Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы проникновения чужеродной ДНК и олигонуклеотидов внутрь клеток

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы проникновения чужеродной ДНК и олигонуклеотидов внутрь клеток"

РГВ ол

На правах рукописи УДК 577.352.4; 547.963.3

П У У БАЛАКИРЕВА

Г

Лариса Анатольевна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПРОНИКНОВЕНИЯ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК И ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ВНУТРЬ КЛЕТОК, клеточная биология - 03.00.25

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

11окоснбирск - 1997

Официальные оппонента:

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН, Институте цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск, и Центре биологической химии Уни всрситета г. Франкфурта-на-Ма1ше, Германия. Научные руководители: член-корр. РАН В. В. Власов,

Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН; доктор биологических наук, профессор Г. М. Дымшиц Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск доктор биолотческих наук, профессор И. И. Кикиадое Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск;

кандидат биологических наук, Л. Ф. Гуляева Инстшут молекулярной патологии и экологической биохимии СО РАМН, г. Новосибирск Государственный Научный Центр Вирусологии и Киотехнологии "Вектор" НИИ молекулярной биологии

Защита состоится 1997 г. на утреннем заседании диссертационного совет

по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в Инста туте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, Ново сибирск , просп. академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики С< РАН

X

Ведущая оргашоа1(ия

Автореферат разослан "'О*

19971

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

А.Д. Груздев

'альность темы. Основным принципом генной терапии является введение в клетку чу-|дных нуклеиновых кислот (НК) и получение экспрессии генов, отсутствующих или де-ных в клетках данной ткани или в организме в целом (метод трансфекции). Идеологиче-5лизкая ген-направленная терапия основана на введении в клетку полинуклеотидов, ком-чентарных выбранной последовательности, с целью ингибирования экспрессии генов су-гвующих. Как для генной, так и для ген-направленной терапии необходимо введение НК их фрагментов, олигонуклеотидов (Ос1Г\1), внутрь клеток. Проникновение полинуклеотидов рь клетки может происходить спонтанно, вероятно, благодаря наличию специфических ;пторов. Однако, поскольку эффективность "спонтанного" проникновения ДНК внутрь кле-<райне низка, в настоящее время используются различные системы (вирусы, липосомы, >сомы, пептиды и другие), позволяющие значительно повысить эффективность доставки и олигонуклеотидов внутрь клеток. Каждый из существующих методов доставки ДНК рь клеток обладает теми или иными недостатками, ограничивающими их широкое приме-1е в генной терапии. Поэтому исследование молекулярных механизмов, обеспечивающих никновение НК внутрь клетки, также актуально, как и создание новых транспортных систем,

и и задачи исследования. Целью данной работы было исследование механизмов про-ювения нуклеиновых кислот и полинуклеотидов внутрь клетки, а также разработка новых 'ем, их достзекл. Непосредственными задачами были: 1) изучить динамику захвата гонуклеотидов, физико-химические параметры их рецепторов и их способность влиять на аболизм клеточных липидов; 2) исследоват.ь возможность применения липосом, приготов-ных из основного фосфолипида археобактерий ТЬегтор/аэта ас/УорЛЛяп (археолипосом), доставки внутрь клеток водорастворимых веществ, в том числе и ДНК, 3) изучить способ-гь нового катионного производного археолилида обеспечивать проникновение ДНК внутрь гок и ее экспрессию; 4) с помощью модельной системы исследовать способность белков афазных хромосом индуцировать слияние мембран.

|>чняя новизна н практическая ценность. Впервые обнаружено, что результатом взаимо-ствия олигонуклеотидов различных последовательностей с поверхностью клеток является укция изменений в метаболизме липидов, приводящих к быстрому увеличению ]меченья фосфатидовой кислоты и понижению уровня диацилглицерола. Впервые показа-что взаимодействие археолипосом с фосфолипидной мембраной приводит к их слиянию, , вероятно, объясняет высокую эффективность использования данных липосом для доске водорастворимых веществ внутрь клеток. Впервые использованы катионные археолипо-|ы для введения чужеродной ДНК в клетки и показана их высокая эффективность. Метода-флуоресцентной спектроскопии и электронной микроскопии впервые показана способность •афазных хромосом инициировать слияние адсорбированных везикул. Предложено воз-

можное использование полученных данных для создания нового типа трансфекци' компетентных комплексов.

Публикации и апробации работы. По материалам диссертации опубликовано 6 печг работ. Результаты исследований были доложены на конференции молодых ученых и cm листов КазГУ, (Алма-Ата, 1989), III Всесоюзной конференции "Макромолекулы клетки" (Мо 1989), на Российско-Французском симпозиуме "Регуляция экспрессии генов" (Новосиб 1995) и на V международном симпозиуме по биомембранам (Франкфурт-на-Майне, 1997). Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинопш текста, включая 49 рисунков и 2 таблицы. Список литературы составляет 145 источникое бота состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и Mei Результаты и их обсуждение, Выводы, Список литературы.

Результаты и их обсуждение То, что молекулы нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов способны пересекать юн ные мембраны и интактными проникать в цитоплазму клеток, уже не вызывает сомж Предполагают, что процесс проникновения нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов еь клетки протекает благодаря наличию специфических рецепторов, присутствие которых н; верхности ряда клеток было показано ранее [Yakubov L.A., 1989]. В настоящей работе ( исследовано участие рецепторов для OdN в процессе захвата олигонуклеотида клеткой i пряжение этих рецепторов с сигнальными системами клетки.

СВЯЗЫВАНИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДА С ПОВЕРХНОСТЬЮ L929 КЛЕТОК.

Специфическое связывание OdN с поверхностью клеток исследовали, инкубируя 4°С фибробласты L929 с 5'-[32Р]меченым 16-звенным олигонуклеот! d(pTCACCCTCTTCCCATC) (рЕ16). Построение графика Скэтчарда на основании полученнь

а

н

0.0 40.0 80.0 120.0

КОНЦЕНТРАЦИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДА, нМ

СВЯЗАННЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТНД, 10-13 моль/ 105 клеток

Рис. 1. (А) Специфическое связывание 5'-[32Р]меченого олигонуклеотида рЕ^ с повер стью клеток и график Скэтчарда (Б), построенный по результатам связывания ол нуклеотнда (А).

4

3

0

ных (рис. 1А и Б) позволяет предположить наличие на клетке центров связывания одного а с константой диссоциации 4,027'10'э М. Количество мест связывания олигонуклеотида тавляет 8106 на клетку. Эти результаты подтверждают полученные ранее данные о том, олигонукпеотиды специфично связывается с поверхностью 1.929 клеток [УакиЬоу Ц..А., .9]. Можно предположить, что центру связывания ОсМ одного типа соответствует обнару-1ный ранее рецептор Мв 79 кДа, общий для ряда различных клеток [Власов В.В., 1993].

ВЛИЯНИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДА НА [згР1МЕЧЕНЬЕ КЛЕТОЧНЫХ ФОСООЛИПИДОВ Одним из свойств рецепторов является их сопряжение с системами вторичных посред-ов клетки. Взаимодействие лиганда с рецептором, сопряженным с одной из сигнальных тем, может приводить к индукции ' быстрых био-

|ических изменений в мембране клетки, приводящих к изменению всей ее последующей ;ни. Инкубация культур клеток в присутствии в среде [згР]ортофосфата и лиганда, к которо-на поверхности клеток имеются рецепторы, позволяет выявить наличие сопряжения данно--ипа рецептора с той или иной системой вторичных посредников - ФИ-или ФХ- специфич-I фосфолипазы С, фосфолипазы й и ДАГ-киназы (Рис.2). Рецептор-опосредованная акти-[ия любой из фосфолипаз С приводит к образованию ДАГ, который быстро фосфорилиру-я с образованием радиоактивно меченой ФК благодаря активности ДАГ-киназы. Расщепле-! липида - источника ДАГ компенсируется увеличением скорости его ресинтеза из радиоак-но меченой ФК, что приводит к усилению радиоактивного меченья липида-источника. Кро-того, образование меченой ФК может происходить в результате рецептор-опосредованной ивации фосфолипазы й и гидролиза предмеченых липидов. И, наконец, недавно обнару-ю, что ДАГ-киназа - регулируемый фермент, к активации которого может приводить взаи-;ействие рецептора с лигандом.

лиганд-рецептор

.2. Схема усиления [33Р1кругооборота фосфатндовон кислоты при рецептор-опосредованной мулпцин фосфолипаз С и О.

показано на Рис.ЗА, добавление олигонуклеотида 1< клеткам приводило к увеличению

[32р]меченья фосфатидовой кислоты (ФК), меченье остальных фосфолипидов не менял Добавление олигонуклеотида другой последовательности - декатимидилата, рТ10, к 1929 к кам также приводило к увеличению радиоактивного меченья ФК (Рис. ЗБ). Поскольку доба!

ФК > 4 ' 0 S

I 0 ро

%ф ti©

ФХ> ®© ©©

© Л г&т-ёД % А

В

bis •

Р- Р

V—' О

OdN время

+ +

120'

- + - + - + 13' 21' 50'

- + 40"

Рис. 3. Влияние олнгонуклеотнда на |згР|меченье клеточных фосфолипидов. А - чере: ч после добавления рТю, 1 мкМ, Б и В - кинетика радиоактивного меченья фосфолипидо! после добавления pEi6l 1 мкМ . ние олигонуклеотида приводило к увеличению [32р]меченья ФК уже через 40 секунд (Рис. можно предположить, что обнаруженный эффект олигонуклеотида на мембрану обусло: взаимодействием OdN с поверхностными рецепторами клетки, а не проникновением внутрь.

ВЛИЯНИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДА НА УРОВЕНЬ ДАГ В КЛЕТКЕ Увеличение [32Р]кругооборота ФК при добавлении лиганда может являться результг как увеличенного образования диацилглицерола (ДАГ) в клетке, так и повышения актив» ДАГ-киназы, фермента, обеспечивающего постоянное фосфорилирование ДАГ до ФК.

= 5200 —

ч о

ы я

4

L-

П

И

<

и

4800 -

4000

4400 - -1-

1 Г

О 6 10 15 20 25 30 ВРЕМЯ ПОСЛЕ ДОБАВЛЕНИЯ ОН, мин.

I ' Г

00 04

КОНЦЕНТРАЦИЯ ОН, мк.\

Рис. 4. Влияние олигонуклеотидов на содержание в клетке ДАГ н ФК. А - кннетпк менения уровня |14С]ДАГ в Ь929 клетках после добавления рЕ^ (1 мкМ). зависимость содержания [14С]ДАГ и |32Р1ФК от концентрации добавленного рЕиб.

Измерение уровня ДАГ в [1,,С]ацетат-предмеченых клетках показало, что добавление 1Гонуклеотида к фибробластам не только не приводит к ожидаемому увеличению уровня точного [14С]ДАГ, но, напротиз, вызывает его постепенное уменьшение (рис. 4А). Исполь-1ание олигонуклеотида другого состава давало аналогичные результаты. Для установления [имосвязи между увеличением [32Р]кругооборота ФК и количеством ДАГ в клетке, 1.929 фиб-Зласты предметили [14С]ацетатом, а затем добавляли в различных концентрациях ОсМ и

ы 32

>]ортофосфат. Одновременное измерение [ С]радиоактивности ДАГ и [ Р]радиоактивности в клетках после добавления различных концентраций олигонуклеотидов показало, что: N дозозависимо стимулирует [32Р]меченье ФК в клетке и снижает содержание [14С]ДАГ в 2тке (рис. 4Б). Следовательно, можно предположить, что уменьшение ДАГ вызвано увели--1ием скорости его фосфорилирования до ФК клеточным ферментом ДАГ-киназой. Измере-е активности протеин киназы С в клеточных мембранах в присутствие других ее активато-о ров - Са2* и фосфатидилсерина (ФС), может служить

% независимым способом определения уровня ДАГ в

Г* Г1

120Ю | сЗ и клетке, поскольку активность мембранной протеин

киназы С зависит от уровня ДАГ. При исследовании влияния олигонуклеотида на активность протеин киназы С в клетке было обнаружено, что добавление олигонуклеотида к клеткам приводит к снижению активности протеин киназы С в мембранной фракции клеток (рис. 5). Т. о., определение содержания [14С]ДАГ в [1<С]ацетат-предмеченых клетках служит прямым, а измерение активности протеин киназы С в клеточных мембранах косвенным доказательствами того, что олиго-нуклеотид вызывает снижение ДАГ в мембране клеток.

■е- о 4000

О -I

мембраны контрольных ОдН-обраб-х клеток клеток

Рис. 5. Эффект 30-мннутной предин-кубации клеток с 0().\ на уровень активности ПКС в мембранах клеток.

ЗАХВАТ ОЛИГОНУКЛЕОТИДА КЛЕТКАМИ Несмотря на то, что данных о присутствии на' поверхности клеток специфических ре-рпторов для ОсМ в литературе достаточно много, их участие в процессе проникновения Ос!Ы клетку не показано. Предварительная инкубация клеток с ОсМ должна приводить к умень-.юнию числа экспонированных рецепторов и снижению захвата ОсМ\|, в том случае, если дан-|ый тип рецептора участвует в процессе транспорта Ос1Ы и не способен к рециклизации.

Динамику захвата ОсМ исследовали, инкубируя 1.92Э клетки с 5'-[32Р]меченым 16-зенным олигонуклеотидом рЕ^. Было обнаружено, что прединкубация с немеченым Ос1М приводит к последующему увеличению захвата [згР]радиоактивномеченого ОсМ клетками в

2 раза. Полученный результат не дает ответа на вопрос участв ли поверхностные рецепторы для OdN в процессе их транспо внутрь клетки. Однако, тот факт, что прединкубация клеток с С приводит к увеличению скорости их захвата может быть объяс увеличением скорости эндоцитоза. Известно, что ФК играет в ную роль в мембранном транспорте, т.к. ее образование в кле может индуцировать нарушения в структуре липидного бисг облегчающие контакт мембран и их слияние в процессе внут клеточного мембранного транспорта. Можно предположить, именно индукция образования в клетках ФК, обусловленная вз модействием OdN с его рецептором, ответственна за увеличе! скорости эндоцитоза и, следовательно, захвата меченого С клетками.

На основании вышесказанного была предложена след; щая цепь событий, отражающая индуцируемый характер проце> захвата олигонуклеотидов клеткой. 1) OdN взаимодействует

"рецептором" 79 кДа, что приводит к активации ДАГ-киназы и у Рис. 6. Влияние прсд-

иикубацни клеток с OdN личению образования ФК, 2) ФК облегчает процесс слияния mi

на захват [32Р] меченого бран и ускоряет процесс эндоцитоза. При этом увеличивав' OdN.

скорость захвата олигонуклеотида. Поскольку ранее было пока но, что взаимодействие поверхностных рецепторов для OdN конкурентно ингибируется доб лением ДНК, можно предположить, что взаимодействие экзогенной ДНК с поверхностью к. ток и ее проникновение внутрь будут протекать по механизму, аналогичному таковому f. олигонуклеотидов.

Тем не менее, как ДНК, так и олигонукпеотиды проникают внутрь клетки крайне неэфф тивно. Поэтому для доставки лолинукпеотидов внутрь клеток разработан ряд методов, обл чающих их проникновение в цитоплазму. В качестве векторов для доставки НК внутрь эу риотических клеток липосомы используются уже с конца 1970 гг. Варьирование липидного става липосом позволяет подобрать оптимальные условия для обеспечения адсорбции слияния липосом с клетками и увеличить эффективность доставки ДНК. Однако, широко использованию фосфолипидных липосом в значительной мере препятствует их нестаби] ность. В связи с этим продолжается поиск новых липидов, способных к организации стаби! ного липидного бислоя. Везикулы, образованные из фосфолипидов археобактерий, непро) цаемы в широком дипазане температур даже для протонов, что делает перспективным их i пользование в качестве носителей водорастворимых веществ, в том числе полинуклеотидов, in vivo.

АРХЕОЛИПОСОМЫ

В настоящей работе была изучена возможность использования липосом, приготовленных основного фосфолипида археобактерии ТЬегтор1азта ас^орЬИит (археолипосом) в каче-ве новой системы для доставки генов. Липиды археобактерии отличны по структуре от обычных жирнокислотных липидов про- и

Рис. 7. Структура основного фосфолипида археобактерий ТИегтор1азта аЫс!орИИит. кариот и представляют собой две молекулы глицерола, ковалентно соединенные простой )ирной связью с двумя разветвленными длинными углеводородными цепями. Как простая 1ирная связь, так и отсутствие лабильных двойных связей обеспечивают высокую стабиль-сть мембран археобактерий по отношению к окружающим условиям. Кроме того, отличи-льной особенностью археолипидов является их биполярная структура, позволяющая фор-фовать монослойный липидный слой в отличие от бислоя, который формируют обычные эсфолипиды. Такая мембрана непроницаема даже для протонов и позволяет экстремаль-1М термоацидофилам выживать в горячих серных источниках при рН 2, температуре 60°С.

Структура основного фосфолипида Пегтор/азта аас1ор11Иит, составляющего 60% от

Тритон х-100

Тритон Х-100

ФХ лнпосомы

археолипосомы

4 6

Время, дни Время, мин

>нс. 8. Стабильность ФХ -вых и археолипосом при хранении и добавлении плодовой сыворотки, »цененная по флуоресценции КФ, заключенного в везикулы в 25 мМ концентрации.

щего содержания липидов в археобактерии изображена на рис. 7. Ранее было показано, что от липид может формировать везикулы (археолипосомы), отличительным свойством кото-IX является их стабильность в широком диапазоне рН и температур [Рге1$1еЬеп Ю., 1995]. юницаемость археолипосом была оценена нами с помощью карбоксифлуоресцеина (КФ),

заключенного в липосомы в самопогашающей концентрации, и сравнена с таковой для фс фатидилхолиновых (ФХ) липосом. При этом было обнаружено, что археолипосомы стабиг нее ФХ липосом как при хранении, так и при добавлении плодовой сыворотки (Рис. 8А и I Полученные результаты имеет прежде всего практическое значение, поскольку позволя предположить, что археолипосомы будут и в кровотоке стабильнее ФХ липосом, что дела перспективным использование их в качестве транспортных ситем /л vivo .

Для того, чтобы эффективно доставлять ДНК внутрь клеток, липосомы -"транспорте; ДНК" должны удовлетворять следующим условиям: 1) связываться с клетками, 2) облада фузогенностью для того, чтобы проникать в цитоплазму клеток благодаря слиянию с плази/ тической мембраной либо с внутриклеточными мембранами; 3) связывать или захватывать I и обеспечивать их проникновение внутрь клеток.

Способность археолипосом связываться и проникать внутрь клеток оценивали с пол/ щью везикул, содержащих во внутреннем объеме 25 мМ КФ и сравнивали с таковой для d липосом. Было обнаружено, что связанная с клетками гепатомы, HepG-2, флуоресценция K<t случае использования археолипосом в 10-15 раз выше таковой в случае использования d липосом (Рис. 9). Повышенное сродство к клеткам археолипосом по сравнению с ФХ липос мами было продемонстрировано на ряде других клеток - карциномы кишечника (НТ-29), кпе ках почки хомячка (ВНК), яичника китайского хомячка (СНО), легкого человека (CF-Pac) и пе

Поскольку ранее было показано, что липосом несущие отрицательный заряд, связываются клетками сильнее чем нейтральные липосомы, с ставленные из цвиттерионных липидов, таких к ФХ [Straubinger R.M., 1993], можно предположит что повышенное сродство археолипосом к клетк. обусловлено наличием отрицательного заряда их поверхности.

Способность археолипосом сливаться клетками была исследована с помощью флуор( центно меченых везикул методом флуоресце! ной микроскопии. Было обнаружено, что инку( ция клеток в течение 70 мин, 37°С с археолипо( мами, содержащими в мемораннои части археолипид, меченый родамином, приводит к no¡ лению точечной флуоресценции, ассоциированной с клетками, тогда как более продол* тельная инкубация (120 мин) приводит к развитию диффузной окраски в клетках, что сви; тельствует о смешении липидов в результате слияния мембран археолипосом и клеток. Т. археолипосомы эффективно сорбируются на поверхности клеток и сливаются с ними.

вичной культуре фибробластов человека.

Концентрация .ишида, мкг/мл

Рис. 9. Захват карбокснфлуоресценна, заключенного в архео- нлн ФХ-лнпосомы, клетками HepG-2.

200

Процесс слияния мембран археолипосом и клеток, необходимый для проникновения ржимого липосом в цитоплазму, был изучен с помощью модельной системы, в которой в :тве аналогов клеток были использованы ФХ липосомы. Взаимодействие отрицательно «енных археолипосом и цвиттерионных ФХ-липосом в среде с низкой ионной силой обес-валось добавлением ионов Са2*. Было обнаружено, что добавление двухвалентных ка-эв к смеси археолипосом, содержащих 25 мМ КФ и "пустых" ФХ липосом приводит к раз-нию флуоресценции карбоксифлуоресцеина, что свидетельствует о дестабилизации 400 — Л — Б мембран археоли-

посом (Рис. 10А). Аналогичные эксперименты, проведенные со смесью ФХ липосом, содержащих 25 мМ КФ, и "пустых" археолипосом, показали, что индуцированное двухвалентным катионом взаимодействие

юом приводит к дестабилизации ФХ мембраны (Рис. 10Б). Повышение ионной силы раса предотвращало взаимодействие мембран между собой и их дестабилизацию. Добавле-Саг* только к ФХ или археолипосомам, вызывало незначительное увеличение проницае-

0

20 30 40 50 0 40 80

Время после добавления Са, мин

"Тго' 160' 200

с. 10. Взаимодействие архео- н ФХ липосом приводит к дестабилизации чбран как археолипосом (А) так и ФХ везикул (Б). Кинетика нзмене-я флуоресценции КФ, заключенного в везикулы после добавления к еси липосом Са2+ (5 мМ).

мости мембраны. Таким образом, именно взаимодействие абсолютно различных по структуре липидных слоев приводило к их дестабилизации.

Известно, что дестабилизация мембран может сопутствовать процессу их слияния. За смешением липидов следили по изменению эффективности переноса между двумя флуоресцентными аналогами фосфатидилэтаноламина (ФЭА) - НБД-ФЭА и Род-ФЭА, встроенных в мембрану ФХ липосом. Флуоресцентно меченые ФХ

липосомы смешивали с 10-кратным избытком 11. Слияние мембран ФХ везикул и ар-

ипосом, оцененное по степени эффектнв- археолипосом. Было обнаружено, что добавлен ГПЭФ между НБД-ФЭА и Род-ФЭА, нт Сдг. к смеси липосш прив0дит к снижению

эффективности переноса энергии флуоресцен-

40

>>30 -

и 20 -3

МО ■

540

560 I

580

юенным в мембрану ФХ липосом.

ции, что отражается в спектре флуоресценции (Рис. 11). Последнее является результ разбавления флуоресцентно меченых аналогов лилидов, произошедшего в результате < ния мембран. Т.о., опосредованное ионами Ca2* взаимодействие ФХ липосом с археоли; мами сопровождается дестабилизацией и слиянием мембран. Можно предположить, взаимодействие мембран археолипосом и фосфолипидной части клеточной мембраны, таточное для индукции их слияния, возможно, и является механизмом, опосредующим с ние археолипосом с клетками.

Можно заключить, что археолипосомы стабильнее фосфатидилхолиновых липе эффективно сорбируются на клеточной поверхности и способны сливаться с клетками, е ятно в результате контакта с фосфолипидной частью клеточной мембраны. В силу выш( занного использование археолипосом представляется весьма перспективным для дост водорастворимых веществ внутрь клеток. Однако при использовании археолипосом для тавки ДНК в культуру клеток линии ВНК, было обнаружено, что археолипосомы являются ко эффективными для трасфекции культуры клеток. Одной из наиболее вероятных пр этому являлась низкая эффективность захвата ими ДНК. Проблемы низкой эффективн инкапсуляции ДНК внутрь липосом, так же как и трудоемкости этого процесса были остро' решены работами [Felgner P.L., 1987, Behr J.P., 1989], которые независимо разработа предложили к использованию для трансфекции два различных синтетических катионны> пида. Благодаря наличию положительного заряда эти липиды способны формировать плексы с НК и обеспечивать их проникновение внутрь клеток.

КАТИОННЫЕ АРХЕОЛИПОСОМЫ

В настоящей работе была исследована возможность применения нового катион липида, производного археолипида (архифекта). для трансфекции клеток в культуре. Стр; ра архифекта приведена на рис. 13. Данный липид обладал высокой стабильностью и име принципиально новую биполярную структуру. Поскольку ранее нами была показана спс

">4+ Î

Рис. 13. Структура катиониого производного археолипида- архифекта. ность археолипосом сливаться с фосфолипидными мембранами, то было предположено, данное производное, синтезированное на основе археолипида, будет способно прони внутрь клеток и, возможно, опосредовать транспорт нуклеиновых кислот.

Для данного производного археолипида нами были охарактеризованы: его способж формировать комплексы с ДНК, проникать внутрь клеток и обеспечивать проникновение и прессию чужеродной ДНК.

5 х et

J

Концентрация архифекта, цМ 14. Образование комплекса АФ'.ДНК. (А) Зависимость флуоресценции ЭБ-ДШС комплекса от 1чсства архифекта (Б) Ретардация комплекса ДНК -архифект в 1% агарозе.

Образование комплекса катионные археолипосомы: ДНК оценивали по флуоресценции листого этидия (ЭБ). Поскольку образование комплекса ДНК с катионными липидами лре-|ращает интеркаляцию бромистого этидия (ЭБ) в молекулу ДНК, флуоресценция комплек-'Б-ДНК пропорциональна количеству свободной ДНК в растворе. ДНК-липидный комплекс (формировали в различных соотношениях липид: ДНК, после чего добавляли ЭБ и изме-1 флуоресценцию (Рис.14А). Кроме того, образование ДНК-липосомного комплекса было |едовано методом гель-электрофореза ДНК в 1% агарозе (Рис. 14Б). Формирование комет ДНК с катионными липосомами приводит к ретардации ДНК в геле. Было обнаружено катионные археолипосомы образуют задерживаемые в геле комплексы с ДНК, при соот-энии 1+ 0,3 моля липида на 1 моль ДНК, что совпадает с оценкой, полученной с помощью

Возможность использования катионных археолипосом для трансфекции была исследо-на культуре клеток почек хомячка ВНК с помощью ппазмиды pSV-lacZ, несущей ген ß-ктозидазы. Эффективность положительно заряженного производного археолипида для сфекции оценивалась как процентное соотношение голубых клеток после проявления ß-ктозидазы in situ в клетках линии ВНК. Было обнаружено, что оптимальным для транс-4ии является молярное соотношение ДНК/липид = 1:1 (Рис. 15А), из которого следует, что цну фосфатную группу ДНК приходится две положительно заряженные группировкам ли-¡. Следовательно, наиболее эффективные ДНК-липидные комплексы заряжены положи-но. Вероятно, одна положительно заряженная группа архифекта взаимодействует с молей ДНК, тогда как другая экспонирована в водную среду.

И-1-1-1-1-1-г

О 5 10 15 20 25 30 Концентрация липида, мкМ

0 10 20 30 40 50 60 70 Время после трансфекции, ч

Рис. 15. Зависимость эффективности трансфекции ВНК клеток от концентрации липида при I стояниой концентрации плазмидной ДНК (4 ц.М) (А). Кинетика экспрессии р-галактозидазы в клетках ВНК, трансфецированиых с помощью катионного археолипида (Б). Концентрация Д1 мкг/мл, лнпида 5 мкг/мл.

2.0

Максимальная экспрессия наблюдалась через 19 часов после окончания 5-часовой инкуб

клеток с комплексом ДНК-архифект. Трансфекция носила временный характер (Рис. 15Б).

При исследовании роли эндоцитоза в процессе проникновения комплекса архи£(

ДНК было обнаружено, что присутствие 100 мкМ хлорокина

я гибитора эндоцитоза, снижает эффективность трансфекци

75% (Рис. 16). Это предполагает, что комплекс архифект

проникает в клетку путем эндоцитоза. Мембрана эндосом !

ется в этом случае первым клеточным барьером, лежащи

пути ДНК к ее экспрессии. Тот факт, что инкубация клеток с

липидным комплексом, тем не менее, приводит к экспресси

жеродных генов, свидетельствует об обратном - о том, что 1

ДНК избегает разрушения в эндосомальном компартменте.

Одним из механизмов, объясняющих способность ка'

ных липидов "избегнуть" разрушения в эндосомах, являет!

способность к слиянию с клеточными мембранами. За слия

катионных археолипосом с мембранами клеток следили

Рис. 16. Влияние ингибитора МОщЬГО археолипосом, содержащих в мембранной части » эндоцитоза на эффективность трансфекции. ный родамином археофосфолипид. Через 70 мин инкуба!.

клетках была обнаружена только диффузная флуоресценция, что свидетельствовало о I

ром слиянии катионных археолипосом с мембранами клеток. Т.о. слияние археолипос

клеточными мембранами, является, по-видимому, одним из механизмов, обеспечива!

проникновение ДНК через мембрану эндосом. Т.о., катионные археолипосомы способны

мировать комплексы с ДНК, сливаться с клеточными мембранами и обеспечивать прон

е и экспрессию чужеродной ДНК внутрь клеток, и, следовательно, представляют несомый практический интерес.

Альтернативная система формирования комплекса ДНК-липосомы была предложена в те [Вийкег V., 1996], в которой взаимодействие ДНК и отрицательно заряженных липосом печивали добавлением гистона Н1, положительно заряженного ядерного белка, обеспе-ющего первый уровень компактизации ДНК в хроматине. Результатом добавления трой-комплекса липосомы гистон ДНК к клеткам являлось проникновение ДНК внутрь клеток и <спрессия.

Ранее было показано [Беляев Н.Д.,1982], что хроматин и хромосомы способны форми-1ть комплексы с цвиттерионными ФХ мембранами. При электронно-микроскопическом ис-(овании хромосомно-липосомных комплексов было обнаружено, что их образование со-юждается формированием мультиламмелярных пипидных слоев, окружающих хромосо-Киселева Е В , 1984]. .Нами было предположено, что в составе метафазных хромосом мо-находиться фузогенная активность, обеспечивающая слияние липосом и формирование 1дных мультислоев. Такая активность может обеспечивать протекание одной из стадий жструкции ядерной оболочки, происходящей в клетке по завершении митоза, - слияние оных везикул. Кроме того, поскольку фузогенная активность необходима для пересечения риклеточных мембран и проникновения макромолекул в цитоплазму клетки, хромосомные ки, обладающие не только способностью формировать комплексы с ДНК, но и стимулиро-' > слияние мембран, можно было бы использовать для конструкции транскрилционно-петентных комплексов. Таким образом, одной из задач данной работы было исследование ичия фузогенной активности в составе метафазных хромосом, изолированных из фиброб-тов, с помощью фосфатидилхолиновых липосом.

СЛИЯНИЕ МЕМБРАН »X ЛИПОСОМ ПРИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ХРОМОСОМАМИ. Способность хромосом, выделенных из метафазных клеток фибробластов мыши 1,929, зывать везикулы была оценена с помощью [14С]ДПФХ-меченых липосом. При концентра-ДНК 160 мкмоль/мл и липида 125 нмоль/мл в инкубационной смеси, содержащей ЗмМ изолированные метафазные хромосомы связывают 36 нмоль липида на 160 мкмоль <. Оценку слияния мембран липосом проводили, используя вышеупомянутый метод РПЭФ. амосомы или ДНК инкубировали с флуоресцентно мечеными липосомами, содержащими Ц-фосфатидилэтаноламин (НБД-ФЭА) и Род-ФЭА, и 10-кратным избытком немеченых ли-:ом в присуствии ионов Са2* или полиаминов. Спектры флуоресценции исходных липосом и юсом, несвязавшихся с хромосомами, практически идентичны, тогда как спектр флуорес-щии липосом, освобожденных из комплекса с хромосомами, свидетельствует об уменьше-1 эффективности переноса энергии, произошедшем в результате разбавления флуорес-1тных маркеров при слиянии меченых и немеченых липосом (Рис. 17). Калибровочная кри-) дает приблизительное значение степени разбавления флуоресцентных липидов в мем-

бране в 7,7 раза, соответствующее увеличению радиуса в 2,77 раз. Поскольку адсорбф посом на ДНК в присутствие ионов Са2* не индуцирует слияния, можно предположить, чт дукции слиянии липосом определяется хромосомными белками. Слияние везикул мож( провождаться нарушением целостности мембран в результате формирования промежутс липидных инвертированных мицелл.

С помощьи посом, содержащи боксифлуоресцеин самопогашающей центрации, или : помощью липоож держащих в мемЕ радиоактивно меч липид [11С]ДПФ> внутри [32Р]АТФ, показано, что об вание хромосс липосомного компг приводит к нез1 тельному наруш проницаемости бран липосом, чтс зволило перейти I следованию объе; ния внутренних с мов липосом.

супернатант II

600

Рис. 17. Схема эксперимента, иллюстрирующая слияние мембран липосом, находившихся в комплексе с хромосомами. А - спектр флуоресценции исходных липосом, Б • липосом, не связавшихся с хромосомами, и В - липосом, освобожденных из комплекса с хромосомами.

Смешение I ренних объемов 01 Ьалось с помощьк посом с нефлуорЕ рующим тер

цитратный комплексом и липосом с дипиколиновой кислотой. В результате слияния везик^ содержимое смешивается и образуется флуоресцирующий тербий-дипиколиновый комш Инкубация липосом с хромосомами, но не ДНК, приводила к появлению флуоресценци длине волны 545 нм, соответствующей мажорному пику флуоресценции тер

иколинового комплекса, что свидетельствует о смешении внутренних объемов. Подтвердив факта слияния везикул на поверхности хромосом было получено независимо методом ктронной микроскопии (рис. 18).

Средний диаметр исходных везикул составляет 300А, везикул, не связавшихся с хромосомами, - 400А. Везикулы, освобожденные из комплекса с хромосомами, гетерогенны по размеру и содержат две субпопуляции липосом, средний размер первой из которых близок к таковому исходных везикул, тогда как средний размер везикул второй субпопуляции составляет приблизительно 700 А, что больше диаметра исходных в 2,5 раза. Т. о., оценки степени слияния везикул в составе хромосомно-липосомного комплекса, полученные методом РПЭФ и электронной микроскопии, хорошо коррелируют между собой.

Таким образом, в составе метафазных хромосом было обнаружено наличие фузогенного белкового фактора, вероятно, обеспечивающего рекон-/кцию ядерной оболочки в телофазе митоза. В перспективе идентификация такого факто-обладающего с одной стороны, сродством к ДНК, и с другой стороны - фузогенной актив-гью, может оказаться полезной для создания новых трансфекционно-компетентных ком-ксов. зоды:

1. Исследованы параметры взаимодействия 16-звенного олигонуклеот11да с поверхностью клеток 1.929 и динамика его захвата. Обнаружено, что специфическое взаимодействие Ос1Ы с поверхностью клеток (Кс1 4Ю"9 М) приводит к быстрому увеличению [32Р]меченья фосфатидовой кислоты, сопровождающемуся одновременным понижением уровня клеточного диацилглицерола и увеличением скорости захвата олигонук-леотида клеткой. Предложен механизм проникновения олигонукпеотидов внутрь клеток.

2. Впервые продемонстрирована эффективность использования археолипосом для доставки водорастворимых веществ внутрь клеток и сравнена с таковой для фосфа-тидилхолиновых липосом. На 6 типах исследованных клеток показана афинность данного типа липосом к клеткам, превышающая таковую для ФХ-пипосом в 5-15 раз. Использование археолипосом, содержащих в мембранной части флуоресцентный аналог археолипида, показало, что липосомы сливаются с клетками.

I

Диаметр липосом, А

8. Распределение по размерам ( I ) -[ых липосом, ( II ) -липосом, не свя-хся с хромосомами н ( III ) - липосом плекса с хромосомами.

3. Изучение механизма слияния археолилосом с клетками, проведенное с n0M0L модельной системы, состоящей из фосфатидилхолиновых везикул, археолипосс ионов Саг\ показало, что взаимодействие мембран фосфолипидных везикул и хеолипосом приводит к дестабилизации их мембран и их смешению. На основа этого было предположено, что механизмом, обеспечивающим слияние археолипо и клеток, является взаимодействие мембран археолипосом с фосфолипидной час клеточной мембраны.

4. Показано, что липосомы, приготовленные из биполярного катионного произвол! археолипида, способны быстро проникать в клетку путем эндоцитоза, при этом и браны археолипидов и клеток смешиваются. Новый катионный археолипид спосс формировать комплексы с ДНК и обеспечивать трансфекцию клеток, зффективн! которой в оптимальных условиях достигает 12%.

5. Исследована способность изолированных метафазных хромосом формировать плексы с фосфатидилхолиновыми липосомами. С использованием методов флуо центной спектроскопии и электронной микроскопии показано, что формирование мосомно-липосомного комплекса приводит к слиянию липосом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Балакирева Л.А. Создание модельных бесклеточных систем для изучения процесса рекон струкции ядерной оболочки / / Материалы конференции молодых ученых и специалистов КазГУ, Алма-Ата. -1989. - С. 177.

2. Belyaev N.D., Budker V.G., Balakireva L.A., Dubrovskaya V.A. Interaction of isolated chromosomes with the liposomes. / / Cell Biology International Reports. - 1990 - V.14. - P. 80.

3. Balakireva L A. Belyaev N.D., Budker V.G., Kiseleva E.V. Metaphase chromosomes from mammalian cells stimulate fusion ofartificial phospholipid vesicles.// FEBS Letters. -1991. - V. 28 P. 203-205.

4. Vlassov V.V., Balakireva L.A., Yakubov L.A. Transport of oligonucleotides across natural and model membranes. / / Biochimica Biophysica Acta.- 1994. - V.1197.-P. 95-108.

5. Vlassov V., Yakubov L., Nechaeva M., Pautova L., Rykova E., Laktionov P., Vlassova I. Balakireva L. Molecular interactions of oligonucleotides in organism - a source of broad spectru biological activities. / / Phosphorus, Sulfur and Silicon. - 1996- V. 111. - P. 78.

6. Balakireva LA, Levashova Z.B., Chroboczek J., Vlassov V.V. Rapid sequence-independent eel response to oligodeoxynucleotides. / / FEBS Letters. - 1997. - V. 400. - P. 267-270.

7. Balakirev M., Balakireva L. Transfection of eucariotic cells with a new cationic bipolar derivativ tetraether lipid. - In. Membrane Structure in Disease and Drug Therapy./ Ed. by Dekker M , Zimms New York. - 1998 (in press).

i