Супрамолекулярные комплексы нуклеиновых кислот как эффективные системы трансфекции клеток

Гусаченко, Олеся Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Супрамолекулярные комплексы нуклеиновых кислот как эффективные системы трансфекции клеток
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Супрамолекулярные комплексы нуклеиновых кислот как эффективные системы трансфекции клеток"

На правах рукописи

□□3448ТТ8

ГУСАЧЕНКО ОЛЕСЯ НИКОЛАЕВНА

СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ КАК ЭФФЕКТИВНЫЕ СИСТЕМЫ ТРАНСФЕКЦИИ

КЛЕТОК

03 00 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 ОПТ 2006

Новосибирск - 2008

003448778

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научный руководитель

д б н, профессор Зенкова Марина Аркадьевна

Официальные оппоненты

д б н Гимаутдинова Ольга Ивановна к б н Васильев Геннадий Владимирович

Ведущая организация

Институт молекулярной биологии им В А Энгельгардта

№

Защита состоится «/-£» OtMKJ^JL- 2008 г в ^ часов на заседании диссертационного совета Д 003 045 01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090, Новосибирск, просп акад Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www niboch nsc ru

Автореферат разослан « ^^¿^/^-20081

Ученый секретарь диссертационного совета к х н , доцент

Коваль В В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Возможность транспорта нуклеиновых кислот (НК) и их химически модифицированных аналогов в эукариотические клетки относится к фундаментальным вопросам современной молекулярной биологии и фармакологии. Интерес к этому вопросу связан с появлением и разработкой нового класса высокоспецифичных терапевтических препаратов на основе НК Одним из основных препятствий для их эффективного применения является крайне низкая способность НК проникать в эукариотические клетки Известно, что образование НК некоторых супрамолекулярных структур, например, квадруплексов, а также наличие в их составе определенных нуклеотидных последовательностей, приводит к повышению эффективности их транспорта в клетки Поиск супрамолекулярных комплексов НК, обладающих повышенным сродством к клеточной поверхности, может привести к разработке новых систем трансфекции С другой стороны, существует обширный спектр искусственных методов трансфекции клеток препаратами на основе НК Катионные полимеры относятся к классу высокоэффективных биохимических трансфектантов На сегодняшний день использование поликатионных трансфектантов остается ограниченным, в основном, связи с довольно высоким токсическим действием, что делает актуальными дальнейшие исследования в данном направлении

Целью настоящей работы являлось изучение супрамолекулярных конкатемерных комплексов олигонуклеотидов, содержащих липофильные группы, в качестве новой системы трансфекции клеток, а также исследование трансфицирующей активности конъюгатов поликатионного трансфектанта полиэтиленимина (PEI), содержащих разное количество липофильных групп, по отношению к разным молекулам НК В ходе исследования предполагалось решить следующие задачи- исследовать закономерности образования супрамолекулярных комплексов олигонуклеотидами с перекрывающимися

взаимокомплементарными последовательностями и оценить влияние введения липофильных групп в конкатемер-образующие олигонуклеотиды на эффективность формирования супрамолекулярных комплексов

- исследовать влияние образования олигонуклеотидами конкатемерных комплексов на их взаимодействие с опухолевыми клетками

- исследовать биологическую активность олигонуклеотидов, доставляемых в клетки в виде супрамолекулярного комплекса

- исследовать влияние степени модификации холестерином на способность к мицеллообразованию и цитотоксичность конъюгатов полиэтиленимина с холестерином.

- исследовать корреляцию между степенью модификации аминогрупп полиэтиленимина холестерином и эффективностью трансфекции НК различной длины в опухолевые клетки

Научная новизна и практическая ценность работы. В рамках первой части работы разработана и исследована новая система трансфекции в клетки коротких одноцепочечных олигонуклеотидов, основанная на образовании олигонуклеотидами конкатемерных комплексов Впервые показано, что формирование конкатемеров существенно повышает эффективность связывания олигонуклеотидов с опухолевыми клетками Благодаря использованию холестерин-модифицированных олигонуклеотидов-носителей получены

конкатемерные комплексы олигонуклеотидов, способные эффективно проникать внутрь эукариотических клеток в отсутствие трансфицирующих агентов Впервые показано, что олигонуклеотиды, попадающие в клетки в составе таких комплексов, способны проявлять специфическое биологическое действие, что приводит к подавлению экспрессии гена-мишени Вторая часть работы представляет собой первое в своем роде систематическое исследование на количественном уровне влияния степени модификации холестерином на трансфицирующие и цитотоксические свойства линейного полиэтиленимина 1PEI (25 кДа) На основании представленных результатов сделано предположение о том, что в ряду исследованных соединений конъюгат PEIC1 со степенью модификации 1% всех аминогрупп может быть рекомендован для применения в лабораторных целях в качестве эффективного трансфектанта для доставки НК различного размера в эукариотические клетки

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях «Химическая биология» (Новосибирск, 2004), «Mechanisms of carrier-mediated delivery of therapeutics» (Монпелье, Франция, 2005), IX Молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2005), международном семинаре для молодых ученых «Nucleic Acids as Targets and tools» (Новосибирск, 2006), XXXI конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (FEBS, Стамбул, Турция, 2006), XXXII конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (FEBS, Вена, Австрия, 2007), международной летней школе для аспирантов и молодых ученых и симпозиуме по химической биологии нуклеиновых кислот (NABC, Оденсе, Дания 2007), VI Всероссийском Научном Семинаре с Молодежной Научной Школой «Химия и медицина» (Уфа, 2007), III и IV международных конференциях «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007 и 2008)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 166 страницах, содержит 37 рисунков и 5 таблиц. Библиография содержит 286 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Предобразование супрамолекулярных комплексов НК как способ

трансфекции

/. Образование олигонуклеотидами конкатемерных комплексов в растворе.

Известно, что самоорганизация олигонуклеотидов в особые структуры может способствовать повышению эффективности их взаимодействия с клеточной поверхностью и как следствие - улучшению процесса их интернализации. Пары олигонуклеотидов, в которых половины их последовательностей с З'-концов и с 5'-концов комплементарны друг другу (рис. 1, А), способны самопроизвольно формировать в растворе конкатемерные комплексы - длинные двуцепочечные молекулы НК, содержащие разрывы типа ников в местах состыковки олигонуклеотидов одной цепи. В данной работе было предложено исследовать влияние образования конкатемеров на взаимодействие олигонуклеотидов с эукариотическими клетками с целью

Рис. 1. Схема образования конкатемерных комплексов: (А) -немодифицированный конкагемер и гибридизация со ¡аоррег-олигонуюкогидом: (Б) - конкагемер. содержащий флуоресцентную и липофильную группы,

присоединенные к олигонуклеотидам противоположных цепей: (В) -гибридизация «модифицированного конкатемера с дуплексом, образованным олишнуклеошдом первой цепи и яоррег-олигонуклеотидом.

разработки новой системы трансфекции. А.

Доставляемый олигонуклеотид (первая цепь)

, I

WW. У} 1 ■ 1 ■ ■ МЧИ Stopper

СВЯЗИ у

Олигсжуклеотцд-носитепь (вторая цепь)

J$(l=nC)

Липофильная группа (холестерин)

В.

. , л

Stopper «

В качестве моделей для исследования образования конкатемерных комплексов в растворе и их взаимодействия с культивируемыми клетками использовали пары олигонуклеотидов серий Е, G и М (табл 1) С целью дополнительной модуляции параметров образования конкатемеров к парам олигонуклеотидов Е1/Е2 и G1/G2 были также подобраны stopperE и stopperG — олигонуклеотиды, представляющие собой укороченные версии олигонуклеотидов второй цепи Stopper-олигонуклеотиды образуют комплементарный дуплекс только с 3'-концом олигонуклеотида первой цепи, не оставляя при этом липкого конца, с которым мог бы связаться следующий олигонуклеотид Таким образом, добавление stopper-олигонуклеотида должно препятствовать дальнейшему удлинению конкатемерного комплекса со стороны 3'-конца первой цепи

Табл. 1 Олиго! уклеотады, использованные д ля получения конкатемеров.

Обозначение Последовательность олигонуютеотвда (5'—>3')

El d(GGAAGTCCAGCCCCATGGATGATG)

Е2 d(GGCrGGACITCCCATCATOCATGG)

StoppetE d(TTTTCATCATCCATGG)

Gl d(AATTCCACTGTAATAATAGGCATAQ

G2 dCTACAGTCGAATICTATGCCTATTAT)

StopperG dCITCCGTATGCCTATTAT)

Ml d(ATGTGTGGAGACGTGGCA<XTCn)

M2 d(GTCrCCACACATAAGAGGTGOCAQ

Asl d(GAACTrcAGGGTCAGCrnjCCG)

As2 d(ACXXriGAAGTTOCGGCAAGCro)

StoppetAs d(TrOGGCAAGCTG)

ON1 d(GACACGCIGAACrroTGGCCGTT)

ON2 d(TCAGCGTGTCAACGGCCACAAGT)

Sal d(CmCGGTAGCATAGCATCGTCTA)

Sct2 dCrGCTAOCGAAAGrAGACGATGCTA)

Образование олигонуклеотидами конкатемерных комплексов было исследовано с учетом следующих параметров ионного состава раствора, условий инкубации олигонуклеотидов, концентраций олигонуклеотидных цепей и их соотношения Оценку длины образуемых конкатемеров проводили с помощью электрофоретического разделения в полиакриламидном геле, используя [32Р]-меченые олигонуклеотиды первой цепи Для получения конкатемеров пары олигонуклеотидов серий Е, О и М смешивали в растворе в эквимолярном соотношении и инкубировали в течение 30 мин при 37°С Варьирование состава раствора, в котором смешивали олигонуклеотиды, показало, что присутствие в растворе ионов М§2+ и К+ в концентрациях, близких к физиологическим, способствует образованию протяженных конкатемеров длиной до 1000-

Дорожка:

2000 п.н. (рис. 2). Для сравнения, при взаимодействии олигонуклеотидов G1 и G2 в дистиллированной воде наблюдается образование комплексов небольшого размера (менее 200 п.н.), при этом существенная часть меченого олигонуклеотида G1 остается в одноцепочечной форме.

Рис. 2. Влияние состава буфера на образование конкатемеров олигонукпеогидами G1 и G2 (1 мкМ каждого). Радиоавтограф нагивного 10% ПААГ после электрофорегического разделения продуктов взаимодействия следующих смесей: 1. - [j2P]-Gl в воде; 2. - [32Р]-G1-K32 в буфере: 50 мМ Трис-HCl, рН 7.3, 200 мМКЦ 10 мМ MgCy; 3. - [32P]-G 1+G2 в буфере: 50 мМ Трис-HCl, рН 7.3, 200 мМ КС1); 4. [32Р]-G1+G2 в буфере: 50 мМ Трис-HCl, рН 7.3); 5. -[32P]-G1+G2 в воде. Стрелкой спмечен Вфхний край геля; М - маркер длины, пн.

- J ООО

- 200

— 100 — 75

Олигонуклеотид:

Первая цепь. мкМ Вторая цепь, мкМ Stopper. мкМ

Рис. 3. Влияние концентрации сшигонуклеотицов первой и второй цепи и присутствия эйзррег-

олигонуклеопщов в смеси на длин/ образуемых конкагемеров. Радиоавтограф нагивного 10% ПААГ после разделения продуктов гибридизации олиго-нуклеоидов. Состав гибрцдиза-ционных смесей приведен сверху над дорожками. Е и О - показывают, олигонуклеащды какой серии были использованы, цифры 1 и 10-конценграция соответствующего олигонуклеотида в мкМ. М-маркер длины, п.н

Эффективность образования протяженных конкатемеров увеличивается при повышении концентрации обоих конкатемер-образующих олигонуклеотидов (рис. 3, дорожки 1-2, 5-6). Как и предполагали, добавление соответствующих з1оррег-олигонуклеотидов приводило к формированию более коротких конкатемеров (рис. 3, дорожки 3, 4, 7, 8 и рис. 4, Б). Существенное снижение средней длины образуемых конкатемерных комплексов также наблюдалось при добавлении в раствор конкатемер-образующих олигонуклеотидов в концентрационном соотношении, отличном от эквимолярного (рис 4, А).

6 7 8 М

- 1000

_200

I I |

9 Ж

I I | _«

ф т щ - 36

* • Щ #

Е2 (мкМ): 1 3 5 7 10 30 50 70 - БЬррегЕ (мкМ): - - 0.5 0.7 1 1.3 1.5 2

Рис. 4. Зависимость длины конкагемеров от концентрации образующих олигонуклеотидов. (А) Радиоавтограф 10% ПААГ после разделения продуктов, образуемых в смесях, содержащих различные концентрации ояиготуклеощда Е2 (приведена внизу под дорожками) при концентрации [32Р]-Е1 равной 5 мкМ (без зЬрреголигонуклеагида). (Б) Радиоавтограф 10% ПААГ после разделения продуктов, образуемых в смесях, содержащих олигонуклешвды [32Р]-Е1 и Е2 в концентрации 1 мкМ каждого при различных концентрациях ЯорретЕ (приведены внизу под дорожками). М - маркер длины, п.н.

2. Определение эффективности связывания конкатемерных комплексов олигонуклеотидов с опухолевыми клетками.

В качестве экспериментальных моделей для изучения взаимодействия конкатемерных комплексов с эукариотическими клетками были использованы различные линии опухолевых клеток человека, хомяка и мыши (рис. 5). Поскольку известно, что уровень связывания олигонуклеотидов эукариотическими клетками в культуре достаточно невысок, для определения эффективности связывания с клетками в среду добавляли [32Р]-меченые олигонуклеотиды первой цепи. Использование радиоактивной метки позволяет зарегистрировать даже небольшие количества олигонуклеотидов, связавшихся с клетками и/или проникших во внутриклеточное пространство. Клетки инкубировали в среде с предформированными конкатемерами или с одноцепочечными олигонуклеотидами в течение 3 ч, а затем подвергали нескольким стадиям промывки от несвязавшихся олигонуклеотидов/комплексов, лизировали и определяли уровень радиоактивности лизата. Результаты экспериментов показали, что эффективность связывания как одноцепочечных олигонуклеотидов, так и их конкатемерных комплексов клетками различных линий достаточно вариабельна. При этом в большинстве проанализированных случаев эффективность связывания олигонуклеотидов в форме конкатемеров в несколько раз (от 1.5 до 7) превышала таковую для одноцепочечных олигонуклеотидов той же последовательности.

s 3,0 ■ 2 и

* 2-5 a>

5 2,0 -

1 1.5

I 1,0

S 0,5

0,0

KB-3-1

■: , I

SC-1

2 93

iil

IMR-32

BHK-IR780

Рис. 5. Связывание одноцепочечных олигонуклеогвдов (Е1, G1 и М1) и конкатемеров, образованных парами Е1/Е2, G1/G2 и М1/М2, с клетеами линий KB-3-1, SC-1,293, IMR-32 и BHK-IR780. Темные столбцы соответствуют уровням связывания конкатемерньк комплексов, светлые - уровням связывания одноцепочечных олигонуклеотидов. Значения предсгашены в % от общего количества [^-меченого олигонуклеощца, добавленного к клеткам. Концентрации всех сшгонуклеощдов в среде - 1мкМ; [32Р]-мегка находилась на 5'-конпах олигонуклеспвдовЕ1,01 иМ1.

А. Б.

100 200 Время инкубации, мин.

0.01 0,1 1 Концентрация Е1,мкМ

Рис. 6. Зависимости уровней связывания с клетками линии 293 одноцепочечного олигонуклеощца [32Р]-Е1 (1 мкМ) (синяя кривая) и конкатемерных комплексов [32Р]-Е1/Е2 (1 мкМ каждого) (красная кривая) от времени инкубации (А) и концентрации олигонуклеощцов в среде (Б). Значения представлены в % от общего количества меченого олигонуклеощца, добавленного к леткам.

При анализе кинетики взаимодействия олигонуклеотидов с клетками линии 293 было выявлено, что кривая уровня связывания одноцепочечного олигонуклеотида приближается к максимальному значению уже через 15 минут инкубации, в то время как в случае конкатемерных комплексов существенное увеличение уровня связывания

с клетками происходит в течение первого часа инкубации (рис. 6, А). В свою очередь, эксперименты по определению концентрационной зависимости взаимодействия с клетками показали, что уровень связывания одноцепочечного олигонуклеотида не увеличивался при повышении его концентрации до 1 мкМ, а для конкатемеров было обнаружено значительное увеличение уровня связывания с клетками при повышении концентрации олигонуклеотидов в среде (рис. 6, Б). Такой вид зависимости, вероятно, определяется тем, что формирование конкатемеров происходит с большей эффективностью при увеличении концентрации формирующих их олигонуклеотидов.

Также была проведена оценка эффективность связывания с клетками олигонуклеотидов в форме конкатемеров разной длины. Для этого клетки инкубировала в среде, содержащей смеси олигонуклеотидов с разным соотношением концентраций конкатемер-образующих олигонуклеотидов, а также содержащие БЮррег-олигонуклеотиды. Наибольший уровень связывания наблюдали в случае добавления к клеткам олигонуклеотидов в форме более длинных конкатемерных комплексов, получаемых при эквимолярном соотношении конкатемер-образующих олигонуклеотидов в отсутствие БЮррег-олигонуклеотида (рис. 7). А.

3.0 2.5 2.0 1.5

1.0 0.5 0.0

■ I Й

Б.

Рис. 7. Эффективность связывания с клетками конкатемеров различной длины. (А) Уровень связывания конкатемеров. образованных олигонуклеогвдами Е1/Е2 в присутствии или в отсутствие stopperE. (Б) Анализ длины конкатемеров, добавленных к клеткам (радиоавтограф 10% ПААГ). Номера дорожек соогвеютвуют номерам столбцов на диаграмме: 1.-1 мкМ El и Е2; 2. -1 мкМ El. Е2 и stopperE; 3. -1 мкМ El и Е2,2 мкМ stopperE; 4.-5 мкМ El и 30 мкМ Е2; 5.-10 мкМ El, Е2 stopperE; 6. - 10 мкМ El. Темные столбцы на диаграмме обозначают добавление к клеткам олигонуклеотидов в составе конкатемерных комплексов.

3. Получение холестерин-модифицированных конкате.меров Конъюгаты олигонуклеотидов с молекулами холестерина обладают повышенной способностью проникать во многие типы клеток, поэтому в данной работе для увеличения эффективности проникновения исследуемых конкатемерных структур через клеточные мембраны также использовали присоединение остатка холестерина к олигонуклеотидам-носителям и зШррег-олигонуклеотидам. Анализ кривых плавления показал, что присутствие остатка холестерина на 5'- конце олигонуклеотида-носителя не приводит к снижению температуры плавления конкатемерных дуплексов (рис. 8, А).

А.

0.06 0,05 «04 0,03 0,02 0.01 0,00

— 01/С2(Ю'М)

— С1/С2-СЬо1(10лМ) Л \ \

30 35 40 45 50 55

«5 70 Т 'С

Б.

Даромка. 1 2 3 М

Дсяхжка 12 3 4 5 в М

Рис. 8. Влияние присоединения холестерина на 5'-конец олигонуклеощдов-носигелей на образование конкатемеров олигонуклеотидами серий Е (верхняя половина) и в (нижняя половина). (А) Первые производные кривых плавления конкшемеров. (Б) Радиоавгофаф нагивного 6% ПААГ после электра]юрггического разделения конктемероа образованных ['"Р]-меченым олигонуклеогидом Е1 или 01 и холесгерин-модифицированными или немодифииировам ыми олигонуклеощаами Е2 или а также з1орреЮ. Дорожки: 1. - [32Р]-Е1 или[32Р]-01 (1 мкМ): 2. - [32Р]-Е1/Е2 или [32Р]-ОШ2 (1 мкМ каждого); 3. - [32Р]-Е1/Е2-Ою1 или [^Р]-01/02-С1ю1 (1 мкМ каждого); 4. (для серии О) - Г"Р]-С 1/02/аорреК} (1 мкМ первой и второй цепи. 0.1 мкМз(оррегчмигонуклеогида);5.-['2Р]-(]1/02/51оррегС-С11о1(1 мкМпервойи второй цепи 0.1 мкМ Яорреголигонуклеотида); 6. - [3^-01/02 (1 мкМ каждой цепи) + О^йзрреЮ (0.1 мкМ каждого олигонуклеотида). СЬо1 - обозначена модификация олигонукпеощда холестерином. М - маркер длины, п.н.

При электрофоретическом разделении было выявлено, что в присутствии холестерин-модифицированных олигонуклеотидов образуются более короткие конкатемеры (рис 8, Б) Вероятно, это связано с тем, что в присутствии модификации между основаниями соседних олигонуклеотидов происходит нарушение стэкинг-взаимодействий, дополнительно стабилизирующих комплекс

На примере олигонуклеотидов серии G также было проанализировано влияние на длину комплексов модификации холестерином stopper-олигонуклеотида При образовании конкатемерных комплексов в присутствии немодифицированного stopper-олигонуклеотида в концентрации, составляющей 1/10 от концентраций конкатемер-образующих олигонуклеотидов, длина комплексов существенно не снижалась (Рис. 8, Б - нижняя панель) В то же время, образование конкатемеров в присутствии холестерин-модифицированного stopper-олигонуклеотида в той же концентрации приводило к получению более коротких комплексов Для того чтобы получить длинные конкатемеры, содержащие только один остаток холестерина, использовали процедуру гибридизации предформированных немодифицированных конкатемеров и дуплекса доставляемого олигонуклеотида с холестерин-модифицированным stopper-олигонуклеотидом (см схему на рис 1, В) В результате проводимой процедуры были получены комплексы, сходные по длине с конкатемерами, образуемыми немодифицированными олигонуклеотидами в отсутствие stopper-олигонуклеотида

4 Определение цитотоксичности конкатемеров и влияния обработки клеток конкатемерами на индукцию генов-маркеров интерферонового ответа

Цитотоксичность конкатемеров оценивали с помощью МТТ теста на примере клеток линии 293 С целью исключить вероятность специфического взаимодействия с внутриклеточными НК для анализа использовали конкатемеры, образуемые олигонуклеотидами серии ON, не имеющими существенной гомологии по отношению к геному человека Было выявлено, что в используемом диапазоне концентраций как немодифицированные, так и холестерин-модифицированные конкатемеры не оказывают цитотоксического действия (рис 9)

Известно, что длинные двуцепочечные молекулы РНК при попадании в клетку вызывают ряд биологических реакций, включая и индукцию интерферонового ответа Для молекул ДНК такой активности в клетках, не относящихся к иммунной системе, отмечено не было Тесты на индукцию генов-маркеров интерферонового ответа -олигоаденилатсинтазы I и протеинкиназы R - подтвердили, что для конкатемерной ДНК такой активности также не наблюдается (рис 10)

rS1 ¿?

Рис. 9. Жизнеспособность клеток, обработанных олигонуклеощдами в одноцепочечной форме и в форме конкатемера, через 4 суток инкубации. Данные ШТ-тесга Концентрация олишнуклеотицов в среде составляла 5 мкМ; Choi - модификация олигонуклеотида холестерином; контроль - количество живых клеток в лунках, необработанных олигонуклеощдами, - принято за 100%.

PKR — щ — 1! _

OAS-» _ «мм ш OAS»

|52М — — |)2М »

■SN л (PKR+P2M) (OAS+P2M)

л . N

fP 12 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

га ГН г?"-} р-?< ' ' " . -гт^г^^

" ' иж-» ' "'

■ lJUwUUwiuLi Р2М »ViielWIdwUMW

24 ч I 4В ч 24 ч \ 46 ч 24 ч \ 48 ч

Рис. 10. Определение уровня экспрессии генов-маркеров ингерферонового ответа в клетках линии 293, инкубированных в присутствии различных типов Ж через 24 и 48 ч после обработки. Анализ продуктов ОТ-ПЦР. (А) Обработка клеток длинной двуцепочечной РНК (Б) Обработка клеток одноцепочечными олишнуклеощдами и конкагемерами: 1. -необработанные клетки; 2. -ON1 (5 мкМ); 3. - ON1/ON2 (5 мкМ каждой цепи); 4. -ON1/ON2-Chol (5 мкМ каждой цепи). Над дорожками приведены пары праймеров, использованные для ПЦР, (32М - продукт гена (Зу-мифоглобулина, OAS - олигоаденилатсишазы I, PKR -протеинкиназы R.

5. Проникновение олигонуклеотидов в клетки в составе холестерин-модифицированных конкатемеров

Добавление к клеткам флуоресцентно-меченого доставляемого олигонуклеотида в форме конкатемеров с холестерин-модифицированным олигонуклеотидом-носителем приводило к трансфекции около 90% клеток в популяции, что даже несколько выше, чем в случае использования трансфектанта Lipofestemine™ (рис. 11). При этом среднее количество олигонуклеотидов, проникших в клетки, составило 30-35% от уровня проникновения олигонуклеотидов в клетки в присутствии Lipofestemine1 м. Данные микроскопического анализа показывают, что при добавлении к клетками конкатемерных комплексов, не содержащих холестерин, наблюдается лишь очень слабое проникновение в клетки флуоресцентно-меченого доставляемого олигонуклеотида (рис. 12, А - панель 2). Напротив, в случае инкубации клеток в присутствии холестерин-

модифицированных комплексов обнаруживается равномерное распределение яркого зеленого сигнала в цитоплазме клеток, соответствующее флуоресцентно-меченому олигонуклеотиду (рис. 12, А — панель 3). Интересно, что при добавлении к клеткам гибридного конкатемерного комплекса, состоящего из конкатемеров, не содержащих холестерин-модифицированные олигонуклеотиды, и гибридизованных с ними холестерин-модифицированными дуплексами также было обнаружено проникновение олигонуклеотидов в клетки, но внутриклеточная локализация заметно отличалась от таковой для конкатемеров с холестерин-модифицированным олигонуклеотидом второй цепи (рис. 12, А - панель 4).

Для подтверждения того, что олигонуклеотиды в форме конкатемеров, проникают внутрь клетки, а не остаются на ее поверхности, был использован анализ с помощью конфокального микроскопа, позволяющего получать изображения для отдельных уровней (сечений) препарата. Оказалось, что в результате обработки клеток Р1ТС-меченым олигонуклеотидом в форме конкатемера с холестерин-модифицированных олигонуклеотидом-носителем происходит проникновение

олигонуклеотида в клетки и равномерное его распределение практически по всей цитоплазме (рис. 12, Б). По-видимому, такое внутриклеточное распределение свидетельствует о том, что большая часть олигонуклеотидов внутри клетки остается в форме конкатемеров, крупный размер которых не позволяет им диффундировать в ядро через ядерные поры.

А. Б. В.

Контроль в1-?1ТС * ироГес1ат1пе" й1-Р1ТС + 62-С/ю/

1Л1:Ш

О 10' 10'

Флуоресценция

0 10' 10' Флуоресценция

Среднее: 9600ЯГи(100%) Уровень трансфекции: 84%

0 10= 10' Флуоресценция

Среднее; 3230(^11(34%) Уровень трансфекции: 89%

Рис. 11. Анализ уровня трансфекции клеток линии 293 олигонуклеощдом 01-ИТС с помощью метода проточной цигофлуориметрии через 3 ч инкубации. (А) Контроль -необработанные олигонуклеотидом клетки. (Б) Обработка клеток комплексами ироГесйпйпе^/С 1 -РГГС (10 мкМ). (В) Обработка клеток конкагемерами С1-НТС/С2-С1ю1 (10 мкМ каждого). ЯРи - относительные единицы флуоресценции; среднее значение интенсивности флуоресценции клеток, трансфицированных с помощью ЦройсШгтипе™. принято за 100%; уровень трансакции оценивался как % флуоресцирующих клеток в популяции.

Рис. 12. Анализ внутриклеточной локализации олигонуклеогщи G1-FITC в клетках линии 293 (10 мкМ) через 3 ч инкубации. (А) Фогогра(1)ии микропрепаратов (стандартная флуоресцентная микроскопия): 1. - клетки без олигонуклесгщда (контроль): 2. - GI-F1TC/G2 (10 мкМ каждого); 3 - G1 -FITC/G2-Chol (10 мкМ каждого): 4- G1-FTFC/G2 (10 мкМ каждого) + Gl/stoppetG-Chol (1 мкМ каждого). Зеленый -G1-FITC (отмечено стрелками): синий цвет-окрашивание ядф Hoechsl33258: на каждой панели левое изображение получено в результате наложения изображений с зеленым и синим сигналами. (Б) Развертка изображений, полученных при сканировании препаратов киетк. обработанных конкагемерами G1-FITC/G2-Chol (10 мкМ каждого) с помощью конфокального микроскопа — наложение трех изображений: зеленый фильтр (FITC-меченый доставляемый олигонуклеощц); синий фильтр (окрашивание ядер с помощью Hoechst33258) и изображение при сканировании на просвет (очертания клеток).

Конкатемерный комплекс олигонуклеотидов представляет собой двуцепочечную структуру. Антисмысловая активность олигонуклеотидов основана на комплементарном взаимодействии с последовательностью мРНК, то есть олигонуклеотиды, доставляемые в клетки в форме конкатемерного комплекса, должны иметь возможность диссоциировать из конкатемера для специфического связывания с биологическими мишенями. Эффективность биологического действия конкатемерных комплексов олигонуклеотидов была определена с использованием антисмыслового олигонуклеотида Asi, комплементарного последовательности в мРНК гена EGFP (рис. 13). В качестве контроля специфичности подавления экспрессии гена-мишени использовали олигонуклеотиды серии Ser, не обладающие существенной гомологией с последовательностью EGFP. Анализ подавления экспрессии гена EGFP оценивали по уровню флуоресценции клеток и уровню мРНК данного гена. Небольшое снижение экспрессии гена-мишени наблюдали при добавлении к клеткам простого дуплекса антисмыслового олигонуклеотида с холестерин-модифицированным stopper. Добавление к клеткам холестерин-модифицированного конкатемерного комплекса антисмыслового олигонуклеотида приводило к снижению флуоресценции

120 ■ 100 ■ 80 ■ во 40 20 ■ 0 / ■ii -• А -- -- гЬ i \ А

f / / / ^ / У / / / / / £ / / / / / J> (V «Р Ф / " # / /

Рис. 13. Уровень экспрессии гена EGFP в клетках линии BHK-IR780 через 72 ч после обработки ангасмысловым олигонуклеощдом Asi, холестериновым производным этого олигонуклеощца Asl-Chol, конкатемерными комплексами Asl/As2-Chol, комплексами, образованными между немодифинированным конкагемером Asl/As2 и дуплексом Asl/stopperAs-Chol, а также после трансфекции олигонуклеогида Asi с помощью Oligofectamine™. Sal - олигонуклеощд со случайной последовательностью, использованныи для оценки специфичности биологического действия, Scr2-Chol - холестерин-модифшдарованный олигонуклесггид-носитель для Scrl. Светлые столбцы - средний уровень флуоресценции клеток; темные столбцы - данные ОТ-ПЦР анализа (уровень мРНК EGFP). За 100% принят уровень экспрессии TmaEGFP в необработанных клетках.

клеток на 30% по отношению к контролю, при этом уровень мРНК EGFP снижался более чем на 40%. Эффективность подавления экспрессии гена-мишени в данном случае была сравнима с подавлением экспрессии EGFP антисмысловым олигонуклеотидом, доставляемым в клетки в комплексе с трансфектантом (Oligofectamine™).

Эффективность трансфекции НК в комплексах с конъюгатами полиэтиленимина с холестерином Катионный полимер PEI зарекомендовал себя как перспективное трансфецирующее НК соединение. Использование полиэтилениминов остается ограниченным в связи с меньшей эффективностью трансфекции по сравнению с вирусоподобными частицами, а также высоким цитотоксическим действием. В работах Фёргесона, Ванга и Хана было показано, что введение остатков холестерина в полиэтиленимин может приводить к снижению его побочного действия и повышению трансфецирующей активности. Нами было предложено провести

сравнительный анализ свойств конъюгатов 25 кДА 1РЕ1 с холестерином с разной степенью модификации Были исследованы производные полиэтиленимина РЕ1С0 5, РЕ1С1, РЕ1С5 и РЕ1С20, содержащие 0 5, 1, 5 и 20% модифицированных холестерином аминогрупп соответственно (рис 14), полученные в лаборатории Органического синтеза УРАН ИХБФМ СО РАН под руководством Сильникова Владимира Николаевича

Рис 14 Структура 1PEI (А) и его шнъюгага с холестерином РИС (Б) показана модификация первичной и вторичной аминогрупп

1 Влияние модификации холестерином на свойства конъюгатов

PEIC

Мы исследовали цитотоксичность полученных соединений по отношению к трем линиям опухолевых клеток человека (табл 2) Согласно данным МТТ-теста значения IC50 - т.е концентрации соединений, при которых выживает 50% обработанных клеток, увеличиваются с повышением степени модификации полимера Достоверное повышение IC50 по сравнению со значениями для немодифицированного полиэтиленимина, наблюдали на двух из трех линий клеток для PEIC1 и PEIC5 и на всех линиях клеток для PEIC20

Таблица 2 Значения IC50 (± стандартное отклонение) для исходного PEI и конъюгатов FEIC

Соединение IC50, hM

HeLa KB-3-1 293 Усредненное змчение

PEI 305125 ЗЗШ45 360±25 330125

РЕГО0.5 460*50 340145 300125 370150

PEIC1 340tí0 45Ш45 44Q¿55 410160

raes 460*30 53Q±20 390165 460±70

PEIC20 1300fcl00 1020Ы60 114Ф95 115Ш40

С помощью метода флуориметрического титрования для

исследуемых соединений были определены критические концентрации

мицеллообразования (ККМ) ККМ является важной характеристикой амфифильного соединения и представляет собой узкий интервал концентраций этого соединения между областью концентраций, в которой оно находится в основном в молекулярно-растворенном виде, и областью более высоких концентраций, в которой мицеллы находятся в равновесии с молекулами Видно, что с повышением количества остатков холестерина в молекуле значение ККМ снижается (рис 15) При этом все полученные значения ККМ выше значений 1С50, то есть в диапазоне концентраций, в котором РЕЮ малотоксичны, они не образуют мицеллоподобные структуры

Рис 15 Определение значений ККМ для исследуемых коньюшгов РЕЮ) 5-РШС20 Зависимость интенсивности флуоресценции раствора ЭРН от концентрации исследуемых катонных агенгоа По оси абсцисс отложены логарифмы концентраций катонных соединений в молях, по оси ординат - интенсивность флуоресценщш раствора БРН в от. ед. на длине волны 430нм при указанной концентрации соединений.

2 Исследование трансфицирующих свойств РЕЮ Эффективность трансфекции в клетки флуоресцентно-меченого олигонуклеотида и плазмиды, экспрессирующей БОБР, с помощью РЕЮ оценивали с помощью метода проточной цитометрии, определяя количество трансфицированных клеток и средний уровень флуоресценции клеток в обработанной популяции (рис 16) В случае трансфекции олиго-

■4о' -¿в' -¿2 -43 ' -44 ЫРЕ1С11

-во -56 -52 -48 -44 ЩРВСО В]

-ТО 6 5 60 -55 50 1ЯРЕ1С51

-70 -65 60 -55 -50 <ВртЕ1С20/

А. Трансфекция FITC-меченого олигонуклеотида

sí 100

О (О 2 л 75

= ш 50

£ §

■е- 25

л е- 0

гЬ

| 200 х

I '50

I <<х> $

Í 50

3S*]

rfi

РВ PEIC0.5 PEICt PEIC5 Б. Трансфекция плазмиды pEGFP-C2

PEI PEIC0.5 PSCÍ РЕЮ5 РВС20

Г1 , Пг

IÍ1

PEIC0.5 PEICÍ РЕЮ5 PEIC20

РЕ/СО, 5 РЕЮ1 РЕЮ 5 PEIC2Q

Рис. 16 Трансфекция ЕГГС-меченого олигонуклешцда в клетки линии HeLa (А) и плазмицы pEGFP-C2 в клетки линии 293 (Б) с помощью PEI и коньюгашв РИС. Результаты цтофлуориметрического анализа' "S-"- трансфекция в среде без сыворотки; "S+" -трана})екция в среде с 10% эмбриональной сывороткой. 1. - количество трансфицированньк клеток, относительно общего количества проанализированных клеток. 2. - средняя интенсивность флуоресценции трансфицированньк клеток. За 100% принята интенсивность зеленого сигнала в клетках, трансфицированньк в присутствии PEI в среде без сыворотки.

нуклеотида, процент трансфецированных клеток в препарате был достаточно высоким для всех соединений, при этом наибольшее количество олигонуклеотида проникало в клетки в присутствии соединения PEIC1. При трансфекции плазмиды в клетки с помощью тестируемых соединений наблюдали различия как в количестве трансфицированных клеток, так и в эффективности экспрессии доставляемого гена. При этом наилучший результат также был показан для соединения PEIC1. Следует отметить, что в отличие от трансфекции олигонуклеотида, эффективность трансфекции плазмиды существенно снижалась в присутствии сыворотки в среде.

С помощью флуоресцентной микроскопии мы оценивали, влияет ли введение остатков холестерина в полимер на внутриклеточное распределение трансфекционных комплексов полимера с НК (рис. 17). Было обнаружено, что как при использовании немодифицированного PEI, так и для всех конъюгатов PEIC распределение трансфекционных

Рис. 17. Анализ внутриклеточной локализации FITC-меченого олигонуклеотида. трансфицированного в клетки с помощью PEI и РЕ1С. Фотографии микропрепаратов (стандартная флуоресцентная микроскопия) клеток линии HeLa через 4 ч после трансфекции FITC-меченого олигонуклеотида (зеленое свечение) в комплексе с: 1. - PEI; 2. - PEIC0.5; 3. - PEIC1; 4. - PEIC5; 5. -PEIC20; 6. -контроль (нетрансфицированные клетки). (А) Клетки окрашены только Hoechst33258 (синий) - окраска ядер; (Б) клетки окрашены Hoechst33258 (синий) и Phalloidin-TRITC (красный) - окраска цитоскелета.

комплексов полимера с FITC-меченым олигонуклеотидом в клетках не различается. При этом в случае использования немодифицированного PEI и конъюгатов PEIC с низкой степенью модификации наблюдалось образование более крупных включений в цитоплазме клеток, чем для PEIC20, что может быть связано с меньшей эффективностью упаковки НК

Рис. 18. Уровень экспрессии гена EGFP в клетках линии BHK-IR780 через 72 ч после трансфекции siPHK в клетки с помощью PEI и конъюгатов PEIC. Данные цитофлуориметрического анализа, показывающие средний уровень флуоресценции клеток ("S-"- трансфекция в среде без сыворотки; "S+" - трансфекция в среде с 10% эмбриональной сывороткой). За 100% принят уровень экспрессии гена EGFP в клетках, обработанных средой, не содержащей siPHK и трансфектанты.

(Ч И) (31 т

- (

«1 ISI (SI ISI

* * . > 1 С МкМ 1С У1.У 1—i

Эффективность трансфекции siPHK в комплексе с тестируемыми соединениями оценивали по уровню подавления экспрессии гена EGFP Введение siPHK (siMedl 2) к EGFP в клетки в комплексе с конъюгатами PEIC приводило к снижению флуоресценции клеток на 45-50%, при этом, эффективность подавления экспрессии гена EGFP мало различалась для всех исследуемых соединений (рис 18) Отсутствие подавления экспрессии гена-мишени при обработке клеток комплексами тестируемых соединений с silntron, негомологичной мРНК гена EGFP свидетельствует

0 специфичности наблюдаемого воздействия Присутствие сыворотки в культуральной среде оказывало существенное негативное влияние на трансфицирующую активность немодифицированного PEI и в меньшей степени (снижение эффективности действия siPHK вдвое) - на трансфекцию с использованием PEIC

ВЫВОДЫ

1 Исследовано образование конкатемерных комплексов немодифицированных и холестерин-модифицированных олигонуклеотидов с перекрывающимися взаимокомплементарными последовательностями в растворе Показано, что

- наиболее эффективно формирование конкатемеров происходит в присутствии ионов К+ и Mg2+ в концентрациях, близких к физиологическим, при эквимолярном соотношении олигонуклеотидов обеих цепей в отсутствие stopper-олигонуклеотидов;

- присоединение холестерина к 5'-концу одного из олигонуклеотидов конкатемер-образующей пары не приводит к термодинамической дестабилизации дуплекса, но препятствует образованию длинных конкатемерных комплексов

2 Исследовано взаимодействие конкатемерных комплексов олигонуклеотидов с опухолевыми клетками различных линий Показано, что

опухолевые клетки связывают олигонуклеотиды в составе конкатемерных комплексов более эффективно, чем одноцепочечные олигонуклеотиды,

холестерин-модифицированные и немодифицированные конкатемерные комплексы олигодезоксирибонуклеотидов являются нетоксичными для клеток и не вызывают индукции экспрессии

маркеров интерферонового ответа при использовании в концентрации до 10 мкМ включительно,

- доставка антисмыслового олигонуклеотида в клетки в форме конкатемера приводит к специфическому подавлению экспрессии гена-мишени - уровень снижения мРНК гена-мишени составил 46%, что сравнимо с подавлением экспрессии того же гена олигонуклеотидом, доставляемым с помощью коммерчески доступного трансфектанта

3 Исследованы свойства и трансфицирующая активность по отношению к НК конъюгатов полиэтиленимина с холестерином (РЕЮ), содержащих 0 520% модифицированных аминогрупп

- определены значения 1С50 для исследуемых соединений для трех линий опухолевых клеток, показано, что для конъюгатов PEIC с ростом степени модификации холестерином происходит существенное снижение их цитотоксичности,

- определены критические концентрации мицеллообразования (ККМ) исследуемых конъюгатов и показано, что значения ККМ уменьшаются для конъюгатов PEIC с ростом степени модификации холестерином,

- показано, что все исследованные конъюгаты PEIC способствуют проникновению НК в опухолевые клетки, при этом конъюгаты PEIC с низкой степенью модификации холестерином (менее 5%) более эффективно доставляют НК в клетки, чем немодифицированный PEI и конъюгаты со степенью модификации более 5%, присутствие сыворотки в среде не снижает эффективность трансфицирующего действия исследуемых конъюгатов PEIC в отношении олигонуклеотидов, но снижает их эффективность в отношении пДНК и siPHK

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1 Simonova O.N., Vladimirova А V , Zenkova M А, Vlassov V V, Enhanced cellular binding of concatemeric oligonucleotide complexes // Biochim Biophys Acta -2006 -V 1758 -№3 -P 413-418

2 Gusachenko (Simonova) O.N., Pyshniy DV., Vlassov V.V, Zenkova M A, Modified concatemeric oligonucleotide complexes new system for efficient oligonucleotide transfer into mammalian cells // Human Gene Ther — 2008 -V 19 -№15 -P 532-546

3 Гусаченко O.H.. Зенкова M A, Полимерные трансфектанты нуклеиновых кислот на основе гидрофобных и амфифильных производных полиэтилениминов // Сборник материалов конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, Арта 2008) С 116123

Подписано к печати 12 сентября 2008г

Тираж 100 экз Заказ № 743 Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел 335-66-00

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гусаченко, Олеся Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИХ ПРОНИКНОВЕНИЯ В ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ К ЛЕТКИ

1.1. Введение: препараты на основе нуклеиновых кислот (НК).

1.2. Влияние структуры НК на эффективность их проникновения в эукариотические клетки.

1.2.1. Механизмы естественного транспорта НК в эукариотические клетки.

1.2.1.1. Исследования механизмов проникновения НК в клетки in vitro.

1.2.1.2. Исследования проникновения НКв клетки in vivo.

1.1.2. Влияние химических модификаций на взаимодействие олигонуклеотидов с эукариотическими клетками.

1.1.2.1. Модифицированные аналоги олигонуклеотидов.

1.1.2.2. Влияние введения лгтофилъных групп на захват олигонуклеотидов клетками.

1.1.2.3. Введение адресующих молекул в состав олигонуклеотидов.

1.1.3. Влияние образования супрамолекулярпых структур НК на взаимодействие с клетками.

1.1.3.1. Трансфекция в двуцепочечпой форме.

1.1.3.2. Агрегация олигонуклеотидов с G-богатыми последовательностями.

1.1.3.2. РНК-наночастицы.

1.2. Конденсация НК и образование комплексов с полиэтилиниминами как эффективный метод трансфекции.

1.2.2. Влияние структуры РЕ1 и условий образования комплексов с НК на эффективность трансфекции НК.

1.2.3. Модификации РЕ1.

1.2.3.1. Гидрофильные полимеры.

1.2.3.2. Биодеградируемые сополимеры.

1.2.3.3. Гидрофобные и амфифилъные полимеры.

1.2.3.4. Присоединение тканеспецифическнх лигандов.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы и препараты.

2.1.2. Оборудование.

2.1.3. Клеточные линии.

2.1.4. Олигонуклеотиды.

2.1.5. Растворы и буферы, использованные в работе.

2.2. Методы.

2.2.1. Гель-электрофорез.

2.2.1.1. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях.

2.2.1.2. Нативный электрофорез в ПААГ.

2.2.1.3. Электрофорез в агарозном геле.

2.2.2. Синтез холестериновых производных олигонуклеотидов.

2.2.3. Введение [ Р]-содержащей фосфатной группы по 5 '-концу олигонуклеотида

2.2.4. Введение остатка флуоресцеина по 5'-концу олигонуклеотида.

2.2.5. Получение конкатемерных комплексов.

2.2.6. Приготовление дуплексов si РНК.

2.2.7. Определение температур плавления конкатемерных комплексов.

2.2.8. Определение критической концентрации мицеллообразования (ККМ).

2.2.9. МТТ-тест.

2.2.10. Трансфекция НК в клетки.

2.2.10.1. Трансфекция с помощью PEIC и коммерчески доступных трансфектантов.

2.2.10.2. Трансфещия олигонуклеотидов в свободной форме и в форме супрамолекулярпых комплексов.

2.2.11. Измерение эффективности связывания олигонуклеотидов с клетками.

2.2.12. Микроскопический анализ.

2.2.13. Определение уровня экспрессии EGFP в клетках.

2.2.13.1. Спектрофлуориметрическое измерение флуоресценции клеток.

2.2.13.2. Измерение суммарной концентрации белка.

2.2.14. Проточная цитофлуориметрия.

2.2.15. Выделение суммарной клеточной РНК.

2.2.16. Измерение уровня экспрессии определенных генов в культивируемых клетках методом ОТ-ПЦР.

2.2.16.1. Получение кДНК.

2.2.16.2. ПЦР.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ: СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ НК КАК ЭФФЕКТИВНЫЕ СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ В ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ.

3.1. Предобразование супрамолекулярных комплексов НК как способ трансфекции.

3.1.1. Образование олигонуклеотидами конкатемерных комплексов в растворе.

3.1.1.2. Влияние состава буферного раствора и условий инкубации на образование конкатемерных комплексов.

3.1.1.3. Влияние состава смеси олигонуклеотидов на размер образующихся комплексов.

3.1.2. Определение эффективности связывания конкатемерных комплексов олигонуклеотидов с опухолевыми клетками.

3.1.2.1. Описание используемых клеточных линий.

3.1.2.2. Уровень связывания конкатемерных комплексов и одноцепочечных олигонуклеотидов с клетками различных линий.

3.1.2.3. Кинетическая и концентрационная зависимости связывания с клетками конкатемерных комплексов олигонуклеотидов.

3.1.2.4. Влияние длины конкатемеров на эффективность связывания с клетками

3.1.3. Получение холестерин-модифицированных конкатемерных комплексов и их взаимодействие с эукариотическими клетками.

3.1.3.1. Эффективность образования конкатемеров холестерин-модифицированными аналогами олигонуклеотидов.

3.1.3.2. Определение цитотоксичности конкатемеров и влияния обработки клеток конкатемерами на индукцию генов-маркеров интерферонового ответа.

3.1.3.3. Эффективность проникновения олигонуклеотидов в клетки в составе холестерин-модифицированных конкатемеров.

3.1.3.4. Внутриклеточная локализация олигонуклеотидов, доставляемых в клетки в составе холестерин-модифицированных конкатемеров.

3.1.3.5. Подавление экспрессии гена-мишени с помощью антисмыслового олигонуклеотида, доставляемого в клетки в составе холестерин-модифицированного конкатемерного комплекса.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Супрамолекулярные комплексы нуклеиновых кислот как эффективные системы трансфекции клеток"

Исследование возможности транспорта нуклеиновых кислот (НК) и их химически модифицированных аналогов в эукариотические клетки является одной из фундаментальных задач современной молекулярной биологии и фармакологии. Интерес к этому вопросу связан с появлением и разработкой нового класса высокоспецифичных терапевтических препаратов на основе НК. Такие препараты рассматриваются как потенциальные биологически активные вещества, способные направленно подавлять экспрессию или напротив, восстанавливать функцию строго определенных генов-мишеней. Использование препаратов на основе НК особенно привлекательно для лечения заболеваний, вызванных дисфункцией одного или нескольких известных генов, а также в случае необходимости направленного действия на продукты генов, кодирующих так называемые "немедикамептируемые" мишени, например, небольшие пептиды или моноклональные антитела [1, 2, 3, 4]. Эффективное применение НК в качестве терапевтических агентов осложнено рядом обстоятельств, включающим их подверженность деградации экзо- и эндогенными нуклеазами и низкую эффективность их транспорта к сайтам направленного действия [5, 6, 7]. Если проблема биодеградации может быть по крайней мере частично решена путем введения в структуру НК различных химических модификаций, то вопрос об эффективном и направленном транспорте молекул НК в клетки-мишени на сегодняшний день остается открытым [8, 9, 10].

Природные молекулы НК представляют собой полианионы, что затрудняет их прохождение через липидные мембраны эукариотических клеток. Известно, что образование НК некоторых супрамолекулярных структур, например, квадруплексов, а также наличие в их составе определенных нуклеотидных последовательностей, приводит к повышению эффективности транспорта НК в клетки [11, 12, 13, 14]. Поиск супрамолекулярных комплексов НК, обладающих повышенным сродством к клеточной поверхности, может привести к разработке новых систем трансфекции.

Существует обширный спектр искусственных методов трансфекции клеток препаратами на основе НК. Наиболее эффективными среди них являются механические и вирусные методы. Механические методы связаны с высоко трудоемкими и сложными процедурами (особенно при использовании in vivo) и могут оказаться крайне болезненными, а применение вирусных и вирусоподобных частиц ограничено в отношении размера доставляемых молекул НК. Кроме того, вирусные методы трансфекции могут представлять потенциальную опасность для живого организма (иммуногенность, онкотрансформирующая активность) [15, 16, 17]. В связи с этим, особое внимание исследователями уделяется разработке так называемых биохимических методов трансфекции. Одним из классов биохимических трансфектантов являются катионные полимеры, обладающие способностью взаимодействовать с молекулами НК с образованием высоко конденсированных частиц. Среди основных преимуществ катионных полимеров перед вирусными системами трансфекции можно назвать относительную легкость и меньшую стоимость их получения, стабильность при хранении, отсутствие ограничения на максимальный размер упаковываемой в полиплекс молекулы НК, возможность введения дополнительных структурных групп в состав полимера. Использование поликатионных трансфектантов остается ограниченным в связи с меньшей эффективностью трансфекции по сравнению с вирусоподобными частицами, а также довольно высоким токсическим действием, и пока не дошло до стадии клинических испытаний [10, 18, 19].

Несмотря на большое разнообразие подходов, применяемых для повышения эффективности трансфекции НК в клетки, можно отметить, что в целом основная часть исследований в данной области направлена на упаковку НК в различного рода супрамолекулярные комплексы, состоящие, как только из молекул самих НК или их конъюгатов со вспомогательными группами, так и из нековалентных ассоциатов доставляемых IIK с биологически активными молекулами разной природы. Помимо организации в компактные структуры, обладающие повышенной способностью взаимодействовать с клеточной поверхностью, для эффективного проникновения получаемых комплексов внутрь клетки зачастую используется введение в их состав групп липофильной природы, обеспечивающих желаемое взаимодействие с гидрофобной частью цитоплазматической мембраны [20, 21].

Целью настоящей работы являлось изучение супрамолекулярных конкатемерных комплексов олигонуклеотидов, содержащих липофильные группы, в качестве новой системы для эффективной трансфекции клеток, а также исследование трансфицирующей активности конъюгатов поликатионного трансфектанта полиэтиленимина, содержащих разное количество липофильных групп, по отношению к разным молекулам НК. В ходе исследования решались следующие задачи:

- Исследовать закономерности образования супрамолекулярных комплексов олигонуклеотидами с перекрывающимися взаимокомплементарными последовательностями и оценить влияние введения липофильных групп в конкатемер-образующие олигонуклеотиды на эффективность формирования супрамолекулярных комплексов.

- Исследовать влияние образования олигонуклеотидами конкатемерных комплексов на их взаимодействие с опухолевыми клетками.

- Исследовать биологическую активность олигонуклеотидов, доставляемых в клетки в виде супрамолекулярного комплекса.

- Исследовать влияние степени модификации холестерином на способность к мицеллообразованию и цитотоксичность конъюгатов полиэтиленимина с холестерином.

- Исследовать корреляцию между степенью модификации аминогрупп полиэтиленимина холестерином и эффективностью трансфекции НК различной длины в опухолевые клетки.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гусаченко, Олеся Николаевна

выводы

1) Исследовано образование конкатемерных комплексов немодифицированных и холестерин-модифицированных олигонуклеотидов с перекрывающимися взаимокомплементарными последовательностями в растворе. Показано, что:

2) Исследовано взаимодействие конкатемерных комплексов олигонуклеотидов с опухолевыми клетками различных линий. Показано, что:

- опухолевые клетки связывают олигонуклеотиды в составе конкатемерных комплексов более эффективно, чем одноцепочечные олигонуклеотиды;

- добавление к клеткам конкатемерного комплекса, образованного между доставляемым олигонуклеотидом и холестерин-модифицированным олигонуклеотидом второй цепи, приводит к проникновению доставляемого олигонуклеотида в клетки; холестерин-модифицированные и немодифицированные конкатемерные комплексы олигодезоксирибонуклеотидов являются нетоксичными для клеток и не вызывают индукции экспрессии маркеров интерферонового ответа при использовании в концентрации до 10 мкМ включительно;

3) Исследованы свойства и трансфицирующая активность по отношению к НК конъюгатов полиэтиленимина с холестерином (РЕЮ), содержащих 0.5-20% модифицированных аминогрупп:

- определены значения IC50 для исследуемых соединений для трех линий опухолевых клеток, показано, что для конъюгатов РЕЮ с ростом степени модификации холестерином происходит существенное снижение их цитотоксичности;

- определены критические концентрации мицеллообразования (ККМ) исследуемых конъюгатов и показано, что значения ККМ уменьшаются для конъюгатов РЕЮ с ростом степени модификации холестерином;

3.2.3. Заключение

25 кДа 1PEI был охарактеризован многими авторами как полимер, способный трансфицировать НК в клетки и обладающий меньшей цитотоксичностью, чем разветвленные PEI с близким молекулярным весом [16], Оптимизация условий трансфекции с помощью 1PEI 25 кДа позволила получить высокую эффективность доставки НК in vitro при меньшем токсическом действии по сравнению таким трансфектантом, как Lipofectamine 2000™ [286]. В то же время было показано, что наибольший уровень трансфекции с использованием PEI наблюдается при высоких значениях соотношения N/P, для которых характерна и высокая цитотоксичность полимера. Одним из наиболее широко применяемых методов модуляции свойств PEI является присоединение различных вспомогательных групп по аминогруппам полимера. Из литературных данных известно множество модифицированных аналогов PEI, полученных на основе bPEI различного молекулярного веса, тогда как для 1PEI количество исследований такого рода много меньше. Конъюгаты PEI, содержащие липофильные заместители, были получены с использованием как разветвленных, так и линейных PEI; было показано, что такие соединения обладают повышенной эффективностью трансфекции относительно исходных полимеров [227, 231, 234]. При этом влияние присоединения липофильных заместителей на цитотоксичность полимеров было неоднозначно и различалось для конъюгатов, полученных разными исследовательскими группами [232]. Конъюгаты bPEI и 1PEI с холестерином, описанные в литературе, содержали не более двух остатков холестерина на молекулу PEI. Анализа влияния степени модификации холестерином на трансфицирующие и цитотоксические свойства полимера ранее не проводилось. Также не была исследована эффективность трансфекции конъюгатами PEI с холестерином НК различного типа. В представленной работе мы предполагали исследовать свойства конъюгатов 25 кДа 1PEI с холестерином, содержащих от 0.5 до 20% модифицированных холестерином аминогрупп, с целью определить оптимальную степень модификации для получения более эффективного трансфектанта.

Сравнение свойств конъюгатов РЕЮ с различным количеством остатков холестерина показало, что с ростом процента модификации наблюдается повышение гидрофобности этих соединений и существенное снижение их цитотоксичности. Тесты на цитотоксичность выявили, что конъюгат РЕЮ20 обладает существенно меньшим (повышение значения Ю50 в 3-4 раза) токсическим действием на клетки, чем исходный PEI. В случае конъюгатов PEIC0.5, РЕЮ1 и РЕЮ5 количество живых клеток различных линий после обработки данными соединениями было достаточно вариабельно, при этом наблюдалось небольшое понижение цитотоксического эффекта по сравнению с немодифицрованным полимером. При сравнении этих результатов с данными по исследованию способности полученных конъюгатов PEI с холестерином к мицеллообразованию можно заметить, что существенное увеличение гидрофобности конъюгатов (снижение значения ККМ) наблюдается при переходе от 1 к 5% модификации холестерином, в то время как ярко выраженное понижение цитотоксичности было обнаружено при повышении степени модификации от 5 до 20% аминогрупп. Модификация большего количества аминогрупп PEI приводит к изменению заряда полимера, что, по-видимому, является основной причиной пониженной цитотоксичности конъюгата PEIC20. Несколькими авторами было выдвинуто предположение, что присоединение к PEI липофильной группы также может привести к снижению его токсического действия на клетки благодаря экранирующему эффекту липофильных остатков по отношению к немодифицированным аминогруппам полимера [193, 235]. Наблюдаемое нами снижение цитотоксичности конъюгатов с низкой степенью модификации холестерином может в некоторой степени послужить подтверждением этой гипотезы. Важно отметить, что ни для одного из исследованных конъюгатов PEIC не наблюдается повышения токсического действия на клетки по сравнению с исходным полимером, которое было показано для конъюгатов с холестерином bPEI малого молекулярного веса [232].

Влияние присоединения холестерина к PEI на трансфицирующую активность полимера складывается из нескольких факторов. С одной стороны, присутствие остатков холестерина повышает эффективность взаимодействия с биологическими мембранами и, возможно, направляет процесс эндоцитоза полиплексов PEIC/HK по пути рецептор-опосредованного механизма. С другой стороны, уменьшение количества заряженных аминогрупп в полимере, а также возможное экранирование остатками холестерина немодифицированных аминогрупп, вероятно, оказывает негативное воздействие на способность полимера компактизовать НК, а также на эндосомолитическую активность. Мы исследовали доставку НК различного типа в опухолевые клетки млекопитающих с помощью конъюгатов PEIC0.5, PEIC1, PEIC5, PEIC20 и немодифицированного PEI 25 кДа, оценивая эффективность трансфекции по количеству трансфицированных клеток, уровню проникновения НК в трансфицируемые клетки и биологической активности доставляемых НК. Также было исследовано влияние присоединения холестерина на внутриклеточную локализацию полиплексов. Нами было обнаружено, что модификация холестерином не приводит к изменению внутриклеточного распределения комплексов PEIC/HK. Наличие более крупных флуоресцентных включений в цитоплазме клеток при использовании полиплексов конъюгатов с низкой степенью модификации может иметь два отчасти противоположных объяснения. Известно, что полиплексы 1PEI/HK склонны к агрегации в более крупные частицы [16]. Присоединение остатков холестерина по аминогруппам полимера может частично препятствовать такой агрегации. Однако, поскольку при использовании высокой степени модификации PEI происходит существенное уменьшение количества протонируемых групп в полимере, присоединение холестерина также может снижать компактизующую способность образуемого конъюгата (PEIC20) по отношению к НК.

В целом, при сопоставлении эффективности трансфекции в присутствии конъюгатов PEIC с разной степенью модификации холестерином наблюдается повышение трансфицирующей активности соединений с малым количеством остатков холестерина. Конъюгаты PEIC, содержащие 5% и 20% модифицированных аминогрупп, показали меньшую трансфицирующую способность и сниженную цитотоксичность, что может быть связано с уменьшением количества протонируемых аминогрупп в полимере. Конъюгат PEIC1 продемонстрировал наибольшую эффективность трансфекции среди протестированного ряда соединений. Доставка пДНК в клетки в комплексе с PEIC1 приводит к трансфекции втрое большего количества клеток, чем при использовании немодифицированного 25 кДа PEI, а в случае трансфекции одноцепочечного олигонуклеотида наблюдается двукратное повышение наблюдаемого количества олигонуклеотида в трансфицированных клетках. Конъюгат PEIC1 также обладает меньшим цитотоксическим действием, чем исходный полимер (повышение IC50 в среднем на >20%). На основании приведенных данных, конъюгат PEIC1 может быть рекомендован для использования в лабораторных целях в качестве эффективного трансфектанта для доставки НК различного размера в эукариотические клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гусаченко, Олеся Николаевна, Новосибирск

1. Opalinska J.В. and Gewirtz A.M. Nucleic-acid therapeutics: basic principles and recent applications // Nat. Rev. Drug Discov. 2002. V. 1. № 7. P. 503-514.

2. Kalota A., Dondeti V.R. and Gewirtz A.M. Progress in the development of nucleic acid therapeutics // Handb. Exp. Pharmacol. 2006. № 173. P. 173-196.

3. Tafech A., Bassett Т., Sparanese D. and Lee C.H. Destroying RNA as a therapeutic approach // Curr. Med. Chem. 2006. V. 13. № 8. P. 863-881.

4. Wagner E. Advances in cancer gene therapy: tumor-targeted delivery of therapeutic pDNA, siRNA, and dsRNA nucleic acids // J. BUON. 2007. V. 12 Suppl 1. P. S77-S82.

5. Jaaskelainen I., Honkakoski P. and Urtti A. In vitro delivery of antisense oligonucleotides // Cell Mol. Biol. Lett. 2002. V. 7. № 2. P. 236-237.

6. Chonn A. and Cullis P.R. Recent advances in liposomal drug-delivery systems // Curr. Opin. Biotechnol. 1995. V. 6. № 6. P. 698-708.

7. Thomas M. and Klibanov A.M. Conjugation to gold nanoparticles enhances polyethylenimine's transfer of plasmid DNA into mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. V. 100. № 16. P. 9138-9143.

8. Patil S.D., Rhodes D.G. and Burgess D.J. DNA-based therapeutics and DNA delivery systems: a comprehensive review// AAPS. J. 2005. V. 7. № 1. P. E61-E77.

9. Schiffelers R.M., de Wolf H.K., van Rooy I. and Storm G. Synthetic delivery systems for intravenous administration of nucleic acids //Nanomed. 2007. V. 2. № 2. P. 169-181.

10. Eliyahu #., Barenholz Y. and Domb A.J. Polymers for DNA delivery // Molecules. 2005. V.10. № l.P. 34-64.

11. Lehmann M.J. and Sczakiel G. Spontaneous uptake of biologically active recombinant DNA by mammalian cells via a selected DNA segment // Gene Ther. 2005. V. 12. № 5. P. 446-451.

12. Suzuki K., Doi Т., Imanishi Т., Kodama T. and Tanaka T. Oligonucleotide aggregates bind to the macrophage scavenger receptor // Eur. J. Biochem. 1999. V. 260. № 3. P. 855-860.

13. Wu C.C., Castro J.E., Motta M., Cottam H.B., Kyburz D., Kipps T.J., Corr M. and Carson D.A. Selection of oligonucleotide aptamers with enhanced uptake and activation of human leukemia В cells // Hum. Gene Ther. 2003. V. 14. № 9. P. 849-860.

14. Yanze M.F., Lee W.S., Poon K., Piquette-Miller M. and Macgregor R.B., Jr. Cellular uptake and metabolism of DNA frayed wires // Biochemistry 2003. V. 42. № 39. P. 11427-11433.

15. Kushibiki T. and Tabata Y. A new gene delivery system based on controlled release technology // Curr. Drug Deliv. 2004. V. 1. № 2. P. 153-163.

16. Lungwitz U., Breunig M., Blunk T. and Gopferich A. Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2005. V. 60. № 2. P. 247-266.

17. Marshall E. Gene therapy death prompts review of adenovirus vector // Science 1999. V. 286. № 5448. P. 2244-2245.

18. Li S.D. and Huang L. Non-viral is superior to viral gene delivery // J. Control Release 2007. V. 123. №3. P. 181-183.

19. Luten J., van Nostrum C.F., De Smedt S.C. and Hennink W.E. Biodegradable polymers as non-viral carriers for plasmid DNA delivery // J. Control Release 2007.

20. Blagbrough I.S., Geall A.J. and Neal A.P. Polyamines and novel polyamine conjugates interact with DNA in ways that can be exploited in non-viral gene therapy // Biochem. Soc. Trans. 2003. V. 31. № 2. P. 397-406.

21. Lorenz C., Hadwiger P., John M., Vornlocher H.P. and Unverzagt C. Steroid and lipid conjugates of siRNAs to enhance cellular uptake and gene silencing in liver cells // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004. V. 14. № 19. P. 4975-4977.

22. Crooke S.T. An overview of progress in antisense therapeutics // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1998. V. 8. № 2. P. 115-122.

23. Stull R.A. andSzoka F.C., Jr. Antigene, ribozyme and aptamer nucleic acid drugs: progress and prospects // Pharm. Res. 1995. V. 12. № 4. P. 465-483.

24. Baker B.F. The role of antisense oligonucleotides in the wave of genomic information // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2001. V. 20. № 4-7. P. 397 -399.

25. Tamm I. and Wagner M. Antisense therapy in clinical oncology: preclinical and clinical experiences // Mol. Biotechnol. 2006. V. 33. № 3. P. 221-238.

26. Vaish N.K., Kore A.R. and Eckstein F. Recent developments in the hammerhead ribozyme field // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. № 23. P. 5237-5242.

27. Vlassov V. V., Balakireva L.A. and Yakubov L.A. Transport of oligonucleotides across natural and model membranes // Biochim. Biophys. Acta 1994. V. 1197. № 2. P. 95-108.

28. Amyere M., Mettlen M., Van Der Smissen P., PlatekA., Payrastre В., Veithen A. and Courtoy P.J. Origin, originality, functions, subversions and molecular signalling of macropinocytosis // Int. J. Med. Microbiol. 2002. V. 291. № 6-7. P. 487-494.

29. Conner S.D. and Schmid S.L. Regulated portals of entry into the cell // Nature. 2003. V. 422. № 6927. P. 37-44.

30. Parton R.G., Joggerst B. and Simons K. Regulated internalization of caveloae // J. Cell Biol. 1994. V. 127. № 5. P. 1199-1215.

31. Matveev S., Li X., Ever son W. and Smart E.J. The role of caveolin in vesicle-dependent and vesicle-independent trafficking // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. № 21. P. 5609-5616.

32. Ferrari A., Pellegrini V., Arcangeli C, Fittipaldi A., Giacca M. And Beltram F. Caveolae-mediated internalization of extracellular HIV-1 tat fusion proteins visualized in real time // Mol. Ther. 2003. V. 8. № 2. P. 284-294.

33. Khalil I.A., Kogure K., Akita H. and Harashima H. Uptake pathways and subsequent intracellular trafficking in nonviral gene delivery // Pharmacol. Rev. 2006. V. 58. № 1. P. 32-45.

34. Loke S.L., Stein С.A., Zhang X.H., Mori K., Nakanishi M., Subasinghe C., Cohen J.S. and Neckers L.M. Characterization of oligonucleotide transport into living cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989. V. 86. № ю. P. 3474-3478.

35. Yakubov L.A., Deeva E.A., Zarytova V.F., Ivanovo E.M., Ryte A.S., Yurchenko L.V. and Vlassov V. V. Mechanism of oligonucleotide uptake by cells: involvement of specific receptors? // Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 1989. V. 86. № 17. P. 6454-6458.

36. Gottlieb T.A., Ivanov I.E., AdesnikM. and Sabatini D.D. Actin microfilaments play a critical role in endocytosis at the apical but not the basolateral surface of polarized epithelial cells // J. Cell Biol. 1993. V. 120. № 3. P. 695-710.

37. Herz J. and Strickland D.K. LRP: a multifunctional scavenger and signaling reccptor // J. Clin. Invest. 2001. V. 108 № 6 P. 779-784.

38. Chelobanov B.P., Laktionov P.P. and Vlassov V.V. Proteins involved in binding and cellular uptake of nucleic acids // Biochemistry (Mosc.). 2006. V. 71. № 6. P. 583-596.

39. Bennett R.M., Gabor G.T. and Merritt M.M. DNA binding to human leukocytes. Evidence for a receptor-mediated association, internalization, and degradation of DNA // J. Clin. Invest 1985. V. 76. № 6. P. 2182-2190.

40. Hefeneider S.H., Bennett R.M., Pham Т.О., Cornell K., McCoy S.L. and Heinrich M.C. Identification of a cell-surface DNA receptor and its association with systemic lupus erythematosus // J. Invest Dermatol. 1990. V. 94. № 6 Suppl. P. 79S-84S.

41. Shi F., Gounko N.V., Wang X., Ronken E. and Hoekstra D. In situ entry of oligonucleotides into brain cells can occur through a nucleic acid channel // Oligonucleotides. 2007. V. 17. № 1. P. 122-133.

42. Leal-Pinto E., Teixeira A., Tran В., Hanss B. and Klotman P.E. Presence of the nucleic acid channel in renal brush-border membranes: allosteric modulation by extracellular calcium // Am. J. Physiol Renal Physiol 2005. V. 289. № 1. P. F97-106.

43. Hanss В., Leal-Pinto E., Bruggeman L.A., Copeland T.D. and Klotman P.E. Identification and characterization of a cell membrane nucleic acid channel // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1998. V. 95. № 4. P. 1921-1926.

44. Budker V., Budker Т., Zhang G., Subbotin V., Loomis A. and Wolff J.A. Hypothesis: naked plasmid DNA is taken up by cells in vivo by a receptor-mediated process // J. Gene Med. 2000. V. 2. № 2. P. 76-88.

45. Vlasov V. V., Nechaeva M. V., Baiborodin S.I., Shestova O.E., Safronov I. V., Koshkin A.A. and Iakubov L.A. Oligonucleotides absorbed by a cell quickly accumulate in the nucleus. // Dokl. Akad. Nauk 1995. V. 345. № 1. P. 123-126.

46. Gasparro F.P., Dall'Amico R., O'Malley M, Heald P.W. and Edelson R.L. Cell membrane DNA: a new target for psoralen photoadduct formation // Photochem. Photobiol. 1990. V. 52. № 2. P. 315-321.

47. Hagstrom J.E., Rybakova I.N., Staeva Т., Wolff J.A. and Ervasti J.M. Nonnuclear DNA binding proteins in striated muscle // Biochem. Mol. Med. 1996. V. 58. № 1. P. 113-121.

48. Levy M.Y., Barron L.G., Meyer K.B. and Szoka F.C., Jr. Characterization of plasmid DNA transfer into mouse skeletal muscle: evaluation of uptake mechanism, expression and secretion of gene products into blood // Gene Ther. 1996. V. 3. № 3 . P. 201-211.

49. Yao G.Q., Corrias S. and Cheng Y.C. Identification of two oligodeoxyribonucleotide binding proteins on plasma membranes of human cell lines // Biochem. Pharmacol. 1996. V. 51. № 4. P. 431-436.

50. Geselowitz D.A. and Neckers L.M. Analysis of oligonucleotide binding, internalization, and intracellular trafficking utilizing a novel radiolabeled crosslinker // Antisense Res. Dev. 1992. V. 2. № l.P. 17-25.

51. Laktionov P.P., Dazard J.E., Vives E., Rykova E.Y., Piette J., Vlassov V.V. and Lebleu B. Characterisation of membrane oligonucleotide-binding proteins and oligonucleotide uptake in keratinocytes // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. № 11. P. 2315-2324.

52. Laktionov P.P., Chelobanov B.P., Rykova E.Y. and Vlassov V.V. Interaction of oligonucleotides with cellular proteins // Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acids. 2001. V. 20. № 4-7. P. 859-862.

53. Chelobanov B.P., Laktionov P.P., Kharkova M. V., Rykova E.Y. and Vlassov V. V. Isolation of nucleic acid binding proteins: an approach for isolation of cell surface, nucleic acid binding proteins // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. V. 1022. P. 239-243.

54. Benimetskaya L., Loike J., Khaled Z., Loike G., Silverstein S., Cao L., el Khoury J., Cai T. and Stein C. Mac-1 (CD1 lb/CD 18) is an oligodeoxynucleotide-binding protein. Nat Med 1997. V. 3. № 4. P. 414-420.

55. Bennett R.M., Gabor G.T. and Merritt M.M. DNA binding to human leukocytes. Evidence for a receptor-mediated association, internalization, and degradation of DNA 11 J. Clin. Invest. 1985. V. 76. № 6. P. 2182-2190.

56. Wang C. and Mo Z. Current reviews in aptamers. // Sheng Wu Yi. Xue. Gong. Cheng Xue. Za Zhi. 2006. V. 23. № 2. P. 463-466.

57. Pearson A.M., Rich A. and Krieger M. Polynucleotide binding to macrophage scavenger receptors depends on the formation of base-quartet-stabilized four-stranded helices // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. № 5. P. 3546-3554.

58. Basner-Tschakarjan E., Mirmohammadsadegh A., Baer A. and Hengge U.R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins // Gene Ther. 2004. V. 11. №9. P. 765-774.

59. Lai J., Gold M.S., Kim C.S., Bian D., Ossipov M.H., Hunter J.C. and Porreca F. Inhibition of neuropathic pain by decreased expression of the tetrodotoxin-resistant sodium channel, NaV1.8 // Pain 2002. V. 95. № 1-2. P. 143-152.

60. Meeker R., LeGrand G., Ramirez J., Smith T. and Shih Y.H. Antisense vasopressin oligonucleotides: uptake, turnover, distribution, toxicity and behavioral effects // J. Neuroendocrinol. 1995. V. 7. № 6. P. 419-428.

61. Herweijer H. and Wolff J. A. Progress and prospects: naked DNA gene transfer and therapy // Gene Ther. 2003. V. 10. № 6. P. 453-458.

62. Hodges B.L. and Scheule R.K. Hydrodynamic delivery of DNA // Expert. Opin. Biol. Ther. 2003. V.3.№ 66 P. 911-918.

63. Davis H.L., Schleef M., Moritz P., Mancini M., Schorr J. and Whalen R.G. Comparison of plasmid DNA preparation methods for direct gene transfer and genetic immunization // Biotechniques 1996. V. 21. № 1. P. 92-99.

64. Tsurumi Y., Kearney M., Chen D„ Silver M., Take shita S., Yang J., SymesJ.F. and Isner J.M. Treatment of acute limb ischemia by intramuscular injection of vascular endothelial growth factor gene // Circulation 1997. V. 96. Suppl. 9. P. II-382-8.

65. Jiao S., Williams P., Berg R.K., Hodgeman B.A., Liu L., Repetto G. and Wolff J. A. Direct gene transfer into nonhuman primate myofibers in vivo // Hum. Gene Ther. 1992. V. 3. № 1. P. 21-33.

66. Herweijer H., Zhang G., Subbotin V.M., Budker V., Williams P. and Wolff J.A. Time course of gene expression after plasmid DNA gene transfer to the liver // J. Gene Med. 2001. V. 3. № 3. P. 280-291.

67. Miao W., Luo Z„ Kitsis R.N. and Walsh K. Intracoronary, adenovirus-mediated Akt gene transfer in heart limits infarct size following ischemia-reperfusion injury in vivo // J. Mol. Cell Cardiol. 2000. V. 32. № 12. P. 2397-2402.

68. Wolff J.A., Malone R. W„ Williams P., Chong W, Acsadi G., Jani A. and Feigner P.L. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo // Science 1990. V. 247. (4949 Pt. 1). P. 1465-1468.

69. Acsadi G., Jiao S.S., Jani A., Duke D., Williams P., Chong W. and Wolff J.A. Direct gene transfer and expression into rat heart in vivo //New Biol. 1991. V. 3. № 1. P. 71-81.

70. Kitsis R.N. and Leinwand L.A. Discordance between gene regulation in vitro and in vivo // Gene Expr. 1992. V. 2. № 4. P. 313-318.

71. Li K., Welikson R.E., Vikstrom K.L. and Leinwand L.A. Dircct gene transfer into the mouse heart//J. Mol. Cell Cardiol. 1997. V. 29. № 5. P. 1499-1504.

72. Sikes M.L., O'Malley B.W., Jr., Finegold M.J. and Ledley F.D. In vivo gene transfer into rabbit thyroid follicular cells by direct DNA injection // Hum. Gene Ther. 1994. V. 5. № 7. P. 837-844.

73. Yang J.P. and Huang L. Direct gene transfer to mouse melanoma by intratumor injection of free DNA // Gene Ther. 1996. V. 3. № 6. P. 542-548.

74. Hengge U.R., Walker P.S. and Vogel J.C. Expression of naked DNA in human, pig, and mouse skin// J. Clin. Invest 1996. V. 97. № 12. P. 2911-2916.

75. Hengge U.R., Walker P.S. and Vogel J.C. Expression of naked DNA in human, pig, and mouse skin // J. Clin. Invest 1996. V. 97. № 12. P. 2911- 2916.

76. Hengge U.R., Chan E.F., Foster R.A., Walker P.S. and Vogel J.C. Cytokine gene expression in epidermis with biological effects following injection of naked DNA // Nat. Genet. 1995. V. 10. №2. P. 161-166.

77. Fan H., Lin O., Morrissey G.R. and Khavari P.A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin // Nat. Biotechnol. 1999. V. 17. № 9. P. 870-872.

78. Condon C., Watkins S.C., Celluzzi СМ., Thompson K. and Falo L.D., Jr. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells // Nat. Med. 1996. V. 2. № 10. P. 11221128.

79. Liu F. and Huang L. Development of non-viral vectors for systemic gene delivery // J. Control Release 2002. V. 78. № 1-3. P. 259-266.

80. Budker V., Zhang G., Knechtle S. and Wolff J.A. Naked DNA delivered intraportally expresses efficiently in hepatocytes // Gene Ther. 1996. V. 3. № 7. P. 593-598.

81. Zhang G., Vargo D„ Budker V., Armstrong N., Knechtle S. and Wolff J.A. Expression of naked plasmid DNA injected into the afferent and efferent vessels of rodent and dog livers // Hum. Gene Ther. 1997. V. 8. № 15. P. 1763-1772.

82. Eastman S.J., Baskin K.M., Hodges B.L., Chu Q., Gates A., Dreusicke R., Anderson S. and Scheule R.K. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA // Hum. Gene Ther. 2002. V. 13. № 17. P. 2065-2077.

83. Liu F., Song Y. and Liu D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA // Gene Ther. 1999. V. 6. № 7. P. 1258-1266.

84. Zhang G., Budker V. and Wolff J.A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA // Hum. Gene Ther. 1999. V. 10. № Ю. P. 17351737.

85. Budker V., Zhang G., Danko I., Williams P. and Wolff J. The efficient expression of intravascularly delivered DNA in rat muscle // Gene Ther. 1998. V. 5. № 2. P. 272-276.

86. Zhang G„ Budker V., Williams P., Subbotin V. and Wolff J.A. Efficient expression of naked dna delivered intraarterially to limb muscles of nonhuman primates // Hum. Gene Ther. 2001. V. 12. №4. P. 427-438.

87. Hagstrom J.E., Hegge J., Zhang G., Noble M., Budker V., Lewis D.L., Herweijer H. and Wolff J.A. A facile nonviral method for delivering genes and siRNAs to skeletal muscle of mammalian limbs // Mol. Ther. 2004. V. 10. № 2 . P. 386-398.

88. Liang K.W., Nishikawa M„ Liu F., Sun В., Ye O. and Huang L. Restoration of dystrophin expression in mdx mice by intravascular injection of naked DNA containing full-length dystrophin cDNA // Gene Ther. 2004. V. 11. № 11. P. 901-908.

89. Liu F. and Huang L. Improving plasmid DNA-mediated liver gene transfer by prolonging its retention in the hepatic vasculature // J. Gene Med. 2001. V. 3. № 6. P. 569-576.

90. Wang O., Contag C.H., lives H., Johnston B.H. and Kaspar R.L. Small hairpin RNAs efficiently inhibit hepatitis С IRES-mediated gene expression in human tissue culture cells and a mouse model // Mol. Ther. 2005. V. 12 № 3. P. 562-568.

91. Lewis D.L., Hagstrom J.E., Loomis A.G., Wolff J. A. and Herweijer H. Efficient delivery of siRNA for inhibition of gene expression in postnatal mice // Nat. Genet. 2002. V. 32. № LP. 107-108.

92. McNeil P.L., Vogel S.S., Miyake K. and Terasaki M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane // J. Cell Sci. 2000. V. 113 ( Pt 11). P. 1891-1902.

93. Satkauskas S., Bureau M.F., Mahfoudi A. and Mir L.M. Slow accumulation of plasmid in muscle cells: supporting evidence for a mechanism of DNA uptake by receptor-mediated endocytosis // Mol. Ther. 2001. V. 4. № 4. P. 317-323.

94. Pan W.-H. and Clawson G.A. Antisense applications for biological control // J. Cell. Biochem. 2006. V. 98. P. 14-35.

95. Chan J.H., Lim S. and Wong W.S. Antisense oligonucleotides: from design to therapeutic application // Clin. Exp Pharmacol. Physiol. 2006. V. 33. № 5-6. P. 533-540.

96. Yu C., Brussaard А.В., Yang X., Listerud M. and Role L.W. Uptake of antisense oligonucleotides and functional block of acetylcholine receptor subunit gene expression in primary embryonic neurons // Dev. Genet. 1993. V. 14. № 4. P. 296-304.

97. Shoji Y, Akhtar S„ Periasamy A., Herman B. and Juliano R.L. Mechanism of cellular uptake of modified oligodeoxynucleotides containing methylphosphonate linkages // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. № 20. P. 5543-5550.

98. Stein C.A., Tonkinson J.L., Zhang L.M., Yakubov L., Gervasoni J., Taub R. and Rotenberg S.A. Dynamics of the internalization of phosphodiester oligodeoxynucleotides in HL60 cells // Biochemistry 1993. V. 32. № 18. P. 4855-4861.

99. Sazani P., Kang S.H., Maier M.A., Wei C., Dillman J., Summerton J., Manoharan M. and Kole R. Nuclear antisense effects of neutral, anionic and cationic oligonucleotide analogs // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. № 19. P. 3965-3974.

100. Svinarchuk F.P., Konevetz D.A., Pliasunova O.A., Pob'ovsky A.G. and Vlassov V.V Inhibition of HIV proliferation in MT-4 cells by antisense oligonucleotide conjugated to lipophilic groups // Biochimie 1993. V. 75. № 1-2. P. 49-54.

101. Shea R.G., Marsters J.C. and Bischofberger N. Synthesis, hybridization properties and antiviral activity of lipid-oligodeoxynucleotide conjugates //Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. № 13. P. 3777-3783.

102. Stein C.A., Yakubov L., Zhang L.M. and Tonkinson J. Mode of uptake of 5'-cholesteryl-linked phosphodiester oligodeoxynucleotides in HL60 cells //.Nucleic Acids Symp. Ser. 1991. № 24. P. 155-156.

103. Ryte A.S., Karamyshev V.N., Nechaeva M.V., Guskova Z.V., Ivanovo E.M., Zarytova V.F. and Vlassov V.V. Interaction of cholesterol-conjugated alkylating oligonucleotide derivatives with cellular biopolymers // FEBS Lett. 1992. V. 299. № 2. P. 124-126.

104. Desjardins J., Mata J., Brown Т., Graham D., Zon G. and Iversen P. Cholesteryl-conjugated phosphorothioate oligodeoxynucleotides modulate CYP2B1 expression in vivo // J. Drug Target 1995. V. 2. № 6 . P. 477-485.

105. Wu G.Y. and Wu C.H. Specific inhibition of hepatitis В viral gene expression in vitro by targeted antisense oligonucleotides // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. № 18. P. 12436-12439.

106. Wagner E., Zenke M., Cotten M., Beug H. and Birnstiel M.L. Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1990. V. 87. № 9. P. 3410-3414.

107. Deshpande D., Toledo-Velasquez D„ Thakkar D., Liang W. and Rojanasakul Y. Enhanced cellular uptake of oligonucleotides by EGF receptor-mediated endocytosis in A549 cells // Pharm. Res. 1996. V. 13. № 1. P. 57-61.

108. Boado R.J. and Pardridge W.M. Complete inactivation of target mRNA by biotinylated antisense oligodeoxynucleotide-avidin conjugates // Bioconjug. Chem. 1994. V. 5. № 5. P. 406410.

109. Frankel D. and Pabo C.O. Cellular uptake of Tat protein from human immunodeficiency virus // Cell. 1988. V. 55. № 6. P. 1189-1193.

110. Joliot A., Pernelle C., Deagostini B.H. and Prochiantz, A. Antennapedia homeobox peptide regulates neutral morphogenesis II Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. V. 88. № 5. P. 1189-1193.

111. Vives E. Present and future of cell-penetrating peptide mediated delivery systems: is the Trojan horse too wild to go only to Troy? II J. Control. Release. 2005. V. 109. № 1-3. P. 77-55.

112. SaalikP., Elmquist A., Hansen M. Padari K., Saar K., Viht K. and Pooga, M. Protein cargo delivery properties of cell-penetrating peptides. A comparative study.// Bioconjug. Chem. 2004. V. 15. №6. P. 1246-1253.

113. Rogers F.A., Manoharan M., Rabinovitch P., Ward D.C. and Glazer P.M. Peptide conjugates for chromosomal gene targeting by triplex-forming oligonucleotides // Nucleic Acids Res. 2003. V. 32. № 22. P. 6595 6604.

114. Richard J.P., Melikov K., Fives E., Ramos C„ Verbeure В., Gait M.J., Chernomordik L.V. and Lebleu B. Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. № 1. P. 555 590.

115. Chu Т., Ebright J. and Ellington A.D. Using aptamers to identify and enter cells // Curr. Opin. Mol. Ther. 2007. V. 9. № 2. P. 137-144.

116. McNamara J.O., Andrechek E.R., Wang Y„ Viles K.D., Rempel R.E., Gilboa E., Sullenger B.A. and Giangrande P.H. Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras //Nat. Biotechnol. 2006. V. 24. № 8. P. 1005-1015.

117. Liu X, Nakamura K., Wang Y., Zhang S„ He J., Liu G., Dou S., Kubo A., Rusckowski M. and Hnatowich D. Improved delivery in cell culture of radiolabeled antisense DNAs by duplex formation // Mol. Imaging Biol. 2006. V. 8. № 5. P. 278-283.

118. Branden L.J., Mohamed A.J. and Smith C.I. A peptide nucleic acid-nuclear localization signal fusion that mediates nuclear transport of DNA // Nat. Biotechnol. 1999. V. 17. № 8. P. 784-787.

119. Astriab-Fisher A., Fisher M.IL, Juliano R. and Herdewijn P. Increased uptake of antisense oligonucleotides by delivery as double stranded complexes // Biochem. Pharmacol. 2004. V. 68. № 3. P. 403-407.

120. KriegA.M., YiA.K., Matson S., Waldschmidt T.J., Bishop G.A., Teasdale R., Koretzky G.A. and Klinman D.M. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation // Nature 1995. V. 374. № 6522. P. 546-549.

121. Spanvasser Т., Miethke Т., Lipford G., Erdmann A., Hacker H., Heeg K. and Wagner H. Macrophages sense pathogens via DNA motifs: induction of tumor necrosis factor-alpha-mediated shock// Eur. J. Immunol. 1997. V. 27. № 7. P. 1671-1679.

122. Stacey К.J., Sweet M.J. and Hume D.A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA//J. Immunol. 1996. V. 157. № 5. P. 2116-2122.

123. Bendigs S., Salzer U., Lipford G.B., Wagner H. and Heeg K. CpG-oligodeoxynucleotides co-stimulate primary T cells in the absence of antigen-presenting cells // Eur. J. Immunol. 1999. V. 29. №4. P. 1209-1218.

124. Lipford G.B. and Sparwasser T. Hematopoietic remodeling triggered by CpG DNA // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2000. V. 247. P. 119-129.

125. Weiner G.J. CpG DNA in cancer immunotherapy // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2000. V. 247. P. 157-170.

126. Zimmermann S., Dalpke A. and Heeg K. CpG oligonucleotides as adjuvant in therapeutic vaccines against parasitic infections // Int. J. Med. Microbiol. 2008. V. 298. № 1-2. P. 39-44.

127. Hemmi H., Takeuchi O., Kawai Т., Kaisho Т., Sato S., Sanjo H., Matsumoto M., Hoshino K., Wagner II., Takeda K. and Akira S. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA // Nature 2000. V. 408. № 6813. P. 740-745.

128. Brown M.S. and Goldstein J.L. Lipoprotein receptors in the liver. Control signals for plasma cholesterol traffic II J. Clin. Invest 1983. V. 72. № 3. P. 743-747.

129. Krieger M. Molecular flypaper and atherosclerosis: structure of the macrophage scavenger receptor // Trends Biochem. Sci. 1992. V. 17. № 4. P. 141-146.

130. Hampton R.Y., Golenbock D.T., Penman M., Krieger M. and Raetz C.R. Recognition and plasma clearance of endotoxin by scavenger receptors // Nature 1991. V. 352. № 6333. P. 342344.

131. Nishikawa K., Arai H. and Inoue K. Scavenger receptor-mediated uptake and metabolism of lipid vesicles containing acidic phospholipids by mouse peritoneal macrophages II J. Biol. Chem. 1990. V. 265. № 9. P. 5226-5231.

132. Burge S., Parkinson G.N., Hazel P., Todd A.K. and Neidle S. Quadruplex DNA: sequence, topology and structure//Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. № 19. P. 5402-5415.

133. Miyoshi D., Matsumura S., Li W. and Sugimoto N. Structural polymorphism of telomeric DNA regulated by pH and divalent cation // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2003. V. 22. №2. P. 203-221.

134. Pisetsky D.S. and Reich C.F., III The influence of base sequence on the immunological properties of defined oligonucleotides // Immunopharmacology 1998. V. 40. № 3. P. 199-208.

135. Liang H. and Lipsky P.E. The response of human В lymphocytes to oligodeoxynucleotides // Springer Semin. Immunopathol. 2000. V. 22. № 1-2. P. 63-75.

136. Verthelyi D., Ishii K.J., Gursel M., Takeshita F. and Klinman D.M. Human peripheral blood cells differentially recognize and respond to two distinct CPG motifs // J. Immunol. 2001. V. 166. №4. P. 2372 -2377.

137. Wloch M.K., Pasquini S., Ertl H.C. and Pisetsky D.S. The influence of DNA sequence on the immunostimulatory properties of plasmid DNA vectors // Hum. Gene Ther. 1998. V. 9. № 10. P. 1439-1447.

138. Poon K. and Macgregor R.B., Jr. Formation and structural determinants of multi-stranded guanine-rich DNA complexes // Biophys. Chem. 2000. V. 84. № 3. P. 205-216.

139. Protozanova E. and Macgregor R.B., Jr. Analysis of the electrophoretic migration of DNA frayed wires // Biophys. Chem. 1998. V. 75. № 3. P. 249-257.

140. Yanze M.F., Но E.A., Macgregor R.B. and Piquette-Miller M. In vivo disposition and stability of DNA frayed wires in mice // Int. J. Biol. Macromol. 2006. V. 39. № 4-5. P. 310-316.

141. Vlassov A., Khvorova A. and Yarns M. Binding and disruption of phospholipid bilayers by supramolecular RNA complexes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2001. V. 98. № 14. P. 7706 -7711.

142. Guo S., Tschammer N., Mohammed S. and Guo P. Specific delivery of therapeutic RNAs to cancer cells via the dimerization mechanism of phi29 motor pRNA // Hum. Gene Ther. 2005. V. 16. №9. P. 1097-1109.

143. KhaledA., Guo S., Li F. and Guo P. Controllable self-assembly of nanoparticles for specific delivery of multiple therapeutic molecules to cancer cells using RNA nanotechnology // Nano. Lett. 2005. V. 5. № 9. P. 1797-1808.

144. Guo P.X., Erickson S. and Anderson D. A small viral RNA is required for in vitro packaging of bacteriophage phi 29 DNA // Science 1987. V. 236. № 4802. P. 690-694.

145. Lu Y. and Low P.S. Immunotherapy of folate receptor-expressing tumors: review of recent advances and future prospects // J. Control Release 2003. V. 91. № 1-2. P. 17-29.

146. Chen C., Zhang C. and Guo P. Sequence requirement for hand-in-hand interaction in formation of RNA dimers and hexamers to gear phi29 DNA translocation motor // RNA. 1999. V. 5. №6. P. 805-818.

147. Shu D., Huang L.P., Hoeprich S. and Guo P. Construction of phi29 DNA-packaging RNA monomers, dimers, and trimers with variable sizes and shapes as potential parts for nanodevices // J. Nanosci. Nanotechnol. 2003. V. 3. № 4. P. 295-302.

148. Ogris M. and Wagner E. Tumor-targeted gene transfer with DNA polyplexes // Somat. Cell Mol. Genet. 2002. V. 27. № 1-6. P. 85-95.

149. Nen AL, Fischer D. and Kissel T. Recent advances in rational gene transfer vector design based on poly(ethylene imine) and its derivatives // J. Gene Med. 2005. V. 7. № 8. P. 992-1009.

150. Lee C.H., Ni Y.H., Chen C.C., Chou C. and Chang F.H. Synergistic effect of polyethylenimine and cationic liposomes in nucleic acid delivery to human cancer cells // Biochim. Biophys. Acta 2003. V. 1611. № 1-2. P. 55-62.

151. Pietersz G.A., Tang C.K. and Apostolopoulos V. Structure and design of polycationic carriers for gene delivery // Mini. Rev. Med. Chem. 2006. V. 6. № 12. P. 1285-1298.

152. Abdallah В., Hassan A., Benoist C., Goula D., Behr J.P. and Demeneix B.A. A powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain: polyethylenimine // Hum. Gene Ther. 1996. V. 7. № 16. P. 1947-1954.

153. Kunath K, von Harpe A., Fischer D. and Kissel T. Galactose-PEI-DNA complexes for targeted gene delivery: degree of substitution affects complex size and transfection efficiency // J. Control Release 2003. V. 88. № 1. P. 159-172.

154. Suh J., Paik H.-J. and Hwang B.K. Ionization of poly(ethylenimine) and poly(allilamine) at various pH's // Bioorg. Chem. 1994. V. 22. P. 318-327.

155. Thomas M., Ge O., Lu J.J., Chen J. and Klibanov A.M. Cross-linked small polyethylenimines: while still nontoxic, deliver DNA efficiently to mammalian cells in vitro and in vivo // Pharm. Res. 2005. V. 22. № 3. P. 373-380.

156. Thomas M., Lu J.J., Ge O., Zhang C., Chen J. and Klibanov A.M. Full deacylation of polyethylenimine dramatically boosts its gene delivery efficiency and specificity to mouse lung // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2005. V. 102. № 16. P. 5679-5684.

157. Thomas M. and Klibanov A.M. Enhancing polyethylenimine's delivery of plasmid DNA into mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2002. V. 99. № 23. P. 14640-14645.

158. Ruponen M., Ronkko S., Honkakoski P., Pelkonen J., Tammi M. and Urtti A. Extracellular glycosaminoglycans modify cellular trafficking of lipoplexes and polyplexes // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 36. P. 33875-33880.

159. Vinogradov S.V., Bronich Т.К. and Kabanov A.V. Self-assembly of polyamine-poly(ethylene glycol) copolymers with phosphorothioate oligonucleotides // Bioconjug. Chem. 1998. V. 9. №6. P. 805-812.

160. Godbey W.T., Barry M.A., Saggau P., Wu K.K. and Mikos A.G. Poly(ethylenimine)-mediated transfection: a new paradigm for gene delivery // J. Biomed. Mater. Res. 2000. V. 51. № 3. P. 321-328.

161. Aigner A., Fischer D., Merdan Т., Brus C., Kissel T. and Czubayko F. Delivery of unmodified bioactive ribozymes by an RNA-stabilizing polyethylenimine (LMW-PE1) efficiently down-regulates gene expression // Gene Ther. 2002. V. 9. № 24. P. 1700-1707.

162. Chollet P., Favrot M.C., Hurbin A. and Coll J.L. Side-effects of a systemic injection of linear polyethylenimine-DNA complexes // J. Gene Med. 2002. V. 4. № 1. P. 84-91.

163. Brissault В., Kichler A., Guis C., Leborgne C., Danos O. and Cheradame II. Synthesis of linear polyethylenimine derivatives for DNA transfection // Bioconjug. Chem. 2003. V. 14. № 3. P. 581-587.

164. Boeckle S., von Gersdorff K., van der P.S., Culmsee C., Wagner E. and Ogris M. Purification of polyethylenimine polyplexes highlights the role of free polycations in gene transfer // J. Gene Med. 2004. V. 6. № 10. P. 1102-1111.

165. Kircheis R., Wightman L. and Wagner E. Design and gene delivery activity of modified polyethylenimines //Adv. Drug Deliv. Rev. 2001. V. 53 № 3. P. 341-358.

166. Marschall P., Malik N. and Larin Z. Transfer of YACs up to 2.3 Mb intact into human cells with polyethylenimine // Gene Ther. 1999. V. 6. № 9. P. 1634-1637.

167. Glodde M., Sirsi S.R. and Lutz G.J. Physiochemical properties of low and high molecular weight poly(ethylene glycol)-grafted poly(ethylene imine) copolymers and their complexes with oligonucleotides // Biomacromolecules. 2006. V. 7. № 1. P. 347-356.

168. Sundaram S., Viriyayuthakorn S. and Roth C.M. Oligonucleotide structure influences the interactions between cationic polymers and oligonucleotides // Biomacromolecules. 2005. V. 6. №6. P. 2961-2968.

169. Godbey W.T., Wu K.K. and Mikos A.G. Size matters: molecular weight affects the efficiency of poly(ethylenimine) as a gene delivery vehicle // J. Biomed. Mater. Res. 1999. V. 45. № 3. P. 268-275.

170. Wightman L., Kircheis R., Rossler V, Carotta S., Ruzicka R., Kursa M. and Wagner E. Different behavior of branched and linear polyethylenimine for gene delivery in vitro and in vivo // J. Gene Med. 2001. V. 3. № 4. P. 362-372.

171. Ogris M„ Walker G., Blessing Т., Kircheis R., Wolschek M. and Wagner E. Tumor-targeted gene therapy: strategies for the preparation of ligand-polyethylene glycol-polyethylenimine/DNA complexes // J. Control Release 2003. V. 91. № 1-2. P. 173-181.

172. Plank C., Mechtler K., Szoka F.C. Jr. and Wagner E. Activation of the complement system by synthetic DNA complexes: a potential barrier for intravenous gene delivery // Hum. Gene Ther. 1996. V. 7. № 12. P. 1437-1446.

173. Ogris M„ Steinlein P., Kursa M., Mechtler K., Kircheis R. and Wagner E. The size of DNA/transferrin-PEI complexes is an important factor for gene expression in cultured cells // Gene Ther. 1998. V. 5. № 10. P. 1425-1433.

174. Kircheis R., Schuller S., Brunner S., Ogris M., Heider K.H., Zauner W. and Wagner E. Polycation-based DNA complexes for tumor-targeted gene delivery in vivo // J. Gene Med. 1999. V. l.№2. P. 111-120.

175. Nguyen H.K., Lemieux P., Vinogradov S.V., Gebhart C.L., Guerin N., Paradis G., Bronich Т.К., Alakhov V.Y. and Kabanov A.V. Evaluation of polyether-polyethyleneimine graft copolymers as gene transfer agents // Gene Ther. 2000. V. 7. № 2. P. 126-138.

176. Kursa M., Walker G.F., Roessler V, Ogris M., Roedl W, Kircheis R. and Wagner E. Novel shielded transferrin-polyethylene glycol-polyethylenimine/DNA complexes for systemic tumor-targeted gene transfer// Bioconjug. Chem. 2003. V. 14. № 1. P. 222-231.

177. Trubetskoy V.S., Wong S.C., Subbotin V., Budker V.G., Loomis A., Hagstrom J.E. and Wolff J.A. Recharging cationic DNA complexes with highly charged polyanions for in vitro and in vivo gene delivery // Gene Ther. 2003. V. 10. № 3. P. 261-271.

178. Pun S.H., Bellocq N.C., Liu A., Jensen G., Machemer Т., Quijano E., Schluep Т., Wen S., Engler H. Heidel J. and Davis M.E. Cyclodextrin-modified polyethylenimine polymers for gene delivery // Bioconjug. Chem. 2004. V. 15. № 4. P. 831-840.

179. Oupicky D., Ogris M., Howard K.A., Dash P.R., Ulbrich K. and Seymour L.W. Importance of lateral and steric stabilization of polyelectrolyte gene delivery vectors for extended systemic circulation // Mol. Ther. 2002. V. 5. № 4. P. 463-472.

180. Carlisle R.C., Etrych Т., Briggs S.S., Preece J.A., Ulbrich K. and Seymour L.W. Polymer-coated polyethylenimine/DNA complexes designed for triggered activation by intracellular reduction // J. Gene Med. 2004. V. 6. № 3. P. 337-344.

181. Kircheis R., Wightman L., Schreiber A., Robitza В., Rossler V, Kursa M. and Wagner E. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application // Gene Ther. 2001. V. 8. № 1. P. 28-40.

182. Brownlie A., Uchegbu I.F. and Schatzlein A.G. PEI-based vesicle-polymer hybrid gene delivery system with improved biocompatibility // Int. J. Pharm. 2004. V. 274. № 1-2. P. 41-52.

183. Gebhart C.L., Sriadibhatla S., Vinogradov S., Lemieiix P., Alakhov V. and Kabanov A. V. Design and formulation of polyplexes based on pluronic-polyethyleneimine conjugates for gene transfer // Bioconjug. Chem. 2002. V. 13. № 5. P. 937-944.

184. Han S., Mahato R.I. and Kim S.W. Water-soluble lipopolymer for gene delivery // Bioconjug. Chem. 2001. V. 12. № 3. P. 337-345.

185. Mahato R.I., Lee M., Han S., Maheshwari A. and Kim S.W. Intratumoral delivery of p2CMVmIL-12 using water-soluble lipopolymers // Mol. Ther. 2001. V. 4. № 2. P. 130-138.

186. Kim W.J., Chang C. W., Lee M. and Kim S. W. Efficient siRNA delivery using water soluble lipopolymer for anti-angiogenic gene therapy // J. Control Release 2007. V. 118. № 3. P. 357363.

187. Wang D.A., Narang A.S., Kotb M„ Gaber A.O., Miller D.D., Kim S.W. and Mahato R.I. Novel branched poly(ethylenimine)-cholesterol water-soluble lipopolymers for gene delivery // Biomacromolecules. 2002. V. 3. № 6. P. 1197-1207.

188. Kim S„ Choi J.S., Jang H.S., Suh H. and Park J. Hydrophobic modification of polyethyleneimine for gene trqansfectants I I Bull. Corean. Chem. Soc. 2001. V. 22. № 10. P. 1069-1075.

189. Fewell J.G., Matar M., Slobodkin G., Han S.O., Rice J., Hovanes В., Lewis D.H. andAnwer K. Synthesis and application of a non-viral gene deliver}' system for immunogene therapy of cancer// J. Control Release 2005. V. 109. № 1-3. P. 288-298.

190. Furgeson D.Y., Cohen R.N., Mahato R.I. and Kim S.W. Novel water insoluble lipoparticulates for gene delivery // Pharm. Res. 2002. V. 19. № 4. P. 382-390.

191. Furgeson D. Y., Chan W.S., Yockman J. W. and Kim S. W. Modified linear polyethylenimine-cholesterol conjugates for DNA complexation // Bioconjug. Chem. 2003. V. 14. № 4. P. 840847.

192. Furgeson D.Y., Yockman J.W., Janat M.M. and Kim S.W. Tumor efficacy and biodistribution of linear polyethylenimine-cholesterol/DNA complexes // Mol. Ther. 2004. V. 9. № 6. P. 837-845.

193. Diebold S.S., Kursa M., Wagner E., Cotten M. and Zenke M. Mannose polyethylenimine conjugates for targeted DNA delivery into dendritic cells // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. № 27. P. 19087-19094.

194. Lu Y. and Low P.S. Folate-mediated delivery of macromolecular anticancer therapeutic agents // Adv. Drug Deliv. Rev. 2002. V. 54. № 5. P. 675-693.

195. Chiu S.J., Ueno N.T. and Lee R.J. Tumor-targeted gene delivery via anti-HER2 antibody (trastuzumab, Herceptin) conjugated polyethylenimine // J. Control Release 2004. V. 97. № 2. P. 357-369.

196. Benns J.M., Maheshwari A., Furgeson D.Y., Mahato R.I. and Kim S.W. Folate-PEG-folate-graft-polyethylenimine-based gene delivery // J. Drug Target 2001. V. 9. № 2. P. 123-139.

197. Guo W. and Lee R.L. Receptor-targeted gene delivery via folate-conjugated polyethylenimine // AAPS. PharmSci. 1999. V. 1. № 4. P. El9.

198. Blessing Т., Kursa M., Holzhauser R., Kircheis R. and Wagner E. Different strategies for formation of pegylated EGF-conjugated PEI/DNA complexes for targeted gene delivery // Bioconjug. Chem. 2001. V. 12. № 4. P. 529-537.

199. O'Neill M.M., Kennedy C.A., Barton R.W. and Tatake R.J. Receptor-mediated gene delivery to human peripheral blood mononuclear cells using anti-CD3 antibody coupled to polyethylenimine // Gene Ther. 2001. V. 8. № 5. P. 362-368.

200. Lewis D.L., Hagstrom J.E., Loomis A.G., Wolff J.A. and Herweijer H. Efficient delivery of siRNA for inhibition of gene expression in postnatal mice // Nat. Genet. 2002. V. 32. № l.P. 107-108.

201. Ding Y., Chan C.Y. and Lawrence C.E. Sfold web server for statistical folding and rational design of nucleic acids // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32 . № Web Server issue. P. W135 -W141.

202. Perbal В., A Practical Guide to Molecular Cloning, Academic Press, Inc., New York, 1984.

203. Proudnikov D. and Mirzabekov A. Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling //Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. № 22. P. 4535-4542.

204. Richards E.G. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology: Nucleic Acids, 3rd Ed. // 1975. V. Ed., G. D. Fasman. Vol. I. P. 589.

205. Priev A., Zalipsky S., Cohen R. and Barenholz Y. Determination of critical micelle concentration of lipopolymers and other amphiphiles: comparison of sound velocity and flourescent measurements. // Langmuir. 2002. V. 18. №3. P. 612-617.

206. Carmichael J., DeGraff W.G., Gazdar A.F., Minna J.D. and Mitchell J.B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing // Cancer Res. 1987. V. 47. № 4. P. 936-942.

207. Peterson G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable // Anal. Biochem. 1977. V. 83. № 2. P. 346-356.

208. Chattopadhyay N., Kher R. and Godbole M. Inexpensive SDS/phenol method for RNA extraction from tissues // Biotechniques 1993. V. 15. № 1. P. 24-26.

209. He C.X., Miao C.Y., Yao J.H., Chen H.M., Lu D.R., Su D.F. andXue J.L. Construction of a recombinant vector based on AAV carrying human endothelial nitric-oxide synthase gene // Acta Pharmacol. Sin. 2003. V. 24. № 7. p. 637-640.

210. Scherr M., Battmer K., Ganser A, and Eder M. Modulation of gene expression by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA // Cell Cycle 2003. V. 2. № 3. P. 251-257.

211. Akhtar S., Hughes M.D., Khan A., Bibby M., Hussain M., Nawaz O., Double J. and Sayyed P. The delivery of antisense therapeutics // Adv. Drug Deliv. Rev. 2000. V. 44. № 1. P. 3-21.

212. Morozkin E.S., Laktionov P.P., Rykova E.Y., Bryzgunova O.E. and Vlassov V.V. Release of nucleic acids by eukaryotic cells in tissue culture // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004. V. 23. № 6-7. P. 927-930.

213. Shestova O.E., Andreeva A.I., Vlasov V.V. and lakubov L.A. Transport of oligonucleotides-cell surface proteins complexes into cell nucleus. // Dokl. Akad. Nauk 1999. V. 368. № 2. P. 264-267.

214. Luo D. and Saltzman W.M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface //Nat. Biotechnol. 2000. V. 18. № 8. P. 893-895.

215. Shabarova Z.A., Dolinnaya N.G., Turkin S.I. and Gromova E.S. DNA-like duplexes with repetitions. I. Properties of concatemer duplexes formed by d(T-G-C-A-C-A-T-G) // Nucleic Acids Res. 1980. V. 8. № 11. P. 2413-2429.

216. Sarkar Т., Conwell С.С., Harvey L.C., Santai C.T. and Hud N.V. Condensation, of oligonucleotides assembled into nicked and gapped duplexes: potential structures for oligonucleotide delivery//Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. № 1. P. 143-151. .

217. Kostenko E. V., Beabealashvilly R.S., llassov V. V. and Zenkova M.A. Secondary structure of the 5'-region of PGY1/MDR1 mRNA // FEBS Lett. 2000. V. 475. № 3. P. 181-186.

218. Kabilova Т.О., Vladimirova A. V., Chernolovskaya E.L. and Vlassov V.V. Arrest of cancer cell proliferation by dsRNAs // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006. V. 1091. P. 425-436.

219. Pyshnyi D.V. and Ivanovo E.M. The influence of nearest neighbours on the efficiency of coaxial stacking at contiguous stacking hybridization of oligodeoxyribonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004. V. 23. № 6-7. P. 1057-1064.

220. Pyshnyi D. V., Pyshnaya /., LevinaA., Goldberg E., Zarytova V, Knorre D. and Ivanova E. Thermodynamic analysis of stacking hybridization of oligonucleotides with DNA template // J. Biomol. Struct. Dyn. 2001. V. 19. № 3. P. 555-570.

221. Martin D.A. and Elkon K.B. Intracellular mammalian DNA stimulates myeloid dendritic cells to produce type I interferons predominantly through a toll-like receptor 9-independent pathway // Arthritis Rheum. 2006. V. 54. № 3. P. 951-962.

222. Suzuki K, Yanagi M., Mori-Aoki A., Moriyama E., Ishii K.J. and Kohn L.D. Transfection of single-stranded hepatitis A vims RNA activates MHC class I pathway // Clin. Exp. Immunol. 2002. V. 127. № 2. P. 234-242.

223. Mechti N., Leonetti J.P., Clarenc J.P., Degols G. and Lebleu B. Nuclear location of synthetic oligonucleotides microinjected somatic cells: its implication in an antisense strategy // Nucleic Acids Symp. Ser. 1991. № 24. P. 147-150.

224. Anselmet A., May at E., WietekS., Layer P. G., Payrastre B. and Massoulie J. Non-antisense cellular responses to oligonucleotides // FEBS Lett. 2002. V. 510. № 3. P. 175-180.

225. Luo D. and Saltzman W.M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface //Nat. Biotechnol. 2000. V. 18. № 8. P. 893-895.

226. Godbey W.T., Wu K.K. and Mikos A.G. Poly(ethylenimine) and its role in gene delivery // J. Control Release 1999. V. 60. № 2-3. P. 149-160.

227. Sonawane N.D., Szoka F.C., Jr. and Verkman A.S. Chloride accumulation and swelling in endosomes enhances DNA transfer by polyamine-DNA polyplexes // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. №45. P. 44826-44831.

228. Tirosh O., Barenholz Y., Katzhendler J. and Priev A. Hydration of polyethylene glycol-grafted liposomes // Biophys. J. 1998. V. 74. № 3. P. 1371-1379.

229. Godbey W.T., Wu K.K. and Mikos A.G. Tracking the intracellular path of poly(ethylenimine)/DNA complexes for gene delivery // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1999. V. 96. №9. P. 5177-5181.

230. Meister G. and Tuschl T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA // Nature 2004. V. 431. № 7006. P. 343-349.

231. Huh S.-H., Do H.-J., Lim K.-Y., Kim D.-K, Choi S.-J., Song H., Kim N.-H., Park J.-K, Chang W.-K., Chung H.-M., Kim J.-H. Optimization of linear 25kDa polyethylenimine for efficient gene delivery // Biologicals. 2007. V. 35. P. 165-171.

Информация о работе

Гусаченко, Олеся Николаевна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Супрамолекулярные комплексы нуклеиновых кислот как эффективные системы трансфекции клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы