Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ и численное моделирование трансмембранного переноса молекул воды, криопретектора и перераспределения мембранных компонентов вдоль бислоев при низкотемпературном консервировании клеточных суспензий

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Анализ и численное моделирование трансмембранного переноса молекул воды, криопретектора и перераспределения мембранных компонентов вдоль бислоев при низкотемпературном консервировании клеточных суспензий"

ЧЛ

АКАДЕМИЯ НАУК УССР ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. А.А. БОГОМОЛЬЦА

ГОРДИЕНКО Евгений Александрович

УДК 577.1:577.3?

АНАЛИЗ И ЧИСЛЕННОЕ ^ОДЕЛИРОЗАНИЕ ;ТРАНС:ШБРАННОГО ПЕРЕНОСА .МОЛЕКУЛ ВОДЫ, КРИОПРСТЕКГОРА И ПЕРЕРАСПРЕ-

НИЗКОТйШЕРАТУРНШ КОНСЕРВИРОВАНИИ КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

На правах рукописи

ДЕЛЕНИЯ ЖЖРАННЫХ КОМПОНЕНТОВ ВДОЛЬ БИСЛОЕВ ПРИ

Киев - 1989

К9иш & Л~~ ,

К/о 0 03£ 2. ЗС^Кс^

Работа выполнена в лаборатории теоретических основ низкотемпературного консервирования Института проблем криобиологии и криомедицины АН УССР

Официальные оппоненты:

член-корреспондент АН СССР доктор биологических наук Олег Александрович КРШГАЛЬ

доктор биологических наук, профессор Владимир Иосифович ЛУГОВОЙ

доктор биологических наук, профессор Валентин Бабкенович АКОГШН

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. ГЛ.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится "_"_19 г.

в_ часов на заседании специализированного совета Д 016.15.

по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук по специальности "биофизика" в Институте физиологии им. A.A. В< гомольца АН УССР по адресу: Киев, ул. Богомольца, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. A.A. Богомольца.

Автореферат разослан "_"_19 г.

Ученый секретарь специализированного совета

З.А. С0Р01ША-МАРИНА

ьш

г®®*!»:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСГГИКА РАБОТЫ

ол

"чинритуальность проблемы. Созданная П. Мейзуром в 1963 году фи-

¡ико-математическая модель процесса обезвоживания клеток при за-[ораживании биологической суспензии и обобщающая ее двухфакторная ■еория криоповреждения долгое время играли роль методологической 1СН0ВЫ при разработке оптимальных режимов криоконсервирования щеточных суспензий. История ее развития убедительно раскрыла »громные потенциальные возможности физико-математического анализа I численного моделирования криобиологических процессов для изуче-мя закономерностей и механизмов криоповреждения и криозащиты, а •акже для объяснения результатов криоконсервирования клеток при ■ех или иных условиях замораживания-отогрева. Однако, пределы при-генимости указанной модели существенно ограничены, в частности, федположениями о постоянстве скорости охлаждения биологической :успензии и о проницаемости клеточных мембран только для молекул юда, тем более, что в криобиологической литературе появились соления об эффективности кусочно-линейных и экспоненциальных режи-юв охлаждения (Фаррант Дж., 1974; Вильнут И., 1972; Новиков А.Н. I др., 1985), которые не охватываются моделью П. Мейзура. Напри-1ер, чрезвычайно эффективным для некоторое клеток оказался так газываемый метод быстрого двухступенчатого замораживания (Фаррант !д., 1974; Вуд М., Фаррант Дж., 1980). По мнении Дж. Фарранта 1977) эффективность быстрого двухступенчатого замораживания сви-(етельствует против основных положений двухфакторной теории и, в [астности, против того, что скорость охлаждения оказывает сущест-¡енное влияние на выживаемость консервируемых с помощью низких •емператур клеток. Его аргументы заключаются в том, что при быст-юм двухступенчатом замораживании скорость охлаждения на двух эта-юх превосходит оптимальное в соответствии с двухфакторной теори-!й значение, а на этапе экспозиции при субнулевой температуре рав-га нулю и, следовательно, меньше оптимальней енорости. В связи с >тим актуальной стала задача критического пересмотра двухфакторной •еории и создания более совершенной количественной модели, описывающей процессы массопереноса в клеточной суспензии на различных >тапах цикла низкотемпературного консервирования и объясняющей фичину и механизм эффективности нелинейных режимов охлаждения.

В рамках двухфакторной теории криоповреадения и криозащиты предполагается, что клеточная мембрана в процессе низкотшператур ного консервирования остается интактной, то есть ее состояние не изменяется. Но обезвоживание и оводнение клеток, которые имеют, ме сто на всех этапах криоконсервирования, приводят к деформации их мембран даже в отсутствие непосредственного контакта с кристаллами льда. Результаты, полученные в работах В.С.Маркина (1980, 198I 1984), показывают, что при деформации в мембранах могут происходить явления, подобные тем, которые возникают при фазовом переходе липвдно-белкового бислоя из жидкокристаллического в твердое гелеобразное состояние, а именно, латеральное разделение липидов, сепарация белков, образование макроскопических разрывов. Считаете (Белоус A.M., Бондаренко В.А., 1982), что фазовое разделение липидов и белков приводит к образованию микродефектов в структуре бислоя на границах твердой и жидкой фаз, вследствие чего нарушает ся барьерная функция мембран. Агрегация белков при латеральном разделении мембранных компонентов ведет к нарушению функционирова ния мембраносвязанных ферментов. В частности, в области температур ниже фазового перехода повышается активность различных фосфо-липаз, вызывающая гидролиз фосфолипидов до лизофосфатидов и свободных жирных кислот, наблвдается метаболический разбаланс между растворимыми и мембраносвязанными ферментными системами. То обсто ятельство, что изотермическая деформация клеточных структур способна вызвать такие же эффекты, как фазовый переход при охлавдени определяет актуальность и целесообразность изучения деформации кл точных структур и обусловленных ею явлений для выяснения причин, механизмов и закономерностей криоповреждения и криозащиты биологи ческих объектов.

Цель работы. Установить причину эффективности быстрых двухст; пенчатых режимов замораживания, а также механизм и закономерности явлений латерального разделения компонентов и нарушения барьерной функции клеточных мембран при их деформации в процессе криоконсер вирования.

Задачи исследования.

I. Методом численного моделирования изучить кинетику изменен! объема клеток, переохлаждения внутриклеточного раствора, концентр ций проникающего и не проникающего через плазматическую мембрану

веществ внутри клеток на этапах изотермической экспозиции клеток в криоконсервиругхцей среде, охлаждения биологической суспензии до качала кристаллизации в ней и в процессе кристаллизации при охла-здении с постоянной, кусочно-постоянной и экспоненциально снижавшейся скорость» охлаждения.

2. Сформулировать рекомендации по применение нелинейных режимов охлаждения для низкотемпературного консервирования биологических объектов.

3. Методом физико-математического анализа установить причини, механизмы и закономерности явлений латерального перераспределения мембранных компонентов при различных типах деформации клеточных мембран.

4. Установить причин и механизм явления нарушения барьерной функции мембран при гипотоническом лизисе эритроцитов.

Научная новизна. Впервые с помощью физико-математического моделирования расчиташ зависимости переохлаждения внутриклеточного раствора, объела клеток и внутриклеточных концентраций проникающего и не проникающих через плазматические мембраны веществ от температуры при кусочно-линейных и экспоненциальных (двухступенчатых) режимах охлаждения.

Впервые указано и описано явление латеральной сегрегации мембранных компонентов при изотропном растяжении клеточной мембраны как альтернатива образованию в ней макроскопической поры.

Впервые построена физико-математическая модель, описывающая кинетику растворения внутриклеточных кристаллов льда при температуре адаптации в процессе быстрого двухступенчатого замораживания, и объяснен криозащитный эффект этого явления.

Построена новая модель сферификации эритроцитов, отличащаяся от существующих тем, что изменение формы клетки рассматривается как изометрическое преобразование исходной (дискоидной) поверхности клеточной мембраны, и предсказывающая наличие двух точек бифуркации, в которых эритроциты скачкообразно принимают вначале форму, близкую к стоматоциту, а затем - к сфероциту.

Впервые указаны физические причина и механизм неодинакового распределения дипидов и белков по монослоям в замкнутых бислойных многокомпонентных мембранах, испытывающих деформацию изгиба.

Теоретически и экспериментально подтверждено, что гипотонический гемолиз эритроцитов происходит вследствие возникновения оди-

ночной макроскопической поры в мембране клетки при ее изотропном натяжении.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Методом физико-математического анализа и численного моделирования процессов массопереноса, протекающих при низкотемпературном консервировании клеточных суспензий, количественно изучена кинетика изменения состава цитоплазмы, объема клеток и переохлаждения внутриклеточного раствора в зависимости от режимов охлаждения, плотности клеток в замораживаемой суспензии и объемной доли осмотически неактивных веществ в клетках.

2. Криозащитный эффект быстрого двухступенчатого замораживания обусловлен понижением степени и длительности переохлаждения внутриклеточного раствора и продолжительности пребывания клеток

в гипертонических растворах на этапе кристаллизации клеточной сус пензии по сравнении с другими режимами охлаждения.

3. Получена количественная оценка для времени растворения внутриклеточного кристалла при изотермической экспозиции клеток в произвольной точке из области сосуществования в замораживаемой суспензии жидкой и твердой фаз.

4. Как изгиб, так и растяжение замкнутых бислойных многокомпонентных мембран вызывает сегрегацию мембранных компонентов, если различны их модули изотермического растяжения и (или) производные от средней площади на молекулу в недсформированном состоянии монослоя по их концентрации.

5. Гипотонический гемолиз эритроцитов обусловлен флуктуаци-оннда образованием одиночной макроскопической поры в мембране.

Теоретическое значение. Построена более общая, чем существующие , теоретическая модель, описывающая процессы массообмена клеток с окружающей их средой при различных условиях замораживания клеточных суспензий, которая позволяет сократить количество опытов, необходимых для разработки способа низкотемпературного консервирования биологического объекта, путем численного моделирования процессов, протекающих при его криоконсервировании. Теоретически обоснована эффективность быстрых двухступенчатых режимов охлаждения.

С помощью физико-математического моделирования вычислены меняющиеся во времени состав внутриклеточной среды и переохлаждение внутриклеточного раствора, непосредственные количественные изме-

рения которых при современном уровне криобиологических исследований осуществить практически невозможно.

Теоретически обоснован более совершенный, чем существующие, алгоритм измерения коэффициентов проницаемости плазматических мембран клеток.

Развитые в работе теоретические представления могут служить основой для постановки, анализа и трактовки результатов криобиологических экспериментов.

Практическое значение. Результаты диссертации частично отражены в монографии "Биохимия мембран. Замораживание и криопротек-ция", М., Высшая школа, 198?, допущенной Министерством высшего и среднего специального образования СССР в качестве учебного пособия для студентов биологических и медицинских специальностей ВУЗов, а также использованы при разработке способов низкотемпературного консервирования тканевых лимфоцитов (1979), спермы ценных пород рыб (1978) и человека (1984) и определения криорезистентности эритроцитов человека (1988).

Полученные теоретические и экспериментальные данные свидетельствуют о целесообразности внедрения в практику низкотемпературного консервирования биологических объектов экспоненциальных режимов охлаждения и создания необходимой для их осуществления аппаратуры, состоящей из жидкостного криостата, поддерживающего заданную температуру в диапазоне от -20 до -40°С, и контейнеров с приспособлением, обеспечивающим регулировку теплоотдачи от них в заполняющую криостат жидкость.

Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит введение, обзор литературы, разделы "Результаты собственных исследований", состоящий из двух глав, и "Обсуждение результатов", выводы, список литературы, включающий 130 наименований, иллюстрирована 75 рисунками, 8 таблицами и изложена на 262 страницах машинописного текста.

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ Индексы ОчЬ и ¿И- относятся к величинам вне и внутри клетки соответственно.

Нижний индекс 0 относится к начальному значению помеченной им величины. ^

Ап~ п ~ " ~ перепад величины л на мембране клетки.

Наименование величины I Обозначение ! Размерность

I ! 2 ! 3

Время Объем клетки Относительный объем клетки Площадь поверхности клеточной мембраны Площадь поверхности клеточной мембраны в недефо рлированном состоянии 1) с м3 I м2 м2

Поверхностно-объемное отношение клетки

Объемная доля осмотически неактивных веществ в клетке

Полный объем клеточной суспензии Абсолютная температура Начальная температура суспензии Универсальная газовая постоянная

Постоянная Больцмана

Осмотическое давление I -го растворенного вещества

Моляльная концентрация <-' -го вещества

Молекулярная концентрация 1 -го вещества

Концентрация -го компонента во внешнем (внутреннем) мембранном монослое

Начальное отношение суммарного объема клеток к полному объему клеточной суспензии

Коэффициент фильтрации клеточной мембраны

Коэффициент отражения клеточной мембраны для I -го растворенного вещества

Ко Фс

сОо

К т

я

То

1С

ПС

а

Сс

сиЬ [¿л)

ь

¿■р

п

м К К

дж моль к

-Ж.

К

н —2

моль

I I

м

н с

I

I

I

!

Коэффициент проницаемости клеточной мембраны для первого растворенного вещества

Время растворения внутриклеточного кристалла

Коэффициент поверхностного натяжения на границе "лед - жидкая фаза"

Молярный объем льда

Коэффициент диффузии молекул воды в межкристаллическом растворе

Начальный радиус внутриклеточного кристалла

Толщина бислоя

Локальное значение средней кривизны мембраны

Средняя площадь на молекулу, соответствующая недеформированному мембранному монослою

Концентрация -го компонента в неде-формированном мембранном монослое

Модуль изотермического растяжения -го мембранного компонента

Модуль изотермического растяжения мембраны

Параметр сепарации

Свободная энергия бислоя

Свободная энергия деформации бислоя

Среднее время образования макроскопической поры в изотропно растянутой мембране

Изотропное натяжение мембраны

Линейное натяжение мембранной поры

Радиус сфероцита в деформированном состоянии

Радиус сфероцита в недсформированном состоянии

Размер макроскопической поры

К'1

ь

ю

1° я

5 Си

ъ

Г

сС-

у %

г

Г £

Яо о.

с

н

м

м м

н

м

н м

I

дж Дж

с

н м

м ы

с

м

2

м

Энергия активации процесса переноса молекул вода через плазматическую мембрану клеток

Энергия активации процесса перенося молегул криопротектора через плазматическую мембрану клеток

Температура плавления раствора

Температура плавления воды

Относительная температура суспензии

Постоянная скорость охлаждения

вора

Переохлаждение внеклеточного раствора

Суммарный объем кристаллов льда в замораживаемой суспензии

Объемная доля льда в замораживаемой суспензии

Показатель экспоненты в экспоненциала ном законе понижения температуры

Температура адаптации при быстром двухступенчатом замораживании

Безразмерное время

и0

¿¿I

моль

да

моль

К

г г = т ¡То К I

к

с К к

V £. м3

X I

сГ с-1

Гд К

I

У с

ч с

«о = Уо !#Т0 I

штр I

Со I

г н I

9 I

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛВДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исходным пунктом для численного моделирования процессов мае-■¡обмена между клетками и криозащитной средой явилась система равнений неравновесной термодинамики, развитая и детализирования нами (Гордиенко Е.А. с соавт., 1974, 1977, 1979, 1981). Эта эдель является непосредственным следствием таких фувдаменталь-ах физических законов, как закон сохранения массы и второй за-эн термодинамики, что уже само по себе гарантирует высокую сте-гнь ее универсальности и адекватности. Коэффициента, фигурировав в этой модели, имеют ясный физический смысл, а способы их из-эрения вполне определяются с а; ой моделью. Последняя представляет збсй систему нелинейных дифференциальных уравнений и в общем слу-1е не поддается аналитическому решению. В связи с этил проводи-зсь численное решение модели на ЭВМ методом Рунге-Кутта четвер-зго порядка.

5изико-математический анализ процессов латеральной сепарации порообразования в деформированных клеточных мембранах осуществится методами теории упругости и статистической физики.

Численное моделирование процессов массопереноса между клетками и окружающей их средой на различных этапах криоконсервирования

Кинетика изменения состава внутриклеточной среды и объема четок при изотермическом контакте с гипертоническими средами 1исывается системой уравнений

% -- (1 а-щ) - £ - -

]'

лI (1-3*31

Дм , Ас'л. .

где уц ( Л-х, ' ~ осмотическое давление проникающего (не проникающего) через плазматическую мембрану вещества внутри клетки, отнесенное к начальному внутриклеточному осмотическому давлению не проникающего в клетки вещества , ) - асимптотиче-

ское значение осмотического давления проникающего (не проникапце-ю)через плазматическую мембрану вещества, соответствующее равномерному распределению этого вещества вдоль системы.

Благодаря переходу к безразмерным переменным в этой системе уравнений ее численные решения становятся универсальными (автомодельными). Построенная нами модель отличается от предшествующих, в частности, тем, что в ней с помощью закона сохранения массы учитываются конечные размеры образца и отличная от нуля плотность кл< ток в суспензии. То обстоятельство, что в модели фигурируют так называемые конечные концентрации (или осмотические давления) и &хоо » оправдано с практической точки зрения, поскольку как ра: эти величины легче всего варьировать и задавать экспериментатору, хотя фактически осмотические давления вне- и внутриклеточного рас творов, конечно, не достигают этих предельных значений.

Решение системы уравнений (I) в нескольких предельных случаю послужило основой для разработки универсального алгоритма определения коэффициентов 1-р , К^ , б^ и <Ье по экспериментальным дан-ньм об изменении объема клетки после ее контакта с гипертоническо{ средой, который для яйцеклетки мыши приводит к результатам, согласующимся с известными данными.

На основании анализа процессов изотермического массопереноса между клетками и окружающим их раствором можно заключить, что осмотическое давление электролитов или других не проникающих через плазматические мембраны веществ в криозащитной среде должно быть равно осмотическому давлению физиологического раствора или слегка превышать его.

Теоретически и экспериментально показано, что плотность клеток в суспензии оказывает влияние на кинетику изменения состава внутриклеточного раствора и сохранность эритроцитов уже в начале

цикла консервирования, а вследствие сильной корреляции исходного состояния клеток с их сохранностью после деконсервирования - на сохранность замороженной-отогретой клеточной суспензии.

Один из самых значительных и физически ясных эффектов, которые вызывает охлаждение клеток до начала кристаллизации в суспензии, заключается в том, что охлаздение замедляет (а при больших скоростях охлаждения - полностью останавливает) те изменения 'снеточного объема и концентраций растворенных внутри клетки веществ, которые происходят е отсутствие охлаждения, то есть на этапе изотермической экспозиции клеток при исходной температуре.

Как показывают результаты численных экспериментов, увеличение проницаемости клеток для растворенного вещества при прочих равных условиях снижает неблагоприятные "эффекты раствора".

Численное моделирование процессов массопереноса между клетками и окружающей их средой на этапе внеклеточной кристаллизации при постоянной скорости охлаждения в криозащитном растворе "диметил-сульфоксид - хлористый натрий - вода" осуществлялось с помощью следующей физико-математической модели:

ехР&о(т-1)/т]>

^ _ (X)

1 / Л -I '

* ыр^т-^т] -фг- ^¿ЩМфУ&Ъ

-ш

. л Ял*. ^

- гл. л у. . \

с^ С _ ______________—--*

с~с7Щш > 110ЛК я> > щ 235 ?>*■ - 5, зе<>

к I-[я: , н ач ? -/, ш <- е, от 93] гн, т Ф - ^

-ШЗ те 93)л -Ш" г'хгч,т Р* -^з , ^ ^ /Я?*.

Здесь - осмотическое давление не проникающих через клеточную мембрану веществ вне клетки, которое определяется диаграммой плавления криозащитного раствора (ее аналитическая аппроксимация подучена нами, исходя из литературных данных).

В отличие от предшествующих работ, посвященных изучению подобных вопросов, формулировка начальных условий для уравнений (2), (3), (4), описывающих процессы массопереноса во время внеклеточной кристаллизации суспензии, вытекала из результатов численного моделирования процессов массопереноса на предшествующем этапе. Переохлаждение внутриклеточного раствора в процессе замораживания расчитывалось как разность между действительной температурой внутриклеточного раствора и равновесной температурой плавления, соответствующей его составу в рассматриваемый момент времени. Корректное вычисление переохлаждения внутриклеточного раствора ранее не проводилось.

Как следует из проведенных расчетов, при постоянной скорости охлаждения по мере падения температуры переохлаждение и концентрации внутриклеточного раствора монотонно нарастают (рис. I). При этом большие значения переохлаждения в процессе медленного охлаждения достигаются при более низких температурах, чем в процессе более быстрого охлаждения. С увеличением исходной концентрации криопротектора в замораживаемой суспензии концентрация электролита в жидкой фазе при определенной температуре (из области сосуществования жидкой и твердой фаз) снижается за счет коллигативного эффекта.

В нашей работе впервые методом численного моделирования изучены особенности массопереноса между клетками и окружающей их средой при кусочно-линейных и "экспоненциальных" режимах охлаждения. Схема расчетов при кусочно-линейных режимах охлаждения формально не отличалась от схемы расчетов при постоянной скорости охлаждения. Субнулевая температура, при которой скорость охлаждения изменяется, делит область температур от начала кристаллизации до эвте-

- 1Ь -

ктической точки на два этапа. При этом конечные значения у » ^ » и переохлаждения внутриклеточного раствора на предшествующем этапе являются начальными для последующего этапа. Результаты одного из численных экспериментов представлены на рис. 2.

Внезапное снижение скорости охлаждения клеточной суспензии вначале приводит к резкому падению степени переохлаждения внутриклеточного раствора, а затем к новому, более медленному его росту почти по линейному закону. С другой стороны, переход от более высокой к более низкой скорости охлаждения повышает интенсивность так называемых эффектов раствора, связанных с почти скачкообразным дополнительным обезвоживанием клеток (более значительным при большей разности исходной и новой скоростей), а также со значительным ростом внутриклеточных концентраций. , .

При экспоненциальных режимах охлаждения Т ~Тд ^ (Тн-Т^ вхрг' на этапе внеклеточной кристаллизации вместо (2) имеем

¿1___1

А

i - С^ О Г V с

ехр[а0(т-1)1Т]{51Г1?

¿т

-1 / ж!

я*

1

*(Т'ТЛ) у-А9 ^ 7

(1 + ь

хЖГ6

у-сСо ' ~ ~ -2,(1-*,)

^ехр[аа(ТЧ)/г] - ~

- г* 1]Гт1

Рис. I. Кинетика изменения относительного объема клеток % (о), концентраций криопротектора ЗС^ ( о ) и электролита ЗС^*1 ( в ) внутри клетки и переохлаждения внутриклеточного раствора Д) на этапе кристаллизации при ох-лаадении с постоянной скоростью: % (0)=0,81 ; ; ^ =0,2; £ =0,0001 =6 5 61=0,9 ; Дв = 4=25 \С0{Т0)*0,1 ; I) 1 =-15 ; 2) % =-75 ; 3)4 =-375.

31»

бт"

у/ч,

0.9

0.91 0.87 СШ 0.79 0.75

Рис. 2. Кинетика изменения относительного объема клеток у (о), концентраций криопротектора (в) и электролита Ж^1 (о ) внутри клетки и переохлаждения внутриклеточного раствора УГ^Св ) при кусочно-линейном режиме охлаждения: У (0) =0,498 ;^"(0)=2,323;^=0,2; /„=0,0001 ;.Г4£~=6;^о,=1;$1=0,9;

«„=<£=25 ;ГС(7^)=0,1. При7*=0,85 параметр 1 скачкообразно меняется с "£¿=-3 на ^=-375. Пунктирной линией показан ход решения системы уравнений (2) при охлаждении с постоянной скоростью, соответствующей параметру Г£1 .

Представление о характере изменений исследуемых величин в роцессе экспоненциального охлаждения на этапе кристаллизации легочной суспензии даст графики приведенные на рис. 3 и 4. Ана-из численных решений приводит к следующим заключениям. Охлавде-ие по экспоненциальному закону имеет значительные преимущества о сравнению с линейными и кусочно-линейными программами. Повыне-ие так называемой температуры адаптации Тд оказывает на сохран-ость консервируемых клеток как положительный эффект, обусловлен-ый понижением вероятности внутриклеточной кристаллизации, так и трицательный, вызываемый значительным обезво-тиванием клеток и резмерным ростом концентрации растворенных в них веществ. Конну-ирупцее воздействие этих эффектов на сохранность клеточных сус-ензий обусловливает существование некоторой промежуточной опти-альной температуры, при которой выживаемость клеток, подвергаете ся экспоненциальному охлаждению в области субнулевых темпера-ур, становится максимальной.

Аналогично, уменьшение показателя экспоненты & неблагоприятно называется на клетках вследствие "эффектов раствора", но в то же ремя влечет за собой снижение переохлаждения, а следовательно, и ероятности кристаллизации внутриклеточного раствора. Поэтому для ежимного параметра охлаждения 5 так же, как и для /д , сущест-ует оптимальное значение в указанном выше смысле.

Поскольку повреждение клеток каким-либо внешним фактором оп-еделяется не только его амплитудой, но и продолжительностью дей-твия этого фактора, даже сравнительно большие переохладдения ци-оплазмы и внутриклеточные концентрации электролитов при экспонен-иальных режимах охлаждения не приводят к повреждению клеток, по-кольку они достигаются на короткий промежуток времени.

Таким образом, в принципиальном отношении объяснение криоза-итного эффекта быстрого двухступенчатого замораживания, при кото-ом как раз и реализуются экспоненциальные режимы охлаждения, не тличается от объяснения факта существования оптимального значе-ия скорости охлаждения при линейных режимах, вытекающего из двух-актроной теории криоповреадения П. Мейзура. Аппаратура, необходи-ая для реализации экспоненциальных режимов охлаждения, проще, де-евле и надежнее обычных замораживателей биообъектов. Осуществле-ие двухступенчатой процедуры замораживания не требует высокой валификации.

Рис. 3. Кинетика изменения переохлаждения внутриклеточного раствора при экспоненциальном режиме охлаждения: $ (0)=0,81 ;£/Ч0)=5,3< а0= =25; <й =0,9 ; ¿о =0,2; 4^=0; ^с- =о;^г<х>=1; ^ )=о,1; =3001

=0,81 ; I) <Г =75 ; 2) <$" =15 ; 3) £ =3; 4) £ =2; 5) сГ =1,5.

0.91

0.87

0.83

0.79

Рис. 4. Кинетика изменения относя тельного объема клеток у (о), концентраций криопротектора хГ (в и электролита внутри клетя

при экспоненциальном режиме охлаждения: у (0) =0,699; 0) =0,816 а„ = 4=25; 61=0,9 ; оС0 =0,4 ;

=0,4; ЗС,о° =3;%й =1; С0 (Г0)= =0,^1 ; Т0 =300 К; <Г =375 ; л I) % =0,77; 2) ^ =0,81; 3) ТА =0,8

0.91

0.87

0.83

Вследствие того, что продолжительность экспозиции клеток при мпературе адаптации значительно меньшая, чем , клетки, замоленные по двухступенчатым программам, устойчивы к постгипертони-скому лизису. Устойчивость ¡меток к замораживанию при быстром ухступенчатом замораживании обеспечивается даже в том случае, гда в части клеток образуются внутриклеточные кристаллы льда на апе охлаждения консервируемого образца до температура адаптации, ледствие эффекта растворения внутриклеточных кристаллов на по-едующем этапе под влиянием термодинамической силы, пропорциональ-й разности кривизны вне- и внутриклеточных кристаллов. Вредя, которое происходит растворение внутриклеточного кристалла со-авляет

t - «ТА° г КГА° ■

р 8<t'v$Kw%1 3.1 ¿'irs Я

Теоретические и экспериментальные результаты этого раздела следований, взятые в совокупности, свидетельствуют о целесооб-эности внедрения в практик низкотемпературного консервирования ологических объектов экспоненциальных режимов охлаждения и соз-ния необходимой для их осуществления аппаратуры.

Причина, механизм и закономерности явления латерального разделения мембранных компонентов при обезвоживании и оводнении клеток.

Анализ явления латерального разделения мембранных компонентов и обезвоживании и оводнении клеток основывается на физическом инципе минимума свободной энергии деформированной бислойной мем-аны, который гласит: в состоянии теплового равновесия форма мем-аны и распределение липидных и белковых компонентов вдоль ее мо-слоев соответствуют минимуму свободной энергии бислоя.

В процессе обезвоживания, которое происходит на различных апах криоконсервирования биологической суспензии, клетки прини-от формы, при которых знак средней кривизны в разных частях мем-аны становится разным, а площадь срединной поверхности мембранно-бислоя остается такой же, как в исходном недеформированном со-эянии. Изгибание оболочки приводит к тому, что в области участ-в с отрицательной кривизной происходит сжатие внешнего монослоя

и растяжение внутреннего, а в области участков с положительной средней кривизной - растяжение внешнего и скатие внутреннего монослоев. 3 наиболее сжатые или растянутые участки мембраны (то есть участки с наибольшей по абсолютной величине кривизной) энер гетпчееки выгодно переместиться компонентам с наименьшим модулем растления и тем самым снизить свободную снергию деформации. Им в стся и другой путь к уменьшению свободной энергии деформации изо гнутой мембраны. Энергетический Быигрш может быть получен, если например, те компонента, рост концентрации которых приводит к уменьшению (увеличению) площади поверхности монослоя (см. ниже н равенство (7) и пояснения к нему), концентрируется во внутреннем (внешнем) монослое в участках с высокой положительной кривизной. Таким образом, изгибание мембраны клетки, вызванное ее обезвоживанием, является причиной латерального перераспределения мембран ных компонентов.

Физико-математический анализ этого явления приводит к уравн ниям Эйлера-Лагранжа, которые соответствуют упомянутому выше вар ационному принципу минимума свободной энергии и описывают как фо му, так и распределение мембранных компонентов вдоль липидных мо нослоев при различных уровнях обезвоживания клеток и фиксированных значениях характеризующих мембрану физико-химических парамет ров. Так, например, в частном случае, когда бислойная мембрана состоит из двух компонентов, модули упругости которых одинаковы равны Г0 , распределение мембранных компонентов определяется условием

_ ? - - г ^

Здесь Сх и 5 - концентрация первого компонента и средняя площад на молекулу, отвечающие отсчетному недсформированному состоянию, в котором концентрации компонентов во внешнем и внутреннем монослоях плоского бислоя одинаковы и постоянны вдоль слоев. Знак ми нус относится к внешнему монослою, а знак плюс. - ко внутреннему. Если, для определенности, с увеличением концентрации первого ком понента средняя площадь,„приходящаяся.на одну молекулу в моносло увеличивается, то ~ > 0. Следовательно, в соответствии с

условием (5) в тех точках внешнего и внутреннего монослоев, где растяжение максимально, преимущественно сосредотачиваются частицы первого сорта. Другими словами, частицы первого сорта скапливаются во внешнем монослое на выступах мембраны, а во внутреннем монослое - в области впадин. Таким образом, деформация мембраны, как и изменение температуры, является физической причиной сепарации мембранных компонентов в согласии с принципом Ле-Шателье, который утверждает, что любое внешнее воздействие стимулирует в системе процессы, оставляющие результат этого воздействия.

В другом частном случае, когда = 0, но модули изо-

термического сжатия компонентов, из которых состоит мембрана и

различны, условия равновесия принимают вид

8(«Т/с1 +у')£ _

~ гг(1 -адд -{1-гл/Г1) & ¿ГУ/* .»*<«.?Т

где Зх - площадь молекулы первого сорта в недеформированном монослое. Если, например, /][ > Г± , то левая часть уравнения (6) положительна , поэтому и >32, и концентрации и должны быть выше там, где кривизна мембраны по абсолютной величине больше. Другими словами, в местах с большей (по абсолютной величине) кривизной преимущественно скапливаются компоненты с меньшим модулем упругости. Как и в предыдущем случае, процесс удовлетворяет принципу Ле-Шателье. В наиболее острых точках (и на выступах, и на впадинах, и во внешнем, и во внутреннем монослое)концентрируются наиболее "мягкие" компоненты.

Итак, мы приходим к заключению, что контакт клетки с гипертонической средой приводит к определенной перестройке латеральной организации мембраны, в частности, на мембране появляются места с повышенным содержанием того или иного компонента. Вероятно, вследствие этого явления "облегчается" фазовое превращение в мембране, если вслед за экспозицией в гипертонической среде суспензия охлаждается. Указанный эффект, естественно, зависит от времени экспозиции клеток в гипертонической среде до начала охлаждения потому, что для перераспределения мембранных компонентов под влиянием деформации необходимо сравнительно большое время.

Вследствие латерального перераспределения мембранных компонентов в деформируемой мембране фазовые превращения в различных ее участках протекают неодновременно, в результате чего при быстром охлаждении жидкие участки мембраны могут подверх аться настолько большому изотропному натяжению (благодаря уменьшению площади, приходящейся на молекулу в твердом монослое, по сравнению с площадью на молекулу в жидком монослое), что энергетически выгодным станет образование макроскопической поры во вкрапленных в затвердевшую фазу жидких участках метбран. Возможно, этот эффект обусловливает сенсибилизацию эритроцитов гипертоническими растворами к последующему охлаждению.

Изотропное натяжение мембраны, состоящей из двух компонентов, как и изгибание, может повлечь за собой сепарацию мембранных компонентов на области, одна из которых обогащается первым компонентом, а другая - вторым. Принципиальная возможность такого явления вытекает из следующего экспериментального факта. Если монослой одного чистого липида занимает площадь ¿1, а монослой другого -площэдь 5/7 , то часто после смешения липидов площадь, занимаемая двухкомпонентным жидким монослоем, оказывается меньше, чем суммарная площадь исходных монослоев:

> Ь.Е ■ (7)

Следовательно, при изотропном натяжении первоначально однородного монослоя, который состоит из нескольких компонентов, латеральное разделение липидов и белков становится энергетически выгодным, если площадь поверхности мембраны с неравномерно распределенными вдоль нее компонентами в отсутствие деформации больше, чем соответствующая равномерному распределению. Правда, с другой стороны, отклонение распределения мембранных компонентов от равновесного приводит к уменьшению энтропии смешения многокомпонентного бислоя и вследствие этого к увеличению свободной энергии мембраны . В зависимости от того, какой из указанных эффектов превалирует, свободная энергия, соответствующая неравномерному распределению компонентов вдоль растягиваемой мембраны, может оказаться меньшей или большей, чем свободная энергия мембраны с равномерно распределенными вдоль нее компонентами при том же растяжении. В первом из указанных случаев перераспределение мембранных компонентов

>ль растянутых монослоев термодинамически выгодно, во втором -

Пусть rt и Q - изотермические модули растяжения монослоя, :тоящего соответственно только из молекул первого или только из [екул второго сорта. Пусть, кроме того, 5Х~ область мембраны, (ержащая только частицы второго сорта, =S~Sj - область мем-1ны, в которой частицы первого и второго сорта распределены рав-1ерно, S - текущее значение площади поверхности мембраны в про-:се ее растяжения, ^ - концентрация молекул первого сорта в об-:ти Sf , Ct(o)~ начальное значение концентрации молекул первого !та в мембране, соответствующее исходному равномерному распределю, <L - доля площади мембраны, 'занятая исключительно частица-второго сорта (параметр сепарации), S - средняя площадь, ко-ия приходится на молекулу в двухкомпонентном монослое, как [кция концентраций молекул первого сорта, - площадь мембраны, ¡ятая^только частицами второго сорта в отсутствие растяжения, а iï = S ~ Sj - площадь остальной части мембраны в отсутствие :тяжения. Тогда свободная энергия деформации растянутого бислоя юделяется следующим образом:

(8)

S- = F t-F f-S,S«T[(d-Cx(o))(i-£)ên(4-C1)<

О flep и

t-cjc) еп cL ¿с)) en [(i - c± с)) -

- eL(o) en <?Uo)J / 5'n*(o))t

e (i-c± (o)) en. (1 - Ci M) Л Сл (о) tn ¿1 (о) = ecnst

- a (sT^ (s, ,

p Гц Si S - (Pt - Гг) Su Si

o_J- = -~-^-------;

rt Sx <- il rL , rs =л{слгх i-a-cja),

^ -.$[1-11 -Ь (о))л]$(е!) ¡£Шо))

Исходя иь приведенных соотношений, с помощью ЭВМ расчитывал] свободную энергию растянутого двухкомпонентного замкнутого бисло) как функцию параметра сепарации, характеризующего перераспределение мембранных компонентов вдоль монослоев, при различных значениях параметра растяжения

и Г . Результаты расчетов показывают (рис. 5), что при достаточно больших растяжениях мембраны латеральное разделение мембранных компонентов становита энергетически выгодным, поскольку соответствует более низким значениям свободной энергии по сравнению со случаем равномерного ра< пределения компонентов вдоль мембраны ( <С= 0).

Рис. 5. Свободная энергия ( слойной двухкомпонентной в« зикулы как функция парамет] сепарации е£- при разных з! чениях натяжения мембраны: 1)$' =1,02; 2)/'=1,06; 3) У=1,1 ; 4) ¿'=»1,12 ; 5) /'=1,14 ; 6)/ =1,16 ; 7)^=1,18 ; 8) р' =1,2 ; ^ =0,4 дж.м~^;<1/У=0.3; £^=0,4; 5 (0)=7.10-19м2; ^ (¿•т1Л)=6.10_19м2 ; £=12,56.Ю-10 м2.

2Б -

Указанные Еыше физические эффекты в качественном отношении ;праведлиЕЫ и вне рамок построенных нами конкретных моделей, бу-учи непосредственным следствием принципа Ле-Ш'ателье, что обеспе-ивает универсальность сформулированных в работе выводов о причи-:ах, механизмах и закономерностях явления латерального перераспре-.еления мембранных компонентов при деформации замкнутых бислойных ногокомпонентных мембран.

Количественный анализ явления образования поры в изотропно растянутой мембране эритроцита.

В соответствии с теорией случайных марковских процессов средне враля Тц флуктуационного перехода из состояния х± в другое окально устойчивое состояние , которые соответствуют соседки?.! инимумам потенциала действующего на систему внешнего поля М(х) и тделекы друг от друга энергетическим барьером & И , определяется юрлулой

-г як Г &И.

Тщ= ^ .__ехр Ар . О)

Ъ Ш (т \ эли /г ^ кТ

' ЭХ*- 'Х±) ( таг)

де Ю - коэффициент одномерной диффузии системы в пространстве ¡е состояний X. координата максимума потенциала внешнего

;оля, который расположен мезду 2-1 и .

Используя этот результат для описания явления образования ма~ :роскопической поры в изотропно растянутой мембране при гипотони-еском лизисе эритроцитов, получаем зависимость среднего времени емолиза от величины изотропного натяжения его мембрайы ( б");

1 («г)3'* >

г щЯ {те* -ЗПу/Ъ)*- ' «> г (Ю)

десь Г - поверхностный модуль изотермического растяжения мембра-ы, у — линейное натяжение поры, которые исходя из имеющихся в итературе данных принимаем равными соответственно при Т = 310 К ,1 н.м и Ю-11 н. Полегая /0 (05= 0,429«Ю™16 м2с-1, находим реднее время гемолиза эритроцита

и

0,1 (КТ)3/Л- X 1,1 ехр (0,т х)

где

ЛЗСуЯ(о)

(И)

Экспериментальные данные о зависимости типа (II) получены Рэндом методом втягивания одиночных эритроцитов ь пипетку с кали рованным диаметром при фиксированном перепаде давления. Удовлетв! рительное согласие между этими экспериментальными денными и расчетным временем гемолиза (Рис. 6) свидетельствует о том, что механизм осмотического лизиса эритроцитов связан с флуктуационным образованием одиночной поры в подвергнутой изотропному натяжению мембране. Одновременное образование нескольких пор в клеточной М1 бране, очевидно, маловероятно и практически не происходит, поско: ку вероятность одновременного осуществления двух независимых соб! тий равна произведению вероятностей осуществления каждого из них отдельности, а в рассматриваемом нами случае и того меньше, так как при образовании одной поры снижается натяжение мембраны в целом и вследствие этого эффекта затрудняется образование других п<

Х.С

200

100

Рис. 6. Экспериментальная с висимость времени гемолиза и теоретическая зависимостг среднего времени образована мембранной поры (—) от об! ной величины натяжения мембраны.

2 4 6 1/СМ05М/Н

Следовательно, гипотонический гемолиз эритроцитов обусловлен образованием в его клеточной мембране одиновдой поры макроскопического размера :

(12)

где Я и $ о - радиусы сфероцита при наличии и в отсутствие растяжения.

В связи с тем, что через образовавшуюся в мембране макроскопическую пору производится выброс части внутриклеточного раствора, эритроцит в момент гемолиза должен испытывать отдачу в сторону, противоположную выбросу. Нами построена физико-математическая модель для вычисления величины смещения эритроцита за счет указанного реактивного эффекта и получены экспериментальные данные, которые подтверждают модельные представления (рис. 7).

Рис. 7. Смещение эритроцита при гемолизе в водном (I М) растворе глицерина.

Сопоставление теоретических и экспериментальных данных, проведенное в §3.3, и удовлетворительное согласие между ними позволяют утверждать, что гипотонический лизис клеток происходит путем флуктуационного образования в изотропно растянутой мембране одиночной макроскопической поры.

ВЫВОДЫ

1. Разработан универсальный алгоритм вольшетрического определения коэффициентов проницаемости клеточных мембран для молекул воды и криопротекторов и доли осмотически неактивных веществ в клетке.

2. Двухступенчатый режим охлаждения снижает вероятность повр ждения замораживаемых клеток за счет внутриклеточного кристаллооС разования и осмотических эффектов вследствие уменьшения переохлал дения цитоплазмы и концентраций растворенных в ней веществ.

3. Быстрое двухступенчатое охлаждение консервируемых клеточных суспензий проще, экономичнее и эффективнее линейных режимов е мораживания.

4. При оптимальном двухступенчатом режиме замораживания кол! чество криопротектора внутри клеток слабо изменяется по отношенш к его исходному (до охлаждения) значению, что гарантирует повышение устойчивости замороженных таким образом клеток к постгипертоническому лизису по сравнению с линейными режимами охлаждения.

5. Медленное изотропное натяжение замкнутой бислойной многокомпонентной мембраны, если оно превышает определенное критичесю значение, приводит к сегрегации компонентов, из которых состоит мембрана, вследствие зависимости средней площади, приходящейся н; молекулу в недеформированном монослое, от их концентрации.

6. Изгибание замкнутой бислойной многокомпонентной мембраны является причиной возникновения или усиления неоднородности расп' деления ее компонентов не только вдоль поверхности мембраны, но между монослоями, что обусловлено различием изотермических модул растяжения и зависимостью средней площади на молекулу в недефор рованном состоянии монослоя от концентрации отдельных компоненте

7. В участках изогнутой мембраны с большей по абсолютному з чению кривизной во внешнем и внутреннем монослое концентрируются преимущественно те компоненты, модуль растяжения которых мал по сравнению с другими; во внешнем монослое изогнутой мембраны на участках с наибольшей положительной (отрицательной) кривизной со средотачиваются преимущественно те мембранные компоненты, повыше ние концентрации которых увеличивает (уменьшает) среднюю площадь молекулы в недеформированном монослое, а во внутреннем монослое наоборот.

8. Гипотонический лизис клеток происходит вследствие флукту-|Ционного образования в клеточной мембране одиночной макросокпи-[еской поры.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Особенности кристаллизации в эритроцитах// Актуальные во-:росы криобиологии и криомедицины,- Киев: Наук, думка, 1974.10-12 (соавторы: В.Л. Бронштейн, Ю.В. Козьмин).

2. К механизму лизиса. I. Математическая модель// Актуальные юпросы криобиологии и криомедицины.- Киев: Наук, думка, 1974.13-15 (соавтор: В.Л. Бронштейн).

3. К механизму лизиса. П. Приложение к криобиологии// Актуаль-ые вопросы криобиологии и криомедицины.- Киев: Наук, думка, 1974,. 15-18 (соавтор: В.Л. Бронштейн).

4. Некоторые аспекты повреждения клеток при замораживании// роблемы гематол. и перел. крови.- 1974,- 4,- с. 44-48 (соавторы: .С. Пушкарь, Л.Ф. Розанов, Ю.А. Иткин).

5. Причина и механизм температурного шока// ДАН СССР.- 1975.21.- с. 1461-1464 (соавторы: Н.С. Пушкарь, Ю.А. Иткин, В.Л. Брон-тейн).

6. Физическая модель повреждения о без вожи вани ем// чт

М'агп^ов^е ил/ Ога^^чщ и*4 У?«*^.- 1976.- 3.- с. 19092.

7. Применение методов неравновесной термодинамики, статисти-еского планирования и обработки результатов экспериментов в крио-иологических исследованиях// Механизмы криоповреждения и криопро-екции биологических структур,- Киев: Наук, думка, 1976,- с. 39-44 соавторы: Ю.А. Иткин, В.Л. Бронштейн).

8. Оп. Не. рч^ее/л. ¡Ф с£еАдсАи^^ен. с^Ысе

Э76,- 13.- с. 147-152 (соавторы: Н.С. Пушкарь, Ю.А. Иткин, В.Л. ронштейн, Ю.В. Ксзьмин).

9. Кинетика обезвоживания клеток в -компонентных растворах еществ, не проникающих в клетку// Механизмы криоповреждения и риозащиты биологических структур.- Киев: Наук, думка, 1977,. 14-16 (соавторы: Ю.А. Иткин, Г.С. Иаков).

10. Кинетика обезвоживания клеток во многокомпонентных среда: при наличии проникающего через мембраны вещества// Механизмы крио повреждения и криозащиты биологических струткур.- Киев: Наук, дум 1977.- с. 16-17 (соавторы: Ю.А. Иткин, Г.С. Ишков).

11. Обезвоживание и некоторые механизмы криоповреждения клеток при низкотемпературном консервировании суспензий// Криобиология и криомедицина,- 1977,- 3,- с. 29-34 (соавторы: Г.С. Ишков, Л.Ф. Розанов).

12. Влияние режимов замораживания на показатели морфо-функци ональной сохранности тканевых лимфоцитов// Криобиология и криомедицина.- 1578,- 4,- е. 52-54 (соавтор: Т.Н. Воскобойникова).

13. Разработка оптимальных режимов программного замораживания лейкоцитов// Проблемы гематол. и перелив, крови.- 1978.- 8,-с. 8-13 (соавторы: Н.С. Пушкарь, Г.С. Лобынцева, А.И. Полякова, Ю.П. Тимошенко, И.А. Вотякова).

14. К вопросу о быстром двухступенчатом замораживании клетоЧ' ных суспензий// Криоконсервирование иммунокомпетентной ткани.-Киев: Наук, думка, 1979.- с. I27-I3I (соавторы: Ю.А. Иткин,

В.Л, Бронштейн, А.А. Цуцаева).

15. fiimetc C « ¿fiwyixj ■facfaz cÉu-'ч'r^f-évw' fen/iÉtoA«' . 1980.- 17 с. 403-409 (соавторы: Н.С, Цушкарь, Ю.А. Иткин, В.Л. Бронштейн).

16. Термодинамическая модель пассивного переноса многокомпонентной жидкости через замкнутую избирательно проницаемую мембрану// Криобиология и криомедицина,- 1981.- 9,- с. 29-36 (соавторы: О.И. Горциенко, Ю.А. Иткин).

17. Физико-математический анализ механизмов криоповреждений и криозащиты клеток// Актуальные проблемы криобиологии.- Киев: Наук, думка, 1981,- с. 300-343 (соавторы: Ю.А. Иткин, В.Л. Бронштейн).

18. Реакция клеток на гипертонические воздействия при крио-протекции// Биофизика,- 1982,- 27,- с. 660-664 (соавторы: Л.Г. Кулешова, Л.Ф. Розанов).

19. Замораживание, факторы, механизмы и гипотезы криоповреждения биологических суспензий// Криоконсервирование клеточных суспензий,- Киев: Наук, думка, 1983,- с. 26-44 (соавторы: Ю.А, Иткин В.Л. Бронштейн, В.Ф. Марценюк).

20. Физико-математический анализ процессов преобразования

|рмы и структуры мембран эритроцитов при контакте с гипо- и гипер-мическими средами// Тезисы П Всесоюз. конф. по теор. и прикл. тр. криобиологии,- Харьков, 1984,- с. 22 (соавтор: М.В. Воинова).

21. Влияние гематокрита, разведения криозащитной средой и 1нцентрации ПЭ0-1500 на сохранность эритроцитов при их экспозиции растворе криопротектора// Тезисы П Всесоюз. конф. по теор. и 1икл. вопр. криобиологии.- Харьков, 1984.- с.158 (соавторы: И.А. 1чережская, Г.С. Ишков).

22. О механизме температурной адаптации клеточных суспензий

>и двухступенчатом замораживании// Экспериментальный анабиоз. Те-[сы докл. П Всесоюз. конф. по анабиозу.- Рига, 1984.- с.57 (со-)Тор: Л.Ф. Розанов).

23. Физико-химические основы низкотемпературного консервиро-1ния клеточных суспензий// Криобиология.- 1985.- I.- с. 23-29 юавторы: Н.С. Пушкарь, Л.Г. Кулешова, О.И. Гордиенко, Л.Ф. Роза-)в, Г.С. Ишков).

24. Влияние температуры и ионной силы среды на пассивную про-щаемость мембран эритроцитов для ионов калия// Биол. мембраны.-)86,- 3,- 3.- с. 869-872 (соавтор: О.И. Гордиенко).

25. Физико-математическая модель латерального перераспределе-м липидов при изотермической деформации замкнутой бислойной мем-заны// Криобиология,- 1986.- 3.- с. 43-48 (соавтор: М.В. Войнова).

26. О механизме осмотического лизиса эритроцитов// Криобиоло-1я.— 1986,- 2.- с. 23-25 (соавтор: О.И. Гордиенко).

27. Термодинамическая модель явления перераспределения мем-занных компонентов в изотропно растянутом замкнутом бислое// Крио-юлогия.- 1987,- 3,- с. 11-15.

28. Биохимия мембран: замораживание и криопротекция,-* М.: jcm. школа, 1987.- 80 с. (соавторы: А.М. Белоус, Л.Ф. Розанов).

29. Деформация плазматических мембран как фактор криоповре-1ения и криозащиты клеток// Достижения и перспективы криобиологии криомедицины. Тезисы докл. международной конф.- Хзрьков, 1988.. 14.

30. Закон Аррениуса - методологический принцип криоконсерви-звания// Моделирование криобиологических процессов.- Харьков, 388,- с. 3-12 (соавтор: О.И. Гордиенко).

31. Теоретический и экспериментальный анализ защитного эффекта "температурной остановки"// Моделирование криобиологических процессов.- Харьков, 1988,- с. 35-43 (соавтор: Н.В. Репин).

32. Особенности гемолиза эритроцитов в водных растворах глицерина// Криоконсервирование клеток и тканей,- Харьков, 1988.-

с. 54-6Г (соавторы: И.А. Некоз, Л.Г. Д/лешова, Л.ф. Розанов).

33. Осмотическая реакция эритроцитов на контакт с гипертоническими растворами непроникающего криопротектора// Криобиология.-1989.- I.- с. 11-13 (соавтор: И.А. Некоз).

АВТОРСКИЕ СВИДЕТЕЛЬСТВА НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ консервирования спермы рыб.- A.C. № 59II64, 1978 (соавторы: Н.С. Пушкарь, Ю.А. Иткин, Е.Ф. Копейка, В.Л. Бронштейн Т.А. Глушко).

2. Способ низкотемпературного консервирования тканевых лимфо цитов,- A.C. № 688163, 1979 (соавторы: A.A. Цуцаева, Т.Н. Воско-бойникова, H.H. Попов, Н.С. Пушкарь)

3. Способ консервирования спермы человека,- A.C. # II03387, 1984 (соавторы: В.И. Грищенко, Н.С. Пушкарь, Ю.С. Паращук, A.C. Капрельянц).

4. Способ определения криорезистантности эритроцитов.-A.C. № I394I29, 1988 (соавторы: Л.К. Стусь, В.М. Куракса).

Ответственный за выпуск член-кор. АН УССР Н.С. ПУШКАРЬ

БЦ № 23418, подписано к печати 16.10.1989 г., физ.п.л. 2, учетн. изд. л. 2, заказ № 239 , тираж 100 экз.

Ротапринт ©ГИНТ АН УССР, 310164, Харьков-164, пр. Ленина, 47