Структура и свойства малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа (hsp25)

Панасенко, Олеся Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура и свойства малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа (hsp25)
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структура и свойства малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа (hsp25)"

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова Биологический факультет

На правах рукописи

Панасенко Олеся Олеговна

Структура и свойства малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа (hsp25)

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004 г.

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Гусев Н.Б.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Курганов Б.И.

доктор биологических наук, профессор Левицкий Д.И.

Ведущая организация:

КИИ экспериментальной кардиологии

Кардиологического научного центра РАМН.

Защита диссертации состоится 19 апреля 2004 г. в 15 часов 30 мин на заседании диссертационного совета Д.501.001.71. Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, аудитория ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 10 марта 2004 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Медведева М.В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В 1974 году Тиссиерес с соавт. [Tissieres et al., 1974] обнаружили, что в ответ на повышение температуры среды у личинок дрозофилы происходит активация синтеза специфической группы белков, которая получила название белков теплового шока (heat shock proteins, hsp). Позже было установлено, что экспрессия hsp в организмах происходит не только при стрессе, но и в нормальных условиях. В клетках эукариот синтезируется несколько классов hsp, которые различаются по молекулярной массе, структуре и функциям. Эти белки способствуют правильному котрансляционному сворачиванию полипептидных цепей, участвуют в транспорте белковых молекул к местам их назначения, а также в процессах репарации частично денатурированных или элиминации полностью денатурированных белков.

Обширное и гетерогенное семейство малых белков теплового шока (small heat shock proteins, shsp) включает белки с молекулярными массами от 12 до 43 кДа, содержащие в своем составе а-кристаллиновый домен, который состоит из 80-100 аминокислот. Белки этого семейства, препятствуют агрегации денатурированных белков, защищают клетку от теплового и окислительного стрессов, могут участвовать в регуляции апоптоза и, по всей видимости, играют важную роль в функционировании цитоскелета.

Малый белок теплового шока с молекулярной массой 25-27 кДа (hsp25/27) синтезируется практически во всех органах и тканях, при этом в мышцах на его долю приходится до 1-2% растворимых белков клетки [Katoetal., 1992]. В

Список сокращений: АДГ - алкогольдегидрогеназа; ДС-Na - додецилсульфат натрия; ПААГ - полиакриламидный гель; ТХУ - трихлоруксусная кислота; ANS - 1-анилино-8-нафталин-1-сульфонат; bis-ANS - 4,4'-дианилин-1,Г-динафталин-5,5'-дисульфокислота; hsp - heat shock proteins (белки теплового шока); shsp - small hsp (малые белки теплового шока); hsp25 - малый белок теплового шока птиц с молекулярной массой 25 кДа; 1D мутант - hsp25 с заменой Ser15 на остаток Asp; 2D мутант - hsp25 с заменой Ser7g и Ser8l на остатки Asp; 3D мутант - hsp25 с заменой Seri5, Ser7s и Ser^ на остатки Asp.

РОС НАЦИОНАЛЬНА* БИБЛИОТЕКА

09 wffipЦ0

ответ на различные внеклеточные воздействия hsp25/27 может фосфорилироваться. Считается, что фосфорилирование приводит к диссоциации крупных олигомеров этого белка и сопровождается уменьшением его шаперонной активности [Rogalla et al., 1999]. Постулируется, что hsp25/27 взаимодействует с актином, влияет на полимеризацию актина и участвует в реорганизации цитоскелета при различных неблагоприятных воздействиях [Miron et al., 1988, Miron et al., 1991, Benndorf et al., 1994]. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в исследовании hsp25/27, физико-химические свойства этого белка, механизмы регуляции его шаперонной активности и детали взаимодействия с актином остаются крайне мало изученными. Это, в особенной степени, характерно для hsp25 из тканей птиц, который описан только в двух публикациях [Miron et al., 1988, Miron et al., 1991].

Целью данной работы был анализ структуры и свойств hsp25 птиц и изучение его взаимодействия с актином. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать содержание hsp25 в тканях птиц.

2. Исследовать влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование, и рН среды на олигомерную структуру, гидрофобные свойства и шаперонную активность hsp25.

3. Исследовать взаимодействие hsp25 и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, с нативным и денатурированным актином.

Научная новизна и практическая ценность работы. Определено содержание hsp25 в различных тканях птиц и установлено, что мышцы содержат наибольшее количество hsp25. Установлено, что мутации, имитирующие фосфорилирование, дестабилизируют четвертичную структуру hsp25. Изменение рН в интервале 5,5-7,5 влияет на олигомерную структуру hsp25 дикого типа и его 3D мутанта, имитирующего фосфорилирование hsp25 по остаткам Serl5, 78, 81. Обнаружено, что hsp25 дикого типа и его 3D мутант

способны образовывать гетероолигомерные комплексы, которые более стабильны, чем гомоолигомеры этих белков.

Используя флуоресцентный зонд bis-ANS, установили, что мутации, имитирующие фосфорилирование, влияют на гидрофобные свойства hsp25 и на структурные перестройки hsp25, вызываемые изменением рН. Это может сказываться на-взаимодействии hsp25 с белками-субстратами. Для проверки этого предположения-проведено сопоставление шаперонных свойств hsp25 дикого типа и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, с различными субстратами. Установлено, что, в зависимости от условий инкубации и природы используемого субстрата, мутации, имитирующие фосфорилирование, могут, как повышать, так и понижать шаперонную активность hsp25. Высказано предположение, что шаперонная активность зависит от олигомерного состояния и доступности гидрофобных участков hsp25, а также определяется свойствами комплексов, образуемых hsp25 с белками-субстратами.

актина и эффективно препятствует агрегации денатурированного актина. Высказано предположение, что актин может быть одним из белков-субстратов hsp25 in vivo и, что взаимодействие hsp25 с актином может играть определенную роль в защите клеток от неблагоприятных воздействий.

Полученные данные расширяют и углубляют знания в области структуры и свойств shsp, а также механизма регуляции их шаперонной активности и могут

быть использованы при чтении курса лекций по общей биохимии и биохимии мышц.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на III съезде Биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002), на 31-ой конференции Европейского общества по исследованию - мышц (Люнтерен, Нидерланды, 2002), на X международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2003" (Москва, 2003), а также на международной конференции "Биология' молекулярных шаперонов. Механизмы и регуляция шаперонов" (Томар, Португалия, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация- изложена на 165 страницах и состоит из введения, обзора литературы, методической части, описания результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 3 таблицы и 37 рисунков. Список литературы включает 322 литературных источника,

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы получения белков. Плазмида pGC25-7, содержащая-ген hsp25 кур, была любезно предоставлена проф. А. Накаи (Kyoto University, Japan). Полноразмерная копия кДНК hsp25 была клонирована в вектор рЕТПс (Novagen). Для моделирования фосфорилирования, остатки Ser в положениях 15, 77 и 81 hsp25 были заменены на остатки Asp и были получены мутанты с заменой одного (S15D; ID), двух (S77,81D; 2D) и трех (S 15,77,8ID; 3D) остатков Ser. Автор глубоко благодарен сотруднику института Молекулярной биологии РАН к.б.н. А.С. Сейт-Неби, за проведение всех операций по клонированию и направленному мутагенезу рекомбинантных форм hsp25. Экспрессию hsp25 проводили в штамме E.coli BL21(DE3) (Novagen). Для очистки рекомбинантных белков использовали фракционирование сульфатом аммония, ионообменную хроматографию на Q-Sepharose и гельфильтрацию на

Sephacryl S-300 [Букач и соавт., 2002]. Такая схема выделения позволяла получить 10-15 мг рекомбинантного белка из 1 л культуры. Актин выделяли из скелетных мышц кролика по ранее описанному методу [Pardee, Spudich 1982]. Полученные белки были гомогенными по данным электрофореза в ПААГ в присутствии ДС-Na [Laemmli, 1970].

Определение содержания и различных форм hsp25 в тканях птиц. 2 г ткани измельчали, заливали 10-кратным объемом 5% раствора ТХУ на ацетоне, охлажденного до -70°С, гомогенизировали, промывали несколько раз ацетоном и лиофилизировали. Экстракцию белков из ткани проводили по ранее описанному методу [Larsen et al., 1997]. Экстракты тканей подвергали электрофорезу в ПААГ или изоэлектрофокусированию в денатурирующих условиях, переносили на нитроцеллюлозу и проводили иммунную детекцию hsp25 с помощью моноклональных. антител. Автор глубоко благодарен ведущему научному сотруднику кафедры, биохимии, д.б.н. А.Г. Катрухе за получение моноклональных антител на hsp25.

Определение олигомерной структуры hsp25.. Для исследования четвертичной структуры hsp25 и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, использовали методы гельфильтрации и нативного электрофореза в градиентном ПААГ. На колонку Superdex-200 10/30, уравновешенную буфером с рН 5,5, 6,0, 6,5 7,0 и 7,5, наносили одинаковое количество белка, предварительно проинкубированного в течение 45 мин при 25°С в буфере для уравновешивания. Электрофорез проводили в отсутствие или в присутствии 0,02% Coomassie G-250 [Schagger et al., 1994]. Кажущуюся молекулярную массу hsp25 и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных белков с известными молекулярными массами.

Образование гетероолигомерных комплексов. hsp25 исследовали с помощью метода ионообменной хроматографии. На колонку Mono Q HR5/5, наносили одинаковое количество дикого типа, его 3D мутанта или

эквимолярную смесь этих белков сразу после приготовления или предварительно проинкубированную при 28°С в течение 3 часов.

Исследование гидрофобных свойств hsp25 проводили с использованием флуоресцентного зонда bis-ANS [Hochgrebe et 2000]. Hsp25 дикого типа или его 3D мутант титровали при разных значениях рН bis-ANS и следили за увеличением флуоресценции, обусловленной- связыванием зонда с гидрофобными участками белка. Кривую титрования обсчитывали по ранее предложенному методу [Medvedeva et а1., 1995] и определяли количество центров связывания флуоресцентного зонда и кажущуюся константу диссоциации комплекса белок-bis-ANS (К^).

Определение шаперонной активности hsp25. О шаперонной активности hsp25 судили по его способности предотвращать агрегацию сс-лактальбумина (вызванную восстановлением его дисульфидных связей [Ка^агашап et аЬ, 1998]) или агрегацию АДГ из дрожжей (вызванную повышением температуры ^агша et а1., 2000]). За агрегацией денатурированных белков-субстратов следили по изменению светорассеяния при 360 нм или по осаждению денатурированных белков при низкоскоростном центрифугировании.

Определение нативности актина проводили с использованием параметра А, равного отношению собственной флуоресценции актина при 320 и 365 нм (А = 1з2о/Ъб5) [Туроверов и соавт., 1975]. Флуоресценция возбуждалась светом с длиной волны 297 нм.

Ограниченный протеолиз актина проводили под действием трипсина (весовое соотношение актин : трипсин = 50 : 1) в течение различного времени. Реакцию останавливали добавлением избытка фенилметилсульфонилфторида и подвергали пробы электрофорезу в присутствии ДС-№. За протеолизом актина следили по убыли полосы интактного белка.

Исследование влияния hsp25 на полимеризацию и агрегацию актина проводили с использованием метода ультрацентрифугирования. Интактный или предварительно прогретый при 60°С О-актин инкубировали с hsp25. Полимеризацию нативного или агрегацию денатурированного актина

инициировали добавлением КС1 и MgCb. После ультрацентрифугирования определяли содержание актина в осадке и супернатанте с помощью электрофореза в присутствии ДС-Na.

Концентрацию белка определяли спектрофотометрически или по методу Шафнера и Вайсмана [Schaffner, Weissmann, 1973].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение содержания hsp25 в различных тканях птиц. Прежде чем приступить к изучению структуры и свойств hsp25 представлялось целесообразным определить содержание этого белка в тканях птиц. Используя иммунологические методы, мы установили, что наибольшее содержание hsp25 характерно для мышц, в которых было обнаружено от 500 до 700 мкг hsp25 на г сырой ткани. Другие ткани птиц (легкие, печень, трахея) содержали заметно меньшее количество hsp25 (от 10 до 170 мкг hsp25 на г сырой ткани). Полученные результаты хорошо согласуются с данными литературы [Miron et al., 1988]. Используя метод изоэлекторофокусирования, мы установили, что в тканях птиц hsp25 представлен тремя формами, которые имеют одинаковую молекулярную массу, но отличаются по своим изоэлектрическим точкам. По-видимому, эти белки соответствуют нефосфоршшрованной, моно- и дифосфорилированной формам hsp25. В мышечных тканях hsp25 преимущественно представлен в виде нефосфорилированной формы, в то время как, в немышечных тканях превалируют моно- и дифосфорилированный hsp25.

Влияние точечных мутаций на олигомерную структуру hsp25. Данные литературы [Rogalla et al., 1999, Ito et al., 2001] свидетельствуют о том, что фосфорилирование приводит к диссоциации крупных олигомеров shsp. Влияние фосфорилирования на олигомерную структуру hsp25 птиц не исследовалось, но можно было предполагать, что точечные мутации, имитирующие фосфорилирование под действием МАРКАР 2/3 киназы, будут дестабилизировать его четвертичную структуру. Для проверки этого

4 6 8 10 12 14 16 18

Объем элюции, мл

предположения мы использовали методы гельфильтрации на колонке Superdex-200 10/30 и градиентного нативного электрофореза. При гельфильтрации hsp25 дикого типа элюируется с колонки в виде симметричного пика с кажущейся молекулярной массой 630-650 кДа (рис. 1). Замена Serl5 на остаток Asp не сопровождается значительным изменением молекулярной массы hsp25. Введение двух точечных мутаций (S77,81D) дестабилизирует четвертичную структуру hsp25 птиц и вызывает частичную диссоциацию его олигомеров. Наконец, замена трех остатков Ser (15, 78, 81) на остатки Asp приводит к диссоциации крупных олигомеров hsp25 и формированию мелких олигомеров с кажущейся молекулярной массой около 90 кДа (рис. 1). Любопытно отметить, что олигомеры hsp25 дикого типа очень стабильны и не диссоциируют при разведении. В то же время, мелкие олигомеры 3D мутанта находятся в концентрационно-зависимом равновесии с крупными олигомерами. При этом повышение концентрации 3D мутанта сдвигает равновесие в сторону образования более крупных комплексов.

Для более детального исследования четвертичной структуры hsp25 и его мутантов мы использовали метод нативного градиентного электрофореза в присутствии Coomassie G-250 [Schagger et al., 1994]. При использовании этого метода электрофоретическая подвижность белковых комплексов определяется их молекулярной массой и зависит от их способности связывать

Рис. 2. Градиентный (4,5-20%) нативный электрофорез Ь«р25 и его мутантов, проведенный в присутствии 0,02% Соопш81е С-250. На гель наносили Ьвр25 дикого типа (дорожки 1 и 5), Ш, Ю и ЗБ мутанты 1кр25 (дорожки 2-4). Слева отмечены молекулярные массы белков-стандартов, справа — молекулярные массы,

определенные для олигомеров Ьвр25.

660-480

66 -

43 -20 -

- 26

1 2 3 4 5

гидрофобный краситель. Оказалось, что в условиях электрофореза hsp25 дикого типа образует стабильные высокомолекулярные комплексы, в то время как, его мутанты, имитирующие фосфорилирование, преимущественно существуют в виде смеси олигомеров с кажущимися молекулярными массами 152,100, 66,53 и 26 кДа (рис. 2). При этом наименьшей стабильностью обладает 3D мутант hsp25. Полученные данные хорошо согласуются с результатами, полученными методом гельфильтрации (рис. 1), и свидетельствуют о том, что мутации, имитирующие фосфорилирование, дестабилизируют четвертичную структуру hsp25.

Влияние рН на олигомерное состояние hsp25. Представленные данные свидетельствуют о том, что мутации, имитирующие фосфорилирование, дестабилизируют четвертичную структуру hsp25. Мы исследовали, какие еще факторы могут влиять на олигомерную структуру этого белка. Известно, что при некоторых патологических состояниях рН в клетке может уменьшаться на 1 и даже 1,5 единицы [Park et al., 1999, Ding et al., 2000], при этом показано участие shsp в защите клеток от ацидоза [Eaton et al., 2000]. В связи с этим, представлялось целесообразным исследовать влияние рН на четвертичную

Рис. 3. Гельфильтрация hsp25 дикого типа (А) и 3D мутанта (Б) на колонке Superdex-200 при рН 5,5 (1), 6,0 (2), 6,5 (3), 7,0 (4),

7,5 (5). На колонку наносили одинаковое количество (100 мкл) белка с концентрацией 1,2 мг/мл. массой

структуру hsp25. Используя метод гельфильтрации, мы обнаружили, что уменьшение рН от 7,5 до 5,5-6,0 сопровождается- диссоциацией крупных олигомеров. hsp25 дикого типа и образованием смеси мелких олигомеров с кажущимися молекулярными массами в интервале от 90 до 300 кДа (рис. ЗА). Влияние рН на олигомерное состояние 3D мутанта hsp25 было более сложным. При кислых значениях рН (рН 5,5-6,0) 3D мутант представлен смесью

низкомолекулярных олигомеров и очень крупных, по всей

видимости, агрегированных комплексов с молекулярной

более 800 кДа (рис. ЗБ) При рН 6,5-7,0 3Б мутант преимущественно существует в виде мелких олигомеров с кажущейся молекулярной массой около 90-120 кДа. Наконец, при рН 7,5 3D мутант образует крупные олигомеры с кажущейся молекулярной массой около 350-400 кДа (рис. ЗБ). Таким образом, сравнительно небольшие изменения рН могут оказывать существенное влияние на олигомерное состояние hsp25 дикого типа и его мутанта, имитирующего фосфорилирование.

Образование смешанных комплексов hsp25. Данные литературы свидетельствуют о том, что shsp могут обмениваться субъединицами и

формировать

гетероолигомеры [Bova et al., 2000, Sobott et aL, 2002]. Для того, чтобы исследовать возможность обмена

субъединицами в олигомерах hsp25 птиц мы использовали метод ионообменной

хроматографии. Замена трех остатков Ser (Serl5,78,81) на остатки Asp в структуре hsp25 приводит к уменьшению pi белка и увеличению его прочности сорбции на колонке Mono Q по сравнению с белком дикого типа (рис. 4). Если эквимолярные количества hsp25 дикого типа и 3D мутанта наносили на колонку сразу после смешивания, то, вместо острых пиков изолированных белков, на профиле элюции был виден один очень широкий пик, который обладал промежуточной прочностью сорбции на анионообменнике по сравнению с изолированными hsp25 дикого типа и его 3D мутантом (рис. 4). Если перед нанесением на колонку, смесь hsp25 дикого типа и 3D мутанта предварительно инкубировали при 28°С в течение 3 ч, то на профиле элюции обнаруживался острый пик, который элюировался между пиками изолированных белков. Полученные данные означают, что между олигомерами hsp25 дикого типа и его 3D мутанта возможен обмен субъединицами и, при этом, образуются гетероолигомерные комплексы, которые более стабильны, чем гомоолигомеры изолированных белков.

Исследование гидрофобных свойств hsp25 с помощью флуоресцентного зонда bis-ANS. Как было установлено ранее, рН оказывает

Рис. 4. Ионообменная хроматография на колонке Mono Q HR5/5 изолированного hsp25 дикого типа (1), его 3D мутанта (2) и их эквимолярной смеси сразу после смешивания (3) или после предварительной инкубации в течение 3 часов при 28°С (4). Эшоцшо проводили линейным градиентом NaCl 0 -350 мМ (электропроводность отмечена на кривой 5).

существенное влияние на олигомерное состояние Изр25 (рис. 3). Можно было ожидать, что изменение рН скажется и на гидрофобных свойствах Изр25. Для проверки этого предположения был использован зонд Ьи-АКБ, флуоресценция которого в водных растворах крайне мала и резко возрастает при связывании с гидрофобными участками белка [Hochgrebe й а1., 2000]. Белки титровали Ьи-АМБ при разных рН и с помощью ранее описанного метода [Меёуеёета й а1., 1995], определяли количество участков связывания Ьи-АКБ на белке (К) и кажущуюся константу диссоциации комплекса зонд-белок (10). Такие расчеты проводились, исходя из предположений, что связывание зонда происходит некооперативно и все участки ^на белке имеют одинаковое сродство к Ыз-АМБ. Очевидно, что эти предположения являются упрощением, однако, они позволяют качественно охарактеризовать гидрофобные свойства белка. Оказалось, что при низких рН (рН 5,5-6,0) параметры связывания Ьи-АКБ с Изр25 дикого типа и его ЗБ мутантом мало отличаются друг от друга (рис. 5). При нейтральных рН (рН 6,5-7,0) количество центров связывания Ьи-АКБ на белке дикого типа существенно меньше количества центров связывания на ЗБ мутанте (рис. 5А), а Кд комплекса Ыз-А^-ЗБ мутант меньше или сопоставима с комплекса Ы8-АК8-Ьзр25 дикого типа (рис. 5Б).

Сопоставляя полученные результаты с данными гельфильтрации (рис. 3), можно предположить, что при рН 5,5 hsp25 дикого типа существует в виде небольших олигомеров (рис. ЗА), гидрофобные участки которых легко доступны для bis-ANS и прочно связывают гидрофобный зонд. В этих же условиях 3D мутант представлен в виде смеси неупорядоченных агрегатов и не крупных олигомеров (рис. ЗБ), гидрофобные свойства которых мало отличаются от свойств белка дикого типа. При рН 6,5-7,0 hsp25 дикого типа образует высокомолекулярные олигомеры (рис. ЗА), гидрофобные участки которых мало доступны и обладают сравнительно низким сродством к bis-ANS (рис. 5). В аналогичных условиях 3D мутант преимущественно существует в виде тетрамеров (рис. ЗБ), которые содержат больше участков связывания bis-ANS, прочно связывающих флуоресцентный зонд (рис. 5).

Шаперонная активность hsp25. Одной из важнейших функций shsp является их способность предотвращать агрегацию денатурированных белков. Поэтому представлялось важным исследовать шаперонные свойства hsp25 птиц, а также проанализировать влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование, и рН среды на шаперонную активность hsp25. Восстановление дисульфидных связей переводит а-лактальбумин в состояние т.н. расплавленной глобулы, которая в выбранных условиях склонна к агрегации [Rajaraman et в1., 1998]. Именно поэтому инкубация лактальбумина в присутствии избытка восстановителей приводит к агрегации белка, что регистрировалось по увеличению светорассеяния в анализируемой пробе (рис. 6А). Добавление hsp25 предотвращает агрегацию лактальбумина, и при этом белок дикого типа более эффективен, чем его мутанты, имитирующие фосфорилирование (рис. 6А). Инкубация АДГ при повышенных температурах также сопровождается ее денатурацией и агрегацией (рис. 6Б). Hsp25 подавляет термоагрегацию АДГ, однако, в этом случае, hsp25 дикого типа обладает меньшей шаперонной активностью, чем его мутанты, имитирующие фосфорилирование (рис. 6Б). Таким образом, мутации, имитирующие фосфорилирование, оказывают существенное влияние на шаперонную

активность И8р25. В

зависимости от условий, такие мутации могут либо уменьшать шаперонную активность И8р25 (рис. 6А), что согласуется с общепринятой точкой зрения [Яс^аИа ег а1., 1999], либо увеличивать шаперонную

активность И8р25 (рис. 6Б), что было впервые обнаружено в нашей работе.

Для того чтобы более подробно проанализировать различные факторы, от которых зависит шаперонная активность И8р25, мы исследовали влияние И8р25 и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, на

агрегацию денатурированных белков при разных рН. Как уже отмечалось, при нейтральных рН (рН 6,5-7,0) 3Б мутант И8р25 более эффективно предотвращает агрегацию АДГ, чем белок дикого типа (рис. 6Б). Это может быть связано с тем, что при рН 6,5-7,0 3Б мутант в основном существует в виде небольших олигомеров (рис. 3), которые содержат больше гидрофобных участков связывания субстрата, чем И8р25 дикого типа (рис. 5). В то же время, при кислых значениях рН (рН 5,5-6,0) И8р25 дикого типа обладает

О 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60

0 10 20 30 40 . 50 60 0 10 20 30 40 50 60

Время, мин Время, мин

Рис 7. Сравнение шаперонной активности Ьзр25 дикого типа и его 3Б мутанта при рН 6,0 и использовании АДГ в качестве белка-субстрата. Влияние И8р25 дикого типа (А) и его 3Б мутанта (Б) на агрегацию АДГ. Изолированная АДГ (0Д5 мг/мл) (1), АДГ в присутствии 0,125 мг/мл (2), 0,25 мг/мл (3) и 0,50 мг/мл (4) И8р25 дикого типа (А) или его 3Б мутанта (Б). Соосаждение АДГ (0,25 мг/мл) и И8р25 (0,25 мг/мл) (В и Г). В. Преципитация изолированной АДГ (1) и АДГ, в присутствии И8р25 дикого типа (2) и его 3Б мутанта (3). Г. Преципитация И8р25 дикого типа (1) и его 3Б мутанта (2), в присутствии АДГ. Отсутствие агрегации изолированных И8р25 дикого типа и его 3Б мутанта показано на кривых 3 и 4, соответственно.

большей. шаперонной активностью, чем его 3Б' мутант (рис. 7). Следует отметить, что при рН 6,0 как олигомерное состояние (рис. 3), так и гидрофобные свойства (рис. 5) И8р25 дикого типа и его 3Б мутанта мало отличаются друг от друга. Мы предположили, что шаперонная активность И8р25 может зависеть от свойств комплексов, образованных И8р25 с его

белками-субстратами. Для проверки этого предположения мы исследовали белковый состав осадка, образующегося при нагревании АДГ в отсутствие и в присутствии hsp25. Как мы и предполагали, в отсутствие hsp25 денатурация АДГ сопровождалась ее агрегацией и преципитацией (рис. 7В). Добавление hsp25 заметно уменьшало преципитацию денатурированной АДГ, при этом белок дикого типа был более эффективным, чем его 3D мутант. Эти данные полностью согласуются с результатами опытов по светорассеянию (рис. 7А,Б). Анализируя белковый состав осадка, мы обнаружили, что изолированные hsp25 и его 3D мутант не выпадают в осадок даже при длительной инкубации (рис. 7Г). Комплекс, образованный денатурированной АДГ и hsp25 дикого типа, хорошо растворим и, практически полностью остается в супернатанте. В то же время, комплекс, образованный 3D мутантом и АДГ, обладает меньшей растворимостью и значительная часть АДГ и 3D мутанта переходит в осадок (рис. 7В,Г). Опираясь на представленные данные, можно заключить, что шаперонная активность hsp25 зависит от многих параметров, таких как его олигомерное состояние и доступность гидрофобных участков, обеспечивающих взаимодействие с белками-субстратами, а также от свойств (растворимости и гидрофобности) комплексов, образованных hsp25 и субстратами. Как уже отмечалось, shsp играют важную роль в функционировании цитоскелета, и актин может быть одним из потенциальных эндогенных субстратов hsp25. Поэтому, заключительные разделы работы были посвящены исследованию влияния hsp25 на полимеризацию и агрегацию G-актина.

Влияние термической обработки на свойства G-актина. Прежде чем исследовать взаимодействие hsp25 с актином мы анализировали изменения в свойствах G-актина, индуцированные тепловой обработкой. Для анализа структуры и свойств G-актина были использованы 4 разных подхода. Параметр А = 1з2(/!зб5 [Туроверов и соавт., 1975] отражает полярность окружения остатков триптофана и позволяет с высокой точностью определить долю денатурированного актина. Гельфильтрация препаратов G-актина, проинкубированного при различных температурах, позволяет определить долю

мономерного белка и выявить образование

высокомолекулярных агрегатов. Измерение

параметров связывания ANS позволяет определить

доступность гидрофобных участков актина. И, наконец, использование

ограниченного трипсинолиза позволяет следить за компактностью упаковки полипептидной цепи актина. Используя все эти подходы, - мы смогли выявить три состояния актина. Интактный G-актин представляет собой мономерный белок, с А = 2,6-2,7, который слабо связывает ANS, достаточно устойчив к трипсинолизу (рис. 8) и с высокой скоростью полимеризуется. G-актин, прогретый в течение 1 ч при 43 °С, имеет более гидрофильное окружение остатков триптофана (А = 2,1-2,3), лучше, связывает ANS и образует незначительное количество высокомолекулярных агрегатов. Такой актин более устойчив к трипсинолизу по сравнению с нативным белком (рис. 8), что может быть связано с частичным закрытием щели между субдоменами 2 и 4 актина [Strzelecka-Golaszewska et al., 1996]. Прогревание G-актина в течение 1 часа при 60°С приводит к более глубокой денатурации, в ходе которой на белке экспонируются гидрофобные участки, эффективно связывающие ANS. Такой, актин имеет А = 1,3 и преимущественно представлен в виде высокомолекулярных агрегатов, которые в высшей степени чувствительны к трипсинолизу (рис. 8). Актин, прогретый при температуре 60°С и выше, не способен к полимеризации, хотя может агрегировать при повышении ионной силы. Мы исследовали взаимодействие

О- *Чф—ф-—О»—|—ф--ф——э—З-о

О 5 10 15 20 25

Время инкубации, мин

Рис. 8. Трипсинолиз интактного актина (1) или актина, предварительно прогретого при 43 (2) или 60°С (3).

Рис. 9. Влияние hsp25 и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, на полимеризацию интактного и агрегацию денатурированного актина (2 мкМ). А. Полимеризация интактного (1, 2) и агрегация денатурированного (3,4) актина в присутствии hsp25 дикого типа (1, 3) или его 3D мутанта (2, 4). Б. Сравнение шаперонной активности hsp25 дикого типа и его мутантов, имитирующих фосфорилирование (4 мкМ), с денатурированным актином. За 100 % принимали весь актин в пробе.

hsp25 и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, с интактным и термически денатурированным актином.

Взаимодействие Ь8р25 с актином. Используя метод ультрацентрифугирования, мы обнаружили, что даже при очень высоких концентрациях hsp25 и его 3D мутант не влияют на степень полимеризации

интактного актина (рис. 9А, кривые 1 и 2). Более подробное исследование (данные не представлены), а также опыты, проведенные в нашей группе MB. Ким с актином, меченым пиренил - иодацетамидом, показали, что hsp25 дикого типа и особенно его 3D мутант, незначительно уменьшают

начальную скорость, но не влияют на степень

полимеризации актина. В то же время, hsp25 эффективно

подавляет агрегацию денатурированного актина, вызванную повышением ионной силы, при этом мутации, имитирующие фосфорилирование, увеличивают шаперонную активность hsp25 (рис. 9А, кривые 3 и 4). При исследовании влияния различных мутантов на агрегацию денатурированного

актина оказалось, что шаперонная активность увеличивается в ряду hsp25 дикого типа < ID = 2D < 3D мутанты (рис. 9Б). Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что в условиях in vitro hsp25 практически не влияет на полимеризацию интактного актина, однако эффективно подавляет агрегацию денатурированного актина.

Наши результаты не могут в полной мере объяснить, каким образом hsp25/27 защищает актиновый цитоскелет клетки in vivo [Lavoie et aL, 1993, Lavoie et aL, 1995, Bryantsev et al., 2002]. Полученные данные свидетельствуют о том, что hsp25/27 слабо взаимодействует с изолированным нативным актином, а это может означать, что защитное действие hsp25/27 на актиновый цитоскелет обусловлено его взаимодействием с какими-то актин-связывающими или регуляторными белками, связанными с актиновым филаментом. В то же время, hsp25 эффективно подавляет агрегацию денатурированного актина. Это позволяет предположить, что в условиях in vivo hsp25 может взаимодействовать с поврежденным актином, предотвращая его агрегацию или участвуя в его элиминации.

ВЫВОДЫ

1. Мутации, имитирующие фосфорилирование, а также уменьшение рН от 7,5 до 5,5 дестабилизируют четвертичную структуру hsp25 и влияют на его гидрофобные свойства.

2. Олигомеры hsp25 дикого типа и его мутанта, имитирующего фосфорилирование, способны обмениваться субъединицами с образованием гетероолигомеров.

3. Шаперонная активность зависит от олигомерного состояния и гидрофобности hsp25, а также определяется растворимостью комплексов, образованных hsp25 и белком-субстратом. Поэтому в зависимости от природы белка-субстрата, мутации, имитирующие фосфорилирование, могут, как уменьшать, так и увеличивать шаперонную активность hsp25.

4. Hsp25 не влияет на степень полимеризации нативного актина. Hsp25 и особенно его мутанты, имитирующие фосфорилирование, эффективно предотвращают агрегацию денатурированного актина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Panasenko O.O., Gusev N.B. (2000), Simultaneous interaction ofactin with oc-actinin and calponin. IUBMBLife, 49,277-282.

2. Panasenko O.O., Gusev N.B. (2001), Mutual effects of a-actinin, calponin and filamin on actin binding. Biochim. Biophys. Ada, 1544,393-405.

3. Букач О.В., Сейт Неби A.C., Панасенко О.О., Ким М.В., Гусев Н.Б. (2002), Выделение тканевого и рекомбинантного малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа (hsp25) из гладких мышц птиц. Вопросы биол. мед. и форм, химии, 1; 50-57.

4. Панасенко О.О., Ким М.В., Букач О.В., Сейт-Неби А., Гусев Н.Б. (2002), Структура и свойства малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа. Тезисы научных докладов Ш съезда Биохимического общества России, Санкт-Петербург, Россия.

5. Panasenko O.O., Seit-Nebi A., Bukach O.V., Marston S.B., Gusev N.B. (2002), Structure and properties of avian small heat shock protein (sHsp) with apparent molecular weight 25 kDa. Biochim. Biophys. Acta, 1601,64-74.

6. Panasenko O.O., Kim M.V., Bukach O.V., Seit-Nebi A., Marston S.B., Gusev N.B. (2002), Effect of heat shock protein with molecular weight 25 kDa (hsp25) on polymerization and aggregation of actin. Abstracts of the 31st Annual Meeting of the European Society for Muscle Research, J. Muscle Res. Cell Motil, 23,40.

7. Panasenko O.O., Kim, M.V., Marston S.B., Gusev N.B. (2003), Interaction of the small heat shock protein with molecular weight 25 kDa (hsp25) with actin. Eur. J. Biochem, 270,892-901.

8. Черник СИ., Панасенко О.О. (2003), Выделение и изучение свойств малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа. Материалы X международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2003", Москва, Россия.

9. Panasenko O.O., Gusev N.B. (2003), Factors affecting chaperone activity of small heat shock protein with molecular weight 25 kDa (hsp25). Abstracts ofthe EURESCO Conference and FEBS Advanced Course "Biology of Molecular Chaperones. Mechanisms and Regulation ofChaperones\ Tomar, Portugal.

10. Панасенко О.О., Ким М.В., Гусев Н.Б. (2003), Структура и свойства малых белков теплового шока. Успехи биол. химии, 43,59-98.

Данное исследование проводилось при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Wellcome Trust (Великобритания).

СПИСОКЦИТИРОВАННОЙЛИТЕРАТУРЫ

Букач О. и соавт., (2002), Вопросы биол., мед. и фарм. химии, 1,50-7.

Туроверов К. и соавт., (1975), Биохимия, 40,316-22.

Benndorf R. et al., (1994), J. Biol Chem., 269,20780-4.

Bova M. et al., (2000), J. Biol. Chem., 275,1035-42.

Bryantsev A. et al., (2002), Cell Stress Chaperones, 7,146-55.

Ding D. et al., (2000), Exp. Neurol, 162,1-12

Eaton P. et al., (2000), J. Mol. Cell Cardiol, 32,961-71.

Hochgrebe T. et al., (2000), Biochemistry, 39,1411-9.

Ito H. et al., (2001), J. Biol. Chem., 276,5346-52.

Kato K. et al., (1992), J. Biol. Chem., 267,7718-25.

Laemmli U. (1970), Nature, 227,680-85.

Larsen J. et al., (1997), Am. J. Physiol, 273,930-40.

Lavoie J. et al., (1993), J. Biol. Chem., 268,24210-4.

Lavoie J. et al., (1995), Mol. Cell Biol, 15,505-16.

Medvedeva M. et al., (1995), FEBSLett, 360,89-92.

Miron T. et al., (1988), Eur. J. Biochem., 178,543-53.

Miron T. et al., (1991), J. Cell Biol, 114,255-61.

Pardee J., Spudich J. (1982), MethodsEnzymol, 85,164-81.

Park С et al., (1999), Am. J. Physiol, 276,1581-90.

Rajaraman K. et al., (1998), Biochem. Biophys. Res. Commun., 249,917-21.

Rogalla T. et aL, (1999), J. Biol. Chem., 214, 18947-56.

Schaffher W., Weissmann C. (1973), Anal. Biochem., 56,502-14.

Schagger H. et al., (1994), Anal. Biochem., 217,220-30.

Sharma K. et aL, (2000), J. Biol. Chem., 275,3767-71.

Sobott F. et al., (2002), J. Biol. Chem., 277, 38921-9.

Strzelecka-Golaszewska H. et al., (1996), Biochem. J., 316,713-21.

Tissieres A. et al., (1974), J. Mol Biol, 84,389-98.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 04.03.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 248. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

»2-P7 4 2

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Панасенко, Олеся Олеговна

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

1. Малые белки теплового шока.

1.1. Общая характеристика семейства малых белков теплового шока.

1.2. Строение мономеров малых белков теплового шока.

1.3. Механизм сборки олигомеров малых белков теплового шока.

1.4. Строение олигомеров малых белков теплового шока.

1.5. Фосфорилирование малых белков теплового шока.

1.6. Шаперонная активность малых белков теплового шока.

2. Актин.

2. 1. Структурная организация молекулы G-актина.

2. 2. Полимеризация актина с образованием актиповых филаментов.

3. Участие hsp25/27 в формировании цитоскелета.

3.1. В нугр и клеточная локализация и взаимодействие hsp25/27 с цитоскелстом.

3.2. Влияние hsp25/27 па полимеризацию актина.

3.3. Возможное участие hsp25/27 в регуляции мышечного сокращения.

Материалы и методы.

1. Препаративные методы.

1.1. Приготовление компетентных клеток.

1.2. Экспрессия рскомбинантного hsp25 и его точечных мутантов.

1.3. Выделение рскомбинантног о hsp25 и его точечных мутантов из клеток Е. coli.

1.4. Выделение актина из ацетонового порошка скелетных мышц кролика.

• 2. Методы, использованные при исследование структуры и свойств hsp25.

2.1. Определение содержания hsp25 в тканях угки.

2.2. Определение олигомерной структуры hsp25 методом гсльфильтрации.

2.3. Исследование свойств hsp25 методом ионообменной хроматографии.

2.4. Исследование гидрофобных свойств hsp25 с помощью флуоресцентного зонда bis-ANS.

2.4.1. Определение параметров связывания bis-ANS с белком.

2.4.2. Флуоресцентный резонансный перенос энергии от остатков триптофана hsp25 на bis-ANS.

2.5. Определение шаперонной активности hsp25.

2.5.1. Определение шаперонной активности hsp25 с а-лактальбумином.

2.5.2. Определение шаперонной активности hsp25 с АДГ.

3. Методы, использованные при исследовании структуры и свойств актина.

3.1. Определение нативности актина.

3.2. Взаимодействие актина с ANS.

3.3. Ограниченный протеолиз актина.

3.4. Исследование агрегации нативного и денатурированного актина методом гсльфильтрации.

3.5. Исследование агрегации актина методом светорассеяния.

4. Методы, использованные для изучения взаимодействия hsp25 с актином.

4.1. Исследование влияния hsp25 на полимеризацию актина методом центрифугирования.

4.2. Исследование влияния hsp25 на агрегацию актина методом центрифугирования

5. Некоторые аналитические методы, использованные в работе.

5.1. Определение концентрации белка.

5.1.1. Спектрофотомстричсский метод.

5.1.2. Метол Бредфорд.

5.1.3. Метод Шафнера и Вайсмаиа.

5.2. Электрофоретические методы.

5.2.1. Электрофорез в ПААГ в присутствие ДС-Na.

5.2.2. Нативный электрофорез по методу Шаггера и соавт. [251].

5.2.3. Изоэлектрофокусирование.

5.3. Иммуноблоттинг.

Результаты исследования.

1. Структура и некоторые свойства hsp25.

1.1. Определение содержания hsp25 в различных тканях птиц.

1.2. Первичная структура hsp25 из тканей птиц.

1.3. Сравнение некоторых свойств рекомбинаптного hsp25 и hsp25, выделенного из разных тканей птиц.

1.4. Исследование олигомерной структуры hsp25.

1.4.1. Влияние точечных мутаций на олигомерную структуру hsp25.

1.4.2. Исследование олигомерного состояния hsp25 и его мутантов методом нативного электрофореза.

1.4.3. Влияние концентрации hsp25 на его олигомерное состояние.

1.4.4. Влияние рН среды на олигомерное состояние hsp25.

1.5. Влияние точечных мутаций на поверхностный заряд олигомеров hsp25.

1.6. Образование гстероолигомерных комплексов hsp25.

1.7. Исследование гидрофобных свойств hsp25 с помощью флуоресцентного зонда bis-ANS.

1.7.1. Определение параметров связывания bis-ANS с белком.

1.7.2. Флуоресцентный резонансный перенос энергии от остатков триптофана

• hsp25 на bis-ANS.

1.8. Шаперонная активность hsp25.

1.8.1. Влияние hsp25 и а-кристаллина на агрегацию а-лактальбумина.

1.8.1.1. Сравнение шаперопной активности hsp25 дикого типа, его мутантов, имитирующих фосфорилирование, и а-кристаллипа.

1.8.1.2. Исследование влияния рН среды на шаперонную активность hsp25.

1.8.2. Влияние hsp25 и а-кристаллина на агрегацию алкогольдегидрогеназы из дрожжей.

1.8.2.1. Сравнение шаперопной активности hsp25 дикого типа, его мутантов, имитирующих фосфорилирование, и а-кристаллина.

1.8.2.2. Исследование влияния рН среды на шаперонную активность hsp25.

2. Структура и некоторые свойства актина.

2.1. Изменение триптофановой флуоресценции актина при тепловой денатурации.

2.2. Влияние термобработки на агрегацию G-актина.

2.3. Влияние термобработки на гидрофобные свойства актина.

2.4. Ограниченный протеолиз актина.

2.5. Исследование агрегации актина методом светорассеяния.

3. Взаимодействие hsp25 с актином.

3.1. Влияние hsp25 на полимеризацию актина.

3.2. Влияние hsp25 на агрегацию термически денатурированного актина.

Обсуждение.

1. Структура и некоторые свойства hsp25.

2. Структура и некоторые свойства актина. Взаимодействие hsp25 с актином.

Выводы.

Список литератры.

Список сокращений

F-актин фибриллярный актин

G-актин глобулярный актин

К<1 константа диссоциации

ЛЛ акриламид

ЛДГ алкогольдсгидрогеназа

Бис-трис бис-(2-гидроксиэтил)-амино-трис-(гидроксиметил)-метан

БСА бычий сывороточный альбумин

ДАБ 3,3'-диаминобспзидин

ДНК дсзокирибонуклеиновая кислота

ДС-Na додсцилсульфат натрия

МБЛ метиленбисакриламид

ПААГ иолиакриламидный гель

I1KG протеинкиназа G или cGMP-завиемая протсинкиназа

IIKA протеинкиназа А или сАМР-зависимая протеинкиназа

ПКС протсинкиназа С или Са-фосфолипид зависимая протсинкииаза

IICA персульфат аммония

ТЕМЕД Ы,К,Ы',Ы',-тетраметил7гилсндиамин

Трис трис-(гидроксиметил)-метиламин

Трицип Ы-трис-(гидроксиметил)-метилглицин

ТХУ трихлоруксусная кислота

ФМСФ фенилметилсульфонилфторид

ЭГТА этилен гл и кол ьтетраацетат

ЭДТА этилеидиамиптетраацетат

ЭПР электронный парамагнитный резонанс

ADP аденозиндифосфат

ANS 1-анилино-8-нафталин-1-сульфоновая кислота

АТР аденозинтрифосфат bis-ANS 4,4-дианилин-1,1 -динафталин-5,5-дисульфоновая кислота сАМР циклический аденозинмонофосфат

1D мутант hsp25 с заменой Seris на остаток Asp

2D мутант hsp25 с заменой Ser7» и Ser»i на остатки Asp

3D мутант hsp25 с заменой Sens, Ser78 и Scr«i па остатки Asp

ERK extracelluarly responsive kinase (внеклеточная киназа)

FAC focal adhesion kinase (киназа фокальных контактов)

GTP гуанозиптрифосфат

HEPES N-(2-i идроксиэтил) ниперазин-Ы'-(2-этансульфоновая кислота) hsp heat shock proteins (белки теплового шока) hsp25 малый белок теплового шока птиц с молекулярной массой 25 кДа

JNK c-jun N-terminal kinase (c-jun N-концсвая киназа)

МАРК mitogen-activated protein kinase (митоген-активируемая протеинкиназа)

МАРКАР киназа MAP kinase-activated protein kinase (протеинкиназа, активируемая

МАРК)

МЕКК МКК kinase (киназа МКК)

MKBP myosin distrophy kinase binding protein (белки-активаторы иротеипкиназы, характерной для скелетных мышц с миотонической дистрофией)

МКК МАРК kinase (киназа МАРК) р38МАРК р38 mitogen-activated protein kinase (р38 митоген-активируемая протеинкиназа)

РАК р21-activated kinase (кипаза активируемая белком р21)

Р1-3 киназа фосфоинозитид-3-киназа

SCM self-complementary motif (самокомплимснтарный мотив) shsp small heat shock proteins (малые белки теплового шока)

TBST 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ №С1и0,1 %Twccn

TNF tumor necrosis factor (фактора некроза опухоли)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура и свойства малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа (hsp25)"

В 1974 году Тиссиерес и соавт. [281] впервые отметили, что, в ответ па повышение температуры среды, у личинок дрозофилы происходит активация синтеза специфической группы белков. Эта группа белков получила название белков теплового шока (heat shock proteins, hsp). Позже было установлено, что индукция синтеза hsp в организмах вызывается не только повышением температуры окружающей среды, а также рядом других факторов, таких как радиация, осмотический шок, воздействие органических растворителей, сильных оксидантов, ионов металлов, аналогов аминокислот, гормонов и ростовых факторов. В нормальных условиях в клетках также синтезируется большое количество белков теплового шока. Это обусловлено тем, что белки теплового шока играют важную роль в процессах котрансляционного сворачивания полипептидных цепей а также участвуют в процессах репарации частично денатурированных или элиминации неправильно свернутых белков. Вероятно, именно поэтому, белки теплового шока обнаружены во всех организмах от бактерий до человека и относятся к группе наиболее консервативных белков.

В основу современной классификации белков теплового шока положены различия в молекулярной массе, струюуре и функциях. Выделяют пять основных классов hsp: hsplOO, 90, 70, 60 и малые hsp (small hsp, shsp) [9;168;224]. Белки семейства hsp70 связываются с новосиптезированпой полипептидной цепью в процессе трансляции, предотвращают ее преждевременное неправильное сворачивание и участвуют в транспорте белков-субстратов к органеллам (митохондриям, эндоплазматическому рстикулуму) [207]. Белки семейства hsplOO являются близкими родственниками hsp70 и выполняют защитную функцию, предохраняя организм в условиях стресса [169;225]. Hsp90 образуют сложный комплекс с несколькими вспомогательными белками. Такой комплекс взаимодействует с рецепторами стероидных гормонов, обеспечивает эффективное связывание гормона с рецепторами и последующий перенос гормон-рецепторного комплекса в ядро. Помимо этого, hsp90 участвуют в направленном переносе нескольких типов протеинкипаз к участкам их функционирования [52]. Белки семейства hsp60 могуг участвовать в фолдипге сложно устроенных многодоменпых белков, таких как актин или тубулин, а также в АТР-зависимом исправлении структуры частично денатурированных белков [207]. К последней группе белков теплового шока относятся hsp с малыми молекулярными массами (shsp) [70;71;177;315].

Малые белки теплового шока выполняют множество важных функций в клетке: препятствуют агрегации денатурированных белков [48;98;158;159;165-167;254;262;263], защищают клетку от окислительного стресса [114;191;192;236], взаимодействуют с ДНК [259], участвуют во взаимодействии с нитоскелетом [104;117;154;155;164;197;198;208]. Кроме того, shsp вовлечены в ряд патологических процессов, протекающих в клетке [8;49;70], таких как миопатия [28;228;291 ], катаракта [8; I ТО], различные пейродегенеративпые заболевания [92;100;124;125;175], образование злокачественных опухолей [51;64;89;134;244;279]. Есть данные относительно антиапоптотической активности малых белков теплового шока [43;88;193]. Все эти данные свидетельствуют об исключительной важности малых белков теплового шока в процессах жизнедеятельности клетки.

1. Проанализировать содержание hsp25 в тканях птиц.

2. Исследовать влияние мугаций, имитирующих фосфорилировапие hsp25, и рН среды на олигомерпую струетуру, гидрофобные свойства и шаперонную активность этого белка.

Научная новизна и практическая значимость.

Определено содержание hsp25 в различных тканях птиц и установлено, что мышцы содержат наибольшее количество hsp25. Установлено, что мутации, имитирующие фосфорилирование, дестабилизируют четвертичную структуру hsp25. Изменение рН в интервале 5,5-7,5 влияет на олигомерную структуру hsp25 дикого типа и его 3D муганта, имитирующего фосфорилирование hsp25 по остаткам Serl5, 78, 81. Обнаружено, что hsp25 дикого типа и его 3D мутант способны образовывать гетероолигомерные комплексы, которые более стабильны, чем гомоолигомеры этих белков.

Используя флуоресцентный зонд bis-ANS, установили, что мутации, имитирующие фосфорилирование, влияют на гидрофобные свойства hsp25 и на структурные перестройки hsp25, вызываемые изменением рН. Это может сказываться па взаимодействии hsp25 с белками-субстратами. Для проверки этого предположения проведено сопоставление шаперонпых свойств hsp25 дикого типа и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, с различными субстратами. Установлено, что, в зависимости от условий инкубации и природы используемого субстрата, мутации, имитирующие фосфорилирование, могут, как повышать, так и понижать шапероппую активность hsp25. Высказано предположение, что шаиеронная активность зависит от олигомерного состояния и доступности гидрофобных участков hsp25, а также определяется свойствами комплексов, образуемых hsp25 с белками-субстратами.

Проведено исследование тепловой денатурации G-актина. Установлено, что прогревание при 43°С сопровождается незначительными изменениями структуры G-актина, увеличением устойчивости к трипсинолизу и ухудшением способности к полимеризации. Инкубация G-актина при температуре 60°С сопровождается появлением гидрофобных участков, формированием высокомолекулярных агрегатов, резким повышением чувствительности к трипсинолизу и полной потерей способности к полимеризации. Обнаружено, что hsp25 незначительно уменьшает скорость полимеризации иптактного актина и эффективно препятствует агрегации денатурированного актина. Высказано предположение, что актин может быть одним из белков-субстратов hsp25 in vivo и, что взаимодействие hsp25 с актином может играть определенную роль в защите клеток от неблагоприятных воздействий.

Полученные данные расширяют и углубляют знания в области структуры и свойств shsp, а также механизма регуляции их шаперонной активности и могут быть использованы при чтении курса лекций по общей биохимии и биохимии мышц.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Панасенко, Олеся Олеговна

Выводы

1. Мугации, имитирующие фосфорилирование, а также уменьшение рН от 7,5 до 5,5 дестабилизируют четвертичную структуру hsp25 и влияют на его гидрофобные свойства.

2. Олигомеры hsp25 дикого типа и его муганта, имитирующего фосфорилирование, способны обмениваться субъедииицами с образованием гетероолигомеров.

3. Шаперонная активность зависит от олигомерного состояния и гидрофобности hsp25, а также определяется растворимостью комплексов, образованных hsp25 и белком-субстратом. Поэтому в зависимости от природы белка-субстрата, мугации, имитирующие фосфорилирование, могуг как уменьшать, так и увеличивать шаперонную активноегь hsp25.

4. Hsp25 не влияет на степень полимеризации иативиого актина. Hsp25 и особенно его мутанты, имитирующие фосфорилирование, эффективно предотвращают агрегацию денатурированного актина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Панасенко, Олеся Олеговна, Москва

1. Arrigo, А.P. (2001) Hsp27: novel regulator of intracellular redox state. IUBMB Life, 52, 303-7.

2. Atomi, Y., Yamada, S., Strohman, R., Nonomura, Y. (1991) Alpha B-crystallin in skeletal muscle: purification and localization. J Biochem (Tokyo), 110, 812-22.

3. Azuma, N., Akasaka, N., Kito, H., Ikeda, M., Gahtan, V., Sasajima, Т., Sumpio, B.E. (2001) Role of p38 MAP kinase in endothelial cell alignment induced by fluid shear stress. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 280, HI 89-97.

4. Bailly, M., Ichetovkin, I., Grant, W., Zebda, N., Machcsky, L.M., Segall, J.E., Condeclis, J. (2001) The F-actin side binding activity of the Arp2/3 complcx is essential for actin nucleation and lamcllipod extension. Curr Biol, 11, 620-5.

5. Bamburg, J.R. (1999) Proteins of the ADF/cofilin family: essential regulators of actin dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol, 15, 185-230.

6. Bcall, A.C., Kato, K., Goldenring, J.R., Rasmussen, H., Brophy, C.M. (1997) Cyclic nucleotidc-dcpcndent vasorelaxation is associated with the phosphorylation of a small heat shock-related protein. J Biol Chem, 111, 11283-7.

7. Ben-Levy, R., Leighton, I.A., Doza, Y.N., Attwood, P., Morricc, N., Marshall, C.J., Cohen, P. (1995) Identification of novel phosphorylation sites required for activation of MAPKAP kinasc-2. EMBOJ, 14, 5920-30.

8. Benedek, G.B., Pande, J., Thurston, G.M., Clark, J.I. (1999) Theoretical and experimental basis for the inhibition of cataract. Prog Retin Eye Res, 18,391-402.

9. Benjamin, I.J, McMillan, D.R. (1998) Stress (heat shock) proteins: molecular chaperones in cardiovascular biology and disease. Circ Res, 83, 117-32.

10. Benndorf, R., Hayess, K., Stahl, J., Biclka, H. (1992) Cell-free phosphorylation of the murine small heat-shock protein hsp25 by an endogenous kinase from Ehrlich ascites tumor cells. Biochim Biophys Acta, 1136, 203-7.

11. Benndorf, R., Sun, X., Gilmont, R.R., Biedcrman, K.J., Molloy, M.P., Goodmurphy,

12. C.W., Cheng, H., Andrews, P.C., Welsh, M.J. (2001) HSP22, a new member of the small heat shock protein superfamily, interacts with mimic of phosphorylated HSP27 ((3D)HSP27). J Biol Chem, 276, 26753-61.

13. Berengian, A.R., Bova, M.P., Mchaourab, H.S. (1997) Structure and function of the conserved domain in alphaA-crystallin. Site-directed spin labeling identifies a beta-strand loeated near a subunit interface. Biochemistry, 36, 9951-7.

14. Bernstein, B.W., Painter, W.B., Chen, H., Minamidc, L.S., Abe, H., Bamburg, J.R. (2000) Intracellular pH modulation of ADF/cofilin proteins. Cell Modi Cytoskeleton, 47,319-36.

15. Bertazzon, A., Tian, G.H., Lamblin, A., Tsong, T.Y. (1990) Enthalpic and cntropic contributions to actin stability: calorimctry, circular dichroism, and fluorescence study and cffccts of calcium. Biochemistry, 29, 291-8.

16. Bhattacharyya, J, Sharma, K.K. (2002) Interactions of chlorpromazinc with alpha-, beta- and gamma-crystallins. J Ocul Pharmacol Ther, 18, 571-9.

17. Bio-Rad. Protein Blotting. A guaidc to transfer and detection. 2d edition, bulletin 1721 US/EG Rev В

18. Bio-Rad. Ready gels application guide. Catalog number 161-0993.

19. Bitar, K.N. (2002) HSP27 phosphorylation and interaction with actin-myosin in smooth muscle contraction. Am J Physiol Gaslroinlest Liver Physiol, 282, G894-903.

20. Bitar, K.N. (2003) Function of gastrointestinal smooth muscle: from signaling to contractile proteins. Am J Med, 115Suppl ЗА, 15S-23S.

21. Bitar, K.N., Ibitayo, A., Patil, S.B. (2002) HSP27 modulates agonist-induced association of translocated RhoA and РКС-alpha in muscle cells of the colon. J Appl Physiol, 92,41-9.

22. Bitar, K.N., Kaminski, M.S., Hailat, N., Cease, K.B., Strahler, J.R. (1991) Hsp27 is a mediator of sustained smooth muscle contraction in response to bombesin. Biochem Biophys Res Commun, 181, 1192-200.

23. Boelens, W.C., Crocs, Y., de Ruwe, M., dc Rcu, L., dc Jong, W.W. (1998) Negativechargcs in the C-terminal domain stabilize the alphaB- crystallin complex. J Biol Chem, 273, 28085-90.

24. Bova, M.P., Ding, L.L., Horwitz, J., Fung, B.K. (1997) Subunit exchange of alphaA-crystallin. J Biol Chem, 272, 29511-7.

25. Bova, M.P., Huang, Q., Ding, L., Horwitz, J. (2002) Subunit Exchange, Conformational Stability, and Chapcrone-like Function of the Small Heat Shock Protein 16.5 from Methanococcus jannaschii. J Biol Chem, 277, 38468-75.

26. Brophy, C.M., Dickinson, M., Woodrum, D. (1999) Phosphorylation of the small heat shock-related protein, HSP20, in vascular smooth muscles is associated with changes in the macromolecular associations of HSP20. J Biol Chem, 274, 6324-9.

27. Brophy, C.M., Lamb, S., Graham, A. (1999) The small heat shock-related protein-20 is an actin-associated protein. J Vase Surg, 29, 326-33.

28. Buchner, J., Ehrnsperger, M., Gaestel, M., Walke, S. (1998) Purification and characterization of small heat shock proteins. Methods Enzymol, 290, 339-49.

29. Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. (1998) Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein. Methods Enzymol, 290, 323-38.

30. Bukach, O.V., Seit-Nebi, A.S., Marston, S.B., Gusev, N.B. (2004) Some properties of human small heat shock protein Hsp20 (HspB6). Eur J Biochem, 271, 291-302.

31. Burridge, K, Feramisco, J.R. (1982) Alpha-actinin and vinculin from nonmuscle cells: calcium-sensitive interactions with actin. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 46, 587

32. Cairns, J., Qin, S., Philp, R., Tan, Y.H., Guy, G.R. (1994) Dephosphorylation of the small heat shock protein Hsp27 in vivo by protein phosphatase 2A. J Biol Chem, 269, 9176-83.

33. Carlier, M.F. (1991) Actin: protein structure and filament dynamics. J Biol Chem, 266, 1-4.

34. Carlier, M.F., Ressad, F., Pantaloni, D. (1999) Control of actin dynamics in cell motility. Role of ADF/cofilin. J Biol Chem, 274, 33827-30.

35. Carver, J.A., Aquilina, J.A., Truscott, R.J., Ralston, G.B. (1992) Identification by 1H NMR spectroscopy of flexible C-tcrminal extensions in bovine lens alpha-crystallin. FEBSLett, 311,143-9.

36. Chakravarty, S., Bhingc, A., Varadarajan, R. (2002) A procedure for detection and quantitation of cavity volumes proteins. Application to measure the strength of the hydrophobic driving force in protein folding. J Biol Chem, 277, 31345-53.

37. Charette, S.J., Lavoie, J.N., Lambert, H., Landry, J. (2000) Inhibition of Daxx-mediated apoptosis by heat shock protein 27. Mol Cell Biol, 20, 7602-12.

38. Chen, H., Bernstein, B.W., Bamburg, J.R. (2000) Regulating actin-filament dynamics in vivo. Trends Biochem Sci, 25, 19-23.

39. Chen, Q., Osteryoung, K., Vicrling, E. (1994) A 21-kDa chloroplast heat shock protein assembles into high molecular weight complexes in vivo and in Organelle. J BiolChem, 269,13216-23.

40. Chen, Q, Vierling, E. (1991) Analysis of conserved domains identifies a unique structural feature of a chloroplast heat shock protein. Mol Gen Genet, 226,425-31.

41. Cherian, M, Abraham, E.C. (1995) Decreased molecular chaperone property of alphacrystalline due to posttranslational modifications. Biochem Biophys Res Commun, 208, 675-9.

42. Clark, J.I, Huang, Q.L. (1996) Modulation of the chaperonc-likc activity of bovine alpha-crystallin. Proc Natl Acad Sci USA, 93, 15185-9.

43. Clark, J.I, Muchowski, P.J. (2000) Small heat-shock proteins and their potential role in human disease. Curr Opin Struct Biol, 10, 52-9.

44. Condcclis, J. (2001) How is actin polymerization nucleated in vivo? Trends Cell Biol, 11,288-93.

45. Cornford, P.A., Dodson, A.R., Parsons, K.F., Desmond, A.D., Woolfendcn, A., Fordham, M., Neoptolcmos, J.P., Kc, Y., Foster, C.S. (2000) Heat shock protein expression independently predicts clinical outcome in prostate cancer. Cancer Res, 60, 7099-105.

46. Csermely, P., Schnaider, Т., Soti, C., Prohaszka, Z., Nardai, G. (1998) The 90-kDa molecular chaperone family: structure, function, and clinical applications. A comprehensive review. Pharmacol Ther, 79, 129-68.

47. D'Angclo, G., Graceffa, P., Wang, C.A., Wrangle, J., Adam, L.P. (1999) Mammal-specific, ERK-dependent, caldesmon phosphorylation in smooth muscle. Quantitation using novel anti-phosphopeptide antibodies. J Biol Chem, 274,30115-21.

48. Dalle-Donne, I., Giustarini, D., Rossi, R., Colombo, R., Milzani, A. (2003) Reversible S-glutathionylation of Cys(374) regulates actin filament formation by inducing structural changes in the actin molecule. Free Radic Biol Med, 34,23-32.

49. Dallc-Donnc, I., Milzani, A., Giustarini, D., Di Simplicio, P., Colombo, R., Rossi, R. (2000) S-NO-actin: S-nitrosylation kinetics and the effect on isolated vascular smooth muscle. J Muscle Res Cell Motil, 21,171-81.

50. Dallc-Donnc, I., Rossi, R., Giustarini, D., Gagliano, N., Di Simplicio, P., Colombo, R., Milzani, A. (2002) Methionine oxidation as a major cause of the functional impairment of oxidized actin. Free Radic Biol Med, 32, 927-37.

51. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Giustarini, D., Milzani, A., Colombo, R. (2003) Proteincarbonyl groups as biomarkers of oxidative stress. Clin Chim Acta, 329, 23-38.

52. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Milzani, A., Di Simplicio, P., Colombo, R. (2001) The actin cytoskeleton response to oxidants: from small heat shock protein phosphorylation to changes in the redox state of actin itself. Free Radic Biol Med, 31, 1624-32.

53. Das, K.P., Pctrash, J.M., Surcwicz, W.K. (1996) Conformational properties of substrate proteins bound to a molecular chaperonc alpha-crystallin. J Biol Chem, 271, 10449-52.

54. Deretic, D., Aebersold, R.H., Morrison, H.D., Papcrmastcr, D.S. (1994) Alpha A- and alpha B-crystallin in the retina. Association with the post-GoIgi compartment of frog retinal photoreceptors. J Biol Chem, 269, 16853-61.

55. Devaja, O., King, R.J., Papadopoulos, A., Raju, K.S. (1997) Heat-shock protein 27 (HSP27) and its role in female reproductive organs. Eur J Gynaecol Oncol, 18, 16-22.

56. Ding, D., Moskowitz, S.I., Li, R., Lee, S.B., Esteban, M., TomascIIi, K., Chan, J., Bcrgold, P.J. (2000) Acidosis induces necrosis and apoptosis of cultured hippocampal neurons. Exp Neurol, 162, 1-12.

57. Ding, L, Candido, E.P. (2000) HSP25, a small heat shock protein associated with dense bodies and M- lines of body wall muscle in Caenorhabditis clcgans. J Biol Chem, 275,9510-7.

58. Ding, L, Candido, E.P. (2000) HSP43, a small heat-shock protein localized to specific cells of the vulva and spcrmatheca in the nematode Caenorhabditis elegans. Biochem J, 349,409-12.

59. Djabali, K., de Nechaud, В., Landon, F., Portier, M.M. (1997) AlphaB-crystallin interacts with intermediate filaments in response to stress. J Cell Sci, 110, 2759-69.

60. Eaton, P., Awad, W.I., Miller, J.I., Hearse, D.J., Shattock, M.J. (2000) Ischemic preconditioning: a potential role for constitutive low molecular weight stress protein translocation and phosphorylation? J Mol Cell Cardiol, 32, 961-71.

61. Ehrnspergcr, M, Buchncr, J. (2002) Small hcat-shock proteins. Wiley encyclopedia of molecular medicine, 5, 2931-34.

62. Ehrnspergcr, M., Buchncr, J., Gacstcl, M. (1998) Structure and function of small hcat-shock proteins. Molecular chaperones in the life cycle of proteins structure, function and mode of action, 22, 533-75.

63. Ehrnsperger, M., Graber, S., Gaestel, M., Buchner, J. (1997) Binding of non-native protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. EMBOJ, 16, 221-9.

64. Ehrnsperger, M., Hergersberg, C., Wienhues, U., Nichtl, A., Buchncr, J. (1998) Stabilization of proteins and peptides in diagnostic immunological assays by the molecular chapcronc Hsp25. Anal Biochem, 259, 218-25.

65. Ehrnsperger, M., Lilie, H., Gaestel, M., Buchner, J. (1999) The dynamics of Hsp25 quaternary structure. Structure and function of different oligomeric spccics. J Biol Chem, 274, 14867-74.

66. Evangelista, M., Zigmond, S., Boone, C. (2003) Formins: signaling cffcctors for assembly and polarization of actin filaments. J Cell Sci, 116, 2603-1 1.

67. Farahbakhsh, Z.T., Huang, Q.L., Ding, L.L., Altcnbach, C., Steinhoff, H.J., Horwitz, J., Hubbell, W.L. (1995) Interaction of alpha-crystallin with spin-labeled peptides. Biochemistry, 34, 509-16.

68. Fares, M.A, Wolfe, K.H. (2003) Positive selection and subfunctionalization of duplicated CCT chaperonin subunits. Mol Biol Evol, 20, 1588-97.

69. Farnsworth, P.N., Frauwirth, H., Groth-Vassclli, В., Singh, K. (1998) Refinement of 3D structure of bovine lens alpha A-crystallin. Int J Biol Macromol, 22, 175-85.

70. Farnsworth, P.N, Singh, K. (2000) Self-complementary motifs (SCM) in alpha-crystallin small heat shock proteins. FEBS Lett, 482, 175-9.

71. Fcil, I.K., Malfois, M., Hendlc, J., van Der Zandt, H., Svergun, D.I. (2001) A novel quaternary structure of the dimcric alpha-crystallin domain with chaperone-like activity. J Biol Chem, 276, 12024-9.

72. Fcramisco, J.R, Burridge, K. (1980) A rapid purification of alpha-actinin, filamin, and a 130,000-dalton protein from smooth musclc. J Biol Chem, 255, 1194-9.

73. Feramisco, J.R., Smart, J.E., Burridge, K., Hclfman, D.M., Thomas, G.P. (1982) Coexistence of vinculin and a vinculin-likc protein of higher molccular weight in smoothmuscle. J Biol Chem, 257, 11024-31.

74. Fersht, A.R. (2000) A kinctically significant intermediate in the folding of barnase. Proc Natl Acad Sci U S Л, 97, 14121 -6.

75. Fu, L, Liang, J.J. (2002) Detection of protein-protein interactions among lens crystallins in a mammalian two-hybrid system assay .J Biol Chem, 277,4255-60.

76. Fu, L, Liang, J.J. (2003) Enhanced stability of alpha B-crystallin in the presence of small heat shock protein Hsp27. Biochem Biophys Res Commun, 302, 710-4.

77. Gacstcl, M., Benndorf, R., Haycss, K., Pricmcr, E., Engel, K. (1992) Dephosphorylation of the small heat shock protein hsp25 by calcium/calmodulin-dependent (type 2B) protein phosphatase. J Biol Chem, 267,21607-11.

78. Garrido, C., Bruey, J.M., Fromcntin, A., Hammann, A., Arrigo, A.P., Solary, E. (1999) HSP27 inhibits cytochrome c-dependent activation of procaspase-9. FASEB J, 13,2061-70.

79. Garrido, C., Fromcntin, A., Bonnotte, В., Favrc, N., Moutet, M., Arrigo, A.P., Mchlcn, P., Solary, E. (1998) Heat shock protein 27 enhances the tumorigcnicity of immunogenic rat colon carcinoma cell clones. Cancer Res, 58, 5495-9.

80. Geeves, M.A, Holmes, K.C. (1999) Structural mechanism of muscle contraction. Annu Rev Biochem, 68, 687-728.

81. Gerthoffcr, W.T, Gunst, S.J. (2001) Invited review: foeal adhesion and small heat shock proteins in the regulation of actin remodeling and contractility in smooth muscle. J Appl Physiol, 91, 963-72.

82. Goldman, J.E, Corbin, E. (1991) Rosenthal fibers contain ubiquitinatcd alpha B-crystallin. Am J Pathol, 139,933-8.

83. Guay, J., Lambert, H., Gingras-Breton, G., Lavoie, J.N., Huot, J., Landry, J. (1997) Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediatcd phosphorylation of heat shock protein 27. J Cell Sci, 110, 357-68.

84. Guo, Z, Cooper, L.F. (2000) An N-tcrminal 33-amino-acid-deletion variant of hsp25 retains oligomcrization and functional properties. Biochem Biophys Res Commun, 270,183.9.

85. Gustavsson, N., Harndahl, U., Emanuelsson, A., Rocpstorff, P., Sundby, C. (1999) Methionine sulfoxidation of the chloroplast small heat shock protein and conformational changes in the oligomer. Protein Sci, 8, 2506-12.

86. Harnett, K.M, Biancani, P. (2003) Calcium-dependent and calcium-independent contractions in smooth muscles. Am J Med, 115,24S-30S.

87. Haslbeck, M. (2002) sHsps and their role in the chaperone network. Cell Mol Life Sci, 59, 1649-57.

88. Haslbeck, M, Buchner, J. (2002) Chaperone function of sHsps. Prog Mol Subcell Biol, 28,37-59.

89. Haslbeck, M., Walke, S., Stromer, Т., Ehrnsperger, M., White, H.E., Chen, S., Saibil, H.R., Buchner, J. (1999) Hsp26: a temperature-regulated chaperone. EMBO J, 18, 6744-51.

90. Head, M.W, Goldman, J.E. (2000) Small heat shock proteins, the cytoskclcton, and inclusion body formation. Neuropathol Appl Neurobiol, 26,304-12.

91. Hedges, J.C., Dcchert, M.A., Yambolicv, I.A., Martin, J.L., Hickcy, E., Weber, L.A., Gcrthoffcr, W.T. (1999) A role for p38(MAPK)/HSP27 pathway in smooth muscle cell migration. J Biol Chem, 274,24211-9.

92. Heide, R.S.V. (2002) Increased expression of HSP27 protects canine myocytes from simulated ischcmia-rcperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 282, H935-41.

93. Hennessey, E.S., Drummond, D.R., Sparrow, J.C. (1993) Molecular genetics of actin function. Biochem J, 291,657-71.

94. Hino, M., Kurogi, K., Okubo, M.A., Murata-Hori, M., Hosoya, H. (2000) Small heat shock protein 27 (HSP27) associates with tubulin/microtubules in HcLa cells. Biochem Biophys Res Commun, 271, 164-9.

95. Hochgrcbc, Т., Pankhurst, G.J., Wilcc, J., Eastcrbrook-Smith, S.B. (2000) pH-dependent changes in the in vitro ligand-binding properties and structure of human clustcrin. Biochemistry, 39, 1411-9.

96. Hodgkinson, J.L. (2000) Actin and the smooth musclc regulatory proteins: a structural perspective. J Muscle Res Cell Motil, 21, 115-30.

97. Holmes, K.C., Popp, D., Gebhard, W., Kabseh, W. (1990) Atomic model of the actin filament. Nature, 347,44-9.

98. Hook, D.W, Harding, J.J. (1998) Protection of enzymes by alpha-crystallin acting as a molecular chaperone. IntJ Biol Macromol, 22, 295-306.

99. Horwitz, J., Bova, M., Huang, Q.L., Ding, L., Yaron, O., Lowman, S. (1998) Mutation of alpha B-crystallin: effects on chaperonc-likc activity. Int J Biol Macromol, 22, 2639.

100. Horwitz, J., Bova, M.P., Ding, L.L., Haley, D.A., Stewart, P.L. (1999) Lens alpha-crystallin: function and structure. Eye, 13,403-8.

101. Horwitz, J., Huang, Q.L., Ding, L., Bova, M.P. (1998) Lens alpha-crystallin: chaperone-like properties. Methods Enzymol, 290, 365-83.

102. Houk, T.W.Jr, Ue, K. (1974) The measurement of actin concentration in solution: a comparison of methods. Anal Biochem, 62, 66-74.

103. Huot, J., Houlc, F., Rousseau, S., Deschcsncs, R.G., Shah, G.M., Landry, J. (1998) SAPK2/p38-dcpcndent F-actin reorganization regulates early membrane blcbbing during stress-induccd apoptosis. J Cell Biol, 143, 1361-73.

104. Huot, J., Houlc, F., Spitz, D.R., Landry, J. (1996) HSP27 phosphorylation-mcdiated resistance against actin fragmentation and cell death induced by oxidative stress. Cancer Res, 56, 273-9.

105. Ibitayo, A.I., Sladick, J., Tuteja, S., Louis-Jacques, O., Yamada, H., Groblewski, G., Welsh, M., Bitar, K.N. (1999) HSP27 in signal transduction and association with contractile proteins in smooth muscle cells. Am J Physiol, 277, G445-54.

106. Inaguma, Y., Ito, H., Iwamoto, I., Saga, S., Kato, K. (2001) AlphaB-crystallin phosphorylatcd at Ser-59 is localized in ccntrosomes and midbodies during mitosis. Eur J Cell Biol, 80, 741-8.

107. Ingolia, T.D, Craig, E.A. (1982) Four small Drosophila heat shock proteins are related to each other and to mammalian alpha-crystallin. Proc Natl Acad Sci U SA, 79, 23604.

108. Ito, H., Kamei, К., Iwamoto, I., Inaguma, Y., Kato, K. (2001) Regulation of the levels of small heat-shock proteins during differentiation of C2C12 cells. Exp Cell Res, 266, 213-21.

109. Ito, H., Kamei, K., Iwamoto, I., Inaguma, Y., Nohara, D., Kato, K. (2001) Phosphorylation-induced change of the oligomerization state of alpha-B-crystallin. J Biol Chem, 276, 5346-52.

110. Ito, H., Okamoto, K., Nakayama, H., Isobe, Т., Kato, K. (1997) Phosphorylation of alphaB-crystallin in response to various types of stress. J Biol Chem, 111, 29934-41.

111. Ito, Т., Kozawa, O., Tanabc, K., Niwa, M., Matsuno, H., Sakai, N., Ito, H., Kato, K., Uematsu, T. (2000) p38 MAP kinase is required for vasoprcssin-stimulated HSP27 induction in aortic smooth muscle cclls. Hypertension, 35, 673-8.

112. Iwaki, Т., Iwaki, A., Tateishi, J., Goldman, J.E. (1994) Sense and antisense modification of glial alpha B-crystallin production results in alterations of stress fiber formation and thermorcsistancc. J Cell Biol, 125, 1385-93.

113. Iwaki, Т., Kume-Iwaki, A., Liem, R.K., Goldman, J.E. (1989) Alpha B-crystallin is expressed in non-lenticular tissues and accumulates in Alexander's disease brain. Cell, 57,71-8.

114. Iwaki, Т., Wisniewski, Т., Iwaki, A., Corbin, E., Tomokane, N., Tateishi, J., Goldman, J.E. (1992) Accumulation of alpha B-crystallin in central nervous system glia and neurons in pathologic conditions. Am J Pathol, 140,345-56.

115. Jacobson, G.R, Roscnbusch, J.P. (1976) ATP binding to a protcase-resistant core of actin. Proc Natl Acad Sci U S A, 73, 2742-6.

116. Jakob, U., Gaestel, M., Engel, K., Buchncr, J. (1993) Small heat shock proteins are molecular chaperones. J Biol Chem, 268, 1517-20.

117. Jaquet, K., Kortc, K., Schnackcrz, K., Vyska, K., Hcilmcyer, L.M.Jr. (1993) Characterization of the cardiac troponin I phosphorylation domain by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry, 32, 13873-8.

118. Kabsch, W., Mannhcrz, H.G., Suck, D., Pai, E.F., Holmes, K.C. (1990) Atomic structure of the actin:DNase I complex. Nature, 347, 37-44.

119. Kantorow, M, Piatigorsky, J. (1994) Alpha-crystallin/small heat shock protein has autokinase activity. Proc Natl Acad Sci USA, 91, 3112-6.

120. Kappe, G., Franck, E., Verschuure, P., Boelens, W.C., Lcunisscn, J.A., de Jong, W.W. (2003) The human genome encodes 10 alpha-crystallin-rclatcd small heat shock proteins: HspBl-10. Cell Stress Chaperones, 8, 53-61.

121. Kato, K., Goto, S., Inaguma, Y., Hascgawa, K., Morishita, R., Asano, T. (1994) Purification and characterization of a 20-kDa protein that is highly homologous to alpha В crystallin. J Biol Chem, 269, 15302-9.

122. Kato, K., Hascgawa, K., Goto, S., Inaguma, Y. (1994) Dissociation as a result of phosphorylation of an aggregated form of the small stress protein, hsp27. J Biol Chem, 269, 11274-8.

123. Kato, К., I to, H., Kamci, K., Inaguma, Y., Iwamoto, I., Saga, S. (1998) Phosphorylation of alphaB-crystallin in mitotic cclls and identification of cnzymatic activities responsible for phosphorylation. J Biol Chem, 273, 28346-54.

124. Kato, K., Shinohara, H., Goto, S., Inaguma, Y., Morishita, R., Asano, T. (1992) Copurification of small heat shock protein with alpha В crystallin from human skeletal muscle. J Biol Chem, 267, 7718-25.

125. Kawazoe, Y., Tanabc, M., Nakai, A. (1999) Ubiquitous and ccll-spccific members of the avian small heat shock protein family. FEBS Lett, 455, 271-5.

126. Kellcy, M.J., David, L.L., Iwasaki, N. Wright, J., Shearer, T.R. (1993) alpha-Crystallin chaperone activity is reduced by calpain II in vitro and in selenite cataract. J Biol Chem, 268, 18844-9.

127. Kim, K.K., Kim, R., Kim, S.H. (1998) Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature, 394, 595-9.

128. Kim, R., Kim, K.K., Yokota, H., Kim, S.H. (1998) Small heat shock protein of Methanococcus jannaschii, a hyperthermophilc. Proc Natl Acad Sci USA, 95, 912933.

129. Kindas-Mugge, I., Ricder, C., Frohlich, I., Micksche, M., Trautinger, F., Ricdler, C. (2002) Characterization of proteins associated with heat shock protein hsp27 in the squamous cell carcinoma cell line A431. Cell Biol Int, 26, 109-16.

130. Koteichc, H.A, McHaourab, H.S. (2003) Mechanism of chaperone function in small heat-shock proteins. Phosphorylation-induccd activation of two-mode binding in alpha-B-crystallin. J Biol Chem, 278, 10361-7.

131. Kuznetsova, I.M., Biktashev, A.G., Khaitlina, S.Y., Vassilenko, K.S., Turoverov, K.K., Uvcrsky, V.N. (1999) Effect of self-association on the structural organization of partially folded proteins: inactivated actin. BiophysJ, 77,2788-800.

132. Lacmmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T-4. Nature 227, 680-85. 1970.

133. Lambert, H., Charette, S.J., Bemicr, A.F., Guimond, A., Landry, J. (1999) HSP27multimcrization mediated by phosphorylation-sensitive intermoleeular interactions at the amino terminus. J Biol Chem, 21 A, 9378-85.

134. Larsen, J.K., Yamboliev, I.A., Weber, L.A., Gcrthoffer, W.T. (1997) Phosphorylation of the 27-kDa heat shock protein via p38 MAP kinase and MAPKAP kinase in smooth musclc. Am J Physiol, 273, L930-40.

135. Lavoie, J.N., Gingras-Breton, G., Tanguay, R.M., Landry, J. (1993) Induction of Chinese hamster HSP27 gene expression in mouse cclls confers resistance to heat shock. HSP27 stabilization of the microfilament organization. J Biol Chem, 268, 3420-9.

136. Lavoie, J.N., Hickey, E., Weber, L.A., Landry, J. (1993) Modulation of actin microfilament dynamics and fluid phase pinocytosis by phosphorylation of heat shock protein 21. J Biol Chem, 268,24210-4.

137. Lc Bihan, T, Gicquaud, C. (1993) Kinctic study of the thermal denaturation of G actin using differential scanning calorimetry and intrinsic fluorescence spectroscopy. Biochem Biophys Res Commun, 194, 1065-73.

138. Lcc, G.J., Pokala, N., Vierling, E. (1995) Structure and in vitro molecular chaperone activity of cytosolic small heat shock proteins from pea .J Biol Chem, 270, 10432-8.

139. Lee, G.J., Roseman, A.M., Saibil, H.R., Vierling, E. (1997) A small heat shock protein stably binds heat-denatured model substrates and can maintain a substrate in a folding-competent state. EMBO J, 16,659-71.

140. Lcc, G.J, Vierling, E. (2000) A small heat shock protein cooperates with heat shock protein 70 systems to reactivate a heat-denatured protein. Plant Physiol, 122, 189-98.

141. Lcroux, M.R., Ma, B.J., Batclicr, G., Melki, R., Candido, E.P. (1997) Unique structural features of a novel class of small heat shock proteins. J Biol Chem, 272, 12847-53.

142. Leroux, M.R., Mclki, R., Gordon, В., Batelicr, G., Candido, E.P. (1997) Structurc-function studies on small heat shock protein oligomcric assembly and interaction with unfolded polypeptides. J Biol Chem, 272, 24646-56.

143. Leskovac, V., Trivic, S., Pcricin, D. (2002) The three zinc-containing alcohol dehydrogenases from baker's yeast, Saccharomyces cerevisiac. FEMS Yeast Res, 2, 481-94.

144. Liang, P, MacRac, Т.Н. (1997) Molecular chaperoncs and the cytoskeleton. J Cell Sci, 110, 1431-40.

145. Lindner, R.A., Kapur, A., Carver, J.A. (1997) The interaction of the molecular chaperone, alpha-crystallin, with molten globule states of bovine alpha-lactalbumin. J Biol Chem, 272,27722-9.

146. Lindner, R.A., Trcweek, T.M., Carver, J.A. (2001) The molecular chaperone alpha-crystallin is in kinctic competition with aggregation to stabilize a monomeric molten-globule form of alpha- lactalbumin. Biochem J, 354, 79-87.

147. Lindquist, S, Craig, E.A. (1988) The heat-shock proteins. Annu Rev Genet, 22, 63177.

148. Lindquist, S, Kim, G. (1996) Heat-shock protein 104 expression is sufficient for thermotolerancc in yeast. Proc Natl Acad Sci USA, 93, 5301-6.

149. Litt, M., Kramer, P., LaMorticclla, D.M., Murphcy, W., Lovrien, E.W., Wclcber, R.G. (1998) Autosomal dominant congenital cataract associated with a missense mutation in the human alpha crystallin gene CRYAA. Hum Mol Genet, 7,471-4.

150. Liu, C, Welsh, M.J. (1999) Identification of a site of Hsp27 binding with Hsp27 and alpha-B-crystallin as indicated by the yeast two-hybrid system. Biochem Biophys Res Commun, 255,256-61.

151. Loktionova, S.A., Ilyinskaya, O.P., Gabai, V.L., Kabakov, A.E. (1996) Distinct effects of heat shock and ATP depletion on distribution and isoform patterns of human Hsp27 in endothelial cells. FEBS Lett, 392, 100-4.

152. Loktionova, S.A, Kabakov, A.E. (1998) Protein phosphatase inhibitors and heatpreconditioning prevent Hsp27 dcphosphorylation, F-actin disruption and deterioration of morphology in ATP-depIetcd endothelial cells. FEBS Lett, 433, 294300.

153. Lorcnz, M., Popp, D., Holmes, K.C. (1993) Refinement of the F-actin model against X-ray fiber diffraction data by the use of a directed mutation algorithm. J Mol Biol, 234, 826-36.

154. Lowe, J., McDermott, H., Pike, I., Spendlove, 1., Landon, M., Mayer, R.J. (1992) alpha В crystallin expression in non-lcnticular tissues and selective presence in ubiquitinated inclusion bodies in human disease .J Pathol, 166,61-8.

155. MacRac, Т.Н. (2000) Structure and function of small heat shock/alpha-crystallin proteins: established concepts and emerging ideas. Cell Mol Life Sci, 57,899-913.

156. Maizels, E.T., Peters, C.A., Kline, M., Cutler, R.E. Jr, Shanmugam, M., Hunzickcr-Dunn, M. (1998) Heat-shock protein-25/27 phosphorylation by the delta isoform of protein kinase C. Biochem J, 332, 703-12.

157. Martin, J.L., Mcstril, R., Hilal-Dandan, R., Brunton, L.L., Dillmann, W.H. (1997) Small heat shock proteins and protection against ischemic injury in cardiac myocytes. Circulation, 96,4343-8.

158. Matsuzaki, F., Matsumoto, S., Yahara, I., Yonczawa, N., Nishida, E., Sakai, H. (1988) Cloning and characterization of porcine brain cofilin cDNA. Cofilin contains the nuclear transport signal sequence. J Biol Chem, 263, 11564-8.

159. Mazhul, V.M., Zaitscva, E.M., Shavlovsky, M.M., Stcpanenko, O.V., Kuznctsova,

160. M., Turovcrov, K.K. (2003) Monitoring of actin unfolding by room temperature tryptophan phosphorescence. Biochemistry, 42, 13551-7.

161. McGough, A. (1998) F-actin-binding proteins. Curr Opin Struct Biol, 8, 166-76.

162. McGough, A., Way, M., DcRosier, D. (1994) Determination of the alpha-actinin-binding site on actin filaments by cryoelectron microscopy and image analysis. J Cell Biol, 126,433-43.

163. McHaourab, H.S., Dodson, E.K., Kotcichc, H.A. (2002) Mechanism of chaperone function in small heat shock proteins. Two-mode binding of the excited states of T4 lysozyme mutants by alphaA-crystallin. J Biol Chem, 277,40557-66.

164. Gusev, N.B. (1995) Interaction of smooth muscle caldcsmon with calmodulin mutants. FEBSLett, 360, 89-92.

165. Mehlen, P., Schulzc-Osthofif, K., Arrigo, A.P. (1996) Small stress proteins as novel regulators of apoptosis. Heat shock protein 27 blocks Fas/APO-1- and staurosporineinduced cell death. J Biol Chem, 271, 16510-4.

166. Merck, K.B., De Haard-Hoekman, W.A., Oude Essink, B.B., Blocmcndal, H., De Jong, W.W. (1992) Expression and aggregation of recombinant alpha A-crystallin and its two domains. Biochim Biophys Acta, 1130, 267-76.

167. Miki, M, Kouyama, T. (1994) Domain motion in actin observed by fluorescence resonance energy transfer. Biochemistry, 33, 10171-7.

168. Miron, Т., Vancompemolle, K., Vandekerckhovc, J., Wilchek, M., Geiger, B. (1991) A 25-kD inhibitor of actin polymerization is a low molecular mass heat shock protein. J Cell Biol, 114,255-61.

169. Miron, Т., Wilchek, M., Geiger, B. (1988) Characterization of an inhibitor of actin polymerization in vinculin- rich fraction of turkey gizzard smooth muscle. Eur J Biochem, 178, 543-53.

170. Moraczcwska, J., Wawro, В., Seguro, K., Strzelecka-Golaszewska, H. (1999) Divalent cation-, nucleotide-, and polymerization-dependent changes in the conformation of subdomain 2 of actin. Biophys J, 77, 373-85.

171. Moriyama, K., Yonezawa, N., Sakai, H., Yahara, I., Nishida, E. (1992) Mutational analysis of an actin-binding site of cofilin and characterization of chimeric proteins between cofilin and destrin. J Biol Chem, 267, 7240-4.

172. Momet, D, Ue, K. (1984) Proteolysis and structure of skeletal muscle actin. Proc Natl AcadSciUSA, 81,3680-4.

173. Mounier, N, Arrigo, A.P. (2002) Actin cytoskeleton and small heat shock proteins: how do they interact? Cell Stress Chaperones, 7, 167-76.

174. Muchowski, P.J, Clark, J.I. (1998) ATP-enhanced molecular chapcrone functions of the small heat shock protein human alphaB crystallin. Proc Natl Acad Sci USA, 95, 1004-9.

175. Muchowski, P.J., Hays, L.G., Yates, J.R. 3rd, Clark, J.l. (1999) ATP and the core "alpha-Crystallin" domain of the small heat-shock protein alphaB-crystallin. J Biol Chem, 274,30190-5.

176. Muhlrad, A., Cheung, P., Phan, B.C., Miller, C., Reisler, E. (1994) Dynamic properties of actin. Structural changes induced by beryllium fluoride. J Biol Chem, 269, 11852-8.

177. Ncira, J.L., Vazquez, E., Fersht, A.R. (2000) Stability and folding of the protein complexes of barnase. EurJBiochem, 267,2859-70.

178. Netzcr, W.J, HartI, F.U. (1998) Protein folding in the cytosol: chaperonin-dependent and -independent mechanisms. Trends Biochem Sci, 23,68-73.

179. Nicholl, I.D, Quinlan, R.A. (1994) Chapcronc activity of alpha-crystallins modulates intermediate filament assembly. EMBOJ, 13,945-53.

180. Novagcn. (2000) pET system manual. TB055,9th edition 05/00, Novagen Inc.

181. Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. (1989) Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. J Biol Chem, 264, 16143-8.

182. Orlova, A, Egclman, E.H. (1992) Structural basis for the destabilization of F-actin by phosphate release following ATP hydrolysis. JMol Biol, 227, 1043-53.

183. Orlova, A, Egelman, E.H. (1993) A conformational change in the actin subunit can change the flexibility of the actin filament. J Mol Biol, 232,334-41.

184. Orlova, A, Egelman, E.H. (1995) Structural dynamics of F-actin: I. Changes in the С terminus .J Mol Biol, 245, 582-97.

185. Orlova, A., Prochnicwicz, E., Egelman, E.H. (1995) Structural dynamics of F-actin: II. Cooperativity in structural transitions. J Mol Biol, 245,598-607.

186. Orlova, A., Rybakova, I.N., Prochniewicz, E., Thomas, D.D., Ervasti, J.M., Egelman, . E.H. (2001) Binding of dystrophin's tandem calponin homology domain to F-actin ismodulated by actin's structure. BiophysJ, 80, 1926-31.

187. Ortwerth, B.J., Slight, S.H., Prabhakaram, M., Sun, Y., Smith, J.B. (1992) Site-specific glycation of lens crystallins by ascorbic acid. Biochim Biophys Acta, 1117, 207-15.

188. Otterbein, L.R., Graccffa, P., Dominguez, R. (2001) The crystal structure of uncomplexed actin in the ADP state. Science, 293, 708-11.

189. Panasenko, O.O, Guscv, N.B. (2000) Simultaneous interaction of actin with alpha-actinin and calponin. IUBMB Life, 49,277-82.

190. Panasenko, 0.0, Guscv, N.B. (2001) Mutual effects of alpha-actinin, calponin and filamin on actin binding. Biochim Biophys Acta, 1544, 393-405.

191. Panasenko, O.O., Kim, M.V., Marston, S.B., Gusev, N.B. (2003) Interaction of the small heat shock protein with molecular mass 25 kDa (hsp25) with actin. Eur J Biochem, 270, 892-901.

192. Panasenko, O.O., Seit Ncbi, A., Bukach, O.V., Marston, S.B., Guscv, N.B. (2002) Structure and properties of avian small heat shock protein with molecular weight 25 kDa. Biochim Biophys A eta, 1601, 64-74.

193. Pardee, J.D, Spudich, J.A. (1982) Purification of muscle actin. Methods Enzymol, 85, 164-81.

194. Park, C.O., Xiao, X.H., Allen, D.G. (1999) Changes in intracellular Na+ and pH in rat heart during ischcmia: role of Na+/H+ exchanger. Am J Physiol, 276, HI 581-90.

195. Parsell, D.A, Lindquist, S. (1993) The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins. Annu Rev Genet, 27, 437-96.

196. Parsell, D.A., Sanchez, Y., Stitzel, J.D., Lindquist, S. (1991) Hsp 104 is a highly conserved protein with two essential nucleotide- binding sites. Nature, 353, 270-3.

197. Pearson, G., Robinson, F., Beers Gibson, Т., Xu, B.E., Karandikar, M., Berman, K., Cobb, M.H. (2001) Mitogen-activatcd protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions. Endocr Rev, 22, 153-83.

198. Permyakov, E.A. (1993) Luminescent spectroscopy of proteins. CRC Press. Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo

199. Perng, M.D., Cairns, L., van den IJssel P, Prescott, A., Hutcheson, A.M., Quinlan, R.A. (1999) Intermediate filament interactions can be altered by HSP27 and alphaB-crystallin. J Cell Sci, 112,2099-112.

200. Piotrowicz, R.S., Hickey, E., Levin, E.G. (1998) Heat shock protein 27 kDa expression and phosphorylation regulates endothelial cell migration. FASEB J, 12, 1481-90.

201. Piotrowicz, R.S, Levin, E.G. (1997) Basolateral membrane-associated 27-kDa heat shock protein and microfilament polymerization. J Biol Chem, 272, 25920-7.

202. Piotrowicz, R.S., Martin, J.L., Dillman, W.H., Levin, E.G. (1997) The 27-kDa heat shock protein facilitates basic fibroblast growth factor release from endothelial cells. J1. Biol Chem, 272, 7042-7.

203. Plater, M.L., Goode, D., Crabbe, M.J. (1996) Effects of site-directed mutations on the chapcronc-Iikc activity of alphaB-crystallin. J Biol Chem, 271, 28558-66.

204. Pollard, T.D. (1983) Measurement of rate constants for actin filament elongation in solution. Anal Biochem, 134,406-12.

205. Pollard, T.D, Borisy, G.G. (2003) Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell, 112,453-65.

206. Poon, S., Rybchyn, M.S., Easterbrook-Smith, S.B., Carver, J.A., Pankhurst, G.J., Wilson, M.R. (2002) Mildly acidic pH activates the extracellular molecular chaperone clusterin. J Biol Chem, 277, 39532-40.

207. Rajaraman, K., Raman, В., Ramakrishna, Т., Rao, C.M. (1998) The chapcrone-Iike alpha-crystallin forms a complex only with the aggregation-prone molten globule state of alpha-Iactalbumin. Biochem Biophys Res Commun, 249,917-21.

208. Raman, В., Ramakrishna, Т., Rao, C.M. (1995) Temperature dependent chaperone-like activity of alpha-crystallin. FEBS Lett, 365, 133-6.

209. Raman, В., Ramakrishna, Т., Rao, C.M. (1995) Rapid refolding studies on the chaperone-Iike alpha-crystallin. Effect of alpha-crystallin on refolding of beta- and gamma-crystallins. J Biol Chem, 270, 19888-92.

210. Rao, C.M., Raman, В., Ramakrishna, Т., Rajaraman, K., Ghosh, D., Datta, S., Trivedi, V.D., Sukhaswami, M.B. (1998) Structural perturbation of alpha-crystallin and its chaperone-Iike activity. IntJ Biol Macromol, 22, 271-81.

211. Rcddy, G.B., Das, K.P., Petrash, J.M., Surcwicz, W.K. (2000) Temperature-dependent chapcronc activity and structural properties of human alpha-A- and alpha-B-crystallins. J Biol Chem, 275,4565-70.

212. Ressad, F., Didry, D., Egilc, C., Pantaloni, D., Carlier, M.F. (1999) Control of actin filament length and turnover by actin dcpolymcrizing factor (ADF/cofilin) in the presence of capping proteins and ARP2/3 complex. J Я/о/ Chem, 274,20970-6.

213. Richards, E.H., Hickcy, E., Weber, L., Master, J.R. (1996) Effect of ovcrcxpression of the small heat shock protein HSP27 on the heat and drug sensitivities of human testis tumor cells. Cancer Res, 56,2446-51.

214. Sakamoto, K., Urushidani, Т., Nagao, T. (1998) Translocation of HSP27 to cytoskeleton by repetitive hypoxia- reoxygenation in the rat myoblast cell line, H9c2. Biochem Biophys Res Commun, 251, 576-9.

215. Schafer, C., Clapp, P., Welsh, M.J., Benndorf, R., Williams, J.A. (1999) HSP27 expression regulates CCK-induced changes of the actin cytoskeleton in CHO-CCK-A cclls. Am J Physiol, 277, CI 032-43.

216. Schaffncr, W, Wcissmann, C. (1973) A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Anal Biochem, 56, 502-14.

217. Schraufstatter, I.U., Hyslop, P.A., Hinshaw, D.B., Spragg, R.G., Sklar, L.A., Cochrane, C.G. (1986) Hydrogen peroxide-induced injury of cells and its prevention by inhibitors of poly(ADP-ribosc) polymerase. Proc Natl Acad Sci USA, 83, 490812.

218. Schutt, C.E., Myslik, J.C., Rozycki, M.D., Gooncsckcrc, N.C., Lindbcrg, U. (1993) The structure of crystalline profilin-bcta-actin. Nature, 365, 810-6.

219. Sharma, K.K., Kaur, H., Kester, K. (1997) Functional elements in molecular chaperonc alpha-crystallin: identification of binding sites in alpha B-crystallin. Biochem Biophys Res Commun, 239, 217-22.

220. Sharma, K.K., Kaur, H., Kumar, G.S., Kester, K. (1998) Interaction of l,l'-bi(4-anilino)naphthalenc-5,5'-disulfonic acid with alpha-crystallin. J Biol Chem, 273, 896570.

221. Sharma, K.K., Kumar, G.S., Murphy, A.S., Kester, K. (1998) Identification of 1,1-bi(4-ani!ino)naphthalcne-5,5'-disulfonic acid binding scqucnccs in alpha-crystallin. J Biol Chem, 273, 15474-8.

222. Sharma, K.K., Kumar, R.S., Kumar, G.S., Quinn, P.T. (2000) Synthesis and characterization of a peptide identified as a functional element in alphaA-crystallin. J Biol Chem, 275,3767-71.

223. Siegers, K., Bolter, В., Schwarz, J.P., Bottchcr, U.M., Guha, S., Hartl, F.U. (2003) TRiC/CCT cooperates with different upstream chaperones in the folding of distinct protein classes. EMBOJ, 22, 5230-40.

224. Singh, K., Groth-Vassclli, В., Farnsworth, P.N. (1998) Interaction of DNA with bovine lens alpha-crystallin: its functional implications. Inl J Biol Macromol, 22, 31520.

225. Smulders, R.H, de Jong, W.W. (1997) The hydrophobic probe 4,4'-bis(l-anilino-8-naphthalene sulfonic acid) is specifically photoincorporated into the N-terminal domain of alpha B- crystallin. FEBS Lett, 409, 101-4.

226. Smulders, R.H., Merck, K.B., Aendekerk, J., Horwitz, J., Takemoto, L., Slingsby, C., Bloemendal, H., De Jong, W.W. (1995) The mutation Asp69->Ser affects the chaperone-like activity of alpha A- crystallin. Eur J Biochem, 232, 834-8.

227. Smulders RHPH, Carver, J.A., Lindner, R.A., van Boekcl, M.A., Bloemendal, H., de Jong, W.W. (1996) Immobilization of the C-terminal extension of bovine alphaA-crystallin reduces chaperone-like activity. J Biol Chem, 271, 29060-6.

228. Smykal, P., Masin, J., Hrdy, I., Konopasck, I., Zarsky, V. (2000) Chapcronc activity of tobacco HSP18, a small heat-shock protein, is inhibited by ATP. Plant J, 23, 70313.

229. Sparrer, H., Rutkat, K., Buchncr, J. (1997) Catalysis of protein folding by symmetric chaperone complexes. Proc Natl AcadSci USA, 94, 1096-100.

230. Spector, A., Chiesa, R., Srcdy, J., Garner, W. (1985) cAMP-dcpcndcnt phosphorylation of bovine lens alpha-crystallin. Proc Natl Acad Sci USA, 82,4712-6.

231. Srinivasan, A.N., Nagincni, C.N., Bhat, S.P. (1992) alpha A-crystallin is expressed in non-ocular tissues. J Biol Chem, 267,23337-41.

232. Stokoe, D., Engel, K., Campbell, D.G., Cohen, P., Gacstcl, M. (1992) Identification of MAPKAP kinase 2 as a major enzyme responsible for the phosphorylation of the small mammalian heat shock proteins. FEBS Lett, 313,307-13.

233. Studer, S, Narberhaus, F. (2000) Chaperone activity and homo- and hctcro-oligomcr formation of bacterial small heat shock proteins. J Biol Chem, 275, 37212-8.

234. Sudhakar, K, Fay, P.J. (1996) Exposed hydrophobic sites in factor VIII and isolated subunits. J Biol Chem, 271,23015-21.

235. Sugden, P.H, Clerk, A. (1998) "Stress-responsive" mitogcn-activated protein kinases (c-Jun N-terminal kinases and p38 mitogcn-activated protein kinases) in the myocardium. Circ Res, 83, 345-52.

236. Sun, T.X., Das, B.K., Liang, J.J. (1997) Conformational and functional differences between recombinant human lens alpha-A- and alpha-B-crystallin. J Biol Chem, 272,6220-5.

237. Sun, T.X, Liang, J.J. (1998) Intcrmolecular exchange and stabilization of recombinant human alpha-A- and alpha-B-crystallin. J Biol Chem, 273, 286-90.

238. Sun, W., Van Montagu, M., Vcrbruggen, N. (2002) Small heat shock proteins and stress tolerance in plants. Biochim Biophys Acta, 1577, 1-9.

239. Tetu, В., Lacassc, В., Bouchard, H.L., Lagace, R., Huot, J., Landry, J. (1992) Prognostic influence of HSP-27 expression in malignant fibrous histiocytoma: a clinicopathological and immunohistochemical study. Cancer Res, 52, 2325-8.

240. Tirion, M.M., ben-Avraham, D., Lorenz, M., Holmes, K.C. (1995) Normal modes as refinement parameters for the F-actin model. Biophys J, 68,5-12.

241. Tissieres, A., Mitchell, H.K., Tracy, U.M. (1974) Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. J Mol Biol, 84,389-98.

242. Turoverov, K.K., Biktashev, A.G., Khaitlina, S.Y., Kuznetsova, I.M. (1999) The structure and dynamics of partially folded actin. Biochemistry, 38, 6261-9.

243. Turoverov, K.K., Verkhusha, V.V., Shavlovsky, M.M., Biktashev, A.G., Povarova, O.I., Kuznetsova, I.M. (2002) Kinetics of actin unfolding induced by guanidine hydrochloride. Biochemistry, 41, 1014-9.

244. Van Troys, M., Vandekcrckhovc, J., Ampe, C. (1999) Structural modules in actin-binding proteins: towards a new classification. Biochim Biophys Acta, 1448, 323-48.

245. Van Why, S.K., Mann, A.S., Ardito, Т., Thulin, G., Ferris, S., Macleod, M.A., Kashgarian, M., Siegel, N.J. (2003) Hsp27 associates with actin and limits injury in energy depleted renal cpithclia. J Am Soc Nephrol, 14,98-106.

246. Veingcr, L., Diamant, S., Buchner, J., Goloubinoff, P. (1998) The small hcat-shock protein IbpB from Escherichia coli stabilizes stress-denatured proteins for subsequent refolding by a multichaperone network. J Biol Chem, 273, 11032-7.

247. Walker J.M. (2002) Isoelectric focusing of proteins in ultra-thin polyacrylamide gels. Protein protocols handbook, 2cd edition, Edited by Walker J.M., Humana Press Inc., Totowa, NJ, 125-129.

248. Walsh, M.P. (1994) Regulation of vascular smooth muscle tone. Can J Physiol Pharmacol, 72, 919-36.

249. Walsh, M.T., Sen, A.C., Chakrabarti, B. (1991) Miccllar subunit assembly in a three-layer model of oligomcric alpha-crystallin. J Biol Chem, 266,20079-84.

250. Wang, K. (2001) alpha-B- and alpha-A-crystallin prevent irreversible acidification-induced protein denaturation. Biochem Biophys Res Commun, 287, 642-7.

251. Wang, K, Spector, A. (2001) ATP causes small heat shock proteins to release denatured protein. Eur J Biochem, 268,6335-45.

252. Wang, P, Bitar, K.N. (1998) Rho A regulates sustained smooth muscle contraction through cytoskclctal reorganization of HSP27. Am J Physiol, 275, G1454-62.

253. Wang, Y., Xu, A., Pearson, R.B., Cooper, G.J. (1999) Insulin and insulin antagonists evoke phosphorylation of P20 at serine 157 and serine 16 respectively in rat skeletal muscle. FEBS Lett, 462,25-30.

254. Waters, E.R, Vierling, E. (1999) Chloroplast small heat shock proteins: evidence for atypical evolution of an organelle-Iocalized protein. Proc Natl Acad Sci USA, 96, 14394-9.

255. Wear, M.A., Yamashita, A., Kim, K., Maeda, Y., Cooper, J.A. (2003) How capping protein binds the barbed end of the actin filament. Curr Biol, 13,1531-7.

256. Webb, B.L., Hirst, S.J., Giembycz, M.A. (2000) Protein kinase С isoenzymes: a review of their structure, regulation and role in regulating airways smooth muscle tone and mitogenesis. Br J Pharmacol, 130, 1433-52.

257. Wegncr, A, Savko, P. (1982) Fragmentation of actin filaments. Biochemistry, 21, 1909-13.

258. Welch, W.J, Feramisco, J.R. (1982) Purification of the major mammalian heat shock proteins. J Biol Chem, 257, 14949-59.

259. Welsh, M.J, Gaestel, M. (1998) Small heat-shock protein family: function in health and disease. Ann N Y Acad Sci, 851,28-35.

260. Wieskc, M., Benndorf, R., Bchlke, J., Dolling, R., Grcllc, G., Biclka, H., Lutsch, G. (2001) Defined sequence segments of the small heat shock proteins HSP25 and alpha-B-crystallin inhibit actin polymerization. Eur J Biochem, 268,2083-90.

261. Wymann, M.P, Pirola, L. (1998) Structure and function of phosphoinositidc 3-kinases. Biochim Biophys Acta, 1436, 127-50.

262. Yambolicv, I.A., Hedges, J.C., Mutnick, J.L., Adam, L.P., GcrthofTfcr, W.T. (2000) Evidence for modulation of smooth muscle force by the p38 MAP kinase/HSP27 pathway. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 278, H1899-907.

263. Zantcma, A., Verlaan-De Vries, M., Maasdam, D., Bol, S., van dcr Eb, A. (1992) Heat shock protein 27 and alpha B-crystallin can form a complex, which dissociates by heat shock. J Biol Chem, 267, 12936-41.

264. Zavialov, A.V., Gaestel, M., Korpela, Т., Zav'yalov, V.P. (1998) Thiol/disulfide exchange between small heat shock protein 25 and glutathione. Biochim Biophys Acta, 1388, 123-32.

265. Zhou, M., Lambert, H., Landry, J. (1993) Transient activation of a distinct serine protein kinase is responsible for 27-kDa heat shock protein phosphorylation in mitogcn-stimulatcd and heat-shocked cells. J Biol Chem, 268,35-43.

266. Zobel, C.A.T., Loranger, A., Marceau, N., Theriault, J.R., Lambert, H., Landry, J. (2003) Distinct chapcronc mechanisms can delay the formation of aggresomes by the myopathy-causing R120G alphaB-crystallin mutant. Hum Mol Genet, 12, 1609-20.

267. Zu, Y.L., Ai, Y., Huang, C.K. (1995) Characterization of an autoinhibitory domain in human mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2. J Biol Chem, 270, 202-6.

268. Букач, O.B., Сейт Неби, A.C., Панасенко, О.О., Ким, М.В., Гусев, Н.Б. (2002) Выделение тканевого и рекомбинантного малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа (hsp25) из гладких мышц птиц. Вопросы биол., мед. и фарм. химии,. 1, 50-7.

269. Гусев, Н.Б., Богачева, Н.Б., Марстон, С.Б. (2002) Структура и свойства малых белков теплового шока (sHsp) и их взаимодействие с цитоскелетом. Биохимия, 67,613-23.

270. Мапиатис, Т., Фрич, Э., Сэмбрук, Дж.М. (1984) "Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование". М., Мир.

271. Остермап Л. А. (1981) "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот электрофорезом и ультрацентрифугированием". М., Наука.

272. Папасспко О.О., Ким М. В., Гусев Н. Б. (2003) Структура и свойства малых белков теплового шока. Успехи биол. химии, 43, 59-98.

273. Ригетти, П. (1986) "Изоэлсктричсскос фокусирование. Теория, методы и применение". М., Мир.

274. Северин С. Е, Соловьева Г. А. (1989) "Практикум по биохимии". М., МГУ.

275. Татунашвили, Л.Б, Привалов, П.Л. (1984) Калориметрическое исследование денатурации G-актина. Биофизика, 29, 583-5.

276. Туроверов, К.К., Хайтлина, С.Ю., Пинаев, Г.П. (1975) Флуоресцентные свойства и определение содержания нативного актина в его препаратах. Биохимия, 40, 316-22.

Информация о работе

Панасенко, Олеся Олеговна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Структура и свойства малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа (hsp25) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы