Комплексы молекулярного шаперона GroEL с денатурированными белками

Марченков, Виктор Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Комплексы молекулярного шаперона GroEL с денатурированными белками
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Комплексы молекулярного шаперона GroEL с денатурированными белками"

На правах рукописи

МАРЧЕНКОВ ВИКТОР ВИКТОРОВИЧ

КОМПЛЕКСЫ МОЛЕКУЛЯРНОГО ШАПЕРОНА вгоЕЪ С ДЕНАТУРИРОВАННЫМИ БЕЛКАМИ

Специальность 03 00 03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

ии^ибБ921

ПУЩИНО - 2007

003066921

Гаоота выполнена в лаборатории физики белка Института белка РАН

Научный руководитель доктор физико-математических наук

Семисотнов Геннадий Васильевич

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Колб Вячеслав Адамович

доктор биологических наук, профессор Долгих Дмитрий Александрович

Ведущая организация

Институт биохимии им А.Н Баха РАН

Защита диссертации состоится « 1В» октября 2007 г В 15 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д 002 038 01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу 142290, Московская область, г. Пущино, ул Институтская, д 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН

Автореферат разослан « 18 » сентября 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

<7 * Смолихина

Актуальность проблемы. В начале 80-х годов обнаружен класс белков, которые обеспечивают внутриклеточный транспорт и правильное сворачивание как вновь-синтезированных полипептидных цепей, так и белков, денатурированных в результате различных клеточных стрессов (тепловой и холодовой шоки, оксидативный стресс и тд) Такие белки были названы шаперонами Среди обширного класса шаперонов существует семейство олигомерных белков, состоящих из 14-16 субъединиц с молекулярным весом около 60 кДа, объединенных в две взаимодействующие друг с другом кольцевые структуры с двумя обширными внутренними полостями Такие шапероны были названы шаперонинами Шаперонин клеток Е coli GroEL -один из наиболее интенсивно исследуемых как со структурной, так и с функциональной точек зрения

Этот белок состоит из 14 идентичных субъединиц с молекулярным весом 57,2 кДа каждая, обладает слабой АТФ-азной активностью и функционирует как шаперон в присутствии своих лигандов ионов К+ и Mg2"1", АДФ, АТФ и белкового ко-шаперонина GroES GroEL взаимодействует с широким спектром денатурированных белков, предотвращая их агрегацию и обеспечивая приобретение этими белками жесткой третичной структуры Несмотря на значительное количество работ по исследованию структуры и функции GroEL, механизм его функционирования как молекулярного шаперона окончательно не установлен В наиболее популярной модели функционирования GroEL предполагается, что ненативный белок связывается во внутренней полости одного из двух колец шаперонина В присутствии адениновых нуклеотидов GroEL образует комплекс с ко-шаперонином GroES, который «прикрывает» внутреннюю полость со связанным в ней ненативным белком, образуя камеру ("ячейку Анфинсена"), которая предохраняет сворачивающийся белок от нежелательных межмолекулярных контактов и обеспечивает окончательное сворачивание белка

Однако, несмотря на привлекательность такой модели и ее соответствие ряду экспериментальных фактов, она не может претендовать на универсальность Во-первых, ОгоЕЬ может осуществлять шаперонную функцию и в отсутствие своих лигандов, включая ко-шаперонин вгоЕВ Во-вторых, ОгоЕЬ обеспечивает правильное сворачивание крупных (более 50 Ша) белков, которые не могут поместиться в его внутреннюю полость В-третьих, эукариотический аналог ОгоЕЬ функционирует как молекулярный шаперон даже в том случае, когда его внутренняя полость занята большим антителом Все эти факты указывают на то, что для расширения нашего представления о механизме функционирования ОгоЕЬ как молекулярного шаперона необходимо подробное исследование взаимодействия шаперонина с денатурированными белками и факторов, влияющих на это взаимодействие Представляет также интерес изучение конформационных изменений ОгоЕЬ при его взаимодействии со своими лигандами

Цели работы. Основной целью данной работы явилось исследование комплексообразования ОгоЕЬ с различными денатурированными белками, факторов, влияющих на этот процесс, и разработка универсальной модели функционирования ОгоЕЬ как молекулярного шаперона

Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы были определены ионные условия, обеспечивающие прочное взаимодействие ОгоЕЬ с белковыми мишенями различного заряда, стехиометрические параметры комплексов ОгоЕЬ с различными денатурированными белками и показано, что приобретение сворачивающимся белком нативной конформации происходит вне его комплекса с шаперонином, т е в свободном состоянии На основании полученных результатов предложена новая более универсальная модель функционирования ОгоЕЬ как молекулярного шаперона, не накладывающая ограничений на размер и количество связываемых шаперонином белковых мишеней

Практическая значимость работы. Полученные результаты имеют в основном фундаментальное значение для понимания механизмов сворачивания белка как in vitro, так и in vivo, а также белок-белкового узнавания Вместе с тем, некоторые результаты могут быть использованы для решения практических задач в области биотехнологии - для широкомасштабного выделения клеточных шаперонов, и медицины - для разработки новых методов диагностики шаперон-зависимых заболеваний

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации изложены в 15 публикациях Результаты работы представлялись на симпозиумах II и III Съездах биофизиков России (1999 и 2004 гг), школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 28 мая-2 июня 2000 г), научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения акад И Н Буланкина, (Харьков, Украина, 16-17 января, 2001г), VIII Украинском биохимическом съезде, (Черновцы, Украина, 1-3 октября 2002г), Пущинских конференциях молодых ученых (1997 и 2005 гг), научной конференции «Современные проблемы молекулярной биофизики» (Санкт-Петербург, 15-16 июня 2006), международных конгрессах 30th FEBS Congress & 9th IUBMB Conference "The Protein World" the FEBS Journal (July 2-7,2005, Budapest, Hungary) и 31th FEBS Congress "Molecules ш Health & Disease" the FEBS Journal (June 24-29, 2006, Istanbul, Turkey)

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, использованных в работе, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация изложена на 131 странице, содержит 18 рисунков и 3 таблицы Список литературы включает 213 ссылок

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Пространственная структура GroEL представляет собой цилиндр, состоящий из двух колец, каждое из которых образовано 7 идентичными

субъединицами Каждое кольцо ОгоЕЬ формирует центральную полость, внутрь которой обращены субстрат-связывающие сайты Функционирование ОгоЕЬ происходит через повторяющиеся циклы связывания и высвобождения белкового субстрата с участием молекул АТФ, АДФ и белкового ко-фактора ОгоЕБ В настоящей работе в качестве белковых субстратов ОгоЕЬ были использованы различные белки, денатурированные в нативных для ОгоЕЬ условиях В кинетических экспериментах исследовано взаимодействие ОгоЕЬ с кинетическими промежуточными состояниями белков, накапливающимися при ренатурации из полностью развернутого в 8 М мочевине состояния а-лактальбумина человека (ЧЛА), фосфоглицераткиназы дрожжей (ФГК) и карбоангидразы Б эритроцитов крови коровы (КАБ) В равновесных исследованиях использованы ЧЛА, пепсин, лизоцим и сывороточный альбумин (БСА), находящиеся в термодинамически стабильных денатурированных состояниях, образующихся при восстановления внутримолекулярных дисульфидных связей этих белков

1. Влияние внешних условий на образование комплекса ОгоЕЬ с денатурированными белками

Влияние рН среды на взаимодействие ОгоЕЬ с эквимолярным количеством пепсина показано на рис 1 В диапазоне от 7 5 до 9 5 единиц рН наблюдается постоянно высокое значение анизотропии флуоресценции флуоресцеин (РАМ)-меченого денатурированного пепсина вследствие его прочного связывания с малоподвижной олигомерной частицей ОгоЕЬ При увеличении рН выше 9 5 наблюдается резкое падение анизотропии флуоресценции до величины, характерной для пепсина в отсутствие шаперонина

Снижение анизотропии флуоресценции БАМ-меченого пепсина в щелочной области свидетельствует об ослаблении сродства ОгоЕЬ к белковой мишени при значениях рН выше 9 5 вплоть до полного отсутствия связывания шаперонином белкового субстрата при рН 10 4 Причина ослабления

взаимодействия состоит, по-видимому, не в увеличении с ростом рН среды электростатического отталкивания между отрицательно заряженными СгоЕЬ и пепсином, поскольку такую же зависимость от рН проявляет и взаимодействие ОгоЕЬ с положительно заряженным лизоцимом (не показано) За нарушение связывания белковой мишени в щелочной области отвечают скорее структурные перестройки в СггоЕЬ частице, приводящие при рН 10 к диссоциации олигомерного комплекса (ЗгоЕЬ на отдельные субъединицы (Сурин и др, 1999, данные малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, персональное сообщение Г В Семисотнова) Дальнейшие опыты с использованием флуоресцентно меченых белков проводили при рН 8 8

~ Рис. 1. Влияние рН раствора на анизотропию флуоресценции РАМ- меченого денатурированного пепсина (20 нМ) в отсутствие (о) и в присутствии - (•) шаперонина СггоЕЬ (20 нМ) Для разных диапазонов значений рН среды . использовали следующие буферные __ системы для рН 7 5-8 5 - 50 мМ ТпвНС1,

I для рН 8 7-9 5 - 50 мМ Борат-КОН, для

II рН 9 75-10 4 - САРБ-КОН Все буферные растворы содержали также 100 мМ КС1, 10 мМ МяС12 и 5 мМ БТТ Измерения проводили при 37°С

Согласно литературным данным, связывание (ЗтоЕЬ с ненативными белками происходит в основном за счет гидрофобных взаимодействий Чтобы выяснить роль электростатических взаимодействий в формировании комплекса ОгоЕЬ с денатурированными белками, нами была исследована зависимость взаимодействия ОгоЕЬ с положительно и отрицательно заряженными белковыми мишенями от ионного состава среды (Марченко и др, 2006) Влияние концентрации одновалентной соли на связывание шаперонином ОгоЕЬ трех разных белков показано на рис 2 Из приведенных данных видно, что анизотропия флуоресценции денатурированного БАМ-меченого положительно заряженного лизоцима в присутствии эквимолярного количества

2 014

012

0 10

0 08

000о0000о о

0 06

рН

100 200 300 400 КС1, тМ

500 600

ОгоЕЬ имеет высокие значения и практически не меняется во всем исследованном диапазоне концентраций КС1 вплоть до 0 6 М, вчетверо превышающей физиологические значения Постоянно высокое значение анизотропии флуоресценции свидетельствует о низкой подвижности положительно заряженных молекул лизоцима вследствие образования прочного комплекса с олигомерной частицей ОгоЕЬ

I о 20 —■—.—>—.—■—.—■—.—■—.—■— Рис. 2. Зависимость анизотропии

флуоресценции денатурированных РАМ-меченых ЧЛА (•), пепсина (■) и лизоцима (а) в присутствии шаперонина (ЗгоЕЬ, от концентрации КС1 в растворе Измерения проводили при 37°С в буферном растворе, содержащем 10 мМ ТшНС!, рН 8 8 и 5 мМ БТТ Концентрации каждого из белков и ОгоЕЬ составляли 20 нМ Заряды белков при нейтральных значениях рН составляют ОгоЕЬ (226), ЧЛА (-7), пепсин (-32), лизоцим (+8) Незачерненными символами показаны значения анизотропии флуоресценции соответствующих белков в отсутствие ОгоЕЬ

Иная картина наблюдается в случае отрицательно заряженных белков ЧЛА и пепсина При низкой ионной силе раствора (10 мМ ТшНС1) анизотропия флуоресценции РАМ-меченых производных этих белков в присутствии ОгоЕЬ имеет такие же низкие значения, как и в отсутствие шаперонина По-видимому, недостаток ионов, которые могли бы экранировать отрицательные заряды на поверхности ОгоЕЬ и белковых субстратов, приводит к тому, что электростатическое отталкивание одноименно заряженных молекул ОгоЕЬ и белковой мишени превышает "гидрофобное притяжение" и полностью блокирует их взаимодействие Такое поведение обусловлено именно разницей в заряде белкового субстрата, поскольку общая "гидрофобность" (сродство к гидрофобному зонду) денатурированного состояния отрицательно заряженного ЧЛА выше, чем у положительно заряженного лизоцима (не показано)

По мере увеличения концентрации одновалентной соли в среде (аналогичные кривые были получены и для ЫаС1) наблюдается кооперативный

рост анизотропии флуоресценции FAM-мечных ЧЛА и пепсина, выходящий на плато при концентрациях соли, близких к физиологическим значениям В этих условиях прочность взаимодействия GroEL с отрицательно заряженными денатурированными белками достигает своего максимума и не претерпевает изменений при дальнейшем повышении ионной силы среды Кривые изменения анизотропии флуоресценции двух кислых белков при повышении ионной силы раствора не совпадают Для прочного связывания с GroEL пепсина, имеющего больший, чем ЧЛА отрицательный заряд, требуется и более высокая ионная сила раствора середина перехода для ЧЛА находится при 90 мМ KCl, тогда как в случае пепсина половина изменений наблюдается при 140 мМ KCl

Помимо ионов калия, для выполнения шаперонных функций GroEL нуждается также в двухвалентных катионах магния Чтобы определить влияние двухвалентных катионов на взаимодействие GroEL с белковыми мишенями, нами были исследованы зависимости анизотропии флуоресценции отрицательно заряженных FAM-меченых ЧЛА и пепсина, денатурированных в присутствии эквимолярного количества GroEL, от концентраций магния и кальция при низкой ионной силе раствора (Марченко и др , 2006, Марченков и др, 2006)

Рис. 3. Влияние концентрации двухвалентных катионов - магния (о) и кальция (■) на анизотропию флуоресценции БАМ-меченого пепсина (20 нМ), денатурированного в присутствии шаперонина ОгоЕЬ (20 нМ) Измерения проводили при 37°С в буферном растворе, содержащем 10 мМ ТгаНС1, рН 8 8 и 5 мМ ШТ

0 1 1 10 концентрация ионов, тМ

На рис 3 представлены такие зависимости для эквимолярной смеси

ОгоЕЬ и денатурированного пепсина (аналогичные зависимости были

получены для ЧЛА, не показаны) Видно, что для образования прочного

комплекса ОгоЕЬ с отрицательно заряженным денатурированным пепсином

требуются существенно меньшие концентрации двухвалентных катионов по сравнению с моновалентными ионами (сравнить с рис 2) Взаимодействие ОгоЕЬ с пепсином, несущим наибольший из исследованных белковых субстратов отрицательный заряд (-32) достигает своего максимума при концентрации магния 5 мМ Кроме того, двухвалентные катионы отличаются по своей эффективности ионы кальция лучше, чем ионы магния, помогают преодолевать электростатическое отталкивание ОгоЕЬ и одноименно заряженного денатурированного белка

Небольшие концентрации двухвалентных катионов, необходимые для прочного взаимодействия ОгоЕЬ с отрицательно заряженными белковыми мишенями, различия в эффективности ионов Са2"1" и а также высокая

кооперативность их действия на комплексообразование объясняются, по-видимому, специфическим взаимодействием двухвалентных катионов с отрицательно заряженными участками на поверхности ОгоЕЬ, расположенными вероятнее всего вблизи гидрофобных субстрат-связывающих сайтов шаперонина

2. Взаимодействие СгоЕЬ с денатурированными белками увеличивает его стабильность по отношению к действию повышенных температур и протеаз

Результаты ограниченного трипсинолиза ОгоЕЬ в присутствии различных белковых мишеней (рис 4) показывают, что связывание белкового субстрата значительно увеличивает стабильность ОгоЕЬ по отношению к протеолитическому расщеплению, причем этот эффект больше выражен для комплекса ОгоЕЬ с пепсином, чем с меньшим по массе лизоцимом Известно, что две точки наиболее эффективного расщепления ОгоЕЬ трипсином находятся вблизи мест связывания белковых субстратов По-видимому, белковые субстраты экранируют возможные места атаки протеазы в полипептидной цепи ОгоЕЬ Причем чем больше размер белкового субстрата, тем эффективней это экранирование

Б. 58кОа полоса

А. ЭгоБ- + трипсин

1.011

0.0

0 5 10 15 го ЭО 40 60 90 130 150 180 240 врем« (мнн.)

О 50 100 150 200 250 время (мин.)

Рис, 4. Кинетика трипе и ноли за ОгоЕЬ в отсутствие и в присутствии белковых субстратов. А, денатурирующий 11ААГ электрофорез продуктов протеолитического расщепления СтТоЕЬ трипсином (соотношение масс 5:1). Справа указаны молекулярные массы основных фрагментов ОгоЕЬ определенные из их электрофоре I и ческой подвижности. Внизу указаны соответствующие времена инкубации с трипсином. Б, - кинетика протеояитической деградации субъединицы

На рис. 5 представлены результаты микрокалориметрического плавления ОгоЕЬ в присутствии различных белковых субстратов (5шш е( а1., 1997; Магскепкоу е! а1., 2005). Из этих данных видно, что связывание с ненативной белковой мишенью увеличивает термостабильность ОгоЕЬ, причем термостабильность шаперонина имеет тенденцию расги пропорционально размеру связанной белковой мишени.

ОгоЕЬ,

Рис. 5.

Кривые

микрокалори метрического плавления ОгоЕЬ (1) и его комплексов с денатуриро ванным и лизоцимом (2); пепсином (3) и БСА (4).

330 340 342 344 346 346 360

т. сю

Повышение термостабильности ОгоЕЬ при связывании денатурированных белков вызвано, по-видимому, тем, что белковый субстрат связывается с ОгоЕЬ и скрепляет его подвижные апикальные домены. Чем

крупнее молекула белкового субстрата, тем с большим числом апикальных доменов она взаимодействует, и, соответственно, тем сильнее стабилизирующее влияние связанной белковой мишени на структуру шалеронина Моделирование крупномасштабных изменений структуры (ЗгоЕЬ при его взаимодействии с денатурированным пепсином на основе данных по малоугловому рассеянию рентгеновских лучей (не приведены) подтверждает, что связывание с ненативной белковой мишенью приводит к сужению центральной полости (ЗгоЕЬ (МагсЬепкоу е1 а1,2005)

3. Сворачивание реиатурирующего белка происходит вне комплекса с йгоЕЬ

Кинетики ренатурации из полностью развернутого состояния ЧЛА, ФГК и БКА регистрировали по изменению собственной флуоресценции этих белков Полученные данные (Марченков и др, 2004) показывают (пример ЧЛА приведен на рис 6), что кинетики ренатурации исследованных белков замедляются с увеличением молярного избытка СгоЕЬ над сворачивающимся белком Во всех случаях эффект замедления ренатурации белка, выраженный в виде зависимости полувремени кинетики от молярного избытка (ЗюЕЬ, носит линейный характер (см вставку на рис 6)

Рис. 6. Кинетика ренатурации ЧЛА (1 мкМ) в присутствии 0, 1, 2 и 5 мкМ ОтоЕЬ (кривые 1-4, соответственно) Пунктирные линии представляют результат

моноэкспоненциальной аппроксимации кинетик

ренатурации белка Амплитуда кинетики ренатурации белка нормирована как уменьшение популяции ненативных молекул (Ри) Вставка представляет зависимости полувремени

ренатурации белка (^д) от молярного избытка (ЗгоЕЬ над

сворачивающимся белком

Время, сек

Существует два возможных объяснения замедления сворачивания белка в присутствии ОгоЕЬ Либо белок, находящийся в раннем кинетическом промежуточном состоянии, взаимодействует с шаперонином и сворачивается в связанном с ОгоЕЬ состоянии При этом в комплексе с ОгоЕЬ белок сворачивается с меньшей, чем в свободном состоянии скоростью

Сго+Ри ^¡Юго Рп -&->Сго+Рк Схема 1

Либо взаимодействие с ОгоЕЬ полностью блокирует дальнейшее сворачивание связанного белка, и это сворачивание возможно лишь в свободном состоянии, после его диссоциации из комплекса с ОгоЕЬ

вго+ Ри Ого Ри Схема 2

рн

В этом случае замедление наблюдаемой скорости сворачивания белка в присутствии ОгоЕЬ обусловлено пониженной вероятностью спонтанного сворачивания за счет сокращения времени жизни белка в свободном состоянии Теоретическое моделирование процесса ренатурации белка в присутствии ОгоЕЬ показало (Марченков и др, 2004), что при избытке ОгоЕЬ над сворачивающимся белком наблюдаемое полувремя ренатурации белка не должно зависеть от концентрации ОгоЕЬ, если сворачивание белка происходит в комплексе с ОгоЕЬ (схема 1) И, напротив, полувремя ренатурации белка зависит от молярного избытка ОгоЕЬ, если его сворачивание блокируется в комплексе с ОгоЕЬ и происходит только вне шаперонина (схема 2)

Сравнение экспериментальных результатов и теоретических расчетов указывает на то, что формирование нативной структуры глобулярных белков при их ренатурации в присутствии ОгоЕЬ происходит вне комплекса с ОгоЕЬ (схема 2) Таким образом, вероятность сворачивания белка в присутствии ОгоЕЬ определяется временем спонтанного сворачивания белка и временем нахождения кинетического промежуточного состояния белка вне комплекса с

ОгоЕЬ, то есть величиной К^ этого комплекса Ренатурация белка вне комплекса с ОгоЕЬ означает, что шаперонин связывает кинетические промежуточные состояния белков, но не участвует в сворачивании белка как таковом Белок сворачивается самостоятельно, на основе информации, закодированной в его аминокислотной последовательности, в полном соответствии с принципом самоорганизации белковой цепи (принципом Анфинсена)

4. Лиганды СгоЕЬ ослабляют его сродство к денатурированным белкам с эффективностью, возрастающей в ряду АДФ < АТФ < АДФ-СгоЕв < АТФ-СгоЕ8

Известно, что лиганды ОгоЕЬ (АДФ, АТФ и СггоЕБ) снижают сродство шаперонина к денатурированным белкам Чтобы выявить возможную зависимость этого эффекта от свойств субстратного белка, нами было исследовано влияние нуклеогидов и ОгоЕБ на взаимодействие ОгоЕЬ с термодинамически стабильными промежуточными состояниями ряда белков, полученными при восстановлении стабилизирующих их структуру дисульфидных связей (Марченко и др, 2006, Марченков и др, 2006, МагсЬепкоу й а!, 2005) Прочность комплексов ОгоЕЬ с денатурированными белками оценивалась методом поляризованной флуоресценции по увеличению анизотропии флуоресценции белкового субстрата Полученные результаты представлены на рис 7

Из приведенных гистограмм видно, что в присутствии ОгоЕЬ и любого из его лигандов анизотропия флуоресценции всех исследованных БАМ-меченых денатурированных белков снижается, свидетельствуя об ослаблении взаимодействия ОгоЕЬ с белковой мишенью Во всех случаях сохраняется одна и та же закономерность эффективности ослабляющего действия лигандов меньше всего взаимодействие ОгоЕЬ с белковой мишенью ослабляет АДФ, затем следуют АТФ, АДФ-ОгоЕБ (не показано) и, наконец, АТФ-ОгоЕБ

Аналогичные результаты получены в кинетических экспериментах по ренатурации белков в присутствии ОгоЕЬ и его лигандов (не показаны)

и ш о.

о >

с; -9-

с о о.

£ го

го

О 18 л О 160 14 О 12 О 1 -0 080 06 0 04 0 02 Н 0

пепсин

ЧЛА

лизоцим

Рис. 7. Анизотропия флуоресценции РАМ-меченых пепсина, ЧЛА, и лизоцима, денатурированных в отсутствие и в присутствии ОгоЕЬ и его лигандов ОгоЕЬ и 5 мМ АДФ, ОгоЕЬ и 5 мМ АТФ, ОгоЕЬ, СгоЕ8 и 5 мМ АТФ Концентрации белковых мишеней и ОгоЕЬ составляли 20 нМ, ОгоЕБ - 40 нМ

Согласно общепринятой модели функционирования ОгоЕЬ, в присутствии полной шаперонной системы ОгоЕЬ, ОгоЕ8 и АТФ, денатурированный белок находится во внутренней полости ОгоЕЬ под "крышкой" связанного ко-шаперонина Маловероятно, что нахождение в небольшом замкнутом пространстве никак не сказывается на подвижности молекулы белкового субстрата А ведь именно такая ситуация наблюдается в одном из случаев анизотропия флуоресценции ЕАМ-меченого ЧЛА в присутствии полной шаперонной системы ОгоЕЬ неотличима от анизотропии белка в свободном состоянии Скорее всего в этом конкретном случае эффективность влияния АТФ-ОгоЕБ на взаимодействие ОгоЕЬ с ЧЛА столь высока, что в их присутствии полностью блокируется связывание ОгоЕЬ с белковым субстратом

5. Полная шаперонная система СгоЕЬ/Ев не удерживает денатурированный белок во внутренней полости СгоЕЬ

В подтверждение того, что белок в присутствии полной шаперонной системы ОгоЕЬ/ЕБ сворачивается не в полости СгоЕЬ, а в свободном состоянии, свидетельствует и эксперимент, проведенный при повышенных концентрациях денатурированного лизоцима (рис 8)

Рис. 8. Кинетика агрегации неспособного свернуться флуоресцентно меченого лизоцима (0 05 мг/мл) в буфере, содержащем 20 мМ ТшНС1 рН 7 5, 100 мМ КС1, 10 мМ М^12, 50 мМ ОТТ при 45°С 1 - в отсутствие (ЗгоЕЬ, 2 - в присутствии двукратного молярного избытка СгоЕЬ, 3 - в присутствии двукратного молярного избытка ОгоЕЬ и о юо 200 300"1450 2 мМ АДФ, 4 - в присутствии двукратного

время инкубации (мин) молярного избытка ОгоЕЬ и (ЗгоЕБ, и

2 мМ АДФ

При сравнительно высокой концентрации 6 5 мкМ, в 300 раз превышающей концентрацию, использованную в предыдущем эксперименте, неспосбные свернуться в присутствии ОТТ молекулы лизоцима с восстановленными дисульфидными связями эффективно ассоциируют Из приведенных данных видно, что в отсутствие ОгоЕЬ уже через 50 минут в растворимом виде находится лишь 10% белка Связывание с ОгоЕЬ сильно замедляет агрегацию лизоцима, больше 80% которого находится в растворе даже после 24-часовой инкубации АДФ, ослабляя взаимодействие лизоцима с ОгоЕЬ, несколько ускоряет его агрегацию В присутствии ОгоЕЬ и АДФ-ОгоЕ8 лизоцим агрегирует почти с той же скоростью, что и в отсутствие шаперонной системы ОгоЕЬ Если бы денатурированный лизоцим находился в закрытой ко-шаперонином ОгоЕБ полости шаперонина ОгоЕЬ ("ячейке Анфинсена"), его агрегация была бы невозможна в силу отсутствия физической возможности вступить в контакт с другими молекулами Напротив, высокая скорость агрегации денатурированного лизоцима в присутствии полной шаперонной

системы свидетельствует о том, что молекулы белкового субстрата большую часть времени проводят в компетентном к межмолекулярным взаимодействиям состоянии, то есть вне ОгоЕЬ (Марченков и др, 2006)

6. СгоЕЬ связывает как минимум две молекулы денатурированного белка: по одной на противоположных кольцах

Олигомерная частица ОгоЕЬ построена из двух одинаковых семисубъединичных колец, каждое из которых формирует субстрат-связывакяций центр Симметричное строение предполагает наличие у СгоЕЬ двух идентичных мест связывания белкового субстрата В то же время ряд косвенных литературных данных свидетельствует о том, что взаимодействие шаперонина и субстрата происходит в эквимолярном соотношении Чтобы четко определить количество молекул белковой мишени, связывающихся с СггоЕЬ, и прочность (КЛз!) этого связывания, нами было проведено титрование денатурированных РАМ-меченых белков шаперонином Взаимодействие ОгоЕХ с белковыми мишенями регистрировали по увеличению анизотропии флуоресценции ЕАМ-меченных белковых мишеней (МагсЬепкоу е! а1, 2005) Результаты такого титрования на примере денатурированного пепсина показаны на рис 9

—I Рис. 9. Титрование флуоресцеин-. меченого пепсина (20 нМ) шаперонином СггоЕЬ в буфере, содержащем 20 мМ ■ Тшна рН 8 8, 100 мМ КС1, 10 мМ М^сь, 5 мМ ВТТ при 22°С На вставке " результаты титровашш представлены в координатах Скэтчарда, где 5- у-количество связанных с

макромолекулой молекул лиганда, (Ь) -250 концентрация свободного лиганда

Из представленных на рисунке данных видно, что при увеличении концентрации СггоЕЬ в растворе наблюдается рост анизотропии флуоресценции РАМ-меченого белка вследствие образования комплекса денатурированного

гагоЕЦ, нМ

белка с ОгоЕЬ Для определения стехиометрических параметров этого комплекса использовали широго известный графический способ представления данных титрования в координатах Скэтчарда (показан на вставке рис 9) Результаты обработки данных по титрованию различных белков шаперонином ОгоЕЬ приведены в таблице 1

Из приведенных данных видно, что три из четырех исследованных белков пепсин, лизоцим и БСА связываются с ОгоЕЬ в соотношении два к одному Микроскопические константы диссоциации комплексов с шаперонином имеют очень близкие значения, несмотря на значительные отличия в размере, заряде и гидрофобности денатурированных состояний этих белков В то же время результаты титрования показывают, что с одной олигомерной частицей ОгоЕЬ с приблизительной той же прочностью связываются как минимум четыре молекулы ЧЛА Возможно, благодаря небольшим размерам полипептидной цепи (14 кДа) и компактности денатурированной формы, подтверждаемой данными по гель-фильтрации (не показаны), ЧЛА способен в виде димера умещаться на одном субстрат-связывающем центре ОгоЕЬ

Таблица 1. Стехиометрические параметры комплексов ОгоЕЬ с

Белок Количество мест связывания Константа диссоциации, нМ

пепсин 2 1 ±0 2 3 7 ± 0 3

лизоцим 2 2 ± 0 2 4 2 ± 0 3

БСА 1 9 ± 0 2 4 3 ± 0 3

ЧЛА 4 6 ± 0 4 3 5±0 5

Вследствие своей симметричности, олигомерная частица ОгоЕЬ должна иметь два идентичных субстратсвязывающих центра Естественно предположить, что две молекулы белкового субстрата, связывающиеся с ОгоЕЬ, располагаются на противоположных кольцах шаперонина В то же

время в литературе отмечается высокая степень отрицательной кооперативности между противоположными кольцами GroEL, которая может приводить к блокированию связывания белкового субстрата при заселении белковой мишенью противоположного кольца Кроме того, существует вероятность связывания с GroEL денатурированного белка в виде олигомеров благодаря склонности денатурированных белков к межмолекулярной ассоциации

Для выяснения распределения связанных молекул белкового субстрата между кольцами GroEL, нами был использован метод резонансной миграции энергии флуоресценции (FRET)

донор

(£) акцептор

360 380 400 420 440 460 480 500 520 длина волны,нм

Рис. 10. Определение взаимной локализации двух молекул белковой мишени, связавшихся на поверхности ОгоЕЬ А, схема эксперимента Схематически представлены ОгоЕЬ и белковые мишени, меченные донором (Д) или акцептором (А) энергии флуоресценции Б, спектры возбуждения комплекса ОгоЕЬ (50 нМ) и РАМ-меченого пепсина (50 нМ) в отсутствие (сплошная линия) и в присутствии (пунктирная линия) родамин Б-меченого пепсина (50 нМ)

В качестве донора энергии флуоресценции использовали БАМ-метку, а в качестве акцептора - родамин Б, конъюгированные с пепсином Эти два флуорофора обладают хорошим спектральным перекрыванием, обеспечивающим высокое значение радиуса Фестера (До=57 А) характеристического расстояния, при котором эффективность миграции энергии флуоресценции составляет 50% На рис 10А представлена схема эксперимента Если связывание двух молекул белкового субстрата происходит на противоположных кольцах ОгоЕЬ, то расстояние между донором и

акцептором должно существенно превышать Ro донорно-акцепторной пары (расстояние между противоположными торцами GroEL составляет 145 Â) На таком расстоянии эффективность миграции энергии крайне низка, что должно проявляться в отсутствии тушения флуоресценции донорной метки Если же связывание обеих молекул денатурированного белка происходит на одном и том же кольце GroEL, расстояние между донорной и акцепторной меткой не должно превышать 60 А, и следует ожидать значительного тушения флуоресценции донора Измерения анизотропии флуоресценции донорных и акцепторных молекул показали, что и те и другие находятся в комплексе с GroEL (не показано) Из рис 10Б видно, что спектры возбуждения флуоресценции эквимолярного комплекса GroEL с пепсином, меченым донором FRET, в отсутствие и в присутствии пепсина, меченного акцептором FRET, практически совпадают Таким образом, можно констатировать, что две молекулы денатурированного пепсина связываются с противоположными кольцами GroEL, по одной на каждый субстрат-связывающий центр шаперонина

7. Модель сворачивания белка вне комплекса с GroEL

На основании представленных в работе результатов исследований и данных литературных источников, мы предлагаем простую и универсальную модель функционирования GroEL в качестве молекулярного шаперона (рис 11) Модель предполагает (Марченков и др, 2006), что GroEL-частица может связывать разнообразные полипептидные мишени на обоих колцах Количество связанных полипептидов зависит от их размера, а прочность их связывания с GroEL определяется их «гидрофобностью» и зарядом Таким образом, концентрация несвернутых полипептидов в растворе (т е в свободном состоянии) понижается, что должно приводить к уменьшению вероятности их неспецифической ассоциации Тем не менее, полипептиды могут диссоциировать с поверхности GroEL и приобретать нативную конформацию или взаимодействовать с другими клеточными факторами в свободном

состоянии Лиганды ОгоЕЬ (Mg-AДФ, Mg-ATФ и ко-шаперонин ОгоЕБ) в различной степени ослабляют его взаимодействие с полипептидными мишенями, увеличивая тем самым время пребывания этих мишеней в свободном состоянии и, следовательно, вероятность приобретения ими нативной структуры При этом, даже в присутствии лигандов ОгоЕЬ способен взаимодействовать с несвернувшимися полипептидными цепями, уменьшая тем самым их концентрацию в свободном состоянии и вероятность неспецифической межмолекулярной ассоциации

О АДФ

ОгоЕЬ

ненативные белки

свернутые белки не взаимодействуют с вгоЕ!.

АТФ

1_П СгоЕЭ

I ©

п I

п и

I □

Е=П

Рис 11 Схема функционирования ОгоЕЬ как молекулярного шалерона Различные символы обозначают различные полипептиды, способные связываться с ОгоЕЬ с различными константами ассоциации Взаимодействие ОгоЕЬ со своими лигандами (АДФ, АТФ и (ЗгоЕЗ) индуцирует конформационные изменения в ОгоЕЬ-частице, которые понижают ее сродство к белковым мишеням В результате, белковые мишени чаше диссоциируют с поверхности ОгоЕЬ в раствор, где они либо приобретают нативную (жесткую) структуру и теряют способность взаимодействовать с ОгоЕЬ, либо опять связываются с ОгоЕЬ или другими клеточными факторами, предотвращающими их от неспецифической межмолекулярной ассоциации в растворе

Такая модель не требует помещения полипептидной мишени во внутреннюю полость комплекса ОгоЕЬ с ОгоЕБ, в которой ее сворачивание в нативную структуру может быть проблематичным и зависящим от ее гидродинамического объема, а также не накладывает ограничений на стехиометрию комплексов ОгоЕЬ с белковыми мишенями Вместе с тем, такой механизм обеспечивает выполнение основной функции ОгоЕЬ -

предотвращение несвёрнутых полипептидных цепей от неспецифической межмолекулярной агрегации, которая не только приводит к невозможности приобретения ими нативной структуры, но и нарушает процессы, обеспечивающие жизнедеятельность клеток По такой схеме могут функционировать и другие шаперонины, которые не имеют ОгоЕБ-подобных партнеров, но связывают адениловые нуклеотиды

ВЫВОДЫ

1 Предложена универсальная модель функционирования ОгоЕЬ в качестве молекулярного шаперона, которая не имеет ограничений на количество и размер связываемых белковых субстратов и предполагает их сворачивание в свободном состоянии вне комплекса с ОгоЕЬ

2 Определены внешние условия, необходимые для прочного связывания ОгоЕЬ с денатурированными белками значения рН от 7 до 9, наличие физиологической ионной силы раствора (не менее 100 мМ ИаС1) либо небольших концентраций двухвалентных катионов (1мМ-5мМ)

3 Связывание белковых мишеней стабилизирует структуру ОгоЕЬ по отношению к действию повышенной температуры и протеаз

4 Шаперонин ОгоЕЬ связывает белки, находящиеся в ранних кинетических промежуточных состояниях, и блокирует их сворачивание Сворачивание белковых мишеней происходит в свободном состоянии, после их диссоциации из комплекса с шаперонином

5 ОгоЕЬ связывает как минимум две молекулы белковой мишени Лиганды ОгоЕЬ ослабляют сродство к денатурированным белкам с эффективностью, увеличивающейся в ряду АДФ < АТФ < АДФ-ОгоЕЯ < АТФ-ОгоЕБ

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1 МарченковВ В. МарченкоН Ю, МарченковаС Ю, СемисотновГ В Молекулярные шаперонины прокариотических и эукариотических клеток Успехи биологической химии 2006 Т 46, С 279-302

2 МарченкоН Ю, МарченковВ В . КайшеваА JI, КашпаровИ А, Котова Н В , Калиман П А, Семисотнов Г В Аффинная хроматография шаперонина GroEL на основе денатурированных белков роль электростатических взаимодействий в регуляции сродства GroEL к белковым субстратам Биохимия 2006 Т 71, выл 12 С 1668-1676

3 Марченков В В . Соколовский И В , Котова Н В , Галзитская О В , Бочкарева Е С, Гиршович А С, и Семисотнов Г В Взаимодействие шаперона GroEL с ранними кинетическими промежуточными состояниями ренатурирующих белков ингибирует формирование их нативной структуры Биофизика 2004 Т 49, С 987-994

4 А К Сурин, Н В Котова, С Ю Марченкова, В В Марченков. Г В Семисотнов Мономерная форма молекулярного шаперона GroEL структура, стабильность и олигомеризация Биоорганическая химия 1999, Т 25, N 5, С 358-365

5 А К Sunn, N V Kotova, I A Kashparov, V V Marchenkov. S Yu Marchenkova, G V Semisotnov Ligands regulate GroEL thermostability FEBS Letters 1997, v 405, p 260-262

6 Марченков В В . Соколовский И В, Сурин А К, Галзитская О В , Семисотнов Г В (1997) Влияние молекулярного шаперона GroEL на кинетику ренатурации глобулярных белков Сборник тезисов II открытой научной конференции молодых ученых города Пущино, Пущино, 23-25 апреля 1997 г, с 77-78

7 В В Марченков. О В Галзитская, Н В Котова, И В Соколовский, А К Сурин, Г В Семисотнов (1999) Спонтанное сворачивание глобулярных белков в присутствии молекулярного шаперона GroEL Сборник тезисов докладов II Съезда биофизиков России, Москва, 23-27 августа 1999 г, Т I, с 57

8 В В Марченков. О В Галзитская, НВ Котова, СЮ Марченкова ИВ Соколовский, А К Сурин, Г В Семисотнов (2000) Сворачивание глобулярных белков в присутствии молекулярного шаперонина GroEL Школа-конференция "Горизонты физико-химической биологии", Пущино, 28 мая - 2 июня 2000 г, с 41-42

9 Марченко НЮ Марченков В В Котова Н В БуланкинаНИ Семисотнов Г В

(2001) Взаимодействие молекулярного шаперона GroEL с ненативным лизоцимом влияние АДФ, АТФ и ко-шаперона GroES «Научное наследие академика И Н Буланкина и его развитие в современной биохимии» Труды научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения акад И Н Буланкина, Харьков Харьковский национальный университет , 16-17 января, 2001 г с 62-63

10 Марченко Н Ю Марченков В В Мельник Б С Котова Н В Семисотнов Г В

(2002) Взаимодействие молекулярного шаперона GroEL с белковой мишенью влияние ADP, АТР и GroES Украинский биохимический журнал, т 74, №46

(приложение 2), 2002 Материалы VIII Украинского биохимического съезда, Черновцы, 1-3 октября, 2002 г с 10-11

11 Марченко НЮ МарченковВ В. КашпаровИА, ШехватоваГВ, Котова H В, Калиман П А, Семисотнов Г В (2004) Взаимодействие молекулярного шаперонина GroEL с ненативными белковыми мишенями влияние лигандов и внешних условий Сборник тезисов докладов III Съезда биофизиков России, Воронеж, Воронежский госуниверситет, 23-27 августа 2004 г, Т I, с 71

12 Марченко H Ю, Кайшева А Л, Марченков В В. Кашпаров И А, Котова H В , Калиман П А, Семисотнов Г В (2005) Исследование зависимости связывания ненативных белков с шапероном GroEL от концентрации его лигандов Сборник тезисов 9-ой Международной Пущинской школы - конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 18-22 апреля 2005 г, с 40-41

13 Marchenkov V V. MarchenkoN Yu, KotovaNV, KashparovIA , MelmkBS, Kalunan P A, Semisotnov G V (2005) Complexes between GroEL and non-native proteins their stoichiometry, conformation, stability and the role of ligands Abstracts of the 30th FEBS Congress & 9th IUBMB Conference "The Protein World", (July 2-7, 2005, Budapest, Hungary) the FEBS Journal, v 272, suppl 1, p 356

14 Марченко H Ю, Кайшева А Л, Марченков В В. Семисотнов Г В (2006) Роль электростатических взаимодействий в формировании комплекса шаперонина GroEL с белковыми субстратами Сборник тезисов научной конференции «Современные проблемы молекулярной биофизики», посвященной 40-летию специализации «молекулярная биофизика» на физическом факультете СПбГУ и 95-летию со дня рождения проф Э В Фрисман Санкт-Петербург, 15-16 июня 2006 г, с 22

15 Marchenko N Yu, Marchenkov Y V . Kaysheva A L, Kashparov IA, Kotova N V, Kaliman P A, Semisotnov G V (2006) A simple method for isolation, purification and express-analysis of GroEL-like chaperones Abstracts of the 31th FEBS Congress "Molecules m Health & Disease" (June 24-29, 2006, Istanbul, Turkey) the FEBS Journal, v 273, suppl 1, p 144

Подписано в нечать 13 09 2007 г Исполнено 13 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 707 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Марченков, Виктор Викторович

Введение.

Обзор литературы.

Глава 1. Проблема самоорганизации белков.

1.1. Равновесные промежуточные состояния белков.

1.1.1. Равновесное промежуточное состояние белков типа "расплавленная глобула".

1.1.2. Равновесное промежуточное состояние "предшественник расплавленной глобулы".

1.1.3. Нативноподобные промежуточные состояния.

1.2. Кинетические промежуточные состояния белков.

1.2.1. Ранние кинетические промежуточные состояния.

1.2.2. Кинетическое промежуточное состояние "расплавленная глобула".

1.2.3. Формирование нативного состояния белка, нативноподобные кинетические промежуточные состояния белков.

Глава 2. Концепция ассистируемой сборки белков. Молекулярные шапероны.

2.1. Шаперонные системы прокариотических и эукариотических клеток.

2.1.1. Семейство малых белков теплового шока (sHSP).

2.1.2. Семейство шаперонов Hsp40.

2.1.3. Семейство шаперонов Hsp60 (шаперонины).

2.1.4. Семейство шаперонов Hsp70.

2.1.5. Семейства шаперонов Hsp90 и HsplOO.

2.1.6. Прочие шапероны.

2.2. Молекулярный шаперон GroEL.

2.2.1. Структура GroEL.

2.2.2. Взаимодействие GroEL с ненативными белками.

2.2.3. Лиганды GroEL.

2.2.4. Модели функционирования GroEL как молекулярного шаперона.

Экспериментальная часть.

Глава 3. Материалы и методы.

3.1. Подготовка препаратов и биохимические методы.

3.1.1. Реактивы.

3.1.2. Выделение и очистка GroEL и GroES.

3.1.3. Белковые препараты.

3.1.4. Получение флуоресцентно-меченых производных белков.

3.1.5. Гель-электрофорез.

3.1.6. Ограниченный трипсинолиз.

3.1.7. Определение эстеразной активности карбоангидразы В.

3.2. Физико-химические методы исследования.

3.2.1. Спектральные измерения.

3.2.2. Определение стехиометрии и констант диссоциации комплексов GroEL с белковыми мишенями.

3.2.3. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия.

3.2.4. Кинетические измерения.

Глава 4. Результаты и обсуждение.

4.1. Взаимодействие GroEL с кинетическими промежуточными состояниями сворачивающихся белков.

4.1.1. Влияние GroEL на кинетику ренатурации белков.

4.1.2. Влияние АТФ и АДФ на кинетику ренатурации белков в присутствии GroEL.

4.1.3. Моделирование сворачивания белка в присутствии GroEL.

4.2. Комплексы GroEL с равновесными промежуточными состояниями белков.

4.2.1. Денатурация белков в нативных для GroEL условиях.

4.2.2. Влияние внешних условий на формирование комплекса GroEL с равновесными промежуточными состояниями белков.

4.2.3. Определение стехиометрических параметров комплексов GroEL с денатурированными белками.

4.2.4. Определение взаимной локализации связанных белковых мишеней на поверхности GroEL.

4.2.5. Влияние лигандов GroEL на взаимодействие шаперонина с равновесными денатурированными состояниями белков.

4.2.6. Влияние белковых субстратов на стабильность и конформацию GroEL

Глава 5. Анализ полученных результатов. Модель сворачивания белка вне комплекса с GroEL.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Комплексы молекулярного шаперона GroEL с денатурированными белками"

Экспериментальные исследования процессов денатурации и ренатурации белков in vitro привели к важному заключению, что вся необходимая и достаточная информация о пространственной структуре белка заключена в его аминокислотной последовательности (см. обзор (Seckler and Jaenicke, 1992)). Однако, исследования процессов жизнедеятельности клетки и сворачивания белков in vivo выявили ряд клеточных компонентов, которые вовлечены либо в катализ процесса сворачивания белков, либо в кинетический контроль распределения вновь синтезированных белков между различными конкурирующими путями сворачивания, ассоциации и агрегации (Gething and Sambrook, 1992; Seckler and Jaenicke, 1992).

К концу 80-х годов сложилось представление, согласно которому определенные белковые факторы могут играть весьма важную роль в процессах формирования и поддержания нативной конформации белка в клетке. На основе имевшихся данных Эллисом (Ellis, 1987) была сформулирована идея ассистируемой самоорганизации белков в противоположность спонтанной. Эта концепция предполагает, что, хотя сворачивание белков является спонтанным процессом, существуют критические стадии, на которых участие специальных клеточных факторов может оказаться необходимым. Роль таких факторов, названных молекулярными шаперонами, состоит в обеспечении оптимальных условий для протекания процесса сворачивания белков путем устранения «помех» или «неадекватных контактов».

Шапероны входят в состав большого семейства белков теплового шока (heat shock proteins (hsp)), синтез которых в клетке значительно увеличивается в ответ на тепловой шок или другие виды клеточных стрессов (Lindquist and Craig, 1988). Вместе с тем, и при нормальных условиях большинство белков этого семейства синтезируются довольно интенсивно. Широкий диапазон функций этих белков включает стабилизацию промежуточных конформаций в процессе созревания белков in vivo, ассистирование сборки олигомерных комплексов, участие в трансмембранном транспорте белков и деградации короткоживущих белков цитозоля (Gething and Sambrook, 1992), а также предотвращение летальной неспецифической ассоциации белков в стрессовых для клетки условиях (Lindquist and Craig, 1988).

Одним из наиболее полно исследованных молекулярных шаперонов является 14-ти субъединичный белок теплового шока клеток Е. coli GroEL, представитель семейства шаперонинов, обнаруженных в эубактериях, митохондриях и хлоропластах (Hemmingsen et al., 1988; Hendrix, 1979; Kusukawa et al., 1989). GroEL взаимодействует с ненативными конформационными состояниями различных белков, предотвращая их неправильное сворачивание и агрегацию, и обладает слабой АТФ-азной активностью (Ellis, 1987; Gething and Sambrook, 1992; Martin et al., 1991; Viitanen et al., 1992). Свою функцию GroEL выполняет с использованием лигандов: ионов К и

Mg", АТФ, АДФ, и гомогептамерного белка GroES (Ellis, 1987; Gething and Sambrook, 1992; Martin et al., 1991; Xu et al., 1997).

Настоящая работа посвящена исследованию закономерностей взаимодействия шаперонина GroEL (hsp60) с денатурированными белками и влияния на это взаимодействие его лигандов in vitro. В работе исследовано взаимодействие GroEL с широким спектром полипептидных цепей, не имеющих жесткой пространственной структуры. В качестве белковых мишеней GroEL были использованы как кинетические промежуточные состояния, накапливающиеся в процессе ренатурации ряда белков, так и термодинамически стабильные промежуточные состояния, полученные денатурацией белков в нативных для GroEL условиях.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Марченков, Виктор Викторович

выводы

1. Предложена универсальная модель функционирования GroEL в качестве молекулярного шаперона, которая не имеет ограничений на количество и размер связываемых белковых субстратов и предполагает их сворачивание в свободном состоянии вне комплекса с GroEL.

2. Определены внешние условия, необходимые для прочного связывания GroEL с денатурированными белками: значения рН от 7 до 9, наличие физиологической ионной силы раствора (не менее 100 мМ NaCl) либо небольших концентраций двухвалентных катионов (1мМ-5мМ).

3. Связывание белковых мишеней стабилизирует структуру GroEL по отношению к действию повышенной температуры и протеаз.

4. Шаперонин GroEL связывает белки, находящиеся в ранних кинетических промежуточных состояниях, и блокирует их сворачивание. Сворачивание белковых мишеней происходит в свободном состоянии, после их диссоциации из комплекса с шаперонином.

5. GroEL связывает как минимум две молекулы белковой мишени. Лиганды GroEL ослабляют сродство к денатурированным белкам с эффективностью, увеличивающейся в ряду АДФ < АТФ < АДФ-GroES < АТФ-GroES.

Хочу выразить глубочайшую признательность своему научному руководителю, Геннадию Васильевичу Семисотнову, за переданные мне знания и опыт, терпение и помощь в подготовке диссертационной работы.

Искренне благодарю Ивана Андреевича Кашпарова и Наталью Яковлевну Кашпарову, своих первых наставников в Институте белка.

Особую благодарность за помощь и совместную работу хочу высказать сотрудникам Института белка: Нине Владимировне Котовой, Светлане Юрьевне Марченковой, Оксане Валериановне Галзитской, Алексею Константиновичу Сурину, Богдану Степановичу Мельнику, Наталии Юрьевне Марченко, Татьяне Николаевне Мельник, Александру Александровичу Тимченко.

Отдельную благодарность хочу выразить заведующему лабораторией Физики белка ИБ РАН Алексею Витальевичу Финкельштейну за обсуждение полученных результатов и ценные рекомендации по их представлению.

Благодарю всех сотрудников Института белка РАН, и особенно коллег из лаборатории Физики белка, за внимание, помощь и поддержку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в работе результаты и анализ литературных данных по структурным и биохимическим аспектам функционирования шаперонина GroEL позволяет поставить под сомнение универсальность модели сворачивания белков во внутренней полости шаперонинов. Хотя такая изоляция сворачивающейся белковой молекулы и представляется привлекательной для предотвращения нежелательных контактов белков, находящихся в сильно «гидрофобных» промежуточных состояниях, друг с другом, эта модель не может объяснить слишком много экспериментальных фактов. Предложенная нами модель, предполагающая наличие в различной степени вероятных актов связывания белковых мишеней с шаперонином и диссоциации с его поверхности, а также спонтанное сворачивание белка в свободном состоянии, сводит функцию шаперонинов к «удержанию» около себя сильно «гидрофобных» промежуточных состояний белков и, тем самым, к понижению концентрации этих состояний в растворе, что должно существенно понижать вероятность их неспецифической ассоциации. Лиганды шаперонинов понижают их сродство к ненативным полипептидным цепям, предотвращая формирование «долгоживущих» комплексов, которые не выгодны для быстрого восстановления клеточных процессов после стресса. Можно предположить, что кольцевая организация олигомерной структуры шаперонинов предназначена не столько для образования обширной внутренней полости, сколько для формирования множественных «гидрофобных» центров связывания, чтобы удержать на себе большие молекулы денатурированных белков. Кроме того, шаперонины должны «защищать» себя самих от неспецифической ассоциации по этим «гидрофобным» центрам. Возможно, именно поэтому они эволюционировали как олигомерные сильно заряженные при нейтральных рН комплексы, обладающие хорошей растворимостью даже при больших концентрациях. Дальнейшее изучение свойств как мономерных, так и олигомерных шаперонов из различных организмов позволит более определённо выяснить механизм их участия в процессах созревания и транспорта белковых молекул в клетке.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Марченков, Виктор Викторович, Пущино

1. Кантор Ч и ШиммелП. Биофизическая химия. Т. 3. 1985. Москва. «Мир»

2. Котова Н В и Семисотнов Г. В. Сворачивание глобулярных белков in vitro. Успехи биологической химии. 1998. Т. 38, С. 199-223.

3. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. 1986. Москва. «Мир».

4. Марченков В. В., Марченко Н. Ю., Марченкова С. Ю., Семисотнов Г. В. Молекулярные шаперонины прокариотических и эукариотических клеток. Успехи биологической химии. 2006. Т. 46, С. 279-302.

5. Птицын О.Б. Стадийный механизм самоорганизации белковых молекул. Докл АН СССР. 1973. Т. 210. С. 1213-1215.

6. Сурин А. К., Котова Н. В., Марченкова С. Ю., Марченков В. В., Семисотнов Г. В. Мономерная форма молекулярного шаперона GroEL: структура, стабильность и олигомеризация. Биоорганическая химия. 1999, Т. 25, N5, С. 358-365.

7. Ahner, A., Whyte, F. M., & Brodsky, J. L. Distinct but overlapping functions of Hsp70, Hsp90, and an Hsp70 nucleotide exchange factor during protein biogenesis in yeast. Arch.Biochem.Biophys. 2005. v. 435(1), p. 32-41.

8. Anfinsen, С. B. Principles that govern the folding of protein chains. Science. 1973. v. 181(96), p. 223-230.

9. Aoki, K., Taguchi, H., Shindo, Y., Yoshida, M., Ogasahara, K., Yutani, K., & Tanaka, N. Calorimetric observation of a GroEL-protein binding reaction with little contribution of hydrophobic interaction. J.Biol.Chem. 1997. v. 272(51), p. 32158-32162.

10. Armstrong, J. M., Myers, D. V., Verpoorte, J. A., & Edsall, J. T. Purification and properties of human erythrocyte carbonic anhydrases. J.Biol.Chem. 1966. v. 241(21), p. 5137-5149.

11. Azem, A., Diamant, S., & Goloubinoff, P. Effect of divalent cations on the molecular structure of the GroEL oligomer. Biochemistry. 1994. v. 33(21), p. 6671-6675.

12. Banecki, B. & Zylicz, M. Real time kinetics of the DnaK/DnaJ/GrpE molecular chaperone machine action. J.Biol.Chem. 1996. v. 271(11), p. 6137-6143.

13. Barrick, D. & Baldwin, R. L. Three-state analysis of sperm whale apomyoglobin folding. Biochemistry. 1993. v. 32(14), p. 3790-3796.

14. Beatrix, B, Sakai, H, & Wiedmann, M. The alpha and beta subunit of the nascent polypeptide-associated complex have distinct functions. J.Biol.Chem. 2000. v. 275(48), p. 37838-37845.

15. Bhattacharyya, A. M. & Horowitz, P. M. The aggregation state of rhodanese during folding influences the ability of GroEL to assist reactivation. J.Biol.Chem. 2001. v. 276(31), p. 28739-28743.

16. Blaha, G, Wilson, D. N, Stoller, G, Fischer, G, Willumeit, R., & Nierhaus, К. H. Localization of the trigger factor binding site on the ribosomal 50S subunit. J.MoLBiol. 2003. v. 326(3), p. 887-897.

17. Bochkareva, E. S, Lissin, N. M, Flynn, G. C, Rothman, J. E, & Girshovich, A. S. Positive cooperativity in the functioning of molecular chaperone GroEL. J.Biol.Chem. 1992. v. 267(10), p. 6796-6800.

18. Bochkareva, E. S, Lissin, N. M, & Girshovich, A. S. Transient association of newly synthesized unfolded proteins with the heat-shock GroEL protein. Nature. 1988. v. 336(6196), p. 254-257.

19. Boisvert, D. C, Wang, J, Otwinowski, Z, Horwich, A. L., & Sigler, P. B. The 2.4 A crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL complexed with ATP gamma S. Nat.Struct.Biol. 1996. v. 3(2), p. 170-177.

20. Bova, M. P., Ding, L. L., Horwitz, J., & Fung, В. K. Subunit exchange of alphaA-crystallin. J.Biol.Chem. 1997. v. 272(47), p. 29511-29517.

21. Braig, K., Adams, P. D., & Brunger, A. T. Conformational variability in the refined structure of the chaperonin GroEL at 2.8 A resolution. Nat.Struct.Biol. 1995. v. 2(12), p. 1083-1094.

22. Braig, К., Otwinowski, Z., Hegde, R., Boisvert, D. C., Joachimiak, A., Horwich, A. L., & Sigler, P. B. The crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL at 2.8 A. Nature. 1994. v. 371(6498), p. 578-586.

23. Braig, K., Simon, M., Furuya, F., Hainfeld, J. F., & Horwich, A. L. A polypeptide bound by the chaperonin groEL is localized within a central cavity. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1993. v. 90(9), p. 3978-3982.

24. Brinker, A., Pfeifer, G., Kerner, M. J., Naylor, D. J., Hartl, F. U., & Hayer-Hartl, M. Dual function of protein confinement in chaperonin-assisted protein folding. Cell. 2001. v. 107(2), p. 223-233.

25. Buchner, J., Ehrnsperger, M., Gaestel, M., & Walke, S. Purification and characterization of small heat shock proteins. Methods Enzymol. 1998. v. 290 339-349.

26. Bukau, B. & Horwich, A. L. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell. 1998. v. 92(3), p. 351-366.

27. Burston, S. G., Ranson, N. A., & Clarke, A. R. The origins and consequences of asymmetry in the chaperonin reaction cycle. J.Mol.Biol. 1995. v. 249(1), p. 138-152.

28. Cai, H., Wang, С. C., & Tsou, C. L. Chaperone-like activity of protein disulfide isomerase in the refolding of a protein with no disulfide bonds. J.Biol.Chem. 1994. v. 269(40), p. 24550-24552.

29. Callender, R. H., Dyer, R. В., Gilmanshin, R., & Woodruff, W. H. Fast events in protein folding: the time evolution of primary processes. Annu.Rev.Phys. Chem. 1998. v. 49 173-202.

30. Cashikar, A. G., Duennwald, M. L., & Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation: Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hspl04. J.Biol.Chem. 2005.

31. Chandrasekhar, G. N., Tilly, K., Woolford, C., Hendrix, R., & Georgopoulos, C. Purification and properties of the groES morphogenetic protein of Escherichia coli. J.Biol.Chem. 1986. v. 261(26), p. 12414-12419.

32. Chaudhuri, Т. K., Farr, G. W., Fenton, W. A., Rospert, S., & Horwich, A. L. GroEL/GroES-mediated folding of a protein too large to be encapsulated. Cell. 2001. v. 107(2), p. 235-246.

33. Cheetham, M. E. & Caplan, A. J. Structure, function and evolution of DnaJ: conservation and adaptation of chaperone function. Cell Stress. Chaperones. 1998. v. 3(1), p. 28-36.

34. Chen, H., Zhou, X., & Ou-Yang, Z. C. Secondary-structure-favored hydrophobic-polar lattice model of protein folding. Phys.Rev.E.Stat.Nonlin.Soft.Matter Phys. 2001. v. 64(4 Pt 1), p. 041905.

35. Chen, L. & Sigler, P. B. The crystal structure of a GroEL/peptide complex: plasticity as a basis for substrate diversity. Cell. 1999. v. 99(7), p. 757-768.

36. Cintron, N. S. & Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J.Biol.Chem. 2006. v. 281(36), p. 26235-26244.

37. Collier, D. N. SecB: a molecular chaperone of Escherichia coli protein secretion pathway. Adv.Protein Chem. 1993. v. 44 151-193.

38. Coyle, J. E., Texter, F. L., Ashcroft, A. E., Masselos, D., Robinson, С. V., & Radford, S. E. GroEL accelerates the refolding of hen lysozyme without changing its folding mechanism. Nat.Struct.Biol. 1999. v. 6(7), p. 683-690.

39. Cyr, D. M. Cooperation of the molecular chaperone Ydj 1 with specific Hsp70 homologs to suppress protein aggregation. FEBS Lett. 1995. v. 359(2-3), p. 129-132.

40. Cyr, D. M. & Douglas, M. G. Differential regulation of Hsp70 subfamilies by the eukaryotic DnaJ homologue YDJ1. J.Biol.Chem. 1994. v. 269(13), p. 97989804.

41. Dekker, P. J. & Pfanner, N. Role of mitochondrial GrpE and phosphate in the ATPase cycle of matrix Hsp70. J.Mol.Biol. 1997. v. 270(3), p. 321-327.

42. Dolgikh, D. A., Gilmanshin, R. I., Brazhnikov, E. V., Bychkova, V. E., Semisotnov, G. V., Venyaminov, S. Y., & Ptitsyn, О. B. Alpha-Lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure? FEBS Lett. 1981. v. 136(2), p. 311-315.

43. Ehrnsperger, M., Gaestel, M., & Buchner, J. Analysis of chaperone properties of small Hsp's. Methods Mol.Biol. 2000. v. 99 421-429.

44. Ehrnsperger, M., Graber, S., Gaestel, M., & Buchner, J. Binding of non-native protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. EMBOJ. 1997. v. 16(2), p. 221-229.

45. Ehrnsperger, M., Lilie, H., Gaestel, M., & Buchner, J. The dynamics of Hsp25 quaternary structure. Structure and function of different oligomeric species. J.Biol.Chem. 1999. v. 274(21), p. 14867-14874.

46. Ellis, J. Proteins as molecular chaperones. Nature. 1987. v. 328(6129), p. 378379.

47. Ewalt, К. L., Hendrick, J. P., Houry, W. A., & Hartl, F. U. In vivo observation of polypeptide flux through the bacterial chaperonin system. Cell. 1997. v. 90(3), p. 491-500.

48. Farr, G. W„ Fenton, W. A., Chaudhuri, Т. K., Clare, D. K., Saibil, H. R., & Horwich, A. L. Folding with and without encapsulation by cis- and trans-only GroEL-GroES complexes. EMBOJ. 2003. v. 22(13), p. 3220-3230.

49. Fayet, O., Ziegelhoffer, Т., & Georgopoulos, C. The groES and groEL heat shock gene products of Escherichia coli are essential for bacterial growth at all temperatures. J.Bacteriol 1989. v. 171(3), p. 1379-1385.

50. Fenton, W. A. & Horwich, A. L. GroEL-mediated protein folding. Protein Sci. 1997. v. 6(4), p. 743-760.

51. Fenton, W. A., Kashi, Y., Furtak, K., & Horwich, A. L. Residues in chaperonin GroEL required for polypeptide binding and release. Nature. 1994. v. 371(6498), p. 614-619.

52. Ferbitz, L., Maier, Т., Patzelt, H., Bukau, В., Deuerling, E., & Ban, N. Trigger factor in complex with the ribosome forms a molecular cradle for nascent proteins. Nature. 2004. v. 431(7008), p. 590-596.

53. Freedman, R. В., Hillson, D. A., & Creighton, Т. E. Disulphide-bound formation in protein folding catalysed by highly-purified protein disulphide-isomerase. Biochem.Soc. Trans. 1981. v. 9(1), p. 78-80.

54. Freeman, В. C. & Morimoto, R. I. The human cytosolic molecular chaperones hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native protein and protein refolding. EMBO J. 1996. v. 15(12), p. 2969-2979.

55. Gebauer, M., Melki, R., & Gehring, U. The chaperone cofactor Hop/p60 interacts with the cytosolic chaperonin-containing TCP-1 and affects its nucleotide exchange and protein folding activities. J.Biol.Chem. 1998. v. 273(45), p. 29475-29480.

56. Genevaux, P., Keppel, F., Schwager, F., Langendijk-Genevaux, P. S., Hartl, F. U., & Georgopoulos, C. In vivo analysis of the overlapping functions of DnaK and trigger factor. EMBO Rep. 2004. v. 5(2), p. 195-200.

57. Georgopoulos, C. P., Hendrix, R. W., Casjens, S. R., & Kaiser, A. D. Host participation in bacteriophage lambda head assembly. J.Mol.Biol. 1973. v. 76(1), p. 45-60.

58. Gething, M. J. & Sambrook, J. Protein folding in the cell. Nature. 1992. v. 355(6355), p. 33-45.

59. Gilmanshin, R. I. & Ptitsyn, О. B. An early intermediate of refolding alpha-lactalbumin forms within 20 ms. FEBS Lett. 1987. v. 223(2), p. 327-329.

60. Goldberg, M. E., Semisotnov, G. V., Friguet, В., Kuwajima, K., Ptitsyn, О. В., & Sugai, S. An early immunoreactive folding intermediate of the tryptophan synthease beta 2 subunit is a 'molten globule'. FEBS Lett. 1990. v. 263(1), p. 51-56.

61. Goloubinoff, P., Christeller, J. Т., Gatenby, A. A., & Lorimer, G. H. Reconstitution of active dimeric ribulose bisphosphate carboxylase from an unfoleded state depends on two chaperonin proteins and Mg-ATP. Nature. 1989. v. 342(6252), p. 884-889.

62. Gomez-Puertas, P., Martin-Benito, J., Carrascosa, J. L., Willison, K. R., & Valpuesta, J. M. The substrate recognition mechanisms in chaperonins. J.Mol.Recognit. 2004. v. 17(2), p. 85-94.

63. Goto, Y., Calciano, L. J., & Fink, A. L. Acid-induced folding of proteins. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 1990a. v. 87(2), p. 573-577.

64. Goto, Y., Takahashi, N., & Fink, A. L. Mechanism of acid-induced folding of proteins. Biochemistry. 1990b. v. 29(14), p. 3480-3488.

65. Grallert, H., Rutkat, K., & Buchner, J. Limits of protein folding inside GroE complexes. J.Biol.Chem. 2000. v. 275(27), p. 20424-20430.

66. Grantham, J., Llorca, O., Valpuesta, J. M., & Willison, K. R. Partial occlusion of both cavities of the eukaryotic chaperonin with antibody has no effect upon the rates of beta-actin or alpha-tubulin folding. J.Biol.Chem. 2000. v. 275(7), p. 4587-4591.

67. Grbovic, О. M., Basso, A. D., Sawai, A., Ye, Q., Friedlander, P., Solit, D., & Rosen, N. V600E B-Raf requires the Hsp90 chaperone for stability and is degraded in response to Hsp90 inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 2006. v. 103(1), p. 57-62.

68. Gross, M., Robinson, С. V., Mayhew, M., Hartl, F. U., & Radford, S. E. Significant hydrogen exchange protection in GroEL-bound DHFR is maintained during iterative rounds of substrate cycling. Protein Sci. 1996. v. 5(12), p. 2506-2513.

69. Gu, L., Abulimiti, A., Li, W., & Chang, Z. Monodisperse Hsp 16.3 nonamer exhibits dynamic dissociation and reassociation, with the nonamer dissociation prerequisite for chaperone-like activity. J.Mol.Biol. 2002. v. 319(2), p. 517526.

70. Hansen, J. E. & Gafni, A. Fluorescence detection of conformational changes in GroEL induced by thermal switching and nucleotide binding. J.Biol.Chem. 1994. v. 269(9), p. 6286-6289.

71. Hartl, F. U. Protein folding. Secrets of a double-doughnut. Nature. 1994. v. 371(6498), p. 557-559.

72. Hartl, F. U. & Martin, J. Molecular chaperones in cellular protein folding. Curr.Opin.Struct.Biol. 1995. v. 5(1), p. 92-102.

73. Hayer-Hartl, M. K., Ewbank, J. J., Creighton, Т. E., & Hartl, F. U. Conformational specificity of the chaperonin GroEL for the compact folding intermediates ofalpha-lactalbumin. EMBOJ. 1994. v. 13(13), p. 3192-3202.

74. Hemmingsen, S. M., Woolford, C., van, d., V, Tilly, K., Dennis, D. Т., Georgopoulos, C. P., Hendrix, R. W., & Ellis, R. J. Homologous plant and bacterial proteins chaperone oligomeric protein assembly. Nature. 1988. v. 333(6171), p. 330-334.

75. Hendrix, R. W. Purification and properties of groE, a host protein involved in bacteriophage assembly. J.Mol.Biol. 1979. v. 129(3), p. 375-392.

76. Herendeen, S. L., VanBogelen, R. A., & Neidhardt, F. C. Levels of major proteins of Escherichia coli during growth at different temperatures. J.Bacteriol. 1979. v. 139(1), p. 185-194.

77. Horwich, A. L., Low, К. В., Fenton, W. A., Hirshfield, I. N., & Furtak, K. Folding in vivo of bacterial cytoplasmic proteins: role of GroEL. Cell. 1993. v. 74(5), p. 909-917.

78. Houry, W. A., Frishman, D., Eckerskorn, C., Lottspeich, F., & Hartl, F. U. Identification of in vivo substrates of the chaperonin GroEL. Nature. 1999. v. 402(6758), p. 147-154.

79. Houry, W. A., Sauder, J. M., Roder, H., & Scheraga, H. A. Definition of amide protection factors for early kinetic intermediates in protein folding. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 1998. v. 95(8), p. 4299-4302.

80. Hunt, J. F., Weaver, A. J., Landry, S. J., Gierasch, L., & Deisenhofer, J. The crystal structure of the GroES co-chaperonin at 2.8 A resolution. Nature. 1996. v. 379(6560), p. 37-45.

81. Ishii, N., Taguchi, H., Sasabe, H., & Yoshida, M. Folding intermediate binds to the bottom of bullet-shaped holo-chaperonin and is readily accessible to antibody. J.Mol.Biol. 1994. v. 236(3), p. 691-696.

82. Ivankov, D. N. & Finkelstein, A. V. Prediction of protein folding rates from the amino acid sequence-predicted secondary structure. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2004. v. 101(24), p. 8942-8944.

83. Jacob, M., Holtermann, G., Perl, D., Reinstein, J., Schindler, Т., Geeves, M. A., & Schmid, F. X. Microsecond folding of the cold shock protein measured by a pressure-jump technique. Biochemistry. 1999. v. 38(10), p. 2882-2891.

84. Jakob, U., Gaestel, M., Engel, K., & Buchner, J. Small heat shock proteins are molecular chaperones. J.Biol.Chem. 1993. v. 268(3), p. 1517-1520.

85. Jeng, M. F., Englander, S. W., Elove, G. A., Wand, A. J., & Roder, H. Structural description of acid-denatured cytochrome с by hydrogen exchange and 2D NMR. Biochemistry. 1990. v. 29(46), p. 10433-10437.

86. Jennings, P. A. & Wright, P. E. Formation of a molten globule intermediate early in the kinetic folding pathway of apomyoglobin. Science. 1993. v. 262(5135), p. 892-896.

87. Katsumata, К., Okazaki, A., & Kuwajima, K. Effect of GroEL on the refolding kinetics of alpha-lactalbumin. J.Mol.Biol. 1996a. v. 258(5), p. 827-838.

88. Katsumata, K., Okazaki, A., Tsurupa, G. P., & Kuwajima, K. Dominant forces in the recognition of a transient folding intermediate of alpha-lactalbumin by GroEL. J.Mol.Biol 1996b. v. 264(4), p. 643-649.

89. Keiler, К. C., Waller, P. R., & Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 1996. v. 271(5251), p. 990-993.

90. Keskin, O., Bahar, I., Flatow, D., Covell, D. G., & Jernigan, R. L. Molecular mechanisms of chaperonin GroEL-GroES function. Biochemistry. 2002. v. 41(2), p. 491-501.

91. Kubota, H., Hynes, G., & Willison, K. The chaperonin containing t-complex polypeptide 1 (TCP-1). Multisubunit machinery assisting in protein folding and assembly in the eukaryotic cytosol. Eur.J.Biochem. 1995. v. 230(1), p. 3-16.

92. Kusukawa, N., Yura, Т., Ueguchi, C., Akiyama, Y., & Ito, K. Effects of mutations in heat-shock genes groES and groEL on protein export in Escherichia coli. EMBO J. 1989. v. 8(11), p. 3517-3521.

93. Kuwajima, K. The molten globule state of alpha-lactalbumin. FASEB J. 1996. v. 10(1), p. 102-109.

94. Kuwajima, K., Semisotnov, G. V., Finkelstein, A. V., Sugai, S., & Ptitsyn, O. B. Secondary structure of globular proteins at the early and the final stages in protein folding. FEBSLett. 1993. v. 334(3), p. 265-268.

95. Kuwajima, К., Yamaya, H., Miwa, S., Sugai, S., & Nagamura, T. Rapid formation of secondary structure framework in protein folding studied by stopped-flow circular dichroism. FEBS Lett. 1987. v. 221(1), p. 115-118.

96. Kuwajima, K., Yamaya, H., & Sugai, S. The burst-phase intermediate in the refolding of beta-lactoglobulin studied by stopped-flow circular dichroism and absorption spectroscopy. J.Mol.Biol. 1996. v. 264(4), p. 806-822.

97. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. v. 227(5259), p. 680-685.

98. Landry, S. J. & Gierasch, L. M. The chaperonin GroEL binds a polypeptide in an alpha-helical conformation. Biochemistry. 1991. v. 30(30), p. 7359-7362.

99. Landry, S. J., Jordan, R., McMacken, R., & Gierasch, L. M. Different conformations for the same polypeptide bound to chaperones DnaK and GroEL. Nature. 1992. v. 355(6359), p. 455-457.

100. Laskey, R. A., Honda, В. M., Mills, A. D., & Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 1978. v. 275(5679), p. 416-420.

101. Lau, С. K. & Churchich, J. E. Binding of polylysine to GroEL. Inhibition of the refolding of mMDH. Biochim.Biophys.Acta. 1999. v. 1431(2), p. 282-289.

102. Laufen, Т., Mayer, M. P., Beisel, C., Klostermeier, D., Mogk, A., Reinstein, J., & Bukau, B. Mechanism of regulation of hsp70 chaperones by DnaJ cochaperones. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1999. v. 96(10), p. 5452-5457.

103. Lin, Z., Schwartz, F. P., & Eisenstein, E. The hydrophobic nature of GroEL-substrate binding. J.Biol.Chem. 1995. v. 270(3), p. 1011-1014.

104. Lindquist, S. & Craig, E. A. The heat-shock proteins. Annu.Rev. Genet. 1988. v. 22 631-677.

105. Lissin, N. M., Venyaminov, S. Y., & Girshovich, A. S. (Mg-ATP)-dependent self-assembly of molecular chaperone GroEL. Nature. 1990. v. 348(6299), p. 339-342.

106. Liu, C. & Welsh, M. J. Identification of a site of Hsp27 binding with Hsp27 and alpha B-crystallin as indicated by the yeast two-hybrid system. Biochem.Biophys.Res. Commun. 1999. v. 255(2), p. 256-261.

107. Lu, Z. & Cyr, D. M. Protein folding activity of Hsp70 is modified differentially by the hsp40 co-chaperones Sisl and Ydjl .J.Biol.Chem. 1998. v. 273(43), p. 27824-27830.

108. Luke, M. M., Sutton, A., & Arndt, К. T. Characterization of SIS1, a Saccharomyces cerevisiae homologue of bacterial dnaJ proteins. J.Cell Biol. 1991. v. 114(4), p. 623-638.

109. Makio, Т., Arai, M., & Kuwajima, K. Chaperonin-affected refolding of alpha-lactalbumin: effects of nucleotides and the co-chaperonin GroES. J.Mol.Biol 1999. v. 293(1), p. 125-137.

110. Martin, J., Langer, Т., Boteva, R., Schramel, A., Horwich, A. L., & Hard, F. U. Chaperonin-mediated protein folding at the surface of groEL through a 'molten globule'-like intermediate. Nature. 1991. v. 352(6330), p. 36-42.

111. Martin, J., Mayhew, M., Langer, Т., & Hartl, F. U. The reaction cycle of GroEL and GroES in chaperonin-assisted protein folding. Nature. 1993. v. 366(6452), p. 228-233.

112. Mayhew, M., da Silva, A. C., Martin, J., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., & Hartl, F. U. Protein folding in the central cavity of the GroEL-GroES chaperonin complex. Nature. 1996. v. 379(6564), p. 420-426.

113. McCarty, J. S., Buchberger, A., Reinstein, J., & Bukau, B. The role of ATP in the functional cycle of the DnaK chaperone system. J.Mol.Biol. 1995. v. 249(1), p. 126-137.

114. McClellan, A. J., Scott, M. D., & Frydman, J. Folding and quality control of the VHL tumor suppressor proceed through distinct chaperone pathways. Cell.2005. v. 121(5), p. 739-748.

115. Mendoza, J. A. & Campo, G. D. Ligand-induced conformational changes of GroEL are dependent on the bound substrate polypeptide. J.Biol.Chem. 1996. v. 271(27), p. 16344-16349.

116. Murphy, K. P., Bhakuni, V., Xie, D., & Freire, E. Molecular basis of co-operativity in protein folding. III. Structural identification of cooperative folding units and folding intermediates. J.Mol.Biol. 1992. v. 227(1), p. 293306.

117. Neuweiler, H., Doose, S., & Sauer, M. A microscopic view of miniprotein folding: enhanced folding efficiency through formation of an intermediate. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 2005. v. 102(46), p. 16650-16655.

118. Nishimura, C., Dyson, H. J., & Wright, P. E. Identification of native and non-native structure in kinetic folding intermediates of apomyoglobin. J.Mol.Biol.2006. v. 355(1), p. 139-156.

119. Nishimura, С., Wright, P. E., & Dyson, H. J. Role of the В helix in early folding events in apomyoglobin: evidence from site-directed mutagenesis for native-like long range interactions. J.Mol.Biol. 2003. v. 334(2), p. 293-307.

120. Ohgushi, M. & Wada, A. 'Molten-globule state': a compact form of globular proteins with mobile side-chains. FEBSLett. 1983. v. 164(1), p. 21-24.

121. Pack, C. G., Nishimura, G., Tamura, M., Aoki, K., Taguchi, H., Yoshida, M., & Kinjo, M. Analysis of interaction between chaperonin GroEL and its substrate using fluorescence correlation spectroscopy. Cytometry. 1999. v. 36(3), p. 247-253.

122. Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., & Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp 104. Nature. 1994. v. 372(6505), p. 475-478.

123. Pearl, L. H. & Prodromou, C. Structure, function, and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone. Adv.Protein Chem. 2001. v. 59 157-186.

124. Perrett, S., Zahn, R., Stenberg, G., & Fersht, A. R. Importance of electrostatic interactions in the rapid binding of polypeptides to GroEL. J.Mol.Biol. 1997. v. 269(5), p. 892-901.

125. Plaxco, K. W., Simons, К. Т., & Baker, D. Contact order, transition state placement and the refolding rates of single domain proteins. J.Mol.Biol. 1998. v. 277(4), p. 985-994.

126. Potekhin, S. & Pfeil, W. Microcalorimetric studies of conformational transitions of ferricytochrome с in acidic solution. Biophys.Chem. 1989. v. 34(1), p. 55-62.ч

127. Pratt, W. В. & Toft, D. О. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr.Rev. 1997. v. 18(3), p. 306-360.

128. Ptitsyn, О. В., Denesyuk, A. I., Finkelstein, A. V., & Lim, V. I. Prediction of the secondary structure of the L7, LI2 proteins of the E. coli ribosome. FEBS Lett. 1973. v. 34(1), p. 55-57.

129. Ptitsyn, О. В., Pain, R. H., Semisotnov, G. V., Zerovnik, E., & Razgulyaev, О. I. Evidence for a molten globule state as a general intermediate in protein folding. FEBS Lett. 1990. v. 262(1), p. 20-24.

130. Raman, B. & Rao, С. M. Chaperone-like activity and temperature-induced 4 structural changes of alpha-crystallin. J.Biol.Chem. 1997. v. 272(38), p. 2355923564.

131. Randall, L. L., Topping, Т. В., & Hardy, S. J. No specific recognition of leader peptide by SecB, a chaperone involved in protein export. Science. 1990. v. 248(4957), p. 860-863.

132. Ranson, N. A., Dunster, N. J., Burston, S. G., & Clarke, A. R. Chaperonins can catalyse the reversal of early aggregation steps when a protein misfolds. J.Mol.Biol. 1995. v. 250(5), p. 581-586.

133. Richarme, G. & Kohiyama, M. Autostimulation of the DnaK (HSP 70) ATPase of Escherichia coli. FEBS Lett. 1993. v. 322(3), p. 277-279.

134. Richarme, G. & Kohiyama, M. Amino acid specificity of the Escherichia coli « chaperone GroEL (heat shock protein 60). J.Biol.Chem. 1994. v. 269(10), p.7095-7098.

135. Robinson, С. V., Gross, M., Eyles, S. J., Ewbank, J. J., Mayhew, M., Hartl, F. U., Dobson, С. M., & Radford, S. E. Conformation of GroEL-bound alpha-lactalbumin probed by mass spectrometry. Nature. 1994. v. 372(6507), p. 646651.

136. Roder, H., Elove, G. A., & Englander, S. W. Structural characterization of folding intermediates in cytochrome с by H-exchange labelling and proton NMR. Nature. 1988. v. 335(6192), p. 700-704.

137. Roseman, A. M., Chen, S., White, H., Braig, K., & Saibil, H. R. The chaperonin ATPase cycle: mechanism of allosteric switching and movements of substrate-binding domains in GroEL. Cell. 1996. v. 87(2), p. 241-251.

138. Roseman, A. M., Ranson, N. A., Gowen, В., Fuller, S. D., & Saibil, H. R. Structures of unliganded and ATP-bound states of the Escherichia coli chaperonin GroEL by cryoelectron microscopy. J.Struct.Biol. 2001. v. 135(2), p. 115-125.

139. Rothman, J. E. Polypeptide chain binding proteins: catalysts of protein folding and related processes in cells. Cell. 1989. v. 59(4), p. 591-601.

140. Rowley, N., Prip-Buus, C., Westermann, В., Brown, C., Schwarz, E., Barrell, В., & Neupert, W. Mdjlp, a novel chaperone of the DnaJ family, is involved in mitochondrial biogenesis and protein folding. Cell. 1994. v. 77(2), p. 249-259.

141. Rudiger, S., Germeroth, L., Schneider-Mergener, J., & Bukau, B. Substrate specificity of the DnaK chaperone determined by screening cellulose-bound peptide libraries. EMBO J. 1997. v. 16(7), p. 1501-1507.

142. Schmid, D., Baici, A., Gehring, H., & Christen, P. Kinetics of molecular chaperone action. Science. 1994. v. 263(5149), p. 971-973.

143. Schmidt, M., Rutkat, K., Rachel, R., Pfeifer, G., Jaenicke, R., Viitanen, P., Lorimer, G., & Buchner, J. Symmetric complexes of GroE chaperonins as part of the functional cycle. Science. 1994. v. 265(5172), p. 656-659.

144. Scholz, С., Mucke, M., Rape, M., Pecht, A., Pahl, A., Bang, H., & Schmid, F. X. Recognition of protein substrates by the prolyl isomerase trigger factor is independent of proline residues. J.Mol.Biol. 1998. v. 277(3), p. 723-732.

145. Seckler, R. & Jaenicke, R. Protein folding and protein refolding. FASEB J. 1992. v. 6(8), p. 2545-2552.

146. Semisotnov, G. V., Kutyshenko, V. P., & Ptitsyn, О. B. Intramolecular mobility of a protein in a "molten globule" state. A study of carbonic anhydrase by 1H-NMR., Mol.Biol.(Mosk). 1989. v. 23(3), p. 808-815.

147. Semisotnov, G. V., Rodionova, N. A., Kutyshenko, V. P., Ebert, В., Blanck, <V J-> & Ptitsyn, О. B. Sequential mechanism of refolding of carbonic anhydrase

148. B. FEBS Lett. 1987. v. 224(1), p. 9-13.

149. Semisotnov, G. V., Uversky, V. N., Sokolovsky, I. V., Gutin, A. M., Razgulyaev, О. I., & Rodionova, N. A. Two slow stages in refolding of bovine carbonic anhydrase В are due to proline isomerization. J.Mol.Biol. 1990. v. 213(3), p. 561-568.

150. Shastry, M. C., Luck, S. D., & Roder, H. A continuous-flow capillary mixing ■f method to monitor reactions on the microsecond time scale. Biophys.J. 1998. v.74(5), p. 2714-2721.

151. Shi, Y. Y., Hong, X. G., & Wang, С. C. The C-terminal (331-376) sequence of Escherichia coli DnaJ is essential for dimerization and chaperone activity: a small angle X-ray scattering study in solution. J.Biol.Chem. 2005. v. 280(24), p. 22761-22768.

152. Siegers, K., Waldmann, Т., Leroux, M. R., Grein, K., Shevchenko, A., Schiebel, E., & Hartl, F. U. Compartmentation of protein folding in vivo:sequestration of non-native polypeptide by the chaperonin-GimC system. EMBOJ. 1999. v. 18(1), p. 75-84.

153. Sosnick, T. R., Shtilerman, M. D., Mayne, L., & Englander, S. W. Ultrafast signals in protein folding and the polypeptide contracted state. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 1997. v. 94(16), p. 8545-8550.

154. Spreter, Т., Pech, M., & Beatrix, B. The crystal structure of archaeal nascent polypeptide-associated complex (NAC) reveals a unique fold and the presence of a ubiquitin-associated domain. J.Biol.Chem. 2005. v. 280(16), p. 1584915854.

155. Staniforth, R. A., Burston, S. G., Atkinson, Т., & Clarke, A. R. Affinity of chaperonin-60 for a protein substrate and its modulation by nucleotides and chaperonin-10. Biochem.J. 1994. v. 300 (Pt 3) 651-658.

156. Sternberg, N. Properties of a mutant of Escherichia coli defective in bacteriophage lambda head formation (groE). I. Initial characterization. J.Mol.Biol. 1973a. v. 76(1), p. 1-23.

157. Sternberg, N. Properties of a mutant of Escherichia coli defective in bacteriophage lambda head formation (groE). II. The propagation of phage lambda. J.Mol.Biol. 1973b. v. 76(1), p. 25-44.

158. Sun, Y. & Macrae, Т. H. The small heat shock proteins and their role in human disease. FEBSJ. 2005. v. 272(11), p. 2613-2627.

159. Surin, A. K., Kotova, N. V., Kashparov, I. A., Marchenkov, V. V., Marchenkova, S. Y., & Semisotnov, G. V. Ligands regulate GroEL thermostability. FEBS Lett. 1997a. v. 405(3), p. 260-262.

160. Surin, А. К., Kotova, N. V., Marchenkova, S. I., Sokolovskii, I. V., Rodionova, N. A., Iaklichkin, S. I., & Semisotnov, G. V. Denatured transitions of the molecular chaperone GroEL from Escherichia coli. Bioorg.Khim. 1997b. v. 23(4), p. 251-256.

161. Szabo, A., Korszun, R., Hartl, F. U., & Flanagan, J. A zinc finger-like domain of the molecular chaperone DnaJ is involved in binding to denatured protein substrates. EMBOJ. 1996. v. 15(2), p. 408-417.

162. Szabo, A., Langer, Т., Schroder, H., Flanagan, J., Bukau, В., & Hartl, F. U. The ATP hydrolysis-dependent reaction cycle of the Escherichia coli Hsp704 system DnaK, DnaJ, and GrpE. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1994. v. 91(22), p.10345-10349.

163. Tanford, C. Protein denaturation. Adv.Protein Chem. 1968. v. 23 121-282.

164. Tang, W. & Wang, С. C. Zinc fingers and thiol-disulfide oxidoreductase activities of chaperone DnaJ. Biochemistry. 2001. v. 40(49), p. 14985-14994.

165. Todd, M. J., Viitanen, P. V., & Lorimer, G. H. Hydrolysis of adenosine 5-triphosphate by Escherichia coli GroEL: effects of GroES and potassium ion. Biochemistry. 1993. v. 32(33), p. 8560-8567.

166. Todd, M. J., Viitanen, P. V., & Lorimer, G. H. Dynamics of the chaperonin ATPase cycle: implications for facilitated protein folding. Science. 1994. v. 265(5172), p. 659-666.

167. Trent, J. D., Nimmesgern, E., Wall, J. S., Hartl, F. U., & Horwich, A. L. A molecular chaperone from a thermophilic archaebacterium is related to the eukaryotic protein t-complex polypeptide-1. Nature. 1991. v. 354(6353), p. 490-493.

168. Tsurupa, G. P., Ikura, Т., Makio, Т., & Kuwajima, K. Refolding kinetics of staphylococcal nuclease and its mutants in the presence of the chaperonin GroEL. J.Mol.Biol. 1998. v. 277(3), p. 733-745.

169. Uversky, V. N. Use of fast protein size-exclusion liquid chromatography to study the unfolding of proteins which denature through the molten globule. Biochemistry. 1993. v. 32(48), p. 13288-13298.

170. Uversky, V. N. & Ptitsyn, О. B. "Partly folded" state, a new equilibrium state of protein molecules: four-state guanidinium chloride-induced unfolding of beta-lactamase at low temperature. Biochemistry. 1994. v. 33(10), p. 27822791.

171. Uversky, V. N. & Ptitsyn, О. B. Further evidence on the equilibrium "pre-molten globule state": four-state guanidinium chloride-induced unfolding of carbonic anhydrase В at low temperature. J.Mol.Biol. 1996. v. 255(1), p. 215228.

172. Uversky, V. N., Semisotnov, G. V., Pain, R. H., & Ptitsyn, О. B. 'AU-or-none' mechanism of the molten globule unfolding. FEBS Lett. 1992. v. 314(1), p. 8992.

173. Vainberg, I. E., Lewis, S. A., Rommelaere, H., Ampe, C., Vandekerckhove, J., Klein, H. L., & Cowan, N. J. Prefoldin, a chaperone that delivers unfolded proteins to cytosolic chaperonin. Cell. 1998. v. 93(5), p. 863-873.

174. Vas, M., Sinev, M. A., Kotova, N. V., & Semisotnov, G. V. Reactivation of 3-phosphoglycerate kinase from its unfolded proteolytic fragments. Eur.J.Biochem. 1990. v. 189(3), p. 575-579.

175. Vickery, L. E., Silberg, J. J., & Та, D. T. Hsc66 and Hsc20, a new heat shock cognate molecular chaperone system from Escherichia coli. Protein Sci. 1997. v. 6(5), p. 1047-1056.

176. Viitanen, P. V., Gatenby, A. A., & Lorimer, G. H. Purified chaperonin 60 (groEL) interacts with the nonnative states of a multitude of Escherichia coli proteins. Protein Sci. 1992. v. 1(3), p. 363-369.

177. Walter, S., Lorimer, G. H., & Schmid, F. X. A thermodynamic coupling mechanism for GroEL-mediated unfolding. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1996. v. 93(18), p. 9425-9430.

178. Weber-Ban, E. U., Reid, B. G., Miranker, A. D., & Horwich, A. L. Global unfolding of a substrate protein by the HsplOO chaperone ClpA. Nature. 1999. v. 401(6748), p. 90-93.

179. Weissman, J. S., Rye, H. S., Fenton, W. A., Beechem, J. M., & Horwich, A. L. Characterization of the active intermediate of a GroEL-GroES-mediated protein folding reaction. Cell. 1996. v. 84(3), p. 481-490.

180. Wickner, S., Gottesman, S., Skowyra, D., Hoskins, J., McKenney, K., & Maurizi, M. R. A molecular chaperone, ClpA, functions like DnaK and DnaJ. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 1994. v. 91(25), p. 12218-12222.

181. Xu, Z., Horwich, A. L., & Sigler, P. B. The crystal structure of the asymmetric GroEL-GroES-(ADP)7 chaperonin complex. Nature. 1997. v. 388(6644), p. 741-750.

182. A 207. Yifrach, O. & Horovitz, A. Allosteric control by ATP of non-folded protein binding to GroEL. J.Mol.Biol. 1996. v. 255(3), p. 356-361.

183. Yifrach, O. & Horovitz, A. Coupling between protein folding and allostery in the GroE chaperonin system. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2000. v. 97(4), p. 1521-1524.

184. Young, J. C. & Hard, F. U. Polypeptide release by Hsp90 involves ATP hydrolysis and is enhanced by the co-chaperone p23. EMBO J. 2000. v. 19(21), p. 5930-5940.

185. Zimmerman, S. В. & Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J.Mol.Biol. 1991. v. 222(3), p. 599-620.

Информация о работе

Марченков, Виктор Викторович
кандидата биологических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.03

Диссертация

Комплексы молекулярного шаперона GroEL с денатурированными белками - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы