Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование и оптимизация трансфекции, транспорта макромолекул и цитотоксичности, вызванных воздействием ультразвука и электрического поля на клетки и ткани

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование и оптимизация трансфекции, транспорта макромолекул и цитотоксичности, вызванных воздействием ультразвука и электрического поля на клетки и ткани"

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ)

На правах рукописи

Зарницын Владимир Григорьевич

Исследование и оптимизация трансфекции,

транспорта макромолекул и цитотоксичности, вызванных воздействием ультразвука и электрического поля на клетки и ткани

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Институте Электрохимии РАН им. А.Н. Фрумкина и Технологическом Институте штата Джорджия, Атланта, США

Научный руководитель:

Чл.-корр РАН, профессор, доктор химических наук, Ю.А Чизмаджев

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук В.В. Смолянинов Доктор биологических наук А.В. Зеленин

Ведущая организация:

Биологический факультет Московского Государственного Университета

Защита диссертации состоится «_»_2004 г. в_часов на

заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-

техническом институте по адресу: 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., д. 9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан «_»_2004 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 212.156.03

кандидат физико-математических наук В.Е. Брагин

2004-4 21192

Гб У?

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Актуальность проблемы исследования транспорта макромолекул и трансфекции при воздействии электрического поля и ультразвука обусловлена необходимостью разработки эффективных способов доставки лекарственных препаратов (включая ДНК) для применения новых способов лечения заболеваний человека, а также коррекции благоприобретенных и врожденных генетических дефектов (генная терапия).

Цель работы

Экспериментальное и теоретическое исследование транспорта макромолекул в клетки (клетки рака простаты DU145) и ткани (кожа человека) под действием электрического поля и ультразвуковой обработки;

выявление механизмов воздействия используемых физических методов на биологические объекты, а также оптимизация их применения.

Задачи исследования

1. Разработать экспериментальный метод исследования эффективности трансфекции клеток DU145 плазмидами ДНК при ультразвуковом воздействии.

2. Исследовать влияние физических и химических параметров на эффективность трансфекции и цитотоксичность при ультразвуковом облучении суспензии клеток, определить оптимальные параметры для достижения максимальной трансфекции при минимальной цитотоксичности.

3. Произвести сравнительное исследование эффективности трансфекции при ультразвуковом облучении и электропорации, используя как промежуточный контроль количество ДНК, доставленной в клетки.

4. Определить скорость залечивания пор, используя динамику заполнения клеток флюоресцентными макромолекулами разного размера, добавляемыми через определенные интервалы времени после окончания ультразвукового воздействия. С помощью математической модели охарактеризовать размер и распределение пор, возникающих под действием ультразвука на клеточной мембране.

5. Разработать модель транспорта макромолекул (кальцеина) в роговом слое кожи человека (stratum corneum) при приложении электрических импульсов высокого напряжения, которая позволила бы объяснить экспериментально наблюдаемый обратимый рост проницаемости кожи.

Научная новизна работы

Последние несколько лет метод ультразвукового облучения клеток и тканей начал активно применяться для облегчения транспорта макромолекул и трансфекции. В то же время систематическое исследование факторов, влияющих на эффективность трансфекции, и рекомендации по оптимальным условиям ее применимости отсутствуют. Проведенное в данной работе экспериментальное исследование факторов, влияющих на эффективность применения ультразвука для трансфекции клеток, показало, что величина потока звуковой энергии, концентрация клеток в суспензии и температура относятся к наиболее существенным факторам.

Исследование транспорта ДНК и трансфекции при электропорации и ультразвуковом облучении выявило, что основным лимитирующим фактором для трансфекции с помощью этих двух методов является внутриклеточный транспорт ДНК из цитоплазмы в ядро. Анализ результатов пассивного транспорта флуоресцентных макромолекул в поврежденные ультразвуком клетки впервые позволил со статистической достоверностью охарактеризовать степень. проницаемости обработанных ультразвуком клеточных мембран, а также предложить описание повреждения в терминах распределения возникающих пор по размерам. Отличительной особенностью предлагаемого метода является использование статистики по данным о повреждении сотен тысяч клеток. На основе модели и имеющихся данных для транспорта макромолекул кальцеина, сывороточного альбумина, а также декстранов (150, 500 и 2000 kDа) можно предсказать эффективность пассивного транспорта для макромолекул размером от 0.6 до 30 нм.

В данной работе впервые была высказана гипотеза, что электропорация липидно-корнеоцитного матрикса рогового слоя кожи человека под действием импульсов высокого напряжения является причиной временного повышения проницаемости кожи для гидрофильных веществ на несколько порядков. Математическое моделирование транспорта макромолекул при электрической обработке с учетом данной гипотезы продемонстрировало высокую степень соответствия экспериментальных и теоретических результатов. Гипотеза электропорации липидно-корнеоцитного матрикса впоследствии получила экспериментальное подтверждение.

Научно-практическая значимость

Работа имеет фундаментальное и прикладное значение. Предложенные методики могут быть использованы как при теоретическом анализе транспорта макромолекул и трансфекции ДНК in vivo и in vitro, так и для выбора конкретных параметров ультразвукового облучения в клинической практике.

Недавно было продемонстрировано, что использование вирусных препаратов для генной терапии представляет серьезную угрозу здоровью пациентов. В связи с этим особую актуальность приобретает задача разработки эффективных и безопасных (невирусных) методов доставки корректирующей генной информации по назначению. В лабораториях Европы и США идет разработка искусственных терапевтических хромосом, которые будут мирно сосуществовать с генотипом клетки хозяина, позволяя вырабатывать недостающие белки. Электрическое поле и ультразвук - перспективные кандидаты на роль основных методов доставки этих новых препаратов. В данной работе исследованы преимущества и недостатки этих методов. Итоги данного исследования приводят к выводу, что наиболее перспективный следующий шаг - сочетание физических методов преодоления внешней клеточной мембраны с химическими факторами, инициирующими клеточные механизмы транспорта в ядро (использование ДНК, химически связанной с аминокислотными последовательностями ядерной локализации (NLS)).

Предложенная методика анализа динамики пассивного транспорта позволяет охарактеризовать распределение повреждений на поверхности клетки и может быть использована как метод получения информации о геометрии обратимо поврежденной клеточной поверхности с разрешением 1-10 нм в дополнении к существующим методам микроскопии.

Модель транспорта макромолекул через роговой слой кожи при воздействии последовательности импульсов электрического поля высокого напряжения явилась первой моделью, которая использовала механизмы электрического пробоя липидных бислоев и информацию о структуре кожи для объяснения экспериментально наблюдаемых результатов..

Апробация работы

Конференции

Результаты работы были доложены на конференции Американского Акустического Общества. (AAS) (декабрь 2002), конференции американской ассоциации биомедицинских инженеров (BMES) (октябрь 2003), симпозиуме "Промышленные применения вузовских результатов" (Educational Partner Symposium) Технологический Институт Джорджии (октябрь 2003).

Публикации

По материалам диссертации опубликована 1 работа, и 1 работа направлена в печать.

Структура и объем диссертации..

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав, заключения, выводов и библиографии. Работа изложена на 160 листах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 30 рисунков, библиография включает 156 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дано краткое описание тематики диссертации и актуальности решаемых в ней задач, приведен обзор литературы по теме, перечислены основные экспериментальные результаты, полученные в области использования ультразвука и электропорации для трансфекции и доставки лекарственных препаратов. Также изложены современные представления о механизмах воздействия ультразвука и электропорации на клетки и ткани, приведен анализ публикаций об использовании электропорации для временного повышения проницаемости кожи для гидрофильных веществ.

В первой главе описываются экспериментальные установки, используемые для облучения клеток ультразвуком (24 и 500 кГц), и электропорации, методы клонирования, очистки и использования плазмидной ДНК, а также методика работы с культурой клеток рака простаты человека DU145, используемой нами для экспериментального исследования.

Трансфекция суспензии клеток осуществлялась путем электро- или ультразвуковой обработки в присутствии раствора плазмиды ДНК. Было проведено исследование зависимости трансфекции клеток низкочастотным ультразвуком 24 кГц с амплитудой давления звуковой волны от 0.4 до 0.8 МПа и общей длительностью воздействия от 0.1 до 0.8 секунд от параметров облучения. Большая часть экспериментов касается изучения последствий обработки клеток импульсами высокочастотного ультразвука 500 кГц с амплитудой давления от 0.5 до 2 МПа в присутствии кавитационного агента Optison. Подробное описание экспериментальных установок приводится в тексте диссертации. Электрообработка

клеток производилась на стандартном оборудовании Electro Cell Manipulator 600 (ВТХ).

Было исследовано влияние параметров ультразвукового поля, концентрации клеток и температуры окружающей среды на выживаемость клеток и трансфекцию.

Для получения сведений о трансфекции плазмидой pEGFp-Nl, кодирующей GFP (зеленый флюоресцентный белок), суспензия клеток анализировалась на поточном цитометре, что позволяло в течении минут получить сведения о распределении 20000 клеток по степени флюоресценции. При возбуждении светом с длиной волны 488 нм успешно трансфецированные клетки отличались более высокой светимостью на длинах волн 505-535 нм, что регистрировалось в FITC канале поточного цитометра. Путем сравнения количества клеток, содержащихся в одном и том же объеме жидкости, для контрольного образца и образца, подвергшегося обработке, удавалось получить сведения о доле клеток, разрушенных в процессе обработки или погибших после ее окончания; - таким образом определить цитотоксичность воздействия. Подобным же образом анализировались результаты доставки в клетки флюоресцентных макромолекул.

Для анализа трансфекции с помощью плазмиды pGL3, кодирующей белок люциферазу, клетки обрабатывались литическим агентом с целью извлечения содержимого цитоплазмы. Полученный экстракт смешивался с люциферином в присутствии молекул АТФ. Концентрации люциферазы определялась по световому выходу реакции окисления люциферина, измеряемому с помощью люминометра.

Измерения транспорта ДНК осуществлялись путем связывания ДНК с флюоресцентными маркерами YOYO-1, YOYO-3, проведения процедуры обработки клеток ультразвуком или электрическим полем и последующего измерения изменения флюоресценции клеток через 1 и 24 часа после эксперимента на поточном цитометре.

Наблюдение трансфекции производилось также на эпифлюоресцентном и конфокальном микроскопах с 4х - 63х кратным увеличением с использованием возбуждения на длинах волн 380, 488 и 543 нм. Полученные снимки позволили определить локализацию доставленной ДНК внутри клеток.

Во второй главе приводятся результаты экспериментального исследования трансфекции с целью оптимизации ее эффективности.

При облучении суспензии клеток в концентрации 106 клеток на. мл в присутствии плазмид ДНК (20 мкрг на мл) ультразвуком 24 кГц был определен оптимальный диапазон потока звуковой энергии (5 -20 Дж/см2). Максимальная эффективность трансфекции при этом составила 0.5% от числа клеток, подвергшихся облучению ультразвуком, что в 7-8 раз выше, чем трансфекция контрольной необлученной суспензии клеток, к которым была добавлена ДНК в той же концентрации. Сходные результаты получены для обеих использованных плазмид.

Был также проведен поиск оптимальных акустических параметров трансфекции при облучении 60 миллисекундными импульсами ультразвука высокой частоты (500 кГц) суспензий клеток в присутствии кавитационного агента Optison (1.7 % v/v) и ДНК (2 мкрг на мл). При применении 60 миллисекундных импульсов с амплитудой давления от 0.5 до 2 МПа, наибольшая трансфекция для обеих плазмид наблюдалась при потоке акустической энергии через образец равной 8-32 Дж/см2, при этом удалось достигнуть повышения трансфекции в 17 раз по сравнению с контрольными образцами.

Поток энергии, ДжУсм1

Рисунок 1 Влияние концентрации клеток в суспензии на трансфекиию плазмидной ДНК и выживаемость клеток (А) СРР транссЬекция и (В) выживаемость клеток как функции потока акустической энергии при различных концентрациях клеток: (♦1 106. (Ч 107. (А) 108 клеток/мл Эксперименты проводились при комнатной температуре 21 °С с использованием ультразвука 500-кГц.

При экспериментальном исследовании было выявлено, что трансфекция и цитотоксичность под воздействием импульсов высокочастотного ультразвука зависят от концентрации клеток в суспензии. Оказалось, что при повышении концентрации клеток от 106 до 107 клеток на мл, эффективность трансфекции повышается в три раза, что сопровождается также снижением цитотоксичности воздействия. При дальнейшем повышении концентрации клеток от 107 до 108 клеток на мл происходит дальнейшее снижение цитотоксичности, однако, эффективность трансфекции снижается (Рис. 1).

Возможным объяснение наблюдаемым эффектам является то, что в концентрированной суспензии клеток изменяется радиус воздействия кавитационного коллапса на клетки, за счет более интенсивного поглощения энергии средой. При первоначальном повышении концентрации снижение радиуса повреждающего воздействия ультразвука происходит существенно сильнее, чем для радиуса его полезного "порирующего" воздействия. При дальнейшем повышении концентрации клеток эффективно экранируется и полезное воздействие.

Было также исследовано влияние температуры окружающей среды на трансфекцию. Исследование показало, что при повышении температуры от 21 до 37°С эффективность трансфекции вырастает в несколько раз для суспензий клеток с концентрациями 106 и 107 клеток на мл.

Таким образом, путем подбора оптимальных условий обработки удалось добиться 98 кратного улучшения трансфекции по сравнению с контрольными

образцами. В оптимальных условиях экспрессия ОБР наблюдалась в 5 процентах облученных клеток при выживаемости -40% клеток (см. рис.2).

В работе было проведено исследование разрушения молекул ДНК под действием ультразвука. Для этого мы сравнили эффективность химически вызываемой трансфекции клеток контрольной и обработанной ультразвуком ДНК (в качестве химического агента вызывающего трансфекцию использовался препарат ПроТах!, представляющий смесь катионных липосом). Оказалось,разрушение ДНК под действием ультразвука становится существенным при таких значениях потока акустической энергии (>80 Дж/см2), которые существенно больше чем те, при которых наблюдалась оптимальная трансфекция. Это верно ультразвука частотой как 24, так и 500 кГц. Таким образом, исследование показало, что разрушение ДНК под действием ультразвука не является обстоятельством, влияющим на эффективность трансфекции при достаточно низких значениях потоков акустической энергии.

Третья глава. Трансфекция эукариотов является многостадийным процессом. Для успешной трансфекции ДНК должна быть доставлена внутрь клетки, затем преодолеть ядерную мембрану, и только затем клеточный аппарат обеспечит считывание генетической информации плазмиды, произведя РНК, с которой в эндоплазматическом ретикулуме будет осуществлен синтез белка. Основываясь на экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что транспорт макромолекул в клетки может быть существенно увеличен при ультразвуковой обработке (Guzman, и др. 2002), мы ожидали, что увеличение эффективности трансфекции должно быть,

по крайней мере, частично, обусловлено увеличенным транспортом ДНК в клетки. Были предприняты специальные эксперименты по измерению транспорта маркированной ДНК в клетки при ультразвуковом воздействии. Анализ эффективности транспорта ДНК, помеченной флюоресцентным красителем YOYO-1 в соотношении 1 молекула красителя на 10 пар оснований ДНК, был произведен с помощью поточного цитометра и конфокального микроскопа (Рис. 3)

FITC флюоресценция

Рисунок 3. Транспорт флюоресцентно меченной ДНК в клетки.

А) Гистограммы, показывающие распределение клеток по флюоресценции в диапазоне 505-550 нм при возбуждении аргоновым лазером 488 нм (FITO контрольных клеток (серый) и выживших клеток (черный) после ультразвукового облучения в суспензии, содержащей 20 микрограмм/мл маркированной ДНК-Усиление флюоресценции облученных клеток связано с попаданием флюоресцентных молекул ДНК внутрь клеток. В) Снимок Флюоресценции клеток, сделанный на конфокальном микроскопе через 1 час после обработки ультразвуком в присутствиии флюоресцентно маркированной ДНК. Флюоресценци ДНК передана на рисунке белым цветом. Темные области внутри клеток в центре снимка и в правом верхнем углу соответствуют их ядрам, транспорт ДНК внутрь которых существенно затруднен. Деление шкалы соответствует 10 микрометрам

Анализ гистограмм распределения флюоресценции клеток (рис 3.А) позволил нам определить число молекул ДНК, доставленных с помощью ультразвука. Гистограмма распределения клеток, облученных ультразвуком в присутствии ДНК, по интенсивности флюоресценции показывает, что помимо популяции клеток, сохранивших интенсивность флюоресценции в процессе обработке, присутствует популяция из примерно 40% клеток с флюоресценцией на порядок величины выше. Калибровка показаний поточного цитометра с помощью микросфер с известной флюоресценцией показала, что этот сдвиг отвечает флюоресценции ~16 тысяч молекул флюоресцеина. Измерения флюоресценции растворов флюоресцеина и ДНК известной концентрации на флюорометре показало, что интенсивность флюоресценции одной меченной красителем YOYO-1 молекулы ДНК соответствует 200 молекулам флюоресцеина. Таким образом нам удалось показать, что в использованных нами для этого эксперимента условиях (частота ультразвука 500 кГц, поток звуковой энергии 16 Дж/см2) в 40% клеток было доставлено в среднем по 800

молекул ДНК. Трансфекция при этом была достигнута лишь в 10% выживших клеток. Следовательно, доставка ДНК оказалась в 4 раза более успешной, чем трансфекция.

Для более тщательного исследования взаимосвязи доставки молекул ДНК в клетки и последующей трансфекции мы произвели эксперименты по одновременному измерению трансфекции и транспорта ДНК при электропорации и ультразвуковом облучении. Условия эксперимента требовали покраски ДНК как можно меньшим числом молекул красителя, чтобы не нарушить пригодность ДНК для трансфекции. Кроме того краситель должен был обладать спектром флюоресценции не пересекающимся со спектром GFP. Эти требования были удовлетворены при использовании красителя YOYO-3 в пропорции 1 молекула красителя на 100 пар оснований ДНК. Результаты исследования транспорта ДНК и трансфекции показали, что трансфекция хорошо коррелирует со средним количеством молекул ДНК доставленных в клетки (Рис 4.).

Проведенные эксперименты показали, что электропорация способна доставить в клетки в среднем в 25-30 раз больше молекул ДНК, чем ультразвук, но трансфекция среди выживших клеток при этом выше всего в 2-2.5 раза. При пересчете результатов на клетки, которые были обработаны, эффективность трансфекции при электропорации оказалась даже ниже в 1.2-1.5 раз, чем при обработке ультразвуком.

Как известно для трансфекции недостаточно доставки ДНК в цитоплазму клеток, поскольку ДНК у эукариот способна функционировать только в ядре. На эффективность транспорта ДНК в ядро влияют следующие обстоятельства: а) диффузия молекул ДНК в цитозоле сильно ослаблена (Lukacs и др., 2000), б) ядро

клеток практически непроницаемо для пассивной диффузии молекул крупнее 4 нм (Neves и др., 1999) и в) время, за которое ДНК должна попасть в ядро ограничено, поскольку плазмиды в цитозоле деградируют за время порядка 90 минут (Lechardeur и др., 1999).

Если бы транспорт доставленной ДНК из цитоплазмы в ядро осуществлялся путем пассивной диффузии, эти факторы приводили бы к существенно более высокой трансфекции при электропорации, чем при ультразвуковой обработке. Возможным объяснением тому, что в десятки раз меньшее количество ДНК, доставленное при ультразвуковом воздействии, вызывает сравнимую и даже большую транфекцию, чем ДНК, доставленная при электропорации, может быть стимуляция активного внутриклеточного транспорта ДНК при ультразвуке. Дополнительным доводом в пользу этой гипотезы является то, что процесс залечивания крупных (радиусом порядка сотен и более нанометров) повреждений клеточной мембраны, которыми сопровождается ультразвуковая обработка клеток, сопровождается усилением внутриклеточного транспорта (McNeil и др.,2003).

В четвертой главе приводятся результаты экспериментов и математической модели, позволяющих оценить степень повреждения наносимого ультразвуком клеткам и кинетику залечивания клетками этих повреждений.

Описываемый эксперимент состоял в том, что флюоресцентные молекулы размером от 0.6 нм (кальцеин) до 28 нм (декстран 2000) добавлялись к клеткам, обработанным двумя импульсами ультразвука 24 кГц (общая длительность обработки 2 секунды), через определенное время (1-120 секунд) после окончания обработки. Анализ флюоресценции клеток с помощью поточного цитометра проводился после того, как они находились в растворе флюоресцентного маркера в течении 10 минут. Это позволило определить концентрацию макромолекул в клетках, получивших повреждение и восстановивших целостность своей мембраны. Сравнение внутриклеточной концентрации макромолекул с их концентрацией в окружающем растворе показало, что за время эксперимента залечивание клеточной мембраны происходило достаточно быстро, так что концентрация в выживших клетках не успевала достигнуть равновесного уровня. Эксперименты показали, что через 120 секунд после окончания обработки транспорт всех молекул прекращается и происходит полное залечивание внешней мембраны клеток. Экспериментально полученные данные по внутриклеточной концентрации флюоресцентных молекул в зависимости от времени их добавления к суспензии клеток после окончания облучения приведены на рисунке 5.

Механизмами транспорта молекул в данных условиях могут выступать диффузия и конвекция через вновь образованные повреждения клеточной мембраны, а также активный клеточный транспорт. В описываемом эксперименте клетки находились в изотоническом растворе, поэтому повреждение их мембран не вызывало потоков воды, связанных с выравниванием осмотического давления. К экспериментальной ячейке, не прикладывалось электрическое напряжение, и она была равномерно прогрета. Из всего этого можно сделать вывод, что конвективная компонента транспорта была равной нулю. Для того, чтобы определить насколько велик активный транспорт исследуемых макромолекул в процессе нормальной жизнедеятельности клеток мы помещали клетки в растворы флюоресцентных макромолекул на 10 минут без обработки ультразвуком. Оказалось, что транспорт макромолекул при этом был ниже порога чувствительности нашей аппаратуры. Таким образом, мы пришли к выводу, что поток макромолекул в данном случае определялся исключительно диффузией. Диффузионный поток вещества пропорционален разности концентраций внутри клеток и в окружающей среде, что можно выразить с помощью уравнения (1).

здесь Va - объем доступный внутри клетки для а-макромолекулы ((ct= {кальцеин, сывороточный альбумин, декстраны 150, 500 и 2000}), который зависит от размера молекулы, поскольку ядро клеток недоступно для молекул радиусом более 4 им), Ca¡ внутреклеточная концентрация a-макромолекул, Ya - коэффициент описывающий

проницаемость клеточной мембраны для а - макромолекулы. Проинтегрировав уравнение 1 по времени можно выразить внутриклеточную концентрацию вещества через интеграл от После некоторых дальнейших преобразований можно

получить следующее выражение для эффективной проницаемости клеточных мембран У„(1)

Результаты расчетов проницаемости Уа(1) по формуле 2 представлены на рисунке 6.

Анализ данных, представленных на рисунке 6, показал, что проницаемость мембраны для крупных молекул (декстран 500 и декстран 2000) существенно ниже, чем можно было бы предположить, исходя из данных о проницаемости мембраны для кальцеина и соотношения коэффициентов диффузии кальцеина и декстранов.

Для объяснения наблюдаемого расхождения требуется учитывать дополнительные эффекты, такие как возможность наличия на поверхности клеток после облучения пор, сопоставимых по размеру с макромолекулами. При этом если размер макромолекулы больше размера поры, то ее транспорт совершенно невозможен, а при сопоставимом размере поры и макромолекулы диффузия существенно затруднена. Наличие популяции пор разного размера на поверхности могло бы объяснить наблюдаемые явления.

1.Е+00

1.Е-07 -,-,-,---

О 30 60 90 120 150

Время, с

Рисунок 6 Зависимость проницаемости клеток для флюоресцентных маркеров от времени, прошедшего после окончания облучения ультразвуком. Проницаемость рассчитана из данных по внутриклеточной концентрации с помощью уравнения 2.

Базовым уравнением для моделирования транспорта было выбрано уравнение описывающее диффузию через одиночную круглую пору в сферическую клетку. В литературе по химической кинетике приводится полуэмпирическое уравнение (3), которое описывает транспорт макромолекул через одиночную круглую пору в плоской мембране (Malone и Anderson, 1977).

здесь Ь- толщина мембраны, г- радиус поры, Всп- эффективный коэффициент диффузии молекул в узкой поре где множитель учитывает

уменьшение доступного размера поры для макромолекулы, Б -коэффициент диффузии, Осу, коэффициент диффузии в цитозоле, равного 0.27 Б для макромолекул весом до 500 Дальтон (Као, и др. 1993, веквек, и др. 1997). Подстрочный индекс в у проницаемости Ум в уравнении 3 введен для того, чтобы отличать проницаемость одиночной поры от проницаемости системы пор. Применимость уравнения (3) к задаче диффузии в сферическую полость (клетка) через круглое отверстие была верифицирована с помощью моделирования методом конечных элементов в программе РешЬаЪ 2.3. В диапазоне размеров поры от 1 до 100 нм результаты компьютерных расчетов совпали с решением уравнений 1,3 с отклонением не более 1%.

При описании транспорта через множество пор необходимо учитывать, что при диффузии вещества через широкую пору (радиус которой сопоставим или больше её длины) в окружающем устье поры растворе наблюдается значительный градиент концентрации на расстояниях порядка нескольких радиусов от поры. Если в пределах этого расстояния размещается еще одна пора, то распределение концентрации вокруг каждой из пор изменяется, а поток вещества уменьшается. Как следствие, проводимости близко расположенных пор перестают складываться аддитивно. Таким образом, задача получения информации о геометрии повреждений на поверхности клетки из данных о диффузии содержит существенную неопределенность, связанную с отсутствием данных о взаимном расположении пор. Тем не менее, некоторая информация может быть получена из анализа двух предельных подходов к взаимному распределению пор.

Первый подход - считать поры достаточно далеко отстоящими друг от друга на поверхности клетки. Это позволяет считать результирующую проницаемость суммой проводимостей отдельных пор. В этом случае искомое распределение пор по размерам было представлено как набор пор пяти различных размеров (3.5, 8.9, 15, 28, 40 нм). Размеры пор были подобраны в соответствии с размером макромолекул так, чтобы обеспечить максимальную селективность. Приравняв проницаемость набора пор значениям проницаемости клетки для использованных макромолекул, мы получили систему уравнений на количество пор каждого размера. Решение этой системы представлено на рисунке 7. Интересным результатов является то, что в непосредственно после облучения максимальная доля открытой поверхности клеток проницаема для молекул размером менее 15 нм (кальцеин, сывороточный альбумин, декстран 150), что, по-видимому, означает наличие слабо поврежденной структуры цитоскелета, образующей сито с размером ячеек порядка 20 -30 нм, которое существенно затрудняет диффузию молекул сопоставимого размера. Стоит отметить, что размер 20-30 нм соответствует максимальному размеру макромолекулы способной диффундировать внутри клетки (ЬиЪу-РИе^ 1987). Через 15-30 секунд после окончания обработки клетка начинает восстанавливать целостность мембраны (как показывают данные электронной фотографии это происходит путем рекрутирования везикул из цитоплазмы) и доля поверхности доступной для транспорта молекул крупнее 8 нм существенно снижается. Практически непроницаемой для молекул размером 3.5 нм клетка становится через 60 секунд, для молекул размером 0.6 нм через 120 секунд.

Второй подход состоит в том, чтобы считать поры максимально тесно расположенными друг к другу. В этом случае радиус в формуле (3) нужно трактовать как размер области, через которую возможна диффузия молекул данного размера (эффективно порированная область), а эффективный коэффициент диффузии может быть получен путем усреденения по области. График зависимости размера области, открытой для молекул кальцеина, от времени приводится на рисунке 8.

О 50 100 150

Время, с

Рисунок 8. Залечивание повреждения на поверхности клетки. Радиус области повреждения экспонециально спадает со временем.

Результаты оценки размера области повреждения в начальный момент времени находятся в полном соответствии с оценками, полученными в нашей лаборатории путем анализа электронными микрофотографий клеток, обработанных ультразвуком (размер области повреждения по данным ТЕМ - 0.5- 1 микрометр) (Рис.9).

Рисунок 9. фотография клетки

DU145._после_облучения

ультразвуком 24 кГц (амплитуда давления 0.7 МРа) и зафиксированной в течение нескольких секунд после облучения. полученная путем:

просвечивающей_электронной

микроскопии (ТЕМ) Слева виден разрыв в клеточной мембране.

Везикулы._участвующие_в

залечивании (McNeil и др. 1997). окружают место повреждения.

фотографии публикуются_с

любезного разрешения Robvn

Schlicher._Длина_светлого

прямоугольника на темном фоне в нижнем левом углу фотографии соответствует 1 им

Проведенное исследование показало, что порация при ультразвуковом облучении существенно отличается от порации при электрической обработке. Так на поверхности клеточной мембраны после ультразвуковой обработки отсутствуют круглые поры размером от 20 до 120 нм характерные для электропор (Chang, 1990). Повреждение мембраны при ультразвуке выглядит как рваная рана радиусом до 1 микрона. Для залечивания ультразвукового повреждения требуется существенно большее время (120 секунд), чем при электропорации (5-10 секунд), при этом клетка использует мембранный материал везикул для формирования "заплаты". Эксперименты с макромолекулами показали, что поверхность повреждения, выглядящая свободной от клеточной мембраны представляет серьезные затруднения для транспорта макромолекул, особенно радиусом более 15 нм. Эти затруднения, по-видимому, создаются сетью цитоскелета, внутриклеточными органеллами и везикулами, подтягиваемыми клеткой к месту повреждения.

В пятой главе описывается модель транспорта молекул кальцеина при электропорации рогового слоя кожи человека. Роговый слой кожи {stratum corneum, далее SC) представляет основной барьер для транспорта гидрофильных молекул через кожу человека.

Как было показано Prausnitz и коллегами (1993а, 1993с), после обработки кожи человека in vitro каждые 5 секунд в течение часа миллисекундными импульсами высокого напряжения, поток кальцеина через кожу увеличился на несколько порядков величины. Похожие результаты были получены для транспорта метапролола через кожу крыс in vitro (Vanbever, и др. 1994). Более того, даже одного импульса высокого напряжения оказалось достаточно для существенного усиления последующего ионтофоретического транспорта (Bommannan, и др. 1994). Таким образом, есть все основания полагать, что эти результаты обусловлены созданием новых транспортных путей через кожу человека. В тоже время, активация существующих ионтофоретических путей через волосяные фолликулы и сальные железы, по-видимому, не способна объяснить наблюдаемые явления (Weaver и

Baгnett, 1992). Простые оценки показывают, что напряжения на каждом монослое при использованных напряжениях вполне достаточно для его электропорации (0.5-1 В). Основной гипотезой данной модели является то, что электропорация (то есть обратимое изменение проводимости для ионов и макромолекул под действием электрического поля) SC является причиной наблюдаемого увеличения проницаемости кожи для макромолекул.

На основе имеющихся данных о структуре верхнего слоя кожи и изменения ее свойств при нагревании и химической обработке мы предложили модели слоя SC кожи и указали возможные новые пути транспорта, которые возникают при приложении к этой системе импульсов высокого напряжения (рис 10).

Основными путями транспорта макромолекул после электропорации могут быть: (а) путь, проходящий частично через поры в изолирующих мультислоях, частично через гидрофильные компартменты, которые могут быть либо внутри ороговевших корнеоцитов, либо вне корнеоцитов в промежутке между липидными мультислоями (прямой путь), (б) путь, проходящий исключительно через поры в липидной фазе в обход корнеоцитов (извилистый путь), (в) путь, проходящий через волосяные окончания и протоки сальных желез и не проходящий через SC. В данной работе анализируется возможности реализации первых двух возможностей, строится математическая модель транспорта при электропорации и производится сопоставление модели и экспериментальных данных.

Одним из ключевых вопросов модели было объяснение нелинейного поведения транспорта макромолекул, когда при повышении напряжения от 100 до 300 В поток молекул через кожу меняется на несколько порядков величины, а сопротивление кожи не претерпевает столь разительных изменений. Предложенное решение проблемы состоит в том, что основные пути для тока малых ионов и потока макромолекул пролегают через разные участки кожи. Малые ионы преимущественно

проникают через волосяные окончания, в то время как макромолекулы диффундируют через поры в SC. Электрическое сопротивление SC включено параллельно сопротивлению волосяных окончаний, непроницаемых для макромолекул, и претерпевает значительные изменения при электропорации (от 50 до 300 В). Электропорация SC увеличивает поток макромолекул кальцеина, однако, сопротивление SC при этом остается существенно больше сопротивления волосяных окончаний и потому не отражается на сопротивлении кожи (эквивалентная электрическая схема кожи приведена на рис. 11).

-т~ Рисунок 11 Эквивалентная электрическая

схема SC. Сопротивление раствора электролита в измерительной ячейке Rk

подключено_последовательно_к

и, сопротивлению кожи. Сопротивление R.

соответствует_основным_путям

о транспорта малых молекул, включая

протоки желез и волосяные фолликулы. Сопротивление R. соответствует общему сопротивлению внутренних частей компартментов и R; сопротивлению липидных бислоев. образующих барьеры

--между компартментами. U, и U; падения

напряжения на соответствующих сопротивлениях.

Число пор в мультислоях при электропорации моделировалось на основе термодинамической теории предложенной в работе Глазера с соавторами (Glaser 1988) с учетом эффекта делителя напряжения

где

Здесь, а - это площадь, занимаемая одним липидом, Zq - диэлектрическая постоянная вакуума, - диэлектрическая проницаемость бислоя,

диэлектрическая проницаемость воды, v - частота латеральных флуктуаций липидов, р - удельное сопротивление раствора электролита, г - средний радиус поры, Г. - радиус поры, соответствующий переходному состоянию, U, - электрическое напряжение на слое SC, AW° - активационная энергия при отсутствии электрического поля.

Это уравнение решалось численно, причем параметры и r варьировались с целью поиска наилучшего соответствия экспериментальных и теоретических результатов.

В модели извилистого пути предполагалось, что через слой SC проходят несвязанные между собою каналы с радиусом равным радиусу поры и плотностью равной плотности пор. Извилистый путь огибает коренеоциты и потому существенно длиннее, чем толщина бислоя (в нашей модели в раз длиннее, где ~ 50

извилистость ). Профиль концентрации в отдельном канале рассчитывался как решение одномерного электродиффузионного уравнения в частных производных. В диссертации приводятся аналитические выражения и результаты численного расчета распространения профилей концентрации через роговый слой кожи при выборе различных граничных условий на границе роговой слой/эпидермис. В режиме установившегося профиля концентрации плотность потока описывается следующим уравнением (5)

где

V = геИЕ/кТ, Е =

Мл. рн

(5)

z - заряд молекулы, е - заряд электрона, D -

коэффициент диффузии, k - константа Больцмана, Т- температура, р - извилистость пути (принята равной 50).

Выражение для суммарного потока через слой SC рассчитывалось как произведение потока в одиночном канале на плотность каналов, принятую равной числу пор ОД.

Релаксация потока после окончания обработки описывается в этой модели наложением явлений диффузионного размывания профиля концентрации в одиночном канале в отсутствии электрического поля и уменьшением числа открытых пор. Итоговое выражение для релаксации потока дается в этой модели уравнением 6.

Анализ параметров задачи показал, что в модели прямого пути падение концентрации происходит преимущественно на границах между компартментами и изменением концентрации внутри компартментов можно пренебречь. Транспорт макромолекул при этом может быть рассчитай как решение системы обыкновенных дифференциальных уравнений, описывающих диффузию вещества из одного компартмент в другой. В целях получения аналитических выражений для потока и профиля концентрации было получено уравнение в частных производных описывающее диффузию в этой системе (7).

дс «Э2с „Эс

ДО Э/

= £»

Эх2 дх'

(7)

ОД -плотность пор, у доля объема

доступного для гидрофильных молекул.

Важной особенностью данного уравнения является явная зависимость коэффициентов от времени. Данное уравнение удается свести к уравнению с постоянными коэффициентами путем введения ренормализованного времени

Т — у 1 |/(/)Л. Это преобразование позволяет привести уравнение 7 к

уравнению электродиффузии с постоянными коэффициентами, что позволяет воспользоваться результатами анализа уравнений, полученных для модели извилистого пути. Выражение для стационарного потока во время электрообработки дается уравнением 8

По форме это уравнение подобно уравнению 5, однако, действующее напряженность поля существенно выше, поскольку падение напряжения происходит не на всей длине извилистого пути, а лишь на тонких перемычках между компартменами. Выражение для релаксации потока в модели прямого пути дается уравнением (9)

Экспериментальные данные содержат два набора данных для фитирования модели. Во-первых, зависимость потока молекул кальцеина от амплитуды прилагаемого напряжения. Во-вторых, скорость релаксации потока после окончания электрообработки. На рисунках 12 и 13 приведены результаты фитирования имеющихся данных с помощью двух предложенных маршрутов транспорта через SC. Параметры, использованные при фитировании для обеих моделей приведены в Таблице 1

10"

10«

10-'

з- а-

ч у

" ¡5

и <-»■

О СП 10"»

Е =1

о

и 'Г

: 1 , | ; ,_Г

■ 1 !

1 \ '. / 1 1 > 1 ; .......... ...........

Г7.......Г.................. » .........1

Напряжение (В)

Рисунок 12. Зависимость потока кальцеина в момент окончания электрообработки от приложенного напряжения. (▼> Экспериментальные данные из работы Ргзиапйг и др. (1993): теоретические кривые построены в соответствии с уравнениями для извилистого и прямого пути соответственно.

Рисунок 13. Зависимость плотности потока от времени. после прекращения электрообработки при Ц.=90 В. (А) Экспериментальные данные из работы Ргаи5пк7 и др. (1993'). Теоретические кривые, полученные для извилистого

(липидного) пути (-и для

прямого пути (----)■

0 0 0.5 10 1.5 2.0 2.5 3 0 15

Время (часы)

Энергетические и кинетические параметры электропор V, а, были взяты из работы Глазера и др. (1988). Для Б и с0 мы использовали значения 106 см2/сек и 0.01 М, согласно работе Ргашпкг и др. (1993). Величины ат и рассматривались как подгоночные параметры. Параметр а полученный из уравнения (4) с п=100 равен 4.8 х 10 4В2, что хорошо соответствует значениям полученным при фитировании (9 х 104 В2 для прямого пути и 1.3 х 104 В2 для извилистого). Значения сопротивлений =2800 Ом см2 (8 модель) и =7200 Ом см2 (1 модель) намного больше Я, (~ 100 Ом см2) в полном соответствии с нашим первоначальным предположением, что открытие новых гидрофильных путей не ведет к существенному изменению сопротивления кожи.

Радиус пор г оказался наиболее существенно влияющим параметром В модели прямого пути, он получился равным 4А, что совпадает по порядку величины с радиусом молекулы кальцеина (бА). Радиус поры, получившийся в модели извилистого пути, г,= 200 А представляется чрезмерно большим, даже если принимать во внимание, что он отражает не радиус поры в бислое, как таковой, а эффективный размер извилистого пути через 8 С, включая межбислойные промежутки.

Полученные параметры позволяют рассчитать долю электропорированной поверхности и плотность пор (см. Таблицу 1). Анализ полученных результатов показывает, что площадь порированной поверхности растет с увеличением прикладываемого напряжения в каждой из моделей, в полном соответствии с результатами, полученными на других липидных системах. Доля порированной поверхности для модели извилистого пути (1 модель) получается на три порядка величины больше, чем для прямого липидно-корнеоцитного пути. Это связано с тем, что модель предполагает более длинный маршрут для макромолекул, тем самым уменьшая средний градиент концентрации и электрическое напряжение, в то время как модель прямого пути предполагает напротив более высокие значения градиентов концентрации и электрического напряжения на межкорнеоцитых изолирующих мультислоях.

Таблица I Доля порированной площади Г и плотность пор N при различных напряжениях для 5 и t моделей_

Напряжение sмодель t модель

U, (В) f„ % N. (см'г) f„% N„ (cm'z)

50 4.5 х Ю-' 7.9 х 104 2.5 х 10 J 1.8 x 106

100 2 х 10"5 3.4 х 10' 4 х 10'z 3 x 107

200 1 х 10"4 1.6 х 108 1.4 x 10"' 1 x 108

500 3.5 х 10"4 6.2 х 10s 4.3 x Ю-1 3.2 x 10s

Более высокое значение пористости необходимое для согласия модели липидного пути с экспериментом (ft ~ 10"' %) соответствует чрезвычайно высокой доли поверхности. По данным электронной микроскопии (Elias, и др. 1977) и ренгеноструктурным данным (Bouwstra, и др. 1992), общая площадь SC, занимаемая липидным доменом в межкорнеоцитных промежутках оценивается в 0.1 %. Таким образом, для соответствия модели извилистого пути с экспериментом необходимо, чтобы весь липидный домен был доступен для транспорта больших, заряженных молекул. Этот вывод, однако, плохо согласуется с экспериментальными результатами, показывающими, что вода составляет лишь малый процент от массы липидного домена (Potts и Francoeur, 1991). Таким образом, в эксперименте реализуется, по всей видимости, прямой путь проходящий через корнеоциты и электропоры в липидных мультислоях.

Разработанная модель позволила показать, что транспорт макромолекул через кожу при импульсной электрообработке объясняется электропорацией липидно-корнеоцитного матрикса. После публикации данной модели был получен ряд интересных результатов, которые подтвердили основные положения и выводы модели. Так измерения электрического тока через кожу при умеренных напряжениях (до 30 В) показали возможность электропорации макропор кожных придатков, а при больших напряжениях подтверждают нашу гипотезой об электропорации липидно корнеоцитного матрикса (Chizmadzhev и др., 1998). Экспериментальные наблюдения также показали, что при приложении импульсов высокого напряжения на слое SC проводимость растет не гомогенно, а в случайно расположенных "зонах повышенной проводимости". Было показано, что появление этих зон вызвано электропорацией, а также предложены стохастические и детерминистические модели их появления (Weaver и др., 1999). В других экспериментах было показано, что при приложении к кожи электрических импульсов длительностью 100 миллисекунд напряжением 300 В джоулево тепло, выделяющиеся при прохождении тока через электропоры, вызывает фазовый переход в липидной фазе, вследствие чего проводимости кожи необратимо растет (Pliquett и Gusbeth, 2000).

Выводы

1. В данной работе показано, что частота облучения, плотность звуковой энергии, плотность клеток и температура являются факторами, определяющими эффективность трансфекции клеток рака простаты человека (ВШ45) при ультразвуковом воздействии. В оптимальных условиях приложение ультразвука вызывает 100 кратный рост трансфекции. Эти условия были достигнуты при облучении суспензии клеток с концентрацией 107 на мл, ультразвуком частотой 500 кГц с потоком звуковой энергии 10-30 Дж/см2 в присутствии кавитационных стабилизированных пузырьков при температуре 37°С.

2. Измерение транспорта ДНК при ультразвуковой обработке показало, что в условиях, соответствующих максимальной трансфекции, ДНК удается обнаружить в 21% облученных клеток, при этом среднее количество молекул ДНК, доставленных в клетку, составляет 800 молекул при концентрации ДНК в растворе 20 цг/мл. Сопоставление данных по трансфекции и транспорту ДНК показало, что трансфекция наблюдается только в 20 процентах клеток, в которые ДНК была доставлена при ультразвуковом облучении.

3. Предложено математическое описание пассивной диффузии макромолекул в клетки, получившие повреждения поверхности. Данный подход позволяет рассчитать характеристики повреждения мембраны, используя данные по кинетике диффузии макромолекул в клетки. Обработка экспериментальных данных с помощью предложенного подхода показала, что при ультразвуковом облучении на поверхности клеток образуется зона повреждения размером порядка 1 микрона, залечивающаяся с характерным временем 20 секунд. Анализ проницаемости поврежденных клеток для пяти макромолекул разного размера показал, что подавляющая часть открытой поверхности закрыта для транспорта молекул радиусом более 15 нм.

4. Построена модель транспорта макромолекул через кожу человека при электрообработке импульсами высокого напряжения. Модель позволила объяснить экспериментально наблюдаемые явления, исходя из гипотезы об электропорации липидной фазы рогового слоя кожи. Результаты моделирования показывают, что новые транспортные пути, образованные в роговом слое кожи, по всей видимости, проходят через корнеоциты и электропоры в липидных мультислоях.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

Публикации

1. Chizmadzhev, Y. A., Zarnitsin, V. G.,Weaver, J. С. and Potts, R. О. "Mechanism of Electroinduced Ionic Species Transport through a Multilamellar Lipid System", Biophys J, 1995, 68(3), pp. 749-765

2. Vladimir G. Zarnitsyn and Mark R. Prausnits "Optimization of ultrasound mediated DNA transfection of prostate cancer cells", направлена в редакцию "Ultrasound in Medicine and Biology" 8 июля 2003 года

Конференции:

1. V. Zarnitsyn and M. Prausnitz "Quantification and optimization of transfection efficiency and cell viability by acoustic cavitation" 144 conference of American Acoustical Society, Cancun, Mexico, December 2-6, 2002

2. M. Prausnitz, P. Kamaev, R. Schlisher and V. Zarnitsyn "Bubbles, membranes and molecules: sequence of events from sonication to intracellular delivery", 144th conference of American Acoustical Society, Cancun, Mexico, December 2-6, 2002

3. V. Zarnitsyn and M. Prausnitz "Optimization of transfection efficiency and DNA uptake by acoustic cavitation". Annual BMES Meeting, Nashville, October 1-4, 2003

4. V. Zarnitsyn, S. Mian and M. Prausnitz "Correlation between DNA uptake and transfection under ultrasound treatment and elecroporation", Educational Partner Symposium, Georgia Institute of Technology, Atlanta, October 19-20, 2003

Типография ордена «Знак почета» издательства МГУ 117234, Москва, Ленинские горы Заказ №1003 Тираж 100 экз.

::. 1 7 8 i

РНБ Русский фонд

2004-4 21192

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Зарницын, Владимир Григорьевич

Раздел стр.

Введение

Литературный обзор

1. Методы экспериментального исследования

1.1. Плазмиды ДНК и клеточная культура

1.2. Экспериментальные ультразвуковые установки (24 и 500 27 кГц)

1.3. Трансфекция клеток плазмидами ДНК и анализ ее 31 эффективности

1.4. Измерение транспорта плазмид ДНК, меченых 35 флуоресцентными маркерами

1.5. Измерения повреждений ДНК под действием 37 4 ультразвука

1.6. Электрообработка клеток

1.7. Статистическая обработка результатов

1.8. Методические замечания о поиске оптимума в системе с 39 большим числом переменных

2. Оптимизация трансфекции клеток

2.1. Влияние потока акустической энергии на трансфекцию и 41 выживаемость клеток при облучении ультразвуком частотой

24 и 500 кГц

2.2. Влияние концентрации клеток в суспензии на 47 трансфекцию и выживаемость клеток при облучении ультразвуком 500 кГц

2.3. Зависимость биологических воздействий ультразвука от температуры окружающей среды

2.4. Разрушение ДНК под действием ультразвука

2.5. Обсуждение результатов оптимизации трансфекции при 53 ультразвуковом воздействии

3. Исследование доставки ДНК, помеченной 58 флуоресцентными маркерами, в клетки при воздействии электрических полей и ультразвука

3.1. Исследование доставки ДНК в клетки под действием 5 8 ультразвука

3.2. Исследование соотношения эффективности доставки 61 ДНК в клетки и трансфекции под действием ультразвука

3.3. Сравнительное исследование доставки ДНК в клетки и 65 трансфекции при электропорации

3.4. Обсуждение результатов исследования доставки ДНК в 69 клетки под действием ультразвука и электрических полей

4. Исследование повреждений клеточной мембраны 72 ультразвуком путем измерения диффузионного транспорта в клетки, подвергшиеся ультразвуковой обработке

4.1. Описание эксперимента и процедуры обработки данных

4.2. Пассивная диффузия через поры в клеточной мембране

4.3. Распределение пор по размерам

4.4. Обсуждение результатов

5. Модель транспорта заряженных макромолекул в роговом 95 слое кожи человека

5.1. Структурная модель рогового слоя

5.2. Электропорация липидного мультислоя в БС

5.3. Модель извилистого (липидного) пути

5.4. Модель прямого (липидно-корнеоцитного) пути

5.5. Оценка параметров модели из сопоставления с 126 экспериментальными данными

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование и оптимизация трансфекции, транспорта макромолекул и цитотоксичности, вызванных воздействием ультразвука и электрического поля на клетки и ткани"

Адресная доставка лекарственных препаратов в органы, ткани и клетки человека является актуальной задачей, стоящей перед современной медициной. В человеческом организме существует множество малопроницаемых барьеров, препятствующих доставке макромолекул. Существующие способы химической и биологической модификации препаратов с целью улучшения их доставки обладают серьезными ограничениями, такими как возникновение побочных эффектов и иммунной реакции организма. В качестве альтернативных подходов к облегчению транспорта макромолекул и трансфекции клеток ДНК были предложены электропорация и ультразвук.

Было показано, что обработка клеток и тканей ультразвуком высокой интенсивности способна на некоторое время повышать эффективность транспорта макромолекул и ДНК внутрь клеток. Известно, что ультразвук с высокой точностью можно сфокусировать практически в любой точке человеческого организма и, таким образом, обеспечить высокую селективность воздействия.

Было обнаружено, что при приложении миллисекундных электрических импульсов высокого напряжения к клеткам и тканям (500-1000 В/см) можно обратимо повысить проницаемость клеточных мембран. В последнее время было также показано, что импульсная обработка кожи человека повышает ее проницаемость для макромолекул.

Целью настоящей работы является экспериментальное и теоретическое исследование транспорта макромолекул в клетки (клетки рака простаты БШ45) и ткани (кожа человека) под действием электрического поля и ультразвуковойобработки; выявление механизмов воздействия используемых физических методов на клетки и ткани, а также оптимизация их применения.

Для выполнения поставленной цели было произведено исследование влияния физических и химических параметров на эффективность трансфекции и цитотоксичность при ультразвуковом облучении суспензии клеток, а также определены оптимальные параметры для достижения максимальной трансфекции и минимальной цитотоксичности.

Было также произведено сравнение эффективности трансфекции при ультразвуковом облучении и электропорации. В данном исследовании в качестве промежуточного контроля использовалось измерение количества ДНК, доставленной в клетки.

В диссертации было впервые произведено исследование обратимых повреждений, вызванных в клетках ультразвуком. Скорость залечивания клеточной мембраны была охарактеризована с использованием экспериментов по заполнению клеток макромолекулами разного размера. При этом флюоресцентные молекулы добавлялись через определенные интервалы времени после окончания ультразвукового воздействия. С помощью математической модели удалось охарактеризовать размер и распределение пор, возникающих под действием ультразвука на клеточной мембране.

В данной работе также разработана модель транспорта макромолекул (кальцеина) в роговом слое кожи человека (stratum corneum) при приложении электрических импульсов высокого напряжения. Эта модель является первой теоретической моделью, показывающей, что электропорация липидных мультислоев в роговом слое коже позволяет объяснить экспериментальнонаблюдаемый обратимый рост проницаемости кожи при импульсной электрической обработке.4мЛитературный обзорПроблема доставки лекарственных препаратовТехнологии доставки лекарственных препаратов, которые позволяютлекарственным средствам попадать контролируемым способом в определенноеместо организма, в настоящее время становятся одним из наиболее динамичноразвивающихся разделов фармацевтической науки. Медицинская ифармацевтическая промышленность формирует возрастающий спрос наподобные технологии. Согласно современным экономическим прогнозам общаявыручка от продаж средств доставки лекарств к 2010 году будет составлять до/20% от всей выручки фармацевтической промышленности (эта доля составила 6% в 2000 году) ((Виге!, 2000)). Согласно другим исследованиям, около 13% мирового фармацевтического рынка уже занято препаратами, содержащими ту или иную технологию их доставки в организм (Ьееи\у, и др. 2000). Исследователи выделяют три основных причины для подобного роста. Во-первых, новые средства доставки лекарств могут позволить выйти на рынок новому поколению терапевтических препаратов, которые отличаются более высокой эффективностью и селективностью по сравнению с ныне используемыми средствами. Во-вторых, использование новых патентованных средств доставки может позволить эффективно продлить патенты на уже используемые препараты. В-третьих, это позволяет более эффективно использовать уже разработанные и используемые препараты, а также сократить расходы на разработку. Новые технологии доставки лекарств должны быть способны безопасно и эффективно преодолевать естественные барьеры организма, с высокой селективностью направлять лекарственные препараты вклетки и ткани, нуждающиеся в них, а также минимизировать неспецифичную доставку. Также необходимо контролировать скорость введения лекарства в организм.

Наибольшие трудности для разработки технологий введения лекарств в организм составляет множество естественных барьеров в организме. Эти препятствия можно в целом разделить на две группы: внешние и внутренние. Внешние барьеры включают кожу, которая препятствует транспорту большинства лекарственных веществ, и ткани, омываемые потоком жидкостей и слизей, которые блокируют проникновение веществ в организм (например, ротовая полость, легкие, носоглотка, ушные раковины и желудочно-кишечный тракт). Внутренние барьеры включают систему биохимических преобразований веществ в печени, которая эффективно разрушает лекарственные вещества, иммунную систему организма, а также физические внутренние барьеры, представленные внешними мембранами клеток, межклеточными контактами и специализированными тканями (эпидермис, гематоэнцефалический барьер и т. д.). Показано, что система барьеров человеческого организма делает невозможной доставку абсолютного большинства терапевтических препаратов молекулярной массой больше, чем несколько сотен дальтон.

Одними из наиболее распространенных способов доставки лекарств являются внутримышечная и внутривенная инъекция. Однако, процедура инъекции отличается болезненностью и недостатком специфичности. Иные существующие методы доставки можно классифицировать как химические, биологические, электрические и механические.

Химический подход заключается в модификации структуры лекарственного вещества путем комплексования, связывания с молекулярнымигидами, упаковки в липидные бислои или липосомы (Zelphati и Szoka, 1996), или компенсации поверхностного заряда (Tomlinson и Rolland, 1996). Воздействуя на размер, гидрофильность и поверхностный заряд лекарственных веществ, удается воздействовать на их распределение в организме, скорость их деградации, фармакологическую кинетику и иммунный ответ (Langer, 1990). Однако, метод химической модификации необходимо подбирать индивидуально для каждого лекарственного препарата. Химическая модификация может вызывать нежелательные побочные явления, а также сильно удорожает стоимость разработки новых лекарств.

Наиболее известная стратегия биологической модификации заключается в использовании вирусов в качестве носителей терапевтической ДНК (Gunzburg и Salmons, 1995). Однако, этот метод не позволяет контролировать участок генома, на котором происходит внедрение нового гена. Уже показано, что в ряде случаев при использовании вирусной генной терапии вызываются фатальные нарушения функционирования клеток и смерть организма, содержащего такие клетки. В настоящий момент эти обстоятельства полностью исключают возможность применения вирусной генной терапии в медицине.

Электрические методы включают электрофорезис (ионтофорезис), а также электропорацию, которая позволяет создать временные поры в мембране клеток путем приложения коротких импульсов высокого напряжения (Chang и Reese, 1990, Weaver, 1993, Weaver, и др. 1998 Abidor, и др. 1978).

Механические методы заключаются в генерации импульсов давления и скачков температуры в тканях и суспензиях. С этими целями используется короткий лазерный нагрев (Lee, и др. 1996, Lin, и др. 2003), фокусированный импульса давления (литотрипсер) (Fair, 1986), ультразвука, а такженепосредственная механическая стимуляция (Fechheimer, и др. 1987, McNeil, идр. 1984).

УльтразвукЗвуковые волны (разновидностью которых является ультразвук) представляют собой продольные механические колебания распространяющиеся в газовой, жидкой или твердой среде. Для описания распространения звуковой волны в конкретном материале используется понятие акустического импеданса, который, как правило, является функцией частоты звука, и связывает плотность вещества со скоростью звука в нем. Когда звуковая волна проходит через границу раздела двух материалов с разными акустическими импедансами, происходит частичное отражение звукового фронта. Отражение от неоднородностей звукового импеданса, или эхо, интенсивно используется в геофизике, физике моря и медицине. Обработка отраженных сигналов позволяет воссоздать картину отражающей поверхности, что нашло применение в эхо локации, неразрушающем исследовании металлов и УЗИ. Термин ультразвук относится к звуковым колебаниям и волнам с частотой выше 20 кГц, что приблизительно совпадает с пределом слышимости человеческого уха (Woodstock, 1979).

В медицине ультразвук генерируется преимущественно акустическими преобразователями (как правило, пьезоэлектрическими) и литотрипсерами. Преобразователь (трансдьюсер) генерирует механический сигнал на частоте, используемого электрического сигнала. Трансдьюсеры, как правило, нагружают сигналом одной резонансной частоты, чтобы получить максимальную амплитуду излучаемой звуковой волны. Литотрипсеры, напротив, используют короткий электрический или химический разряд, для формирования одногоступенчатого волнового фронта (Bjorno, 1970, Bjorno и Jensen, 1973). Эти методы создания ультразвукового поля активно исследовались и широко применяются в медицине для диагностики (трансдьюсеры) и разрушения камней в почках и печени (литотрипсеры). В настоящее время ведутся исследования и иных способов применения ультразвука. Показано, что высокочастотный ультразвук способен вызвать коагуляцию крови и обеспечить оперативное "заваривание" обширных поверхностных кровоточащих поверхностей внутренних органов для использования в медицине катастроф (Vaezy, и др. 2001). Облучение мозга высокочастотным ультразвуком позволяет ускорить разрушение тромбов, вызывающих инсульт головного мозга, и находит применение в нейрохирургии (Eggers, и др. 2003).

Биологическое воздействие ультразвука на клетки возможно через нагрев, кавитацию пузырьков и синтез химически активных радикалов (Barnett, 1998, Chapelon, и др. 1992). Однако, именно кавитация является основныммеханизмом воздействия ультразвука на клетки (Barnett, 1998, Carstensen, и др. 1993, Ciaravino, и др. 1981).

Акустическая кавитацияТермин "акустическая кавитация" применяется для описания активности пузырьков газа в жидкости, возникающей вследствие приложенного акустического поля ((Apfel, 1997, Young, 1989). Возникновение пузырьков газа в. абсолютно чистой беспримесной жидкости описывается молекулярно-кинетической теорией, согласно которой предел прочности жидкостей определяется молекулярными связями между молекулами (Sirotyuk, 1971). Если руководствоваться этой теорией, то для образования газовых полостей к жидкости необходимо приложить отрицательное давление порядка нескольких десятков тысяч атмосфер. Так теоретический предел прочности для воды составляет порядка 1000 атмосфер (Apfel, 1997). На практике этот предел гораздо ниже, благодаря присутствию неоднородностей. Эти неоднородности действуют как зародыши газовой фазы. Они уменьшают энергетический барьер образования газовой фазы и, следовательно, предел прочности жидкости. Этими неоднородностями могут быть малые частицы пыли, растворенные или попавшие в неоднородности стенки сосуда пузырьки газа. Для экспериментальной проверки теоретических оценок предела прочности жидкости производятся исследования на сверхмалых каплях, так, чтобы вероятность найти каплю без неоднородностей, была выше 50 процентов (Apfel и Holland, 1991). Известно также, что порог амплитуды звуковой волны, при котором возникает кавитация, (кавитационный предел) зависит от частоты ультразвука (Gaertner, 1954, Kuttruf, 1991), вследствие этого энергиянеобходимая для достижения одних и тех же результатов при воздействии на биологические системы меняется с частотой воздействия (Sundaram, и др. 2003).

Для того, чтобы искусственно снизить кавитационный предел в жидкости, в нее добавляются стабилизированные газовые пузырьки. Благодаря модификации поверхности раздела газ-жидкость с помощью специальных молекул, а также использования плохо растворимых в воде газов, удается увеличить время жизни пузырька. Так коммерчески доступные пузырьки Optison размером 1-3 микрона (резонансный размер для частот ультразвука 0.53 МГц) стабильны при физиологических условиях в течение 10 минут. Воздушные пузырыси того же размера нестабильны. В зависимости от давления и температуры окружающей среды они растворяются или увеличиваются в размерах за счет ректификационной диффузии за доли секунды, поэтому вероятность их обнаружения при нормальных условиях чрезвычайно мала. Поведение пузырька в ультразвуковом поле является чрезвычайно сложным, помимо основной гармоники и кратных ей, в спектре колебаний пузырька наблюдаются такие субгармоники как 1/2 v, 3/2v, 1/3 v, 1/4 V при приближении амплитуды звукового возбуждения к критической (Leighton, и др. 1991). Стабилизированные пузырыси под обобщенным названием контрастных агентов производятся фармацевтическими компаниями и используются в диагностических приложениях. Повышенное отражение ультразвука от поверхности раздела газ-жидкость в областях, содержащих контрастный агент улучшает контрастность получаемого с помощью УЗИ изображения (Goldberg, и др. 1994), дополнительное улучшение контрастности можно получить, если вести детектирование сигнала на частоте равной одной второй от той, на которой идет облучение (Shi, и др. 1999). Если же существенно поднятьамплитуду ультразвуковой волны и увеличить длительность воздействия, то нелинейные осцилляции пузырыса приводят к его катастрофическому схлопыванию - инерционной кавитации. При этом в широком диапазоне амплитуды давления ультразвука кавитация в физиологических жидкостях происходит только там, где содержатся контрастные агенты (Apfel и Holland, 1991) Традиционно газовый состав коммерчески доступных пузырьков был воздушным (Albunex; Mallinckrodt), последнее время используются иные газы, такие как перфлюорокарбоны, например, октафлюоропропан C3F8 (Optison, Mallinckrodt). Кавитационные агенты, как правило, имеют белковую оболочку (например, взаимосвязанные молекулы сывороточного альбумина), в тоже время производятся коммерчески пузырьки, стабилизированные фосфолипидным монослоем (SonoVue, Вгассо, Италия) или синтетической полимерной оболочкой (Acuscphere, США).

Кавитацию принято классифицировать как инерционную и стационарную (Miller, и др. 1996). При стационарной кавитации, наблюдаемой при низких амплитудах давления, пузырек растет за счет ректификационной диффузии, или сжимается за счет растворения газа вплоть до резонансного размера, а затем осцилирует неограниченно долго. Инерционная кавитация происходит при больших амплитудах давлениях. Она характеризуется быстрым ростом пузырька в фазе отрицательного давления, а затем коллапсом рэлееевского типа, когда инерция сжимающейся жидкости превалирует над давлением газа, препятствующим сжатию. Динамика пузырька в этой фазе описывается решением задачи о схлопывании сферической полости заполненной вакуумом в жидкости (Besant, 1859, Rayleigh, 1917, Ландау и1 в наших экспериментах с частотой 500 кГц биологические эффекты кавитации в жидкостях без кавитационных агентов была по крайней мере на три порядка слабее, чем в их присутствииЛифшиц, 1988). В решении задачи Рэлея скорость стенок пузырька неограниченно растет при сжатии. Для реального пузырька это описание применимо только до момента, когда скорость стенок пузырька достигает скорости звука в жидкости. Экспериментальное и теоретическое исследование кавитационного схлопывания показывает, что локальная температура в момент сжатия достигает 1000-5000 К, а давление в полости - тысяч атмосфер. Коллапс пузырька при схлопывании приводит к возникновению в жидкости локальных потоков с высокими скоростями течения, сдвиговых напряжений, ударных волн. При асимметричном коллапсе происходит генерация микроструй (Apfel, 1997). Среди физических явлений сопровождающих кавитацию необходимо упомянуть сонолюминесценцию, то есть генерацию фотонов видимого света. Механизм люминесценции до сих пор не полностью изучен. Эффекты кавитации могут вызывать повреждение материалов, например, разрушение лопаток турбин, быстро вращающихся в воде. В биологических системах повреждения наносимые мембранам клеток могут быть как необратимыми (Miller и Thomas, 1996), так и обратимыми (Fechheimer, и др. 1987). Оба явления могут быть с пользой использованы на практике. Целью нашего исследования являются обратимые воздействия.

Применения ультразвука для облегчения транспорта лекарственных веществВозможность облегченного транспорта макромолекул в биологических системах, обработанных ультразвуком, была в последнее время подтверждена в многочисленных исследованиях. Saad и Hahn (1989) показали, что облучение ультразвуком 2 МГц увеличивает токсичность адриамицина и амфотерицина в СНО (Chinese hamster ovary) клетках. Было также показано, что воздействиелитотрипсера способно вызывать эффективное увеличение транспорта лекарств в раковые опухоли ((Prat, и др. 1994)). Mitragotri и др. (1995) продемонстрировал возможность транспорта терапевтических доз инсулина, у-интерферона и эритропоэтина через эпителий кожи человека при использовании 20 кГц ультразвука.

Общей механизм облегчения транспорта во всех этих явлениях - порация барьеров (клеточных мембран или поверхностного слоя кожи) вследствие инерционной кавитации (Bao, и др. 1997). Ранее высказывалось предположение, что свободные радикалы, выделяющиеся при кавитации, могут быть ответственны за наблюдаемые разрушения клеточных мембран, однако, последнее время было показано, что воздействие свободных радикалов незначительно (Bamett, 1998).

Разрушение мембран, вследствие образования ударной взрывной волныБыло показано, что ударные волны с амплитудой 10-1000 атмосфер способны вызывать разрушение клеточных мембран (Delius, 1997, 2002, Kodama, и др. 2000). Критические значения амплитуд давления в ударных волнах, по-видимому, зависят в основном от конкретного вида экспериментальной системы (Kodama, и др. 2002, Raeman, и др. 1994, Sonden, и др. 2000). В частности было показано, что одиночной ударной волны с амплитудой всего в 3 атмосферы достаточно, чтобы вызвать обратимое увеличение проницаемости мембран, не вызывая летальных для клеток последствий (Kodama, и др. 2000).

Также экспериментально установлено, что при кавитационном коллапсе в ультразвуковом поле происходит генерация ударных волн с амплитудойдавления в эпицентре до 40-60 тысяч атмосфер (Pecha и Gompf, 2000). Существуют теоретические и экспериментальные способы определения давления внутри коллапсирующего пузырька и амплитуды ударной волны, возникающей при коллапсе. В теоретических моделях адиабатический коллапс пузырька приводит к возникновению давлений свыше 10000 атмосфер (Vichare, и др. 2000). Однако, провести прямое экспериментальное подтверждение этих предсказаний пока не удалось. В частности это связано с тем, что высокие давления возникают в исключительно узком пространственном и временном интервале (Pecha и Gompf, 2000). Тем не менее, вся совокупность прямых и косвенных измерений процессов в коллапсирующих пузырьках позволяет грубо максимальное давление от 1 000 до 73 000 атмосфер ((Matula, 1999, Pecha и Gompf, 2000, Wang, и др. 1999). Эти всплески давления сопровождаются ударными волнами, распространяющимися сферически симметрично вокруг центра коллапса. Точный механизм воздействия ударной волны на клетки не известен, однако, попытки прояснить этот вопрос продолжаются. В течение последних лет был опубликован теоретический анализ разрушения клеток в ударной волне (Lokhandwalla, и др. 2001b). Авторы этой статьи показывают, что пространственные и временные градиенты давления вызывают повреждения клеточной мембраны. Роль градиентов давления в разрушении мембран подчеркивается и в других работах (Doukas, и др. 1995). Howard и Sturtevant утверждают, что ударные волны вызывают деформацию клеток. Амплитуда деформации пропорциональна времени действия и амплитуде ударной волны (Howard и Sturtevant, 1997). Другая точка зрения, которую отстаивает Kodama и коллеги, состоит в том, что ударная волна приводит к увеличениюпроницаемости мембраны за счет вызова относительного смещения между клеточной мембраной и окружающей ее жидкостью (Kodama, и др. 2000).

Разрушение мембраны, вызванное осцилляциями размера кавитационного пузырькаСдвиговые напряжения, возникающие в жидкости при кавитации, также могут вызывать увеличение проницаемости клеточных мембран (Wu, 2002, Wu, и др. 2002). В статье Lokhandwalla высказано предположение, что радиальное движение стенки пузырька может вызывать деформацию клеток и, как следствие, растяжение клеточных мембран (Lokhandwalla, и др. 2001b). Они приводят некоторые оценки. Так в фазе низкого давления, пузырьки растут от их начального радиуса Ro до радиуса Rmax за время меньшее, чем половина периода акустических колебаний, а затем резко сжимаются в фазе положительного давления. Wu и Roberts оценили, что осциллирующие газовые полости в жидкости облучаемой ультразвуком 26.5 кГц растут до радиуса порядка 37 микрометров приблизительно за 16 микросекунд (от начального радиуса 5 микрон) и схлопываются за время порядка 3 микросекунд (Wu и Roberts, 1993). Таким образом средняя скорость стенки пузырька составляет 2 м/с при расширении и 12 м/с при сжатии. Деформация мембран, вызываемая вклетках в непосредственной близости от осциллирующего пузырька согласно модели ЬокЪапёшаИа составляет■ААгиьЯ2ь А г3где иь -скорость стенки пузырька, Яь -радиус пузырька, г - расстояние клетки от пузырька и х — время расширения/сжатия соответственно (ЬокЬапсЬуаНа, и др. 2001а). Оценки, приведенные Бипёагат и коллегами, показывают, что на расстоянии меньше чем Г| 60-130 микрометров осцилляции стенки пузырька вызывают необратимые повреждения клеточных мембран, обратимые повреждения возникают при расстояниях от клеток до коллапсирующих пузырьков 107-110% от п.

Поскольку при акте кавитации клетка может погибнуть, получить обратимые повреждения или оказать незатронутой, то для теоретического описания применяют вероятностные модели. Такой вероятностный анализ был произведен для описания смертности и транспорта кальцеина при ультразвуковом облучении на частотах от 20 до 93 кГц линии ЗТЗ клеток мышей и показал статистически достоверное сходство теории и эксперимента (Зипёагат, и др. 2003).

ЭлектропорацияОбратимое повышение проницаемости клеточных мембран в суспензиях клеток может бьггь достигнуто при приложениях к ним коротких (несколько миллисекунд) электрических импульсов высокого напряжения ( 500-900 В/см). Было показано, что повышение проницаемости достигается, в первую очередь, за счет электропорации липидного бислоя, что, в свою очередь, приводит к созданию новых транспортных путей через клеточные мембраны. Это явлениеинтенсивно изучалось в последние 30 лет (Abidor, и др. 1978, Golzio, и др. 2002, Kinosita и Tsong, 1977, Neumann и Rosenheck, 1972, Rols, и др. 1994, Tsong, 1991, Weaver, 1993). В настоящее время электропорация широко используется для доставки препаратов в клетки и липосомы, а также для трансфекции клеток и интеграции белков в клеточные мембраны (Neumann и др, 1979; Chang и др,1992). Электропорация также используется для противоопухолевой терапии (Mir и др., 1991; Orlowski и Mir, 1993), а также для трансфекции in vivo (Titomirov и др., 1991). Предполагается, что рост транспорта макромолекул при электропорации связан с образованием пор, созданных электрическим полем. Электрическое поле не только порождает новые транспортные пути, но и создает движущую силу для перемещения заряженных макромолекул (Klenchin, и др. 1991, Sukharev, и др. 1992, Xie и Tsong, 1990).

Использование слабых электрических полей для транспорта лекарственных веществ через кожу (ионтофорез) является хорошо известным методом (Delgado-Charro и Guy, 1994). Увеличение транспорта лекарственных веществ в этом случае вызвано тем, что миграция заряженных молекул в электрическом поле является гораздо более эффективной, чем пассивная диффузия. В диапазоне слабых электрических напряжений (U < 1 В) транспорт линейно зависит от напряжения. Следовательно, нет никаких оснований предполагать, что ионтофорез создает новые транспортные пути (Dinh, и др.

1993). Прямые измерения (Cullander и Guy, 1991, Scott, и др. 1993) показали, что основные пути транспорта при ионтофорезе пролегают через потовые железы и волосяные фолликулы кожи. Ряд авторов признает возможность ионтофоретического транспорта через липидно-корнеоцитный слой Stratum сотеит (Grimnes, 1983, Monteiro-Riviere, и др. 1994). В описанномэксперименте электрическое напряжение 1 вольта) недостаточно велико для электропорации липидных мультислоев рогового слоя, поэтому оно может выступать только в роли движущей силы. Однако, ситуация радикально меняется при росте прикладываемых напряжений. При приложении к коже человека напряжения в несколько вольт его вольтамперная характеристика становится нелинейной (Kasting и Bowman, 1990а, Kasting и Bowman, 1990b). При этих условиях электрический ток выходит на стационар со значительной задержкой по времени, и поведение системы приобретает необратимые черты. Это поведение никак не может быть объяснено на языке линейных уравнений электродиффузии. Теории поверхностно лимитированных стадий транспорта или электропорации возникли для объяснения возникающей нелинейности (Kasting и Bowman, 1990а, Kasting и Bowman, 1990b). Однако, только необратимая электропорация может быть причиной необратимых изменений системы. Также, при объяснении не омического поведения в данных работах не делается никаких предположений о возможных объектах электропорации. Наиболее вероятно, что при напряжении 1 В, только несколько последовательных слоев клеток могут быть порированы. Учитывая, что кожа практически полностью покрыта слоем ороговевших клеток, наиболее вероятно, что порация затрагивает в этом случае только волосяные фолликулы и/или сальные железы. Вероятность электропорации stratum сотеит при этих напряжениях пренебрежимо мала. SC содержит около 100 липидных бислоев. При напряжении на коже в несколько вольт разность электрических потенциалов на отдельном бислое составляет всего —10-100 милливольт. Эта величина недостаточна для пробоя. Термодинамическая теория возникновения пор в липидном бислое под действием электрического поля предложена вработе Глазера с соавторами (1988). Согласно этой теории возникновение пор при электрических полях даже вдвое ниже пробойного напряжения (обычно 200 милливольт на бислой) чрезвычайно мала.

При повышении напряжения на коже до 50 В ситуация разительно меняется. Как было показано Prausnitz и коллегами (1993а, 1993с), после обработки кожи человека in vitro несколькими миллисекундными импульсами высокого напряжения, поток кальцеина через кожу увеличился на несколько порядков величины. Похожие результаты были получены для транспорта метапролола через кожу крыс in vitro (Vanbever, и др. 1994). Более того, даже одного импульса высокого напряжения достаточно для существенного усиления последующего ионтофоретического транспорта (Bommannan, и др. 1994). Мы полагаем, что эти результаты обусловлены созданием новых транспортных путей через SC человека. При данных напряжениях разность потенциалов на каждом бислое более чем достаточна для электропорации. Другим возможным объяснением было бы активация существующих ионтофоретических путей через волосяные фолликулы и сальные железы. Однако, эта гипотеза не способна объяснить наблюдаемые явления, поскольку выстилающие ионтофоретические пути бислои должны испытывать электропорацию при существенно более низких напряжениях (Benz, и др. 1979, Kinosita, и др. 1988).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Зарницын, Владимир Григорьевич

Выводы

В данной работе показано, что частота облучения, плотность звуковой энергии, плотность клеток и температура являются факторами, определяющими эффективность трансфекции клеток рака простаты человека (Би 145) при ультразвуковом воздействии. В оптимальных условиях приложение ультразвука вызывает 100 кратный рост трансфекции. Эти условия были достигнуты при облучении суспензии клеток с концентрацией 107 на мл, ультразвуком частотой 500 кГц с потоком звуковой энергии 10-30 Дж/см2 в присутствии кавитационных стабилизированных пузырьков при температуре 37°С.

Измерение транспорта ДНК при ультразвуковой обработке показало, что в условиях, соответствующих максимальной трансфекции, ДНК удается обнаружить в 21% облученных клеток, при этом среднее количество молекул ДНК, доставленных в клетку, составляет 800 молекул при концентрации ДНК в растворе 20 цг/мл. Сопоставление данных по трансфекции и транспорту ДНК показало, что трансфекция наблюдается только в 20 процентах клеток, в которые ДНК была доставлена при ультразвуковом облучении.

•

Предложено математическое описание пассивной диффузии макромолекул в клетки, получившие повреждения поверхности. Данный подход позволяет рассчитать характеристики повреждения мембраны, используя данные по кинетике диффузии макромолекул в клетки. Обработка экспериментальных данных с помощью предложенного подхода показала, что при ультразвуковом облучении на поверхности клеток образуется зона повреждения размером порядка 1 микрона, залечивающаяся с характерным временем 20 секунд. Анализ проницаемости поврежденных клеток для пяти макромолекул разного размера показал, что подавляющая часть открытой поверхности закрыта для транспорта молекул радиусом более 15 нм.

Построена модель транспорта макромолекул через кожу человека при электрообработке импульсами высокого напряжения. Модель позволила объяснить экспериментально наблюдаемые явления, исходя из гипотезы об электропорации липидной фазы рогового слоя кожи. Результаты моделирования показывают, что новые транспортные пути, образованные в роговом слое кожи, по всей видимости, проходят через корнеоциты и электропоры в липидных мультислоях.

6. Заключение

Экспериментальное исследование трансфекции ОШ45 клеток (линия рака простаты человека) показало, что путем выбора оптимальных условий трансфекция "свободной" плазмидной ДНК может быть увеличена практически в 100 раз. Увеличение трансфекции наблюдалось как для ультразвука при частоте 24 так и 500 кГц, хотя более высокая частота обработки приводила к более успешной трансфекции. Поток звуковой энергии, который, как было показано в данной работе, является хорошим индикатором силы воздействия ультразвука, коррелирующим как с трансфекцией, так и выживаемостью клеток, приводил к оптимальной трансфекции при значениях 10 — 30 Дж/см2. При этих условиях достигался баланс между уменьшающейся выживаемостью клеток и увеличивающейся порацией клеток, и, следовательно, улучшенному транспорту ДНК при больших энергиях облучения. Мы также обнаружили, что концентрация клеток в суспензии серьезно влияет на эффективность п трансфекции, а лучшие результаты достигаются при концентрации 10 клеток/мл. Полученные данные также свидетельствуют о том, что повышение температуры с 21 до 37°С существенно повышает трансфекцию, но не оказывает заметного влияния на выживаемость клеток.

Несмотря на то, что при высоких потоках звуковой энергии через суспензию наблюдалось повреждение ДНК, плазмиды ДНК не были повреждены в диапазоне параметров оптимальном для трансфекции. Это, в свою очередь, свидетельствует о том, что полезное воздействие ультразвука на клетки может бьггь достигнуто с использованием акустических энергий ниже порога повреждения молекул ДНК.

Сходство экспериментальных результатов, полученных для двух различных плазмид, дает основание считать, что полученные результаты не являются специфичными только для одного вида плазмидной ДНК, а могут быть распространены на более широкий класс молекул, сходного размера.

Оптимальные условия определенные нами оказались следующими, частота ультразвука 500-кГц, облучение в присутствии кавитационного агента Орйвоп, поток звуковой энергии 10-30 Дж/см2 приложенный к суспензии клеток с концентрацией 10 клеток/мл при температуре 37 °С. Есть все основания полагать, что не только замеченные закономерности, но и определенный нами . диапазон оптимальных параметров применения ультразвука может бьггь использован в оптимизации его применения для трансфекции клеток, тканей, а также клинического применения.

Наши измерения показали, что трансфекция была достигнута только в 25 процентах клеток, в которые ДНК была доставлена с помощью ультразвука. Более пристальное изучение взаимосвязи между доставкой ДНК в клетки и трансфекции показало, что эффективное количество ДНК, необходимое для трансфекции зависит от среднего уровня доставки и ее способа. Так электропорация способна доставить существенно большее количество ДНК, чем ультразвук, однако, ультразвук позволяет достигнуть сравнимой и даже большей трансфекции. Данное явление может являться следствием разнообразных факторов, таких как а) действие внутриклеточной системы инактивации сторонней ДНК, действующей тем эффективнее, чем больше ДНК попадает в клетку; б) возможном существенном повреждении ДНК при электропорации; в) меньшей эффективности электропорации по сравнению с ультразвуком в облегчении транспорта ДНК к клеточному ядру. Эти и другие возможные гипотезы подлежат дальнейшему детальному исследованию. Объяснение механизмов столь разного реагирования клеток на одинаковое количество доставленной в них ДНК может объяснить довольно низкую эффективность генной терапии с помощью суспензий чистой ДНК и указать способы повышения эффективности.

В данной работе было произведено исследование размера и кинетики залечивания повреждений клеточных мембран при ультразвуковом облучении. Для определения степени через определенное время после окончания обработки повреждения мембраны к суспензии клеток добавлялись флюоресцентные маркеры. Измерение транспорта макромолекул из внешней среды в цитоплазму клеток позволило оценить степень проницаемости клеточной оболочки в зависимости от размера тестовой молекулы и времени, прошедшего после облучения. В данной работе предложено математическое описание пассивной диффузии макромолекул в клетки, получившие повреждения поверхности. Данный подход позволяет рассчитать характеристики повреждения мембраны, используя данные о скорости диффузии макромолекул в клетки. Обработка экспериментальных данных с помощью предложенного подхода показала, что при ультразвуковом облучении на поверхности клеток образуется зона повреждения размером порядка 1 микрона, залечивающаяся с характерным временем 20 секунд. Анализ проницаемости поврежденных клеток для пяти макромолекул разного размера показал, что подавляющая часть открытой поверхности недоступна для транспорта молекул радиусом более 15 нм.

В данной работе была разработана модель транспорта молекул кальцеина через роговой слой кожи, подвергшейся обработки импульсами электрического напряжения. Модель транспорта макромолекул через 51га1шп согпешп при электропорации кожи человека позволила объяснить наблюдаемые явления нелинейного роста транспорта кальцеина. При построении модели были предложены два возможных пути транспорта (прямой путь через корнеоциты и извилистый путь через липидную фазу). Из сравнения расчетных значений с экспериментально наблюдаемыми следует, что прямой путь является более вероятным. Прямой путь может проходит в обход корнеоцитов или через корнеоциты в зонах, повышенной проводимости. По нашим оценкам доля гидрофильная область, участвующая в транспорте, составляет примерно 1% объема SC.

Разработанная' модель позволила показать, что транспорт макромолекул через кожу при импульсной электрообработке объясняется электропорацией липидно-корнеоцитного матрикса. После публикации данной модели был получен ряд интересных результатов, которые подтвердили основные положения и выводы модели. Так измерения электрического тока через кожу при умеренных напряжениях (до 30 В) показали возможность электропорации макропор кожных придатков, а при больших напряжениях подтверждают нашу гипотезой об электропорации липидно-корнеоцитного матрикса (Chizmadzhev и др., 1998). Экспериментальные наблюдения также показали, что при приложении импульсов высокого напряжения на слое SC проводимость растет не гомогенно, а в случайно расположенных "зонах повышенной проводимости". Было показано, что появление этих зон вызвано электропорацией, а также предложены стохастические и детерминистические модели их появления (Weaver и др., 1999). В других экспериментах было показано, что при приложении к коже электрических импульсов длительностью 100 миллисекунд напряжением 300 В джоулево тепло, выделяющиеся при прохождении тока через электропоры, вызывает фазовый переход в липидной фазе, вследствие чего проводимости кожи необратимо растет (Pliquett и Gusbeth, 2000).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Зарницын, Владимир Григорьевич, Долгопрудный

1. Abidor 1.G., et al. Electrical breakdown of lipid bilayer membranes. Dokl Akad Nauk SSSR 1978; 240: 733-6

2. Aium. Mechanical bioeffects from diagnostic ultrasound: Aium consensus statements. Section 7 discussion of the mechanical index and other exposure parameters. American institute of ultrasound in medicine. 2000.

3. Apfel R.E. Sonic effervescence: A tutorial on acoustic cavitation. 1997.

4. Apfel R.E. and Holland C.K. Gauging the likelihood of cavitation from short-pulse, low-duty cycle diagnostic ultrasound. 1991.

5. Bao S., Thrall B.D. and Miller D.L. Transfection of a reporter plasmid into cultured cells by sonoporation in vitro. Ultrasound Med Biol 1997; 23: 953-9

6. Barnett S. Nonthermal issues: Cavitation its nature, detection and measurement. Ultrasound Med Biol 1998; 24: SI 1-S21

7. Benz R., Beckers F. and Zimmermann U. Reversible electrical breakdown of lipid bilayer membranes: A charge-pulse relaxation study. J Membr Biol 1979; 48: 181-204

8. Besant. Hydrostatics and hydrodynamics. 1859.

9. Bjorno L. A comparison between measured pressure waves in water arising from electrical discharges and detonation of small amounts of chemical explosives. Trans. ASME J. Engineering for Industry 1970; 11: 29-34

10. Bjorno L. and Jensen F.B. Some elements of nonlinear acoustics. 1973.

11. Bohrer M.P. Difiusional boundary layer resistance for membrane transport. Ind. Eng. Chem. Fundam 1983; 22: 72-78

12. Bommannan D.B., Tamada J., Leung L. and Potts R.O. Effect of electroporation on transdermal iontophoretic delivery of luteinizing-hormone-releasing hormone (lhrh) in-vitro. Pharm. Res. 1994; 11:1809-1814

13. Burd G. A strategic insight into the global drug delivery industry. In Innovation in drug delivery systems. London:SMI Publishing Inc., 2000

14. Canatella P.J., Karr J.F., Petros J.A. and Prausnitz M.R. Quantitative study of electroporation-mediated molecular uptake and cell viability. Biophys J 2001; 80:M755.64

15. Canatella P. J. and Prausnitz M.R. Prediction and optimization of gene transfection and drug delivery by electroporation. Gene Ther 2001; 8: 1464-9

16. Carstensen E.L., et al. Lysis of erythrocytes by exposure to cw ultrasound. 1993.

17. Chang D.C. and Reese T.S. Changes in membrane structure induced by electroporation as revealed by rapid-freezing electron microscopy. 1990.

18. Chapelon J. Y., et al. In vivo effects of high-intensity ultrasound on prostatic adenocarcinoma dunning r3327. Cancer Res 1992; 52: 6353-7

19. Chizmadzhev Y.A., et al. Electrical properties of skin at moderate voltages: Contribution of appendageal macropores. Biophys J 1998; 74: 843-56

20. Ciaravino V., Miller M.W. and Kaufman G.E. The effect of 1 mhz ultrasound onthe proliferation of synchronized chínese hamster v-79 cells. 1981.

21. Cleveland R.O., Mcateer J.A., Andreoli S.P. and Crum L.A. The effect of polypropylene vials on lithotripter shock waves. Ultrasound Med Biol 1997; 23: 93952

22. Coleman A. J., Saunders J.E., Crum L.A. and Dyson M. Acoustic cavitation generated by an extracorporeal Shockwave lithotripter. 1987.-425. Cullander C. What are the pathways of iotophoretic flow through mammalian skin? Adv Drug Deliv Rev 1992; 9:19-135

23. Cullander C. and Guy R.H. Sites of iontophoretic current flow into the skin -identification and characterization with the vibrating probe electrode. J. Invest. Dermatol. 1991; 97: 55-64V

24. Deen W.M. Hindered transport of large molecules in liquid-filled pores. Aiche J. 1987; 33:1409-1425

25. Delgado-Charro M.B. and Guy RH. Characterization of convective solvent flow during iontophoresis. Pharm Res 1994; 11: 929-35

26. Delius M. Minimal static excess pressure minimises the effect of extracorporeal shock waves on cells and reduces it on gallstones. 1997.

27. Denuzzio J.D. and Berner B. Electrochemical and iontophoretic studies of human skin. J. Control. Release 1990; 11: 105-112

28. Dinh S.M., Luo C.W. and Berner B. Upper and lower limits of human skin electrical-resistance in iontophoresis. Aiche J. 1993; 39: 2011-2018

29. Doukas A.G., et al. Physical factors involved in stress-wave-induced cell injury: The effect of stress gradient. Ultrasound Med Biol 1995; 21: 961-7

30. Edelberg R. Electrical properties of skin. 1971.

31. Eggers J., et al. Effect of ultrasound on thrombolysis of middle cerebral artery occlusion. Ann Neurol 2003; 53: 797-800

32. Elias P.M. Epidermal lipids, barrier function, and desquamation. J Invest Dermatol 1983; 80 Suppl: 44s-49s

33. Elias P.M., Mcnutt N.S. and Friend D.S. Membrane alterations during cornification of mammalian squamous epithelia: A freeze-fracture, tracer, and thin-section study. Anat Rec 1977; 189: 577-94

34. Endoh M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Mol Ther 2002; 5: 501-8

35. Escriou V., et al. Critical assessment of the nuclear import of plasmid during cationic lipid-mediated gene transfer. J Gene Med 2001; 3: 179-87

36. Escriou V., Carriere M., Scherman D. and Wils P. Nls bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Adv Drug Deliv Rev 2003; 55: 295-306

37. Evans E.A. Constitutive relation for red cell membrane. Correction. Biophys J 1976; 16: 597-600

38. Fair W.R. Extracorporeal treatment of kidney stone using the shock wave lithotripser. Trans Assoc Life Insur Med Dir Am 1986; 69: 113-7

39. Fechheimer M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proc Natl Acad Sei U S A 1987; 84: 8463-7

40. Fregeau C.J. and Bleackley R.C. Factors influencing transient expression in cytotoxic t cells following deae dextran-mediated gene transfer. Somat Cell Mol Genet 1991; 17: 239-57

41. Frenkel P.A., et al. DNA-loaded albumin microbubbles enhance ultrasoundmediated transfection in vitro. Ultrasound Med Biol 2002; 28: 817-22

42. Gaertner W. Frequency dependence of ultrasonic cavitation. J Acoust Soc Am 1954;84:1863-1876 -46. Glaser R.W., et al. Reversible electrical breakdown of lipid bilayers - formation and evolution of pores. Biochimica Et Biophysica Acta 1988; 940: 275-287

43. Goldberg B.B., Liu J.B. and Forsberg F. Ultrasound contrast agents: A review. Ultrasound Med Biol 1994; 20: 319-33

44. Golzio M., Teissie J. and Rols M.P. Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field. Biochim Biophys Acta 2002; 1563:23-8

45. Greenleaf W.J., et al. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound Med Biol 1998; 24: 587-95

46. Grimnes S. Dielectric breakdown of human skin in vivo. Med Biol Eng Comput 1983;21:379-81 .

47. Gunzburg W.H. and Salmons B. Virus vector design in gene therapy. Mol Med Today 1995; 1: 410-7

48. Guzman H.R., Nguyen D.X., Khan S. and Prausnitz M.R. Ultrasound-mediated disruption of cell membranes. I. Quantification of molecular uptake and cell viability. J Acoust Soc Am 2001; 110: 588-96

49. Guzman H.R., Nguyen D.X., Mcnamara A. J. and Prausnitz M.R. Equilibrium loading of cells with macromolecules by ultrasound: Effects of molecular size and acoustic energy. J Pharm Sci 2002; 91:1693-701

50. Guzman H.R. and Prausnitz M.R. Bioeffects caused by changes in acoustic cavitation bubble density and cell concentration: A unified explanation based on cell-to-bubble ratio and blast radius. 2003.

51. Holbrook K.A. and Odland G.F. Regional differences in the thickness (cell layers) of the human stratum corneum: An ultrastructural analysis. J. Invest. Dermatol. 1974; 62: 415-422

52. Howard D. and Sturtevant B. In vitro study of the mechanical effects of shockwave lithotripsy. Ultrasound in Medicine and Biology 1997; 23: 1107-1122

53. Husseini G.A., et al. DNA damage induced by micellar-delivered doxorubicin and ultrasound: Comet assay study. Cancer Lett 2000; 154: 211-6

54. Kao H.P., Abney J.R. and Verkman A.S. Determinants of the translational mobility of a small solute in cell cytoplasm. J Cell Biol 1993; 120:175-84

55. Kasting G.B. and Bowman L.A. Dc electrical-properties of frozen, excised human skin. Pharm. Res. 1990a; 7: 134-143

56. Kasting G.B. and Bowman L.A. Electrical analysis of fresh, excised human skin -a comparison with frozen skin. Pharm. Res. 1990b; 7: 1141-1146

57. Kay M.A., Glorioso J.C. and Naldini L. Viral vectors for gene therapy: The art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nat. Med. 2001; 7: 33-40

58. Kelly W.J. Perspectives on plasmid-based gene therapy: Challenges for the product and the process. Biotechnol Appl Biochem 2003; 37: 219-23

59. Keminer O. and Peters R. Permeability of single nuclear pores. Biophys J 1999; 77: 217-28

60. Keyhani K., et al. Intracellular drug delivery using low-frequency ultrasound: Quantification of molecular uptake and cell viability. Pharm Res 2001; 18: 1514-20

61. Kim H.J., et al. Ultrasound-mediated transfection of mammalian cells. Hum Gene Ther 1996; 7: 1339-46

62. Kinosita K., et al. Electroporation of cell-membrane visualized under a pulsedlaser fluorescence microscope. Biophys. J. 1988; 53: 1015-1019

63. Kinosita K., Jr. and Tsong T.Y. Formation and resealing of pores of controlled sizes in human erythrocyte membrane. Nature 1977; 268: 438-41

64. Klenchin V.A., et al. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys. J. 1991; 60: 804-811

65. Kodama T., Doukas A.G. and Hamblin M.R. Shock wave-mediated molecular delivery into cells. Biochim Biophys Acta 2002; 1542:186-94

66. Kodama T., Hamblin M.R. and Doukas A.G. Cytoplasmic molecular delivery with shock waves: Importance of impulse. Biophys J 2000; 79: 1821-32

67. Kuttruf H. Ultrasonics: Fundamentals & applications. London:Elsevier Applied Science, 1991

68. Lakshminarayanaiah N. Equations of membrane biophysics. New York:Academic Press, 1984

69. Langer R. New methods of drug delivery. Science 1990; 249: 1527-33

70. Lee S., et al. Alteration of cell membrane by stress waves in vitro. Ultrasound Med Biol 1996; 22:1285-93

71. Leeuw B., Hadfield G., Saunders E. and Findlay G. Strategies and practices of pharmaceutical companies: The result of international survey. In The application of drug delivery systems: Current practices and strategies. Epsom:CMR International, 2000

72. Leighton T.G. The acoustic bubble. 1994.

73. Leighton T.G., Lingard R.J., Walton A.J. and Field J.E. Acoustic bubble sizing by combination of subharmonic emissions with imaging frequency. Ultrasonics 1991; 29: 319-323

74. Lin T.Y., et al. Nuclear transport by laser-induced pressure transients. Pharm Res 2003; 20: 879-83

75. Liu J., Lewis T.N. and Prausnitz M.R. Non-invasive assessment and control of ultrasound-mediated membrane permeabilization. Pharm Res 1998; 15: 918-924

76. Lokhandwalla M., Mcateer J.A., Williams J.C., Jr. and Sturtevant B. Mechanical haemolysis in shock wave lithotripsy (swl): Ii. In vitro cell lysis due to shear. Phys Med Biol 2001a; 46:1245-64

77. Lokhandwalla M., Mcateer J.A., Williams J.C., Jr. and Sturtevant B. Mechanical haemolysis in shock wave lithotripsy (swl): Ii. In vitro cell lysis due to shear. 2001b.

78. Luby-Phelps K., Castle P.E., Taylor D.L. and Lanni F. Hindered diffusion of inert tracer particles in the cytoplasm of mouse 3t3 cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1987; 84: 4910-3

79. Lukacs G.L., et al. Size-dependent DNA mobility in cytoplasm and nucleus. J Biol Chem 2000; 275: 1625-9

80. Madison K.C., Swartzendruber D.C., Wertz P.W. and Downing D.T. Presence of intact intercellular lipid lamellae in the upper layers of the stratum-corneum. J. Invest. Dermatol. 1987; 88: 714-718

81. Matula T.J. Inertial cavitation and single-bubble sonoluminescence. Philos T Roy Soc A 1999; 357: 225-249

82. Mcneil P.L., Murphy R.F., Lanni F. and Taylor D.L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. J Cell Biol 1984; 98: 1556-64

83. Michaels A.S., Chandrasekaran S.K. and Shaw J.E. Drug permeation through human skin: Theory and in vitro experimental measurements. Aiche J. 1975; 21: 985996

84. Miller D.L., Bao S., Gies R.A. and Thrall B.D. Ultrasonic enhancement of gene .transfection in murine melanoma tumors. Ultrasound Med Biol 1999; 25: 1425-30

85. Miller D.L. and Thomas R.M. The role of cavitation in the induction of cellular DNA damage by ultrasound and lithotripter shock waves in vitro. Ultrasound Med Biol 1996;22:681-7

86. Miller M.W., Miller D.L. and Brayman A. A. A review of in vitro bioeffects of inertial ultrasonic cavitation from a mechanistic perspective. 1996.

87. Mitragotri S., Blankschtein DI and Langer R. Ultrasound-mediated transdermal protein delivery. Science 1995; 269: 850-3

88. Monteiro-Riviere N.A., Inman A.O. and Riviere J.E. Identification of the pathway of iontophoretic drug-delivery light and ultrastructural studies using mercuric-chloride in pigs. Pharm. Res. 1994; 11: 251-256

89. Moret I., et al. Stability of pei-DNA and dotap-DNA complexes: Effect of alkaline ph, heparin and serum. J Control Release 2001; 76: 169-81

90. Munkonge F.M., et al. Emerging significance of plasmid DNA nuclear import in gene therapy. Adv Drug Deliv Rev 2003; 55: 749-60

91. Netz R.R. and Schick M. Pore formation and rupture in fluid bilayers. Physical Review E 1996; 53:3875-3885

92. Oh S.Y., et al. Effect of current, ionic strength and temperature on the electrical properties of skin. 1993.

93. Paine P.L., Moore L.C. and Horowitz S.B. Nuclear envelope permeability. Nature 1975; 254: 109-14

94. Papadopoulos S., Jürgens K.D. and Gros G. Protein diffusion in living skeletal muscle fibers: Dependence on protein size, fiber type, and contraction. Biophys J 2000; 79: 2084-94

95. Pearson C.E. Handbook of applied mathematics. Van Nostrand Reinhold Company, 1988

96. Pecha R. and Gompf B. Microimplosions: Cavitation collapse and shock wave emission on a nanosecond time scale. Physical Review Letters 2000; 84:1328-1330

97. Poling B.E., Prausnitz J.M. and O'connell J.P. The properties of gases and liquids. 5th ed. New York:McGraw-Hill, 2001

98. Potts RO. and Francoeur M.L. The influence of stratum-corneum morphology on water permeability. J. Invest. Dermatol. 1991; 96: 495-499

99. Potts R.O. and Guy R.H. Predicting skin permeability. Pharm Res 1992; 9: 663-9

100. Potts R.O., Guy R.H. and Francoeur M.L. Routes of ionic permeability through mammalian skin. Solid State Ion. 1992; 53-6: 165-169

101. Prat F., et al. Increased chemocytotoxicity to colon cancer cells by shock wave-induced cavitation. Gastroenterology 1994; 106: 937-44

102. Prausnitz M.R., Bose V.G., Langer R. and Weaver J.C. Electroporation of mammalian skin a mechanism to enhance transdermal drug-delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993a; 90: 10504-10508

103. Prausnitz M.R., et al. A quantitative study of electroporation showing a plateau in net molecular-mransport. Biophys J 1993b; 65:414-422

104. Prausnitz M.R., et al. A quantitative study of electroporation showing a plateau in net molecular-transport. Biophys. J. 1993c; 65:414-422

105. Raeman C.H., et al. Damage to murine kidney and intestine from exposure to the fields of a piezoelectric lithotripter. Ultrasound Med Biol 1994; 20: 589-94113. Rayleigh. 1917.

106. Rols M.P., Delteil C., Serin G. and Teissie J. Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells. Nucleic Acids Res 1994; 22: 540

107. Saad A.H. and Hahn G.M. Ultrasound enhanced drug toxicity on Chinese hamster ovary cells in vitro. 1989.

108. Sambrook J., Russell D.W. and Sambrook J. Molecular cloning: A laboratory manual (3rd edition). Cold Spring Harbor Laboratory, 2001

109. Scheuplein R.J. and Bronaugh R.L. Percutaneous absorption. 1983.

110. Schindelhauer D. and Laner A. Visible transient expression of egfp requires intranuclear injection of large copy numbers. Gene Ther 2002; 9: 727-30

111. Scott E.R., Laplaza A.I., White H.S. and Phipps J.B. Transport of ionic species in skin: Contribution of pores to the overall skin conductance. Pharm Res 1993; 10: 1699-709

112. Seksek O., Biwersi J. and Verkman A.S. Translational diffusion ofmacromolecule-sized solutes in cytoplasm and nucleus. J Cell Biol 1997; 138: 131-42

113. Shi W.T., et al. Subharmonic imaging with microbubble contrast agents: Initial results. Ultrason Imaging 1999; 21: 79-94

114. Sibille A., et al. Extracorporeal ablation of liver tissue by high-intensity focused ultrasound. Oncology 1993; 50: 375-9

115. Sirotyuk M.G. Experimental investigations of ultrasonic cavitation. In High intensity ultrasonic fields. L. D. Rozenburg, L. D. Rozenburg. New York:Plenum Press, 1971

116. Sonden A., et al. Laser-induced shock wave endothelial cell injury. Lasers Surg Med 2000; 26: 364-75

117. Stewart H.F. and Stratmeyer M.E. An overview of ultrasound: Theory, measurement, medical applications, and biological effects. Rockville, Md.

118. Washington, D.C.:U.S. Food and Drug Administration Bureau of Radiological Health, 1982

119. Sukharev S.I., et al. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells -the effect of DNA interaction with electropores. Biophys. J. 1992; 63: 1320-1327

120. Sundaram J., Mellein B.R. and Mitragotri S. An experimental and theoretical analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes. Biophys J 2003; 84: 3087-101

121. Swartzendruber D.C., et al. Molecular-models of the intercellular lipid lamellae in mammalian stratum-corneum. J. Invest. Dermatol. 1989; 92: 251-257

122. Swartzendruber D.C., Wertz P.W., Madison K.C. and Downing D.T. Evidence that the corneocyte has a chemically bound lipid envelope. J. Invest. Dermatol. 1987; 88: 709-713

123. Taniyama Y., et al. Development of safe and efficient novel nonviral gene transfer using ultrasound: Enhancement of transfection efficiency of naked plasmid DNA in skeletal muscle. Gene Ther 2002; 9: 372-80

124. Tata D.B., Dunn F. and Tindall D.J. Selective clinical ultrasound signals mediate differential gene transfer and expression in two human prostate cancer cell lines: Lncap and pc-3. Biochem Biophys Res Commun 1997; 234: 64-7

125. Tezel A., Sens A. and Mitragotri S. Incorporation of lipophilic pathways into the porous pathway model for describing skin permeabilization during low-frequency sonophoresis. J Control Release 2002a; 83: 183-8

126. Tezel A., Sens A. and Mitragotri S. A theoretical analysis of low-frequency sonophoresis: Dependence of transdermal transport pathways on frequency and energy density. Pharm Res 2002b; 19:1841-6

127. Tezel A., Sens-A. and Mitragotri S. Description of transdermal transport of hydrophilic solutes during low-frequency sonophoresis based on a modified porous pathway model. J Pharm Sci 2003; 92: 381 -93

128. Tomlinson E. and Rolland A.P. Controllable gene therapy pharmaceutics of non-viral gene delivery systems (vol 39, pg 357, 1996). J. Control. Release 1996; 42: 297297

129. Tsong T.Y. Electroporation of cell-membranes. Biophys. J. 1991; 60: 297-306

130. Unger E.C., et al. Therapeutic applications of microbubbles. Eur J Radiol 2002; 42:160-8

131. Vaezy S., Martin R. and Crum L. High intensity focused ultrasound: A method of hemostasis. Echocardiography 2001; 18: 309-15

132. Vanbever R., Lecouturier N. and Preat V. Transdermal delivery of metoprolol by electroporation. Pharm Res 1994; 11:1657-62

133. Vichare N.P., et al. Energy analysis in acoustic cavitation. Ind Eng Chem Res 2000; 39: 1480-1486

134. Wang Z.Q., Pecha R., Gompf B. and Eisenmenger W. Single bubble sonoluminiscence: Investigations of the emitted pressure wave with a fiber optic hydrophone. Phys Rev E 1999; 59: 1777-1780

135. Ward M., Wu J. and Chiu J.F. Experimental study of the effects of optison concentration on sonoporation in vitro. Ultrasound Med Biol 2000; 26: 1169-75

136. Wasan E.K., Reimer D.L. and Bally M.B. Plasmid DNA is protected against ultrasonic cavitation-induced damage when complexed to cationic liposomes. J Pharm Sci 1996; 85:427-33

137. Weaver J.C. Electroporation a general phenomenon for manipulating cells and tissues. J. Cell. Biochem. 1993; 51:426-435

138. Weaver J.C., Vaughan T.E. and Chizmadzhev Y. Theory of skin electroporation: Implications of straight-through aqueous pathway segments that connect adjacent corneocytes. J Investig Dermatol Symp Proc 1998; 3: 143-7

139. Woodstock. Ultrasonics. Bristol:Adam Hilger Ltd, Techno House, 1979

140. Wu C.C. and Roberts P.H. Shock-wave propagation in a sonoluminescing gas bubble. Physical Review Letters 1993; 70: 3424-3427

141. Wu J. Theoretical study on shear stress generated by microstreaming surrounding contrast agents attached to living cells. Ultrasound Med Biol 2002; 28:125-9

142. Wu J., Ross J.P. and Chiu J.F. Reparable sonoporation generated by microstreaming. J Acoust Soc Am 2002; 111: 1460-4

143. Xie T.D. and Tsong T.Y. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection .2. Transfection by low-amplitude, low-frequency alternating electric-fields. Biophys. J. 1990; 58: 897-903

144. Young R.F. Cavitation. London:McGraw-Hill, 1989

145. Zelphati O. and Szoka F.C. Liposomes as a carrier for intracellular delivery of antisense oligonucleotides: A real or magic bullet? J. Control. Release 1996; 41: 99119

146. Ландау Л.Д. and Лифшиц E.M. Гидродинамика, т. 6. Москва:Наука, 1988

147. Пугачев B.C. Теория вероятностей и математическая статистика. Москва: ФИЗМАТЛИТ, 2002