Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическое изучение биосинтеза биотина у облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическое изучение биосинтеза биотина у облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum"

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

На правах рукописи

СЕРЕБРИЙСКИЙ ИЛЬЯ ГЕНРИХОВИЧ

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ БИОСИНТЕЗА БИОТИНА У ОБЛИГАТНОГО МЕТИЛОТРОФА МеШу1оЬасШиз НадеИаШт

03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1992

Работа выполнена в лаборатории генетики метилотроФных бактерий всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель - доктор биологических наук Ю. Д. Цыганков.

Официальные оппоненты • доктор биологических наук А. А. Сибирныи: кандидат биологических наук ■ А. С. Миронов. ■

Ведущее учреждение - кафедра гелетики Белорусского Государственного Университета.

зашита состоится 10 марта 1992 года в у}— час. на заседании специализированного совета Д 098. 12.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: Носква, 1-дорожный проезд. 1.

С диссертацией иожно ознакомиться в библиотеке ВНИИгенетика.

I С с?1

Автореферат разослан._____^___гл___ 199гг.

Ученый секретарь Специализированного совета ' кандидат биологических наук

В. И. ЩЕРБАКОВА

• . - :.'...* 5

. тЛ'-ОБЙ/|я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тени. нетилотроФн. т. е. микроорганизмы. способные утилизировать восстановленные Формы одноуглеродных соединений, привлекают повышенное внимание как перспективные объекты для промышленного применения.

Бактерии, утилизирующие . ci-соединения. обладают рядом преимуществ. Главным образом это - кепатогенность, способность расти на простых средах. используя относительно дешевые и доступные субстраты (например, метанол), удовлетворительные ростовые характеристики и качество биомассы.

По сравнению с другими нетилобактериями, MethYlobacillus flasellatum, объект нашего исследования,- имеет некоторые преимущества: повышенный температурный оптимум роста, использование энергетически наиболее выгодного пути ассимиляции с1-соединений, биохимическая изученность. • отсутствие Фагов, разработанные генетические методы работы вплоть до успепной экспрессии гетерологичных генов и получения гесА- мутантов.

Полекулярно-генетическая информация об облигатных метилот-рофах в настояпее время весьма ограничена, в связи с этим представляет интерес сравнение Функционирования некоторых клеточных процессов у метилобактерий и других микроорганизмов, это относится также к механизмам регуляции экспрессии генов метаболизма; до1" сих пор такая регуляция у облигатных метилот-рофов ке обнаружена, остается открытый и вопрос о том, как организовав гены у нетилотроФных бактерий: имеют ли гены биосинтеза оперонную организацию или транскрибируются с индивидуальных промоторов. выбор модельной систены для попытки ответить на некоторые из этих вопросов определил нал интерес к изучению пути биосинтеза биотина. На примере Е. coll было показано. что зиотиновые гены организованы в оперон по классической модели жакоба-Моно;.хорошо изучена также и система регуляции активности Ферментов; этого метаболического пути: ' ее характеризуют координированная - репрессия и полное отсутствие ретроингибирования какими-либо промежуточными продуктами.

Несомненную важность представляет и конечный продукт этого биосинтетического . пути - биотин. в настоящее время хорозо

- г -

известно, что биотин как кофактор ферментов, участвующих в реакциях карбоксилирования, необходим дли нвдмшшаюя яатклдлв-тельности всех живых существ, независимо от сложности их организации. Различные стороны метаболизма клетки оказываются пря- ' мо или косвенно зависящими от биотина.

Биотин производят. как известно, химическим синтезом. Этот синтез сложен и сопровождается образованием стереоизомер-ных продуктов. Использование для получения биотина'микроорганизмов казалось до недавних пор нецелесообразным из-за недостаточно высокого уровня их .синтетической активности. Лишь сравнительно недавно были-получены штаммы-продуценты на основе клонированных генов из E.Coll и В. sphaericus. Таким образоь. исследование.путей биосинтеза биотша и клонирование биотино-вых генов облигатного метилотрофа' может иметь и практический интерес.

пель и задачи исследования. Основной целью данного исследования являлось изучение на генетической и молекулярно-биологи-ческом уровне организации и'функционирования генов биосинтеза биотина Н. flaeellatum. Непосредственной целью работы было получение и характеристика Bio- мутантов М. flaeellatum, картирование полученных мутаций, клонирование некоторых генов биосинтеза биотина этого, никроорганизма ■ и сравнение организации генов биосинтеза биотина у Н. flaeellatum и других бактерий. Для осуществления поставленной цели решали следующие задачи:

- получение мутаций по биосинтезу биотина у н. fiaseilatum;

- характеристика полученных мутантов;

- картирование охарактеризованных мутаций;

- клонирование генов Moa. ЫоВ. bloF. ыон. mod м. flaeel latum;

- построение рестрикционной карты и определение взаимного расположения этих генов;

- определение нуклеотидной последовательности гена ЫоВ

Н. flaeeliatum и сравнение аминокислотной последовательности кодируемого им Фермента с первичными структурами белков ВЮВ другие бактерий;

- исследование регуляции экспрессии генов биосинтеза биотина М. flaee:latum в Е. coll;

- сравнение организации генов биосинтеза бкотина м. flagellatum и других бактерий.

научная новизна и практическая значимость работы, впервые, для метилотроФов получены ауксотроФные мутанты по биосинтезу биотина, найден структурный ген пути биосинтеза биотина, не имеющий аналогов в Е. сои. В числе первых геной облигатных метилотроФных бактерий клонированы Б генов биосинтеза биотина. Полностью или частично секвенированы гены ыов. bioF. ъюн. ыоА и bloD. а также новый ген. обозначенный blol. ген ЫоН -единственный, кроме гомологичного гена Е.coll. который клонирован и для которого определена нуклеотидная

последовательность.

Мутанты и. flaEellatum ыо- ногут оказаться удобными хозяевами для стабильного поддержания рекомбинантных конструкции с клонированными генами биосинтеза биотина, что важно для возможного использования М. flagellatum в.биотехнологии.

структура и обьем работы. диссертация состоит из следующих разделов: введение, материалы и методы, результаты и обсуждение (6 глав), выводы, списгбк литературы ( 109 наименований): и содержит-13 рисунков и 5 таблиц.

Апробапия работы. Результаты исследования были представлены на конференциях молодых . ученых "Биотехнология: эксперимент, теория, практика" (Кандалакша. 1989). б-ой Международной конференции "Микробный рост на ci-соединениях" (Геттинген. ФРГ. 1989). б-он Международном синпозиуне но генетике промышленных микроорганизмов GIH-90 (Страсбург. Франция. 1990). на сенкнаре научного пентра Фирмы "Орсан", Париж, франция. 1991.- семинаре'. отдела молекулярной генетики

вниигенетика. 1991.

РЕЗУЛЬТАТЫ Н ОБСУЕДеЖЕ

1. Получение биотиновых. нутантов к. f laeellatum.

в результате оптимизации условия нг-мутагенеза и разработки специального подхода для селекции ауксотрофных мутантов впервые для метилотрофов создана представительная коллекция мутан-тое м. f lasenatum. насчитывающая более 40 эуксотрофных мутантов, мутанты по ключевым генам ci-метаболизма и гесА мутанты.

Для выделении ауксотрофных мутантов у м. flasellatum иутаге-низированные бактерии высеваются не на полноценную среду, компонента которой подавляют рост ауксотроФов, а на минимальную агаризованнур среду, содержащую добавки отдельных ростовых Факторов в высокой концентрации, тем самым производится направленный отбор мутантов определенных Фенотипических групп.

Р.еализуя описанный Еыше подход, мутагенизированкую культуру н. flasellatum MFK3 высевали на чагаки с минимальной средой, содержащей различные концентраций биотина.

Отбор мутантов стал' возможным только после повышения концентрации биотана в 10 ООО раз по сравнению с концентрацией витамина, достаточной для компенсации соответствующих дефектов Bio- штаммов Е: сои (до 160 мкН). Всего было, отобрано 17 мутантов. Анализ этих мутантов (см. след. раздел) показал, что больше половины из них дефектны по гену ыов. последнему гену пути биосинтеза биотипа! поэтому мы повторяли мутагенез, высевая мУтагенизироБакную смесь на среду, содержащую вместо биотипа его непосредственный прешественник - детиобиотин с той же концентрации. Таким образом были отобраны еше ю мутантов. Частота мутагенеза составляли о, 5И при отборе на среде с биотипом и о,ix - при отборе на среде с детиобиотином: уровни реверсий составляли не более чем 10 ; 3 мутанта имели 1еакг-фенотип.

г. Определение блоков метаболического пути полученных мутантов. Поскольку сведения о пути биосинтеза биотина у метилотро-фов отсуп. гсовали. ны исходили из схемы, предложенной ранее

неиза предаественкики

пиме.

i "

ЛЙЛ-КОА

ЫОС. ЫОН

bloF

7-кето-З-амино-пеларгоновая к-та

ЫоА

7,8-дйзкино-г.еларгоковая к-та

i

и« 1

детаобиотан

bloD

ЫоВ

Рис. 1 Путь биосинтеза биотена у Е. coll

для других микроорганизмов. на рис. 1 приведена,упрошенная схема метаболического пути биосинтеза бнотина для Е. coll. при изучении роста на биотине и детиобнотине полученных мутантов

М. flageilatum было показано, что часть полученных мутантов растет только на биотине, а часть- как на биотине, так и на детиобиотинё. Если исх<}дить из метаболического пути бнотина у Е. сои и В. sphaerlcus. неспособность к росту на детиобнотине указывает на муташю в гене ьюв. который кодирует биотинсинте-тазу. Для идентификации мутантов мы использовали также метод взаимной

таблипа 1. определение метаболических блоков в мутантах

м. flageilatum в опытах по подкормке и взаимной подкормке.

М. flagei latum MOB ' 29-40 bloD - ЫОА 61, 80. 05-90 bloc, bloF, ЫОН 82-84.91-94

могут использовать: биотин детиобиотин + +

подкармливают blo-мутантов Е. coll: K871(blt-B2> R877 (MOD). R879 (ЫОА) R378 (МоС). R874 (bloF) ЕИ355 (ЫОН) + + - '

-. б -

подкормки с использованием в качестве тост-культур вю-мутантов Е. coli. Результаты проведенных тестов представлены в табл. 1.

По полученным данным все тестируемые мутанта могут быть разделены на 3 большие группы. К первой группе относятся мутанты Ыов. определенные однозначно, ко второй группе Относятся мутанты. способные- подкармливать только мутантов е. coll bioF. ыос и ЫоН. в этой группе могут быть штаммы с мутациями bloD и Ыоа.

Наконец, в третьей группе оказались все мутанты м. flagellatun. не способные подкармливать мутантов Е. сои. очевидно, среди мутантов этой группы могут быть только штаммы с мутациями, аналогичными нутациям bioF.с и н Е. coli.

Как видно. . вместо ожидавшихся четырех групп мутантов было полхчено только три. это может быть объяснено тем, что количество секретируемои мутантами bioD H.flaeel latum дианикопе-ларгоновой кислоты недостаточно для подкормки'мутанта е. coli Ыоа. Для определения мутантов bloD и ЫоА был использован другой подход. основанный на комплементаионном картировании при поноши r'-плазмид.

з. клонирование генов биосинтеза биотина и. flasellatum in vivo в составе R'-плазмид и комплентационное картирование сложность получения нутантов. отсутствие или низкая эффективность собственных систем генетического обмена обусловили развитие заменительных или вспомогательных путей генетического анализа нетклотроФных бактерий, одним из которых является использование коньюгативных плазмид широкого круга хозяев для клонирования генов-нетилотрофов in vivo и последующая идентификация по кокпленентации в гетерологичнои хозяине, такой подход получил название "суррогатная" (заменительная) генетика.

Нонш.сментаиионное картирование было использовано тал еже и для генетического 'исследования н. f íaseiiatum [юг. ЮЗ], выла получена аредставительная 'коллекция R'-плазмид на основе

pULBl13, содержащих различные фрагменты хромосомы м. flagellatum.

В этой коллекции проводило^ поиск R'-плазмид. содержащих гены биосинтеза биотина н. flasellatum. Было найдено, что группа R'-плазмид. отобранная по комплементации мутации рголг в штамме АВ2463. комплементирует также мутации bloD в штамме R677. ыоН и pro- в штамме ЕМ355. а также Ыов в штамме ES71..

Не было найдено комплементации генов bloF. bloc и МоА; очевидно, что количество имеющихся R'-плазкид недостаточно для конплементашш всех биоТиновых мутаций. Поэтому было решено попытаться клонировать соответствующие гены отдельно.

Предварительные данные показали нестабильность R'-плазмид в гес+ хозяевах, поэтому для клонирования m vivo были получены гесА- варианты соответствующих штанмов Е. coli. В скрещивании с донором н. fiaaellatum(PULBii3) и реципиентнын штанном Е. coll ЫоА2 было отобрано 5 клонов. При частоте передачи PULB113 г.гчо'2 частота образования И'-плазмид составила • 1. б» ю~ ^ на репипиеитную '--клетку, полученные R' -плазмиды не конплементировали других биотиновых мутаций в штаммах е.coll.

попытки отобрать R'-плазмиды. содержащие гены bioF и bloc, оказались безуспешными.

3.1. Определение возможных блоков метаболического пути у мутантов н.flasellatum с использованием R'-плазмид Используя полученную информацию по комплементации известных мо- мутаций Е. сои R'-плазнидами, мы попытались уточнить Фенотипическую принадлежность полученных мутантов Н. fiase 1-latun. Для этого была проведена серия скрещиваний этих мутантов со штаммами, несущими R'-плазмиды. Одна группа мутантов комплементчровались R'proA. другая - R'bioA. три мутанта не комплементировались ни одним из типов R'-плазмид; не были также обнаружены мутанты, комплементировавшиеся одновременно двумя типами R'-плазнид. Результаты этих опытов, а также данные экспериментов по подкормке позволили выделить 5 групп Ыо - мутантов Н. flasel latum (табл. 2):

Мутанты первой группы были определены ранее как bioB (см.

- в -

табл.1). Мутанты второй и четвертой групп обладают способностью подкармливать bloF нэ'тант Е. coli; это указывает на ну-тапии в генах bioD или Ыол. Комплементация этих мутантов различными R'-плазмидами позволило отнести 4 мутанта к классу Ыол и еше 5 - к классу bioD.

Нутанты третьей и пятой групп не могут подкармливать bioF мутант Е. coli; это указывает на мутации в каких-либо ранних генах. Мутанты этих групп не могли быть определены' однозначно

таблица г. характеристика Bio- мутантов н. fiasellatum ' с использованием R'-плазмид

Характеристика мутантов Группы мутантов

I II III IV V

мутанты м. fiageilatum 29-40 СО. 65 82. 63 61. 81 84, 91

63-90 93. 94 86. 87 92

Рост на детиобиотине - + + ♦

Комплементация R'ргса + + - -

комплементация R'bloA - : - ' ■ - + - '

Подкармливает Е. coll bloF- + . + - + -

ИдентиФиаирован как: ыов bioD bloH blOA ЫОС

(и/или и/или

bloc.bioF) bloF

с использованием только этих данных, поскольку не было известно. все ли гекы Н. fläse1 latum могут одинаково хорошо выражаться в составе R'-плазмид в Е.coli и совпадают ли полностью пути биосинтеза биотина в этьх микроорганизмах. Во всяком случае, все мутанты по ранним генам биосинтеза биотина удалось разделить на 2 различные группы. .

Окончатдльная характеристика мутантам н. flaeellatum могла

быть дана только после клонирования индивидуальных генов на отдельных плазнидах (см. раздел ).

4.

Картирование генов биосинтеза'биотина M. flagellatum

4. 1. Компленентапионное картирование генов ЫоВ. МоР, ЫоН

Для определения порядка расположения биотиновых генов и других генов м. flasellatum, сцепленных в составе клонированных ка R'-плазнидах фрагментов . проводился Фенотипический анализ индивидуальных R'-плазмид группы R'proA. а также кома-лементадия индивидуальными R'-плазмидами этой группы ауксот-рофной мутации llvC в соответствующих штаммах Е. coll.

argS3 thi-1 proâ2 bioB

О B.B

_55

-rr>-1

_10

-:—i

32

ilvC

Рис, 2

Комплементапионный анализ индивидуальных И'-плазмид группы К'ргоа. всего было проанализировано 29 И'-плазмид. Цифры указывают процент й'-плазмид. несущих на фрагменте хроносомы н. flasellatum соответствующий маркер.

Резул гаты анализа индивидуальных R'-плазмид представлены на рис. 2. Эти данные позволяют однозначно определить порядок расположения генов: КагаЕЗ - Kthl-l - кргоа2- KbloB.d,h -Kllvc (гены H. flagellatum, идентифицированные по комплементации ауксотроФных мутаций Е. coll. имеют индекс К). Тем самым, установлено тесное взаимное сцепление биотиновых генов

-loll. flaco 11atún и их сцепление с маркерон ргоА2. а также определено место кластеру генов биосинтеза биотина в большой группе сцепленных маркеров, включающей в себя всего 16 маркеров (см. рис. 3).

4. г. комплементааионное картирование гена Ыол

Проводился Фенотипический анализ индивидуальных R'-плазмид группы К'ЫоА. а также комплементация индивидуальными R'-плаз-мидами этой группы ауксотрофных мутаций в штаммах е. сои из коллекции ВНИИгенетаки. Была показана несцепленность маркеров ыоа с маркерами любого из штаммов, использовавшихся в этих опытах (скрещивания были проведены со всеми доступными штаммами из ВКПМ, насчитывающим более чем 30 различных тестированых мутаций).

следует отметить, что'цо данным рестрикционного анализа размер вставки на R'-плазмидах составляет в среднем около 20 т.п.н.. что достаточно для кодирования более ю генов средней величины.

Картирование маркера Ыол с использованием системы передачи хромосомы в гомологичных скрещиваниях, обусловленных плаз-мидой IncPi-группы R66. 45 также, не показало сцепленности зто-г9 иаркера с какими-либо другими хромосомными маркерами, полученные результаты заставляют предположить, что данный ген может находиться в области. ненасыщенной биосинтетическими генами. Существует предположение, что организация генома ме-тилотрофов может быть схожа с его организацией у псевдомонад, как установлено, ауксотроФные маркеры на генетических картах псевдомонад распределнены неравномерно., так. у p. put ida 64/. известных ауксотрофных маркеров ограничены 36* генетической. карты, не исключено, что подобным же образом организован геном у облигатных нетилотроФов.

4. 3. Картирование по вренени вхождения хромосомных маркеров

полу,,£1ние стабильного Hfr-донора (MFK64). способного к поляризованному переносу хромосомных маркеров Н. flagellatum ^

разработка условий'прерывания коныогашюнных скрещиваний на Фильтрах позволили определить время вяоядения маркеров Ыош и bloAl. Маркер Ыов локализован на 6-7 кинуте, а маркер bloA - на 17-18 минуте генетической карты М. fiase 1 latum.

На модельных объектах, таких как Е. coll и P. aeri..:inosa [781. картирование осуществлялось с использованием нескольких доноров с разными точками начала и направлениями переноса хромосомы: однако для сравнительно небольшой ранней области хромосомы м. flasellatum точность определения относительного расположения маркеров мохет быть достаточной и при использовании одного донора.

Генетическая карта И. flasellatum с локализованными на ней генами ЫоА и Ыов представлена на рис. J.

5.клонирование генов биосинтеза биотина Н. flasellatum in vitro

5.1. Клонирование генов ыон. bloB. bioF. bioD M. fiase} latum

в состкве плазмиды широкого круга хозяев

для клонирования генов Оиосиитеза биотинс н. flasellatum использован банк генов этой бактерии. сконструированный на основе вектора PAYC31. Эта плазмида'может быть передана конъюгацией и поддерживаться в широкон круге хозяев, включая не-тилотроФные бактерии, в скрещивании с И. flasellatum hfk60 было отобрано 5 ВЮ+ apr SmR клонов: в скрещивании с mfk80 - 3: в скрещивании с - ч. рестрикдионныл анализ выделенных, из

них плазмгд выявил наличие общего ВапЯ!-фрагмента: 5.2 т. п. н. кроме, того, все выделенные из штамма ИПС80 плазмиды содержали Taiate вставку 2.9 т. г. . н.. в дальнейшей исследовали одну из таких рокомбинантных плазмид (pbi01). носушу» вставку 8.1 т. п. н.

5.2. клонирование гена ыоА н. f lasellatum i:i PUC19

для клонирования гена bio:'была использована одна из R'-плазмид, полученных ранее (см. раздел<". Плазмидная ДНК обрабатывалась эндонуклеазой рестрикции HindiII. после чего полученные фрагменты лигировались с ДНК PUC19. линеаризованной той

ре!-1 1

СрузгЕ Ск г-р(КБ-ЗО) СтоЧ:—26 -Ьг-рЕ

1

то-Ь—5 риг—2

: СригЬ СЪЬуА СЬЬг-С ЛИгАг Сэ-Ьг—31 СЫгг-В СригЧ СогвН СагвЕ СагдВ

СргоА Сруг-1» СргоС СИуС СЫоБ СЫ оЕ" СЫоН СЫ о I СЫоС

СЫвВ СЫеС СЫэГ-а11а-68

ЫеВ Ыв-З Ыэ-'« 111е-6

Рис. з

Локализация генов биосинтеза биотипа на хромосомной карте н. £¡авепашт. стрелка указывает начало переноса хромосоны донором нгеб4 Н{гд. карта откалиброваиа в минутах. . Гены Ыов и ЫоА локализованы по времени вхождения маркеров; гены ЫоН и Ыоо - по принадлежности к той же группе сцепления, что и Ыов. Гены ЫоР и Ь1о1 включены в данную группу по результатам анализа клонированного Фрагмента хроносомы Н. ЛавеПаПип (раздел б).

же рестриктазой. Полученной лигированной смесью трансформировали Е. coll MOA2. отбирая ВЮ»ар* клоин. Било получено 17 клонов; рестрикционный анализ выделенных из отобранных клонов плазмид выявил наличие обшего Hindi И-Фрагмента: 9.1 т. п. н. в дальнейшем исследовали одну из таких рекомбинантных плч.мид. обозначенную PBI02.

б. Рестрикционное картирование и локализация генов биосинтеза биотина м. flaeeilátum Была построена предварительная рестрикпионная карта фрагмента, клонированного в составе плазниды pBIOl. üiu. пос--ледуюпей габоты фрагменты BamHI-BaroHI (3.2 и 2.9 т. п. н. ) и sal-sal (2. в т. п. н. ) гибридной плазниды pfclOl встроили в соответствующие сайта вектора рис19. Полученные.плазниды обозначены соответственно рВЮЗ. рВ104 h рВ105. Дальнейший анализ делепконных производных этих плазмид (схема представлена на рис.1) позволил построить подробную рестрикдионную карту этого Фрагмента • хромосомы И. fiaseUatún и локализовать гены ыон. ыов и. Mod. нутадия mof»e. coll не конплеиентировалась плазмидой рВЮЗ и ее производными. поэтому рестрикпионное картирование гена biôF H. flasellatum проводили непосредственно на плазмиде pBIOl. в составе которой этот ген хорошо экс-прессировался в Е. coll. По данным рестрикнионного. делеиион-ного и комплементационного анализов удалось локализовать ген bloF гежду-генами bloB и ЫоН (см рис. 4). .

дальнейший анализ делеииотшх прллзеодных pBIO?. (схема представлена на рис) позволил локализовать ген ЫоА на фрагменте 2, т. п. н. и построить подробную рестрикционную карту этого Фрагмента хромосомы л flasellatum.

6. 1. Фенотипическая характеристика мутантов и. flasellatum с использованием клонированных генов.

Для характеристики мутантов исслед- далась их комплементация плазмидами. использованными для определения расположения гена bloF (рис.4). Результаты проверки представлены в табл. з,-

ЫоВ ==> МоН bl»D

bloF Mol

pBIOl

рВЮЗ .рВЮЗг + +

PBI031

PBI032 —

рВХОЗЗ ' 4-

PBI034 +

'рВ1035 —

рВЮЗб —

PBI037 —

PBI038 —

рВЮЗЭ _

О

PBI04 pBI04r

-С^ рВ105 рВЮ5г S

рВ1051 PBI052

pBXOll

PBI012

PBI013

. Комплементация маркеров Е. coll ЫоН ЫоВ bloD bloF

+

ч-+

+

4.

+ +

+ +

-I-4-

+ +

+

+

+ '

4-

4-

+

Рис. 4. локализация генов ЫоВ, ЫоН, bloD и bloF при помощи делеиионного анализа плазмид PBIOl, PBI03. PBI04 и PBI05. Сайты для эндонуклеаз рестрикции, обозначенные на рисунке: S. SalGI; В. BamHI; P. PstI: G. Belli; V. Avail I; A. SacI; X. Xhol. Толстой линией показан фрагмент хромосомы в составе плазнид на основе pBIOl. Тонкие двойные линии со стрелкани обозначают ориентацию соответствующих фрагментов, .переклонированных на .4JC19 (по отношению к ее промоторам).

Таблица 3. Комплем'ентационный анализ Bio- мутантов M. f laseliatum

Характеристика мутантов Группы мутантов

I II III Illa IV V

мутанты м. Навепагит 29-40 80. 85 83.93 82 61. 81 84. 91

68-90 94 86.87 92

Рост на детиобнотине - + ♦ + ♦

конплементапия 1г'моА - - - + -

Комплементация РВЮ1 ♦ ■ ♦ ♦ + - . -

Конплементапия РВЮ11 ♦ - ♦ + - -

Комплементация РВ1012 + - ♦ - -

Комплементация РЩ013 - - - -

предварительно идентифи- MOB bloD MoH/F MoH/F bloA bloC/F

цирован как:

Окончательно идентифици- MOB bloD blOF MOI bloA MoC

рован как:

Таким образон. в основном была подтверждена установленная ранее классификация мутантов M. flasella'.um. Вместе с тем выяснилось. что в группе III нет мутантов bloH и bloF. а есть только мутанты ыо~ соответственно, среди мутантов группы v могут присутствовать только мутанты ыос. Был также обнаружен мутант по какому-то из ранних генок. о наличии которых у м. fiase i latum ранее не было никаких даллих. Этот мутант был выделен в отдельную.группу Illa, и соответствующий ген получил обозначение Mol.

Анализ полученных данных позволяет в целом определить путь биосинтеза биотина у н. fiase Hat um. он включает в себя как минимум 7 стадия; 5 иг» них совпадают для е. coli и H. f lasenatum (в том числе н стадии с идентифицированными функциями). и 2 ранние стадии, по крайней мере одной из которых нет аналога в Е. coli.

7. Изучение регуляции экспрессии генов биосинтеза .биотина н. flageilatura в Е. coli

Механизм регуляция экспрессии в Е. coli был ранее подробно изучен. Так. было показано, что контроль осуществляется по типу репрессии и что все синтетазы репрессируются координировано. Ретроингибирования биотином каких-либо звеньев синтеза обнаружено не было.

дл>* определения регуляции экспрессии генов М. flaeellatum в клетках Е. coli использовали систему, разработанную в 1980 г. в работе А.Campbell.В хромосоме тташа ВМ2661 репортерный ген lacz находится под контролем промотора гена ЫоВ (Рв). При низкой концентрации биотица в среде низкой остается и концентрация репрессора: оператор остается свободным, и с промотора Рв идет транскрипция гена Ji-галактозидазы. Присутствие биотипа (концентрация 4МН). приводящее к возрастанию концентрации репрессора.■ сильно подавляет транскрипцию.. Если в штамм вводится многокопийная плазмида. обладающая сродством к репрг-сору. -То происходит так называемое титрование репрессора: он связывается с сайтами на плазмиде. и его эффективная концентрация падает. Это приводит к повышению эффективности транскрипции р-галактозидазы с промотора Рв. По изменению степени репрессии1 можно судить ■ о сродстве клонированного фрагмента к репроссору биотинового оперона Е. сон.

В штамм ВН2661 вводили следующие плазмиды: PBI02. рВЮЗ и РВЮ5, а также контрольную плазмиду - рис 19 с произволной вставкой.

Были проведены количественные измерения активности J-ra-лактозидазы в условиях роста в присутствии биотина и без него.

По получонным данным. степень репрессии р-галактозидазы во веек плазнидннх производных близка и практически неотличима от контроля. это свидетельствует об отсутствии заметного сродства клонированных на плазмидах фрагментов к репрессору бнотинового оперона Е. coli.

Известно, что операторная область Е. coli изменяет степень репрессии в 25 раз. Citrobacter freundu - в 16 раз. и

- 17 -

Salmonella typMrcurium - в 17 раз. в то яе время било показано, например. что клонированный ген ЫоН не изменяет степень репрессии и. следовательно, не имеет сродства к реп-рессору.

Очевидно, экспрессия био-пшовых генов н. flasellati i в Е. coll не регулируется на уровне транскрипции (другого уровня регуляции в Е. col i нет).

в. Нуклеотидная_последовательность . фрагментов ДНК,

содержащих гены биосинтеза биотина Н. flaeellatum Для определения нуклеотидноя последовательности различные фрагменты плазмид. ' содержащие. согласно данным делеиионного анализа (см. раздел ). гены биосинтеза биотина И. flasellatum и прилегающие области, клонировали в соответствующие сайты по-линкеров Фага Н13 tgl30 и tél3l. нуклеотиднло последовательность определяли методом сэнгера.

Была определена нуклеотидная последовательность фрагмента хромосомы и. fiase 1 latum, содержащего ген mob 'toil п.н. ). а

также частично фрагментов с генами: bioF и ЫоН (1136 п. и. );

■ *

bloD (8ео П. Н. »: MOA (550 П.Н. ) И blol (250 П. Н. ).

Нуклеотидная последовательность гена bloß н. flaaeiiatum и Фланкирующих областей представлена на рис. 5.

8. 1'. ' Анализ структурной части гена ь;.об

06¡tapvxena ORF (номера нуклеотидое: l - 986). соотсетс тиуюзая гену. . продукт которого оказывается гомологичным из-ве;тным структурам белков ыоВ других бактерий. (54-64/ для Е. coll. 11. fiaeellatüm и В. sphaericus).

ORF (i -986) кодирует полипептид из ззо аминокислот с Mr 35831. инициирующий кодон гена - atg, терминирующий - taa.

6. 2. Анализ 5' -концевой областг .перед структурной частью гена Mos 8. 2. i. Поиск сигналов транскрипции и трансляции.

Перед первым транслируемый кодоном гена bloß (ATG) на расстоянии 5 нуклеотняов расположена A+G - богатая область, ко-

с tgcaggtatcgattctatggattgatgggggcgttggtggtgctactcaatttcagctc

— 160

caacatggcaggctgggtaggcgtagggatgatc tcgccttgatcatatgggagtcagca^

tgc tgg tgatcgtcccgc tgggg tgcgcgacatac tqcqaqcqcqcaqqgaqccatgqca

'MRD"SVID 7 ggatttaaccatcaagacaqaataaqtcaqagaggacagcatgcqagactcagtgattga

IRG'LDR"vaRÄRV a"AKE*EAPK 27 catacgcggccttgaccgtgtccaacgtgcaagggtgcaggcgaaggaagaagcgccaaa

RWS'VDD'IVALFEL'PFS'DLMH 47 acgc tggag'gtggatgata t tg tggca t tg ttcgagttgcca111tcaga tc tga tgca

141

RAQSVHRENFD'PNGVQVSTL 67 cugggcacagtccgtgcatcgcgagaatttcgatcccaatggtgtgcaggtcagtacctt

LSl"KTG*GCSEDCG"YCP*aAAR 87 gc 11 tcca tcaagaccgg tgg ttg ttc tgaggac tg tggc ta t tg tcc tcaggccgccc^ ^

YHT"DVE'KQDL.HAA"GRG"TRSR 107 с taccacaccgatgtgg&aaagcaggatttgcatgcagc tggaagagg tac tcgcag

V L P"R R M *R 43 P F С M A'A W a'p О А А 127 cg tgc tgccaaggagaatgcgccagccg ttc tgca tggc tgca tggcagccccaagcagc^

R P R"A R A"G H D S R M K'A M G*U E T C 147 gcgacctcgagcc g tgctggccatgattcgcgaatgaaagcdatgggcctggaaac tt^

А T L* G M L *K D- G Q А E Ö" L К E *A G L D 167 cgctactcttggaatgctgaaagataggcaggccgagcaattgaaggaagcgggtctcga

•501

V Y N H N Lj О T А .P E V Y G E V- I T T R 187 с tactacaaccataactttjgacactgcgcctgaatac tacggcgaagtcatcacgacccg

T Y c' D R U *D T L D R V R* E Q D 'i N V F 207 cacctaccaggaccgcctggatacgctggatcgtgtgcgcgaacaggacatcaacgtctt

С G G* I I G "(1 G E S fc V o' R A G *L L A S 227 ctgtggcggcattatcggcatgggggagtcccgc^tccagcgtgccggacttcttgcgag^

F A N* M E R > P E S V P l' X S О 'A G G R ctttgccaatatggagcgtccgcccgaaagcgtgccgatcacctctgacgcaggtggaa^

tp h'ygm'delö pfe'fvr't i да 267 gacaccgatgtatggcatggacgagctggacccgtttgaattcgtgcgcacgatcgcggc

A R Г T M p'k S F'V R L s'v ß r'o S M H • 287 tgcccgcatcacgatgccgaagagtttcgtgcggttgtccgttggccgccaaagcatgca

E E S* A L С *F L А V А N S* I L Y *G E К L, 307 tgaggaatccgccttgtgctttctggctgttgctaactcgattctctatggtgagaagct

V T S* G N P *E А E С D R K* L F D *K L D I 327 tgtgaccagtggcaaccctgaagccgaatgtgaccgcaagttattcgacaaactcgacat

' « .■ • 981

H P L 330

ccatccgctataagtcacgatgccttccatgctggaatctcacccgcagaagcagccacc

... 1041

ccattgtggagcatacaagcc

. Ю61 .

247

рис. 5. нуклеотидная последовательность гена bloß Н. flagellatura и фланкирующих областей. а также первичная структура кодируемого белка. Последовательности, входящие в гипотетический промотор, подчеркнуты.

- 19 -

торая может служить' SD-последовательность».

При поиски анализа на ПЭВМ били найдены последователь-кости. максимально гомологичных боксам "-35" (TTGACA) и "-10" (ТАТААТ) канонического промотора Е. coll и разделенных 10 - 20 нуклеотидами. Гипотетический промотор может ею-зчать в себя область aTGaCA. отделенную 17 нуклеотидами от области сАзААТ или 20-ю - от области аАТААв (см. рис. 5)

0. г. 2. Поиск регуляторной области

В работе была определена нуклеотидная последовательность операторной области Е. coll. С. freimdll и .8. typnimurium. последовательность оператора у этих микроорганизмов практически идентична (с одной заменой). Последовательность обладает па-лиидроиной структурой и перекрывает полностью промотор Рв; даже единичные замены иуклеотидов в некоторых позициях ведут к полной потере как регуляторной. • так и промоторной активности.

Исследуемая область ДНК и.ff 1 age 1 latum была проанализирована на ПЭВМ на. предмет поиска в данной пос-едовательности структур, проявляющих наибольшее сходство с консенсусной операторной последовательностью.

Максимально гомологичные последовательности имеют не более чем 16 обших нуклеотидов с консексусной последовательностью (из 40) и. кроме того, не имеют пзлиндромной структуры.

Таким образов, в секвенированной последовательности (221 нуклеотидз; 5'-концепой области перид ыоВ ны не обнаружили сайта связывания репгессора. который расположен перед этим геном в операторах описанных к настоящему времени биотиновых опгронов Enterobacterlaceae. Это хорошо согласуется с отсутс-. твием сродства репрессора Е. сои к клонированной последовательности.

9. сравнение организации гсоа биосинтеза биотина у к. fläge 1 latum. Е. coll и В. 3Phaer'cus Обнаружены существенные различия в организации генов биосинтеза биотина у этих бактерий (рис. б).

- го -

Рис. б Взаимное расположение известных генов биосинтеза

биоткна м. f läge 11 atura, Е. coll и В. sphaerlcus

t

"*Л В F С 5 ____iL.. Е. С011

_- 49Г-:-

"§"f ТГТТ Т _■ н. flasellatum

_-и*—-

VXTTf ТТУТ" В. SPhaericu3

Гены биосинтеза биотина Е. сон организованы в классический оперон. где транскрипция идет с двух разнонаправленных промоторов, перекрывавшихся с одним оператором. Исключение составляет ген Мои. отстоящий пЬчти на 50 мин. хромосомной карты от этого оперона; Функции и способ регуляции этого гена пока неизвестны. : ■ •. • .

Гены биосинтеза биотипа в. зрьаепсиз . организованы в два близкорасположенных кластера, в отличие от Е.'со! 1. ген МоА не снепл^н с генами ьюо и МоВ. Есть данные, свидетельствующие в пользу /опаронной организации./ этих кластеров.

Большинство генов биосинтеза биотина н. ПавеПашп также организованы в кластер, состоящий из 5 генов, на расстоянии 10 кин. хромосомной карты от от которого находится ген ЫоА. в отличие от Е. со11. ген МОИ находится в кластере генов Ыов -Моб. возможно, атот ¿«ластер генов также представляет,- кобоя оперон. 1

выводи •

1. получена представительная коллекция Bio- мутантов облигат-ного метилотрофа Н. flasellatum; мутанты охарактеризованы и разделены на б групп,;. 5 из которых идентифицированы. Анализ мутантов позволил установить основные .этапы , метаболического пути биосинтеза биоткна М. flasellatum.

2. Все идентифицированные мутации локализованы на хромосомной карт<> н. flasellatum.

3. клонированы и Физически охарактеризованы б генов биосинтеза биотина и. flaeellatum. клонированные гены ыоа. MoB. bioF. ЫоН и bioD н. flagellatum кодируют белки, способные функционально замешать соответствующие активности в мутантах Е. coll вю-. ген blol не имеет аналога в Е. con

4. полностью определена • нуклеотидная последовательность гена ьюв и частично - генов bioD. bioF. ЫоН ыоа и blol. структурная организация белка' вюв аналогична организации соответствующих белков других бактерий, а его аминокислотная последовательность проявляет значительную гонологию (64И для Е. coll) с этими белками.

5. экспрессия генов биосинтеза биотина Н. flaeeilatum не регулируется в Е. coll; 5'-лидерная область черед структурной частью ЫоВ не содержит последовательности, гомологичной консенсусиой последовательности оператора биотинового опероиа Enterobacterlaceae. ' •

6. .Установлен порядок расположения генов биосинтеза биотина и проведено его сравнение с организацией соответствующих генов

Е. coll и В. sphaericus.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЯ

1. у. D. TsyeanKov. s. н. KazaKova. I. G. SerebrusKi. Genetic mapping of the obligate methylotropli liethYlobaci l lus f lasel latum: characteristics of prime plasmid^ and mapping of the chromosome in time-of-entry unit3. J. Bacterlol. 1990. 172:

2747-2754

2. Y. D. 'J syganhov, н. V. GomelsKy. G. N. HarchenKo. I. G. SerebrusKi. . Genetics of methylotrophs. In: Proceedings 6th International

Symposium on Genetics of Industrial Hlcrooreanisms. Strasbourg, 1990, pp. 645-656

3. SerebrusKi I.G.. TsyeanKov ' Yu. D. Genetic study of blotln biosynthesis in Methviobaclllus flaeeilatum

In: Proceedings 6th international symposium on Genetics of Industrial Microorganisms. Strasbourg. 1990, p. 835

зпкг. u».ta