Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности деградации полигидроксиалканоатов в лабораторных и природных условиях

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности деградации полигидроксиалканоатов в лабораторных и природных условиях"

003457827

На правах рукописи

Вонпова Ольга Ннколаевпа

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ДЕГРАДАЦИИ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ В ЛАБОРАТОРНЫХ И ПРИРОДНЫХ УСЛОВИЯХ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 2008

003457827

Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Волова Татьяна Григорьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Бондарь Владимир Станиславович

доктор химических наук, профессор Миронов Петр Викторович

Ведущая организация:

Казанский Государствешшй Университет, кафедра микробиологии

Защита диссертации состоится «¿3»•QtuddJiA 2008 года в часов на заседании диссертационного совета Д 003.007.01 в Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, Красноярск, Академгородок, д. 50, стр. 50

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики

СО РАН

Автореферат разослан » Л 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Франк Л.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. За последнее десятилетие спрос на синтетические пластмассы на мировом рынке увеличился более чем на порядок, и к 2010 году достигает 250 млн. тонн (Пономарева и др., 2002). Такой прогноз вызывает обоснованную тревогу, связанную с накоплеш!ем отходов синтетических полимерных материалов в окружающей среде, что может принести к необратимому нарушению экологического равновесия в биосфере. Радикальным решением данной проблемы является освоение полимеров биологического происхождения, которые под действием биологических агентов (ферментов, клеток) подвергаются деградации с образованием нетоксичных для природной среды продуктов (диоксида углерода и воды).

Среди применяемых и активно разрабатываемых в настоящее время биоразрушаемых материалов особое место принадлежит полимерам микробиологического происхождения - полигидроксиалканоатам (ПГА). Эти полимеры, помимо термопластичности, аналогично полипропилену и полиэтилену, обладают спектром ценных свойств, таких как антиоксидантные свойства, биосовместимость и, самое главное, биоразрушаемость. Эти свойства делают данные полимеры востребованными в медицине, фармакологии, пищевой и косметической промышленности, сельском и коммунальном хозяйстве (Brandl et al., 1990; Dawes, 1990; Amass, 1998). Одной из причин сдерживания широкого применения ПГА является нсизученность механизмов их деградации, как в лабораторных, так и в природных условиях. В основном, исследования деградации ПГА выполняются в модельных средах с использованием чистых микробных культур или деполимеризующих ферментов. Это не позволяет прогнозировать картину разрушения данных полимеров в условиях природной среды. Поэтому необходимо изучение закономерностей биодеградации ПГА в биологических средах, включая сложные и постоянно изменяющиеся реальные природные условия.

Цель и задачи исследования. Целью работы является сравнительное изучение биодеградации полигидроксиалканоатов в лабораторных и природных условиях и выявление факторов, влияющих на этот процесс.

Для достижения цели сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать биодеградацию ПГА в лабораторных условиях в зависимости от химического состава и свойств полимеров, и способа переработки их в изделия.

2. Выявить закономерности биодеградации микрочастиц из ПГА в экспериментах на лабораторных животных.

3. Исследовать биоразрушаемость ПГА в природных условиях под воздействием почвенной микрофлоры и идентифицировать микроорганизмы-деструкторы полимера.

4. Изучить биодеградацию ПГА в водных экосистемах на примере пресных водохранилищ (Бугач и Лесное) и соленого озера (Шира).

Научная повизпа. Впервые проведены комплексные исследования биодеградации полигадроксиалканоатов в лабораторных и природных условиях, выявлены зависимости скорости деградации ПГА от структуры полимера, типа и условий среды. Установлена разрушаемость микрочастиц из ПГА в биологических средах in vivo (кровь, ткани органов, мышцы); деградация структуры полимерного матрикса начинает проявляться при длительности эксперимента 12 и более недель. Определены скорости биодеградации ПГА в почве, пресных водоемах и соленом озере, которые, соответственно, составили (1,6 -15)х10"3 сут1; (3-77)х10"3 сут"1; (1-3,4)х10"3 сут"1. Впервые установлена биоразрушаемость ПГА в анаэробной зоне природных водоемов. Идентифицированы микроорганизмы-деструкторы ПГА в почве: бактерии -Agrobacterium sp., Cellulomonas sp., Bacillus fastidiosus и грибы - Paecilomyces lilacitrus, Aureobasidium pullulons, Pénicillium canescens, Pénicillium corylophyloides.

Практическая значимость. Выявленные закономерности биодеградации полигидроксиалканоатов позволяют прогнозировать динамику распада полимерных изделий в природных условиях в почве, в пресных и соленых водоемах, различающихся структурой и микробным пейзажем. Установлена возможность применения полигидроксиалканоатов в качестве матрикса для депонирования и долговременной доставки препаратов (лекарств, пестицидов).

Положения, выносимые на защиту.

1. Био деградация ПГА зависит от структуры и способа переработки полимера, температуры среды и активности биологического агента (микробоценоз природной экосистемы, клетки макрофагалыюго типа in vivo).

2. Удельные скорости деградации ПГА в почве составляют от 1,6х10~3 до 1,5хЮ"2 сут"1, в зависимости от состава почвенной микрофлоры в местах произрастания деревьев разных видов. Идентифицированные доминирующие микроорганизмы-деструкторы ПГА: бактерии - Agrobacterium sp., Cellulomonas sp., Bacillus fastidiosus и грибы - Paecilomyces lilacinus, Aureobasidium pullulons, Pénicillium canescens, Pénicillium corylophyloides.

3. Закономерности био деградации ПГА в природных водоемах определяются состоянием водной экосистемы. Скорости деградации ПГА в аэробной зоне различных водоемов составляют (2-77)хЮ"3 сут"1, в анаэробной зоне - (1-58)х 10"3 сут"1.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на X Международной конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Социально-экологические проблемы природопользования в Центральной Сибири» (Красноярск, 2006); конференции молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск 2007); IX Европейском симпозиуме по биополимерам (Турция, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 5 статей в рецензируемых научных журналах.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка использованных литературных источников.

Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 37 рисунков и 11 таблиц. Список цитируемой литературы насчитывает 182 источника, в том числе 155 иностранных.

Работа выполнена в рамках плановой тематики НИР Института биофизики СО РАН, № госрегистрации 01.200703091, а также при поддержке Министерства образования и науки РФ и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) (фант № Р1М0002), РФФИ (грант № 07-0896800), ККФН (индивидуальный грант для молодых ученых №18G142), Фонда содействия отечественной науке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Во введении обоснована актуальность работы, изложены цели и задачи работы, показана научная новизна и практическая значимость проводимых исследований.

В первой главе проводится анализ известных результатов исследований по биодеградации ПГА в модельных биологических средах. Рассмотрены основные пути их биоразрушения, выявлены факторы, оказывающие наибольшее воздействие на скорость биодеградации данных полимеров. Проанализировано современное состояние исследований in vivo деградации ПГА. Обоснована целесообразность изучения биодеградации ПГА в природных условиях во взаимосвязи с постоянно меняющимися условиями окружающей среды.

Во второй главе рассматриваются объекты и методы исследования. Использовали полимеры двух типов (полимер ß-гидроксимасляной кислоты (111 Б) и сополимеры ß-гидроксибутирата и ß-гидроксивалерата (ПГБ/ПГВ)), полученные в Институте биофизики СО РАН в условиях Опытного производства полигидроксиалканоатов. Для синтеза полимеров использовали штамм водородных бактерий Wautersia eutropha ВКЛМ-5786 (прежние названия Ralstonia eutropha -Alcaligenes eutrophus), которые культивировали в условиях лимитирования роста по азоту (Волова и др., 1992). Исследовали экспериментальные образцы полимеров в виде 2-х и 3-х мерных матриксов, моножильных нитей, гранул и микрочастиц (рис. 1).

(а) (б) (в) (г) (д)

Рис. 1. Образцы полимерных изделий из полигидроксибутирата, полученные разными способами: а - пленка, б - прессованный компакт, в -моножильная нить, г - гранулы, д - микрочастицы

Исследования биодеградации ПГА от vivo были проведены при внутримышечном и внутривенном введении полимерных микрочастиц лабораторным животным. Фракцию микрочастиц средним диаметром 10 мкм вводили в бедренную мышцу крысам. Оценку биодеградации проводили анализом полутонких срезов тканей с использованием Системы анализа изображений ("Carl Zeis", Германия). Для изучения биодеградации ПГА при внутривенном введении (в хвостовую вену крысам) использовали микрочастицы, меченые 14С, диаметром 0,5-4 мкм. Измерения радиоактивности тканей органов проводили на сцинтилляционном счетчике Tri-Carb ("Hewlett Packard", USA). Для изучения резорбции полимерного матрикса и накопления продуктов деградации ПГА осуществляли метанолиз образцов высушенных тканей и хроматографически определяли метиловые эфиры жирных кислот на хроматомасс-спектрохметре GCD plus ("Hewlett Packard", USA). Для детекции наличия в тканях органов высокомолекулярного полимера проводили его экстракцию из проб тканей хлороформом, осаждая затем гексаном.

Исследования биодеградации ПГА в почве включали модельные почвенные микрокосмы и эксперименты в природных условиях. В качестве модельных объектов использовали монокультуры бактерий (Watiiersia eutropha, Bacillus megalerium, Pseudomonas fluorescens), почву и почвенную вытяжку. Полевые испытания проводили в дендрарии Института леса СО РАН (г. Красноярск) (июль-октябрь 2007 г.). Образцы ПГА в виде пленок размещали в почве на глубине 0,05 м под различными видами деревьев (Larix sibirica, Betula pendula). Скорость деградации оценивали по убыли массы полимера. Выделите различных групп микроорганизмов из почвы проводили методом посева на селективные питательные среды (Звяппщев, 1990). Для идентификации доминирующих представителей бактерий и микромицетов использовали определители (Берджи, 1997; Егорова, 1986; Литвинов, 1967).

Для изучения динамики выхода пестицидов из полимерного матрикса их экстрагировали из почвы серией растворителей (ацетон, гексан), концентрацию определяли газовой хроматографией ("Hewlett Packard", USA).

Исследования биодеградации ПГА в водных средах проводили в двух природных водоемах, Бутач и Лесное, расположенных в окрестностях г. Красноярска (май-сентябрь 2006 г.) и в озере Шира (Хакасия) (июнь-сентябрь 2007 г.). Показателями биодеградации полимерных пленок служили изменения массы полимера и морфологии поверхности образцов. Морфологию поверхности пленок в ходе деградации оценивали при помощи микроскопа ("Meiji Techno Co. Ltd.", Япония) с цифровой камерой (Infiniti I, Канада). С учетом стратификации озера Шира полимерные пленки размещали в озере на различных глубинах: 3, 9, 13 и 20 м. В течение полевого сезона анализировали изменение массы полимерных образцов в сочетании с динамикой основных показателей состояния водоема (температуры, pH, концентраций кислорода и хлорида натрия), измеренных погружным зондом (YSI corp, CHIA).

Статистическую обработку результатов проводили по стандартным методикам (Лакин, 1990) с использованием программною обеспечения Microsoft Excel.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Исследование биодеградации ИГА в лабораторных условиях

Изучены закономерности деградации изделий из ПГА в виде нитей, пленок, гранул и объемных компактов в различных модельных средах (фосфатный солевой буфер (ФСБ), стабилизированная кровь, почвенная вытяжка). Наибольшая скорость деградации зарегистрирована для пленочных изделий, имеющих наиболее развитую поверхность и изготовленных методом, который оказывает наименьшее воздействие на полимер. Через 50 суток экспозиции в почвенной вытяжке пленки практически полностью разрушились, остаточная масса прессованных компактов и нитей на этот период времени составила, соответственно 37 и 50% для Г1ГБ, 27% и 40% для ПГБ/ПГВ (от исходной массы образцов) (рис. 2). Скорость убыли массы полимерных образцов, полученных из сополимера ПГБ/ПГВ, превосходила таковую у ПГБ.

Рис. 2. Изменение массы ПГА в зависимости от типа образца и модельной среды: а - нити, ФСБ; б - нити, кровь; в - нити, почва; г - прессованные компакты, почва; д - гранулы, почва; е - пленки, почва (через 50 суток экспозиции)

Независимо от состава и физико-химических свойств полимеров, изделия из них в фосфатном буфере не деградировали (рис. 2а). Полученные результаты согласуются с современными представлениями о том, что ПГА не подвержены небиологической гидролитической деструкции (Amass et al., 1998; Sudesh et al, 2000).

В экспериментах на лабораторных животных изучалась биодеградация полимерных микрочастиц, которые, вследствие своего малого объема и хорошо развитой пористой поверхности, являются наиболее перспективной формой для инкапсулирования различных лекарственных препаратов (Kim and Pack, 2007). При внутримышечной имплантации полимерных микрочастиц крысам зарегистрировано уменьшение среднего диаметра частиц (среднее арифметическое по числу частиц), который был принят в качестве показателя деструкции (рис. 3). Через 2 недели после введения в кластере имплантированных микросфер число крупных (свыше 10 мкм) частиц сократилось в 2,5 раза относительно исходного количества. Средний диаметр

микрочастиц составил 6,6±0,1 мкм. На рисунке 4, иллюстрирующем состояние тканей в месте имплантации микрочастиц, видно присутствие моноядерных макрофагальных клеток секреторно-фагацитарного типа, а также наличие единичных гигантских клеток инородных тел (ГКИТ) с 2-3 ядрами, являющихся, как известно, активными деструкторами полиги,дроксибутирата (Шишацкая и др., 2002).

Ос1<2 мкм 0с1=2-1О мкм ■ с1=10-35 мкм

гЬ

1

12 время, недели

Рис. 3. Размерное распределение микрочастиц, имплантированных внутримышечно, в ходе деградации

С увеличением длительности эксперимента отмечено снижение диаметра микрочастиц и нарастание макрофашльной инфильтрации в зоне введения микросфер. Через 5 недель в месте имплантации микросфер наблюдали увеличение моно- и полиядерных макрофагальных клеток, что говорит об активном процессе деградации ПГБ. При этом фракция частиц диаметром 10-35 мкм существенно сократилась и не превышала 4-5% от общего числа в поле зрения. Вокруг крупных микросфер зафиксировано скопление ГКИТ с 6-8 ядрами (рис. 4в). В конце эксперимента (12 неделя наблюдения) отмечено наличие достаточно крупных симпластов ГКИТ клеток с 10-12 и более ядрами, окружающих полимерные частицы или сгруппированных вокруг кластера мелких микрочастиц (рис. 4г). Отмечено значительное уменьшение в поле зрения количества крупных микросфер диаметром свыше 10-15 мкм (около 23% от исходного количества) и появление фрагментированных микрочастиц (рис. 4е).

Результаты эксперимента показывают, что процесс взаимодействия микрочастиц из ПГБ с биологической средой внутри организма включает в себя следующие стадии: концентрирование макрофагов вокруг микрочастиц; появление гигантских клеток инородных тел (ГКИТ) и активных макрофагов; обволакивание частиц и их фрагментов макрофагами и ГКИТ; распад микрочастиц.

Рис. 4. Микроскопическая картина тканей в месте имплантации мшсросфер из иолигидроксибутирата (полутонкие срезы, окраска -метиленовый синий). Маркер: а, б, в, г - 20 мкм; д, е - 10 мкм (а-б) - 2 недели; (в) - 5 недель; (г-е) - 12 недель после введения микрочастиц мч - микрочастицы; мф - макрофаги; гкит - гигантские клетки инородных тел.

Для изучения распределения и деградации полимерных микрочастиц во внутренних органах лабораторных животных при внутривенном введении использовали микрочастицы диаметром 0,5-4 мкм, изготовленные из меченого углеродом-14 иолигидроксибутирата, которые вводили в хвостовую вену крысам. Содержание радиоактивного углерода анализировали в сердце, легких, печени, почках, селезенке, костном мозге и крови животных. Динамика удельной радиоактивности тканей внутренних органов в ходе эксперимента представлена на рис.5а. Ткани внутренних органов по-разному проявляли кумулятивную активность в отношении сорбции полимерных микрочастиц. Через 3 ч после введения микрочастиц в кровоток животным максимальные значения удельной радиоактивности зарегистрированы в тканях сердца и почек. Самый низкий уровень радиоактивности зафиксирован в крови и костном мозге. Через сутки радиоактивность тканей сердца резко снизилась (в 2 раза), а в тканях печени и селезенки резко возросла (соответственно, в 5,5 и 2 раза). Через 7 суток также отмечено увеличение содержания метки в тканях печени на фоне ее уменьшения в сердце и легких. Спустя 28 суток уровень удельной радиоактивности тканей сердца снизился от исходного практически в 4 раза. При этом зафиксировано некоторое возрастание метки в тканях селезенки, что, возможно, связано с аккумуляцией продуктов резорбции полимера в ней, так как в этом органе, помимо гидролитических ферментов, активно

функционируют клетки макрофагального типа, резорбирующие клеточные элементы. Начиная с 28 суток эксперимента, и далее, происходило снижение суммарной радиоактивности органов (рис. 56). Это свидетельствует о том, что полимер деградирует, а продукты разрушения полимера, меченные 14С, выводятся из организма.

(а)

(б)

а сердце и легкие ■ селезенка 13 почки а костный мозг

£

О

(через 3 ч после ведения)

28

Время, сутки

28 60 120

Время, сутки

Рис. 5. Динамика накопления меченных по С полимерных микрочастиц в органах: а - удельная радиоактивность, б - суммарная радиоактивность тканей органов

В тканях внутренних органов проанализировано содержание фракции мономеров ПГБ ф-гидроксибутират) и высокомолекулярного полимера (таблица 1). Зарегистрировано изменение содержания мономеров во всех органах, но наиболее активно в печени и селезенке, где измеряемая величина через 12 недель уменьшилась, соответственно, в 30 и 40 раз относительно начальных значений. Данные по содержанию высокомолекулярного полимера, подтвердили наличие не разрушенных микрочастиц в тканях внутренних органов животных.

Таблица 1

Содержание мономеров полигидроксибутирата и высокомолекулярного

Орган Содержание, мкг/орган

мономеры ПГБ высокомолекулярный ПГБ

недели

1 8 12 1 8 12

сердце 152,7 13,2 7,5 42,0 3,0 0,5

легкие 169,4 11,1 5,6 60,0 0,5 0,6

печень 586,1 488,9 19,7 36,0 11,0 8,0

селезенка 60,6 25,1 1,4 0,6 1,0 0,5

почки 18,9 12,4 4,3 1,6 2,0 0,7

Наибольшее содержание высокомолекулярного полимера через неделю после введения микрочастиц зарегистрировано в легких и сердце. Однако резкое падение этой величины через 8 недель свидетельствует в пользу вывода о вымывании частиц, нежели протекании процессов деградации в этих органах. По результатам хроматографии через 12 недель после введения микрочастиц в тканях органов зарегистрированы существенно более высокие значения содержания мономеров полигидроксибутирата по сравнению с количеством высокомолекулярного полимера. Это позволяет предположить, что к концу эксперимента основная доля радиоактивного полимера присутствует in vivo в виде мономеров гидроксимасляной кислоты и продуктов ее распада.

В целом, выполненные исследования показали, что деградация полимерного матрикса в тканях внутренних органов происходит с различной интенсивностью. Обнаруженное относительно невысокое содержание полимера в органах, в особенности, в печени и селезенке, на фоне зарегистрированной высокой радиоактивности этих тканей, свидетельствует об интенсивности процесса разрушения полимерного матрикса в них. Таким образом, по истечению длительного периода наблюдения (12 недель) в органах и мышечной ткани лабораторных животных присутствует неразрушенные микрочастицы, что свидетельствует о длительности процесса биодеградации ПГА in vivo и пригодности полигидроксибутирата для создания долговременной лекарственной формы при внутримышечном и внутривенном введении.

2. Исследование биодеградации ПГА в почвенных средах

Биодеградация ПГА почвенной микрофлорой исследована в модельных лабораторных (культуры бактерии; почва; почвенная вытяжка) и в реальных природных условиях. Оценивали разрушаемость полигидроксибутирата в монокультурах бактерий Wautersia eutropha, Pseudomonas fluorescens, Bacillus

megaterium, являющихся типичными представителями почвенной микрофлоры. Показано, что штамм-продуцент ПГА W. eutropha В5786 не деградирует экзогенный ПГБ, а бактерии Р. fluorescens и В. megaterium активно утилизируют его с удельной скоростью 8,5x10"2 сут"1.

Присутствующий в составе ПГА в качестве сополимера гидроксивалерат,

изменяя степень кристалличности полимера (Волова и др., 2006), ускоряет его деструкцию под воздействием микрофлоры почвы. Разница в скоростях разрушения ПГБ и ПГБ/111 В составляла 20-30%. Эта величина практически соответствует разнице значений степени кристалличности гомо- и гетерополимерных ПГА.

Деградация ПГА исследована при различных значениях pH, температуры среды и концентрации хлорида натрия в почвенной вытяжке (общее микробное число 2,4х107 КОЕ/г почвы). Повышение температуры среды с 15 до 30°С сопровождалось увеличением удельной скорости деградации ПГА от 3,7x10° до 1,5хЮ'2 сут"1 (рис. 6). Однако при температуре выше 30°С процесс деградации пленок замедлялся. Вероятно, данная температура не являлась оптимальной и ингибировала активность почвенной микрофлоры.

При увеличении концентрации хлорида натрия от 1 до 20 г/л наблюдалось постепенное снижение численности микроорганизмов в среде и, как следствие, замедление деградации полимера (рис. 7). Влияния рН среды в диапазоне 4,0-9,8 на скорость биодеградации ПГА не зафиксировано.

□ ПГБ 0 ПГБ/ПГВ

NaCI, г/л

10 20

Время, сутки

Рис. 6. Зависимость удельной скорости деградации ПГА от температуры среды

Рис. 7. Динамика разрушения ПГА в почвенной вытяжке при различных концентрациях ЫаС1

Биоде1радация ПГА в природных условиях в почве исследована в местах произрастания деревьев хвойных (лиственница сибирская - Larix sibirica) и лиственных (береза повислая - Betula pendilla) пород во взаимосвязи с микробной составляющей почвы. Большая часть исследуемого периода наблюдения (июль - август 2007 г.) характеризовалась высокой температурой воздуха, отсутствием дождей и относительно низкой влажностью почвы (1529% и 8-23% в зоне произрастания лиственницы и березы, соответственно). Микробоценозы исходной почвы в местах произрастания деревьев разных видов имели существенные отличия, как по общей численности, так и по видовому составу. Численность гидролитических микроорганизмов в почве прикорневой зоны лиственницы была на порядок выше, по сравнению с их числом в прикорневой зоне березы, и, соответственно, составила 14,7x108 и 13,3x107 КОЕ/г почвы. Количество прототрофов и олиготрофов была также выше при этом же варианте опыта.

В почве прикорневой зоны лиственницы в качестве доминирующих видов выделены бактерии Cellulomonas (52,3%), Acaligenes (25,0%) и грибы Pénicillium (74,5%), Verticillium (18,2%); в прикорневой зоне березы - бактерии Pimelobacter (48,4%), Actinomyces (16,1 %) и грибы Pénicillium (33,3%), Beltrania (31,7%), Verticillium (15,0%) (рис. 8).

Отличия количественного и качественного состава микробоценозов в местах произрастания деревьев двух видов оказывали влияние на процесс био деградации ПГА (рис. 9).

100

(б)

20

40 60 80 Время, сутки

100 120

20 40 60 80 100 120 Время, сутки

Рис. 9. Динамика уменьшения массы ПГА в прикорневой зоне деревьев двух видов: Larix sibirica (а) и Betula pendula (б)

Активная деструкция ПГА зарегистрирована в более влажной и населенной микроорганизмами почве прикорневой зоны лиственницы. Удельные скорости деградации ПГБ и ПГБ/ПГВ за весь исследуемый период (109 суток) в почве прикорневой зоны Larix sibirica составили, соответственно, 8,3x10"3 и 1,5х 10"2 сут \ Betula pendula - 1,6х 10"3 и 2,8х 10~3 сут"1. Как видно из представленных данных, по сравнению с лабораторными наблюдениями, биодеградация ПГА в выбранном для исследований типе почвы в природных условиях протекала с меньшими скоростями, чем в модельных почвенных микрокосмах при стабилизированной температуре и влажности.

Результаты анализа микрофлоры почвы в конце вегетационного периода (87-е сутки эксперимента) продемонстрировали общую тенденцию увеличения численности гидролитиков: в 3,5 и 16 раз для березы и лиственницы, соответственно (таблица 2).

Таблица 2

Численность основных эколого-грофических групп микроорганизмов (87-е сутки эксперимента)

Варианты опыта Гидролитики Олиготрофы Прототрофы

а с контроль (почва) (51,1±4,2)х108 (7,4±0,7)х 107 (7,3±0,3)х107

поверхность полимера (16,0±0,4)хЮ10 (12,1±0,9)хЮ10 (29,8±3,2)х109

-5 контроль (почва) (22,l±2,4)xl0s (3,8±0,7) х 108 (2,6±0,1)хЮ7

к а> поверхность полимера (12,9±0,8)х108 (1,7±0,4)х Ю9 (1,8±0,2)хЮ8

□ Pénicillium (74,5%) Я Verticillium (18,2%) a др. виды (7,3%)

И Сellulomonas (52,3%) im Alcaligenes (25,0%) H Aureobacterium(15,9%) Ш др. виды (6,8%)

□ Pénicillium (33,3%) Ш Beltrania (31,6%) U Verticillium (15,0%) m др. виды (20,1%)

В Pimelobacter (48,4%) И Actinomyces(16,1%) Q Micrococcus (9,7%) Ш др. виды (25,8%)

Микрофлора исходной почвы (б)

Микрофлора почвы на 87-е сутки эксперимента

□ Pénicillium (50,1%) □ Micrococcus (76,5%)

В Aureobasidium (38,7%) a Acinetobacter (11,7%)

m Paecilomyces (5,6%) ш др. виды (11,8%) Ш др. виды (5,6%)

О Penicillium (68,1%) □ Micrococcus (76,9%)

a Aureobasidium (13,6%) и Actinomyces (6,2%)

Ш Verticillium (9,1%) и др. виды (16,9 %) a Trichoderma (9,2%)

Рис. 8. Состав почвенной микрофлоры в местах произрастания Larix sibirica (а) и Betula pendula (б)

В контрольной почве во всех вариантах опыта отмечено увеличение численности прототрофов (примерно в 3 раза, по сравнению с их численностью в исходной почве), что свидетельствует об усилении процессов минерализации. Состав микрофлоры контрольных образцов почвы на 87-е сутки эксперимента представлен на рис. 86. Среди бактерий в обоих вариантах опыта преобладали представители рода Micrococcus (77% от общего числа идентифицированных видов). Также выделены бактерии родов Actinomyces sp., Arthrobacter sp., Bacillus fastidiosus, Pseudomonas sp. Анализ почвенных микромицетов показал, что к кощу вегетационного периода сохранилось преобладание грибов рода Pénicillium, что согласуется с литературными данными о доминировании пенициллов среди микромицетов северных почв (Егорова, 1986). Кроме того, в конце периода наблюдений большую долю микромицетов составляли представители рода Aureobasidium (38,9% и 13,6% в прикорневой зоне лиственницы и березы, соответственно).

Концентрация микроорганизмов, развивающихся на поверхности полимерных пленок, превышала таковую в контроле (таблица 2). Особенно это было выражено в варианте опыта с полимером, размещенным под лиственницей, где численность микроорганизмов, возросла на 2-3 порядка. Возможно, данный эффект был вызван различиями в составе почвенной микрофлоры в прикорневой зоне исследуемых древесных растений. В почве прикорневой зоны лиственницы, вероятно, было больше микроорганизмов, способных к деструкции полимера. Были идентифицированы доминирующие микроорганизмы, участвующие в деградации ПГА в условиях природной среды (таблица 3).

Таблица 3

Видовой состав почвенных микроорганизмов, выделенных с поверхности полимерных пленок при их деградации в почве

Вариант опыта Грибы Бактерии

% от общей числ. % от общей числ.

Larix sibirica Paecilomyces lilacinus 81,5 Agrobacterium sp. 24,3

Aureobasidium pullulons 11,1 Cellulomonas sp. 17,5

Acremonium butyri 3,7 Alcaligenes sp. 6,6

Zygosporium masonii 1,9 Aureo bacterium terregens 4,5

Pénicillium novae-eahdoniae 1,8 Acinetobacter sp. 1,9

Pseudomonas sp. 1,9

Arthrobacter sp. 1,3

Betula pendula Pénicillium canescens 47,6 Bacillus fastidiosus 21,1

Pénicillium corylophyloides 33,3 Arthrobacter sp. 5,3

Aureobasidium pullulons 7,1 Micrococcus luteus 5,3

Paecilomyces lilacinus 7,1 Actinomyces sp. 5,3

Verticillium lateritium v. beticola 2,4 Bacillus brevis 5,3

Nigrospora gallarum 2,4 Alcaligenes sp. 5,3

В составе микробоценоза, сформировавшегося на поверхности полимерных пленок в условиях прикорневой зоны лиственницы, доминировали бактерии рода Agrobacterium (24,3%) и Cellulomonas (17,5%); прикорневой зоны березы - Bacillus (26,4%). Среди микромицетов основными деструкторами ПГА в почве прикорневой зоны лиственницы были грибы вида Paecilomyces lilacinus (81,5%). В варианте опыта с березой преобладали Pénicillium canescens (47,6%) и Pénicillium corylophyloides (33,3%). Доминирование определенных видов микроорганизмов, выделенных с поверхности полимера, позволяет предположить, что они являются основными биодеструкторами полишдроксиалканоатов. Отличия в скоростях деградации ПГА в почве в местах произрастания деревьев разных видов, вероятно, связаны с различиями в составе почвенной микрофлоры, деградирующей полимер.

Полученные результаты о достаточно медленном процессе разрушения полимера в почвенных экосистемах побудили сформулировать задачу оценки применимости ПГА в качестве матрикса для контролируемой доставки пестицидов в почву. Были получены экспериментальные формы препаратов а-гексахлорциклогексана (ГХЦГ) и линдана, включенные в полимерный матрикс из сополимера ПГБ/ПГВ, в виде прессованных 3-х мерных компактов с различным содержанием пестицидов. Соотношение «полимер/препарат» для ГХЦГ составила 60:40; для линдана - 40:60 (в % от общей массы). Основная масса полимера в обоих вариантах разрушилась через 40-50 суток от начала эксперимента, и в конце наблюдения зафиксировано остаточное содержание полимера в прессованных таблетках на уровне 5-10% от исходного содержания в форме (рис. 10а).

40 60

0 20 40 60 80

Время, сутки

Рис. 10. Динамика деградации сополимера ПГБ/ПГВ, % (а), и выхода пестицидов, мкг/г почвы (б), при экспонировании в почве. I - ГХЦГ, П - линдан

Динамика выхода пестицидов из прессовашшх полимерных таблеток представлена на рис. 106. В течение первых 30-40 суток выход ГХЦГ во внешнюю среду был низким, скорость выхода составила 0,2 мкгосут^хг1 почвы. И только в последующий период зафиксировано нарастание его содержания в почве, которое составило па 70-80 сутки 30 мкг/г почвы. Скорость выхода линдана в почву была выше (рис. 106,11). К концу эксперимента в почве зафиксировано 50 мкг линдана/г почвы, при средней скорости оттока 0,59 мкгхсут'хг1 почвы. Этими экспериментами впервые показана принципиальная возможность использования биоразрушаемых полишдроксиалканоатов в качестве матрикса для депонирования пестицидов с целью их регулируемого выхода в почву.

3. Исследование закономерностей биодеградации ПГА в природных водоемах с различной структурой экосистем

Биодеградацию ПГА изучали в двух пресных водохранилищах (Бугач, Лесное) и соленом озере Шира. Исследования по динамике разрушения ПГА двух типов в водохранилище Бугач уже проводились ранее (Волова и др., 2006), и было показано, что на процесс деградации ПГА влияет химическая структура полимера, а также погодно-климатические условия. В данной работе сопоставлены процессы деградации сополимера ПГБ/ПГВ в двух природных водоемах, главным отличием которых является наличие летнего «цветения» цианопрокариотами в одном (Бугач) и его отсутствие в другом (Лесное); а также исследована разрушаемость полимера в анаэробных условиях водоема Бугач. Образцы ПГА в виде пленок экспонировали в прибрежье водоемов на глубине 1 м (аэробная зона), а также в центре водоема Бугач на глубине 4 м (анаэробная зона, черные илы). Динамика убыли массы полимера для двух временных периодов представлена на рис. 11. Первая серия экспериментов проводилась с 17 мая по 21 июня 2006 г. при начальной температуре воды 5,5°С, вторая - с 9 августа по 27 сентября при температуре 19,5°С.

В водоеме Бугач процесс биодеградации происходит быстрее, чем в водоеме Лесное. Удельные скорости деградации ПГБ/ПГВ варьировали от 1,2* 10"2 до 7,7* 10"2 сут"1 в водоеме Бугач, от 3,0х 103 до 5,2* 10"3 сут"1 в водоеме Лесное. В период проведения экспериментов в водохранилище Бугач средняя за сезон концентрация минерального фосфора составила 14 мкг/л, тогда как в водоеме Лесное в августе была зарегистрирована концентрация 6 мкг/л. Ранее показано, что при деградации простых в элементном отношении субстратов водные бактерии, как правило, бывают лимитированы содержащим в воде минерального фосфора (Gladyshev et al., 1993). Принимая во внимание этот факт, выдвинуто предположение о том, что биодеградация полимера в пресном водохранилище Лесное была лимитирована именно недостатком минерального фосфора в воде, ограничивающим развитие микроорганизмов, принимающих участие в деградации ПГА.

100

)5

S 80

П I 60

S 40

О

Время, сут.

Рис. 11. Деградация пленок из ПГБ/ПГВ в водохранилищах Бугач и Лесное. I - период 17.05 - 21.06.2006: а - Бугач, дно, б - Бугач, прибрежье, в -Лесное прибрежье; II - период 09.08 - 27.09.2006: г - Бугач, дно, д - Бугач, прибрежье, е - Лесное прибрежье. Точки - экспериментальные данные; линии -расчет согласно модели М.И. Гладышева (Волова и др. 2006; Воинова и др., 2007).

(е)

20 40

Впервые зарегистрирована разрушаемость ПГА в анаэробной зоне водоема Бугач. Удельные скорости деградации в анаэробных условиях составили 6,7х 10"3 - 5,8х 10"2 сут", что в 1,5 раза ниже по сравнению с аэробной зоной водоема Бугач.

Обнаруженный факт биодеградации полигадроксиалканоатов в анаэробной зоне пресного водохранилища Бугач побудил провести исследования деградации ПГА в озере Шира на различных горизонтах, соответствующих стратификации водоема по температуре, кислороду и ряду химических параметров. Образцы полимеров в виде пленок размещали в озере на различных глубинах: 3 м - эпилимнион, 9м- гиполимнион, 13 м -хемоклин, 20 м - монимолимнион. Изменение массы полимерных пленок происходило с различной интенсивностью в зависимости от глубины экспонирования образцов. Максимальная скорость разрушения полимера отмечалась в эпилимнионе, наиболее прогреваемом и аэрируемом горизонте озера, где через 50 суток после начала эксперимента масса образцов ПГБ уменьшилась на 9,0% от исходной, сополимерных образцов ПГБ/ПГВ - еще в большей степени, на 15,8%. Удельные скорости деградации ПГА за этот период составили 1,7хЮ"3 и З,4х10"3 сут"1 для ПГБ и ПГБ/ПГВ, соответственно. Выявлена разрушаемость полимера в аноксигенных, с низкой температурой воды, хемоклине и монимолимнионе, где отмечается высокая активность микроорганизмов (Kopylov et al., 2002; Пименов и др., 2003). В конце периода

наблюдения (80 суток) отмечено снижение массы гомополимера, соответственно, на 8,8 и 9,2%; сополимера - несколько выше, соответствешю, на 13,3 и 16,2% от исходных величин. Удельные скорости разрушения полимера на этих глубинах практически не отличались и составили для ПГБ -(0,9-1,2)х 10"3 сут"1; дня ПГБ/ПГВ - (2-2,2)хЮ"3 сут"1. В пшолимнионе достоверного изменения массы образцов III'Л обоих типов не выявлено. Полученные скорости деградации ПГА в соленом озере Шира значительно ниже показателей разрушения этих полимеров в пресных водоемах, где удельная скорость деградации варьировала в пределах от Зх 10"э до 7,7х 10"2суг"!.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что скорость био деградации менее кристалличного сополимера ПГБ/ПГВ в среднем на 20-30% выше, по сравнению с гомополимером ПГБ, независимо от типа и условий среды.

2. Установлено, что бактерии вида IVaiitersia eutropha (штамм В5786), являющиеся продуцентом ПГА, не способны к деградации экзогенного полигидроксибутирата, в отличие от бактерий видов Bacillus megaterium и Pseudomonas fluorescens, утилизирующих его с удельной скоростью 8,5* КГ сут1.

3. Выявлено, что биоразрушаемость ПГА в почвенных микрокосмах зависит от температуры и солености среды: наибольшая удельная скорость деградации (1,3x10"2 сут"1) зарегистрирована при температуре 28°С, хлорид натрия при концентрации более 10 г/л оказывает ингибирующее воздействие на этот процесс.

4. Показано in vivo, что в биологических средах (кровь, ткани органов, мышцы) наиболее активное разрушение микрочастиц ПГА происходит в селезенке и печени. Установлено, что в мышечной ткани деградация полимера осуществляется за счет активного участия макрофагов и гигантских клеток инородных тел.

5. Установлено, что скорость био деградации ПГА в природных условиях почвы существешю зависит от её микробной составляющей: удельная скорость деградации полимера в прикорневой зоне хвойных деревьев составляет (8,3-15)хЮ~3 сут"1, лиственных деревьев - (1,6-2,8)* W"3 сут"1. Доминирующими микроорганизмами-деструкторами ПГА в почве являются бактерии: Agrobacterium sp., Celhdomonas sp., Bacillus fastidiosus и грибы Paecilomyces lilacinus, Aureobasidium pullulons, Pénicillium canescens.

6. Показана возможность создания на основе ПГА форм пролонгированной доставки пестицидов и установлено, что скорости их выхода из полимерного матрикса варьируют от 0,35 до 0,6 мкгхсут"'хг"1.

7. Впервые обнаружена биоразрушаемость ПГА в анаэробной зоне природных водоемов: удельные скорости деградации полимера составляют для пресных водоемов (6,7-58)* 10"3 сут"1, для соленых - (1-2,2)х 10"3 сут"1.

8. Установлено, что независимо от типа водоема удельная скорость деградации ПГА в аэробных условиях в 1,5 раза выше, чем в анаэробных.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Войнова, О.Н. Деградация биопластиков в природных водоемах с различивши экологическими характеристиками / О.Н. Войнова, H.A. Кожевникова, М.И. Гладышев, Т.Г. Волова // Доклады Академии Наук. -

2007. -Т. 417. -№ 1.-С. 130-132.

2. Шишацкая, Е.И. Реакция тканей на имплантацию микрочастиц из резорбируемых полимеров при внутримышечном введении / Е.И. Шишацкая, О.Н. Войнова, A.B. Горева, O.A. Могильная, Т.Г. Волова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 144. -№12.-С. 635-639.

3. Shishatskaya, E.I. Biocompatibility of polyhydroxybutyrate microspheres: in vitro and in vivo evaluation / E.I. Shishatskaya, O.N. Voinova, A.V. Goreva, O.A. Mogilnaya, T.G. Volova // J. Mater Sei: Mater Med. - 2007. - V. 19. -№. 6. - P. 2493-2502.

4. Волова, Т.Г. Перспективы использовашм резорбируемых полиэфиров для конструирования безопасных форм пестицидов / Т.Г. Волова, О.Н. Войнова, Г.С. Калачева, И.Д. Гродницкая II Доклады Академии Наук. -

2008. - Т. 419. -№ 2.-С. 272-275.

5. Voinova, O.N. Comparative study of PHA degradation in natural reservoirs having various types of ecosystems / O.N. Voinova, M.I. Gladyshev, T.G. Volova // Macromolecular Symposia. - 2008. - V. 269. - P. 34-37.

6. Войнова, О.Н. Изучение деструкции биопластика в природных водоемах с различным типом экосистем / О.Н. Войнова // Материалы X международной школы-конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий». - Абакан, 2006. - Выпуск 10. - Т. 2. - С. 48-49.

7. Войнова, О.Н. Деградация биопластика в природных условиях / О.Н. Войнова // Материалы конференции молодых ученых КНЦ СО РАН. -Красноярск: ИВМ СО РАН, 2007. - С. 37-39.

Подписано в печать 14.11.08 Формат 60x84/16 Бумага офсетная 80 7м2 Отпечатано на ризографе. . Заказ № 284. Тираж 100 экз

Отпечатано в типографии «ДарМа-печать» 660036 г. Красноярск, Академгородок, 50/28 оф. 156 тел 290-72-32

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Войнова, Ольга Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Полигидроксиалканоаты и пути их биоразрушения.

1.2 Деградация ПГА в модельных биологических средах.

1.3 Закономерности деградации ПГА in vivo.

1.4 Биодеградация ПГА в природных условиях.

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Объекты исследования.

2.2 Получение экспериментальных образцов ПГА.

2.2.1 Синтез и выделение полимера.

2.2.2 Методика получения изделий из ПГА.

2.3 Исследование биодеградации ПГА в модельных системах in vitro и in vivo.

2.4 Исследование деградации ПГА почвенной микрофлорой.

2.4.1 Деградация ПГА в микробных монокультурах и почвенных микрокосмах.

2.4.2 Исследование биодеградации ПГА в природных условиях в почве.

2.4.3 Изучение микробиоценоза почвы и идентификация микроорганизмов-деструкторов ПГА.

2.4.4 Депонирование пестицидов в полимерный матрикс.

2.5 Исследование биодеградации ПГА в водных экосистемах.

2.5.1 Биодеградация полимера в пресных водоемах.

2.5.2 Биодеградация ПГА в соленом озере Шира.

2.6 Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3 ИССЛЕДОВАНИЕ БИОДЕГРАДАЦИИ ПГА В ЛАБОРАТОРНЫХ

УСЛОВИЯХ.

3.1 Деградация изделий из ПГА, полученных различными способами.

3.2 Биодеградация полимерных микрочастиц in vivo.

3.2.1 Деградация микрочастиц при внутримышечном введении.

3.2.2 Деградация микрочастиц при внутривенном введении.

Резюме.

ГЛАВА 4 ИССЛЕДОВАНИЕ БИОДЕГРАДАЦИИ ПГА В ПОЧВЕННЫХ

СРЕДАХ.

4.1 Деградация ПГА в модельных средах.

4.2 Деградация ПГА в природных условиях в почве.

4.3 Использование полигидроксиалканоатов в качестве матрикса для депонирования пестицидов.

Резюме.

ГЛАВА 5 ИССЛЕДОВАНИЕ БИОДЕГРАДАЦИИ ПГА В ПРИРОДНЫХ ВОДОЕМАХ С РАЗЛИЧНОЙ СТРУКТУРОЙ ЭКОСИСТЕМ.

5.1 Биодеградация ПГА в пресных водоемах.

5.2 Биодеградация ПГА в соленом озере Шира.

Резюме.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Закономерности деградации полигидроксиалканоатов в лабораторных и природных условиях"

Производство синтетических пластмасс на современном этапе развития возрастает очень высокими темпами, что вызвано стремительным ростом потребления. За последние десять лет спрос на пластмассы увеличился более чем в 10 раз, и к 2010 году достигнет 250 млн. тонн (Пономарева и др., 2002). Однако такой впечатляющий прогноз вызывает обоснованную тревогу, связанную с накоплением отходов синтетических полимерных материалов в окружающей среде, что может привести к необратимому нарушению экологического равновесия в биосфере. Радикальным решением данной проблемы является освоение полимеров биологического происхождения, которые под действием биологических агентов (ферментов, клеток) подвергаются деградации с образованием нетоксичных для природной среды продуктов (диоксида углерода и воды).

Среди применяемых и активно разрабатываемых биоразрушаемых материалов особое место принадлежит полимерам микробиологического происхождения - полигидроксиалканоатам (ПГА) (Amass, 1998; Sudesh et al., 2000). Эти полимеры, помимо термопластичности, аналогично полипропилену и полиэтилену, обладают спектром ценных свойств, таких как антиоксидантные свойства, пьезоэлектрический эффект, биосовместимость и, самое главное, биоразрушаемость. Сферы применения ПГА потенциально широки и могут включать медицину, фармакологию, пищевую и косметическую промышленность, сельское и коммунальное хозяйство (Brandl et al., 1990; Dawes, 1990; Amass, 1998). Все это выдвигает данные полимеры в разряд материалов XXI века, которые в будущем смогут заменить широко используемые в настоящее время неразрушаемые синтетические пластики.

Перспективы использования полигидоксиалканоатов в качестве разрушаемого в природе материала требуют детального изучения механизмов их деградации, как в лабораторных, так и в природных условиях. До настоящего времени исследования деградации ПГА были сосредоточены, главным образом, на изучении биоразрушаемости в модельных средах с использованием чистых микробных культур или деполимеризующих ферментов, что не позволяет прогнозировать картину разрушения данных полимеров в условиях природной среды. Нет четкого ответа на вопрос, о влиянии на биодеградацию ПГА состава и свойств собственно полимера, а также свойств среды. Не решена проблема регулируемости и контролируемости процессов деструкции полигидроксиалканоатов в живых организмах. Поэтому необходимо изучение закономерностей биодеградации ПГА в биологических средах, включая сложные и постоянно изменяющиеся реальные природные условия.

Целью работы является сравнительное изучение биодеградации полигидроксиалканоатов в лабораторных и природных условиях и выявление факторов, влияющих на процесс деградации.

Для достижения цели сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать биодеградацию ПГА в лабораторных условиях в зависимости от химического состава и свойств полимеров, и способа переработки их в изделия.

2. Выявить закономерности биодеградации микрочастиц из ПГА в экспериментах на лабораторных животных.

3. Исследовать биоразрушаемость ПГА в природных условиях под воздействием почвенной микрофлоры и идентифицировать микроорганизмы-деструкторы полимера.

4. Изучить биодеградацию ПГА в водных экосистемах на примере пресных водохранилищ (Бугач и Лесное) и соленого озера (Шира).

Научная новизна работы.

Впервые проведены комплексные исследования биодеградации полигидроксиалканоатов в лабораторных и природных условиях, выявлены зависимости скорости деградации ПГА от структуры полимера, типа и условий среды. Установлена разрушаемость микрочастиц из ПГА в биологических средах in vivo (кровь, ткани органов, мышцы); деградация структуры полимерного матрикса начинает проявляться при длительности эксперимента 12 и более недель. Определены скорости биодеградации ПГА в почве, пресных водоемах и соленом озере, которые, составили,

1 1 1 | 1 I соответственно: (1,6—15)х10" сут" ; (3-77)х10" сут"; (1-3,4)х10" сут" . Впервые установлена биоразрушаемость ПГА в анаэробной зоне природных водоемов. Идентифицированы микроорганизмы-деструкторы ПГА в почве: бактерии — Agrobacterium sp., Cellulomonas sp., Bacillus fastidiosus и грибы — Paecilomyces lilacinus, Aureobasidium pullulans, Penicillium canescens, Penicillium corylophyloides.

Практическая значимость.

Выявленные закономерности биодеградации полигидроксиалканоатов позволяют прогнозировать динамику распада полимерных изделий в природных условиях в почве, в пресных и соленых водоемах, различающихся структурой и микробным пейзажем. Установлена возможность применения полигидроксиалканоатов в качестве матрикса для депонирования и долговременной доставки препаратов (лекарств, пестицидов).

Положения, выносимые на защиту:

1. Биодеградация ПГА зависит от структуры и способа переработки полимера, температуры среды и активности биологического агента (микробоценоз природной экосистемы, клетки макрофагального типа in vivo).

2. Удельные скорости деградации ПГА в почве составляют от 1,6x10"3

2 1 до 1,5x10" сут", в зависимости от состава почвенной микрофлоры в местах произрастания деревьев разных видов. Идентифицированные доминирующие микроорганизмы-деструкторы ПГА: бактерии - Agrobacterium sp., Cellulomonas sp., Bacillus fastidiosus и грибы — Paecilomyces lilacinus, Aureobasidium pullidans, Penicillium canescens, Penicillium corylophyloides.

3. Закономерности биодеградации ПГА в природных водоемах определяются состоянием водной экосистемы. Скорости деградации ПГА в

3 1 аэробной зоне различных водоемов составляют (2-77)х10" сут" , в

3 1 анаэробной зоне - (1-58)х10~ сут" .

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались на X Международной конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Социально-экологические проблемы природопользования в Центральной Сибири» (Красноярск, 2006); конференции молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск 2007); IX Европейском симпозиуме по биополимерам (Турция, 2007).

Работа выполнена в рамках плановой тематики НИР Института биофизики СО РАН, № госрегистрации 01.200703091, а также при поддержке Министерства образования и науки РФ и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) (грант № Р1М0002), РФФИ (грант № 0708-96800), ККФН (индивидуальный грант для молодых ученых №18G142), Фонда содействия отечественной науке.

Автор благодарит своего научного руководителя Волову Татьяну Григорьевну за постоянное внимание и участие в работе, сотрудников Института биофизики СО РАН Г.С. Калачеву, О.Г. Беляеву, В.Ф. Плотникова, а также сотрудницу Сибирского федерального университета С.В. Прудникову за помощь в проведении экспериментов, М.И. Гладышева за неподдельный интерес к работе и обсуждение результатов исследований.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Войнова, Ольга Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что скорость биодеградации менее кристалличного сополимера ПГБ/ПГВ в среднем на 20-30% выше, по сравнению с гомополимером ПГБ, независимо от типа и условий среды.

2. Установлено, что бактерии вида Wautersia eutropha (штамм В5786), являющиеся продуцентом ПГА, не способны к деградации экзогенного полигидроксибутирата, в отличие от бактерий видов Bacillus megaterium и Pseudomonas fluorescens, утилизирующих его с удельной скоростью 8,5х Ю-2 сут1.

3. Выявлено, что биоразрушаемость ПГА в почвенных микрокосмах зависит от температуры и солености среды: наибольшая удельная скорость деградации (1,3*Ю"2 сут"1) зарегистрирована при температуре 28°С, хлорид натрия при концентрации более 10 г/л оказывает ингибирующее воздействие на этот процесс.

4. Показано in vivo, что в биологических средах (кровь, ткани органов, мышцы) наиболее активное разрушение микрочастиц ПГА происходит в селезенке и печени. Установлено, что в мышечной ткани деградация полимера осуществляется за счет активного участия макрофагов и гигантских клеток инородных тел.

5. Установлено, что скорость биодеградации ПГА в природных условиях почвы существенно зависит от её микробной составляющей: удельная скорость деградации полимера в прикорневой зоне хвойных

•j 1 »j деревьев составляет (8,3-15)х 10" сут", лиственных деревьев - (1,6-2,8)хЮ сут"1. Доминирующими микроорганизмами-деструкторами ПГА в почве являются бактерии: Agrobacterium sp., Cellulomonas sp., Bacillus fastidiosus и грибы Paecilomyces lilacinus, Aureobasidium pullulans, Penicillium canescens.

6. Показана возможность создания на основе ПГА форм пролонгированной доставки пестицидов и установлено, что скорости их выхода из полимерного матрикса варьируют от 0,35 до 0,6 мкгхсут^хг"1.

7. Впервые обнаружена биоразрушаемость ПГА в анаэробной зоне природных водоемов: удельные скорости деградации полимера составляют

3 1 3 1 для пресных водоемов (6,7-58)х 10" сут" , для соленых - (1-2,2)х 10" сут" .

8. Установлено, что независимо от типа водоема удельная скорость деградации ПГА в аэробных условиях в 1,5 раза выше, чем в анаэробных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Работа посвящена исследованиям биодеградации полигидроксиалканоатов (ПГА) - нового класса биоразрушаемых полиэфиров природного происхождения в лабораторных и природных условиях и выявлению факторов, влияющих на процесс деградации.

Впервые проведены комплексные исследования биодеградации ПГА двух типов (полигидроксибутирата и сополимеров гидроксибутирата и гидроксивалерата), синтезированных в Институте биофизики СО РАН, в различных биологических средах (в системах in vivo, в лабораторных микробных культурах и микрокосмах, в природных экосистемах).

Показано, что ПГА устойчивы к гидролизу в буферных растворах и разрушаются в результате истинной биологической деградации: in vivo под воздействием клеток с активным участием макрофагов и гигантских клеток инородных тел; в природных условиях — под воздействием почвенной и водной микрофлоры.

В экспериментах in vivo показана длительность процесса биодеградации (до 12 недель) полимерных микросфер из ПГА при различных способах введения лабораторным животным. Процесс деструкции микрочастиц в тканях органов животных протекает с различной интенсивностью: наиболее активно в печени и селезенке. Полученные результаты позволяют говорить о перспективности применения полигидроксиалканоатов в качестве деградируемого матрикса для долговременной доставки лекарственных препаратов.

Изучены закономерности биодеградации ПГА в лабораторных условиях в почвенных средах (микробные культуры, почвенная вытяжка, почва). Выявлена разрушаемость ПГБ в культурах бактерий, являющихся типичными представителями почвенной микрофлоры: Pseudomonas fluorescens и Bacillus megaterium (с удельной скоростью деградации f\ 1

8,5x10" сут" ). Тем самым показано, что полигидроксибутират способен выполнять роль дополнительно источника углерода и энергии. Для бактерий вида Wautersia eutropha В5786 (продуцента ПГА) способности к разрушению экзогенного полигидроксибутирата не обнаружено.

Проведено исследование разрушаемости ПГА в почвенных микрокосмах при различных значениях рН, температуры и концентрации NaCl. Показано, что исследованные факторы, за исключением рН, оказывают влияние на скорость деградации ПГА. Повышение температуры среды от 15 до 30 °С сопровождается увеличением скорости деградации ПГА в диапозоне

О 1 1 от 3,7x10" до 15x10" сут" . Хлорид натрия оказывает ингибирующее воздействие на процесс биодеградации полимера при концентрации в среде более 10 г/л.

Биодеградация ПГА в природных условиях в почве исследована в месте произрастания деревьев хвойных (лиственница сибирская - Larix sibirica) и лиственных (береза повислая - Betula pendula) пород во взаимосвязи с микробиоценозом почвы. Более активная разрушаемость ПГА зарегистрирована в почве под хвойной породой (удельная скорость деградации - 8,3x10" и 15x10" сут" для ПГБ и ПГБ/ПГВ, соответственно) по сравнению с лиственной (1,6x10" и 2,8x10" сут" для ПГБ и ПГБ/ПГВ, соответственно). Среди доминирующих микроорганизмов - деструкторов ПГА идентифицированы бактерии: Agrobacterium sp., Cellulomonas sp., Bacillus fastidiosus и грибы Paecilomyces lilacinus, Aureobasidium pullulans, Penicillium canescens.

Полученные результаты о достаточно медленном процессе разрушения полимера в почвенных экосистемах побудили сформулировать задачу оценки применимости ПГА в качестве матрикса для контролируемой доставки пестицидов в почву. Впервые разработаны экспериментальные формы пестицидов (ГХЦГ, линдан), включенные в полимерную основу из ПГА, в виде прессованных компактов. Показано, что выход пестицидов в среду происходит постепенно, с низкими скоростями, на фоне разрушения полимера почвенной микрофлорой. Варьируя соотношение полимер:пестицид в форме, можно регулировать скорость его выхода в среду.

В сравнительном аспекте изучена деградация сополимера ПГБ/ПГВ в двух природных пресных водоемах, главным отличием которых является наличие летнего «цветения» цианопрокариотами в одном (Бугач) и его отсутствие в другом (Лесное). Скорость деградации ПГБ/ПГВ в водоеме Бугач варьировала от 6,7x10"3 до 77x10"3 сут"1, в водоеме Лесное от ЗхЮ"3 до

3 1

5x10" сут" . Установлено, что скорости деградации ПГА существенно зависят не только от температуры среды, но и от структуры водной экосистемы и минеральной составляющей воды. Выдвинуто предположение о лимитировании процесса биодеградации полимера дефицитом растворенного в воде минерального фосфора, ограничивающего развитие микроорганизмов, участвующих в деструкции ПГА. Впервые обнаружена разрушаемость ПГА в анаэробной зоне (черные илы) водоема Бугач. Скорости деградации полимера в анаэробных условиях в 1,5 раза ниже, чем в аэробных.

Проведено исследование биодеградации ПГА в соленом озере Шира с учетом стратификации озера (по температуре, кислороду и ряду химических параметров). Обнаружен феномен биоразрушения полимера в аноксигенных и низкотемпературных хемоклине и монимолимнионе. Наибольшие

Л 1 11 удельные скорости деградации ПГА (1,7x10" сут" для ПГБ и 3,4x10" сут" для ПГБ/ПГВ) зарегистрированы в оксигеном эпилимнионе.

Скорость разрушения сополимера ПГБ/ПГВ была в среднем на 20-30 % выше по сравнению с гомогенным ПГБ независимо от типа и условий среды.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Войнова, Ольга Николаевна, Красноярск

1. Ведрова, Э.Ф. Агрохимическая характеристика дерново-карбонатной почвы дендрария / Э.Ф. Ведрова // отчет НИР. Институт Леса СО РАН. -Красноярск. - 1990.

2. Волова, Т.Г. Влияние условий роста на накопление полиоксибутирата водородными бактериями / Т.Г. Волова, Г.С. Калачева, В.М. Константинова, А.П. Пузырь // Прикладная биохимия и микробиология. 1992. - Т. 28. - С. 221-222.

3. Волова, Т.Г. Получение и исследование пленок и шовных нитей из полиоксиалканоатов / Т.Г. Волова, Е.И. Шишацкая, Ю.П. Некрасов, С.А. Гордеев // Пластические массы. 2003. - № 3. - С. 6-8.

4. Волова, Т.Г. Синтез сополимеров полигидроксибутирата и полигидроксивалерата поли(ЗГБ/ЗГВ) бактериями Ralstonia eutropha / Т.Г. Волова, Г.С. Калачева // Микробиология. 2005. - Т. 78. - № 1. - С. 71-76."

5. Волова, Т.Г. Полиоксиалканоаты биоразрушаемые полимеры для медицины / Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов, Е.И. Шишацкая; под ред. В.И. Шумакова. - Красноярск: Платина, 2006. - 287 с.

6. Генин, A.M. Биоэтические правила проведения исследований на человеке и животных в авиационной, космической и морской медицине / A.M. Генин, А.Е. Ильин, А.С. Капланский и др. // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2001. - Т. 35. - № 4. — С. 14-20.

7. Гузеев, B.C. Функциональная структура зимогенной части микробной системы почвы / B.C. Гузеев, П.И. Иванов // Изв. АН СССР. Сер. Биол. -1986, №5.-С. 739-746.

8. Егорова, JI.H. Почвенные грибы Дальнего Востока. Гифомицеты / JI.H. Егорова. Л.: Наука, 1986. - 192 с.

9. Заварзин, Г.А. Введение в природоведческую микробиологию / Г.А. Заварзин, Н.Н. Колотилова. М., 2001. - 253 с.

10. Звягинцев, Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Д.Г. Звягинцев. М.: Изд-во МГУ, 1990. - 303 с.

11. Иванова, Е.А. Роль литорали водохранилища в инициации "цветения" воды синезелеными водорослями / Е.А. Иванова // Сиб. Экол. Журн. 2006. Т. 13. — № 1.-С. 105-113.

12. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных; бактерий / Р. Вейант и др.. -М.: Мир, 1999. 1784 с.

13. Козловский, А.Г. Изучение биодеградации поли-(3-гидроксибутирата микроскопическими грибами / А.Г. Козловский, В.П. Желифонова, Н.Г. Винокурова и др. // Микробиология. 1999. - Т. 68. - № 3. - С. 340-346.

14. Лакин, Г.Ф. Биометрия: Учеб. Пособие для биол. спец. Вузов / Г.Ф. Лакин. М.: Высш.шк., 1990. - 352 с.

15. Литвинов, М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов / М.А. Литвинов. -М.: Наука, 1967. С. 140-185.

16. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермаков и др.. Л.: Колос, 1972. - 283 с.

17. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. / под ред.: Дж. Хоулт, Н.Криг, П. Снит и др.. М.: Мир, 1997.

18. Пидопличко, Н.М. Грибы паразиты культурных растений. Определитель: в 2 т. Т.2. Грибы несовершенные / Н.М. Пидопличко. - Киев: Наукова Думка, 1977. - 299 с.

19. Пименов, Н.В. Микробные процессы циклов углерода и серы в озере Шира (Хакасия) / Н.В. Пименов, И.И. Русанов, О.Н.Карначук и др. // Микробиология. 2003. - Т. 72. - № 2. - С. 259-267.

20. Пономарева, В.Т. Использование пластмассовых отходов за рубежом / В.Т. Пономарева, Н.Н. Лихачева, З.А. Ткачик // Пластические массы. 2002. - № 5. - С. 44-48.

21. Практикум по микробиологии / под ред. Н.С. Егорова. М.: изд-во Моск. ун-та., 1976. - 307 с.

22. Пхакадзе, Г.А. Биодеструктивные полимеры / Г.А. Пхакадзе. Киев: Наукова думка, 1990. - 143 с.

23. Розанова, И.Б. Биодеструкция имплантатов / И.Б. Розанова // Биосовместимость / под ред. В.И. Севастьянова. М.: ИЦВНИИгеосистем, 1999.-С. 212-242.

24. Шишацкая, Е.И. Биодеградация полиоксиалканоатов в биологических средах / Е.И. Шишацкая, Т.Г. Волова, А.П. Пузырь, С.А. Гордеев // Перспективные материалы. 2002. - № 2. - С. 57-62.

25. Шишацкая, Е.И. Микрочастицы из биоразрушаемого полиоксибутирата в качестве матрикса для депонирования рубомицина / Е.И. Шишацкая, А.В. Горева // Перспективные материалы. 2006. - № 4 - С. 6570.

26. Штильман, М.И. Полимеры медико-биологического назначения / М.И. Штильман. М.: Академкнига, 2006. - 400 с.

27. Abe, Н. Enzymatic and environmental degradation of racemic poly(3-hydroxybutyric acid)s with different stereoregularities / H. Abe, Y. Doi // Macromol. 1996. - Vol. 29. - P. 8683-8688.

28. Abe, H. Structure effects on enzymatic degradabilities for poly(R)-3-hydroxybutyric acid. and copolymers / H. Abe, Y. Doi // Int. J. of Biol. Macromol. -1999. -№25. -P. 185-192.

29. Abou-Zeid, D.M. Degradation of natural and synthetic polyesters under anaerobic conditions / D.M. Abou-Zeid, R.J. Muller, W.D. Deckwer // J. Biotechnol.-2001.-Vol. 86.-P. 113-126.

30. Abou-Zeid, D.M. Biodegradation of alifatic homopolyesters and aliphatic-aromatic copolyesters by anaerobic microorganisms / D.-M. Abou-Zeid, R.-J. Muller, W.-D. Deckwer // Biomacromolecules. 2004. - Vol. 5. - P. 1687-1697.

31. Anderson, AJ. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates / A .J. Anderson, E.A. Dawes // Microbiol. Rev. 1990. - Vol. 54. - P. 450-472.

32. Bahri, Z. Elaboration and characterisation of microparticles loaded by pesticide model / Z. Bahri, J.-L. Taverdet // Powder Technology. 2006. - Vol. 172.-P. 31-41.

33. Behrend, D. Biodegradation and biocompatibility of resorbable polyester / D. Behrend , S. Kramer, K.P. Schmitz // Zetl. Interoke. Biomater. 2000. - P. 2832.

34. Borkenhagen, M. In vivo performance of a new biodegradable polyester system used as a nerve guidance channel / M. Borkenhagen, R.C. Stoll, U.W. Suter et al. // Biomaterials. 1998. - Vol. 19. - № 23. - P. 2155-2165.

35. Braunegg, G. Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and engineering aspects (Rewiew article) / G. Braunegg, G. Lefebvre, K.F. Genzer // J. of Biotechnol. 1998. - Vol. 65. - P. 127-161.

36. Brucato, C. Extracellular poly(3-hydroxybutyrate) from Penicillum funiculosum: general characteristics and active / C. Brucato, S. Wong // Arch. Biochem. Byophys. 1991. - Vol. 290. - P. 497-502.

37. Calabia, B.P. A novel PHB depolymerase from thermophilic Streptomyces sp. / B.P. Calabia, Y. Tokiwa // Biotechnol Lett. 2006. - Vol. 28. - P. 383-388.

38. Cao, A. Solid structure and biodegradation of the compositionally fractionated poly(3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxypropionic acids) / A. Cao, Y. Arai, N. Yoshie et al. // Polymer. 1999. - Vol. 40. - P. 6821-6830.

39. Chowdhury, A.A. Poly-P-hydroxybuttersaure abbauende Bakterien und Exoenzym / A.A. Chowdhury // Arch Mikribiol. 1963. - Vol. 47. - P. 167-200.

40. Chaput, C. Processing biodegradable natural polyesters for porous soft materials / C. Chaput, E.A. Des Rosiers, M. Assad et al. // NATO ASI Ser. -1995. Vol. 294. - P. 229-245.

41. Delafield, F.P. Decomposition of poly-P-hydroxybutyrate by pseudomonas / F.P. Delafield, M. Doudoroff, N.J. Palleroni et al. // J. Bacteriol. 1965. - Vol. 90.-P. 1455-1466.

42. Dawes, E.A. Novel biodegradable microbial polymers. Kluwer Academic, Dordrecht / E.A. Dawes. Netherlands, 1990. - 287 p.

43. Dijkhuizen-Radersma, R. Biocompatability and degradation of poly(ether-ester) microspheres: in vitro and in vivo evaluation / R. Dijkhuizen-Radersma, S.C. Hesseling, P.E. Kaim, K. De Groot, J.M. Bezemer // Biomaterials. 2002. - Vol. 23.-P. 4719-4729.

44. Do, Y.K. Molecular characterization of extracellular medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoate) depolymerase genes from Pseudomonas alcaligenes strains / Y.K. Do, C.K. Hyun, Y.K. Sun et al. // J. Microbiol. 2005. - Vol. 43. -P. 285-294.

45. Doi Y., Kanesawa Y., Tanahashi N. et al. Biodegradation of microbial poly(hydroxyalkanoates) // Makromol. Chem. Rapid. Commun. 1989. - Vol.10. -P. 227-230.

46. Doi, Y. Microbial polyesters / Y. Doi // VCH Publishers : New-York, 1990. -156 p.

47. Doi, Y. Biodegradation of microbial copolyesters: poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) and poly(hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) / Y. Doi, Y. Kanesawa, M. Kunioka, T. Saito // Macromolecules. 1990. - Vol. 23. - P. 2631.

48. Doi, Y. Enzymatic degradation of microbial poly (3-hydroxybutyrate) films / Y. Doi, Y. Kanesana // Makromol Chem. 1992a. - № 193. - P. 53-57.

49. Doi, Y. Hydrolytic degradation of microbial polyesters in the marine environment / Y. Doi, Y. Kanesawa, Y. Kawaguchi et al. // Polym. Degrad. Stub. -1992b. -Vol. 36.- P.173-177.

50. Doi, Y. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates / Y. Doi, Y. Kawaguchi, S. Nakamura et al. // FEMS Microbiol.Rev. 1992c. - Vol. 1-3. - P. 103-108.

51. Duvernoy, O. A biodegradable patch used as a pericardial substitute after cardiac surgery: 6- and 24-month evaluation with CT / O. Duvernoy, T. Malm, J. Ramstrom et al. // Thorac Cardiovasc. Surg. 1995. - Vol. 43. - № 5. - P. 271274.

52. Fournier, E. The brain tissue response to biodegradable poly(methylidene malonate 2.1.2)-based microspheres in the rat / E. Fournier, C. Passirani, N. Colinet al. // Biomaterials. 2006. - Vol. 27. - P. 4963 - 4974.t

53. Freiberg, S. Polymer microspheres for controlled drug release / S. Freiberg, X. Zhu // Int. J. Pharm. 2004. - Vol. 282. - P. 1-18.

54. Freier, T. In vitro and in vivo degradation studies for development of a biodegradable patch based on poly(3-hydroxybutyrate) / T. Freier, C. Kunze, C. Nischan et al. // Biomaterials 2002. - Vol. 23. - P. 2649-2657.

55. Fujita, M. Morphology and enzymatic degradation of oriented thin film of ultrahigh molecular weight poly(R-3-hydroxybutyrate) / M. Fujita, Y. Takikawa, S. Teramachi et al. // Biomacromolecules. 2004. - Vol. 5. - P. 1787-1791.

56. Gaevsky, N.A. Vertical structure and photosynthetic activity of Shira Lake phytoplankton / N.A. Gaevsky, T.A. Zotina, T.B. Gorbaneva // Aquatic Ecology. -2002. Vol. 36, № 2. - P. 165-178.

57. Gilmore, D. Degradation of poly(p-hydroxyalkanoates) and polyolefin blends in a municipal wastewater treatment facility / D. Gilmore, S. Antoun, R. Lenz et al. // J. Ind. Microbiol. 1992. - Vol. 10. - P. 199-206.

58. Gladyshev, M.I. Disappearance of phenol in water samples taken from the Yenisei river and the Krasnoyarsk reservoir / M.I. Gladyshev, I.V. Gribovskaya, V.V. Adamovich // Water Research. 1993. - Vol. 27, № 6. - P. 1063-1070.

59. Gladyshev, M.I. The effect of algal blooms on the disappearance of phenol in a small forest pond / M.I. Gladyshev, N.N. Sushchik, G.S. Kalachova, L.A. Shchur // Water Research. 1998. - Vol. 32, № 9. - P. 2769-2775.

60. Gordeev, S.A. Processing and mechanical properties of oriented poly(p-hydroxybutyrate) fibers / S.A. Gordeev, Y.P. Nekrasov // J. Mater. Sci. Lett. -1999.-Vol. 18.-P. 1691-1692.

61. Grassie, N. The thermal degradation of poly(-D-)-/?-hydroxybutyric acid: part I Identification and quantitative analysis of products / N. Grassie, E.J. Murray // Polym Degrad. and Stability. - 1984. - Vol. 6. - P. 47-61.

62. Grizzi, I. Hydrolytic degradation of devices based on poly(DL-lactic acid) size-dependence / I. Grizzi, H. Garreau, S. Li, M. Vert // Biomaterials. 1995. -Vol. 16.-P. 305-311.

63. Hasircii, V. Biodegradable biomedical polymers / V. Hasircii // In: D.L. Wase. Ed. Biomaterials and Bioengineering Handbook. New-York: Marcel Dekker. 2000. - P. 141-155.

64. Hazari, A. A new resorbable wraparound implant as an alternative nerve repair technique / A. Hazari, G. Johanson-Ruden, K. Junemo-Bostron et al. // J. Hand. Surg. 1999. - Vol. 24. - P. 291-295.

65. Ho, Y.-H. Bio degradation of a medium-chain-length polyhydroxyalkanoate in tropical river water / Y.-H. Ho, S.-N. Gan, I. Tan // Applied biochemistry and biotechnology. 2002. - Vol. 102, № 1-3. - P. 337-347.

66. Hoang, K.-C. Polyester-degrading actinomycetes isolated from the Touchien river of Taiwan / K.-C. Hoang, C.-Y. Lee, M. Tseng et al. // J. Microbiol Biotechnol. 2007. - Vol. 23. - P. 201-205.

67. Hocking, P.J. Enzymatic degradation of single crystals of bacterial and synthetic poly((3-hydroxybutyrate) / P.J. Hocking, R.H. Marchessault, M.R. Timmins et al. // Macromolecules. 1996. - Vol. 29. - P. 2472-2478.

68. Holland, S.J. Polymers for biodegradable medical devices. II. Hydroxybutyrate-hydroxyvalerate copolymers: hydro lytic degradation studies / S.J. Holland, A.M. Jolli, M.Yasin et al. // Biomaterials. 1987. - Vol. 8, № 3. -P. 289-295.

69. Janssen, P.H. Pathway of anaerobic poly-f3-hydroxybutyrate degradation by Ilyobacter delafieldii / P.H. Janssen, B. Schink // Biodegradation. 1993. - Vol. 4. -P. 179-185.

70. Jendrossek, D. Biodegradation of polyhydroxyalkanoic acids / D. Jendrossek, A. Schirmer, H. Schlegel // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. -Vol. 46.-P. 451-463.

71. Jendrossek, D. Microbial degradation of polyesters: a review on extracellular poly(hydroxy alkanoic acid) depolymerases / D. Jendrossek // Polym. Degrad. Stab. 1998. - Vol. 59. - P. 317-325.

72. Jendrossek, D. Microbial degradation of Polyhydroxyalkanoates / D. Jendrossek, R. Handrick // Annu. Rev. Microbiol. 2002. - Vol. 56. - P. 403-432.

73. Jiang, Y. Cloning and expression of the polyhydroxyalkanoate depolymerase gene from Pseudomonas putida, and characterization of the gene product / Y. Jiang, J. Ye, H. Wu, H. Zhang // Biotechnol Lett. 2004. - Vol. 26. - P. 15851588.

74. Kalacheva, G.S., Chemical analysis of lake Shira water (1997-2000) / G.S. Kalacheva, V.G. Gubanov, I.V. Gribovskaya et al. // Aquatic Ecology. 2002. -Vol. 36.-P. 123-141.

75. Kanewasa, Y. Enzymatic degradation of microbial poly(3-hydroxyalkanoates) / Y. Kanewasa, N. Tanahashi, Y. Doi et al. // Polymer Degrad. and Stability. 1994. - Vol. 45. - P. 179-185.

76. Kawaguchi, Y. Kinetics and Mechanism of Synthesis and Degradation of Poly(3-hydroxybutyrate) in Alcaligenes eutrophus / Y. Kawaguchi, Y. Doi // Reprinted from Macromol. 1992. - № 25. - P. 55-60.

77. Kasuya, K. Substrate and binding specificities of bacterial polyhydroxybutyrate depolymerases / K. Kasuya, T. Ohura, K. Masuda et al. // Int. J Biol Macromol. 1999. - Vol. 24. - P. 329-336.

78. Kennedy, J.E. Assessment of the biocompatibility of PHB and P(HB-co-HB): PhD Thesis / J.E. Kennedy. University of Bath, UK. - 1990.

79. Kim, D.Y. Characterization of an extracellular medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoate) depolymerase from Pseudomonas alcaligenes LB 19 / D.Y. Kim, J.S. Nam, Y.H. Rhee // Biomacromolecules. 2002. - Vol. 3. - P. 291-296.

80. Kita, K. Properties of poly(3-hydroxybutyrate) depolymerase from a marine bacterium, Alcaligenes eutrophus AE122 / K. Kita, K. Ishimaru, M. Teraoka et al. // Appl Environ Microbiol. 1995. - Vol. 61. - P. 1727-1730.

81. Kopylov, A.I. Structure of planktonic microbial food web in a brackish stratified Siberian lake / A.I. Kopylov, D.B. Kosolapov, A.V. Romanenko et al. // Aquatic Ecology. 2002. - Vol. 36. - P. 179-204.

82. Korkusuz, F. In vivo response to controlled antibiotic release systems / F. Korkusuz, P. Korkusaz, F. Eksioglu et al. // J. Biomed. Mater. Res. 2001. - Vol. 55, №2.-P. 217-228.

83. Koyama, N. Effects of solid-state structures on the enzymatic degradability of bacterial PHA / N. Koyama, Y. Doi // Macromolecules. 1997. - Vol. 30. - P. 826-832.

84. Kumagai, Y. Enzymatic degradation of microbial poly(3-hydroxybutyrate) films / Y. Kumagai, Y. Kanasawa, Y. Doi // Macromol. Chem. 1992. - Vol. 193. -P. 53-57.

85. Kurchenko, I.I. Effect of salinities and temperature on enzyme activities of fungi from the Dead Sea / I.I. Kurchenko, A.S. Lauer, S. Buchalo et al. // Abstr.VI. Intern. Mycol. Congress. Israel, 1998. - p.169.

86. Kusaka, S. Properties and biodegradability of ultra-high-molecular-weight poly(R)-3-hydroxybutyrate. produced by recombinant Escherichia coli / S.

87. Manna, A. Degradation of microbial polyester poly(3-hydroxybutyrate) in environmental samples and in culture / A. Manna, A.K. Paul // Biodegradation. -2000.-Vol. 11.-P. 323-329.

88. Marchesault, R.H. Chemical, enzymatic and microbial-degradation of bacteria and synthetic poly-beta-hydroxyalkanoates / R.H. Marchesault, C.J. Monasterios, J.J. Jesudason et al. // Polym Degrad Stabil. 1994. - Vol. 45. - P. 187-196.

89. Martin, D.P. Polyhydroxyalkanoate compositions having controlled degradation rates / D.P. Martin, F.A. Skraly, S.F. Williams // PCT Patent application. № WO 99/32536. - 1999.

90. Matavulj, N. Fungal degradation of polyhydroxyalkanoates and a semiquantitative assay for screening their degradation by terrestrial fungi / N. Matavulj, H. Molitoris // FEMS Microbiol Rev. 1992. - Vol. 103. - P. 323-332.

91. McLellan, D. Preparation and chromatographic analysis of poly(3-htdroxybutyrate) hydrolysis products / D. McLellan, P. Hailing // J. Chromatogr. -1988. Vol. 445. - P. 251-257.

92. Mergaert, J. Microbial degradation of poly(3-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) in soils / J. Mergaert, A. Webb, C. Anderson et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - Vol. 59. - P. 3233-3238.

93. Mergaert, J. Microbial degradation of poly(3-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) in compost / J. Mergaert, C. Anderson, A. Wouters et al. // J. Environ. Polym. Degrad. 1994. -Vol. 2. - P. 177-183.

94. Mergaert, J. Biodiversity of microorganisms that degrade bacterial and synthetic polyesters / J. Mergaert, J. Swings // J. Ind. Microbiol. 1996. - Vol. 17. -P. 63-469.

95. Miller, N.D. On the biodegradation of poly-/?-hydroxybutyrate (PHB) homopolymer and poly-/?-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate copolymers / N.D. Miller, D.F Williams // Biomaterials. 1987. -Vol. 8. - P.129-137.

96. Mukai, K. Enzymatic degradation of poly(hydroxyalkanoates) by a marine bacterium / K. Mukai, K. Yamada, Y. Doi // Polym. Degrad. Stab. 1993 - Vol. 41.-P. 85-91.

97. Molitoris, H. Decomposition of thermoplastics in the sea / H. Molitoris, S. Moss, B. Zaunstock et al. // Abstr. IX Intern. Congr. Marine Corrosion and Fouling. Portsmouth, England, 1995.-P. 133.

98. Molitoris, H. Scanning electron microscopy of polyhydroxyalkanoate degradation by bacteria / H. Molitoris, S. Moss, J. Koning et al. // Applied Microbiology and Biotechnology. 1996. - Vol. 46. - P. 570-579.

99. Molitoris, H. Growth of fungi from the Dead Sea at different salinities and temperatures / H. Molitoris, I. Lauer, A. Buchalo et al. // Abstr. VI Intern. Mycol. Congress. Israel, 1998.-P. 169.

100. Miiller, H.M. Polyhydroxyalkanoates: a fifth class of physiologically important organic biopolymers? / H.M. Miiller, D. Seebach // Angew Chem. -1993.-Vol. 32.-P. 477-502.

101. Neumeier, S. Abbau thermoplastischer biopolymere auf poly-p-hydroxyalkanoat-basis durch terrestrische und marine pilze / S. Neumeier. -Diplomarbeit, Universitat Regensburg, 1994.- 99 p.

102. Nishida, H. Effects of high-order structure of poly(3-hydroxybutyrate) on its biodegradation. II. Effects of crustal structure on microbial degradation / H. Nishida, Y. Tokiwa // J. Environ. Polymer. Degrad. 1993. - Vol. 1. - P. 65-80.

103. Oda, Y. Microbial degradation of poly(3-hydroxybutyrate) and polycaprolactone by filamentous fungi / Y. Oda, H. Asari, T. Urakami et al. // J. Ferment. Bioeng. 1995. - Vol. 80. - P. 265-269.

104. Oda, Y. Purification and properties of poly(3-hydroxybutyrate) depolymerase from the fungus Paecilomyces lilacinus D218 / Y. Oda, H. Osaka, Y. Urakami et al. // Curr Microbiol. 1997. - Vol. 34. - P. 230 - 232.

105. Ohura, Т. Biodegradation of poly(3-hydroxyalkanoik acids) fibers and isolation of poly(3-hydroxybutyric acid)-degrading microorganisms under aquatic environments / T. Ohura, Y. Aoyagi, K. Takagi et al. // Polym Degrad Stab. -1999.-Vol. 63.-P. 23-29.

106. Perez-Martinez, J.I. Ethyl cellulose polymer microspheres for controlled release of norfluazon / J.I. Perez-Martinez, E. Morillo, C. Maqueda et al. // Pest. Manag. Sci. 2001. - Vol. 57, № 8. - P. 688-694.

107. Piletska, E.V. Controlled release of the herbicide simazine from computationally designed molecularly imprinted polymers / E.V. Piletska, N.W. Turner, A.P.F. Turner et al. // Journal of controlled release. 2005. - Vol. 108. -P. 132-139.

108. Poirier, Y. Production of polyhydroxyalkanoates, a family of biodegrabable plastics and elastomers, in bacteria and plants / Y. Poirier, C. Nawrath, C. Somerville // BioTechnol. 1995. - Vol. 13. - P. 142-150.

109. Pouton, C.W. Degradation of polyhydroxybutyrate and related copolymers / C.W. Pouton, M.I.A. Majid, L.J. Notarianni // Proc. Int. Symp. Controlled Release Bioact. Mater.- 1988.-Vol. 15.-P. 181-183.

110. Pouton, C.W. Diosynthetic polyhydroxyalkanoates and their potential in drug delivery / C.W. Pouton, S. Akhtar // Advanced drug delivery review. Vol. 18.- 1996.-P. 133-162.

111. Qu, X. In vivo studies of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) based polymers: Biodegradation and tissue reactions / X. Qu, Q. Wu, K. Zhang et al. // Biomaterials. 2006. - Vol. 27. - P. 3540-3548.

112. Quinteros, R. Extracellular degradation of medium chain length poly(|3-hydroxyalkanoates) by Comamonas sp / R. Quinteros, S. Goodwin, R. Lenz et al. // Int. J. of Biol. Macromol. 1999. - Vol. 25, № 1-3. - P. 135-143.

113. Rizzarelli, P. Soil burial and enzymatic degradation in solution of aliphatic co-polyesters / P. Rizzarelli, C. Puglisi, G. Montaudo // Polymer degradation and stability. 2004. - Vol. 85.-P. 855-863.

114. Renard, E. Hydrolytic degradation of blends of polyhydroxyalkanoates and functionalized polyhydroxyalkanoates / E. Renard, M. Walls, P. Guerin et al. // Polym. Degrad. Stab. 2004. - Vol. 85. - P. 779-787.

115. Rhee, Y.H. Haracterization of an extracellular poly(3-hydroxyoctanoate) depolymerase from the marine isolate, Pseudomonas luteola Ml3-4 / Y.H. Rhee, Y.H. Kim, K.S. Shin // Enzyme Microb Technol. 2006. - Vol. 38. - P. 529-535.

116. Romen, F. Thermotolerant poly(3-hydroxybutyrate)-degrading bacteria from hot compost and characterization of the PHB depolymetrase of Schlegella sp. KB la / F. Romen, S. Reinhardt, D. Jendrossek // Arch. Microbiol. 2004. - Vol. 182. -P. 157-164.

117. Rutkowska, M. Environmental degradation of blends of atactic poly(R,S)-3-hydroxybutyrate. with natural PHBV in Baltic sea water and compost with activated sludge / M. Rutkowska, K. Krasowska, A. Heimowska [et al] // J. Polym. Environ. 2008.

118. Saito, T. In vivo and in vitro degradation of poly(3-hydroxybutyrate) in rat / T. Saito, K. Tomita, K. Juni et al. // Biomaterials. 1991. - Vol. 12. - P. 309-312.

119. Sang, B.-I. Fungal contribution to in situ biodegradation of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) film in soil / B.-I. Sang, K. Hori, Y. Tanji et al. // Appl Microbiol Biotechnol. 2002. - Vol. 58. - P. 241-247.

120. Sanyal, P. Degradation of poly(3-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by some soil Aspergillus spp. / P. Sanyal, P. Samaddar, A. Paul // J. Polym. Environ. 2006. - Vol. 14. - P. 257-263.

121. Scandola, M. Study of the crystal phase and crystallization rate of bacterial Poly(/?-hydroxybutyrate-co-/?-hydroxyvalerate) / M. Scandola, G. Ceccorulli, M. Pizzoli et al. //Macromol. 1992. - Vol. 25. - P. 1405-1410.

122. Scherer, T. Production, purification and activity of an extracellular depolymerase from Aspergillus fumigatus / T. Scherer, R. Fuller, R. Lenz et al. // J. Environ. Polym. Degrad. 1999. - Vol. 7. - P. 117-125.

123. Shah, A. Isolation and characterization of poly(3-xydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) / A. Shah, F. Hasan, A. Hameed et al. // International biodeterioration&biodegradation. 2007. - Vol. 60. - P. 109-115.

124. Shangguan, Y.-Y. The mechanical properties and in vitro biodegradation and biocompatibility of UV-treated poly(3-xydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) / Y.-Y. Shangguan, Y.-W. Wang, Q. Wu et al. // Biomaterials. 2006. - Vol. 27, № 11. - P. 2349-2357.

125. Shinomiya, M. The adsorbtion of substrate-binding domain of PHB depolymerases to the surface of poly(3-hydroxybutyric acid) / M. Shinomiya, T. Iwata, Y. Doi // Int. J. of Biol. Macromol. 1998. - Vol. 22. - P. 129-135.

126. Shishatskaya, E.I. Degradation of P(3HB) and P(3HB-co-3HV) in biological media / E.I. Shishatskaya, T.G. Volova, S.A. Gordeev et al. // J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 2005. - Vol. 16, № 5. - P. 643-657.

127. Schlegel, H.G. Bin Submersverfahren zur Kultur wasserstoffoxydierenden Bakterien: wachstumphysiologische Untersuchung/ H.G. Schlegel, H. Kaltwasser, G. Gottschalk // Arch. Mikrobiol. 1961. - Vol. 38. - P. 209-222.

128. Sridewi, N. Degradation of commercially important polyhydroxoalkanoates in tropical mangrove ecosystem / N. Sridewi, K. Bhubalan, K. Sudesh // Polymer degradation and stability. 2006. - Vol. 91. - P. 2931-2940.

129. Steinbuchel, A. Physiology and molecular genetics of ро1уф-hydroxyalkanoic acid) synthesis in Alcaligenes eutrophus / A. Steinbuchel, H.G. Schlegel //Mol Microbiol. 1991. - Vol. 5. - P. 535-542.

130. Steinbtichel, A. Considerations on the structure and biochemistry of bacterial polyhydroxyalkanoic acids inclusions / A. Steinbtichel, K. Aerts, W. Babel et al. // Can. J. Microbiol. 1995. -V. 41, № 1. - P. 94-105.

131. Steinbtichel, A. Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids / A. Steinbtichel, H.E. Valentin // FEMS Microbiol Lett. 1995. - Vol. 128. - P. 219228.

132. Stock, U. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation / U. Stock, M. Nagashima, P.N. Khalil et al. // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2000. -Vol. 119.-P. 732-740.

133. Sudesh, K. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters / K. Sudesh, H. Abe, Y. Doi // Prog. Polym. Sci. 2000. -Vol. 25.-P. 1503-1555.

134. Takeda, M. Thermostable poly(3-hydroxybutyrate) depolymerase of a thermophilic strain of Leptothrix sp. isolated from a hot spring / M. Takeda, J. Koizumi, K. Yabe et al. // J. Ferment. Bioeng. 1998. - Vol. 85. - P. 375-380.

135. Tomasi, G. Enzymatic degradation of bacterial poly(3-hydroxybutyrate) by a depolymerase from Pseudomonas lemoigeni / G. Tomasi, M. Scandola, B.-H. Briese et al. // Macromolecules. 1996. - Vol. 29. - P. 5507-513.

136. Tseng, M. Polyester-degrading thermophilic actinomycetes isolated from different environment in Taiwan / M. Tseng, K.C. Hoang, M.-K. Yang et al. // Biodegradation. -2007. Vol. 18. - P. 579-583.

137. Urmeneta, J. Biodegradation of poly-(beta)-hydroxyalkanoates in a lake sediment sample increases bacterial sulfate reduction / J. Urmeneta, J. Mas-Castella, R. Guerrero // Appl. Envir. Microbiol. 1995. - Vol. 61. - P. 2046-2048.

138. Wabnegg, В. About the compatibility of retard tablets consisting of poly-D-3-hydroxybutyric acid as a carrier of active agents delivered applied perenterally / Wabnegg В., KorsatkoW. // Sci. Pharm. 1983. - Vol. 51. - P. 372.

139. Wang, Y. Biodegradation studies of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) / Y. Wang, W. Mo, H. Yao et al. // Polymer degradation and stability.-2004.-Vol. 85.-P. 815-821.

140. Williams, S.F. Applications of PHAs in Medicine and Pharmacy / S.F. Williams, D.P. Martin // In: A. Steinbiichel. Ed. Series of Biopolymers in 10 vol. Wiley-VCY Verlag GmbH. 2002. - Vol. 4. - P. 91-121.

141. Williams, D.F. The degradation of polyhydroxybutyrate (PHB) / D.F. Williams, N.D. Miller // Advances in Biomaterials: Biomaterials Clin. Appl. -1987.-Vol. 7.-P. 471-476.

142. Wu, C. A novel method of studying polymer biodegradation / C. Wu, Z. Gan //Polymer. 1998. -Vol. 39.-P. 4429-4431.

143. Yamane, H. Enzymatic degradation of bacterial homo-poly(3-hydroxybutyrate) melt spun fibers / H. Yamane, K. Terao, S. Hiki et al. // Polymer. 2001. - Vol. 42. - P. 7873-7878.

144. Yasin, M. Polymers for medical devices: VII. Hydoxybutyrate-hydroxyvalerate copolymers: physical and degradative properties of blends with polycaprolacton / M. Yasin, B.J. Tighe // Clin. Materials. 1992. - Vol. 10, № 2. -P. 21-28.

145. Yasin, M. Strategies for the design of biodegradable polymer system-manipulation of polyhydroxybutyrate-based materials / M. Yasin, B.J. Tighe // Plastics Rubber Composites Processing Appl. 1993. - Vol. 19. - P. 15-27.

146. Yew, S.-P. Photocatalytic activity and biodegradation of polyhydroxybutyrate films containing titanium dioxide / S.-P. Yew, H.-Y. Tang, K. Sudesh // Polym. Degrad. Stab. 2006. - Vol. 91. - P. 1800-1807.

147. Yu, G.-E. Characterization of low molecular weight ро1уф-hydroxybutyrate)s from alkaline and acid hydrolis / G.-E. Yu, R.H. Marchessault // Polymer. 2000. - Vol. 41. - P. 1087-1098.

148. Zadereev, Y. The vertical distribution of zooplankton in brackish meromicitic lake with deep-water chloroohyll maximum / Y. Zadereev, A. Tolomeyev // Hydrobiologia. 2007. - Vol. 576. - P. 69-82.

149. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

150. ПГА — полигидроксиалканоаты

151. ПГБ полимер p-гидроксимасляной кислоты (полигидроксибутират) ПГБ/ПГВ - сополимер гидроксибутирата и гидроксивалерата мч - микрочастицы мф - макрофаги

152. ГКИТ — гигантские клетки инородных тел ГХЦГ а-гексахлорциклогексан