. , Naylor K. et al. Isolation of thymosin from thymosin fraction of different species by high performance iquld chromatography//!. Chromatogr. -1983. -v. 266. p. 533.

149. Low T.L.K., Thurman G. B., Chincarini C. et al. Current status of thymosin research: evidence for the existence of a family of thymic factors that control T-cell maturation// Ann.N.Y. Aoad. Sci.-1979. -v. 332.-p.34-48.

150. Low T.L.K., Thurman G. B. , NfcAdoo et al. The chemistry and biology of thymosin. I. Isolation, characterisation and biological actlvltes of thymosin and polypeptide from calf thymus//J. Biol. Chem. -1979. -v. 254.-p.981-986. ,

151. Low T.L.K., Wang S. S. , Goldstein A. L. Solid-phase synthesis of thumosin Chemical and biological characterisation of the synthetic peptlde/ZBiochemlstry. -1983. -v. 22. -p. 733.

152. McClure J. E. , Lamerls N. , Wars D. W. St al. Immunoohemloal studies of thymosin: radioimmunoassay of thymosin//.!. Immunol, 1982. -v. 128.-p.368.

153. Haver T.C., Green G. L. Derivative Speotroscopy//Int Lab. -1975. -v. 11/12.-N 14. -p. 17-20.170. 0 Haver T.C., Green G. L. Numerical error analysis of mixtures//Anal. Chem. -1976. -v. 48. -N 2. -p.312-318.

154. Piantanelli L. , Fabris N. Decreased rate of DNA synthesis in subman mandibular grand of thymus cell mude mice after isoproterenal stimulation// Abstr. 10th FEBS meeting. 1975. Abs. N 1595.-Soo. de Chemie Blologlque. Paris.-p. 14-16.

155. Plerpaoli W. , Bezedowski H. 0. Role of the thymus n programmation of. neuroendocrinal funotions//Clin. Exp. Immunol. -1975.-v. 20. -p. 323-328.

156. Rajnavolgui E. , Kulich J. , Szllaguvarl M. et al. The influence of new thymopoietin derivatives on the immune responce of Inbred mice//Int. J. Immunopharmao.-1986.-v. 8.-p. 167-177.

157. Rowinski W. , Lukaswicz H. , Ortowski T. ,Sluzewska V. Rosette inhibitory activity of uraemic sera andthe influence of dialysis// Proc. Eur. Dialysis and Transplant.Assoc.-1972.-v.9.-p.507.

158. Ruggieri S., Erikson-Vlltanen S., Horecker B.L.

159. Thymosin -Arg a major variant of thymosin pin rabbit tissues //Aroh . Biochem. Biophys.-1983.-v. 226.-p.388.

160. Savino W. , Dardenne M., Paplernic M. , Bach J. F. Thymic hormone oontalning oells: Characterisation and localisation of serum thumic factor in young mouse thymus studied by monoolonal antibodies//J. Exp. Med.-1982.-v.156. p. 628-634.

161. Schlesinger D.H.,Goldstein G. The amino acid sequence of thymopoietin II//Gell .-1975 . v. 5.-p. 361-365.121

162. Strachan R. G. ,Paleveda W. J., B. J. Berdstran S.J.et al. Synthesis of a proposed thymic factor//J. Med. Chem. -1979. -v. 22.-p.586-588.

163. Svidersky L.P., Hui A., May L. et al. Induction of augmentation of mitogen-Induced immune inter feron production n human peripheral lymphocytes by N-desacetylthymosln//Eur. J. Immunol. -1982. -v.12.-p. 244-247.

164. WangS.S., BloomfieldN. J. Asn2.-Thymosin analogs thereof.

165. Vang S. S. , Kulesha I.D., Winter D.P. Synthesis of thymosin //J. Amer. Chem. Soc.-1978.-v. 101.-p.253

166. Wang S.S., Makofske A., Merrlfleld R. B. Automated solid-phase synthesis of thymosin//Int. J. Peptide Protein Res.-1980.-v.15.-p. 1.

167. Vang S.S. , WangB . S. H. , Chang J. et al. Synthesis of thymos 1 n//l nt.J. Peptide Proten Res.-1981.-v. 18.-p. 413.

168. Wetzel R., Heyneker H. L. , Goeddel 0. V. et al. Production of biological active N- -desaoetyl-thymosin ,in Eoheriohia coil through expression of chemically synthesised gene// Biochemistry .-1980 .-v 19.-p.6096-6104.

169. Won T.W. Merrlfleld R. B. Solid-phase synthesis of thymosinusing tert-butyloxycarbonylamlnoacyl-l-4(oxyme-thyl)- phenulaccetamido-metil -resin //Biotchemistry. 1980/-v/19-p/3233

170. Yakubov Kh. M., Vinnichenko G. M. .Offengenden E. Ya. , Astanlna A. N. Iron coordination compounds with glycine, glycylglycine and diglycylglycine//Inorg. Chim. Aota.-1983.-v.79.-N 7. -p. 273-274.

Информация о работе

Гиесов, Асомуддин Шамсуддинович
кандидата биологических наук
Душанбе, 1999
ВАК 03.00.04

Диссертация

Синтез и некоторые фармакологические свойства низкомолекулярных цинксодержащих иммуноактивных пептидов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы