Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию F-актина

Пивоварова, Анастасия Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию F-актина
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию F-актина"

На правах рукописи » /) -

□0344ЫУи^

ПИВОВАРОВА Анастасия Викторовна

Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию Б-актина

03 00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1б°КТ2008

Москва 2008

003448904

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и на факультете биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Дмитрий Иванович Левицкий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Сергей Сергеевич Шишкин

доктор биологических наук, профессор Евгений Николаевич Добров

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «30» октября 2008 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002 247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Институте биохимии им. А Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «2£» сентября 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Актин - один из наиболее распространенных белков в природе. Образуемые им филаменты (F-актин) являются одним из главных компонентов цитоскелета эукариотических клеток, где содержание актина очень высоко, а их взаимодействие с миозином лежит в основе мышечного сокращения. Различные неблагоприятные условия (такие, как тепловой шок) могут приводить к денатурации актина и его последующей агрегации. Накопление агрегированного белка представляет серьезную угрозу для клетки и это особенно опасно в случае белков, представленных в большом количестве, - таких как актин. Для предотвращения формирования нерастворимых белковых агрегатов в клетке существуют различные механизмы, одним из которых является экспрессия малых белков теплового шока (sHSP).

sHSP - большая и гетерогенная группа белков с молекулярными массами от 12 до 43 кДа, характерной особенностью которых является наличие консервативного участка (а-кристаллинового домена) в С-концевой части. Многие sHSP образуют большие олигомерные комплексы, которые могут различаться по структуре и количеству мономеров. Было показано, что in vitro они могут функционировать как молекулярные шапероны и предотвращать агрегацию частично или полностью денатурированных белков, причем эта их способность зависит от четвертичной структуры sHSP. В клетках многие sHSP подвергаются фосфорилированию под действием различных протеинкиназ, что сопровождается изменением их олигомерного состояния и шаперонной активности.

К настоящему времени в литературе накоплен огромный материал о защитном действии sHSP на агрегацию различных белков-мишеней в процессе их денатурации. При этом, однако, конкретный молекулярный механизм такого шаперонного действия sHSP оставался зачастую совершенно неясным. Так, например, не было однозначного ответа на один из ключевых вопросов, связанных с молекулярным механизмом действия sHSP: влияют ли они на денатурацию белка-мишени, приводящую к его агрегации, или же лишь препятствуют агрегации частично или полностью денатурированного белка Многие авторы, наблюдая in vitro лишь подавление агрегации различных белков-мишеней малыми белками теплового шока, делали вывод о том, что sHSP препятствуют денатурации исследуемого белка, не имея на то достаточных оснований.

актином. Было показано, что в ответ на стресс зНБР могут перемещаться из цитозоля и локализоваться в области цитоскелета, причем такое перемещение может приводить к стабилизации актиновых филаментов. Исходя из этих данных, более вероятным кажется предположение, что бШР взаимодействуют с актином только при неблагоприятных условиях, таких как тепловой шок, но конкретный молекулярный механизм этого взаимодействия оставался до недавнего времени совершенно неясным. В частности, оставалось неясным, способны ли вШР взаимодействовать с нативными актиновыми филаментами и оказывать влияние на их денатурацию Все еще оставалось неизвестным, какую роль в защите актина от агрегации может играть фосфорилирование вШР и их олигомерное состояние. Выяснение этих вопросов и составило главную цель данной диссертационной работы

Цель и задачи работы. Итак, целью работы было детальное изучение защитного действия малых белков теплового шока на агрегацию актиновых филаментов, вызываемую их тепловой денатурацией. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1 Исследовать влияние эШР на тепловую денатурацию Р-актина.

2. Проанализировать процесс агрегации Р-актина при его тепловой денатурации в отсутствие и в присутствии вШР.

3. Сравнить шаперонные свойства нефосфорилированного малого белка теплового шока и его мутантной формы, имитирующей фосфорилирование.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Малые белки теплового шока эффективно защищают актиновые филаменты от агрегации, вызываемой тепловой денатурацией, но при этом они не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами и не оказывают влияния на сам процесс тепловой денатурации Р-актина.

2. Защита Р-актина от агрегации осуществляется путем образования небольших, стабильных и хорошо растворимых комплексов малых белков теплового шока с денатурированным актином.

3. Исходное олигомерное состояние малых белков теплового шока, определяемое, в частности, фосфорилированием этих белков или его имитацией, не оказывает существенного влияния на способность вНвР предотвращать агрегацию Р-актина в процессе его тепловой денатурации и образовывать небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином.

Научная новизна. Разработан новый подход на основе сочетания метода ДСК с измерениями температурных зависимостей светорассеяния для исследования взаимодействия бШР с Р-актином в процессе его тепловой денатурации. Впервые удалось

получить ответ на один из ключевых вопросов, связанных с молекулярным механизмом действия вНБР, - а именно выяснить, что они предотвращают тепловую агрегацию белка-мишени, но не препятствуют его тепловой денатурации, предшествующей агрегации. Установлено, что защита Р-актина от агрегации осуществляется путем образования небольших, стабильных и хорошо растворимых комплексов вНБР с денатурированным актином. При совместном использовании методов ДСК, динамического светорассеяния, седиментационного и флуоресцентного анализа проведены исследования свойств таких комплексов. Показано, что изменение исходного олигомерного состояния $Н8Р, вызываемое, в частности, фосфорилированием этих белков или его имитацией, не оказывает существенного влияния на способность эНБР образовывать небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином. Получены данные, впервые позволяющие описать механизм защиты актинового цитоскелета от аморфной агрегации, приводящей к гибели клеток при различных неблагоприятных воздействиях.

Научно-практическая ценность. Полученные данные расширяют и углубляют знания в области механизма, лежащего в основе шаперонной активности бШР, и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии. Разработанный нами экспериментальный подход - параллельное исследование тепловой денатурации и агрегации Р-актина, проводимое в одинаковых условиях и при одной и той же скорости прогрева в отсутствие и в присутствии бНБР, может использоваться (и уже успешно используется) для изучения взаимодействия бШР с другими белками-мишенями.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (г. Пущино-на-Оке Московской области, 2004; 2006; 2008), на XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2005» (г. Москва, 2005), на 33-й, 34-й и 35-й Европейских мышечных конференциях (о. Эльба, Италия, 2004; г. Дебрецен, Венгрия, 2005; г Гейдельберг, Германия, 2006), на 30-м Международном конгрессе РЕВБ (г. Будапешт, Венгрия, 2005), на 2-ой Международной конференции по проблемам стресса (г. Будапешт, Венгрия, 2007) и на конкурсе лучших научных работ, выполненных в Институте биохимии им А.Н. Баха РАН в 2005 г

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ (4 статьи в рецензируемых журналах и 10 тезисов).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (4 главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (145 источников). Диссертация изложена на 104 страницах, содержит 35 рисунков и 1 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

В обзоре литературы рассматриваются известные к настоящему моменту сведения о структуре и свойствах F-актина и малых белков теплового шока, а также анализируются имеющиеся в литературе данные о взаимодействии между этими белками.

Материалы и методы исследования

Актин выделяли из ацетонового порошка скелетных мышц и очищали двумя циклами полимеризации-деполимеризации. За час до использования мономерный G-актин полимеризовали, добавляя MgCl2 до конечной концентрации 2 мМ, и использовали в F-форме. Рекомбинантные малые белки теплового шока — Hsp25-wt (белок дикого типа), Hsp25-3D (мутант с имитацией фосфорилирования путем замены остатков серина в положениях 15, 77 и 81 на остатки аспарагиновой кислоты), Hsp27-wt, Hsp27-3D (мутант с имитацией фосфорилирования путем замены остатков серина в положениях 15, 78 и 82 на остатки аспарагиновой кислоты) и Hsp20 были любезно предоставлены профессором Н.Б. Гусевым (кафедра биохимии Биологического факультета МГУ им. М В. Ломоносова).

Калориметрические исследования проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (Институт биологического приборостроения РАН, г. Пущино) с капиллярными платиновыми ячейками объемом 0,47 мл. Все эксперименты проводили в буфере 30 мМ Hepes/KOH (рН 7,3), содержащем 1 мМ MgCl2 и 100 мМ NaCl (или КС1). Для получения кривых теплопоглощения препарат белка или смеси белков с концентрацией 0,5-3,0 мг/мл в соответствующем буфере помещали в ячейку прибора и прогревали со скоростью 1-2°С в минуту с 10 до 90°С при постоянном давлении 2,2 атм. Базовую линию записывали, помещая в рабочую и контрольную ячейки используемый в опыте буфер. Для проверки обратимости тепловой денатурации исследуемых белков, после первого сканирования и последующего охлаждения образцов проводили их повторное сканирование.

Для обработки и анализа кривых теплопоглощения изученных белков использовали пакеты программного обеспечения "Origin 1.16" и "Origin 7.0" фирмы "MicroCal" (США). Калориметрическую энтальпию (AHcai) определяли как площадь под пиком теплопоглощения.

Процесс тепловой агрегации F-актина контролировали, регистрируя температурные зависимости светорассеяния F-актина как в присутствии, так и в отсутствие sHSP. Светорассеяние измеряли на флуоресцентном спектрофотометре Сагу Eclipse (Varían), инкубируя образец при постоянной температуре 43°С или нагревая его с постоянной скоростью 1°С в минуту от 25°С до 75-90°С при скрещенных монохроматорах и длине волны 350 нм.

Одним из методов, используемых для характеристики формы и размера макромолекул в растворе, является аналитическое ультрацентрифугирование. Опыты по седиментации проводили на аналитической ультрацентрифуге «Beckman» модели Е. Образцы белков центрифугировали в роторе на 6 двухсекторных ячеек с использованием контрбаланса. Через определенные промежутки времени после достижения скорости вращения ротора 30000,40000 или 56000 об/мин регистрировали распределение вещества, поглощающего при 290 нм, по длине ячейки Для получения данных в цифровом виде было использовано программное обеспечение, разработанное А.Г. Жаровым (www.ADClab.ru) Для определения коэффициента седиментации и коэффициента диффузии использовали уравнение Ламма, моделирующее распределение вещества в секторной ячейке при ультрацентрифугировании. Для решения этого уравнения и анализа получаемых седиментограмм использовали программу SEDFIT

(http.//www.analyticalultracentrifugation.com)

Динамическое лазерное светорассеяние (ДЛС) широко используется для определения размеров наночастиц в анализируемой суспензии по измерению динамики флуктуаций (колебаний) интенсивности рассеянного света. Исследования проводили при помощи коммерческой установки фотометра рассеянного лазерного света Photocor (Photocor Instruments Inc., USA; www photocor com), с He-Ne лазером мощностью 10 мВт и длиной волны падающего света 632,8 нм. Сигнал светорассеяния от образца наблюдали под углом 90°. Температуру образца можно контролировать при помощи ПИД (пропорционально-интегрально-дифференциального) регулятора PhotoCor-TC, с точностью до ± 0,1°С; такой регулятор позволяет также осуществлять нагрев образца с постоянной скоростью. Анализ данных и контроль работы прибора выполняли с помощью программы PhotoCor версии 5 3.3. Анализ корреляционных функций для полидисперсных частиц проводили при помощи программного обеспечения DynaLS (Alango, Израиль), версия 2.5.2.

При центрифугировании на больших скоростях филаменты актина осаждаются. Если в растворе есть небольшие молекулы, способные связываться с актиновыми филаментами, то они также будут обнаруживаться в осадках вместе с ними. Следовательно, анализируя осадки и супернатанты после ультрацентрифугирования, можно делать выводы о способности небольших белков взаимодействовать с F-актином. Для проведения таких экспериментов по соосаждению использовали ультрацентрифугу Airfuge фирмы «Beckman» с ротором 18°. Подготовленные растворы белков объемом 100— 200 мкл центрифугировали в течение 20 минут при 140000 g. Затем отбирали супернатанты, а осадки суспендировали в буфере того же объема, что и исходный объем образца. Содержание белков в супернатантах и осадках анализировали при помощи SDS-электрофореза в полиакриламидном геле.

Белковый состав проб анализировали методом вертикального SDS-электрофореза по методу Лэммли. В работе использовали 13% и 15% разделяющие гели. Электрофорез проводили в камере Mini-Protean 3 Cell (Bio-Rad) при постоянном напряжении 200 В. Гель окрашивали раствором Кумасси R-250 Полученные гели сканировали, используя планшетный сканер Umax Astra 6700. Электрофореграммы обрабатывали с помощью программы ImageQuant 5.2.

Для изучения взаимодействия денатурированного актина с Hsp27-3D методом гель-фильтрации использовали колонку Superdex 200 HR 10/30 (хроматограф ACTA FPLC, Amersham Pharmacia Biotech). Для этого на колонку Superdex 200, уравновешенную буфером 30 мМ Hepes/KOH (pH 7,3), содержащим 1 мМ MgCl2 и 100 мМ NaCl, наносили растворы белков объемом 500 мкл и затем элюировали со скоростью 0,5 мл/мин.

Основные результаты и их обсуждение

Исследование процессов тепловой денатурации F-актина и малых белков теплового шока.

Известно, что температура максимума тепловой денатурации (Тт), измеряемая методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), для F-актина может варьировать в зависимости от условий проведения эксперимента, таких как концентрация белка, концентрация добавленных нуклеотидов и скорость прогрева, и находится в пределах 58-67°С. В природных условиях такая высокая температура может привести к гибели клетки. В работах, посвященных изучению функционирования живых организмов в условиях теплового шока, как правило, используют инкубацию при температурах 42-43°С.

Для того чтобы понять, как условия теплового шока влияют на актиновые филаменты, мы провели следующий эксперимент. F-актин в концентрации 1 мг/мл инкубировали при постоянной температуре 43°С, через разные периоды времени отбирая аликвоты и исследуя их методом ДСК. Для того, чтобы оценить долю денатурированного актина, мы из значения энтальпии (площади под кривой теплопоглощения) для нативного белка (ДНо = 411 кДж/моль) вычитали значения энтальпии прогретого белка для Рис. 1. Зависимости тепловой агрегации каждого момента времени, а затем

F-актина, измеренной по приросту . т,

^ полученные величины делили на ДЯ0.

светорассеяния, и доли денатурированного белка, измеренной методом ДСК, Параллельно с экспериментом по ДСК мы от времени инкубации F-актина при 43°С. g

—А— Доля - денатурированного белка - - - • Светорассеяние

100 си о Й ей

012345878 Время инкубации при 43ПС, часы

регистрировали процесс вызываемой денатурацией агрегации Р-актина, инкубируемого при 43°С, снимая зависимость светорассеяния от времени в непрерывном режиме. Мы сопоставили кривую агрегации и график увеличения доли денатурированного белка от времени (рис. 1), оказалось, что они очень хорошо коррелируют между собой. То есть, действительно, в условиях теплового шока актиновые филаменты вполне могут, подвергаться тепловой денатурации и последующей агрегации (хотя и довольно медленно)

Мы также провели серию контрольных экспериментов по исследованию тепловой денатурации различных эНЗР. В таблице 1 приведены основные калориметрические характеристики для различных бШР. Кооперативность тепловых переходов для всех малых белков теплового шока была невысокой. Полученные результаты хорошо согласуются с известными из литературы данными для некоторых бНБР.

Таблица 1. Характеристики тепловой денатурации различных вГОР, полученные методом ДСК

Белок T °C 1 m, Обратимость тепловой денатурации

а-кристаллин 60,3 -50%

Hsp27-wt 70,8 Полностью обратима

Hsp27-3D 70,0 Полностью обратима

Hsp20 63,6 Необратима

Hsp22 Плавится некооперативно

Помимо этого, провели сравнительный анализ тепловой денатурации Hsp27 дикого типа (Hsp27-wt) и его мутантной формы с заменой трех остатков серина в положениях 15, 78 и 82 на остатки аспарагиновой кислоты, в дальнейшем именуемого Hsp27-3D. Эти мутации, как было показано ранее, имитируют фосфорилирование Hsp27 под действием MAPKAP2 киназы, происходящее т vivo при воздействии неблагоприятных факторов и в условиях стресса. Нам не удалось обнаружить заметных различий в характере тепловой денатурации между Hsp27-wt и Hsp27-3D, что свидетельствует об отсутствии существенных различий в третичной структуре этих белков.

Для ответа на вопрос, способны ли sHSP влиять на процесс тепловой денатурации F-актина, мы воспользовались методом ДСК Для этого мы снимали кривые теплопоглощения F-актина в отсутствие и в присутствии различных sHSP; здесь представлен эксперимент с Hsp27-3D (рис. 2А). Максимум теплового перехода F-актина в отсутствие sHSP приходился на 62°С и его денатурация была полностью необратимой. При исследовании тепловой денатурации F-актина в присутствии sHSP были получены следующие результаты. Смесь F-актина и Hsp27-3D давала точно такую же калориметрическую кривую, что и изолированный актин, максимум теплового перехода F-актина не менял своего положения, а пик, соответствующий тепловой денатурации F-актина, не менял своей формы (рис. 2А). Исходя из этих результатов, мы можем сделать

вывод о том, что добавление малых белков теплового шока никак не влияет на тепловую денатурацию актиновых филаментов. Интересно, что на термограмме тепловой денатурации Р-актина в присутствии Нзр27-ЗБ пик, соответствующий денатурации самого 115р27-ЗП, никак не проявлялся (рис. 2А). Однако в случае денатурации Р-актина в присутствии Н5р25^ нам удалось заметить небольшой дополнительный тепловой переход при температурах выше 80°С. Не исключено, что взаимодействие с

денатурированным актином изменяет термостабильность малых белков теплового шока, защищая их от тепловой денатурации, которая происходит в этом случае при более высоких температурах и менее кооперативно.

Рис. 2. Температурные зависимости тепловой денатурации Р-актина, регистрируемом методом ДСК (А), и вызываемой ею агрегации, регистрируемой по приросту светорассеяния (Б). Изолированный Р-актин (1 мг/мл) (1), изолированный Шр27-30 (1 мг/мл) (2) и Р-актин (1 мг/мл) в присутствии Нзр27-30 (0,33 мг/мл) (3) прогревали с постоянной скоростью 1°С/мин и получали кривые тепловой денатурации или агрегации методами ДСК (А) или светорассеяния (Б).

Для анализа влияния вНБР на агрегацию

Р-актина, вызываемую его тепловой

денатурацией, мы одновременно с

изучением тепловой денатурации Р-актина методом ДСК исследовали температурные

зависимости светорассеяния в тех же самых условиях, используя те же самые растворы

белков, и с такой же скоростью прогрева. Результаты такого совместного эксперимента

представлены на рис. 2. Хорошо видно, что в отсутствие малых белков теплового шока Р-

актин начинает агрегировать при температурах выше 55°С, а видимая температура

полуперехода составляет приблизительно 62°С, что очень хорошо коррелирует с

максимумом теплового перехода на кривых ДСК. В присутствии же Нбр27-ЗВ начало

агрегации заметно смещается в сторону более высоких температур, вплоть до 80°С, а

полупереход - до ~85°С (рис. 2Б). Таким образом, нам удалось показать, что бНБР

эффективно защищают Р-актин от агрегации, вызываемой нагреванием, сдвигая кривую

температурной зависимости светорассеяния Р-актина в сторону более высоких температур.

Отметим, что добавление бНБР к пробе, содержащей предварительно прогретый

денатурированный и агрегированный Р-актин, не приводило к снижению уровня

светорассеяния. Это свидетельствует о том, что эН8Р препятствуют агрегации денатурированного белка, но не могут разбирать уже сформированные агрегаты.

Влияние малых белков теплового шока на агрегацию Е-актина, вызываемую нагреванием

Для того, чтобы более подробно изучить влияние вНЭР на агрегацию Р-актина, вызываемую нагреванием, мы провели серию экспериментов по изучению температурных

зависимостей светорассеяния Р-актина в отсутствие и в присутствии разных зНБР в различных концентрациях. Условия во всех экспериментах были одинаковыми (30 мМ Нереэ, 100 мМ КС1, 2 мМ р-МЭ, рН 7,3). Прогрев проводили со скоростью ГС/мин или 2°С/мин при концентрации актина, равной 0,25 или 1 мг/мл. Характерные результаты (на примере НБр27-ЗВ и Н5р27-\у1), представлены на рис. 3. В отсутствие малых белков теплового шока И-актин начинает агрегировать при температуре ~55°С, а наблюдаемая (кажущаяся) температура полуперехода составляет приблизительно 57сС, тогда как в присутствии БНвР температура начала агрегации заметно смещается в сторону более высоких значений, вплоть до 80°С, а кажущаяся температура полуперехода - до ~85°С.

К сожалению, за агрегацией Р-актипа следует процесс преципитации образуются огромные белковые агрегаты, которые оседают на дно кюветы. В результате при измерениях светорассеяния невозможно наблюдать полную кривую агрегации, и, следовательно, нельзя определить точные температуры полупереходов и коэффициенты кооперативное™ кривых. Тем не менее, на качественном уровне очень хорошо видно, что бНБР эффективно защищают Р-актин от агрегации, вызываемой нагреванием, сдвигая кривую температурной зависимости светорассеяния Р-актина в сторону более высоких температур

50 60 70 Температура, °С

Рис. 3. Зависимость светорассеяния Р-актина от температуры в отсутствие и в присутствии Шр27-\у( (А) или №р27-ЗВ (Б) в различных концентрациях Концентрация И-актина составляла 0,25 мг/мл (А) или 1 мг/мл (Б) Р-актин прогревали с постоянной скоростью 2°С/мин в отсутствие (кривая 1) или в присутствии Шр27 (кривые 2-4) Весовое соотношение Р-актин/Н5р27 составляло 12, 6 и 3 для кривых 2,3 и 4, соответственно

Необходимо отметить, что этот эффект довольно кооперативный, т. к. он наблюдается при достаточно высоких весовых соотношениях Р-актин/вНЭР. Для Нзр27-\У1 и Н$р27-30 тепловая агрегация актина подавлялась уже при весовом соотношении Р-актин/эНЗР, равном 12/1, что соответствует молярному соотношению Р-актин/вНБР, равном —6/1 (из расчета на мономеры белков). Важно добавить, что результаты, полученные для малых белков теплового шока дикого типа, не отличаются от результатов для их мутантов, имитирующих фосфорилирование этих белков (рис. 3). Таким образом, фосфорилирование вНБР (или его имитация) не оказывает, скорее всего, существенного влияния на их способность защищать актиновые филаменты от агрегации, вызываемой тепловой денатурацией актина.

Результаты описанных выше экспериментов наглядно свидетельствуют о том, что малые белки теплового шока не влияют на тепловую денатурацию Р-актина, но эффективно защищают денатурированный белок от последующей агрегации. Это наводит на мысль о том, что эти белки способны связываться лишь с денатурированным актином, но не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами. Для проверки этого предположения и выяснения механизма взаимодействия Р-актина с малыми белками теплового шока нами были проведены эксперименты по соосаждению этих белков с Р-актином после прогрева до определенных температур (рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграммы, представляющие распределение белков (актин и Нзр27-30) в супернатантах (с) и осадках (о) после прогрева Р-актина (1 мг/мл) в отсутствие (А) или в присутствии Нзр27-ЗР (0,33 мг/мл) (Б) до определенной температуры. В обоих случаях пробы прогревали со скоростью ГС/мин, при температурах 25, 75 и 90°С отбирали аликвоты, центрифугировали их в течение 15 мин при 140000g, после чего методом ЗОЭ-ПААГ-электрофореза определяли содержание актина и Нзр27-30 в осадках и супернатантах.

Препараты Р-актина (1 мг/мл) в отсутствие и в присутствии малых белков теплового шока прогревали с постоянной скоростью 1°С/мин в кюветах флуориметра, регистрируя зависимость светорассеяния от температуры. При определенных температурах отбирали аликвоты белковых проб, охлаждали их и подвергали ультрацентрифугированию при 140000§, после чего методом БОБ-электрофореза исследовали содержание актина и хНБР в осадках и супернатантах (рис. 4). Как и ожидалось, в отсутствие эНЗР нативные актиновые филаменты при комнатной температуре почти полностью обнаруживались в осадке. После прогрева до температуры 70°С и выше изолированный актин полностью денатурировал и агрегировал. Таким образом, в отсутствие эНЭР актин всегда обнаруживался в осажденной

25°С 70°С 90°С

фракции (рис. 4А). Затем мы исследовали соосаждение Р-актина с Н5р27-30 (0,33 мг/мл) Необходимо отметить, что сам по себе Н5р27-30, существующий главным образом в виде небольших димеров или тетрамеров, не агрегирует при тепловой денатурации и в условиях данного эксперимента не осаждается ни при комнатной температуре, ни после прогрева.

При комнатной температуре практически весь Н5р27-30 находился в супернатанте, а почти весь Р-актин - в осадке (рис. 4Б), то есть в разных фракциях. Это свидетельствует о том, что малые белки теплового шока не связываются с нативными актиновыми филаментами. После прогрева до 90°С как актин, так и Нзр27-30 обнаруживаются в осадке (рис. 4Б), это значит, что взаимодействие этих белков происходит после денатурации Р-актина. Этот результат вполне согласуется с современными представлениями о механизме работы малых белков теплового шока' они взаимодействуют с денатурированным белком-субстратом за счет гидрофобных контактов.

В этом же эксперименте был получен неожиданный интересный эффект - после прогрева до 70°С более 70% актина и почти весь Нзр27-30 одновременно обнаруживались в супернатанте (рис. 4Б). Полученные данные наводят на мысль о том, что после прогрева до 70-75°С малые белки теплового шока образуют с денатурированным актином комплексы, которые не осаждаются при кратковременном высокоскоростном центрифугировании. В этих комплексах актин присутствует уже не в виде филаментов Р-актина, которые полностью осаждаются при ультрацентрифугировании. Это вполне согласуется с предложенной недавно моделью тепловой денатурации Р-актина, согласно которой перед денатурацией происходит диссоциация актиновых филаментов на мономеры или короткие олигомеры. По-видимому, именно эти короткие олигомеры связываются с малыми белками теплового шока, которые защищают их от агрегации, - в результате образуются растворимые комплексы, не осаждающиеся при ультрацентрифугировании. Для исследования характеристик этих комплексов, таких как их размеры и стехиометрия, мы провели дополнительные исследования методами скоростной седиментации, гель-фильтрации и динамического светорассеяния.

Изучение свойств растворимых комплексов, образуемых малыми белками теплового шока с денатурированным актином.

Для более подробного исследования влияния малых белков теплового шока на агрегацию Р-актина, вызываемую его тепловой денатурацией, мы воспользовались рядом аналитических методов. В этой серии экспериментов мы использовали малый белок теплового шока НБр27-ЗВ. Наш выбор обусловлен тем, что этот белок существует в виде небольших однородных олигомеров (димеров или тетрамеров) - в отличие от Нзр27-\у1 и многих других бНЗР, которые формируют большие, неоднородные по размерам комплексы.

Метод динамического светорассеяния (ДЛС) хорошо применим для оценки размеров частиц, формируемых в процессе тепловой агрегации белка. Мы проводили эксперименты методом ДЛС в тех же условиях и при той же скорости прогрева, что и описанные выше эксперименты по тепловой денатурации, регистрируемой методом ДСК, за исключением того, что использовали более низкие концентрации Р-актина (0,5 мг/мл). В этих условиях денатурация Р-актина происходит в температурном интервале 55-70°С с максимумом теплового перехода при 61°С. До начала тепловой денатурации, то есть при температурах ниже 55°С, для Р-актина наблюдается широкое случайное распределение значений гидродинамического радиуса (Ль) - от 10 до 1000 нм (Рис. 5А и 6А). Определить точные значения Дь для длинных актиновых филаментов разного размера практически невозможно. В отсутствие малых белков теплового шока тепловая денатурация Р-актина приводит к образованию очень больших агрегатов со значениями вплоть до 10 мкм (рис. 6Б). Напротив, в присутствии Нбр27-ЗВ тепловая денатурация Р-актина сопровождалась полным исчезновением компонент с высокими значениями /?(,: мы наблюдали наличие лишь небольших частиц с —17 нм (Рис. 5А, 6Б). Размеры этих комплексов почти не менялись при прогреве вплоть до 80°С и увеличивались лишь при дальнейшем прогреве. Так, после прогрева до 84°С значение вырастало до 40-50 нм (рис 5А). Важно отметить,

что это значение ^ для комплексов не менялось после охлаждения до 25°С (Рис. 6Б) Этот факт имеет большое значение, так как говорит о том, что сформированные комплексы денатурированного актина с малыми белками теплового шока достаточно стабильны и уже не меняют своих размеров в зависимости от температуры и с течением времени.

Рис. 5. Формирование комплексов денатурированного актина с Шр27-30, регистрируемое методом ДЛС в процессе тепловой денатурации Б-актина (А) Р-актин (0,5 мг/мл) прогревали с постоянной скоростью 1°С/мин в присутствии №р27-30 (0,125 мг/мл) и строили температурную зависимость значений гидродинамического радиуса частиц (Яь), получаемых в процессе прогрева (Б) После того, как образец прогрели до 85°С, его остудили до 25°С и построили зависимость значений от времени инкубации при 25°С

30 40 50 60 70 80

0 1 2 3 4 5

Температура, °С Вре™ инкубации

при 25"С, мин

О О 00

О 00

Рнс. 6. Распределения частиц по размеру (Яь) для Р-актина (0,5 мг/мл) в отсутствие и в присутствии Н8р27-30 (0,125 мг/мл), зарегистрированные методом ДЛС до начала денатурации (при температуре 30-35°С) (А) и после полной тепловой денатурации Р-актина (при 70°С) (Б) Каждый график был получен как среднее значение из 10 распределений, полученных в температурном интервале 30-35°С на рис 5А (А) или 5 распределений, полученных в интервале 69-7 ГС (Б)

Сходные эксперименты с использованием метода ДЛС проводили в условиях, при которых Р-актин с постоянной концентрацией 0,5 мг/мл прогревали до 70°С в присутствии Нзр27-ЗВ при различных его концентрациях - от 0,015 до 0,5 мг/мл (рис. 7). Хорошо прослеживается зависимость размеров комплексов Яь от количества добавленного к образцу бИБР. Значения для комплексов Н5р27-30 с денатурированным актином уменьшаются от 53 до 16-17 нм с увеличением концентрации Нзр27-30 в пробе от 0,015 до 0,125 мг/мл и затем не меняются при дальнейшем увеличении концентрации Н5р27-30 вплоть до 0,5 мг/мл. Этот результат позволяет предположить, что комплексы денатурированного актина с Шр27-30 образуются при концентрациях Нзр27-30, превышающих 0,125 мг/мл, т. е. в тех случаях, когда весовое соотношение Нзр27-3О/актин превышает 1/4

Рис. 7. Зависимость значении Яи для комплексов

денатурированного актина с №р27-30 от концентрации Н8р27-30, добавленного в исходную 50 смесь Концентрация №р27-30 варьировала от 0,015 до 0,5 мг/мл, концентрация Р-актина была \40 постоянной и равной 0,5 мг/мл Средние значения 05

г> „зо

К|, рассчитывали из распределении, полученных методом ДЛС при температуре 70°С Для каждой 20 точки указаны весовые соотношения Нзр27-ЗО/актин в исходной смеси Н5р27-ЗЭ с Р-актиком ю

Итак, результаты, полученные методом ДЛС, отчетливо демонстрируют процесс формирования стабильных растворимых

1 32

Ч> 4 1 2 1 * •---|

00 01 02 03 04 05 П.ш27-ЗГ), мг/мл

комплексов денатурированного актина с Шр27-30. Размеры таких комплексов намного меньше, чем соответствующие значения для нативных актиновых филаментов и агрегатов актина, полученных в результате прогрева Р-актина в отсутствие малых белков теплового шока.

Отметим, что способ оценки размеров частиц из данных динамического светорассеяния имеет ряд определенных недостатков, один из которых - довольно низкая разрешающая способность метода. Поэтому для анализа свойств комплексов Н5р27-30 с денатурированным актином мы использовали гораздо более чувствительный метод аналитического ультрацентрифугирования.

Пробы, содержащие Р-актин (0,5 мг/мл) в отсутствие или в присутствии 1^27-30 в различных концентрациях (от 0,1 до 0,4 мг/мл), а также пробу, содержащую изолированный №р27-ЗВ (0,4 мг/мл), прогревали с постоянной скоростью ГС/мин до 75°С, то есть до полной необратимой денатурации актина, одновременно регистрируя кривые зависимости светорассеяния от температуры. Убедившись, что в отличие от Р-актина, исследуемого в отсутствие эНБР, для проб, содержащих смесь Р-актина и Нзр27-ЗЭ, не наблюдалось заметного увеличения светорассеяния, мы использовали эти образцы для экспериментов по аналитическому ультрацентрифугированию

Прогретый до 75°С Р-актин вследствие очень большого размера агрегатов осаждался еще на стадии разгона ротора, что не позволяло определить для него коэффициент седиментации. Для того, чтобы определить значения коэффициентов седиментации оставшихся полидисперсных образцов, мы воспользовались методом, предложенным Шуком. Разработанная им компьютерная программа вЕОРП позволяет выявить несколько компонентов, различающихся по величинам коэффициентов седиментации, и определить их относительное содержание Графики распределения компонентов с различным коэффициентами седиментации для комплексов, полученных путем прогрева Р-актина (0,5 мг/мл) до 75°С в присутствии Нзр27-ЗВ в различных концентрациях (0,4, 0,2 и 0,1 мг/мл), а также для прогретого в тех же условиях изолированного Нзр27-30 (0,4 мг/мл) представлены на рис. 8.

Анализ седиментации прогретого Н8р27-30 демонстрирует наличие нескольких составляющих. Основной пик распределения приходится на компоненту с коэффициентом седиментации 3,1 в; помимо нее в системе присутствуют еще две компоненты с максимумами 6,7 и 8,9 Э (Рис. 8Г) Этот результат хорошо согласуется с литературными данным, в которых показано, что нативный Н8р27-ЗЭ имеет коэффициент седиментации 2,7 Б, что соответствует димерам. Что касается распределения ф, ///0) для комплексов денатурированного актина с Няр27-30, то во всех случаях распределения были представлены набором плохо разрешенных пиков, коэффициенты седиментации которых зависели от концентрации добавленного Н5р27-ЗП. При самой низкой концентрации Нзр27-30 (0,1 мг/мл) образцы демонстрировали коэффициенты седиментации в пределах

10—45 S (рис 8 В). Увеличение концентрации Hsp27-3D в два раза, до 0,2 мг/мл, привело к практически полному исчезновению фракций с коэффициентами седиментации s > 30 S (рис. 8 Б). В этом случае распределение c(s, f/f0) представлено основным пиком с высокой амплитудой и максимумом при 21,6 S, и несколькими небольшими дополнительными пиками. Дальнейшее увеличение концентрации Hsp27-3D до 0,4 мг/мл привело к полному исчезновению компонент, имеющих коэффициенты седиментации выше 30 S, сужению распределения и сдвигу всей кривой в сторону более низких значений коэффициента седиментации (рис. 8А). Все распределения с(s, f/f0) для комплексов денатурированного актина с Hsp27-3D также содержат пик с максимумом при 3,0-3,2 S (рис. 8А-В). Этот пик

отражает, скорее всего, седиментацию димеров Hsp27-3D, не связавшихся с денатурированным актином. С увеличением концентрации Hsp27-3D в пробе увеличивается и амплитуда пика с максимумом в районе 3,2 S; что указывает на то, что количество свободного Hsp27-3D увеличивается с повышением концентрации

добавленного Hsp27-3D.

Рис. 8. Седиментационный анализ комплексов, образуемых Hsp27-3D с денатурированным актином Комплексы получали путем прогрева F-актина (0,5 мг/мл) до 75°С при постоянной скорости 1°С/мин в присутствии Hsp27-3D при разных его концентрациях 0,1 мг/мл (А), 0,2 мг/мл (Б) или 0,4 мг/мл (В) На плоте (Г) представлено распределение коэффициентов седиментации для изолированного Hsp27-3D (0,4 мг/мл), прогретого в тех же условиях, что и остальные образцы Ультрацентрифугирование образцов проводили при скорости вращения ротора 30000 об/мин и температуре 20°С. Рассчитывали дифференциальные распределения коэффициентов седиментации c(s, f/fo), на рисунках представлены одномерные распределения по параметру s

о 10 20 30 40 Коэффициент седиментации, S

Проанализировав эти результаты, можно сделать вывод, что в условиях эксперимента лишь часть Н$р27-ЗВ вовлекается в образование стабильных растворимых комплексов с денатурированным актином. Коэффициенты седиментации таких комплексов

находятся в пределах 8-40 Б со средним значением около 17-20 8, в зависимости от концентрации добавленного П5р27-30. Чем больше Н5р27-30 в пробе, тем компактнее выглядит распределение комплексов по коэффициентам седиментации и тем меньше среднее значение этих коэффициентов.

Зная общую концентрацию добавленного НБр27-30 и определив долю свободного Пяр27-30, мы могли бы вычислить количество 1Ьр27-30, включенного в комплексы с денатурированным актином, и таким образом оценить стехиометрию Н5р27-30/акти[| в этих комплексах. К сожалению, аналитическое ультрацентрифугирование не позволяет получить точные количественные данные о концентрации свободного Нзр27-30 в пробах. Для этой цели мы воспользовались методом гель-фильтрации.

Пробы для экспериментов по гель-фильтрации готовились так же, как и для экспериментов по аналитическому ультрацентрифугированию, за исключением использования более высоких концентраций белков. Р-актин (1,0 мг/мл) в отсутствие или в присутствии Нзр27-ЗВ в различных концентрациях (от 0,25 до 1 мг/мл), а также изолированный Нзр27-30 (0,5 мг/мл) прогревали с постоянной скоростью ГС/мин до 68°С, то есть до полной необратимой денатурации Р-актина. После охлаждения пробы подвергали ультрацентрифугированию (20 мин при 140000 §) для того, чтобы избавиться от белковых агрегатов. Супернатанты отбирали и использовали для эксперимента по гель-фильтрации. Профили элюции нанесенных образцов представлены на рис. 9А. Р-актин, прогретый до 68°С в отсутствие малых белков теплового шока, осаждался во время ультрацентрифугирования, поэтому на его профиле элюции никаких пиков не наблюдалось. В тех случаях, когда Р-актин прогревали в присутствии Нзр27-30, после проведения гель-фильтрационной хроматографии этих образцов на профилях элюции можно было обнаружить два пика (рис. 9А). Согласно данным 808-электрофореза, первые асимметричные пики, элюировавшиеся в исключенном объеме (8-10 мл), содержали в себе как актин, так и Нзр27-30. Это свидетельствует о том, что данные пики содержали растворимые комплексы, сформированные денатурированным актином и Нзр27-30.

Второй пик, элюировавшийся в районе 14,2 мл (кажущиеся молекулярные массы около 100 кДа), содержал только Нзр27-ЗП, т. е. этот пик соответствовал свободному Н5р27-30, не связавшемуся с денатурированным актином. Размер этого пика явно увеличивался с увеличением концентрации Нзр27-30, добавленного в пробу (рис. 9А). Для оценки концентрации свободного Н$р27-30, площади под соответствующими пиками элюции сопоставляли с площадью контрольного пика, полученного для Н$р27-30 (0,5 мг/мл), прогретого в отсутствие актина. Построив график зависимости концентрации Н5р27-30, связанного с денатурированным актином, от общей концентрации добавленного в пробу Н5р27-30, мы попытались определить стехиометрию сформированных комплексов. К сожалению, при постоянной концентрации Р-актина (24 мкМ) и концентрации Нзр27-30, меняющейся в пределах 0-44 мкМ, мы не смогли достичь

насыщения (Рис. 9Б) Поэтому мы провели сходный эксперимент, но в несколько иных условиях: теперь мы использовали постоянную концентрацию Н5р27-30, равную 1 мг/мл (-44 мкМ), и различные концентрации Р-актина - от 0,25 до 3 мг/мл (6-70 мкМ) (рис. 10)

Рис. 9. Анализ состава комплексов Н$р27-30 с денатурированным актином методом гель-фильтрации Комплексы были получены при постоянной концентрации Р-актина (1 мг/мл) и различных концентрациях Нзр27-30, как описано в тексте (А) Одинаковые количества (500 мкл) каждого образца наносили на колонку для гель-фильтрации Бирегдех 200 Ж 10/30 Кривая 1 соответствует профилю элюции изолированного Нзр27-30 (0,5 мг/мл) Кривые 2-4 соответствуют профилям элюции комплексов Нэр27-30 с денатурированным актином, полученных при концентрациях добавленного Нзр27-30, равных 1,0, 0,5 и 0,25 мг/мл, соответственно (Б) Зависимость молярной концентрации Нзр27-30, связавшегося с денатурированным актином, от молярной концентрации Н5р27-ЗЭ, добавленного в исходную пробу.

Как и в предыдущем случае, на профилях элюции наблюдали по два пика (рис 10А). Первый пик содержал комплексы денатурированного актина и Нвр27-30 (рис. 10Б), в то время как второй пик содержал только свободный Нвр27-30 (рис. 10В). Размеры второго пика, зависели от начальной концентрации Р-актина - количество свободного Н$р27-30 увеличивалось при уменьшении концентрации добавленного Р-актина; из этих данных вполне можно было извлечь количественную информацию об Нзр27-30, не связавшемся с актином. Как и в предыдущем эксперименте, сравнив площади под пиками элюции, соответствующими свободному Нвр27-30 (пики 3-7 на рис. 10А), с площадью контрольного пика, полученного для НБр27-30 (1,0 мг/мл), прогретого в отсутствие Р-актина (пик 2 на рис 10А), мы смогли определить концентрации свободного Шр27-30, не связавшегося с актином. Концентрации Н$р27-30, связавшегося с денатурированным актином, определяли путем вычитания концентрации свободного Н$р27-ЗВ из исходной концентрации добавленного в пробу Н5р27-30 Построив график зависимости концентрации связанного с актином Н5р27-ЗБ от молярного соотношения Р-актин/Нзр27-

Объем элюции, мл

0 10 20 30 40

Добавленный Нар27-30, мкМ

ЗЭ в исходной пробе (рис. ЮГ), мы обнаружили, что кривая выходит на плато при молярных соотношениях белков 1:1. Это значит, что в состав комплексов, полученных в условиях насыщения, актин и Нзр27-30 входят в приблизительно эквимолярных концентрациях.

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Объем элюции, мл

0.0 0.5 1.0 1.5 Г-а1сгии/1-кр27-3[) (моль/моль)

актин

3 4 5 6 7 2 1

НБр27-30

Рис. 10. Анализ состава комплексов Нзр27-30 с денатурированным актином методом гель-фильтрации. Комплексы были получены при постоянной концентрации Нэр27-30 (1 мг/мл) и различных концентрациях Р-актина путем прогрева проб до 70°С с постоянной скоростью 1°С/мин. (А) Кривые 1 и 2 соответствует профилям элюции изолированного Нзр27-30 (0,5 мг/мл), негретого (1) и прогретого до 70°С (2). Кривые 3-7 соответствуют профилям элюции комплексов Нзр27-30 с денатурированным актином, полученных при концентрациях р-актина 0,25, 0,5, 1,0, 2,0 и 3,0 мг/мл, соответственно. (Б) Электрофореграмма фракций, собранных с колонки при объеме элюции 8,5-9 мл. Номера дорожек соответствуют кривым на плоте (А). (В) Электрофореграмма фракций, собранных с колонки при объеме элюции 14 мл. Номера дорожек соответствуют кривым на плоте (А). (Г) Зависимость молярной концентрации Нзр27-30, связавшегося с денатурированным актином, от молярного соотношения Р-актин/Нзр27-30 в исходной пробе.

Анализируя описанные выше данные, можно предложить следующий многостадийный механизм взаимодействия Нзр27-ЗБ с денатурированным актином. Тепловой денатурации Р-актина предшествует его диссоциация, т.е. актиновые филаменты

денатурируют не целиком, а в виде небольших олигомеров, диссоциирующих с их концов.

Эти олигомеры актина легко подвергаются денатурации, которая в отсутствие эНЗР сопровождается аморфной агрегацией. Именно с такими денатурированными олигомерами актина и взаимодействует Н$р27-30, предотвращая их дальнейшую агрегацию путем образования относительно небольших стабильных растворимых комплексов (рис. 11).

Рис. 11. Схема, иллюстрирующая механизм предотвращения агрегации актина в процессе его тепловой денатурации путем образования комплексов с зНБР. Молекулы АДФ как в свободном состоянии, так и связанные с актиновыми мономерами, обозначены буквой «О». Штриховкой выделены актиновые мономеры или короткие олигомеры, отрывающиеся при нагревании с «-»-конца актинового филамента и способные присоединиться к «+»-концу того же или другого филамента.

Возникает вопрос - влияет ли исходное олигомерное состояние Нэр27 на его способность предотвращать агрегацию

денатурированного актина и образовывать с ним растворимые комплексы? Для ответа на этот вопрос мы провели сравнительный анализ процессов денатурации и агрегации Р-актина в присутствии Нвр27-30, представленного главным образом небольшими димерами или тетрамерами, и белка дикого типа Н8р27-\у1, существующего в виде крупных олигомеров.

Сравнение свойств комплексов, образуемых Шр27-30 и Н5р27-уу1 с денатурированным актином.

Для того чтобы проанализировать и сравнить влияние Н5р27-и4 и Н5р27-30 на агрегацию Р-актина в процессе его тепловой денатурации, мы провели ряд экспериментов по исследованию температурных зависимостей светорассеяния (рис. 12А), прогревая Р-актин в отсутствие и в присутствии Н5р27-\у( или Нэр27-30 в тех же условиях и с той же скоростью (1°С/мин), что и в предыдущих экспериментах с Нзр27-30. В отсутствие Нвр27 прогрев Р-актина сопровождался значительным приростом светорассеяния, отражающим агрегацию белка. Для проб, содержащих Р-актин и Нзр27-«'1 или его мутантную форму Нэр27-ЗВ, кривые зависимости светорассеяния от температуры не имеют переходов и практически не отличаются друг от друга (рис. 12А). Это свидетельствует о том, что оба

(+) Р-актин

.. / V0

»о^ °

щш

эти белка, несмотря на значительные различия в исходной олигомерной структуре, одинаково эффективно защищают Р-актин от агрегации, вызываемой его тепловой денатурацией.

Рис. 12. Температурные зависимости вызываемой тепловой денатурацией агрегации Р-актина, регистрируемой по приросту светорассеяния (А) и по изменениям величины гидродинамического радиуса определенной методом ДЛС (Б). Измерения температурных зависимостей светорассеяния (А) проводили при концентрации Р -актина 0,5 мг/мл в отсутствие (кривая /) и в присутствии 0,125 мг/мл №р27-ЗВ (кривая 2) или 0,125 мг/мл Н5р27-\\1 (кривая 3) Температурные зависимости Ли (Б) представлены для Р -актина (0,5 мг/мл) в присутствии Нэр27 ЗБ (0,125 мг/мл) (/) или Н8р27-\¥1 (0,125 мг/мл) (2) Все эксперименты проводили со скоростью нагрева 1°С/мин Вертикальная пунктирная линия соответствует температуре максимума теплового перехода для Р -актина (62°С)

Для более детального исследования процесса агрегации Р-актина в присутствии разных форм Нэр27 мы воспользовались методом ДЛС. Для этого исследовали температурные зависимости значений для образцов, содержащих Р-актин и либо НБр27-ЗЭ, либо Нзр27-\у1. Результаты эксперимента приведены на рис. 12Б. В обоих случаях до денатурации Р-актин демонстрировал хаотическое распределение значений Яь в очень широком диапазоне (от 10 нм до 1000 нм), а тепловая денатурация Р-актина сопровождалась полным исчезновением компонент с высокими значениями остались только небольшие частицы со значениями ~ 17— 18 нм как в случае Нзр27-ЗВ, так и в случае Нзр27-\У1 (рис. 12Б).

Мы также провели серию экспериментов по определению размеров комплексов, образованных денатурированным актином и Нвр27-\У1, в зависимости от концентрации добавленного Нзр27-\у1. На рис. 13 сопоставлены зависимости, полученные для Р-актина, прогретого в присутствии либо Няр27-\у1, либо 11зр27-30. Мы показали, что при значениях весового соотношения Нзр27/актин меньших или равных 1/4 кривая, соответствующая комплексам денатурированного актина с Н5р27-и,1, практически полностью совпадает с кривой для комплексов с Нзр27-ЗВ. При увеличении доли НБр27 в пробе оказалось, что значения комплексов с Н5р27-\у1 несколько превышают соответствующие значения для комплексов с Нзр27-ЗВ (при весовых соотношениях Н5р27/актин, равных 1/2 и 1/4,

----1 - 2 ............3 * / / / / У '. А 1 1 1

О ^ А оА * О А . о ^ а ж аа 4> 4аа° 1 „ о - о Ч4«." ^ 004 „° 4 °*о * * А О \ А Б А 1 о 2

30 40 50 60 70 80

Температура, °С

значения Яь составляли для Н5р27^ 18,8 и 18 нм, а для Н5р27-ЗЭ - 15,9 и 16,5 им, соответственно) Такое расхождение может быть следствием того, что при весовых соотношениях Н5р27/актин, превышающих 1/2, часть малых белков теплового шока остается несвязанной с денатурированным актином. Так как размеры олигомеров Нбр27-\у1 значительно превышают размеров димеров или тетрамеров Шр27-30, то эти свободные частицы могут давать дополнительный небольшой вклад в значения определяемые методом ДЛС

: I 1-32 —А— -Н5р27-30

■••О' Нэр27^

- .1 16

V1 8

к 14 1 2 1:1

—-1

0 2 04

зНБР, мг/мл

Рис. 13. Зависимость значений , измеренных методом ДЛС, для комплексов денатурированного актина с Н$р27-ЗВ или Нзр27-№Т от исходной концентрации Нзр27, добавленного в исходную смесь Концентрации НБр27 варьировали от 0,015 до 0,5 мг/мл, концентрация Р-актина была постоянной и составляла 0,5 мг/мл Для каждой точки указаны весовые соотношения Н5р27/Р-актин в исходных пробах Средние значения Яь рассчитывали из распределений, полученных при температуре 70°С в режиме прогрева с постоянной скоростью 1°С/мин

Таким образом, результаты экспериментов по динамическому светорассеянию свидетельствуют о том, что Н5р27-ш1, подобно его мутантной форме Н5р27-30, способен эффективно подавлять агрегацию денатурированного актина, образуя с ним небольшие растворимые комплексы.

Для более подробного сравнения свойств комплексов Нзр27-\у1 и Нзр27-ЗВ с денатурированным актином мы также использовали гораздо более чувствительный метод аналитического ультрацентрифугирования Для этих экспериментов мы использовали охлажденные пробы, полученные в экспериментах по светорассеянию (рис. 12А) Дифференциальные распределения коэффициентов седиментации для комплексов денатурированного актина с Н8р27-№Т или Н5р27-30 показаны на рис. 14. В используемых условиях (при весовом отношении Нзр27/актин, равном 1/4) коэффициенты седиментации комплексов денатурированного актина с Н5р27-30 распределялись в диапазоне 10-45 8, а максимум распределения находился в области 23 Б (рис 14). В случае комплексов денатурированного актина с Н5р27-\¥1 распределение 1з^*(5) смещено в сторону больших коэффициентов седиментации (от 18 до 60 Б), а его максимум составляет ~32 Б (рис. 14). Это свидетельствует о том, что комплексы, образованные денатурированным актином с

Нвр!?-1^, в среднем несколько крупнее, чем комплексы, образованные с Н5р27-30, При этом надо отметить, что большие олигомеры Н5р27-\У1 исходно имели коэффициенты седиментации -15 Б, что намного превосходит коэффициенты для изолированного Нзр27-30 (~ 3 Б).

Рис. 14 Седиментационный анализ комплексов Нзр27-«1 (7) или Нзр27-30 (2) с денатурированным актином, полученных в результате прогрева Б-актина (0,5 мг/мл) до 70°С в присутствии Нзр27-30 (0,125 мг/мл) или Нзр27-\у1 (0,125 мг/мл) и последующего охлаждения до 20°С Представлены дифференциальные распределения

коэффициентов седиментации ls*g(i).

Подводя итоги, следует отметить, что, несмотря на значительную разницу в исходном олигомерном состоянии, как Н5р27-30, так и Нзр27-\¥1 эффективно предотвращают агрегацию денатурированного актина, образуя с ним растворимые комплексы относительно небольшого размера. Это согласуется с данными литературы о том, что размеры комплексов, образуемых малыми белками теплового шока с частично или полностью денатурированными белками-мишенями, определяются главным образом свойствами этих белков, но мало зависят от исходного олигомерного состояния вНЭР. В то же время важно отметить, что средние размеры растворимых комплексов 1Ьр27 с денатурированным актином оказались несколько больше в случае Нвр27-\у1, чем в случае Н5р27-30 (рис. 14). В литературе уже высказывалось мнение о том, что большие олигомеры Нзр27 могут представлять собой некое «депо», а их диссоциация на более мелкие олигомеры является важным условием для проявления способности НБр27 предотвращать агрегацию частично или полностью денатурированных белков. Можно предположить, что подобная диссоциация происходит и в нашем случае, при взаимодействии Н8р27-\у[ с денатурированным актином. Она может быть обусловлена, например, появлением белка-субстрата - частично или полностью денатурированного актина. По всей видимости, относительно небольшие олигомеры, на которые диссоциируют крупные олигомеры Нбр27-\у1, все-таки существенно превышают по размерам те димеры или тетрамеры, которые образуются при фосфорилировании Нзр27 или при его имитации в случае Нзр27-30. Именно этим можно, по-видимому, объяснить наблюдаемую нами разницу между Нзр27-\у1 и Нзр27-30 в размерах растворимых комплексов, образуемых ими с денатурированным актином

Коэффициент седиментации, Э

выводы

1) Разработан новый экспериментальный подход к изучению влияния малых белков теплового шока (sHSP) на процессы денатурации и агрегации белков. Этот подход отработан на примере F-актина и включает параллельное исследование тепловой денатурации и агрегации F-актина, проводимое в одинаковых условиях и при одной и той же скорости прогрева в отсутствие и в присутствии sHSP.

2) Показано, что sHSP не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами и не оказывают влияния на их тепловую денатурацию.

3) Продемонстрировано, что sHSP эффективно подавляют агрегацию F-актина, индуцированную нагреванием.

4) Установлено, что подавление агрегации F-актина осуществляется путем образования небольших по размеру, растворимых комплексов sHSP с денатурированным актином. Определен ряд характеристик таких комплексов - гидродинамический радиус (15-25 нм), распределение по коэффициенту седиментации и кажущаяся молекулярная масса (-2000 кДа)

5) На примере малого белка теплового шока Hsp27, существующего в виде крупных олигомеров, и его мутантной формы Hsp27-3D, имитирующей фофорилированную форму Hsp27 и представленной димерами и тетрамерами, показано, что изменение исходного олигомерного состояния sHSP не оказывает существенного влияния на их способность предотвращать тепловую агрегацию F-актина и образовывать небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в репетируемых журналах:

1. Pivovarova A.V., Mikhailova V.V., Chernik I.S., Chebotareva N.A., Levitsky D.I. and Gusev N B. (2005) Effects of small heat shock proteins on the thermal denaturation and aggregation of F-actin. Biochem. Biophys Res. Commun 331, 1548-1553.

2. Pivovarova A.. Chebotareva N., Chernik I., Gusev N. and Levitsky D (2007) Small heat shock protein Hsp27 prevents heat-induced aggregation of F-actin by forming soluble complexes with denatured actin. FEBSJ, 274, 5937-5948.

3 Levitsky D I, Pivovarova A V . Mikhailova V V and Nikolaeva О P (2008) Thermal unfolding and aggregation of actin Stabilization and destabilization of actin filaments. FEBSJ, 275, 4280-4295.

4. Пивоварова A.B., Чеботарева H.А., Гусев Н.Б , Левицкий Д.И. (2008) Свойства комплексов, образуемых малыми белками теплового шока с денатурированным актином. Биофизика, т. 53, № 5, с 766-771.

Тезисы докладов:

1 Chernik I S , Mikhailova V V , Pivovarova A V . Levitsky D I, and Gusev N B. (2004) Protective effects of small heat shock proteins (sHSP) on the thermally induced aggregation of actin filaments Abstracts of International Symposium "Biological Motility" (Pushchino, Moscow region, 23 May-1 June 2004), p 78

2 Mikhailova V , Pivovarova A . Chernik I, Gusev N , and Levitsky D (2004) Small heat shock proteins prevent thermally induced aggregation, but not thermal denatuiation of aetm filaments J Muscle Res and Cell Motil, 2004, v 25,№3,p 251. (Abstracts of the 33rd European Muscle Conference, Isola d'Elba, Italy, 19-23 September 2004)

3 Пивоварова А В (2005) Малые белки теплового шока предотвращают агрегацию актина, денатурированного нагреванием Тезисы докладов XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2005» (Москва, 12-15 апреля 2005г)с 177-178

4 Pivovarova А V . Mikhailova V V , Chernik 1 S , Gusev N В , and Levitsky D I. (2005) Small heat-shock proteins prevent thermally induced aggregation of actin filaments by formation of soluble complexes with denatured actin TheFEBSJ,\ 272, SuppI l,p 356 (Abstracts of the 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference, Budapest, Hungary, 2-7 July 2005)

5 Mikhailova V , Pivovarova A . Chernik I, Chebotareva N., Gusev N , and Levitsky D (2005) A new insight into "dissociative" mechanism of the thermal unfolding of F-actin by using small heat shock proteins J Muscle Res and Cell Motil, v 26, № 1, p 79. (Abstracts of the 34th European Muscle Conference, Hortobagy, Hungary, 17-21 September, 2005)

6 Levitsky D I, Pivovarova A V. Mikhailova V V., Chebotareva N A , and Kurganov В I (2006) Thermal denaturation and aggregation of actin filaments Abstracts of Internationa! Symposium "Biological Motility Basic Research and Practice" (Pushchino, Moscow Region, May 11-15, 2006), p 29-30

7 Gusev N В , Bukach О V., Chernik I S , Pivovarova A V . and Levitsky DI (2006) Small heat shock proteins probable participation in regulation of muscle contraction Abstracts of International Symposium "Biological Motility Basic Research and Practice" (Pushchino, Moscow Region, May 11-15 2006), p 23-24

8 Pivovarova A , Mikhailova V , and_Levitsky D I (2006) Comparative studies on the thermal unfolding of G-actin and F-actin by using ANS fluorescence J Muscle Res Cell Motil, v 27, № 5-7, p 512 (Abstracts of 35lh European Muscle Conference, Heidelberg, Germany, 9-12 September 2006)

9 Pivovarova A V (2007) Small heat shock proteins effectively protect myosin S1 and F-actin from thermally induced aggregation Abstracts of the 2nd World Conference of Stress, (Budapest, Hungary, 23-26 August 2007), p 26

10 Levitsky D 1, Pivovarova A V . N A Chebotareva, N В Gusev (2008) Stable soluble complexes formed by small heat shock proteins with denatured actin Abstracts of International Symposium "Biological Motility. Basic Research and Practice " (Pushchino, Moscow Region, May 11-15, 2008), v l,p 39-40

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН

Заказ № 193/09/08 Подписано в печать 22 09 2008 Тираж 100 экз Уел пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 \vwwcfmi, e-mail-wfo@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пивоварова, Анастасия Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Актин

1.1. Строение G-актина

1.2. Полимеризация актина

1.3.F-aKTHH

1.4. Тепловая денатурация и агрегация актина

2. Малые белки теплового шока

2.1. Строение мономеров малых белков теплового шока

2.2. Сборка и структура олигомеров малых белков теплового шока

2.3. Фосфорилирование малых белков теплового шока

2.4. Шаперонная активность sHSP

3. Взаимодействие малых белков теплового шока с актином

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Препаративные методы

1.1. Выделение актина

1.1.1. Получение ацетонового порошка для выделения актина из скелетных мышц кролика

1.1.2. Выделение актина из ацетонового порошка

1.2. Определение концентрации белков

1.3. Полимеризация актина

2. Используемые методы исследования

2.1. Исследования термодинамических характеристик тепловой денатурации белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)

2.2. Исследование агрегации F-актина методом светорассеяния

2.3. Исследование белков и их комплексов методом скоростной седиментации

2.4. Динамическое лазерное светорассеяение (ДЛС)

2.5. Определение вязкости растворов

2.6. Аналитическое соосаждение

2.7. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS

2.8. Гель-фильтрация 41 . 2.9. Метод флуоресцентной спектроскопии

2.10. Электронная микроскопия

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование процессов тепловой денатурации F-актина и малых белков теплового шока

1.1. Денатурация F-актина в условиях теплового шока (при 43°С)

1.2. Калориметрические исследования малых белков теплового шока

1.3. Исследование влияния малых белков теплового шока на денатурацию F-актина методом ДСК

2. Влияние малых! белков теплового шока на агрегацию F-актина, вызываемую нагреванием

2.1. Исследование шаперонных свойств sHSP методом светорассеяния

2.2. Исследование влияния малых белков теплового шока на агрегацию F-актина с использованием флуоресцентных меток

2.3. Исследование взаимодействия sHSP с F-актином при разных температурах методом соосаждения

3. Изучение характеристик растворимых комплексов, образуемых малыми белками теплового шока с денатурированным актином

3.1. Исследование комплексов, образуемых Hsp27-3D с денатурированным актином, методом динамического светорассеяния

3.2. Исследование растворимых комплексов, образуемых Hsp27-3D с денатурированным актином, методом аналитического ультрацентрифугирования

3.3. Определение стехиометрии комплексов, образуемых Hsp27-3D с денатурированным актином, с использованием метода гель-фильтрации

4. Сравнение свойств комплексов, образуемых денатурированным актином с Hsp27-3D и с Hsp27-wt

4.1. Сравнение с использованием метода ДЛС

4.2. Сравнение с использованием метода аналитического ультрацентрифугирования

4.3. Электронные микрофотографии комплексов Hsp27-3D и Hsp27-wt с денатурированным актином

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию F-актина"

Актин — один из наиболее распространенных белков в природе. Образуемые им филаменты (F-актин) являются одним из основных компонентов цитоскелета эукариотических клеток, где содержание актина очень высоко (может достигать —2,5 мг/мл), а их взаимодействие с головками молекул миозина, сопряженное с гидролизом АТФ, лежит в основе мышечного сокращения. Различные неблагоприятные условия (такие, как тепловой шок) могут приводить к денатурации актина и его последующей агрегации. Накопление агрегированного белка представляет собой серьезную угрозу для жизнедеятельности клетки и это особенно опасно в случае белков, представленных в большом количестве, — таких как актин. Для предотвращения формирования нерастворимых белковых агрегатов в клетке существуют различные механизмы, одним из которых является экспрессия малых белков теплового шока (sHSP). sHSP — большая и гетерогенная группа белков с молекулярными массами от 12 до 43 кДа, характерной особенностью которых является наличие консервативного участка (так называемого а-кристаллинового домена) в С-концевой части. Многие из малых белков теплового шока образуют большие олигомерные комплексы, которые могут различаться по структуре и количеству мономеров. Было показано, что in vitro многие sHSP могут функционировать как молекулярные шапероны и предотвращать агрегацию частично или полностью денатурированных белков, причем эта их способность зависит от четвертичной структуры sHSP. В клетках многие sHSP подвергаются фосфорилированию под действием различных протеинкиназ, что сопровождается изменением их олигомерного состояния и шаперонной активности.

К настоящему времени в литературе накоплен огромный материал о защитном действии sHSP на агрегацию различных белков-мишеней в процессе их денатурации. При этом, однако, конкретный молекулярный механизм такого шаперонного действия sHSP оставался зачастую совершенно неясным. Так, например, не было однозначного ответа на один из ключевых вопросов, связанных с молекулярным механизмом действия sHSP: влияют ли они на денатурацию белка-мишени, приводящую к его агрегации, или же лишь препятствуют агрегации частично или полностью денатурированного белка. Многие авторы, наблюдая in vitro лишь подавление агрегации различных белков-мишеней малыми белками теплового шока, делали вывод о том, что sHSP препятствуют денатурации исследуемого белка, не имея на то достаточных оснований.

В ответ на различные неблагоприятные воздействия, такие как тепловой шок, экспрессия некоторых sHSP (аВ-кристаллин, Hsp27) значительно увеличивается, и их наибольшее количество обнаруживается именно в мышечных тканях, где содержание актина также очень велико. Можно предположить, что одна из функций таких sHSP заключается во взаимодействии с актином. В ряде исследований были сделаны попытки проанализировать взаимодействие некоторых sHSP (аВ-кристаллин, Hsp27, Hsp20) с нативными актиновыми филаментами. Результаты этих исследований, однако, весьма противоречивы и не подтверждают того, что sHSP могут связываться с нативным F-актином. Было показано, что в ответ на стресс sHSP могут перемещаться из цитозоля и локализоваться в области цитоскелета, причем такое перемещение может приводить к стабилизации актиновых филаментов. Исходя из этих данных, более вероятным кажется предположение, что sHSP взаимодействуют с актином только при неблагоприятных условиях, таких как тепловой шок, но конкретный молекулярный механизм этого взаимодействия оставался до недавнего времени совершенно неясным. В частности, оставалось неясным, способны ли sHSP взаимодействовать с нативными актиновыми филаментами и оказывать влияние на их денатурацию. Все еще оставалось неизвестным, какую роль в защите актина от агрегации может играть фосфорилирование sHSP и их олигомерное состояние. Выяснение этих вопросов и составило главную цель данной диссертационной работы.

Итак, целью работы было детальное изучение защитного действия малых белков теплового шока на агрегацию актиновых филаментов, вызываемую их тепловой денатурацией. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние sHSP на тепловую денатурацию F-актина.

2. Проанализировать процесс агрегации F-актина при его тепловой денатурации в отсутствие и в присутствии sHSP.

Научная новизна и практическая значимость.

Разработан новый подход на основе сочетания метода ДСК с измерениями температурных зависимостей светорассеяния для исследования взаимодействия sHSP с F-актином в процессе его тепловой денатурации. При помощи этого подхода показано, что малые белки теплового шока эффективно предотвращают агрегацию F-актина, вызываемую его тепловой денатурацией, но при этом не оказывают заметного влияния на сам процесс денатурации белка. Таким образом, впервые удалось получить ответ на один из ключевых вопросов, связанных с молекулярным механизмом действия sHSP, — а именно выяснить, что они влияют лишь на тепловую агрегацию белка, но не препятствуют тепловой денатурации белка, предшествующей агрегации. Методом соосаждения показано, что малые белки теплового шока связываются с актином лишь в процессе его тепловой денатурации, защищая F-актин от агрегации, но не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами. Установлено, что защита F-актина от агрегации осуществляется путем образования небольших, стабильных и хорошо растворимых комплексов sHSP с денатурированным актином. При совместном использовании методов ДСК, динамического лазерного светорассеяния (ДЛС), седиментационного и флуоресцентного анализа проведены исследования свойств таких комплексов. Показано, что размеры этих комплексов снижаются с повышением концентрации sHSP. В условиях насыщения, которое наступает при приблизительно эквимолярных исходных концентрациях sHSP и F-актина, гидродинамический радиус таких комплексов равен —16 нм, коэффициент седиментации - 17-20 S, а их молекулярная масса составляет около 2000 кДа. Показано, что изменение исходного олигомерного состояния sHSP, вызываемое, в частности, фосфорилированием этих белков или его имитацией, не оказывает существенного влияния на способность sHSP образовывать небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином. Полученные данные впервые позволяют описать механизм защиты актинового цитоскелета от аморфной агрегации, приводящей к гибели клеток при различных неблагоприятных воздействиях.

Полученные данные расширяют и углубляют знания в области механизма, лежащего в основе шаперонпой активности sHSP, и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии. Разработанный нами экспериментальный подход -параллельное исследование тепловой денатурации и агрегации F-актина, проводимое в одинаковых условиях и при одной и той же скорости прогрева в отсутствие и в присутствии sHSP, может использоваться (и уже успешно используется) для изучения взаимодействия sHSP с другими белками-мишенями.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Актин

Актин, один из основных белков сократительного аппарата мышц, является также основой структуры микрофиламентов (тонких нитей) цитоскелета эукариотических клеток, где его содержание очень высоко (может достигать —2,5 мг/мл). Впервые актин был открыт Штраубом в 1942 г. [Straub, 1942] как белок мышц, активирующий АТФазу миозина, что и определило его название. В настоящее время установлено, что актин является структурным белком любых клеток эукариот; более того, недавно в бактериях были найдены белки, гомологичные актину — РагМ и МгеВ. С актиповыми структурами цитоскелета связаны поддержание формы, движение и деление клеток, эндо- и экзоцитоз, передача медиаторов, свертывание крови, а также процессы, происходящие при дифференцировке клеток [Pollard, 1976; Egea et al., 2006; Malacombe et al., 2006]. Предполагается участие актинового цитоскелета в регуляции активности ионных каналов, передаче внутриклеточного сигнала в ядро, транспорте мРНК и транскрипции [Mazzocci et al., 2006; de Lanerolle and Cole, 2002; Miralles and Visa, 2006].

Важнейшей особенностью актина, определяющей его исключительное физиологическое значение, является способность к обратимой трансформации из глобулярного состояния (G-актин) в полимер (F-актин). В отличие от стабильных актиновых нитей сократительного аппарата мышц, микрофиламенты цитоскелета способны динамически собираться и разбираться в зависимости от потребностей клетки. Нарушение процессов полимеризации и деполимеризации актиновых филаментов может привести к нарушению жизнедеятельности клетки.

1.1. Строение G-актина

Актины образуют семейство белков, кодируемых отдельными генами. Гены актина весьма консервативны: максимальные различия в аминокислотных последовательностях актинов, выделенных из разных клеток и тканей, не превышают 10%. В клетках позвоночных синтезируется несколько изоформ актина, которые экспрессируются в разных тканях или на разных стадиях развития: а-изоформы из скелетных и сердечных мышц, а- и у-актин из гладких мышц, а также цитоплазматические р~ и у-изоформы [Хайтлина, 2007].

Молекула G-актина скелетных и сердечных мышц имеет молекулярную массу 42 кДа, размер 5,5 х 5,5 х 3,5 нм и кислую изоэлектрическую точку (5,4—5,5). G-актин состоит из одной поли пептид ной цепи, включающей 375 аминокислотных остатков, причем N-концевая аминокислота (Asp или Glu) ацетилирована [Rubenstetn, 1990]. Трехмерная структура мономера актина с разрешением 2,8 А впервые была получена в 1990 г. из данных рентгеноструктурного анализа кристаллов G-актина в комплексе с ДНКазой-I [Kabsch et aL, 1990]. По этим данным молекула актина состоит из двух хорошо различимых доменов, разделенных глубокой щелью (Рис. 1). Каждый домен состоит из двух субдоменов. Субдомен 1 сформирован N- и С-концевыми областями молекулы и состоит из пяти fi-слоев, окруженных пятью а-спиралями. Субдомен 2 сформирован тремя антипараллельными р-слоями. Первый и второй fi-слои соединены между собой петлей, ограниченной аминокислотными остатками 38-52, которая участвует в связывании ДНКазы-I [Kabsch et al„ 1990; Orlova and Egelman, 1995]. Субдомен 3 состоит из пяти fi-слоев, окруженных тремя а-спиралями. Субдомен 4 состоит из двух антипараллельных р-слоев и четырех а-спиралсй. Субдомены 1 и 2 образуют так называемый «малый» домен, который связан с «большим» доменом, образованным субдоменами 3 и 4, через шарнирный участок [Tinon and ben-Avraham, 1993]. В щели, разделяющей «большой» и «малый» домены, находится участок связывания ионов двухвалентных металлов и нуклеотид-связ ывающий центр. Как правило, молекула актина содержит прочно связанную АТФ (или АДФ), которая может свободно обмениваться с нуклеотидом в растворе или замещаться другими нуклеотидами, и двухвалентный катион (Са2+ или Mg2+).

Рнс.1. Трехмерная структура молекулы актина [Kabsch et al„ 1990] [mmdbld:47984]. В вертикальной щели между "большим" (слева) и "малым" (справа) доменами показано положение нукяеотида (АТФ) и двухвале(гпюго катиона (в виде шарика). Iсвязываюшая петля суадомен 3 сувд1)мен 1 субдомен 4 субдомен 2

Необходимо отметить, что молекула актина не принимает правильную конформацию самостоятельно. В сворачивании актина участвует несколько шаперонных белков, среди них - группа белков Ssb, префолдин, шаперонный комплекс ССТ [Fares and Wolfe, 2003; Martin-Benito et al., 2002].

По структурному строению G-актин относят к семейству белков-АТФаз, содержащих АТФ-связывающий участок. К этому семейству также относятся белок теплового шока HSP-70, гексокиназа, Агр2 и прокариотические актино-подобные белки МгеВ и РагМ. Все эти белки состоят из двух доменов, соединенных между собой шарнирным участком, в щели между которыми располагается нуклеотид-связывающий сайт. Для ряда белков из этого семейства было показано, что щель между доменами может менять свою конформацию: она закрывается, когда белок связывает нуклеотид (АТФ или АДФ) и остается открытой, если связывания не происходит [Flaherty et al., 1991]. К настоящему времени опубликовано более 25 кристаллических структур G-актина, полученных либо в его комплексах с различными белками и токсинами, либо при использовании актина, подвергнутого различным модификациям. Во всех случаях кроме одного, когда исследовали кристалл комплекса актина с профилином, нуклеотид-связывающая щель оказывалась в закрытом состоянии [Reisler and Egelman, 2007]. Структура актина, закристаллизованного в комплексе с профилином, имеет значительные отличия от остальных кристаллических структур, имеющих сходные конформации. Переход между открытым и закрытым состоянием щели сопровождается вращением большого домена относительно малого на ~9.6°, а также поворотом субдомена 2. При этом субдомены 1 и 2 ведут себя как две независимые единицы [Chik et al., 1996]. До сих пор остается открытым вопрос, к каким конформационным изменениям в молекуле актина приводит замена связанного нуклеотида с АТФ на АДФ. Анализируя литературные данные о взаимодействии актин-связывающих белков в растворе с G- и F-актином, содержащими АТФ или АДФ, можно сделать вывод, что нуклеотид оказывает существенное влияние на структуру актина .[Reisler and Egelman, 2007]. Сравнение кристаллических структур неполимеризуемой мутантной формы актина со связанными АТФ и АДФ не выявило, однако, существенной разницы в этих двух состояниях белка, за исключением локальных изменений в области связывания у-фосфата АТФ, а также в области петли, содержащей His-73 [Rould et al., 2006]. Возможно, условия кристаллизации влияют на состояние нуклеотид-связывающей щели, вызывая ее закрытие даже в отсутствие связанного нуклеотида. Таким образом, степень влияния нуклеотида на конформационное состояние актина остается неясной.

В щели между доменами также содержится центр связывания ионов двухвалентных металлов, причем сродство актина к Са2+ в несколько раз выше, чем к Mg2+ (Kd=2-8 iiM и 10-30 нМ для ионов Са и Mg, соответственно). Известно, что актин, содержащий Mg2+, менее подвержен протеолизу, чем Са2+-содержащий актин, а нуклеотид-связывающая щель между субдоменами 2 и 4 актина в случае Mg-АТФ находится в более закрытом состоянии, чем в случае Са-АТФ-актина [Strzelscka-Golaszewska et al., 1996; Takamoto et al., 2007]. Помимо прочно связанного катиона с молекулой актина могут слабо связаться 5-9 катионов (Kd=0,15 мМ для ионов Са или Mg и 10 мМ для ионов К). Связывание ионов с низкоафинными сайтами приводит к активации одного из самых важных процессов — полимеризации мономерного глобулярного актина с образованием нитей полимерного F-актина [Carlier, 1991].

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Пивоварова, Анастасия Викторовна

ВЫВОДЫ

3) Продемонстрировано, что sHSP эффективно подавляют агрегацию F-актина, индуцированную нагреванием.

4) Установлено, что подавление агрегации F-актина осуществляется путем образования небольших по размеру, растворимых комплексов sHSP с денатурированным актином. Определен ряд характеристик таких комплексов — гидродинамический радиус (15—25 нм), распределение по коэффициенту седиментации и кажущаяся молекулярная масса (-2000 кДа).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение подведем главные итоги проделанной работы.

Во-первых, сочетая метод ДСК с измерениями температурных зависимостей светорассеяния и флуоресценции зондов bis-ANS, ANS и ТНТ, мы подробно исследовали взаимодействие sHSP с F-актином в процессе его тепловой денатурации. Используя такой подход, нам удалось показать, что малые белки теплового шока эффективно предотвращают агрегацию F-актина, вызываемую его тепловой денатурацией, но при этом не оказывают влияния на сам процесс денатурации белка. Таким образом, впервые удалось получить ответ на один из ключевых вопросов, связанных с молекулярным механизмом действия sHSP, — а именно выяснить, что они влияют лишь на тепловую агрегацию белка-мишени, но не препятствуют тепловой денатурации белка, предшествующей агрегации. Более того, применив метод соосаждения, мы показали, что малые белки теплового шока не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами (и именно поэтому не влияют на тепловую денатурацию F-актина), однако они связываются с актином в процессе его тепловой денатурации, защищая F-актин от агрегации.

Во-вторых, благодаря использованию метода соосаждения, удалось установить, что защита F-актина от агрегации осуществляется путем образования небольших, стабильных и хорошо растворимых комплексов sHSP с денатурированным актином. Это наблюдение позволяет предположить, что в клетке sHSP создают своеобразное «хранилище» для частично или полностью денатурированных белков, в том числе и актина, которые затем могут подвергаться либо ренатурации при помощи набора других белков-шаперонов, либо, что наиболее вероятно, они расщепляются в протеосомомах и затем выбрасываются из клетки.

Более подробный анализ свойств растворимых комплексов малых белков теплового шока с денатурированным актином мы провели, применив сочетание методов ДЛС, седиментационного анализа и гель-фильтрации. Нам удалось показать, что размеры этих комплексов снижаются с повышением концентрации sHSP. В условиях насыщения, которое наступает при приблизительно эквимолярных исходных концентрациях sHSP и F-актина, гидродинамический радиус таких комплексов равен ~16 нм, коэффициент седиментации — 17—20 S, а их молекулярная масса составляет около 2000 кДа.

И, наконец, в-третьих, мы провели сравнение свойств комплексов денатурированного актина с малым белком теплового шока дикого типа (Hsp27-wt) и его мутантной формой, имитирующей фосфорилирование (Hsp27-3D). Нам удалось показать, что изменение исходного олигомерного состояния sHSP, вызываемое, имитацией фосфорилированием этих белков, не оказывает существенного влияния на способность sHSP образовывать небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином.

Принимая во внимание предложенный ранее диссоциативный механизм денатурации F-актина и анализируя данные, полученные в этой работе, мы впервые смогли описать механизм защиты актинового филаментов от агрегации, вызываемой его тепловой денатурацией. Этот механизм позволяет объяснить функцию sHSP в защите цитоскелета и всей клетки от повреждений, вызываемых накоплением больших нерастворимых аморфных агрегатов при неблагоприятных условиях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пивоварова, Анастасия Викторовна, Москва

1. Клюева А.В., Левчук Ю.Н., Набока Ю.Н. (2002) Фотонкореляционнаяспектроскопия белков. Укр. биохим, журн., 74, 12—26.

2. Левицкий Д.И. (2004) Применение метода дифференциальной сканирующейкалориметрии для структурно-функциональных исследований мышечных белков. Успехи биол. химии, 44, 133—170.

3. Левицкий Д.И., Николаева О.П., Орлов В.Н., Павлов Д.А., Пономарев М.А.,

4. Росткова Е.В. (1998) Дифференциальная сканирующая калориметрия миозина и актина. Биохимия, 63, 381—394.

5. Левицкий Д.И., Хайтлина С.Ю., Гусев Н.Б. (1995) Белки актомиозиновой системыподвижности. В кн.: «Белки и пептиды» (ред. Иванов В.Т., Липкин В.М.), М. Наука, том 1, с. 249-293.

6. Меремьянин А.В., Еронина Т.Б., Чеботарева Н.А., Клейменов С.Ю., Юдин И.К.,

7. Муранов К.О., Островский М.А., Курганов Б.И. (2007) Влияние альфа-кристаллина на тепловую агрегацию гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика. Биохимия, 72, 642-654.

8. Михайлова В.В., Курганов Б.И., Пивоварова А.В., Левицкий Д.И. (2006)

9. Диссоциативный механизм тепловой денатурации F-актина. Биохимия, 71, 1550-1560.

10. Остерман Л.А. (1981) «Методы исследования белков и нуклеиновых кислот.

11. Электрофорез и ультрацентрифугирование». М. Наука.

12. Панасенко, О.О., Ким, М.В., Гусев, Н.Б. (2003) Структура и свойства малыхбелков теплового шока. Успехи биол. химии, 43, 59—98.

13. Татунашвили Л.В., Привалов П.Л. (1984) Калориметрические исследованияденатурации G-актина. Биофизика, 29, 583-585.

14. Хайтлина С.Ю. (2007) Механизмы сегрегации изоформ актина в клетке.1. Цитология, 49, 345-354.

15. Benndorf R., Hayess K., Ryazantsev S., Wieske M., Behlke J. and Lutsch G. (1994)

16. Phosphorylation and supramolecular organization of murine small heat shock protein HSP25 abolish its actin polymerization-inhibiting activity. J. Biol. Chem. 269,20780-20784.

17. Berengian A.R., Bova M.P. and McHaourab H.S. (1997) Structure and function of theconserved domain in alphaA-crystallin. Site-directed spin labeling identifies a beta-strand located near a subunit interface. Biochemistry, 36, 9951-9957.

18. Bertazzon A. and Tsong T.Y. (1990) Effects of ions and pH on the thermal stability ofthin and thick filaments of skeletal muscle: high-sensitivity differential scanning calorimetric study. Biochemistry, 29, 6447—6452.

19. Blanchoin L, and Pollard T.D. (1999) Mechanism of interaction of Acanthamoebaactophorin (ADF/Cofilin) with actin filaments. J. Biol. Chem., 274, 1553815546.

20. Blanchoin L. and Pollard T.D. (2002) Hydrolysis of ATP by polymerized actin dependson the bound divalent cation but not profilin. Biochemistry, 41, 597—602.

21. Bobkov A.A., Muhlrad A., Pavlov D.A., Kokabi K., Yilmaz A. and Reisler E. (2006)

22. Cooperative effects of cofilin (ADF) on actin structure suggest allosteric mechanism of cofilin function. J. Mol. Biol., 356, 325—334.

23. Bombardier H., Wong P. and Gicquaud C. (1997) Effects of nucleotides on thedenaturation of F-actin: a differential scanning calorimetry and FTIR spectroscopy study. Biochem. Biophys. Res. Commun., 236, 798-803.

24. Boros S., Kamps В., Wunderink L., de Bruijn W., de Jong W.W., Boelens W.C. (2004)

25. Transglutaminase catalyzes differential crosslinking of small heat shock proteins and amyloid-beta. FEBS Lett., 576, 57-62.

26. Bova M.P., Huang Q., Ding L., Horwitz J. (2002) Subunit exchange, conformationalstability, and chaperone-like function of the small heat shock protein 16.5 from Methanococcus jannaschii. J. Biol. Chem., Ill, 38468—38475.

27. Bremer A., Henn C., Goldie K.N., Engel A., Smith P.R. and Aebi U. (1994) Towardsatomic interpretation of F-actin filament three-dimensional reconstructions. J. Mol. Biol., 242, 683-700.

28. Brophy C.M., Dickinson M. and Woodrum D. (1999) Phosphorylation of the small heatshock-related protein, HSP20, in vascular smooth muscles is associated with changes in the macromolecular associations of HSP20. J. Biol. Chem., 274, 6324-6329.

29. Brown P.H. and Schuck P. (2006) Macromolecular sizc-and-shape distributions bysedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Biophys. J., 90, 46514661.

30. Bryantsev A.L., Loktionova S.A., llyinskaya O.P., Tararak E.M., Kampinga H.H.,

31. Kabakov A.E. (2002) Distribution, phosphorylation, and activities of Hsp25 in heat-stressed H9c2 myoblasts: a functional link to cytoprotection. Cell Stress Chaperones, 7, 146-155.

32. Bukach O.V., Marston S.B. and Gusev N.B. (2005) Small heat shock protein withapparent molecular mass 20 kDa (Hsp20, HspB6) is not a genuine actin-binding protein. J. Muscle Res. Cell. Motil., 26, 175-191.

33. Cao W., Goodarzi J.P., De La Cruz E.M. (2006) Energetics and kinetics of cooperativecofilin-actin filament interactions. J. Mol. Biol., 361, 257—267.

34. Carlier M. (1991) Actin: protein structure and filament dynamics. J. Biol. Chem., 266,1.4.

35. Carlier M.F. (1998) Control of actin dynamics. Curr. Opin. Cell Biol., 10, 45-51.

36. Chang Z., Primm T.P., Jakana J., Lee I.H., Serysheva I., Chiu W., Gilbert H.F. and

37. Quiocho F. A. (1996) Mycobacterium tuberculosis 16-kDa antigen (Hspl6.3) functions as an oligomeric structure in vitro to suppress thermal aggregation. J.Biol. Chem., 271, 7218-7223.

38. Chernik I.S., Panasenko O.O., Li Y, Marston S.B. and Gusev N.B. (2004) pH-inducedchanges of the structure of small heat shock proteins with molecular mass 24/27 kDa (HspBl). Biochem. Biophys. Res. Commun., 324, 1199-1203.

39. Chik J.K., Lindberg U. and Schutt C.E. (1996) The structure of an open state of p-actinat 2.65 A resolution. J. Mol. Biol., 263, 607-623.

40. Chowdary Т.К., Raman В., Ramakrishna T. and Rao C.M. (2004) Mammalian Hsp22 isa heat-inducible small heat-shock protein with chaperone-like activity. Biochem. J., 381, 379-387.

41. Combeau C. and Carlier M-F. (1988) Probing the mechanism of ATP hydrolysis on Factin using vanadate and the structural analogs of phosphate BcF3" and AIF4". J. Biol. Chem., 263, 17429-17436.

42. Creighton Т.Е. (1993) Proteins. Structures and Molecular Properties. WH Freeman &1. Co, New York.

43. Dalle-Donne I., Rossi R., Milzani A., Di Simplicio P. and Colombo R. (2001) The actincytoskeleton response to oxidants: from small heat shock protein phosphorylation to changes in the redox state of actin itself. Free Radic. Biol. Med., 31, 1624-1632.

44. Das K.P., Surewicz W.K. (1995) Temperature-induced exposure of hydrophobicsurfaces and its effect on the chaperone activity of alpha-crystallin. FEBS Lett., 369,321-325.

45. Dedova I.V., Nikolaeva O.P., Mikhailova V.V., dos Remedios C.G. and Levitsky D.I.2004) Two opposite effects of cofilin on the thermal unfolding of F-actin: a differential scanning calorimetric study. Biophys. Chem., 110, 119—128.

46. Dos Remedios C.G., Chhabra D., Kekic M., Dedova I.V., Tsubakihara M., Berry D.A.and Nosworthy N.J. (2003) Actin binding proteins: regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiol. Rev., 83, 433—473.

47. Dudich I.V., Zav'yalov V.P., Pfeil W., Gaestel M., Zav'yalova G.A., Denesyuk A.I. and

48. Korpela T. (1995) Dimer structure as a minimum cooperative subunit of small heat-shock proteins, Biochim. Biophys. Acta, 1253, 163—168.

49. Egea G., Lazaro-Di6guez F. and Vilella M. (2006) Actin dynamics at the Golgi complexin mammalian cells. Curr. Opin, Cell. Biol., 18, 168—178.

50. Ehrnsperger M., Graber S., Gaestel M. and Buchner J. (1997) Binding of non-nativeprotein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. EMBO J., 16, 221-229.

51. Ehrnsperger M., Lilie H., Gaestel M., Buchner J. (1999) The dynamics of Hsp25quaternary structure. Structure and function of different oligomeric species. J. Biol. Chetn., 274, 14867-14874.

52. Fares M.A. and Wolfe K.H. (2003) Positive selection and subfunctionalization ofduplicated CCT chaperonin subunits. Mol. Biol Evol, 20, 1588-1597.

53. Farnsworth P.N. and Singh K. (2000) Self-complementary motifs (SCM) in alphacrystallin small heat shock proteins. FEBSLett., 482, 175-179.

54. Feil 1.К., Malfois M., Hendle J., van Der Zandt H. and Svergun D.I. (2001) A novelquaternary structure of the dimeric alpha-crystallin domain with chaperone-like activity. J. Biol. Chem., 276, 12024-12029.

55. Flaherty K.M., McKay D.B., Kabsh W. and Holmes K.C. (1991) Similarity of the threedimensional structures of actin and the ATPase fragment of a 70-kDa heat shock cognate protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88, 5041-5045.

56. Franck E., Madsen O., van Rheede Т., Ricard G., Huynen M.A. and de Jong W.W.2004) Evolutionary diversity of vertebrate small heat shock proteins. J. Mol. Evol 59, 792-805.

57. Galkin V.E., Van Loock M.S., Orlova A. and Egelman E.H. (2002) A new internalmode in F-actin helps explain the remarkable evolutionary conservation of actin's sequence and structure. Curr. Biol., 12, 570—575.

58. Ganea E. (2001) Chaperone-like activity of alpha-crystallin and other small heat shockproteins. Curr. Protein. Pept. Sci., 2, 205-225.

59. Gesierich U. and Pfeil W. (1996) The conformation stability of a-crystallin is ratherlow: Calorimetric results. FEBS Lett., 393, 151-154.

60. Golub N., Meremyanin A., Markossian K., Eronina Т., Chebotareva N., Asryants R.,

61. Muronets V. and Kurganov B. (2007) Evidence for the formation of start aggregates as an initial stage of protein aggregation. FEBS Lett., 581, 4223— 4227.

62. Groenning M., Olsen L., van de Weert M., Flink J.M., Frokjaer S., and Jorgensen F.S.2007) Study on the binding of thioflavin T to P-sheet-rich and non- P-sheet cavities. J.Struct. Biol. 58, 358-369.

63. Haley D.A., Horwitz J. and Stewart P.L. (1998) The small heat-shock protein, alphaBcrystallin, has a variable quaternary structure. J. Mol. Biol., 277, 27-35.

64. Haslbeck M., Walke S., Stromer Т., Ehrnsperger M., White H. E., Chen S., Saibil H.Rand Buchner J. (1999) Hsp26: a temperature-regulated chaperone. EMBO J., 18, 744-751.

65. Hennessey E.S., Drummond D.R. and Sparrow J.C. (1993) Molecular genetics of actinfunction. Biochem. J., 291, 657—671.

66. Holmes K.C., Popp D., Gebhard W. and Kabsch W. (1990) Atomic model of the actinfilament. Nature, 347, 44-^19.

67. Horwitz J., Huang Q. and Ding L. (2004) The native oligomeric organization of alphacrystallin: is it necessary for its chaperone function? Exp. Eye Res., 79, 817—821.

68. Hozumi T. (1990) A hydrophobicity on skeletal muscle actin molccule modulated bynucleotide binding at a second site. Biochem. Int., 20, 45—51.

69. Huot J., Houle F., Spitz D.R. and Landry J. (1996) HSP27 phosphorylation-mediatedresistance against actin fragmentation and cell death induced by oxidative stress. Cancer Res., 56, 273-279.

70. Ingolia T.D. and Craig E.A. (1982) Four small Drosophila heat shock proteins arerelated to each other and to mammalian alpha-crystallin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,19, 2360-2364.

71. Kabsch W., Mannherz H.G., Suck D., Pai E.F. and Holmes K.C. (1990) Atomicstructure of the actin:DNase I complcx. Nature, 347, 37-44.

72. Kappe G., Franck E., Verschuure P., Boclcns W.C., Leunissen J.A. and de Jong W.W.2003) The human genome encodes 10 alpha-crystallin-related small heat shock proteins: HspBl-10. Cell Stress Chaperones, 8, 53—61.

73. Kasai M., Nakano E. and Oosawa F. (1965) Polymerization of actin free of nucleotidesand divalent cation. Biochim. Biophys. Acta, 94, 494—503.

74. Kasakov A.S., Bukach O.V., Seit-Nebi A.S., Marston S.B. and Gusev N.B. (2007)

75. Effect of mutations in the beta5-beta7 loop on the structure and properties of human small heat shock protein HSP22 (HspB8, Hll). FEBS J., 274, 56285642.

76. Khaitlina S.Y., Moraczewska J. and Strzeleeka-Golaszewska H. (1993) The actin/actininteractions involving the N terminus of the DNase-I-binding loop are crucial for stabilization of the actin filament. Eur. J. Biochem., 218, 911-920.

77. Kim K.K., Kim R. and Kim S.H. (1998) Crystal structure of a small heat-shock protein.1. Nature, 394, 595-599.

78. Kinosan H.J., Selden L.A., Estes J.E. and Gershman L.C. (1993) Actin Filamentannealing in the presence of ATP and phalloidin. Biochemistry, 32, 12353— 12357.

79. Koh T.J. and Escobedo J. (2004) Cytoskeletal disruption and small heat shock proteintranslocation immediately after lengthening contractions. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 286, C713-722.

80. Кокке B.P., Leroux M.R., Candido E.P., Boelens W.C. and de Jong W.W. (1998)

81. Caenorhabditis elegans small heat-shock proteins Hspl2.2 and Hspl2.3 form tetramers and have no chaperone-like activity. FEBSLett., 433, 228—232.

82. Kurganov B.I., Kornilaev B.A., Chebotareva N.A., Malikov V.P., Orlov V.N., Lyubarev

83. A.E. and Livanova N.B. (2000) Dissociative mechanism of thermal denaturation of rabbit skeletal muscle glycogen phosphorylase b. Biochemistry, 39, 13144— 13152.

84. Kuznetsova I.M., Biktashev A.G., Khaitlina S.Y., Vassilenko K.S., Turoverov K.K. and

85. Uversky V.N. (1999) Effect of self-association on the structural organization of partially folded proteins: inactivated actin. Biophys. J., 77, 2788-2800.

86. Kuznetsova I.M., Khaitlina S.Y., Konditerov S.N., Surin A.M. and Turoverov K.K.1988) Changes of structure and intermolecular mobility in the course of actin denaturation. Biophys. Chem., 32, 73—78.

87. Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. and Uversky V.N. (1999) Inactivated actin, anaggregate composed of partially-folded monomers, has an overall native-like packing density. Protein Peptide Lett., 6, 173—178.

88. Lambert H., Charette S.J., Bernier A.F., Guimond A. and Landry J. (1999) HSP27multimerization mediated by phosphorylation-sensitive intermolecular interactions at the amino terminus. J. Biol. Chem., 274, 9378—9385.

89. Lavoie J.N., Hickey E., Weber L.A. and Landry J. (1993) Modulation of actinmicrofilament dynamics and fluid phase pinocytosis by phosphorylation of heat shock protein 27. J. Biol. Chem., 268, 24210-24214.

90. Le Bihan T. and Gicquaud C. (1993) Kinetic study of the thermal denaturation of Gactin using differential scanning calorimetry and intrinsic fluorescence spectroscopy. Biochem. Biophys. Res. Commun., 194, 1065—1073.

91. Lebowitz J., Lewis M.S. and Schuck P. (2002) Modern analytical ultracentrifugation inprotein science: a tutorial review. Protein Sci., 11, 2067—2079.

92. Lelj-Garolla B. and Mauk A.G. (2006) Self-association and chaperone activity of Hsp27are thermally activated. J. Biol. Chem., 281, 8169-8174.

93. Leroux M.R., Melki R., Gordon В., Batelier G. and Candido E.P. (1997) Structurefunction studies on small heat shock protein oligomeric assembly and interaction with unfolded polypeptides. J. Biol. Chem., 272, 24646-24656.

94. Levitsky D.I., Pivovarova A.V., Mikhailova V.V. and Nikolaeva O.P. (2008) Thermalunfolding and aggregation of actin. Stabilization and destabilization of actin filaments. FEBSJ., 275, 4280-4295.

95. Lindner R.A., Carver J.A., Ehrnsperger M., Buchner J., Esposito G., Behlke J., Lutsch

96. G., Kotlyarov A. and Gaestel M. (2000) Mouse Hsp25, a small shock protein. The role of its C-terminal extension in oligomerization and chaperone action. Eur. J. Biochem., 267, 1923-3192.

97. Lorenz M., Popp D. and Holmes K.C. (1993) Refinement of the F-actin model against

98. X-ray fiber diffraction data by the use of a directed mutation algorithm. J. Mol. Biol, 234, 826-836.

99. Lorinczy D., Konczol F., Gaszner B. and Belagyi J. (1998) Structural stability of actinfilaments as studied by DSC and EPR. Thermochim. Acta, 322, 95-100.

100. MacRae Т.Н. (2000) Structure and function of small heat shock/alpha-crystallinproteins: established concepts and emerging ideas. Cell Mol. Life Sci., 57, 899— 913.

101. Malacombe M., Bader M.F. and Gasman S. (2006) Exocytosis in neuroendocrine cells:new tasks for actin. Biochim. Biophys. Acta., 1763, 1175—1183.

102. Markov D.I., Pivovarova A.V., Chernik I.S., Gusev N.B. and Levitsky D.I. (2008) Smallheat shock protein Hsp27 protects myosin SI from heat-induced aggregation, but not from thermal denaturation and ATPase inactivation. FEBS Lett., 582, 1407— 1412.

103. Martin-Benito J., Boskovic J., Gomez-Puertas P., Carrascosa J.L., Simons C.T., Lewis

104. S.A., Bartolini F., Cowan N.J. and Valpuesta J.M. (2002) Structure of cukaryoticprefoldin and of its complexes with unfolded actin and the cytosolic chaperonin CCT. EMBOJ., 21, 6377-6386.

105. Mazzocci C., Benos D.J. and Smith P.R. (2006) Interaction of epithelial ion channelswith actin-based cytoskeleton. Amer. J. Physiol. Renal. Physiol., 291, F1113-F1122.

106. Melkani G.C., Cammarato A. and Bernstein S.I. (2006) ocB-Crystallin maintains skeletalmuscle myosin enzymatic activity and prevents its aggregation under heat-shock stress. J. Mol. Biol., 358, 635-645.

107. Merck K.B., De Haard-Hoekman W.A., Oude Essink B.B., Bloemendal H. and De Jong

108. W.W. (1992) Expression and aggregation of recombinant alpha A-crystallin and its two domains. Biochim. Biophys. Acta, 1130, 267—276.

109. Michaud S., Marin R. and Tanguay R. M. (1997) Regulation of heat shock geneinduction and expression during Drosophila development. Cell Mol. Life Sci. 53, 104-113.+

110. Miralles F. and Visa N. (2006) Actin in transcription and transcription regulation. Curr.

111. Opin. Cell Biol., 18, 261-266.

112. Miron Т., Vancompernolle K., Vandekerckhove J., Wilchek M. and Geiger B. (1991) A25.kD inhibitor of actin polymerization is a low molecular mass heat shock protein. J. Cell. Biol., 114, 255-261.

113. Mounier N. and Arrigo A-P (2002) Actin cytoskeleton and small heat shock proteins:how do they interact? Cell Stress Chaperones 7, 167—176.

114. Narberhaus F. (2002) Alpha-crystallin-type heat shock proteins: socializingminichaperones in the context of a multichaperone network. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66, 64-93.

115. Nikolaeva O.P., Dedova I.V., Khvorova I.S. and Levitsky D.I. (1994) Interaction of Factin with phosphate analogues studied by differential scanning calorimetry. FEBSLett., 351, 15-18.

116. Nolen В J. and Pollard T.D. (2007) Insights into the influence of nucleotides on actinfamily proteins from seven structures of Arp2/3 complex. Mol. Cell., 26, 449— 457.

117. Oda Т., Namba K. and Maeda Y. (2005) Position and orientation of phalloidin in F-actindetermined by X-ray fiber diffraction analysis. Biophys. J., 88, 2727—2736.

118. Orlova A. and Egelman E.H. (1993) A conformational change in the actin subunit canchange the flexibility of the actin filament. J. Mol. Biol., 232, 334-341.

119. Orlova A. and Egelman E.H. (1995) Structural dynamics of F-actin: I. Changes in the Сterminus. J. Mol. Biol., 245, 582-597.

120. Panasenko O.O., Kim M.V., Marston S.B. and Gusev N.B. (2003) Interaction of thesmall heat shock protein with molecular mass 25 kDa (hsp25) with actin. Eur. J. Biochem., 270, 892-901.

121. Panasenko O.O., Seit Nebi A., Bukach O.V., Marston S.B. and Gusev N.B. (2002)

122. Structure and properties of avian small heat shock protein with molecular weight 25 kDa. Biochim. Biophys. Acta, 1601, 64-74.

123. Philo J.S. (2006) Is any measurement method optimal for all aggregate sizes and types?1. AAPSJ., 8, E564—571.

124. Photon Correlation and Light Beating Spectroscopy (1974) (Cummins, H. Z. and Pike,

125. E. R., Eds) Plenum, New York.

126. Plater M. L., Goode D. and Crabbe M.J. (1996) Effects of site-directed mutations on thechaperone-like activity of alphaB-crystallin. J. Biol. Chem., 271, 28558-28566.

127. Plater M.L., Goode D. and Crabbe M.J. (1996) Effects of site-directed mutations on thechaperone-like activity of alphaB-crystallin. J. Biol. Chem., 271, 28558-28566.

128. Pollard T.D. (1976) The role of actin in the temperature-dependent gelation andcontraction of extracts of Acanthamoeba. J Cell. Biol., 68, 579-601.

129. Privalov P.L. and Potekhin S.A. (1986) Scanning microcalorimetry in studyingtemperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol., 131, 4-51.

130. Raman В., Ramakrishna T. and Rao C.M. (1995) Temperature dependent chaperonelike activity of alpha-crystallin. FEBS LettX 365, 133-136.

131. Reddy G.B., Das K.P., Petrash J.M. and Surewicz W.K. (2000) Temperature-dependentchaperone activity and structural properties of human alphaA- and alphaB-crystallins. J. Biol. Chem., 275, 4565-4570.

132. Reisler E. and Egelman E.H. (2007) Actin structure and function: what we still do notunderstand. J. Biol. Chem., 282, 36133-36137.

133. Rogalla Т., Ehrnsperger M., Preville X., Kotlyarov A., Lutsch G., Ducasse C., Paul C.,

134. Wieske M., Arrigo A. P., Buchner J. and Gaestel M. (1999) Regulation of Hsp27 oligomerization, chaperone function, and protective activity against oxidative stress/tumor necrosis factor alpha by phosphorylation. J. Biol. Chem., 274, 18947-18956.

135. Rould M.A., Wan Q., Joel P.B., Lowey S. and Trybus K.M. (2006) Crystal structures ofexpressed non-polymerizable monomelic actin in the ADP and ATP states. J. Biol. Chem., 281, 31909-31919.

136. Rubenstein P.A. (1990) The functional importance of multiple actin isoforms.1. Bioessays, 12, 309-315.

137. Sakamoto H., Mashima Т., Yamamoto K. and Tsuruo T. (2002) Modulation of heatshock protein 27 (Hsp27) anti-apoptotic activity by methylglyoxal modification. J. Biol. Chem., 277, 45770^15775.

138. Sanchez-Ruiz J.M. (1992) Theoretical analysis of Lumry-Eyring models in differentialscanning calorimetry. Biophys. J., 61, 921—935.

139. Schmid M.F., Sherman M.B., Matsudaira P. and Chiu W. (2004) Structure of theacrosomal bundle. Nature, 431, 104—107.

140. Singh B.N., Rao K.S., Ramakrishna Т., Rangaraj N. and Rao C.M. (2007) Associationof aB-crystallin, a small heat shock protein, with actin: role in modulating actin filament dynamics in vivo. J. Mol. Biol., 366, 756—767.

141. Straub F.B. (1942) Actin. Stud. Inst. Med. Chem. Univ. Szeged, vol. 2, p. 1.

142. Stromer Т., Ehrnsperger M., Gaestel M. and Buchner J. (2003) Analysis of theinteraction of small heat shock proteins with unfolding proteins. J. Biol. Chem., 278,18015-18021.

143. Studer S. and Narberhaus F. (2000) Chaperone activity and homo- and hetero-oligomerformation of bacterial small heat shock proteins. J. Biol. Chem., 275, 37212— 37218.

144. Sun W., Van Montagu M. and Verbruggen N. (2002) Small heat shock proteins andstress tolerance in plants. Biochim. Biophys. Acta, 1577, 1—9.

145. Takamoto K., Kamal J.K. and Chance M.R. (2007) Biochemical implications of a threedimensional model of monomeric actin bound to magnesium-chelated ATP. Structure, 15, 39-51.

146. Taylor R.P. and Benjamin I.J. (2005) Small heat shock proteins: a new classificationscheme in mammals. J. Mol. Cell Cardiol., 38, 433-444.

147. Tezel G. and Wax M.B. (2000) The mechanisms of hsp27 antibody-mediated apoptosisin retinal neuronal cells. JNeurosci., 20, 3552—3562.

148. Theriault J.R., Lambert H., Chavez-Zobel A.T., Charest G., Lavigne P. and Landry J.2004) Essential role of the NH2-terminal WD/EPF motif in the phosphorylation-activated protective function of mammalian Hsp27. J. Biol. Chem., 279, 23463-23471.

149. Thomson J.A. and Augusteyn R.C. (1984) On the structure of alpha-crystallin. Thereversibility of urea dissociation. J. Biol. Chem., 259, 4339^4345.

150. Tirion M.M. and bcn-Avraham D. (1993) Normal mode analysis of G-actin. J. Mol.1. Biol., 230, 186-195.

151. Wagstaff M.J., Collaco-Moraes Y., Smith J., de Belleroche J.S., Coffin R.S. and1.tchman D.S. (1999) Protection of neuronal cells from apoptosis by Hsp27 delivered with a herpes simplex virus-based vector. J. Biol. Chem., 274, 5061— 5069.

152. Wang K. and Spector A. (1996) a-Crystallin stabilizes actin filaments and preventscytochalasin-induced depolymerization in a phosphorylation-dependent manner. Eur. J. Biochem. 242, 56—66.

153. Wieske M., Benndorf R., Behlke J., Dolling R., Grelle G., Bielka H. and Lutsch G.2001) Defined sequence segments of the small heat shock proteins HSP25 and alphaBcrystallin inhibit actin polymerization. Eur. J. Biochem. 268, 2083—2090.

154. Yudin I.K., Nikolaenko G.L., Kosov V.I., Agayan V.A., Anisimov M.A. and Sengers

155. J.V. (1997) Simple photon-correlation spectrometer for research and education. Int. J. Thermophys., 18, 1237-1248.1. БЛАГОДАРНОСТИ л1. И)

156. Я искренне признательна своему научному руководителю доктору биологических наук, профессору Дмитрию Ивановичу Левицкому за внимательное, чуткое и доброжелательное руководство.

157. Я благодарна своим коллегам и друзьям из отдела структурной биохимии белка Института биохимии им. А. Н. Баха РАН за неоценимую помощь в работе, поддержку и доброту.

158. Данная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ и Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН.

Информация о работе

Пивоварова, Анастасия Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию F-актина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы