Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Негистоновые белки хроматина HMG1, HMG2, HMG17 и линкерный гистон Н1-эффективные носители ДНК в процессе трансфекции

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зайцев, Сергей Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. НЕВИРУСНЫЕ ТРАНС ФЕКЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ: ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ, СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНИМОСТИ В ГЕННОЙ ТЕРАПИИ.

1.1. СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ ГЕНОВ В КЛЕТКИ IN VITRO.

1.1.1. Кальций-фосфатная копреципитация.

1.1.2. Физические методы доставки генов.

1.1.3. Катионные липиды и липосомы.

1.1.4. Лиганд-опосредованная трансфекция.

1.2. ТРАНСФЕКЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БЕЛКОВЫХ

НОСИТЕЛЕЙ.

1.2.1 Современные представления о первом уровне организации хроматина.

1.2.2. HMG-белки. История открытия, структура и свойства.

1.2.3. Линкерный гистон HI - предполагаемый переносчик ДНК в процессе трансфекции. Структурам свойства.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Негистоновые белки хроматина HMG1, HMG2, HMG17 и линкерный гистон Н1-эффективные носители ДНК в процессе трансфекции"

Актуальность проблемы.

Достижения клеточной и молекулярной биологии открыли возможности для направленного изменения генетической основы эукариотических клеток. Они способствовали развитию нового направления исследований, целью которых является создание на основе ДНК лекарственных средств для генной коррекции (терапии) генетических заболеваний человека. Предполагается, что в основе действия таких средств лежит процесс, получивший название трансфекции. Трансфекция - это направленный перенос чужеродной ДНК в определенные типы клеток с ее последующей полноценной экспрессией, а в идеальном случае, и с интеграцией в геном трансфецируемых клеток. В более обобщенном смысле ее следует понимать, как взлом сложившегося в ходе эволюции барьера, запрещающего горизонтальную передачу генетической информации от клетки к клетке. С практической точки зрения чужеродная ДНК должна быть упакована неким гипотетическим носителем в структуры, способные преодолеть плазматическую мембрану клетки, избежать деградации внутри клетки, направить чужеродную ДНК к ядру и обеспечить ее проникновение через ядерную оболочку с последующей полноценной экспрессией. Как известно, на данный момент лишь вирусы в процессе эволюции научились решать эти задачи. И именно поэтому на ранних этапах исследований в области генной терапии явно доминировали вирусные системы доставки ДНК в клетки. По сей день эффективность таких систем оказывается более высокой по сравнению с другими методами. Однако, наряду с высокой эффективностью действия, вирусные системы имеют серьезные недостатки, делающие их применение в ряде случаев совершенно невозможным. Таковыми недостатками являются: отличная от нуля вероятность захвата части ДНК трансфецируемых клеток с последующим переносом ее в другие клетки, ограниченный размер переносимой генетической конструкции (7,5 тысяч нуклеотидных пар для аденовирусных систем), а самое главное - наличие иммунного ответа, который приводит к быстрому уничтожению трансфецированных клеток. Эти обстоятельства привели к тому, что наряду с совершенствованием уже известных вирусных трансфекционных систем стало параллельно развиваться направление по созданию так называемых невирусных систем трансфекции (Schofield and Caskey, 1995).

Представленная работа относится к сравнительно недавно возникшей в этой области ветви исследований, связанной с использованием белков или же полипептидов в качестве компатизующих ДНК агентов, образующих комплексы с ДНК, проникающие в клетку в процессе трансфекции (Bottger et al., 1988, Kaneda et al., 1989).

В качестве компактизующего и переносящего ДНК агента в нашей работе используются белки, так или иначе участвующие в упаковке и структуризации хроматина in vivo. Подобный выбор сделан, исходя из следующих предпосылок. Во-первых, белки хроматина изначально обладают свойством компактизовать ДНК и тем самым могут не только способствовать проникновению чужеродной ДНК в клетку, но и защитить ее от внутриклеточных нуклеаз при транспорте в клетке. Во-вторых, белки хроматина имеют в своем составе последовательность аминокислот, ответственную за ядерную локализацию (Nuclear Localization Signal - NLS), что может способствовать направленному транспорту трансфецируемой ДНК в ядро. Направление это представляется многообещающим, поскольку использование белков хроматина в качестве носителей может позволить не только эффективно компактизовать и транспортировать чужеродную ДНК внутрь клетки, но и доставлять ее в ядро в форме приемлемой для активной транскрипции.

Пели и задачи исследования.

Цель предлагаемой работы состояла в том, чтобы установить, какие из ядерных белков, участвующих в структурной организации хроматина, могут служить эффективными белками-носителями в процессе трансфекции ДНК в клетки млекопитающих. С выделенными активными в трансфекции белками предполагалось провести оптимизацию условий трансфекции и определить механизмы к пути следования в клетке трансфекционных ДНК-белковых комплексов. В качестве источника белков хроматина использовали зобную железу (тимус) теленка - объект, ставший классическим при изучении ядерных белков. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Провести различными способами экстракцию белков из ядер клеток тимуса теленка, расфракционировать гидрофобным растворителем полученные экстракты и оценить их потенциальную трансфекционную активность на системах с репортерным геном in vitro.

2. Применяя различные типы и способы хроматографической очистки, получить активные в трансфекции белки в чистом виде и идентифицировать их.

3. Для каждого белка подобрать оптимальные условия для постановки трансфекции in vitro и провести сравнение активности с уже имеющимися коммерческими аналогами в этой области. Полученные результаты попытаться применить для постановки трансфекции in vivo.

4. Применяя иммуномаркирование, изучить основные стадии процесса трансфекции, а именно: захват ДНК-белковых комплексов клетками, пути внутриклеточного транспорта этих комплексов к ядру, внутриядерную локализацию комплексов.

Научная новизна и научно-практическая ценность работы.

Результатом работы явилось обнаружение трансфекционной активности у четырех белков хроматина. Была доказана ранее предполагавшаяся способность быть носителями ДНК в процессе трансфекции для белков HMG1 и HMG2, принадлежащих к группе белков хроматина с высокой электрофоретической подвижностью (High Mobility Group) (Bottger et al. 1988, 1990, 1996). Впервые была обнаружена трансфекционная активность у негистонового хроматинового белка HMG17 (Zaitsev et al., 1997). Наиболее важным стало открытие у линкерного гистона HI способности быть носителем ДНК при трансфекции (Zaitsev et al., 1997; Bottger et.al., 1998).

Было установлено, что после оптимизации условий при постановке трансфекции in vitro с использованием HI в качестве носителя ДНК, можно добиться уровня трансфекции равного и даже превышающего таковой эффект при использовании общеизвестных и коммерчески доступных трансфекционных агентов (липофектин, липофектамин и т.д.) (Zaitsev et al., 1997; Bottger et.al., 1998). Необходимо также отметить, что перед этими агентами HI имеет огромное преимущество в том, что комплексы образуемые им с переносимой ДНК не являются токсичными для клеток даже в высокой концентрации. Гистон HI, в отличие от большинства липосом-образующих соединений, способен сохранять трансфекционные свойства в присутствии 100% сыворотки, что делает потенциально возможным его применение для трансфекции in vivo.

Нами было показано, что трансфекция с применением HMG1/2, HMG17, а также гистона HI является Са2+-зависимым процессом (Zaitsev et al., 1997; Bottger et al., 1998; Haberland et al., 1999, 2000). В ходе экспериментов по иммуномаркированию трансфекционных комплексов с целью определения их путей следования в клетке было установлено, что в результате действия ионов Са2+ происходит структурная перестройка 9 захваченных клеткой ДНК-белковых комплексов и их высвобождение из эндосом/лизосом. На процесс захвата трансфекционных комплексов клетками ионы Са не влияют. Дальнейшее выявление деталей внутриклеточного транспорта трансфекционных комплексов и механизмов действия ионов Са2+ несомненно поможет оптимизировать уже имеющиеся в наличии невирусные трансфекционные системы и существенно увеличить их эффективность, а также пролить свет на механизм трансфекции в целом, который по единодушному мнению многих авторов до сих пор остается загадкой (Coonrod et а!., 1997).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

НЕВИРУСНЫЕ ТРАНСФЕКЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ: ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ, СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНИМОСТИ В ГЕННОЙ

ТЕРАПИИ.

История данного вопроса восходит к периоду конца шестидесятых, начала семидесятых годов. Благодаря появлению новых идей и принципиально новых методов молекулярной биологии и генной инженерии, стали все чаще высказываться соображения по поводу того, что направленные генетические изменения могут быть одной из наиболее эффективных форм терапии некоторых человеческих заболеваний. Так родилась мечта о генной терапии.

Идейная основа для генной терапии в целом выглядит следующим образом: последовательности чужеродной ДНК (полученные из других организмов или синтезированные искусственно) вносятся в эукариотические клетки с последующей их интеграцией с геномом хозяина. Одним из основных требований является стабильная и регулируемая экспрессия внесенных генов не приводящая к общему дисбалансу метаболизма клетки и организма в целом. В идеальном варианте эта задача может быть выполнена путем замены дефектных нуклеотидных последовательностей ДНК нормальными через гомологическую рекомбинацию. Только в этом случае можно быть полностью уверенным, что внесенные последовательности будут регулироваться и экспрессироваться в точности так, как это происходит в генетически нормальной клетке. Несколько экспериментов, проведенных в данном направлении (преимущественно на стволовых клетках мышиного и эмбриона) увенчались успехом (Frohman and Martin, 1989). Однако в целом этот метод не получил широкого применения.

Вплоть до настоящего времени методы генной терапии основываются на подавлении дефектов путем внедрения в клетки нормальной функциональной копии дефектного гена. За последние 10 лет эффективность методов доставки чужеродной ДНК в эукариотические клетки возросла многократно. В целом все имеющиеся методы можно подразделить на две большие группы. Первая группа характеризуется использованием в качестве носителя вирусов с подавленной патогенностью, в которых подлежащая переносу ДНК внедрена в вирусный геном. Для подобных конструкций используются в основном ретровирусные и аденовирусные системы (Hodgson et al., 1997; Ooboshi et al., 1997). Но несмотря на очень высокую эффективность вирусных систем, они имеют серьезные недостатки, делающие их использование сильно ограниченным. Остаточные вирусные элементы, входящие в эти типы носителей могут быть иммуногенными, цитопатическими и рекомбиногенными, что серьезно мешает их применению в генной терапии для лечения заболеваний человека (Ledley, 1995).

Вторая группа методов для переноса и внедрения чужеродных генов в клетки млекопитающих основана на трансфекции. Трансфекция - это направленный перенос чужеродной ДНК в определенные типы клеток с ее последующей полноценной экспрессией, а в идеальном случае, и с интеграцией с геномом трансфецируемых клеток. В более обобщенном смысле ее следует понимать, как взлом сложившегося в ходе эволюции барьера, запрещающего горизонтальную передачу генетической информации от клетки к клетке. С практической точки зрения чужеродная ДНК должна быть упакована неким гипотетическим носителем в структуры, способные преодолеть плазматическую мембрану клетки, избежать деградации внутри клетки, направить чужеродную ДНК к ядру и обеспечить ее проникновение через ядерную оболочку с последующей полноценной экспрессией. Основные этапы трансфекции представлены схематически на Рис. 1.

Как известно, на данный момент лишь вирусы в процессе эволюции научились решать эти задачи. И именно поэтому на ранних этапах исследований в области генной терапии явно доминировали вирусные системы доставки. По сей день эффективность таких систем оказывается более высокой по сравнению с другими методами. Однако, наряду с высокой эффективностью действия, вирусные системы имеют целый ряд указанных выше недостатков, делающих их применение в ряде случаев совершенно невозможным. Поэтому наряду с совершенствованием уже известных вирусных трансфекционных систем стало параллельно развиваться направление по созданию так называемых невирусных систем трансфекции (Schofield and Caskey, 1995).

Исследования в этой области до сих пор были направлены на поиск носителей, взаимодействующих с ДНК и обеспечивающих ее эффективный перенос в эукариотические клетки. Были предложены различные решения, отличающиеся друг от друга по типу используемых носителей ДНК и способу ее проникновения в клетку. Здесь приводится лишь краткое их перечисление: DEAE-декстран опосредованная трансфекция (Pagano et al., 1967), кальций-фосфатная копреципитация (Graham and Eb, 1973), метод переноса метафазных хромосом (McBride and Ozer, 1973; Spandidos and Siminovitch, 1977), метод слияния клеток с бактериальными сферопластами (Schaffner, 1980), метод переноса ДНК в составе липосом (Fraley et al., 1980), метод переноса в мембранных оболочках эритроцитов (Sugawa et al., 1985), метод слияния клеток с оболочками Сендай-вируса (Volsky et al., 1984), метод цельноклеточного слияния (Stanbridge, 1976), метод с использованием комплексов ДНК с липидами (Feigner et al., 1987), метод микроинъекции ДНК (Capecchi, 1980), метод переноса микроснарядами (Klein et al., 1987), метод внедрения чужеродной ДНК через мембрану при помощи электрических полей высокого напряжения (Shigekawa and Dower, 1988).

HI - ДНК комплексы

Захват

Ядро

Эндосома

Без Са

2+

Эндоцитоз

Арест

Эндосомы

Добавка Са 2+ после 4-х часов

Рис. 1 Схема основных этапов трансфекции. Процессы, изображенные ниже горизонтальной черты, являются Са2+ - зависимыми в случае применения белковых носителей.

Несмотря на разнообразие методов, нужно все же отметить, что ни один из них не является универсальным при решении глобальных задач генной терапии. Каждый из приведенных подходов имеет свои недостатки: либо это высокая токсичность образующихся комплексов (случай липосом), либо сравнительно низкая эффективность, либо слишком большой размер агрегатов, делающий их проникновение через капилляры невозможным (кальций-фосфатная копреципитация). В основном, каждый из методов дает хорошие результаты трансфекции in vitro на одних типах клеток и совершенно не применим на других. Но, пожалуй, наиболее серьезным препятствием, возникающим при переходе от экспериментов in vitro к практике на животных in vivo, является ингибирующее действие сыворотки (плазмы) крови (Yang and Huang, 1997; Escriou et al., 1998).

Поскольку, как показала практика, задача трансфекции in vivo напрямую не решается, то сейчас очень интенсивно идет деятельность по отработке и усовершенствованию имеющихся методов на модельных экспериментах in vitro. Некоторые основные направления и подходы мы рассмотрим более детально в следующей главе.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Зайцев, Сергей Валерьевич

5. ВЫВОДЫ

1. С помощью различных методов экстракции и способов очистки показано, что в пуле белков хроматина из ядер клеток тимуса теленка содержится как минимум четыре белка, способных быть активными переносчиками векторной ДНК при трансфекции in vitro и, предположительно, in vivo. Таковыми белками являются HMG1, HMG2 и HMG17, принадлежащие к белкам хроматина с высокой электрофоретической подвижностью - High Mobility Group (HMG), а также линкерный гистон HI.

2. Принцип действия вышеперечисленных белков в роли трансфекционных носителей основан на их природном свойстве связывать и компактизовать ДНК. Образующиеся при этом нуклеопротеидные комплексы способны захватываться клетками при постановке трансфекции путем эндоцитоза. Результатом процесса является проникновение векторной ДНК в ядра трансфецируемых клеток с последующей полноценной экспрессией репортерного гена.

3. Белок-опосредованная трансфекция (имеются в виду перечисленные выше белки) у I является Са зависимым процессом. Установлено, что этот катион не влияет на захват клетками нуклеопротеидных комплексов. Предполагается, что ионы Са вызывают структурную перестройку трансфекционных комплексов, содержащихся в составе эндосом/лизосом и способствуют их высвобождению из этих органелл, что, в конечном итоге, делает возможным проникновение трансгенной ДНК в ядра клеток с последующей экспрессией репортерного гена.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог вышеизложенному, можно сказать, что в данной работе была предпринята попытка исследования потенциальной возможности белков хроматина из ядер клеток зобной железы (тимуса) теленка быть носителями чужеродной ДНК в процессе трансфекции. Результатом работы явилось подтверждение на новом техническом уровне трансфекционной активности для белков HMG1 и HMG2, а также открытие способности быть эффективными переносчиками в процессе трансфекции для белков HMG17 и линкерного гистона HI. Помимо этого установлено, что трансфекция, опосредованная вышеперечисленными белками, является Са2+ - зависимым процессом. Сделана попытка всесторонне исследовать влияние данного катиона на описываемый процесс. В результате применения современных иммуноцитохимических методов в комбинации с количественными измерениями эффективности трансфекции удалось установить, что роль Са2+ заключается в воздействии на трансфекционные комплексы, захваченные клетками в процессе эндоцитоза, приводящем к структурной перестройке комплексов с последующим их высвобождением из эндосом/лизосом. Последнее является необходимым условием для транспорта чужеродной ДНК в ядро. Исходя из экспериментальных данных выдвигается гипотеза, что Са2+ оказывает свое действие не в свободном виде, а в форме кальций-фосфатных микропреципитатов.

Однако, некоторые проблемы, затронутые в работе, пока остаются невыясненными. Не совсем понятно, как кальций-фосфатные микропреципитаты могут вызывать структурную перестройку комплексов внутри эндосом/лизосом. Вопрос о транспорте чужеродной ДНК в ядро и детали механизма этого процесса пока тоже остаются неясными. Хотя, возможно, именно здесь кроется ответ на вопрос о столь сильно различающейся трансфекционной активности (более двух порядков) при трансфекции разных клеточных линий при помощи

86 одного и того же белка-носителя. К сожалению, иммуноцитохимические методы, на данный момент, не позволили распознать какие-либо принципиальные отличия в картинах трансфекции с использованием разных клеточных линий. Тем не менее, исследования в этих направлениях нами продолжаются и хочется надеяться, что достигнутые результаты, равно, как и те, что будут получены в будущем, помогут пролить больше света на столь загадочное явление природы, как белок-опосредованная трансфекция ДНК в эукариотические клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зайцев, Сергей Валерьевич, Санкт-Петербург

1. Воробьев В.И. (1986) Наднуклеосомная организация хроматина. В сб. Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. JL: Наука, С. 18-38.

2. Baatz J.E., Bruno M.D., Ciraolo P.J., Glasser S.W., Stripp B.R., Smyth K.L., Korfhagen T.R. (1994) Utilization of modified surfactant-asociated protein В for delivery of DNA to airway cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,2547-2551.

3. Barthel F., Remy J.S., Leoffler J.P., Behr J.P. (1993) Gene transfer optimization with lipospermine-coated DNA. DNA & Cell Biol. 12, 553-560.

4. Behr J.P., Demeneix В., Leoffler J.P., Perez-MutuI J. (1989) Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,6982-6986.

5. Bernues J., Querol E. (1989) Non-random reconstitution of HMG1 and HMG2 in cromatin. Determination of the histone contacts. BBRC 1008, 52-61.

6. Bertling W.M., Gareis M., Paspaleeva V., Zimmer A., Kreuter J., Nurnberg E., Harrer P. (1991) Use of liposomes, viral capsids, and nanoparticles as DNA carriers. Biotechnol. Appl. Biochem. 13, 390-405.

7. Bianchi M.E. (1991) Production of functional rat HMG1 protein in E.coli. Gene 104,271-275. Bianchi M.E., Beltrame M., Paonessa G. (1989) Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science 243, 1056-1059.

8. Blumental R., Seth P., Willingham M.C., Pastan I. (1986) pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus. Biochemistry 25,2231-2237.

9. Bobrov M.N., Harris T.D., Shaughnessy K.J., Litt G.J. (1989) Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application for immunoassays. J. Immunol. Methods 125, 279-285.

10. Bottger M., von Mickwitz C.-U., Scherneck S., Lindigkeit R. (1984) Interaction of histone HI with superhelical DNA. Conformational studies and influence of ionic strength. Molec. Biol. Rep. 10, 38.

11. Bottger M., von Mickwitz C.-U., Scherneck S., Grade K., Lindigkeit R. (1981) Interaction of histone HI with superhelical DNA. Sedimentation and electron microscopical studies at low salt concentration. Nucleic Acids Recearch. 9(20), 5253-5268.

12. Bottger M., Scherneck S., von Mickwitz C.-U., Fenske H., Lindigkeit R. (1979) Salt- and histone Hl-induced structural changes of reconstituted minichromosomes. Nucleic Acids Recearch. 6(11), 3581-3597.

13. Burkholder J.K., Decker J., Yang N.S. (1993) Rapid transgene expression in lymphocyte and macrophage primary cultures after particle bombardment-mediated gene transfer. J. Immunol. Methods 165,149-156.

14. Bustin M., Lehn D.A., Landsman D. (1990) Stractural features of HMG chromosomal proteins and their genes. Biochim. Biophys. Acta 1049, 231-243.

15. Capecchi M. (1980) High efficiency transformation by direkt microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell 22,479-488.

16. Chen C., Okayama H. (1987) High efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752.

17. Chen J., Stickles R.J., Daichent K.A. (1994) Galactosylated hi stone-mediated gene transfer and expression. Human Gene Therapy 5,429-435.

18. Cheng L., Ziegelhoffer P.R., Yang N.S. (1993) In vivo promoter activity and transgene expression in mammalian somatic tissues evaluated by using particle bombardment Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4455-4459.

19. Chu G., Haykawa H., Berg P. (1987) Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acid Res. 15, 1311-1326.

20. Cole R.D. (1987) Microheterogenity in HI histones and its consequences. Peptide Protein Res. 30, 433-449.

21. Cole R.D. (1984) A minireview of microheterogeneity in HI histone and its possible significance. Anal. Biochem. 136, 24-30.

22. Coonrod A., Li F-Q., Horwitz M. (1997) On the mechanism of DNA transfection: efficient gene transfer without viruses. Gene Therapy, 4, 1313-1321.

23. Cotten M., Wagner E., Zatloukal K., Birnstiel M.L. (1993) Chicken adenovirus (CELO virus) particles augment receptor-mediated DNA delivery to mammalian cells and yield exceptional levels of stable transformants. J. Virol. 67,3777-3785.

24. Cristiano R.G., Smith L.C., Woo S.L. (1993) Hepatic gene therapy: adenovirus enhancement of receptor-mediated gene delivery and expression in primary hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,2122-2126.

25. Cristiano R.G., Smith L.C., Kay M.A., Brinkley B.R., Woo S.L. (1993) Hepatic gene therapy: efficient gene delivey and expression in primary hepatocytes utilizing a conjugated adenovirus-DNA complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11548-11552.

26. Curiel D.T. (1994) High-efficiency gene transfer employing adenovirus-polylysine-DNA complexes. Nat. Immun. 13, 141-164.

27. Curiel D.T., Agarwal S., Roemer M.U., Cotten M., Birnstiel M.L., Boucher R.C. (1992) Gene transfer to respiratory epithelial cells via the receptor-mediated endocytosis pathway. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 6, 247-252.

28. Curiel D.T., Wagner E., Cotten M., Birnstiel M.L., Agarwal S., Li C.M., Loechel S., Ни P.C. (1992) High efficiency gene transfer mediated by adenovirus coupled to DNA-polylysine complexes. Hum. GeneTher. 3,147-154.

29. Curiel D.T., Agarwal S., Wagner E., Cotten M. (1991) Adenovirus enhancement of transferrinpolylysine-mediated gene delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8850-8854.

30. Eckner R., Birnstiel M.L. (1989) Cloning of cDNA-s coding HMG1 for human and

31. HMGY proteins: both are capable of binding to the octamer sequence motif. NAR, V.17, N15,1. P.5947-5959.

32. Escriou V., Ciolina C., Lacroix F., Byk G., Sherman D., Wils P. (1998) Cationic lipid-mediated gene transfer: effect of serum on cellular uptake and intracellular fate of lipopolyamine/DNA complexes. Biochimica Biophysica Acta 1368, 276-278.

33. Fedor M.J. (1992) Chromatin structure and gene expression. Curr. Opin. Cell Biol., V.4, P.436-443.

34. Feigner J.H., Kumar R., Sridhar C.N., Wheeler C.J., Tsai Y.J., Border R., Ramsey P., Martin M., Feigner P.L. (1994) Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. J. Biol. Chem. 269, 2550-2561.

35. Feigner P.L., Ringold G.M. (1989) Cationic liposome-mediated transfection. Nature 337, 387-388.

36. Feigner P.L., Gadek T.R., Holm M., Roman R., Chan H.W., Wenz M., Northrop J.P., Ringold G.M., Danielson M. (1987) Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl Acad Sci. USA 84, 7413-7417.

37. Felsenfeld G. (1992) Chromatin as an essential part of the transcription mechanism. Nature, V.355, P.219-224.

38. Fisher K.J., Wilson J.M. (1994) Biochemical and functional analysis of an adenovirus-based ligand complex for gene transfer. Biochem. J. 299, 49-58.

39. Fraley R., Subramani S., Berg P., Papahadjopoulos D. (1980) Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. Journ. Biol. Chem. 225,10431-10435.

40. Frohman M.A., Martin G.R. (1989) Cut, paste, and save: new approaches to altering specific genes in mice. Cell 56, 145-147.

41. Gao X.A., Huang, L. (1991) A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 280-285.

42. Gottschalk S., Cristiano R.J., Smith L.C., Woo S.L.C. (1993) Folate receptor mediated DNA delivery into tumor cells: potosomal disruption results in enhanced gene expression. Gene Ther. 1, 185-191.

43. Grieshmacher A., Weigel G., Schreiner W., Muller M.M. (1989) Thromboxan At generation by human umbilical endothelial cells. Thromb Res. 56, 611-623.

44. Griswold D.P., Corbett Т.Н. (1975) A colon tumor model for anticancer agent evaluation. Cancer 36, 2441-2444.

45. Haensler J., Szoka F.C.Jr. (1993) Synthesis and characterization of a trigalactosylated bisacridine compound to target DNA to hepatocytes. Bioconjug. Chem. 4, 85-93.

46. Haensler J., Szoka F.C.Jr. (1993) Polyamidoamine cascade polymers mediate efficient transfection of cells in culture. Bioconjug. Chem. 4,372-379.

47. Jaffe E.A., Nachman R.L., Becker C.G., Minick C.R. (1973) Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. J. Clin. Invest. 52,2745-2756.

48. Johns E.W. (1982) The HMG chromosomal proteins. Academic press, New York.

49. Kaneda Y., Iwai K., Uchida T. (1989) Increased expression of DNA cointroduced with nuclearprotein in adult rat liver. Science 243, 375-378.

50. Klein T.M., Wolf E.D., Wu R., Sanford J.C. (1987) High-velosity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327, 70-73.

51. Knowles B.B., Howe C.C., Aden D.P. (1980) Human hepatocellular carcinoma cell lines secret themajor plasma proteins and hepatitis В surface antigen. Science 209,497-499.

52. Marekov L.N., Demirov D.G., Beltchev B.G. (1984) Isolation of High-Mobility-Group proteins

53. HMGl and HMG2 in nondenaturating conditions and comparison of their properties with those ofacid extracted proteins. Biochim. Biophys. Acta 789, 63-68.

54. McBride O.W., Ozer H.L. (1973) Transfer of genetic information by purified metaphase chromosomes. Proc.Natl Acad.Sci. USA 70,1258-1262.

55. Ooboshi H., Rios C.D., Heistad D.D. (1997) Novel methods for adenovirus-mediated gene transfer to blood vessels in vivo. Mol-Cell-Biochem.l72(l-2), 37-46.

56. Pagano J., McCutchan J.H., Yaheri A. (1967) Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J.Virology. 1, 891-897.

57. Panyim S., Chalkley R. (1969) High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones. Arch. Biochem. Biophys. 130, 337-346.

58. Pil P.M., Show C.S., Lippard S.J. (1993) High-mobility-group 1 protein mediates DNA bending as determined by ring closures. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,9465-9469.

59. Ramakrishnan V. (1997) Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., V.26, P.83-112.

60. Reeck G.R., Isackson P.J., Teller D.C. (1982) Domain structure in high molecular weight High Mobility Group nonhistone chromatin proteins. Nature, 300, 76-78.

61. Scangos G., Ruddle F.H. (1981) Mechanisms and applications of DNA-mediated gene transfer in mammalian cells- a review. Gene 14, 1-10.

62. Scangos G., Huttner K.M., Juricek D.K., Ruddle F.H. (1981) Desoxyribonucleic-mediated gene transfer in mammalian cells: molekular analysis of unstable transformants and their progression to stability. Mol. Cel. Biol. 1, 111-120.

63. Schaffner W. (1980) Direct transfer of cloned genes from bacteria to mammalian cells. Proc. Natl Acad Sci. USA 77, 2163-2168.

64. Scherphof G., Nicolau C. (1983) Targeted and nontargeted liposomes for in vivo transfer to rat liver cells of a plasmid containing the preproinsulin I gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 71287131.

65. Schwamborn K., Albig W., Doenecke D. (1998) The istone HI0 contains multiple sequence elements for nuclear targeting. Experimental Cell Research, 244, 206-217.

66. Soriano P., Dijkstra J., Legrand A., Spanjer H., Londos-Gadliardi D., Roerdink F., Seth P. (1994) Adenovirus-dependent release of choline from plasma membrane vesicles at an acidic pH is mediated by the penton base protein. J. Virol. 68,1204-1206.

67. Spandidos D.A., Siminovitch L. (1977) Transfer of codominant markers by isolated metaphase chromosomes in Chinese hamster ovary cells. Proc.Natl Acad.Sci. USA 74, 3480-3484.

68. Staedel C., Remy J.S., Hua Z„ Broker T.R., Chow L.T., Behr J.P. (1994) High-efficiency transfection of primary human keratinocytes with positively charged lipopolyamine-DNA complexes. (1994) J. Invest. Dermatol. 102, 768-772.

69. Stanbridge E.J. (1976) Suppression of malignancy in human cells. Nature 260, 17-20.

70. Svaren J., Horz W. (1993) Histones, nucleosomes and transcription. Curr. Opin. in

71. Genetics and Develop., V.3, P.219-225.

72. Takahashi K., Sawasaki Y. (1991) Human endothelial cell line, ECY304, produces pro-urokinase. In Vitro Cell Dev. Biol. 27A, 766-768.

73. Thompson T.A., Gould M.N., Burkholder J.K., Yang N.S. (1993) Transient promoter activity in primary rat mammary epithelial cells evaluated using particle bombardment gene transfer. In Vitro Cell Dev. Biol. 29A, 165-170.

74. Wagner E., Cotten M., Foisner R., Birnstiel M.L. (1991) Transferrin-polycation DNA complexes: the effect of polycations on the structure of the complex and DNA delivery to cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4255-4259.

75. Wang C.Y., Huang L. (1989) Highly efficient DNA delivery mediated by pH-sensitive immunoliposomes. Biochemistry 28, 9508-9514.

76. Wang C.Y., Huang L. (1987) Plasmid DNA adsorbed to pH-sensitive liposomes efficiently transforms the target cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 147, 980-985.

77. Zenke M., Steinlein P., Wagner E., Cotten M., Beug H., Birnstiel M.L. (1990) Receptor-mediated endocytosis of transferrin-polycation conjugates: an efficient way to introduce DNA into hematopoietic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3655-3659.