Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование амилаз гибридного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae У-717 с целью интенсификации производства этанола

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование амилаз гибридного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae У-717 с целью интенсификации производства этанола"

г "о од

2 и НОГ* 'ЛР7

■

На правах рукописи

Гунысина Наталия Ивановна

ИССЛЕДОВАНИЕ АМИЛАЗ ГИБРИДНОГО ШТАММА ДРОЖЖЕЙ БассИаготусез сеге\^1ае У-717С ЦЕЛЫО ИНТЕНСИФИКАЦИИ ПРОИЗВОДСТВА ЭТАНОЛА

Специальность 03.00.23. - Биотехнология

. АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Воронеж - 1997

Работа выполнена на кафедре технологии бродильных производств и виноделия Воронежской технологической государственной академии

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: канди :ат технических наук,

профс ссор Е.Д. Фараджева

V

HAУЧÍ^ЫЙ КОНСУЛЬТАНТ; кандидат технических наук,

доцент О.С. Корнеева

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор технических наук,

профессор кафедры процессов ферментации и промышленного биокатализа .' МГУПП, академик МАЭН

М.В. Гернет

Кандидат биологических наук, доцент кафедры технической микробиологии и биохимии ВГТА Г.П. Шуваева

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ТОО фирма «Кристалл»

Защита состоится « 1997 года в // часов на засе-

дании диссертационного Совета К 063.90.01 при Воронежской государственной технологической академии по адресу: 394017, г.Воронеж, проспект Революции, 19

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГТА

Автореферат разослан « 1997 года

Ученый секретарь диссертационного Совета

д.т.н., профессор В С' Грнгоров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы, Диссертация посвящена исследованию амила! гибридного штамма дрожжей З.сегеу18те У-717 с целью интенсификации производства этанола, разработке метода получения ферментного препарата глю-коамилазы, обладающего высокой рН и термостабильностыо, а так же исследованию новых сортов зерна тритикале, в целях использования его в качестве крахмалсодержащего сырья в спиртовом производстве, что в совокупности позволяет сократить, расход ферментных препаратов, вести процесс брожения при повышенных температурах и дает возможность получить более высокий выход продукта хорошего качества.

Работа является составной частью научных исследовании кафедры технологии бродильных производств и виноделия, входящей в координационный план РАН.

Цель и задачи исследования, Целью настоящей работы было исследование амилаз гибридного штамма дрожжей БассИаготусез сегеуиаае У-717 для интенсификации производства этанола. В соответствии с этим были определены следующие задачи:

-исследовать процесс биосинтеза глюкоамилазы дрожжами Я.сегеу^ае У-717, изучить влияние различных факторов на биосинтез;

-найти рациональные условия биосинтеза глюкоамилазы, изучить динамику биосинтеза в процессе спиртового брожения;

-разработать метод выделения препарата и очистки дрожжевой глюкоамилазы;

-изучить некоторые физико-химические свойства фермента; -исследовать возможность применения зерна тритикале в спиртовом производстве;

-разработать оптимальные режимы водно-тепловой и ферментативной обработки тритикале;

-изучить физиологические свойства дрожжей Б.сегеу^'ае У-717; -определить влияние дрожжей 8.сегеуЫае У-717 на процесс получения этанола и его качество.

Научная новизна диссертационной работы заключается в следующем: -подобраны рациональные условия и состав питательной среды для культивирования (источника глюкоамилазы) гибридного штамма дрс.жжей Б.сегеуЫае У-717;

- изучена роль глюкоамилазы Б.сегеу1з1ас У-717 в биосинтезе этанола; -разработан способ получения препарата глюкоамилазы и предложена схема очистки;

-исследован процесс термической и кислотной инактивации глюкоамилазы;

-идентифицированы функциональные группы каталитического пенцм глюкоамилазы;

-na основе экспериментальных данных проведена оптимизация водно-тепловой обработки нового вида зерна - тритикале;

-разработаны оптимальные режимы получения и сбраживания тритика-левого сусла дрожжами S.cerevisiae У-717;

-доказана целесообразность совместного использования гибридного штамма S.cerevisiae У-717 и тритикале.

Практическая ценность. Применение S.cerevisiae У-717 в спиртовом производстве позволяет вести разваривание в более мягких условиях, что ведет к сокращению теплозатрат; сократить расход осахаривающих ферментных препаратов за счет секреции глюкоамилазы. Данный штамм обладает возможностью сбраживать сусло в условиях повышенных температур, что позволяет сократить расход охлаждающей воды. Ои обладает Ьысокой бродильной энергией, это позволяет сократить продолжительность брожения.

Использование в качестве крахмалсодержащего сырья зерна тритикале позволяет получить жидкие подвижные замесы и сократить расход разжижающих ферментных препаратов за счет высокого содержания а-амилазы в зерне тритикале.

Совместное использование дрожжей S.cerevisiae У-717 и зерна тритикале позволяет повысить выход спирта и получить продукт хорошего качества.

Результаты проведенной работы подтверждены актом внедрения гибридного штамма дрожжей S.cerevisiae У-717 на Белебеевском спнрто-водочном комбинате. Ориентировочный годовой экономический эффект от внедрения S. cerevisiae У-717 на спиртзаводе производительностью 2000 дал/т условного крахмала составит около 107 млн. руб. (в ценах 1995 г.).

Высокое качество спирта подтверждено протоколом заседания дегустационной комиссии ПО «Воронежспиртагропром» водки «Золотая степь» разработанного на основе спирта-ректификата, выработанного из тритикале, сброженного дрожжами S. cerevisiae У-717 на ликеро-водочном заводе «Бу-турлиновский».

Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались в 15 сообщениях на внутривузовских, республиканских, международных конференциях и международных симпозиумах в гг. Воронеже, Могилеве, Ставрополе, Казани, Пущшю, Видное в период 1993-1997 годов.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 17 публикациях, в т. ч. одной заявки на патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 198 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы (177 источников) и приложений. Иллюстрационный материал включает 26 рисунков, 34 таблицы.

СОДЕРЖЛНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснованы актуальность темы и определены основные направления исследования.

В обзоре литературы дана характеристика амилолитических ферментов и их свойств. Приводятся данные об особенностях физико-химических свойств глюкоамилаз различного происхождения, специфичности и механизме их действия, выделении и очистки глюкоамилаз. Показана роль глгокоамилазы в технологии брожения. Дана характеристика штаммов дрожжей с амилолитиче-ской активностью и дрожжей спиртового производства, толерантных к стрессовым воздействиям среды, а так же технологическая оценка новых сортов тритикале. Показаны пути совершенствования гидролиза сырья в процессе получения этилового спирта.

В результате анализа литературы установлено, что данные по исследованию физико-химических свойств амилолитических ферментов дрожжей очень малочисленны. Что же касается исследования глюкоамилаз дрожжей S.cerevisiae, то таких данных практически нет.

Обоснованы цель и задачи исследовании.

В экспериментальной части представлены материалы исследований, обоснован выбор основных показателен и факторов, обобщены и обсуждены результаты экспериментальных данных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили чистая культура дрожжей Saccharo-myces cerevisiae У-717 полученная из ВНИИ пищевой биотехнологии (г.Москва) и новые сорта зерна тритикале полученные из НИИСХ ЦЧП им. В.В. Докучаева.

Культивирование дрожжей проводили глубинным методом в термостате при 34 - 36 °С и течение 48 часов.

При определении сбалансированного состава питательной среды для культивирования дрожжей S.cerevisiae У-717 использовали математический метод симплекс-решетчатого планирования (Зедгинидзе, 1976).

Глюкоамилазную активность определяли глюкозооксидазным методом.

Активность а-амилазы определяли методом ВНИИПБТ (Рухлядева,

1979).

Для выделения препарата фермента использовали ультрафильтрацию через мембраны УПМ, осаждение органическими растворителями и гель-фильтрацию (Детерман, 1971).

Электрофоретические исследования фермента проводили по методу Дэвнса (Devis, 1964). Белок определяли по методу Лоури (Louri, 1951).

Определение физико-химических и технологических показателей зерна, физиологических свойств дрожжей, анализ осахаренного сусла и зрелой браж-

кн, этилового спирга-ректификата проводили по методикам спиртового, дрожжевого и ликеро - водочного производства (Рухлядева, 1976; Слюсаренко, 1984; Фертман, Шойхет, 1975).

Опыты проводились в 3 - 4 кратном повторении, причем аналитические определения для каждой пробы осуществляли в 3 повторпостях. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизводимы в каждом опыте.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

■ ИССЛЕДОВАНИЕ БИОСИНТЕЗА ГЛЮКОАМИЛАЗЫ ДРОЖЖАМИ БассИагошусез сегеу|5ше У-717

Характеристика морфолого-физйологических свойств дрожжей. Гибридный штамм спиртовых дрожжей Б.сегеуЫае У-717 получен в результате гибридологического анализа. В качестве исходных были взяты термотолерантный штамм дрожжей Б.сегеуЫае ВПУ-408 и культура 3,сегеУ151ас У-792. Гибрид способен к усвоению крахмала в качестве единственного источника углерода благодаря секреции глюкоамилазы. Максимальное накопление глюкоамилазы наблюдали к 48 часам глубинного культивирования на среде содержащей 2 % растворимого крахмала, 1% дрожжевого автолизата и 0.3 % (№Ц)г?>0,| при температуре 35 °С.

Влияние различных источников питания на биосинтез глюкоамилазы. В качестве источников углерода были испытаны: крахмал, декстрины, мальтоза, сахароза, лактоза, рафиноза, глюкоза, галактоза, фруктоза, ксилоза, арабшюза, маннит, сорбит, дульцит. Синтез глюкоамилазы осуществляется только на крахмале, декстринах, мальтозе и рафинозе, то есть углеводах имеющих а-1,4 и а-1,6-глюкозидные связи. Причем максимальное накопление глюкоамилазы наблюдалось на среде с крахмалом. Из вышеизложенного можно сделать вывод, что глюкоамилаза, продуцируемая дрожжами является индуцибельным ферментом.

В качестве источников азота были испытаны минеральные соли: (ИНд^О.,, (МН.,)зР04, (Ш4)2НР04, Ш4Н2Р04, N11,01, МаШз, К1\'03 и органические соединения: мочевина, пептон, кукурузный экстракт и дрожжевой ав-толизат. Более интенсивное действие на биосинтез глюкоамилазы оказывали источники органического азота, в частности кукурузный экстракт. Из неорганического азога наибольшее влияние оказывают восстановленные формы -аммонийные соли, а именно (КН4)21П,04. Окисленные формы азота - ЫаИОз и К1ЧОз дрожжами не усваивались.

В биосинтезе ферментов важную роль играют внешние условия. Биосинтез глюкоамилазы протекает в интервале температур 25-40 °С, достигаег максимума при температуре 35 °С. Это позволяет заключить, что данный продуцент относится к термотолерантным микроорганизмам. Оптимальная начальная величина рН 4,5-5. Количество посевного материала 1,5 % к объему питательной среды является наиболее оптимальным.

Оптимизацпя питательной среды с помощью математического метола планирования. В качестве основных факторов, влияющих на рост дрожжей S.cerevisiae У-717, были выбраны: Xi - концентрация растворимого крахмала, %; Х2 - концентрация диаммоний фосфата, %; Хз - концентрация кукурузного экстракта, %. Критерием оценки влияния различных факторов на процесс биосинтеза глюкоамилазы служила ее активность (У, ед/см3). Для исследования применяли метод симплекс-решетчатого планирования. В результате обработки данных получено уравнение регрессии, адекватно описывающее процесс биосинтеза глюкоамилазы:

У=0,258+0,01 ЗХ,+0.001 Х2-+0.008Х3-0,001 Х1Х2-0,002Х2Х3-0,024Х12--0.006X22-0,007X32.

При наложении оптимальных составов питательных сред для биосинтеза глюкоамилазы рациональной средой является, %: растворимый крахмал -2; диаммоний фосфат - 0.5; кукурузный экстракт - 0.8. При таких значениях параметров активность глюкоамилазы составляет 0.26 ед/см3.

Исследование биосинтеза глюкоамилазы S.cerevisiae У-717-в процессе спиртового брожения. При сбраживании тритикалевого сусла повышается титруемая кислотность, идет снижение рН. Наиболее интенсивное накопление этанола и сбраживание углеводов наблюдается в первые 24 часа брожения и завершается к 58 - 60 -ти часам брожения. Наблюдалось так же интенсивное сбраживание нерастворенного крахмала.

Из табл.1 видно, что дрожжи S.cerevisiae У-717 осуществляют биосинтез глюкоамилазы в процессе спиртового брожения. Максимальное накопление глюкоамилазы наблюдалось к 48 часам брожения, с увеличением активности глюкоамилазы в среде идет быстрое сбраживание растворимых углеводов и превращение крахмала в сбраживаемые углеводы и вовлечение последних в процесс спиртового брожения.

Таблица 1

Динамика биосинтеза глюкоамилазы Saccharomyces cerevisiae

Титруемая Массовая

кислотность, доля Массовая

Продолжи- см3 р-ра Активность сбражи- доля не-

тельность рн NaOH глюкоами- ваемых раство-

брожения конц.0.1 моль/дм3 на 20 см3 бражки лазы, ед/см3 растворимых углеводов,0/» ренного, крахмала,0/»

0 5.5 2.0 0.0 11.220 0.365

24 5.2 3.2 1.4 1.500 0.073

48 5.0 3.4 4.9 0.486 0.019

72 4.8 3.6 4.5 0.292 0.012

Это ведет к большему накопленшо этанола и повышению выхода спир-

та на 0.15 см3/100г условного крахмала по сравнению с дрожжами З.сегеуЫас У-717.

ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ БассЬагошусеэ сегеу1зше У-717 Выделение и очистка глюкоамилазы. Препарат глюкоамилазы получали из культуральной жидкости Э.сегеуЫае У-717 методом осаждения органическими растворителями (этанолом, ацетоном, изопропанолом), предварительно избавляясь от трансглюкозилазы и концентрируя культуральную жидкость методом ультрафнльтрации через мембраны УПМ-50. Наиболее полное осаждение глюкоамилазы наблюдалось при рН 5.0. Очевидно, к этому значению рН близка изоэлектрическая точка глюкоамилазы. Лучшим осаднтелем для глюкоамилазы является ацетон в концентрации 66,7 %.

Данные по очистке глюкоамилазы представлены в табл.2.

Таблица 2

Очистка глюкоамилазы Б.сегеуЫае У-717

Стадии очистки Объем, см3 Общая акт-ть, ГлА, ед Общий белок, мг Уд. акт-ть, ед/мг белка Выход преп-та по акт-ти, % Степень очистки

Исходная куль-

туральная жид- '4000 968.00 649.16 1.49 100.00 1.00

кость

Освобождение

от трансглюко- 4000 936.00 465.25 2.01 96.69 1.35

зилаз

Ультрафильтра- 400 846.00 342.23 2.47 87.40 1.66

ция на УПМ-50

Осаждение аце- 1520 450.45 36.60 12.31 46.53 8.26

тоном (66.7 %) (мг)

Гель-

фильтрация на 20 104.58 3.15 33.20 14.42 22.28

сефадексе

й-50

Получен очищенный ферментный препарат глюкоамилазы с удельной активностью 33 ед/мг белка и степенью очистки 22 %.

Некоторые физико-химические свойства глюкоамилазы.

Исследованием влияния температуры и рН на каталитическую активность фермента установлены оптимальные параметры действия глюкоамилазы: температура 40 "С, рН - 4.7.

Опыты по кислотной инактивации глюкоамилазы показали наибольшую стабильность фермента в интервале рН 4.0 - 5.0. Через 72 ч инкубации при температуре 30 "С фермент сохранял активность при рН 4.0 на 97.02 %, при рН 4.5 - 98.02 %, при рН 5.0 - 97.79 %.

Термическая инактивация глюкоамилазы исследовалась в интервале температур 30 - 60 "С. Фермент проявлял достаточно высокую термостабильность в интервале температур 30 - 50 °С. Сопоставление полученных данных с данными по кислотной и термической инактивации глюкоамилаз различного происхождения позволило прийти к выводу, что глюкоамилаза 5.сеге\'1зте У-717 обладает высокой рН-термостабильностыо.

Таблица 3

Динамика термической инактивации глюкоамилазы 8.сегеу1зте У-717

при рН 4.5

Время инкубации,ч Активность глюкоамилазы в % от максимальной при температуре, °С

30 40 50 60

2 72 99.94 98.02 99.73 90.80 98.03 48.72 46-.18

Процесс кислотной и термической инактивации глюкоамилазы является типичной реакцией первого порядка. Константа скорости инактивации (К) рассчитывается по уравнению:

„ 2.303 £„ К = -Х1£-

. -I.

Е0 - исходная активность;

г . ' Е

где К - константа скорости инактивации, ч' Е - активность в момент времени т.

В табл.4, приведены данные кинетики инактивации глюкоамилазы 5.сегеу1з1ае У-717.

Таблица 4

Влияние температуры и рН на константу скорости

Температура, С КхЮ3,* при рН

3.0 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0

30 0.88 0.42 0.29 0.32 0.53 1.22

40 8.55 2.58 1.33 1.80 4.28 12.68

50 88.51 24.43 9.95 14.06 39.17 150.66

60 2208.00 748.17 386.37 493.17 963.73 2937.65

Из табл.4 видно, что температура и рН являются тесно взаимосвязанными факторами интенсивности процесса инактивации. Поскольку инактивация была необратимой, определить ее истинные термодинамические параметры энтальпию АН, свободную энергию Дв, энтропию А8 - невозможно. Одна-

ко, воспользовавшись теорией переходного комплекса, мы определили важнейшие параметры этого комплекса АН', АС и ДБ* (табл.5)

Таблица 5

Термодинамическая характеристика активированного комплекса про-

цесса кинетики инактивации глюкоамшазы Б.сегеушае У-717

Температура, °С рН Еакт АН* АР' АЗ*, ДжхК''хмоль"'

кДжхмоль'1

30-50 ' 3.0 188.99 186.39 89.20 320.10

50-60 3.0 268.53 265.80 80.24 565.73

30-50 4.0 152.39 149.79 92.33 183.58

50-60 4.0 285.29 282.56 83.21 607.77

30-50 4.5 125.88 123.28 94.04 93.35

50-60 4.5 304.02 301.29 85.03 659.33

30-50 5.0 136.20 133.60 93.26 128.88

50-60 5.0 295.06 292.33 84.36 634.05

30-50 6.0 199.05 196.45 88.18 345.91

50-60 6.0 248.07 245.34 79.43 505.82

Как видно из табл.5, инактивация глюкоамилазы носит сложный характер. По-видимому, это связано с тем, что в формировании белковой глобулы фермента принимают участие два типа взаимодействий: гидрофобные и различные виды электростатических связей. В зоне рН 3.0 - 6.0 и сравнительно невысоких температурах (30 - 50 °С) происходит разрушение слабых электростатических, по всей видимости, водородных связей, которые играют незначительную роль в формировании белковой глобулы, и, таким образом, приводят к меньшей потере каталитической активности. Об этом свидетельствуют небольшие значения изменения энтропии Д8*. При температурах выше 50 °С ДБ* резко возрастает, это дает возможность предположить, что в формировании белковой глобулы фермента важный вклад вносят гидрофобные взаимодействия.

Защитное действие субстрата было исследовано в интервале 30-60 °С, при рН 4,0-6,0 . Крахмал оказывает высокое защитное действие против термической инактивации глюкоамилазы. Инактивация фермента в 2 % -ном растворе крахмала меньше по сравнению с раствором глюкоамилазы не содержащей крахмал, при чем, при повышении концентрации крахмала эффект защиты возрастает. По мере приближения рН к значению, оптимальному для действия фермента защитное дф1ствие субстрата так же возрастает. Можно предположить, что снижение константы скорости инактивации в растворе крахмала свя-

защитным действием субстрата на каталитический центр фермента.

Идентификация функциональных групп активного центра глюкоамнла-зы 8,сегеу15!ае У-717. Идентификация функциональных групп ферментов, принимающих участие в акте катализа, играет важную роль в расшифровке механизма катализа - одной из главных задач современной энзимологии. Важным критерием идентификации этих групп являются константа ионизации (рК) и теплота ионизации (АН*).

100 А,% 80

60

40

20

1 У 1 // 1 //

1 //

1 //\

1 / 1 ГУ / 1 /У1 I р 1 1 1 I

' 1 ; 1 11 1 1 1 1

Величину рК определяли, используя кинетическую зависимость активности фермента от рН при температурах 5 и 50 °С (рис.1). Профиль кривых активность - рН свидетельствует об участии в элементарном акте разрыва а-1,4-глюкозидной связи в молекуле' крахмала двух функциональных групп.

При скорости расщепления субстрата ферментом, равной половине скорости в оптимуме рН, константа ионизации каталитически активной группы фермента численно равна концентрации водородных ионов среды (Жеребцов Н. А. , 1984). Исходя из этого, были определены рК| и рК2 для глюкоамилазы (рис.1); они оказались равными 2.5 и 6,3 при 5 °С и 2,8 и 5,8 при 50 °С, что соответствует рК карбоксильной группы, вероятно аспарагиновой или глутамииовой кислоты и рК нмидазольной группы гисти-дина (Диксон, Уэбб , 1982). Это дает основание считать, что здесь мы имеем дело только с ионизацией каталитически активных групп - карбоксильной и нмидазольной.

Наличие в активном центре глюкоамилазы карбоксильной и нмидазольной групп подтверждают найденные нами величины теплот ионизации этих групп. Рассчитанные по уравнению Вант-Гоффа теплоты ионизации функциональных групп оказались равными для «кислой» ветви кривой 11,46 кДжхмоль"' и для «щелочной» - 19.11 кДжхмоль'.что соответствует теплотам ионизации также карбоксильной и нмидазольной групп.

Типичной реакцией на нмидазольную группу гистидина является ее фотоокисление. Фотоокисленне осуществляли при разных значениях рН в присутствии метилеиового синего, играющего роль фотосенсибилизатора.

Фотоокисление приводит к разрыву гетероцикла ядра гистидина и к инактивации фермента. Результаты опытов покачали, что глюкоамилаза пол-

о 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 рН

Рис.1. Зависимость активности глюкоамилазы от рН при температуре, °С: 1-5; 2-50; А-активность глюкоамилазы, % от максимального.

вергалась интенсивной фотоинактивации, которая также описывается уравнением реакции первого порядка.

' г~ Г • Фотоокисление глю-

коамилазы' в интервале р! I 3,0-6,0 и температуре 20°С показано на рис.2 с уменьшением концентрации Н+-ионов в среде скорость фотоинактивации возрастает. Как видно на рис.2, точка пересечения прямых на кривой (рН) находится при рН 5,3 , соответствую-б.о "Де'| рК имидазольной группе гнстидина.

Итак, кинетические кривые активность-рН, величины рК, инактивация фермента фотоокислением в присутствии метиленового синего, величины теп-лот ионизации достаточно убедительно свидетельствуют о том, что в каталитический центр глюкоамилазы Б.сегеу'шае У-717 входят карбоксильная и имидазольная группы.

ПРИМЕНЕНИЕ ДРОЖЖЕЙ БассИаготусез сегеушае У-717 И НОВЫХ НЕТРАДИЦИОННЫХ ВИДОВ СЫРЬЯ С ЦЕЛЬЮ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ПРОИЗВОДСТВА ЭТАНОЛА

3.5

5.0

4.0 „45 р.И ■

Рис.2. Зависимость константы инактивации глюкоамилазы от оН пои (Ьотоокислении.

Целью дальнейших исследований явилась разработка технологий способствующих максимально полной утилизации углеводов сырья, увеличению выхода спирта и улучшению его качества. Для достижения этой цели были предприняты попытки совершенствования процесса по всей технологической цепочке, начиная с подготовки сырья к сбраживанию и заканчивая анализом готового продукта - этилового спирта.

В качестве источника сырья была выбрана новая зерновая культура -тритикале, гибрид пшеницы и ржи. Были исследованы ее физико-химические и технологические показатели и показана перспективность применения в спиртовой промышленности. Тритикале имеет большие преимущества перед другими зерновыми культурами по урожайности, питательной ценности, устойчивости при возделывании к неблагоприятным природно-климатическим условном и наиболее опасным болезням. Оно превосходит пшеницу и рожь по цело-■•■.V ряду показателей. Новые сорта тритикале имеют крупное, тяжелое, вырав--•..ц.ч- черно. Содержание крахмала в тритикале в зависимости от сорта на 2-5 V и.:не. чем в пшенице и на 10-12 % больше чем во ржи. Зерно тритикале

обладает значительной активностью амилолитических ферментов, что определяет его способность к самодекстринированию.

Разработка оптимальных условий водно-тепловой обработки. Использовали тонкий помол зерна тритикале. Было исследовано влияние гидромодуля на состав осахаренного сусла и установлено, что при гидромодуле 3,5 сусло получается с оптимальным углеводным составом. Сравнивая вязкость замесов из различных видов зерна, мы установили, что для тритикале она в 2-5 раз ниже чем для пшеницы и а 5 -10 раз ниже чем для ржи, что можно объяснить наличием п зерне тритикале активной а-амилазы и способности его к самодекстринированию. Оптимальной температурой подваривания является 63-65 °С, позволяющая использовать саморазжижение замеса; продолжительность 8-10 мин.

Разваривание проводили при разных режимах, характеризующихся различной температурой и продолжительностью: 1 - 125-128 °С, 70 мин.; 2 - 125128 "С, 90 мин.; 3 - 132-135 °С, 40 мин.; 4 - 132-135 °С, 60 мин. Оптимальным является третий режим. Сусло содержит наибольшее количество сбраживаемых углеродов - 11.256%, минимум нерастворенного крахмала - 0.217%, имеет максимальную доброкачественность - 75 %,

Оптимизация процесса ферментативной обработки. Для получения высокого выхода спирта необходимо определить оптимальную дозировку ферментных препаратов для водно-тепловой обработки и полного осахаривания. крахмала тритикале.

Дозировки амилосубтилина варьировали из расчета 0,5-1,5 ед АС и глюкаваморина 5,0-8,0 ед ГлА на 1г крахмала. Осахарнвание проводили при температуре 58-59 °С в течение 40 мин. Использование тритикале, обладающего способностью к самодекстринированию позволило сократить расход разжижающих ферментных препаратов до 1,0 ед АС/г крахмала, при этом не наблюдалось повышение вязкости замесов и разваренной массы, а выход спирта был выше, чем изо ржи и пшеницы, переработанных по регламентному режиму, то есть без сокращения расхода амилосубтилина. Минимально необходимую дозировку глюкаваморина приняли 6,0 ед ГлА/г крахмала.

В целях дальнейшей оптимизации ферментативной обработки исследовали четыре режима разового и дробного внесения ферментных препаратов. Все предложенные режимы осахаривания обеспечивают получение сусла с высоким содержанием растворимых углеводов. Однако, наибольший выход спирта обеспечивает 4-й режим - 30 % амилосубтилина использовали при под-варивании замеса, 70 % при осахаривании, 80 % глюкаваморина при осахари-вании при 58-59 °С и 20 % в начале брожения сусла. Выход спирта составил 66,58 дал/т условного крахмала, что на 0.6 дал/т выше, чем при разовом внесении ферментных препаратов.

Физиологические свойства дрожжей. Б.сегеу^ае У-717 были исследованы в сравнении с расой XII при температурах 30-35 "С. Наиболее интенсивно сбраживающими являются дрожжи У-717, они же обладают более высокой

скоростью роста и уровнем почкования, содержанием гликогена и низким процентом мертвых клеток.

Результаты наших исследований указывают на превосходство 8.сеге\чз1ае У-717 перед расой XII по физиологическим показателям н подтверждают, что оптимальной для них является температура 35-36 °С, что позволяет причислить их к термотолерантным микроорганизмам.

Влияние дрожжей 5.сегеу!з1ае У-717 на процесс получения этанола. Шгамм обладает способностью индуцировать фермент глюкоамилазу в сбраживаемую среду, а, следовательно, наиболее полно осуществлять гидролиз конечных декстринов и крахмала, нерастворепного в процессе водно-тепловой обработки сырья.

В связи с этим представлялось возможным проводить водно-тепловую подготовку в более мягких условиях - подваривание при температуре 63 - 65 °С 18-20 мин, разваривание - при 105-110 °С 20 мин. Режим является оптимальным и характеризуется повышением выхода спирта на 0.06 дал/т условного крахмала, за счет снижения потерь Сахаров, неизбежных при более жестком и продолжительном режиме. Данный режим позволяет сократить расход пара, идущего на разваривание сырья.

Была исследована возможность сокращения расхода ферментных препаратов. На основе проведенных экспериментов было установлено, что возможно снижение расхода амилосубтилина на 10 % и глюкаваморина на 10 % без ухудшения качественных показателей бражки и выхода спирта (66.68 дал/т условного крахмала).

Уменьшение количества ферменных препаратов на 20 % компенсируется глюкоамнлазой, нарабатываемой дрожжами непосредственно в бродильном цикле.

Оптимальной является дозировка дрожжей 2.0 г на 100 г сырья.

Сбраживание сусла дрожжами Б.сегеуЫае У-717 проходит более интенсивно и полно, в то время как 3.сегеУ1Б1ае XII сбраживают сусло медленнее, что отражается на выходе спирта.

Таблица 6

Сравнительная характеристика основных показателей зрелой

бражки при использовании различных дрожжей

Показатели БассЬагошусез сегеушае

У-717 XII

1 2 3

Массовая доля углеводов, %:

общих 0.230 0.316

растворимых 0.216 0.253

! ч ч овая доля нерастворепного крахмала, % 0.013 0.057

/0, Активная кислотность, рН 4.75 4.80

Окончание табл. 6

1 2 3

Титруемая кислотность, см3 р-ра К'аОН конц. 0.1моль/дм3 на 20 см бражки Объемная доля спирта, % Выход спирта, дал/т условного крахмала Продолжительность брожения, ч 3.3 8.36 66.68 58 3.2 8.03 66.53 70

В табл.6 представлены результаты сравнения основных техно-химических показателей З.сегеу^ае У-717 и расы XII, при этом расход ферментных препаратов для У-717 снижен на 20 %. При применении 5.сегеу1з1ае У-717 выход спирта увеличивался на 0.15 дал/т условного крахмала.

Влияние 5.сегеу!з1ае У-717 на качество готового продукта. Был проведен анализ спирта-ректификата по соответствию его показателей ГОСТу по сравнению со спиртом, полученным из бражки сброженной дрожжами расы XII (табл.7).

Таблица 7

Сравнительная характеристика этилового спирта-ректификата, полу-

ченного сбраживанием сусла различными дрожжами

Гост 5962 на Спирт с использованием

Показатели спирт выс- S.cerevisiae

шей очистки У-717 XII

Объемная доля спирта, % 96,2 96.3 96.3

Проба на чистоту выдерживает выдерживает выдерживает

Окисляемость, мин 15 23 21

Содержание, мг/дм3 безвод-

ного спирта:

альдегидов 4 3 3

сивушного масла 4 2 3

кислот 15.00 6.20 9.23

эфиров 30.00 9.05 18.10

метанола 0.030 0.017 0.028

фурфурола отсутствует отсутствует отсутствует

Прозрачность прозрачный прозрачный прозрачный

Цвет бесцветный бесцветный бесцветный

Данные табл. 7 подтверждают высокое качество этанола по всем показателям, лучшим по сравнению с этанолом полученным из бражки сброженной 5.ссгеу1з1ае XII.

Таким образом, гибридный штамм З.сегеу151ае У-717 благоприятно влияет на качество этилового спирта и результаты брожения в целом, что подтверждается результатами производственных испытании па Белсбеепском спирто-водочном комбинате и дегустационной оценкой водки «Золотая степь», получившей среднюю бальную оценку 9.6. Образец водки был разработан на

основе спнрга-ректнфикага выработанного из тритикале, сброженного дрожжами S.cerevisiae У-717.

Годовой экономический эффект при внедрении данного штамма дрожжей на заводе производительностью 2000 дал спирта в сутки составил около 107 млн. рублей в ценах 1995 г.

ВЫВОДЫ

1.Гибридный штамм дрожжей S.cerevisiae У-717 обладает способностью к биосинтезу глюкоамилазы, максимальное накопление которой наблюдается к 48 часам культивирования.

2.Установлено, что оптимальной температурой для биосинтеза глюкоамилазы является 34-36 "С. Это позволяет отнести данный штамм дрожжей к термотолерантным микроорганизмам. Исходная величина рН среды 4.5 - 5.0.

3.С помощью математического планирования эксперимента получена рациональная питательная среда следующего состава, %: растворимый крахмал - 2.0; дпаммоний фосфат - 0.5; кукурузный экстракт - 0.8.

4.Этот штамм развивает интенсивное спиртовое брожение с максимальным накоплением этанола. Установлено, что между биосинтезом глюкоамилазы и накоплением этанола наблюдается прямая зависимость. Это позволяет получить высокий выход спирта.

5.В процессе спиртового брожения максимальное накопление глюкоамилазы S.cerevisiae У-717 в бражке наблюдается к 48 часам брожения. По истечении указанного времени активность глюкоамилазы снижается за счет частичной инактивации. Биосинтез глюкоамилазы носит индуцнбельный характер.

6.Впервые получен высокоочищеннын препарат глюкоамилазы S.cerevisiae У-717 с удельной активностью 33.2 ед/мг белка и степенью очистки 22. Максимальная активность глюкоамилазы наблюдается при рН 4.7 и температуре 40 °С.

7.Исследован процесс кислотной и термической инактивации глюкоамилазы. Установлено, что глюкоамилаза обладает термостабильностью в кислой зоне рН (4.0 - 5.0). Инактивация фермента описывается реакцией первого порядка. Расчет термодинамических параметров этого процесса позволяет сделать вывод о том, что в формировании белковой глобулы фермента важную роль играют гидрофобные взаимодействия.

8.Идентификация функциональных групп активного центра глюкоамилазы по кривым активность - рН, величинам теплот ионизации, фотоокислению в присутствии фотосенсибилизатора (метиленового синего) свидетельствует о вероятном присутствии карбоксильной и имидазольной групп в активном центре фермента.

9.Показана целесообразность использования зерна тритикале в качестве крахмалсодержащего сырья в спиртовом производстве. Разработаны опти-

мальные рс:кимы подно-тепловой и ферментативной обработки тритикале. Получено положительное решение по заявке на патент РФ.

10.Гибридный штамм дрожжей S.cerevisiae У-717 превосходит расу XII по основным физиологическим показателям. Применение этого штамма дао г возможность сокращения расхода ферментных препаратов на 20 %, позволяет интенсифицировать процесс спиртового брожения, что ведет к сокращению его продолжительности н увеличению выхода этанола высокого качества.

11.Ориентировочный годовой экономический эффект от применения S.cerevisiae У-717 в спиртовом производстве, по данным полученным в результате производственных испытаний на Белебеевском спирто-водочиом комбинате, составил около 107 млн. рублей в ценах 1995 года. Качество спирта подтверждается дегустационной оценкой водки «Золотая степь».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Громковская Л.К., Гунькина H.H., Копылова В.В. Сравнительная оценка вязкости зерновых подваренных замесов / Тез. докл. и сообщений XXXII научной внутривузовской конференции, май 1993 г. - Воронеж. - 1993, с. 72.

2. Фараджева Е.Д., Гунькина H.H., Усачева Е.В. Оптимизация осахариви-ния тритикалевого сусла ферментными препаратами /Тез.докл. ХХХШ отчетной научной конференции за 1993 г./ Воронеж.технол. институт. Воронеж, 1994.-c.154.

3. Фараджепа Е.Д., Гунькина Н.И. Использование термо толерантных дрожжей ■ для получения спирта из зерна тритикале ! Тез.докл.ХХХ1Уотчетной научной конференции за 1994 г. / Воронеж.гос.технол.акад.-Воронеж, 1994,-c.l 54.

4. Фараджева Е.Д., Куршева Н.Г., Горбунов В.Н., Гунькина Н.И. Оптимизация ripoi тсов переработки новых" сортов тритикале па спирт -Вестник Российской Академии сельскохозяйственных наук.-1995.-№3.-с.68-69.

5. Гунькина Н.И. Получение спирта с использованием термотолерантных дрожжей в условиях Белебеевского спирто-водочного комбината / Тез.докл. научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов / Воронеж.гос.технол.акад.-Воронеж, 1995.-с.111 - 113.

6. Фараджева Е.Д., Гунькина Н.И. Применение новых сортов тршлк.'ие в производстве спирта / Новые нетрадиционные растения и перспективы их практического использования: Тез.докл.первого медждупзродного симпозиума, август 1995 г. - Пущино, - 1995. -с.714 - 715.

7. Фараджева Е.Д., Гунькина Н.И. Оптимизация осахаривания тритикалевого сусла при дробном внесении ферментных препаратов / Экология человека: пищевые технологии и продукты: Тез.докл. IV Международный симпозиум, октябрь 1995. - Видное, - 1995. - с.89 - 90.

8. Фараджева Е.Д., Саввин С.Н,, Гуиькина Н.И. Оптимизация процесса осахаривания новых сортов тритикале в спиртовом производстве. -Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 1996. №2. - с.27 -28.

9. Гуиькина Н.И. Исследование режима водно-тепловой обработки зерна тритикале /Молодежь и проблемы информационного и экологического мониторинга: Тез.докл.Российского молодежного научного симпозиума, март 1996 г. - Воронеж, 1996. - с.86 - 87,

10. Фараджева Е.Д., Гунькина Н.И. Новые технологии обработки зерна тритикале в спиртовом производстве / Пищевая проышленность - 2000: Тез.докл.Межрегиональной научно-практической конференции, июнь 1996 г.-Казань, -с. 54-55.

11. Фараджева Е.Д., Гунькина Н.И. Влияние новой расы дрожжей на качество спирта / Современные достижения биотехнологии: Тез. докл. Всероссийской конференции, июль 1996 г. - Ставрополь, 1996. - с.230.

12. Фараджева Е.Д., Корнеева О.С., Гунькина Н.И. Выделение и очистка амилаз гибридного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae У-717 / Физико-химические основы пищевых и химичесих производств: Тез. докл. Всероссийской научно-практической конференции, ноябрь 1996 г. - Воронеж, - 1996. - с.79.

13. Гунькина Н.И., Фараджева Е.Д. Интенсификация процесса брожения с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae У-717 в спиртовом производстве / Проблемы пищевой технологии и техники: Тез. докл. Международной научной конференции, апрель 1997 г. - Могилев, -1997.-с. 21 -22.

14. Фараджева Е.Д., Гунькина Н.И., Корнеева О.С. Влияние pH на стабильность глюкоамилазы Saccharomyces cerevisiae У-717 и эффективность осахаривания сусла в спиртовом производстве /Тез. докл. XXXV отчетной научной конференции за 1996 г. /Воронеж.гос. технол.акад. -Воронеж, 1997.-с.31.

15. Яковлев А.Н., Гунькина Н.И. Сбраживание топинамбура термотолерантной расой дрожжей У-717 / Тез.докл. XXXV отчетной научной конференции за 1996 г./ Воронеж, гос.технол.акад. — Воронеж, 1997. -с.44.

16. Фараджева Е.Д., Гунькина Н.И., Саввин С.И., Коростелев В.Л. Влияние различных источников углерода на биосинтез глюкоамилазы Saccharomyces cerevisiae У-717 / Научно - технический прогресс в бродильных производствах: Тез. докл. Международной научно - практической конференции, май 1997 г. - Воронеж, - 1997. - с. 9.

17. Фараджева Е.Д., Гунькина Н.И., Саввин С.И., Малкин B.Ä. Способ получения спирта из крахмалистого сырья. Положительное решение Российского агенства по патентам и товарным знакам по заявке на изобретение As 96100728 от 04.03.97.