Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства и функции HSP 70 скелетных мышц млекопитающих

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Свойства и функции HSP 70 скелетных мышц млекопитающих"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

РГ6 ОД - 5 ИЮН 1995

На правах рукописи УДК 577.214/215

КИНЕВ Александр Витальевич

СВОЙСТВА И ФУНКЦИИ НБР 70 СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.25 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание.ученой степени кандидата биологических наук

Санкт - Петербург 1995

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии клетки Отдела клеточных культур Института цитологии РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук профессор А.Ф.Яковлев кандидат биологических наук Б.А.Маргулис

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук П.Я.Шварцман

кандидат биологических наук Д.Б.Громов

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургский Государственный Университет Биолого-почвенный факультет

Защита состоится " ' июня 1995 года в часов на заседании диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, С.Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан " мая 1995 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Л.Н.Писарева

© - Институт цитологии РАН

Актуальность темы. Термин "шаперон(ы)", впервые использованный для обозначения функций ядерного белка нуклеоплазмина Р.А.1_азкеу и соавт. в 1978 году, впоследствии был распространен на разнородную обширную группу белков, осуществляющих сборку, . разборку и поддержку определенной конформации полипептидов и олигомерных структур. Молекулярные шапероны, по-видимому, образуют основу "издательской системы" клетки. Она включает в себя биосинтез и созревание полипептидов, их доставку в клеточные органеллы, а также деградацию белков, неспособных осуществлять свои функции в результате поврежда-ющих воздействий и/или ошибок биосинтетического аппарата клетки. Очевидно, что шапероны принимают участие и необходимы во многих, если не во всех процессах, в которых наблюдаются изменения конформаций белков. Семейство НЗР70 - один из наиболее хорошо изученных классов шаперонов. Эти белки необходимы для жизнедеятельности клетки и в нормальных условиях, и при стрессе. Несмотря на имеющийся прогресс, изучение свойств белков этого семейства, спектра белков, с которыми они взаимодействуют, и специфики этих взаимодействий является актуальной темой клеточной биологии. Она непосредственно связа-на с вопросами интеграции и тонкой регуляции метаболизма клетки в изменяющихся условиях внешней среды, а также с изучением особенностей метаболизма специализированных клеток, к которым относятся и клетки скелетных мышц млекопитающих.

Цель и задачи исследования. Основные цели представленной работы: сравнить* физико-химические свойства Н5Р70 скелетных мышц млекопитающих и свойства родственных им белков других клеток; изучить причины накопления и особенности функции НБР70 в мышечных клетках.

Для достижения этих целей необходимо было решить следующие проблемы: получить препарат высокоочищенного НЗР70 и поликлональные антитела, специфичные к НЗР70;

создать инструментарий, необходимый для определения белков, связывающихся с HSP70; отработать тест-систему для определения шаперонной активности HSP70.

В соответствии с вышесказанным были сформулированы конкретные задачи исследования:

1). выделить и очистить HSP70 из скелетных мышц КРС1 ;

2). сравнить свойства полученного белка с имеющимися в литературе данными о свойствах белков, относящихся к

-"семейству HSP70;

3). получить поликлональные антитела и с их помощью оценить уровень HSP70 в клетках мышечных волокон разного метаболического профиля до и после стресса, вызванного физической нагрузкой;

4). определить спектр белков, связывающихся с HSP70;

5). определить условия, в которых реализуются эти комплексы in vitro и оценить возможность их существования in vivo;

6). используя полученные результаты определить специфику функций HSP70 в скелетных мышцах млекопитающих.

Научная новизна. В представленной работе впервые показано, что глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (GAPDH) - один из ключевых ферментов гликолиза -взаимодействует с HSP70, находясь в форме ацил- и ano-, но не голоэнзима. HSP70 связывается как димером, так и с тетрамером GAPDH и способен всстанавливать активность фермента, ингибированного ATP/ADP. Высокое содержание HSP72 характерно для саркоплазмы медленных оксидативных волокон скелетных мышц крысы, что, согласно выдвинутой автором гипотезе, является результатом реализации in vivo условий способствующих формированию комплекса ацил-GAPDH - HSP70.

'Сокращения: КРС-хрупный рогатый скот; АТР-аденозннтрнфосфорная кислота; ADP-аденозпндлфосфорная кислота; NAD(H)-

никотинамидадениндинуклеотид-фосфат(восстановленный); ДДС-

додецилсульфат; PMSF-фенилметансульфонил-фторид;EDTA-

этиленднаминтетрауксусная кислота; DTT-дитиотреитол

Научная и практическая ценность. Успех примененной в данной работе стратегии поиска и идентификации белков, специфично связыва-ющихся с HSP70, позволяет надеяться на применимость ее в работе с другими объектами. Наличие взаимодействия между шаперонами и ферментами гликолиза указывает на возможность существования особого механизма регуляции метаболизма клетки - через стабилизацию определенных (активных или нет) конформаций ферментов.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на ежегодных сессиях аспирантов во Всесоюзном институте генетики и развития животных (г. Пушкин) в марте-апреле 1991, 1992 и 1993 гг., на семинаре в Лаборатории биохимии мышц Института физкультуры (СПб) в марте 1993 г., на годовом отчетном докладе в Отделе клеточных культур ИНЦ РАН (СПб) в ноябре 1993 г. Частично результаты были представлены на трех международных конференциях: в июне 1994 г. на 4-м Europian Congress of Се!! Biology в г. Прага (Чехия), в июне 1994 г. на ежегодной встрече American College of Sports Medicine в г. Indianapolis (США) и на 10-м Rinshoken Conference в мае 1995 г. в г. Токио (Япония).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной час-ти, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 15 отечественных и 168 зарубежных источников. Текст изложен на 81 страницах. Работа содержит 18 рисунков (оригинальные фотографии и схемы) и 2 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. Q Sepharose, Sephadex G-200 SF, CNBr-Sepharose, Mono Q (FPLC) фирмы Pharmacia. ATP-Agarose (тип III), протеаза V8 и BSA (тип V) фирмы Sigma. ATP, ADP, 3PGA - Boehringer Mannheim. Антитела C92 и N27 получены от

W.Welch. Il-e антитела - от Sigma и Bio-Rad. ECL - от Amersham. Реактивы для ЭФ и блоттинга - Sigma и Bio-Rad. Методы.

1. HSP70 получен по модифицированному методу W.¡.Welch и

1.R.Feramisco (1985). Коротко: мышцы гомогенизировали в буфере А (20мМ Tris-HCI, 20мМ NaCI, 0,1мМ EDTA рН7,5), содержащем 0,2мМ PMSF, 0,5мМ DTT и 0,1% Nonidet Р-40. После ультрацентрифугирования экстракт наносили на Q Sepharose. Элюировзли 350мМ NaCI, элюат высаживали 55% сульфатом аммония. Осадок растворяли в буфере ТМ (20мМ Tris-HCI, ЗмМ MgCI2), обессаливали и наносили на АТР-Agarose. Белок, полученный элюцией ЗмМ Мд-АТР, концентрировали и доочищали на Mono Q (Pharmacia).

2. Специфичные к HSP70 антитела получали очисткой иммунной сыворотки на колонке с иммобилизованным HSP70.

3. Для определения ренатурирующей активности HSP70 раствор ß-галактозидазы (ß-GAL) в 4 М гуанидин-HCI разводили в буфере, в который предварительно были внесены титры HSP70 (соотношение Н : G = 0,1:1; 1:1; 10:1 и 100:1). В параллельном эксперименте HSP70 добавляли уже после разведения ß-GAL. После часа инкубации при комнатной температуре в раствор вносили Мд-АТР и инкубировали при +37о С. Через определенные промежутки времени отбирались аликвоты раствора для проверки активности фермента.

4. Хроматографические процедуры. Проскок, полученный после Q Sepharose, делили на две части и пропускали через две колонки: HSP70 - Sepharose (HSP-S) и Н15 - Sepharose (H15-S), уравновешенные буфером А, Здесь и далее все колонки отмывались от слабо связанных белков последовательно 1М NaCI и 0,05% Tween-20. Остальные белки элюировали 3mM МдАТР/ТМ. и 0,1М глицином рН2,5.

Далее исследовались два альтернативных состояния HSP70. При одном из них колонка с HSP70 промывалась 0,1М глицином рН2,5, а затем длительное время инкубировалась с 50mM EDTA (колонка обозначалась "N-F"). Перед нанесением на колонку экстракт диализовали против буфера А и, затем,

добавляли ЭДТА до 5мМ. В другом варианте HSP-S промывалась Mg-АТР (обозначалась "АТР-Н"); этот же агент включался в экстракт и во все элюнрующие растворы. Колонки последовательно промывались: PBS, 1mM GTP, 5тМ NAD, ЗтМ АТР и, наконец, 0,1М глицином рН2,5.плюс 0,ЗМ NaCI. Все растворы готовились на буфере А для "N-F" колонки и на буфере ТМ для "АТР-Н". В некоторых случаях порядок элюции был изменен и АТР - фракция снималась перед фракцией NAD. В параллельных экспериментах хроматографировали экстракт, приготовленный на фосфатном, буфере, содержащем ЗОмМ КН2РО4 и 1мМ EDTA (КФ-экстракт).

Хроматография на колонке с иммобилизованными антителами (H15-S). Tris-солевой экстракт пропускали через Н15-S, вымывали слабосвязанные белки и инкубировали колонку с буфером, содержащим 1мМ NAD и 1мМ 3PGA. Фракцию собирали, а затем колонку элюировали последовательно PBS, 5мМ NAD и, наконец, 0,1М глицином рН2,5

Хроматография на ATP-Agarose. На колонку наносили либо КФ-, либо Tris-солевой экстракты. После отмывки от слабосвязанных белков, специфически связанные белки элюировали последовательно растворами: PBS/TM, 1мМ GTP/TM, 5мМ NAD/TM и ЗмМ Мд-АТР/ТМ. Во всех фракциях после всех хроматографий определяли общее количество и спектр белков.

5. Исследование накопления HSP70 в мышцах крыс в состоянии покоя и в период восстановления после физической нагрузки. (Работа выполнялась совместно с к.б.н. А.И.Пшендиным, Институт физкультуры, СПб). Разовая физическая нагрузка заключалась в плавании животных с дополнительным грузом в течении 40 минут. Другая группа крыс была подвергнута экспериментальной тренировке плаванием с дополнительным грузом с увеличением длительности ежедневных нагрузок от 5 до 40 минут в течение 4 недель. Группы животных исследовали в состоянии покоя, через 1, 4 и 24 часа после последнего (или единственного) упражнения (брали по 4-6 особей на точку).

6. GAPDH очищалась по методу Cori и соавт.(1948 )

7. Аналитические методы. Электрофорез в нативных и денатурирующих условиях проводили согласно методу Laemmli (1970). Изоэлектрофокусирование и NEPHGE - по O'Farrell (1975 и 1978). Пептидное картирование с использованием протеазы V8 - по Cleveland и соавт. (1977). Измерение концентрации белка - по методу Bradford (1976), Измерение АТФазной активности при помощи малахитового зеленого - метод Ca.ster и Kool (1982). Активность GAPDH измеряли по изменению поглощения NADH при А=340нм (Velick, 1955). Хроматофокусирование проводилось в соответствии с рекомендациями производителя Polybuffer (Pharmacia).

8. HSP70 и IgG ковалентно пришивались к CNBr-Sepharose с концентрацией 4мг белка на 1 мл геля в соответствии с инструкцией производителя.

9. Микросиквенс провел Dr. Ulf Hellman из университета г. Uppsala (Швеция)

СВОЙСТВА HSP70 СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ КРС

1. Свойства HSP70. С помощью модифицированного метода двухступенчатой очистки HSP70 с использованием АТР-Agarose был получен препарат белков, которые при электрофорезе (ЭФ) в денатурирующих условиях движутся как дуплет с MW равными 70 и 72 кДа. С помощью иммуноблоттинга с использованием антител N27 и С92 эти белки были идентифицированны как HSP72 и HSC73. Сравнение пептидных карт HSP72 и HSC73 мышц КРС и клеток HeLa выявило их идентичность. Изоэлектрофоку-сированием (ИЭФ) в 8М мочевине выявлена значительная гетерогенность препарата: HSP72 разделяется на 4-5 изоформ с pl5,1 -5,4, a HSC73 на 3 изоформы с р!5,6-5,8. О гетерогенности свидетельствуют также данные хроматографии на Mono Q и нативный электрофорез в неградиентном геле. При хроматофокусировании, методе, при котором белки разделяются по заряду в неденатури-рующих условиях, наблюдались две, впрочем весьма

d'

размытые, фракции, в которых обнаружены и HSP72, и HSC73. Среднее значение pi фракций нативного HSP70 4,8 и 6,3. С помощью нативного ЭФ в градиентном геле и гель-фильтрации в тонком слое выяснилось, что очищен-ный HSP70 образует равновесную смесь мономеров, димеров и тримеров. Присутствие в растворе Мд-АТР приводит к сдвигу равновесия в сторону образования мономеров. Ионная сила, Са++ и Мд++ не оказывали влияния на олигомерность белка. Очищенный HSP70 обладал спонтанной АТФазной активностью равной 7 пкМ/мкг/мин, что соответствует данным литературы об АТФазной активности HSP70. Таким образом, HSP70 скелетных мышц КРС обладает теми же характеристиками, что и известные HSP70 из других клеток.

2. Шаперонная активность HSP70. Представление о белках семейства HSP70 как о молекулярных шаперонах широко распространено и нашло ряд экспериментальных подтверждений. Мы обнаружили, что очищенный HSP70 КРС связывается с модельными денатурированными белками (у-интерферон и ß-галактозидаза). По гипотезе H.Pelham'а (1986) HSP70 могут восстанавливать нативную конформацию белков, поврежденную под действием стресса, используя энергию АТР. Мы попытались смоделировать эту ситуацию in vitro, исследуя восстановление активности модельного белка - денатурироанной ß-галактозидазы (ß-GAL). Выяснилось, что ренатурация ß-GAL в присутствии HSP70 происходила крайне неэффективно. Возможно, аналогично очищенным рекомбинантному человеческому HSP72, HSC73 из мозгов КРС и Dna К E.Coü, HSP70 мышц КРС взаимодействует с развернутыми полипептидами и стабилизирует их в этом состоянии. Как показано другими авторами, DnaK может эффективно ренатурировать белки при участии DnaJ и GrpE.

ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ К HSP70

Препарат (95% чистоты) HSP70 использовался для иммунизации кроликов. После стандартного цикла иммунизации и забора крови полученную сыворотку, специфичную к

7 Здесь VI далее НЗР70, кроме специально огооорелных случаев, будет обозначать Н5Р72/Н5С73

HSP70 (по иммуноблоттингу, ИБ), очищали на колонке с иммобилизованным (99% чистоты) HSP70. Результаты ИП и ELISA свидетельствуют, что наши антитела (обозначаются -Н15) специфично "узнают" как нативный, так и денатурированный HSP72 мышц коровы. Полученные антитела перекрестно реагировали с HSP72 различных линий клеток. Антитела в дальнейшем использовались для определения количества HSP72 и для коиммунопреципитации HSP70 и HSP70BP.

УРОВЕНЬ HSP72 В МЫШЦАХ КРЫС

С помощью антител Н15 было определено относительное содержание HSP72 в мышечных волокнах разного метаболического профиля у крыс. В саркоплазме клеток красных мышц M.soleus (медленные оксидативные волокна) наблюдается высокий уровень HSP72. В быстрых гликолитических волокнах (поверхностный слой M.quedriceps), также как в печени, почках и селезенке имеются только следо-вые количества HSP72. В сердечной мышце уровень HSP72 был выше, чем в белых волокнах, но значительно ниже, чем в M.soleus.

Одна из возможных причин аккумуляции HSP70 недоступность действию протеаз в результате образования комплексов с некими специфическими белками и/или денатурированными/развернутыми полипептидами.

GAPDH - ОСНОВНОЙ СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ

С HSP70 БЕЛОК САРКОПЛАЗМЫ МЫШЦ

Для определения HSP70BP использовались колонки с иммобилизованным очищенным HSP70 и с иммобилизованными антителами Н15. HSP70, ковалентно сшитый с носителем, демонстрировал АТФазную активность и сохранял свою антигенную детерминанту.

1. В процессе хроматографии проскока после Q Sepharose на HSP70-S и H15-S, оказалось, что Mg-ATP-фракции с этих колонок не содержали белка. С ATP-Agarose элюировались два полипептида с MW равными 37 и 70 кДа (по ДДС-ЭФ). Зоны с такой же подвижностью были основными в глициновых

элюатах с HSP70-S и H15-S. С помощью ПК и ИБ установлено, что р70 - это HSP70, и что р37 - мажорный белок саркоплазмы - не является фрагментом ни одного из белков мышечных клеток. ИЭФ и NEPHGE показали, что р37 -основной белок с pi 8,6-8,8, имеющийй по меньшей мере три изоформы. Наконец, при помощи микросиквенирования было установлено, что р37 - это глицеральдегид-3-фосфат дегидрогенеза (NAD-оксидоредуктаза (фосфорилирующая); ЕС 1.2.1.12, GAPDH).

2. Известно, что HSP70 способны связывать денатурированные/развернутые белки. Известно также, что содержание GAPDH в скелетных мышцах составляет примерно 8-10%, от общей массы всех растворимых белков мышечной клетки. Поэтому резонно предположить, что HSP70 связывает денатурированную форму этого значительного компонента мышечного экстракта. Для того, чтобы решить, так это или нет, было предпринято исследование условий, при которых GAPDH взаимодействует с HSP70. С этой целью проводились хроматографии в присутствии и отсутствии АТР. В результате этих процедур выяснилось, что GAPDH связывается с обеими формами HSP70. Независимо от порядка нанесения элюентов не Mg-ATP, a NAD был способен диссоциировать комплекс GAPDH-HSP70. Тем не менее, в глициновой фракции всегда обнаруживалось некоторое количество GAPDH, причем во фракции, полученной, с "АТР-Н", значительно больше, чем с "N-F". При элюции буфером, содержащим фосфат, помимо множества минорных компонентов, . освобождалось значительное количество GAPDH.

Поскольку было обнаружено, что фосфат способствует частичной диссоциации GAPDH и HSP70 в хроматографи-ческий протокол были внесены изменения. Теперь экстракт был приготовлен на калий-фосфатном (КФ) буфере. Эта модификация оказала сильное отрицательное влияние на формирование комплекса GAPDH-HSP70. Ни в одной из фракций фермент не был обнаружен. "АТР-Н" адсорбиро-вала следовые количества дегидрогеназы, которая

о

vj

обнаруживалась только в глициновой фракции наряду с другими (вероятно, денатурированными) полипептидами. На эффективность связывания их с HSP70 фосфат не повлиял.

3. Для объяснения обнаруженных эффектов обратимся к схеме реакции, которую катализирует GAPDH - реакции фосфорилирования глицеральдегид-3-фосфата (3PGA) с образованием 1,3-дифосфоглицерата (1.3DPG), в которой NAD участвует как коэнзим и восстанавливается до NADH. Эта реакция - многоступенчатый процесс, который можно записать следующим образом:

esh ± NAD

±3PGA

(NAD)

±1,3DPG

±P¡

Eacyl(NAD) P¡ (VI)

eACYL(NADH)

±NADH

jrACYL

(IV) ±NAD

Eacyl(NAD) (V)

где esh обозначает субъединицу фермента с реакционной SH группой, eacyl обозначает переходную форму фермента, образуемую ковалентной пришивкой 3PGA к SH-rpynne фермента. NAD необходим для взаимодействия фермента и 3PGA и для стадии фосфорилирования. Конформация фермента значительно изменяется при последовательном присоединении коэнзима; субстрата и Pi. При наличии в реакционной смеси фосфата происходит быстрое деацилирование энзима, так что форма VI существует очень короткое время. Существование ¡n vivo формы IV также представляется маловероятным из-за высокой аффинности

to

NAD (и еще большей NADH) к ферменту и высокой концентрации NAD в саркоплазме мышц. Диссоциация комплекса фермент-НЗР70 под действием Pi означает, что HSP70 связывает ацильную (V), но не голо- (II) форму фермента. В ходе экстракции КФ-буфером форма V, по-видимому, должна деацилироваться и превращаться в форму II, т.к. в экстракте содержится некоторое количество эндогенного NAD. Вследствие этого мы не видим GAPDH среди HSP70BP после хроматаграфии этого экстракта на HSP-S. В отсутствие Pi добавление NAD к комплексу фермент-Н5Р70 должно приводить к тому, что GAPDH может оказаться в форме II и/или V. Форма II при этом элюируется, а форма V (образовавшаяся из формы III) элюируется в данном случае 0,1М глицином рН2,5, причем ацил-энзим в форме III адсорбируется лучше на "АТР-Н". То, что мы находим GAPDH в NAD-фракции свидетельствует о том, что апо-фермент тоже взаимодействует с HSP70.

С учетом вышесказанного была проведена заключительная хроматография на H15-S. Принятый в данном случае порядок промывки колонки привел к тому, что весь фермент при инкубировании с коэнзимом и субстратом ацилировался (форма V) и оставался связанным с HSP70. При добавлении Pi фермент освобождал продукт реакции фосфорилирования 1,3DPG и элюировался в PBS-фракции, после чего на колонке оставался связанным с антителами чистый HSP70, который и был обнаружен во фракции 0,1 М глицин рН2,5. Последний эксперимент окончательно убеждает нас, что GAPDH из скелетных мышц КРС связывается с HSP70, будучи в ацил- и апо-формах.

HSP70 НАКАПЛИВАЕТСЯ В МЕДЛЕННЫХ ОКСИДАТИВНЫХ ВОЛОКНАХ В КОМПЛЕКСЕ С АЦИЛ-GAPDH

На оснований полученных данных, автор выдвигает гипотезу, согласно которой в медленных оксидативных волокнах HSP70 аккумулируется на высоком уровне вследствие ассоциации с ацил-GAPDH. W. Bloch и соавт.

(1971) обнаружили, что значительная часть GAPDH в мышцах кролика находится в ацилированном состоянии. Накопление фермента в ацильной форме in vivo ,можно объяснить недостатком доступного неорганического ^шш^аншеИзвестно, что ферменты дыхательной цепи митохондрий и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа конкурируют за свободный фосфат. Это является одной из причин так называемых Пастеровского и Крабти эффектов. Было показано, что 'концентрация неорганического фосфата контролирует как аэробный, так и анаэробный гликолиз, в том числе и на уровне GAPDH. В обзоре D.H.Koobs (1972) указывается, что ферменты дыхательной цепи и GAPDH, вероятно, утилизируют фосфат преимущественно в форме Н2Р04". Однако при физиологическом значении pH (7,4)

о

концентрация этого иона в пять раз меньше, чем НР04 . Кроме того, в клетках, видимо существует механизм активного транспорта Н2Р04". Ингибирование гликолиза - в аэробных условиях (эффект Пастера) характерно для оксидативных волокон мышц, в которых наблюдается большое количество и высокая активность митохондрий. В гликолитических волокнах реализуется обратный (Крабти) эффект. Ингибирование гликолиза фосфатом на уровне GAPDH должно приводить к накоплению этого фермента е ацильной форме, как это следует из механизма реакции Присутствие ферментов, разлагающих АТР на АДР и Р оказывает стимулирующее действие на аэробный гликоли: (это показано, в частности,в работе S.Gatt и E.Racker, 1959) В этом плане, в клетках мышц основное влияние на контролк скорости гликолиза на уровне GAPDH и на количество ацил фермента должна оказывать миозиновая АТФаза, Kai основной потребитель АТР. Медленные оксидативные волоки; содержат тяжелые цепи миозина первого типа, которые осуществляет гидролиз АТР относительно медленно, что npt наличии высокой активности митохондрий, должно приводит! к дефициту свободного фосфата, и, следовательно, i накоплению ацил-GAPDH и ассоциирущемуся с ним HSP70. Е сердечной мышце мы наблюдаем относительно низко!

1Z

содержание HSP70 (однако выше, чем в белых волокнах), что связано, видимо, с высокой активностью сердечной миозиновой АТФазы. В поддержку нашей' гипотезы можно привести данные M.Locke и соавт. (1994), согласно которым при длительной электростимуляции белых волокон крысы возрастание уровня HSP72 коррелирует с количеством миозина I типа.

ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ HSP70 ПОСЛЕ

ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ

1. С помощью ИБ установлено, что через час после однократной физической нагрузки не происходит заметного изменения количества HSP72 в мышцах разного метаболического профиля. Через 4 часа после окончания упражнения уровень HSP72 в белых волокнах возрастает в несколько раз, затем постепенно снижается, но и через 24 часа остается выше, чем до нагрузки. Аналогичную картину мы наблюдаем и в цитоплазме сердечной мышцы: через 4 часа уровень HSP72 практически не изменяется по сравнению с покоем, а через сутки он значительно выше. В оксидативных волокнах через 4 часа по окончании физической нагрузки уровень HSP72 значительно снижается и не возвращается к первоначальному даже через 24 часа. Картина еще более усложнилась, когда было обнаружено, что у тренированных крыс через четыре часа после однократной физической нагрузки концентрация HSP72 возрастает в несколько раз по сравнению с первоначальным уровнем как в белых, так и в красных волокнах.

2. Известно что, накопление HSP72 в период восстановления является характерной реакцией клетки на стресс. Общепринятая на сегодняшний день концепция индукции синтеза HSP70 постулирует существование механизма негативной регуляции гена hsp72. Согласно этой гипотезе, при стрессе появляющиеся в большом количестве денатурированные белки связывают свободный HSP70. В результате этого комплекс HSP70-HSF диссоци-ирует и фактор активируется, что приводит к экспресии гена hsp70 и

появлению новых молекул HSP70. При избытке HSP70 по отношению к субстрату свободный HSP70 снова связывается с HSF и инактивирует его.

В периоды физической нагрузки и восстановления после нее в мышечных клетках наблюдаются глубокие метаболические изменения. В период восстановления уровень АТР очень быстро возвращается к норме, а доминирующими становятся процессы ката- и анаболизма. Повышенный синтез" и деградация белков, характерные для этого периода, требуют участия HSP70 и, как мы показали, уровень HSP72 повышается в клетках быстрых глико-литических- волокон и сердечной мышцы, в соответствии с изложенным выше механизом индукции HSP70. Снижение уровня HSP72 в медленых оксидативных волокнах указывает на существование более сложного механизма регуляции накопления этого белка. Автор считает, что общее количество HSP70 в медленных оксидативных волок-нах определяется суммой количества HSP70, связанного с денатурированнми/синтезирующимися полипептидами, и количества связанного с GAPDH HSP70. Если в клетке реализуются условия, приводящие к исчезновению ацил-GAPDH, в цитоплазме появляется пул свободного HSP70. Относительно мягкий стресс (в нашем случае 40-минутное плавание) может привести к тому, что не весь уже имеющийся HSP70 будет связан с денатурированными/ /развернутыми полипептидами и, в таком случае, он станет доступным действию протеаз.

3.Такие условия могут реализовываться в процессе ресинтеза гликогена. В мышцах нетренированных животных гликоген является основным источником энергии при продолжительных физических нагрузках. Глюконеогенез протекает в течение нескольких часов (и даже суток) по окончании физической нагрузки, и интенсивность его зависит от количества использованного гликогена. Механизм протекающей при глюконеогенезе обратной реакции, катализируемой GAPDH, предполагает отсутствие стабильной ацильной формы фермента. То есть, в условиях интенсивного

/у

ресинтеза .гликогена комплекс GAPDH и HSP70 должен распадаться, что ведет к повышенной деградации последнего. Заметим, что в печени (где идет интенсивный глюконеогенез) обнаружены лишь следовые количества HSP72.

Данные других авторов об особенностях метаболизма нетренированных и адаптированных к физическим упражнениям мышц свидетельствуют, что в процессе тренировки у мышечной клетки увеличивается способность использовать в качестве источника энергии свободные жирные кислоты. В результате, расход гликогена значительно снижается и глюконеогенез протекает с меньшей интенсивностью. Особенно это характерно для медленных оксидативных волокон, адаптированных к длительным нагрузкам низкой интенсивности. Вероятно, в наших эксперементах при разовой нагрузке тренированные животные расходовали мало гликогена и, следовательно, глюконеогенез протекал с низкой интенсивностью. Повышение концентрации HSP70 в медленных оксидативных волокнах, предположительно, связано с тем, что уровень ацил-GAPDH в данном случае сохранялся а, следовательно, и комплекс HSP70-GAPDH не диссоциировал, в то время, как процессы синтеза/ /деградации белков требовали дополнительного количества HSP70.

ВЛИЯНИЕ HSP70 НА АКТИВНОСТЬ GAPDH

1. Выше уже говорилось о том, что GAPDH связывается с ATP-Agarose и может быть элюирован вместе с HSP70 при помощи Mg-АТР. Это объясняется тем, что у этого фермента есть сайт связывания с адениновой частью молекулы NAD. Известно, что GAPDH взаимодействует с различными адениновыми основаниями и их производными. Если в ходэ хроматографии на ATP-Agarose в качестве элюента вместо Mg-АТР использовать NAD, то в собранной фракции мы обнаруживаем примерно равные количества GAPDH и HSP70. Контрольные эксперименты по хроматографии пробы, не содержащей GAPDH (Q-элюат), и препарата очищенного

/_Г

HSP70 показали, что NAD не может конкурировать с Мд-АТР за связывание с HSP70. Кроме того, известно, что ATP/ADP вызывает димеризацию тетрамерной молекулы GAPDH (см. напр. В.И.Муронец и Н.К.Наградова, М., 1984). Из этого следует, что в результате инкубации экстракта с ATP-Agarose на колонке иммобилизуются димеры фермента. Причем димеры как ano- так и ацил-энзим одинаково хорошо связываются с АТР, т.к. результаты хроматографий КФ- и Tris-солевого экстрактов практически одинаковы. Учитывая это, можно сделать вывод, что HSP70, элюирующийся NAD, в данном случае адсорбировался на колонке в комплексе с димером GAPDH. Т.к. АТР не является коэнзимом GAPDH, то в присутствии Pi реакция фосфорилирования не идет, соответственно GAPDH не может изменить конформацию и "освободить" HSP70. Экспериментальные данные свидетельствуют, что во фракции, содержащей Pi оба белка практически не элюируются.

2. Хорошо известно ингибирующее действие адениновых оснований на активность GAPDH. Опыты по восстановлению активности очищенного фермента, ингибированного ATP/ADP, показали, что после преинкубации с ADP активность восстанавливалась быстрее в присутствии HSP70 по сравнению с контролем. АТР в наших условиях практически необратимо инактивировала фермент в отсутствие HSP70. При наличии HSP70 в течение 10 минут восстанавливалось примерно 20% активности GAPDH.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итоги следует отметить следующее. HSP70 может накапливаться в клетках в комплексе с ацил-GAPDH. Поэтому условия, способствующие образованию устойчивого пула ацил-GAPDH, должны приводить к аккумуляции HSP70. Такие условия возникают, в частности, при наличии высокой активности митохондрий и относительно низкой общей АТФазной активности клетки. Это свойственно, очевидно, клеткам медленных оксидативных волокон скелетных мышц. При интенсивных гликолизе (в клетках быстрых

/в

гликолитических волокон) и глюконеогенезе (в клетках печени и в миофибриллах в период восстановления после физической нагрузки), а также при высокой АТФазной активности (в клетках сердечной мышцы) реализуются условия, приводящие к снижению количества ацильной формы GAPDH, а следовательно, и количества HSP70.

Способность медленных оксидативных волокон выполнять продолжительную работу связана с высокой мощностью АТР-регенерирующей системы. Активность GAPDH в мышцах может блокироваться высоким уровнем АТР, который свойственен этой ткани. Наличие большого количества HSP70 в саркоплазме мышечных волокон может играть определенную роль в процессах ресинтеза АТР. Деингибирование GAPDH под действием HSP70 ведет к увеличению гликолитической продукции АТР, а также производству пирувата, который в дальнейшем может утилизироваться ферментами цикла Кребса.

выводы

1. Белки семейства HSP70 клеток скелетных мышц КРС -HSP72/HSC73 - обладают свойствами, аналогичными свойствам HSP70 других клеток.

2. Очищенный HSP70 обладает значительной зарядной гетерогенностью. HSP70 способен образовывать димеры и тримеры, а в присутствии Mg-АТР мономеризуется. HSP70 скелетных мышц обладает спонтанной АТФазной активностью, способен связывать денатурированные/разверну-тые полипептиды в присутствии Mg-ATP/Mg-ADP, но не восстанавливает активность денатурированной (3-галактозидазы.

3. Количество HSP72 поддерживается на высоком уровне в саркоплазме клеток медленных оксидативных волокон скелетных мышц. В период восстановления после однократной физической нагрузки уровень HSP72 в этих волокнах у крыс, неадаптированных к физическим упражнениям, снижается. В противоположность этому, белые (гликолитические) волокна, сердечная мышца и мышцы тренированных животных накапливают HSP72 в ответ на однократное упражнение.

4. HSP70 образует комплекс с ацил- и ano-GAPDH, который диссоциирует в присутствии, соответственно, Pi и NAD.

5. HSP70 взаимодействует как с димером, так и с тетрамером GAPDH и in vitro восстанавливает активность фермента, ингибированного ATP/ADP.

/S

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Margulis,B.A., Nacharov,P.V., Tsvetkova.O., Welsh,М., Kinev.A. The characterisation and use of different antibodies against the HSP70 major heat shock protein family for the development of an immunnoassay. 1991. Electrophoresis, 12: 670-673.

2. Phendin.A, Kinev.A, Rogozkin,V. The evdurance training and accumulation of HSP-72 in various rat sceletal muscles. 1994. Med. and Sci. in Sports and Exercise,26:S134.

3. A.Kinev and B.Margulis. HSP70 interaction with GAPDH from bovine muscles. 1994. J.Cell Intern., 6: 312.