Получение и изучение биологической активности конъюгатов эпидермального фактора роста с противоопухолевыми химиотерапевтическими препаратами

Гуманов, Сергей Георгиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и изучение биологической активности конъюгатов эпидермального фактора роста с противоопухолевыми химиотерапевтическими препаратами
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение и изучение биологической активности конъюгатов эпидермального фактора роста с противоопухолевыми химиотерапевтическими препаратами"

Г- Г Г» Г\ '! ,,

, [ у ! На правах рукописи

..... [:;:-•; £<Ю

Туманов Сергей Георгиевич

ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КОНЪЮГАТОВ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА С ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМИ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМИ ПРЕПАРАТАМИ

03. 00. 04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1999 г.

Работа выполнена в лаборатории биорегуляции клеточных процессов центра «Биоишкенерия» РАН.

Научные руководители:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, профессор Северин С.Е.

кандидат биологических наук Луценко C.B.

кандидат биологических наук Фельдман Н.Б.

доктор биологических наук, профессор Свешников П.Г. кандидат медицинских наук Хомяков Ю.Н.

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Л ж

2000 г. на заседании

Защита состоится Диссертационного совета Д. 171.02.01. при Центре медико-биологических и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем РАЕН.

Автореферат разослан < 1999 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук /7Т)

Отраднова В.В,

ь>121. Ы

О -

! Л 1 I с

Актуальность проблемы. Фундаментальной проблемой химиотерапии злокачественных опухолей является высокая общая токсичность противоопухолевых препаратов известных классов. Как правило, терапевтическая доза в этих случаях близка к максимально толерантной. Лечение сопровождается тяжелыми побочными эффектами. В связи с этим особую актуальность приобретает поиск путей повышения терапевтической эффективности химиолрепаратов за счет снижения токсичности и увеличения избирательности их действия. Эта задача может быть решена путем создания систем направленного транспорта противоопухолевых терапевтических препаратов к тканям с помощью векторных молекул.

Идея о возможности направленной доставки лекарственных веществ была высказана Паулем Эрлихом около 100 лет назад. Эта концепция приобрела новую актуальность применительно к химиотерапии злокачественных новообразований в связи с открытием и развитием технологии получения и использования моноклонапьных антител. Однако на пути применения моноклональных антител в качестве векторов для направленного транспорта химиотерапевтических препаратов к опухолям за 20 лет широкомасштабных исследований заметных успехов достигнуто не было. Это связано с низкой селективностью моноклональных антител в отношении опухолей, недостаточной эффективностью клеточной интернализации их конъюгатов с химиопрепаратами, а также нестабильностью, приводящей к освобождению препарата до момента достижения контакта с опухолевой клеткой. Кроме того, эффективность интернализации конъюгатов цитотоксических препаратов с моноклонапьными антителами достаточно низка.

Более предпочтительным представляется использование физиологических лигандов, рецепторы которых либо специфичны для быстропролиферирующих опухолевых клеток, либо высоко экспрессированы в них. Одним из белков, отвечающих этим требованиям, является эпидермальный фактор роста (ЭФР), рецепторы которого экспрессируются на клетках широкого спектра опухолей, в отличие от нормальных тканей, в большом количестве (до 3x106 у клеток эпидермоидной карциномы человека линии А431). Поскольку ЭФР характеризуется высоким сродством к своему рецептору, данный белок может быть использован для эффективной доставки различных

цитотоксических веществ в раковую клетку. Высокая стабильность и возможность получения препаративных количеств, наряду с доступностью в виде рекомбииантного белка также являются существенными достоинствами ЭФР.

Получение конъюгатов ЭФР с различными классами цитотоксических агентов, например, с фталоцианинами, антрациклиновыми антибиотиками, винкаалкалоидами и исследование их противоопухолевой активности позволяет провести сравнительный анализ эффективности действия конъюгатов и выбрать наилучшую систему направленной доставки. Флуоресцентные свойства анграциклиновых антибиотиков позволяют провести исследование накопления и внутриклеточного распределения этих препаратов, доставляемых в клетку в составе коныогата, что может позволить прояснить механизм их цитотоксического действия.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось получение конъюгатов фталоцианинов, винкаалкалоидов и антрациклинов с ЭФР, обладающих высокой цитотоксической и противоопухолевой активностью. В связи с большим значением антрациклиновых антибиотиков в химиотерапии злокачественных новообразований особое внимание уделялось исследованию возможности снижения резистентности опухолевых клеток к доксорубицину (Др) и карминомицину (Км) посредством их транспорта в клетки в виде конъюгатов с ЭФР. Параллельно решалась задача изучения закономерностей поступления и внутриклеточного распределения свободных антрациклинов и их конъюгатов с ЭФР в чувствительных и резистентных опухолевых клетках человека, с целью разъяснения механизма и возможностей повышения эффективности цитотоксического действия исследуемых химиопрепаратов.

Научная новизна н практическая ценность работы. Получены конъюгаты ЭФР с фталодианинами, винкаалкалоидами и антрациклинами, проявляющие более высокую цитотоксическую активность, чем свободные вещества. Использование конъюгатов Др и Км с ЭФР в качестве цитотоксических агентов позволяет снизить резистентность опухолевых клеток к данным антибиотикам. В отличие от свободных препаратов, терапевтическое применение конъюгатов ЭФР с терафталом кобальта (ТФ(Со)), винбластином (Вб), Др и Км приводит к значительному

ингибировапию роста опухолей и увеличению продолжительности жизни животных с привитыми опухолями, что позволяет рассматривать конъюгаты в качестве перспективных химиотерапевтических средств, используемых в области практической онкологии.

Впервые проведено исследование накопления и распределения антрациклинов, поступающих в чувствительные и резистентные опухолевые клетки в виде конъюгатов с ЭФР. Убедительно продемонстрировано, что антрациклины, связанные с ЭФР, преимущественно накапливаются в ядрах опухолевых клеток, и их содержание в клетках, ядрах, а также распределение препаратов между ядром и цитоплазмой практически не зависят от чувствительности клеток к антибиотикам, что может служить объяснением высокой ЦТА конъюгатов в отношении резистентных клеток.

Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты работы и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Bayev memorial conference, Cobiotec-RAN, Moscow, Russia, 1996; the XXIV meeting of the ISOBM, San Diego, Calif. USA, 1996; втором съезде биохимического общества РАН, Москва, Пущино, Россия, 1997; the XXV anniversary meeting of the ISOBM, Montreux, Switzerland, 1997; international conferences new anticancer agents, Athens, Greece, 1997; second european symposium of the protein society, Cambridge, England, 1997; VIll конференции «Новые направления биотехнологии» РАН, Москва, Россия, 1997; the XXVI meeting of ISOBM, Umea, Sweden, 1998; 10th NCA-EORTC symposium on new drugs in cancer therapy, Amsterdam, Netherlandes, 1998; 15th meeting European association for cancer research (EACR XV), Stockholm, Sweden, 1998; fourth european congress of pharmaceutical sciences, Milan, Italy, 1998; 5th IUBMB conference on the biochemistry of health and diseases, Jerusalem, Israel, 1998. Диссертационная работа апробирована 2 декабря 1999 г. на совместном научном семинаре МНИИМЭ, ВНЦМДЛ и ЦМЭП РАЕН.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Получение конъюгатое. Конъюгаты ЭФР с ФЦ(А1), ФЦ(Со), Вк получали методом прямого синтеза, в 0,1 М карбонатном буфере, pH 8,6, Молярное соотношение ЭФР:цитотоксический препарат в реакционной смеси составляло 1:8,4. Инкубацию проводили 2 ч при 20°С. Конъюгаты ЭФР с Др, Км, Вб получали при помощи 1-этил-3-(Здиметиламинопронил)-карбодиимида (ЭДК). Молярное соотношение ЭФР:цитотоксический препарат:ЭДК в инкубационной смеси было 1:40:3000 (1:0,25:3000 в случае Вб). Инкубацию проводили 3 ч при 20°С. Непрореагировавшие низкомолекулярные вещества отделяли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25 (Pharmacia). Дополнительную очистку копъгогатов проводили на колонке Bondopak С18. Концентрацию цитотоксических. препаратов в конъюгатах определяли спектрофотометрически при /„=690 нм для ФЦ(А1), ФЦ(Со), ТФ(Со) и ¿,=450 нм для Др и Км.

Культивирование клеток. В работе использовали клетки эпидермальиой карциномы человека линии А431, карциномы молочной железы человека линий MCF-7wt и MCF-7AdrR, карциномы яичников человека линий SKOV3 и SKVLB и мышиной меланомы Зшнии В16. Резистентные линии MCF-7AdrR и SKVLB получены путем селекции исходных линий MCF-7WI и SKOV3 по устойчивости к Др. Клеточные линии культивировали в пластиковых флаконах (Costar) в среде RPMI (Sigma), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в увлажненной атмосфере 5%С02 при 37°С. Для поддержания резистентности клеток линии MCF-7AdrR и SKVLB их 1 раз в месяц инкубировали в среде, содержащей 0.4 мкг/мл дауномицшш для удаления чувствительной популяции.

Определение_цитотоксической_активности_препаратов.

Цитотоксическую активность (ЦТА) препаратов определяли по ингибированию пролиферативной активности клеток. Количество выживших клеток определяли с использованием бромида 3-[4,5-

диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) в качестве витального красителя (Mossmann Т., 1983). Относительное увеличение ЦТА (ОУ ЦТ А) рассчитывали по формуле:

[Сзо свободного препарата - 1С;о коныогата

ОУ ЦТА --х 100%

ÎCjo свободного препарата

Исследование накопления и внутриклеточного распределения антраииклиновых антибиотиков и их коныогатов с ЭФР. Перенос Др и Км в составе конъюгатов с ЭФР и в свободном виде в клетки контролировали, используя флуоресцентные свойства этих антибиотиков (X возбуждения = 473 им, X эмиссии = 556 им). Следует отметить, что интеркаляция Др (Км) в ДНК приводит к тушению его собственной флуоресценции. Клетки инкубировали с конъюгатами или свободными Др и Км 2 ч в питательной среде, затем собирали центрифугированием, измеряли флуоресценцию супернатанта, быстро промывали PBS с 0,1% BSA, суспендировали в растворе PBS и измеряли флуоресценцию суспензии клеток, соответствующую количеству Др (Км) в цитоплазме и на мембранах клеток. Затем клетки лизировали, добавляя к суспензии 10% раствор SDS до его конечной концентрации 0,2%, инкубировали 2 мин при 37 °С и измеряли флуоресценцию лизатов, отражающую общее содержание Др (Км) в клетках. Количество антрациклина, интеркалировавшего в ДНК, в ядрах клеток определяли по разности флуоресценции препаратов в присутствии SDS и без него. Количество распавшегося Др (Км) определяли по разности значений флуоресценции препарата в начале инкубации и в лизате.

Определение противоопухолевой активности препаратов in vivo. Испытания проводили на мышах линии С57В1/6 с привитыми подкожно солидными опухолями меланомы В16. Препараты вводились 1 раз в 4 дня, всего 3 инъекции, начиная со 2 дня после прививки опухоли. Терапевтическую эффективность препаратов оценивали по влиянию на развитие опухолей и среднюю продолжительность жизни животных. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Штотоксическая активность конъюгатов ЭФР с ФЦ(А1), ФЦ(Со) и ТФ(Со)

Для сравнительного исследования эффективности цитотоксического действия ФЦ, доставляемых в опухолевые клетки ЭФР, были синтезированы конъюгаты ЭФР-ФЦ(А1), ЭФР-ФЦ(Со) и ЭФР-ТФ(Со) с молярными соотношениями ЭФР:ФЦ в конъюгате, равным 1:1, 1:1 и 1:2 соответственно. ЦТА конъюгатов исследовали в отношении опухолевых клеток человека линии А431, несущих большое количество рецепторов ЭФР (Jimio Н. et al., 1996) и опухолевых клеток меланомы мыши линии В16, широко используемых для индукции солидных опухолей в модельных экспериментах по оценке противоопухолевого действия конъюгатов in vivo. Исследование ЦТА конъюгатов в отношении клеток линии А431 показало, что при отсутствии светового облучения (для ФЦ(А1)) или аскорбиновой кислоты в клеточной среде (для ФЦ(Со) и ТФ(Со)) в диапазоне исследуемых концентраций ФЦ не обладали выраженной ЦТА (рис. 1 а, б, в). Напротив, в условиях соответствующей стимуляции все исследуемые конъюгаты проявляли дозозависимую ЦТА. Как следует из табл.1, ЦТА ЭФР- ФЦ(А1), ЭФР-ФЦ(Со) и ЭФР-ТФ(Со) в отношении клеток линии А431 превышала активность свободных веществ в 5.95, 8.35 и 11.86 раз соответственно. Исследование ЦТА конъюгатов в отношении клеток линии В16 показало, что активность ЭФР-ФЦ(А1) была выше активности свободного ФЦ(А1) примерно в 2.4 раза (табл.1). Конъюгаты ЭФР-ФЦ(Со) и ЭФР-ТФ(Со) проявляли ЦТА близкую к активности свободных ФЦ(Со) и ТФ(Со) (табл.1). Более высокая ЦТА конъюгатов фталоцианинов по сравненшо со свободными препаратами может

Табл.1. Цитотоксическая активность ФЦ(А1), ФЦ(Со) и ТФ(Со) и их конъюгатов с ЭФР в отношении опухолевых клеток.

Линия клеток tCso, мкМ

ФЦ(А1) ФЦ(Со) ТФ(Со)

конъюгат свободный препарат конъюгат свободный препарат конъюгат свободный препарат

А431 1.9 11.3 2.0 16.7 0.76 901

Ш6 2.5 6.1 12.1 16.2 6.8 8.1

о 'иг ьщла-ап о фп(лг»+<>»г Д ЭФР ФЩЫ) V «•««*»

ОД

(ФЦ(А1)|, мкМ

|ФЦ(Со)),мкМ

10 100 1ТФ(Со)], мкМ

Рис. 1. Цитотоксическая а1схивность фталоцианинов и их с конъюгатов ЭФР в отношении клеток зпндермальной карциномы человека линии А431 (АК -аскорбиновая кислота).

объясняться тем, что

интерналнзацпя свободного

фталоциажша затруднена

присутствием в молекуле отрицательно заряженных групп. Токсичность свободного

препарата, таким образом, ограничена поверхностью клетки, в то время как ФЦ, интернализованный с помощью ЭФР, проявляет цитотоксическое действие внутри клетки. Из приведенных данных следует, что цитотоксическое действие исследуемых конъюгатов

наиболее эффективно по сравнению со свободными ФЦ в отношении клеток линии A43I. Это может быть обусловлено большим количеством (3x10й рецепторов на клетку) и высокой скоростью рециклирования

высокоаффинных рецепторов ЭФР на поверхности данных клеток, что создает

благоприятные условия для рецептор-опосредованного эндоцитоза конъюгатов.

Необходимо отметить также, что все исследуемые конъюгаты характеризовались либо более высокой, либо близкой ЦТА к активности свободных ФЦ. Хотя in vitro ЦТА конъюгата может существенно не отличаться от активности свободного ФЦ,

представляются безусловно оправданными эксперименты с таким коныогатом in vivo, где могут проявиться его преимущества перед свободным цитотоксическим веществом, к числу которых следует отнести возможности снижения побочных эффектов и терапевтических доз препарата за счет повышения его селективности в отношении опухолевой ткани при векторном транспорте. Таким образом, дальнейшие модельные эксперименты in vivo по изучению противоопухолевой активности полученных конъюгатов могли бы позволить определить наиболее чувствительные к терапии виды опухолей. При этом конъюгат ЭФР-ФЦ(А1) может быть использован в экспериментах в области фотодинамической, а ЭФР-ФЦ(Со) и ЭФР-ТФ(Со) темповой (каталитической) терапии злокачественных новообразований, что расширяет спектр возможностей практического применения ФЦ.

Противоопухолевая активность кочыогата ЭФР с ТФ(Со) in vivo Для изучения роли ЭФР в качестве вектора для направленной доставки ТФ(Со) к клеткам-мишеням in vivo мы провели сравнительный анализ противоопухолевой активности ЭФР-ТФ(Со) и ТФ(Со). На рис.2 представлена динамика роста опухолей В16 у мышей, получавших внутривенно ТФ(Со) н его конъюгат с ЭФР в дозах 0,2 мг/кг (по ТФ(Со)).

В случае ТФ(Со) и ЭФР-ТФ(Со) у мышей, получавших препараты, наблюдалось ингибирование роста опухолей, начиная с 25 дня после прививки опухоли. Максимальное ингибирование отмечено на 35-40 день у животных, получавших конъюгат - 91% , в случае чистого ТФ(Со) эта величина составила 67%. Применение конъюгата также увеличивало

продолжительность жизни

животных по сравнению с контролем на 19,4%. В то же время использование чистого препарата ТФ(Со) практически не

Рис. 2. Влияние ТФ(Со) и его конъюгата с ЭФР на рост солидных опухолей мышиной меланомы В16.

оказывало влияния на У С ГОК животных.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности успешного использования ЭФР в качестве вектора для доставки фталоцианинов к опухолевым клегкам-мишеням. При этом представляется актуальной задачей изучение механизма действия конъюгатов ЭФР с ФЦ, разработка методов их синтеза и очистки, позволяющих повысить противоопухолевую активность препаратов, а также совершенствование схем введения конъюгатов животным с использованием повторных курсов лечения.

Цитотоксическая активность конъюгатов ЭФР с винкаалкалоидами. ЦТА конъюгатов ЭФР с винкаалкалоидами изучалась на клеточных линиях А431 и В16. Результаты исследований представлены в табл. 2. .Испытания показали, что оба конъюгата на исследованых клеточных линиях проявили большую ЦТА, чем свободные препараты. Конъюгат с Вб наиболее эффективен в отношении клеток меланомы В16 (ЦТА конъюгата ЭФР-Вб превышает активность свободного Вб на 2 порядка). Конъюгат с Вк также более активен в отношении клеточной линии В16. В отношении клеток А431 оба конъюгата проявили ЦТА, в 3 раза превышающую активность свободных препаратов.

Таблица 2. ЦТА. конъюгатов ЭФР с винкаалкалоидами.

препарат Линия клеток 1С5(1, иМ

ЦИТОТОКС11К конъюгат

винбластин А431 3,9 1,0

В16 34,3 0,2

винкристин А431 2,7 0,9

В16 10,6 2,2

Противоопухолевая активность конъюгата ЭФР с Вб in vivo Несмотря на то, что как Вб, так и Вк проявляли ЦТА в отношении клеток В16, для экспериментов in vivo был выбран винбластин, более дешевый и доступный по сравнению с Вк препарат. Исследование влияния Вб и его конъюгата с ЭФР в дозах 0,2 мг/кг по Вб на рост опухолей линии В16 показало, что Вб-ЭФР обладал более выраженным ингибирующим действием, чем свободный Вб (рнс.З). Относительный размер опухолей у

дни после прививки оную.ш

Рис. 3. Влияние Вб и его конъюгата с ЭФР на рост солидных опухолей мышиной меланомы В16,

животных, получавших Вб-ЭФР, к 31 дню эксперимента оказался в 1,6 раза меньше, чем у животных, получавших Вб, и более чем в 2 раза меньше, чем в контроле. При лечении животных коныогатом Вб-ЭФР УСПЖ животных достигало 27%, тогда как свободный Вб в используемых дозах практически не оказывал влияния на продолжительность жизни животных,

Линия клеток 1С$о, нМ

доксорубицни коныогат

А431 40 20

5КОУЗ 120 100

БКУЬВ 1200 800

В16 66 20

Цитотоксическая активность конъюгата ЭФР-Лр.

Для изучения ЦТА, накопления и внутриклеточной компартментализации Др при его векторном транспорте, мы синтезировали коныогат Др с ЭФР и использованием водорастворимого карбодиимида в качестве сшивающего агента. Мольное соотношение ЭФР:Др в конъюгате составило 1:2. Результаты исследования ЦТА конъюгата ЭФР-Др в отношении опухолевых клеток различных линий приведены в табл. 3. Наиболее эффективен конъюгат в отношении меланомы В16, его ЦТА превышает активность свободного препарата в отношении клеток этой линии в 3 раза. В 2 раза эффективней свободного препарата конъюгат действует на клетки линии А431. В отношении клеток 5К\ЮЗ конъюгат проявлял ЦТА близкую к активности свободного препарата, в то время как в отношении резистентных клеток линии БКУЬВ активность конъюгата превышала активность свободного Др в 1,5 раза.

Таблица 3. Цитотоксическая активность доксорубицина и его конъюгата с ЭФР в отношении опухолевых клеток человека и мыши.

Противоопухолевая активность коиыогата ЭФР с Ир in vivo В связи с тем, что антрациклиновые антибиотики проявляют низкую терапевтическую активность в отношении злокачественных мелаком (Yang Н.М. et al., 1988), представляло интерес проведение сравнительного исследования противоопухолевой активности конъюгата ЭФР-Др и свободного Др. На рис.4 приведена динамика роста опухолей в контрольной и опытных группах после прививки животным клеток мышиной меланомы линии В16. В группах животных, получавших Др и ЭФР-ДР в дозах 0,2 мг/кг (по Др), наблюдалось заметное ингибирование роста опухолей по сравнению с контролем. При этом средний размер

опухолей у животных, получавших ЭФР-Др, к 40 дню после прививки опухоли оказался в 1,7 раза меньше, чем у животных получавших свободный Др и в 3,4 раза меньше, чем в контрольной группе. Кроме того, в отличие от свободного Др, внутривенное введение ЭФР-Др приводило к 20% УСПЖ по сравнению с контролем. Таким образом, коньюгат ЭФР-Др in vivo проявлял заметно более высокую терапевтическую активность, чем свободой ¡i Др, в отношении меланомы.

Цитотоксическая активность конъюгата ЭФР-Км. Конъгогат Км с ЭФР был получен при помощи водорасгворимого карбодиимида. Мольное соотношение ЭФР:Км в конъюгате составило 1:2. Результаты исследования ЦТА конъюгата ЭФР-Км в отношении опухолевых клеток различных линий приведены в табл. 4. Наибольшую ЦТА коньюгат проявлял в отношении клеток карциномы А431 (ЦТ а конъюгата превышала активность свободного Км в 6,7 раза.) На клетках SKOV3 коньюгат проявил ЦТА в 3 раза большую, чем свободный Км. В отношении резистентных клеток линии SKVLB ЦТА ЭФР-Км была в 1,5

Рис. 4. Влияние Др и его конъюгата с ЭФР на рост солидных опухолей мышиной меланомы В16.

Табл. 4. Цитотоксическая активность Км и его конъюгата с ЭФР в отношении опухолевых клеток различных линий.

Линия клеток 1С50, пМ

карминомиции коиъюгат

А431 67 10

БКОУЗ 110 30

5КУЬВ 540 360

В16 28 27

раза выше, чем активность свободного Км, В отношении меланомы В16 ЦТА конъюгата и свободного препарата существенно не различались.

Противоопухолевая активность конъюгата ЭФР с 1См т у/уо

—а—контроль —О—Км —Л—ЭФР-Км

Противоопухолевую активность Км, ЭФР-Км (в дозах 0,2 мг/кг по Км) исследовали с использованием модели солидной формы меланомы В16. Как видно на рис.5, Км оказывал слабое ингибирующее действие в отношении роста опухолей в сравнении с контролем, тогда как ингибирующее действие ЭФР-Км оказалось значительным - к 31 дню

эксперимента в группе, получавшей коиъюгат,

относительный размер опухолей составил лишь 48,2%. Эффект ЭФР-Км в отношении УСПЖ животных также оказался существенно выше эффекта свободного Км (27,5% и 5,2% соответственно). Таким образом, конъюгаты антрациклинов с ЭФР можно рассматривать в качестве перспективных средств лечения злокачественных меланом и других видов опухолей.

20 25 30 35 дан после прививки опухоли

Рис. 5. Влияние Км и его конъюгата с ЭФР на рост солидных опухолей мышиной меланомы В1б.

Сравнительный анализ UTA конъюгатов ЭФР с фталоцаанинами, винкаалкалоидами и антрациклинаыи в отношении опухолевых клеток исследованных линий.

Исследование возможности повышения ЦТЛ противоопухолевых химиотерапевтических препаратов показало, что активность фталоцианинов, винкаалкалоидов и антрациклинов (за исключением конъюгатов ЭФР-Км и ЭФР-Др в отношении клеток В16 и SKOV3, соответственно) может быть значительно увеличена за счет их транспорта в клетки в виде конъюгатов с ЭФР (рис. 6, 7). Применение конъюгатов ЭФР с Др и Км позволяет также заметно снизить резистентность опухолевых клеток MCF-7AdlK и S1CVLB к антрациклипам, являющуюся одним из главных препятствий эффективной терапии злокачественных новообразований (рис. 7). Различия в уровнях ЦТА конъюгатов

140-

120-

100-

80-

и 60-

о 40-

20-

83.1

91 &

25.3

19.1

ФЦ(А|) ФЦ(Со)ТФ(Со)

I l А431 I I В16

994

74.3

66.«

79 2

BR Вк

Рис. 6. Относительное увеличение ЦТА

фталоцианинов н

винкаалкалоидов, достигаемое при инкубации их конъюгатов с ЭФР с опухолевыми клетками линий А431 и В16.

120' 100

69.6

75 75-8

3.5

Е~] ДР I I Км

72.7

16.7

33.3 33.3

а 431 в16 mcf-7 mcf-7 skov3 skvlb

Рис. 7. Относительное увеличение ЦТА

антрациклинов, достигаемое при инкубации их конъюгатов с ЭФР с опухолевыми клетками

различных линий.

индивидуальных химиопрепаратов с ЭФР в отношении исследуемых линий опухолевых клеток, очевидно, обусловлены различиями в количестве рецепторов ЭФР на поверхности клеток, скоростях эндоцитоза конъюгатов, а также чувствительностью клеток к химиопрепаратам.

Сравнительное исследование UTA, динамики накопления_и

внутриклеточного распределения антраииклиновых антибиотиков и их конъюгатов с ЭФР

UTA антрациклинов и их конъюгатов с ЭФР.

Для сравнительного исследования ЦТА, накопления и внутриклеточной компартментализации свободных и химически связанных с векторным белком антрациклинов мы провели испытание ЦТА конъюгатов ЭФР с Др и Км и свободных антибиотиков в отношении, чувствительных (MCF-7wt) и резистентных (MCF-7AdrR) к действию антрациклинов опухолевых клеток. ЦТА конъюгатов Др и Км с ЭФР превышала активность свободных антибиотиков в отношении клеток MCF-7WI примерно в 4 раза, и в 2 раза в отношении MCF-7AdrR. При этом эффективность цитотоксического действия конъюгатов антибиотиков с ЭФР в отношении клеток MCF-7WI была примерно в в 2 раза выше, чем в отношении MCF-7AdlR (табл. 5). Следует отметить, что несмотря на высокую ЦТА конъюгатов антибиотиков с ЭФР, их токсичность в отношении клеток MCF-7AJrR была существенно ниже, чем MCF-7wt, что может объясняться активным

Таблица 5. Цитотоксическая активность Др, Км и их конъюгатов с ЭФР в отношении чувствительных МСР-7№ и резистентных МСР-7да к антрациклинам клеток карциномы молочной железы человека.

препарат MCF-7W MCF-7"'

IC50. мкМ ПСД* ICso, мкМ ПСД*

ДР 0,180 4,0 3,5 2,2

ЭФР-Др 0,045 1,6

Км 0,029 4,1 0,48 1,9

ЭФР-Км 0,007 0,25

* Показатель соотношения доз (ПСД) выражает отношение значений 1С50 в присутствии свободного антрациклина и его конъюгата с ЭФР.

выбросом Др и Км нз резистентных клеток посредством насоса Р170 (Ва1с1пп N. е1 а1., 1995). Очевидно, что уровень ЦТА исследуемых коныогатов и свободных антрациклиновых антибиотиков во многом определяется скоростью и характером поступления препаратов в клетку (пассивная диффузия и рецептор-опосредованный эндоцитоз), их компартментализацией, а также эффективностью действия механизмов клеточной резистентности.

Накопление свободных и связанных с ЭФР ашпрациклннов в чувствительных и резистентных опухолевых клетках Данные по накоплению свободных антрациклииов и их конъюгатов с ЭФР в чувствительных и резистентных клетках приведены в табл. 6, 7. Как видно из табл. 6, уровень накопления Др как клетками МСГ'-7ич, так и МСР-7А<1гК при его поступлении в составе конъюгата с ЭФР заметно превышает уровень накопления свободного Др. При этом уровень накопления Др в клетках МСГ-?1"1 и МСР-?'"11* при инкубации с конъюгатом ЭФР-Др существенно не различался (табл. 6). Очевидно, что при рецептор-опосредованном эндоцитозе конъюгата ЭФР-Др эффективность действия механизма, определяющего резистентность клеток к Др, заметно снижена. Содержание свободного Др в клетках МСР-7Ш оказалось в 1,95 раза выше, чем в МСР-7Д1|гК. Низкое содержание Др в резистентных клетках может быть обусловлено внутриклеточной деградацией антибиотика, а также механизмом, обеспечивающим его выведение из клетки (Сергеева Н.С. и др., 1996).

Представленные данные свидетельствуют о том, что рецепторопосредованный эндоцитоз конъюгата ЭФР-Др является более

Таблица 6. Содержание ДР в клетках и среде инкубации по отношению к его исходному количеству в среде через 2 ч инкубации клеток МСР-7 и МСГ-7Дс1гК со свободным ДР и его конъюгатом с ЭФР.

Клеточная культура Препарат Содержание ДР, %

Клетки Среда Распад

МСТ-7 др ЭФР-ДР 29,7 40,1 60,1 52,4 10,2 7,5

МСР_7лаи ДР ЭФР-ДР 15,2 36,6 68,5 55,3 16,3 8,1

Таблица 7. Содержание Км в клетках и среде инкубации по отношению к его исходному количеству в среде через 2 ч инкубации клеток со свободным Км и его конъюгатом с ЭФР.

Клеточная культура Препарат Содержание Км, %

Клетки Среда Распад

МСР-?'*'1 Км ЭФР-Км 45.2 35.75 40.8 57.75 14 6.5

МСР-7Л,И Км ЭФР-Км 36.75 34.2 45.75 58.3 17.5 7.5

действенным механизмом доставки Др в клетки МСР-7, чем диффузия свободного Др через клеточную мембрану по градиенту концентрации. Высокий уровень накопления Др резистентными клетками при их инкубации с конъюгатом ЭФР-Др может являться одной из главных причин повышения их чувствительности к цитотоксическому действию антибиотика (табл. 5).

Исследование накопления Км в клетках показало, что наибольшее количество антибиотика регистрировалось в клетках МСР-7№1 при их инкубации со свободным Км, тогда как в клетках МСР-7да'г( его уровень был заметно ниже (табл. 7). Уровни накопления Км, связанного с ЭФР, в клетках МСР-7№' и МСР-7Л1№, так же, как и в случае Др, характеризовались близкими значениями.

Известно, что в антрациклины в клетке могут подвергаться деградации (ТпНоп Т.!?.., 1991). Как видно из табл. 6, 7, уровень деградации антрациклинов, доставляемых ЭФР в клетки МСР-7Ш1 и МСР-7д<1гК, был более чем в 2 раза ниже (в случае ЭФР-Др в клетках МСР-7Щ в 1,4 раза) в сравнении с сответствующими свободными Др и Км, что может рассматриваться как преимущество при использовании конъюгатов в качестве противоопухолевых агентов.

Уровни накопления свободного Км как в клетках МСР-7Ш, так и МСР-7ла,к превышали уровни Др в 1,5 и 2,4 раза соответственно. Уровни накопления антибиотиков, поступивших в клетки исследуемых линий в виде конъюгатов с ЭФР, характеризовались близкими значениями (табл. 6, 7). По-видимому, уровень накопления конъюгатов определяется количеством рецепторов ЭФР на поверхности клеток, аффинностью лиганда к рецептору и, в конечном итоге, эффективностью рецепторопосредованного

эндоцитоза. Природа антрациклинов и действие механизмов клеточной резистентности в данном случае имеют меньшее значение.

Накопление свободных и связанных с ЭФР антрациклинов в ядрах чувствительных и резистентных опухолевых клеток. Результаты исследования динамики и уровня накопления антрациклинов и их конъюгатов с ЭФР в ядрах клеток приведены на рис. 8, 9 и в табл. 8. Как видно из табл. 8, с наибольшими скоростями происходило полумаксимальное накопление свободных Др и Км, причем скорость накопления антибиотиков в ядрах клеток МСР-7т была выше, чем в МСР-7А<Ы\ Конъюгаты Км и Др с ЭФР также накапливались в ядрах клеток

MCF-7 с более высокой скоростью, чем в MCF-7

/WiR

Скорости

накопления свободного Км и его коныогата с ЭФР были выше, чем в случае препаратов Др, что, по-видимому, обусловлено более высокой полярностью молекулы Км (Skovsgaard Т. et al., 1982). Различия в скоростях накопления свободных антрациклинов и их конъюгатов с ЭФР определяются как природой антибиотиков и путем их транслокации в клетку, так и особенностями внутриклеточной компартментализации. Свободные антрациклины быстро проникают в клетку в результате пассивной диффузии (Siegfried J.M. etal., 1985). Конъюгаты ЭФР попадают в клетку в результате их рецепторопосредованного эндоцитоза, протекающего с более низкой скрростыо (Willinghain М.С. et al., 1983; Haigier Н.Т., 1983).

1 5

200 1, мин

Рис. 8. Тушение флуоресценции Др при инкубации опухолевых клеток карциномы молочной железы человека линий МСГ-7и' (А) и МСР-7л<'гК (Б) с конъюгатом ЭФР-Др и свободным Др.

Таблица 8. Накопление свободных п связанных с ЭФР антрациклннов в ядрах чувствительных и резистентных опухолевых клеток.

препарат Др ЭФР-Др Км ЭФР-Км

(м*, мин МС[7-7А'1 17 38 4.2 22

МСР-7А4К 36 46 8.5 25

С**, 0.538 0.616 0.768 0.500

мкМ/104 кл МСР.7д<1гК 0.257 0.543 0.551 0.458

* '1/2 - время полумаксимального накопления антибиотика в ядрах опухолевых клеток.

** С — концентрация связанного с ядром антрациклина, определенная в условиях стационарного состояния.

Как видно на рис. 8, 9, кривые насыщения ядер клеток свободными антрациклинами и их конъюгатами достигают плато лишь после 2 ч инкубации, за исключением свободного Км (насыщение клеток МСР-7№ и . МСР-7а'№ антибиотиком достигается через 30 и 50 мин соответственно). Очевидно, что скорость поступления препаратов антрациклинов в клетку складывается из скоростей проникновения антрациклинов через плазматическую мембрану, внутриклеточной компартментализации и транслокации антибиотиков в ядро.

Как видно из табл. 8, уровень накопления Др, связанного с ЭФР, в ядрах клеток МСР-7т и МСР-7А,М1 был йЬиие уровня свободного антибиотика. В

а 3

1 а

а. о

¡5' ■е

1, мни

I, М|

Рис. 9. Тушение флуоресценции Км при инкубации опухолевых клеток карциномы молочной железы и свободным Км.

молочной железы человека линий МСР-7ад (А) и МС1;-7л<1гК (Б) с конъюгатом ЭФР-Км

случае препаратов Км, напротив, уровень свободного антибиотика в ядрах клеток исследуемых линий превышал уровень Км, доставляемого и клетки ЭФР. По-видимому, различие в уровнях накопления Др и Км связано с более высокой проницаемостью клеток для Км и низкой эффективностью его выброса из клетки насосом Р170. Уровни накопления свободных Др и Км в ядрах клеток MCF-7wt были заметно выше, чем в MCF-7AJrli, что может служить одним из объяснений резистентности клеток к цитотоксическому действию антибиотиков. Уровни накопления антрациклинов, связанных с ЭФР, в ядрах клеток MCF-7wt и MCF-7Al,rR существенно не различались (табл. 8). При поступлении антибиотиков в клетку в составе конъюгатов их содержание в ядре практически не зависит от чувствительности клеток к антибиотику (табл. 8), что может служить причиной высокой ЦТА конъюгатов в отношении резистентных клеток (табл. 5).

Результаты исследования распределения антрациклинов и их конъюгатов с ЭФР между цитоплазмой и ядром опухолевых клеток приведены в табл. 9, 10. Поступающие в клетки свободные Др и Км и их конъюгаты с ЭФР преимущественно локализуются в ядрах как клеток MCF-7WI, так и MCF-jAdrR j-jpH этом распределение свободных антрациклинов между ядром и цитоплазмой клеток MCF-7Wl и MCF-7AJrR существенно различается. Так, соотношение содержания свободного Др в ядерной и цитоплазматической фракциях клеток MCF-7wt и MCF-"7AdrR составило 9,0 и 5,7 соответственно (для Км соотношение составило 5,7 и 3,0). Таким образом, по сравнению с клетками MCF-7wt, относительный уровень свободных Др и Км в ядрах клеток MCF-7AdtR снижается, а в цитоплазме возрастает, что, очевидно,

Таблица 9. Распределение ДР между ядром и цитоплазмой клеток через 2 ч инкубации с ДР и конъюгатом ДР с ЭФР.

Линия клеток Препарат Содержание ДР, %

Ядро Цитоплазма

MCF-7 да ЭФР-ДР 90 77 10 23

MCF-7Ad* ДР ЭФР-ДР 00 15 26

Таблица 10. Распределение Км между ядром и цитоплазмой клеток через 2 ч инкубации с Км и конъюгатом Км с ЭФР.

Линия клеток Препарат Содержание Км, %

Ядро Цмтоилшма

MCF-7WI Км ЭФР-Км 85 70 15 30

MCF7AdrR Км ЭФР-Км 75 67 25 33

вызвано действием механизма клеточной резистентности (Сергеева Н.С. и др., 1996), препятствующего поступлению антрациклинов в ядро. Поскольку интеркаляция антрациклинов между парами оснований ДНК рассматривается в качестве основного механизма проявления их цитотоксической активности (Liu L.F. et al., 1983), внутриклеточные механизмы, обуславливающие низкое содержание Др и Км в ядрах резистентных клеток, вероятно, могут быть определяющими в отношении устойчивости клеток к действию антибиотиков (табл. 5). В противоположность свободным антрациклинам, соотношение содержания Др, связанного с ЭФР, в ядерной и цитоплазматической фракциях клеток MCF-7wt и MCF-7AdlR составило 3,3 и 2,8 соответственно (для Км соотношение составило 2,3 и 2,0). То есть, при поступлении антрациклинов в клетку в составе конъюгатов с ЭФР их содержание в ядре (табл. 8), а также уровень их относительного распределения (табл. 9, 10) практически не зависит от чувствительности клеток к антибиотикам, что может свидетельствовать о низкой эффективности действия механизма клеточной резистентности в отношении конъюгатов. Представленные данные свидетельствуют о значительных различиях в скоростях, уровнях накопления и внутриклеточного распределения свободных и связанных с ЭФР антрациклинов. Вероятно, что этими различиями определяется более высокая ЦТА конъюгатов в отношении чувствительных и резистентных опухолевых клеток по сравнению со свободными антрациклинами.

Выводы

1. Получены конъюгэты ЭФР с ФЦ(А1), ФД(Со), ТФ(Со), Вб, Вк, Др, Км, проявляющие более высокую ЦТА, чем свободные вещества, в отношении опухолевых клеток линий А431 и В16.

2. Конъюгаты Др и Км с ЭФР проявляют более высокую ЦТА, чем свободные вещества, как в отношении чувствительных к антрациклинам клеток MCF-7wt и SKOV3, так и резистентных MCF-7AdrR и SKVLB.

3. В экспериментах in vivo на мышах с привитыми опухолями меланомы В)6 показано, что терапевтическое применение коныогатов ЭФР с ТФ(Со), Вб, Др и Км в исследуемых дозах приводит к значительному ингибированию опухолевого роста и увеличению продолжительности жизни по сравнению с контролем. Применение свободных препаратов в тех же дозах практически не оказывало влияния на эти параметры.

4. При поступлении в опухолевые клетки MCF-7 свободные и связанные с ЭФР Др и Км преимущественно накапливаются в ядрах как чувствительных, так и резистентных к антрациклинам клеток. При этом все исследуемые препараты накапливаются в ядрах чувствительных клеток с более высокой скоростью, чем в резистентных.

5. Накопление свободного Км как в резистентных, так и в чувствительных клетках MCF-7 и их ядрах происходило с более высокими скоростями и достигало более высоких уровней, чем накопление Др. Скорости накопления конъюгатов Км с ЭФР в ядрах клеток MCF-7Wt и MCF-7A,ill! также превышали скорости накопления ЭФР-Др.

6. Накопление свободных антрациклинов в ядрах чувствительных и резистентных клеток MCF-7 происходит с более высокими скоростями, чем накопление их конъюгатов с ЭФР.

7. При поступлении антрациклинов в клетки MCF-7 в составе конъюгатов с ЭФР, в отличие от свободных Др и Км, их содержание в клетках, ядрах, а также их распределение между ядром и цитоплазмой практически не зависят от чувствительности клеток к антибиотикам.

8. При поступлении антрациклинов в клетки MCF-7wt и MCF-7AclrR в составе конъюгатов с ЭФР уровень их внутриклеточной деградации заметн<Гснижается.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Skryabin K.G., Kirpichnikov М.Р., Severin S.E., Lutsenko S.V., Mihailova L.I., Gumanov S.G. Development of cytotoxic conjugates of recombinant human epidermal growth factor with doxorubicin and phtlialocyanin and studies of their influence on malignant cells. Bayev memorial conference, Cobiotec-RAN, Moscow, Russia, 1996, p. 101.

2. Eldarov M.A., Karpychev I.V., Lutsenko S.V., Posypanova G.A., Gumanov S.G. Expression and secretion of epidermal growth factor in yeast. Bayev memorial conference, Cobiotec-RAN, Moscow, Russia, 1996, p. 101.

3. Lutsenko S.V., Posypanova G.A., Gumanov S.G., Severin S.E., Skryabin K.G., Kiipitchnikov M.P., Lukianetz E.A. The antitumoral effect of EGF-phthalocyanin conjugates in vitro. The XXIV meeting of the International society for oncodevelopmental biology and medicine, San Diego, Calif. USA, 1996, p. 189.

4. Луценко C.B., Туманов С.Г., Гукасова H.B., Родина А.В., Северин С.Е. Использование эпидермального фактора роста для направленной доставки доксорубицина к клеткам-мишеням. Второй съезд биохимического общества РАН, Москва, Пущино, Россия, 1997, с.450.

5. Severin S.E., Moskaleva E.Yu., Katukov V.Yu., Belousova Yu.V., Rodina A.V., Lutsenko S.V., Gumanov S.G., Shmyrev 1.1., Severin E.S. Efficiency of doxorubicin targeting in the form of conjugates with alpha-fetoprotein, epidermal growth factor and growth hormone. The XXVth anniversary meeting of the ISOBM, Montreux, Switzerland, 1997, p. 45.

6. Lutsenko S.V., Gumanov S.G., Gukasova N.V., Rodina A.V.. Katukov V.Yu., Korzhenevsky D.A., Severin S.E. EGF: a vector for doxorubicin and vincristine delivery to target cells. The XXVth anniversary meeting of the ISOBM, Montreux, Switzerland. 1997, p. 63.

7. Lutsenko S.V., Finakova G.V., Feldman N.B., Gumanov S.G., Korzhenevsky D.A., Gukasova N.V., Severin S.E. The increase in selectivity of antitumor action of vinblastine and vincristine by targeted delivery of their EGF-conjugates to tumor cells. International institute of anticancer research. International conferences «new anticancer agents, Athens, Greece, 1997, p. 56.

'ч

8. Луценко C.B., Гукасова H.B., Посыпанова Г.А., Туманов С.Г., Фельдман Н.Б., Москалева Е.Ю., Северин Е.С., Северин С.Е., Скрябин К.Г. ЭФР как вектор для направленной доставки доксорубицина (ДР) к клеткам

опухолевых линий, резистентных к ДР. VIII конференция «Новые направления биотехнологии» РАН, Москва, Россия 1997, с. 81.

9. Луценко С.В., Туманов С.Г., Фельдман Н.Б., Посыпанова Г.А., Москалева Е.Ю., Северин С.Е., Северин Е.С., Скрябин К.Г. Накопление и внутриклеточная локализация доксорубицина (ДР) при его направленном транспорте к опухолевым клеткам с помощью эпидермального фактора роста (ЭФР). VIII конференция «Новые направления биотехнологии» РАН, Москва, Россия, 1997, с. 82.

10.Lutsenko S.V., Gumanov S.G., Posypanova G. A., Severin S.E. The epidermal growth factor (EGF) as a vector for targeted delivery of cytotoxic drugs to target tumor cells. The XXVI meeting of 1SOBM, Uinea, Sweden, 1998, p. 80.

11.Lutsenko S.V., Gumanov S.G., Moskaleva E.Yu., Belushkina N.N., Eldarov M.A., Severin S.E., Skryabin K.G., Kirpichnikov M.P. Epidermal growth factor conjugates with doxorubicin and vincristine produce toxic effect on cell cultures resistant to antibiotics. !OlllNCA-EORTC symposium on new drugs in cancer therapy, Amsterdam, Netherlandes, 1998, p. 157.

12.Lutsenko S.V., Gukasova N.V., Gumanov S.G., Posypanova G.A., Korzhenevsky D.A., Feldman N.B., Severin S.E. Study of the cytotoxic activity of the epidermal growth factor-doxorubicin conjugate against human tumor cell cultures. 15th meeting European association for cancer research (EACR XV), Stockholm, Sweden; 1998, p. 127.

13.Северин C.E., Савельева Г.М., Туманов С.Г., Луценко С.В., Москалева Е.Ю., Родина А.В., Клименко П.А., Шмырев И.И., Попова О.Н., Зыкова И.Е., Северин Е.С. Исследование противоопухолевой активности конъюгатов доксорубицина с альфа-фетопротеином и с эпидермальным фактором роста в отношении клеток карциномы яичника человека in vitro. Вестник акушерства и гинекологии, 1998, №2, с. 15-18.

14.Lutsenko S.V., Feldman N.B., Gukasova N.V., Posypanova G.A., Gumanov S.G., Skryabin K.G., Severin S.E. Toxicity of epidermal growth factor conjugate with doxorubicin against antibiotics-resistant tumor cell cultures. Fourth european congress of pharmaceutical sciences, Milan, Italy, 1998, p.

^56.

15.Луценко С.В., Посыпанова Г*А., Туманов С.Г., Северин С.Е. Увеличение накопления доксорубицина в резистентных опухолевых клетках при направленном транспорте антибиотика с помощью

эпидермалыюго фактора роста. 5lh IUBMB conference on tlie biochemistry of health and diseases, Jerusalem, Israel, 1998.

16.Луценко C.B., Финакова Г.В., Фельдман Н.Б., Туманов С.Г., Родина

A.B., Посыпанова Г.А., Гукасова Н.В., Корженевский Д А., Катуков

B.Ю., Северин С.Е., Скрябин К.Г., Кирпичников М.Г1. Рецепторопосредованный токсический эффект конъюгата эпидермального фактора роста с доксорубицином в отношении опухолевых клеток. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 1998, №1, с. 21-25.

17.Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Финакова Г.В., Туманов С.Г., Гукасова Н.В., Корженевский Д.А., Бобрускин А.И., Гельперина С.Э., Посыпанова Г.А., Катуков В.Ю., Северин С.Е., Скрябин К.Г., Кирпичников М.П., Калия О.Л., Ворожцов Т.Н. Направленная доставка к клеткам-мишеням и цитотоксическая противоопухолевая активность окга-4,5-карбоксифталоцианина (терафтал). Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 1998, №1, с. 34-37.

18.Родина A.B., Москалева Е.Ю., Посыпанова Г.А., Шмырев И.И., Туманов С.Г., Луценко C.B., Катуков В.Ю., Северин Е.С. Сравнение цитотоксической активности конъюгатов доксорубицина с альфа-фетопротеином и эпидермальным фактором роста в отношении чувствительных и резистентных к доксорубицину клеточных линий. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтическоой химии, 1998, №2, с. 20-25. .

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гуманов, Сергей Георгиевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эпидермальный фактор роста

1.1.1. Структура и физико-химические свойства ЭФР

1.1.2. Видоспецифичность ЭФР

11.3. Предшественники ЭФР и ЭФР-связывающий белок

1.1.4. Ген ЭФР

1.1.5. Получение ЭФР

1.1.6. Структура и функции рецептора ЭФР

1.1.7. Механизмы митогенного действия ЭФР

1.1.8. Процессинг ЭФР-рецепторных комплексов

1.1.9. Распределение рецепторов ЭФР в организме

1.1.10. Получение химических производных ЭФР

1.1.11 Перспективы использования ЭФР в качестве вектора для адресного транспорта противоопухолевых препаратов

1.2. Противоопухолевые препараты

1.2.1. Антибиотики антрациклинового ряда

1.2.2. Использование конъюгатов антрациклинов для направленной терапии опухолей

1.2.3. Винкаалкалоиды

1.2.4. Конъюгаты с винкаалкалоидами

1.2.5. Фталоцианины как агенты для фотодинамической и темновой (каталитической)терапии

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Выделение и очистка ЭФР

2.2. Получение конъюгатов

2.2.1. Конъюгаты ФЦ(А1), ФЦ(Со) и Вк с ЭФР

2.2.2. Конъюгаты Др, Км и Вб с ЭФР

2.3. Культивирование клеток

2.4. Определение цитотоксической активности препаратов in vitro

2.4.1. Фталоцианины и их конъюгаты с ЭФР

2.4.2. Антрациклиновые антибиотики, растительные алкалоиды и их конъюгаты с ЭФР

2.4.3. Оценка жизнеспособности клеток

2.5. Исследование накопления и внутриклеточного распределения антрациклиновых антибиотиков и их конъюгатов с ЭФР

2.6. Определение противоопухолевой активности препаратов in vivo

2.7. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Цитотоксическая активность конъюгатов ЭФР с ФЦ(А1), ФЦ(Со) и ТФ(Со)

3.2. Противоопухолевая активность конъюгата ЭФР с ТФ(Со) in vivo

3.3. Цитотоксическая активность конъюгатов ЭФР с винкаалкалоидами

3.4. Противоопухолевая активность конъюгата ЭФР с Вб in vivo

3.5. Цитотоксическая активность конъюгата ЭФР-Др

3.6. Противоопухолевая активность конъюгата ЭФР с Др in vivo

3.7. Цитотоксическая активность конъюгата ЭФР-Км

3.8. Противоопухолевая активность конъюгата ЭФР с Км in vivo

3.9. Сравнительный анализ ЦТА конъюгатов ЭФР с фталоцианинами, винкаалкалоидами и антрациклинами в отношении опухолевых клеток исследованных линий

3.10. Сравнительное исследование ЦТА, динамики накопления и внутриклеточного распределения антрациклиновых антибиотиков и их конъюгатов с ЭФР

3.10.1. ЦТА антрациклинов и их конъюгатов с ЭФР

3.10.2. Накопление свободных и связанных с ЭФР антрациклинов в чувствительных и резистентных опухолевых клетках

3.10.3. Накопление свободных и связанных с ЭФР антрациклинов в ядрах чувствительных и резистентных опухолевых клеток

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и изучение биологической активности конъюгатов эпидермального фактора роста с противоопухолевыми химиотерапевтическими препаратами"

Проблема химиотерапии злокачественных новообразований занимала значительное место в медико-биологических исследованиях на протяжении всего двадцатого века. Долгое время эффективность химиотерапии была невелика, однако с начала 70-х годов, с момента создания технологий получения рекомбинантных ДНК и моноклональных антител, когда появилась возможность совершить значительный прорыв в понимании природы возникновения злокачественных новообразований, химиотерапия рака приобрела второе дыхание. Появилась надежда на возможность целенаправленного воздействия на различные этапы внутриклеточной передачи сигналов, индуцирующие превращение здоровой клетки в злокачественную (Северин С.Е. и др., 1998). Значительный прогресс был достигнут также в изучении фундаментальных отличий рецепторных и маркерных портретов раковых клеток от нормальных, что, в сочетании с применением моноклональных антител и успехами в выделении и очистке ростовых факторов, позволило возродить идею П. Эрлиха о «магической пуле», т.е. нетоксичном для клеточного окружения соединении, специфически атакующем клетку-мишень. В это же время были достигнуты значительные успехи в получении противоопухолевых антибиотиков, обладающих высокой цитотоксичностью. Тридцатилетие с начала 70-х годов было ознаменовано многочисленными попытками создания высокоспецифичных конъюгатов различных противопухолевых препаратов с векторными молекулами, селективно и с высоким сродством связывающимися с уникальными маркерами, локализованными на поверхности раковых клеток. В качестве токсических агентов широко использовали вещества различных классов - антагонисты фолиевой кислоты (метотрексат), антибиотики антрациклинового ряда (доксорубицин, дауномицин, карминомицин, эпирубицин и их многочисленные производные), растительные алкалоиды (винкристин, винбластин и др), антибиотики ендиинового класса (калихемицин, эсперамицин), белковые токсины (дифтерийный токсин, экзотоксин А из Pseudomonas, рицин), 6 различные фоточувствительные соединения на основе протопорфирина (фталоцианин, фотофрин, фотогем Р) и ряд других соединений. В качестве молекул-векторов первоначально наибольшее внимание привлекали моноклональные антитела против различных онкофетальных маркеров, и других антигенов, высокоэкспрессированых в опухолевых клетках, однако использование таких конъюгатов столкнулось с рядом фундаментальных ограничений. Эти ограничения связаны с низкой селективностью моноклональных антител в отношении опухолей, недостаточной эффективностью клеточной интернализации их конъюгатов с химиопрепаратами, а также с нестабильностью, приводящей к освобождению препарата до момента достижения контакта с опухолевой клеткой. В настоящее время для направленной доставки более перспективным представляется использование физиологических лигандов, рецепторы которых либо специфичны, либо высокоэкспрессированы на поверхности быстропролиферирующих клеток. Примерами таких лигандов могут служить трансферрин, альфа-фетопротеин, многие ростовые факторы. Последние особенно интересны в связи с высокой константой связывания с рецептором, высокой скоростью специфического эндоцитоза, а также доступностью, в большинстве случаев, в виде рекомбинантного человеческого белка.

Наша работа посвящена созданию и изучению биологической активности конъюгатов эпидермального фактора роста (ЭФР) с различными цитотоксическими агентами. К преимуществам ЭФР как молекулярного вектора следует отнести доступность белка в препаративных количествах, стабильность при комнатной температуре его и в органических растворителях, а также ряд физиологических свойств. ЭФР связывается со своим рецептором с высокой аффинностью (Кд=Ю"10 М), причем ЭФР-рецепторный комплекс достаточно быстро интернализуется. Целый ряд злокачественных опухолей экспрессирует на поверхности клеток аномально высокое количество рецепторов ЭФР, что, несмотря на убиквитарность фактора роста, обеспечивает селективность доставки химиопрепаратов, связанных с ЭФР. В настоящее время созданы штаммы-продуценты рекомбинантного человеческого ЭФР, в связи с чем белок доступен в препаративных количествах. Механизм рецепторопосредованного эндоцитоза ЭФР также представляется удобным для целенаправленной интернализации цитотоксического агента. Кроме того, особенности процесса 7 внутриклеточной компартментализации комплекса ЭФР-рецептор-цитотоксический агент могут играть определенную роль в снижении резистентности к антрациклинам, что представляет значительный интерес для клинического использования. 8

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гуманов, Сергей Георгиевич

ВЫВОДЫ

1. Получены конъюгаты ЭФР с ФЦ(А1), ФЦ(Со), ТФ(Со), Вб, Вк, Др, Км, проявляющие более высокую ЦТА, чем свободные вещества, в отношении опухолевых клеток линий А43 1 и В16.

2. Конъюгаты Др и Км с ЭФР проявляют более высокую ЦТА, чем свободные вещества, как в отношении чувствительных к антрациклинам клеток MCF-7Wt и SKOV3, так и резистентных MCF-7AdrR и SKVLB.

3. В экспериментах in vivo на мышах с привитыми опухолями меланомы В16 показано, что терапевтическое применение конъюгатов ЭФР с ТФ(Со), Вб, Др и Км в исследуемых дозах приводит к значительному ингибированию опухолевого роста и увеличению продолжительности жизни по сравнению с контролем. Применение свободных препаратов в тех же дозах практически не оказывало влияния на эти параметры.

5. Накопление свободного Км как в резистентных, так и в чувствительных клетках MCF-7 и их ядрах происходило с более высокими скоростями и достигало более высоких уровней, чем накопление Др. Скорости накопления конъюгатов Км с ЭФР в ядрах клеток MCF-7Wt и MCF-7AdlR также превышали скорости накопления ЭФР-Др.

8. При поступлении антрациклинов в клетки MCF-7Wt и MCF-7AdlR в составе конъюгатов с ЭФР уровень их внутриклеточной деградации заметно снижается.

Таким образом, в заключение рассмотрения первой концепции действия антрациклиновых антибиотиков, можно сформулировать следующие выводы: 1. Интеркаляция Др в ДНК хотя и имеет место, но не играет ведущей роли в формировании нерепарируемых двухцепочечных разрывов; 2. Ведущую роль в образовании фрагментов ДНК играет активационный комплекс антрациклин-ДНК-топоизомераза II; 3. В результате действия этого комплекса происходит фрагментация ДНК по апоптотическому механизму.

Перед детальным рассмотрением второй концепции механизма действия антрациклинов необходимо рассмотреть тесно связанные с ней данные, описывающие метаболизм антрациклиновых антибиотиков, образование свободных радикалов и проявление цитотоксической активности.

По некоторым данным, свободные радикалы, генерируемые антрациклиновыми антибиотиками, играют важную роль в проявлении их токсичности и противоопухолевой активности [Эммануэль Н.М. и др., 1984; Lown J.V. et al., 1983]. Показано, что НАДФН-цитохром Р-450 катализирует образование семихиноновых радикалов антрациклинов. Семихиноновый радикал легко отдает электрон кислороду с образованием супероксида, и снова превращается в стабильную хиноновую форму. Если кислорода недостаточно, семихиноновый радикал не отдает электрон другим акцепторам и происходит неэнзиматическое расщепление гликозидной связи с образованием 7-дезоксиагликонов [Bachur N.R. et al., 1979]. Восстановлене антрациклинов могут осуществить и другие флавопротеиды [Fisher J. et al., 1983]. Взаимодействие семихиноновых радикалов антрациклиновых антибиотиков с внутриклеточным кислородом может приводить к образованию супероксидных и гидроксильных радикалов. Важную роль могут при этом играть ионы металлов, в частности, железа [Eliot H. et al., 1984; Zweier J.L., 1984]. Главную роль в процессах образования однотяжевых разрывов ДНК играют

А + NADPH АН2 + NADP'

АН2 + 02 АН*+ Н02

СОД

Н02 + НО*2 Н202 + 02 каталаза

2 Н202 2 Н20 + 02

КХ Fe(III) + 02 КХ ' Fe(III) + О

КХ ' Fe(II) + Н202 KX'Fe(III) + ОН"+ ОН

ОН + ДНК образование разрывов

Рис. 7. Схема образования свободных радикалов при восстановлении -окислении антрациклиновых антибиотиков (А - антибиотик, АН семихиноновый радикал антибиотика, СОД - супероксиддисмутаза, КХ Fe(lII) и КХ' Fe(II) - комплексы ионов железа с АТФ или с белком). гидроксильные радикалы. В работе [Lown J.V. et al., 1983] предложена общая схема образования свободных радикалов при восстановлении-окислении противоопухолевых антибиотиков (рис. 7). В некоторых работах [Тараховский A.M. и др., 1983; Эммануэль Н.М. и др., 1984; Bachur N.R. et al., 1979; Lown J.V et al., 1983] предполагалось, что образование свободных радикалов может быть основой противоопухолевой активности и токсичности антрациклинов. В частности, кардиотоксичность антрациклиновых антибиотиков объясняли образованием гидроксильных радикалов или супероксида в сердечной мышце [Doroshow J.H., 1983; Nohl Н., Jordan W., 1983]. Образование свободных радикалов может стимулировать перекисное окисление липидов, что в свою очередь может вести к дезинтеграции эндоплазматического ретикулума и мембран митохондрий. Тем не менее, представляется более вероятным, что свободнорадикальный механизм все же играет вспомогательную роль в механизме проявления цитотоксичности антрациклинов. Показано, что образование разрывов ДНК и цитотоксическое действие антрациклинов в

38 культуре опухолевых клеток не зависит от присутствия кислорода [Brox L. et al., 1982; Kennedy К. A. et al., 1983]. Ингибиторы образования свободных радикалов не подавляют образования однотяжевых разрывов ДНК в присутствии Др [Pommier Y. et al., 1983]. Разрывы ДНК, индуцируемые свободными радикалами, выявляются только в хорошо аэрируемых клетках в присутствии очень высоких (2,8х10"4 М) концентраций Др, то есть значительно выше тех, которые могут быть достигнуты в плазме при внутривенном введении антибиотика в клинике. Следовательно, по имеющимся в литературе данным, противоопухолевая активность и цитотоксичность антрациклинов не могут быть связаны со свободнорадикальными механизмами.

Взаимодействие антрациклинов с клеточной мембраной

Рассмотрим вторую концепцию механизма цитотоксического действия антрациклиновых антибиотиков. Известно, что антрациклиновые антибиотики, а также другие интеркаляторы и такие противоопухолевые препараты, как актиномицин Д и соединения платины, взаимодействуют с плазматическими мембранами животных клеток [Sinha В.К., Chignell С.F., 1979]. Антрациклины, в частности, могут вызывать лизис эритроцитов и разрушение мембран теней эритроцитов [Myers С.Е. et al., 1982]. Показано, что комплекс Др-Ре3+ связывается с фосфолипидами мембраны [Demant E.J.F., 1984]. Высказывалось предположение, что первичным токсическим эффектом антрациклиновых антибиотиков является действие на мембрану. Так, например, [Tritton T.R., Yee G., 1982], сообщили, что Др может вызывать цитотоксический эффект, не проникая внутрь клетки. Они ковалентно иммобилизовали Др на агарозных гранулах. Иммобилизованный антибиотик подавлял рост клеток лейкоза LI210 так же эффективно, как и свободный, при этом в клетках Др не обнаруживался. Другие исследователи [Tokes Z.A. et al., 1982; Rogers K.E. et al., 1983] получили Др, ковалентно связанный с микросферами, образованными полиглутаральдегидом. В этом случае антибиотик также оказывал токсическое действие на опухолевые клетки, не проникая в них. Почти весь антибиотик оставался связанным с микросферами и не проникал в клетки, так что активность нельзя было объяснить его освобождением, следовательно, он действовал с поверхности клетки. При этом цитотоксичность не только сохранялась, но и в некоторых случаях значительно усиливалась. Кроме того,

39 устойчивые к Др опухолевые клетки проявляли чувствительность к антибиотику, связанному с микросферами. В этом случае, вероятно, имеет место новый механизм цитотоксического действия, не свойственный в норме антрациклинам [Rogers К.Е, Tokes Z.A., 1984]. Действительно, неактивный аналог Др, 4-деметокси-7,9-диэпирубомицин, в концентрации не влиял на рост клеток лейкоза L1210, но это же производное, связанное с микросферами, подавляло рост того же штамма на 50 %, в концентрации 2,1x10" 7М. Микросферы без антибиотика в эквивалентной концентрации не оказывали влияния на рост опухолевых клеток. Кроме того, смесь микросфер, не содержащих производного, со свободным деметоксидиэпирубомицином так же не подавляла рост клеток лейкоза L1210. Авторы работы пришли к выводу, что связанные с полимером антрациклины воздействуют на клеточную мембрану, причем не характерным для свободных антибиотиков способом.

Таким образом, можно сделать два основных вывода из проанализированных фактов, подтверждающих вторую концепцию действия Др: 1. Взаимодействуя с мембраной, антибиотик в состоянии оказывать значительное влияние на регуляцию процессов внутри клетки, вплоть до продукции цитотоксических эффектов; 2. Проникновение антибиотика внутрь клетки не является необходимым условием для проявления его цитотоксичности.

На основании представленных литературных данных можно заключить, что рассматриваемые концепции механизма действия Др являются взаимодополняющими, а не противоречащими друг другу.

1.2.2. Использование конъюгатов антрациклинов для направленной терапии опухолей

Антибиотики антрациклинового ряда, в частности, Др и рубомицин, получившие широкое распространение в химиотерапии злокачественных опухолей, были использованы для создания конъюгатов с векторными белками для направленной доставки антрациклинов в ткани-мишени. Первые работы были основаны на использовании для конъюгирования водорастворимого карбодиимида ЕДС (1-этил З-(З-диметиламинопропил)-карбодиимид) [Hurwitz Е. et al., 1975; Arnon R., Sela M., 1982], однако полученные конъюгаты с моноклональными антителами были неактивны. Несколько лучшие результаты

40 показали смешанные производные, в которых один белок служил носителем Др, а другой - вектором. При этом белок - носитель Др ковалентно связывался с моноклональным антителом, способным распознавать специфические антигены на поверхности клеток-мишеней. Полученные конъюгаты проявляли активность in vitro, лишь незначительно превышающую активность свободного препарата и характеризовались повышенной иммунной реактивностью [Hurwitz Е. et al., 1975].

Для увеличения цитотоксической активности конъюгатов предпринимались попытки повышения молярного отношения антибиотик/белок в конъюгате путем использования водорастворимых декстранов в качестве аккумуляторов антибиотика. Это позволило повысить молярное отношение с 5 до 50 раз. Однако, активность таких конъюгатов была снижена по сравнению с конъюгатами, в которых белок и Др были «сшиты» непосредственно [Arnon R., Sela М., 1982]. Хорошие результаты дало использование конъюгата связанного с Др аминодекстрана, и антител NP-4 против раково-эмбрионального антигена. Молярное отношение антибиотик/белок в конъюгате составляло 20. Антигенспецифическая активность антител, входящих в состав конъюгата, сохранялась in vitro и in vivo, однако интернализация была замедлена (порядка 5 ч) [Shih L.B. et al., 1991, 1994]. При этом предполагалось, что быстрое освобождение антибиотика из состава конъюгата внутри клетки после интернализации лиганд-рецепторных комплексов положительно скажется на его активности. С этой целью для сшивки декстрана с Др использовали различные кислотолабильные спейсеры, легко распадающиеся в лизосомах. В частности, широко и успешно использовался амид cis-аконитовой кислоты для связывания Др и даунорубицина с широким набором антител [Shen W.G., Ryser J.P., 1981; Gallego J. et al., 1984; Diener E. et al., 1986; Dillman R.O. et al., 1988]. Такие конъюгаты были стабильны при рН 7 и освобождали антрациклин при рН 5, соответствующем рН в лизосомах. Все конъюгаты проявляли антигенспецифическую активность in vitro. Кислотолабильные конъюгаты Др с гидразиновыми производными декстрана по С-13 кетогруппе и моноклональными антителами проявляли как антигенсвязывающую, так и цитотоксическую активность [Hurwitz Е. et al., 1980; Arnon R., Sela M., 1982]. Активность конъюгатов морфолинодоксорубицина, полученных при помощи гидразона и оксима с антителами против рецептора фибронектина, зависела от

41 РОССИЙскорости гидролиза; конъюгаты полученные при помощи оксима оказались стабильными при значениях pH, близких к кислотности лизосомальной среды, и не обладали цитотоксической активностью. Напротив, конъюгаты, полученные при помощи ацил- или сульфанил гидразонов, были кислотолабильными и проявляли высокую цитотоксическую активность [Muller В.М. et al., 1990]. Представляется обоснованным широко отраженное в литературе мнение, что чем более кислотолабильна связь в конъюгате, и чем выше молярное отношение антибиотик/белок (в разумных пределах, так как слишком большое количество «пришитого» антибиотика затрудняет интернализацию), тем эффективнее цитотоксическое действие препарата. Однако, к сожалению, терапевтические дозы, приведенные в литературе, даже самых эффективных конъюгатов с антрациклинами всегда были близки к максимальной толерантной дозе (кумулятивная доза составляла 27,6 мг/кг по Др). Таким образом, терапевтический индекс оставался низким, поэтому преимущество использования описанных выше конъюгатов по сравнению со свободным Др следует признать незначительным.

Одним из важных факторов, которые необходимо учитывать при создании конъюгатов, является чувствительность тканей, несущих специфические рецепторы, к токсическому агенту. Например, использование конъюгатов Др с Mab BR96 против легочной карциномы L2987, которая вообще чувствительна к Др, и где антиген BR-96 высокоэкспрессирован, может быть весьма эффективным, тогда как применение против опухолей сердечного эндотелия является недопустимым из-за опасной специфической кардиомиопатии. Эффективность применения конъюгатов в значительной мере определяется размером опухолей. Так, при применении конъюгатов против небольших опухолей иногда достигается 10-кратный выигрыш в скорости накопления по сравнению со свободным препаратом, даже введенным в максимальной толерантной дозе [Trail P.A. et al., 1993]. Необходимо также добиваться устойчивости создаваемых конъюгатов к сывороточной среде для обеспечения возможности достижения антибиотиком ткани-мишени Др, связанный с моноклональным антителом дисульфидной связью, например, хотя и проявлял неплохую модельную цитотоксическую активность, оказался, тем не менее, не пригоден для клинического использования из-за плохой фармакокинетики. В противоположность этому, терапевтический индекс

42 тиоэфирсвязанных конъюгатов Mab 1Ж64-Др и Mab BR-96-Др был высок, устойчивость в сыворотке позволяла эффективно достигать мишени, в связи с чем удалось достичь кумулятивной дозы 306 мг/кг Др/пациент [Trail P.A. et al., 1993].

1.2.3. Винкаалкалоиды

Винбластин (Вб) (рис. 8) - алкалоид, содержащийся в растениях барвинок и катарантус розовый, относится к алкалоидам индольного ряда. Вб является цитостатическим веществом, обладающим противоопухолевой активностью. Механизм противоопухолевого действия объясняется способностью препарата блокировать митоз на стадии метафазы. Вб действует угнетающе на лейкопоэз и тромбоцитопоэз, существенно не влияя на эритропоэз. Применяется Вб при лимфогрануломатозе, гематосаркомах, миеломной болезни, хориокарциноме. Успех лечения во многом определяется правильным выбором схемы терапевтического применения препарата. Курс терапии начинают с дозы 0,025 мг/кг, затем дозу постепенно повышают до 0,150,3 мг/кг. Курсовая доза составляет 100-120 мг. При отсутствии эффекта применение препарата прекращают при общей дозе 50 мг. Если наблюдается терапевтический эффект, проводят, проводя длительную поддерживающую терапию, подбирая дозу, которая при регулярном применении не уменьшает уровень лейкоцитов в крови ниже Зх109/л. Препарат вводят 1 раз в 2-4 недели. винбластин: Rj = СН3 винкристин: Rj = СНО

Рис. 8. Химическая структура винкаалкалоидов.

Вб широко используется в комплексной химиотерапии опухолей в сочетании с другими противоопухолевыми препаратами.

Винкристин (Вк) (рис. 8) - алкалоид, также содержащийся в растении барвинок розовый, по своему химическому строению близок к Вб. Вк обладает цитостатической активностью, механизм которой аналогичен таковому у Вб. Препарат применяется главным образом в терапии острого лейкоза, нейробластомы, используют также в комплексной терапии лимфогранулематоза, меланомы, рака молочной железы и других опухолей. Начальная доза курса химиотерапии составляет 0,05 мг/кг, конечная - 0,15 мг/кг. При применении винкристина возможна лейкопения. Препарат можнт оказывать нейротоксическое влияние и вызывать парастезии, двигательные расстройства, очаговые поражения ЦНС. В процессе лечения необходимо тщательно наблюдать за состоянием больных, проводить анализ крови.

Наряду с Вб и Вк в настоящее время в клинике используют навельбин (винорельбин) (Нб) и виндезин (Вд).

Нб относится к классу полусинтетических винкаалкалоидов [Potier Р., 1989]. Как и другие представители этого класса Нб воздействует на клетку в фазе G2 и M [Binet S., 1989; Cros S. et al., 1989]. При I фазе клинических испытаний было установлено, что лимитирующей токсичностью при применении Нб была лейкопения III и IV степени [Mathe G. et al., 1985]. В итоге клинических исследований Нб, проведенных во Франции и Японии, была рекомендована разовая доза 30 мг/м2 1 раз в неделю [Weber В. et al., 1993; Besenval M. et al., 1989]. Нб применяют при раке легкого, молочной железы, яичников и лимфомах. При применении Нб отмечалась также нейротоксичность, которая была значительно ниже, чем у Вк и Вд. По сравнению с другими винкаалкалоидами, Нб вызывал больший процент частичных ремиссий. Сравнительное изучение Нб и Вд при немелкоклеточном раке легкого показало явное превосходство Нб [Depierre A. et al., 1989].

Наибольшее число рандомизированных исследований посвящено сравнению эффективности Нб в монорежиме и в комбинации с другими препаратами: цисплатином, карбоплатином, ифосфамидом, митомицином С, вепезидом и др. Работы, проведенные Depierre и др. [Depierre A. et al., 1993], показали большую эффективность комбинации Нб+цисплатин по сравнению с одним Нб (48% и 17% соответственно). Таким образом, результаты 2 больших

44 рандомизированных исследований показали преимущество комбинированной химиотерапии Нб+цисплатин по сравнению с одним Нб или одним цисплатином.

Нб изучается также в комбинированной химиотерапии при раке молочной железы с Др, фарморубицном, митоксантроном, 5-фторурацилом. Была отмечена высокая активность Нб в комбинированной химиотерапии с антрациклинами, цисплатином, митоксантроном, таксанами [Blajman С. et al, 1993; Dabaja В.S. et al., 1995; Bruni S.S. et al., 1993; Kourousis C. et al., 1996]. В настоящее время также ведутся исследования роли Нб в адъювантной и неоадъювантной химиотерапии рака молочной железы, а также в комбинации с гормональной терапией.

Вд - первый полусинтетический винкаалкалоид, который был предложен для клинического применения. Его химическое название - дезацетил винбластин-амид сульфат. Структурно он очень схож с естествеными алкалоидами - Вк и Вб и отличается от последних наличием виндолинового кольца [Dyke R.W. et al., 1979].

Механизм действия Вд еще до конца не ясен. Как и другие барвинковые алкалоиды - Вк и Вб, Вд вызывает остановку клеточного деления в метафазе митоза. Кроме того, исследования in vitro показали, что Вд предупреждает инвазию злокачественных клеток в нормальную ткань [Nelson R.L. et al., 1979]. Однако, сравнительное изучение этих трех алкалоидов выявило резкие различия их действия на молекулярном уровне. Показано, что Вд в 3 раза эффективнее, чем Вк, и почти в 10 раз эффективнее, чем Вб; он останавливает митоз от 10 до 15 % клеток в культуре ткани. В дозах, останавливающих митоз от 40 до 50% клеток, Вд и Вк были примерно одинаково эффективны, причем оба оказались в три раза активнее Вб. Кроме того, между этими тремя алкалоидами отмечены качественные различия. Под действием низкой дозы Вб в препарате исследуемых клеток преобладают клетки в постметафазе, в которых отчетливо видны клеточная пластинка и хромосомы. Для клеток, обработанных Вк, напротив, характерна "шаровидная" метафаза с компактными хромосомами внутри сморщенного веретена. В отличие от Вб, Вд вызывает появление очень небольшого количества клеток в постметафазе. Клетки, обработанные Вд, имеют набухшие веретена с разбросанными хромосомами, которые резко отличаются от плотно упакованных хромосом в клетках, обработанных Вк

Rahmani В. et al., 1985; Bodey G.P. et al., 1980; Binet S., 1990; Bayssas M. et al., 1980].

Вд проявляет онколитическую активность у больных при рецидивах, возникших на фоне комбинированного лечения несколькими препаратами, включая Вк. Как у лабораторных животных, так и у человека, главная роль в экскреции Вд принадлежит желчевыводящей системе [Rahmani В. et al., 1985]. В предклинических испытаниях было показано, что Вд обладает противоопухолевой активностью, сходной с Вк, но большей, чем у Вб, при остеосаркому Риджуэя, лимфосаркоме Гарднера и карциноме 755 молочной железы. На линиях немелкоклеточного рака легкого и рака желудка было показано, что Вд проявлял одинаковую активность с Вб, но более высокую, чем Вк. Активность Вд при лейкемии Р388 была в 3 раза больше, чем у Вк и в 10 раз выше, чем у Вб [Barnett C.J. et al., 1978; Cros S. et al., 1989]. При I фазе клинических испытаний Вд было отмечено, что дозолимитирующей токсичностью является нейтропения. После более чем 30-летних клинических исследований остался нерешенным вопрос об оптимальном режиме комбинированной химиотерапии с включением Вд при немелкоклеточном раке легкого [Sorensen G.B. et al., 1987]. В настоящее время Вд применяется как в монорежиме, так и при комбинированной терапии рака молочной железы, опухолей головы и шеи, меланом, лейкозов и лимфогранулематозов [Cersosimo R.J. et al., 1983].

1.2.4. Конъюгаты с винкаалкалоидами

Большинство конъюгатов с винкаалкалоидами было получено на основе антител к 40 кДа гликопротеину, экспрессированному на поверхности клеток многочисленных карцином, таких как карцинома легких, толстого кишечника, яичников, желудка и др. В литературе эти антитела обозначаются Mab KS 1/4. При испытании полученных конъюгатов in vitro и в отношении человеческих опухолей, перевитых иммунодифецитным мышам была продемонстрирована их антигенспецифическая активность [Johnson I S. et al., 1987; Johnson D.A. et al., 1990; Gutowski 1991, Starling J.J. et al., 1992]. Конъюгаты с дезацетилвинбластином и с дезацетилвинбластингидразидом, проявляли также противоопухолевую активность на моделях с перевитыми человеческими опухолями, причем второй оказался более эффективным [Johnson I.S. et al.,

1987]. Более низкая активность дезацетилвинбластинового конъюгата связана с его большей лабильностью, что с учетом медленной интернализации комплекса с целевым антигеном ведет к высвобождению алкалоида из препарата на поверхности клетки [Starling J.J. et al., 1988, 1992].

В работе [Johnson I.S. et al., 1987] определили терапевтический индекс, то есть отношение максимальной толерантной дозы к минимально эффективной, для конъюгата с гидразидом дезоксивинбластина. Он оказался примерно равен 2,5. Тем не менее, этот конъюгат нельзя признать оптимальным для клинического применения, так как в диапазоне эффективных доз (40-250мг/м2) наблюдается высокая общая токсичность препарата. К тому же отмечена стимуляция конъюгатом системы комплемента [Schneck D. et al., 1989] и зафиксирована повышенная иммуногенность этого конъюгата [Petersen В.H. et al., 1991]. Таким образом, представляется необходимым дальнейшие исследования винкаалкалоидов в качестве цитотоксических компонентов средств направленного действия для терапии злокачественных опухолей. Необходим также поиск векторных молекул, способных эффективно доставлять винкаалкалоиды в опухолевые клетки.

1.2.5. Фталоцианины как агенты для фотодинамической и темновой (каталитической) терапии

В качестве соединений для синтеза конъюгата с ЭФР, перспективным является использование ряда фталоцианинов (ФЦ): фталоцианина AI как агента для фотодинамической терапии (ФДТ); фталоцианина Со и терафтала как агентов для темновой (каталитической) терапии [Van Hillegersberg R. et al., 1994; Daniell M.D. et al., 1991]. В основе ФДТ лежит использование фотосенсибилизаторов - веществ порфиринового ряда или порфириноподобных соединений, которые активируются и приобретают цитотоксические свойства только при облучении их светом определенной длины волны [Moan J., 1990].

ФДТ является одним из быстро развивающихся направлений практической онкологии [Kessel D., 1992]. Несмотря на то, что концепция ФДТ существует уже давно и используется в лечении ряда заболеваний, например, псориаза [Grand A. et al., 1993], лишь недавно началась разработка таких фотосенсибилизаторов, которые могут быть пригодны для лечения

47 злокачественных новообразований. В 1978 году в США были проведены первые широкие клинические испытания метода ФДТ, который оказался наиболее эффективным при лечении поверхностно расположенных опухолей кожи, мочевого пузыря, бронхов, женских половых органов, головы и шеи, пищевода и желудка [Van Hillegersberg R. et al., 1994]. В настоящее время в клиниках различных стран мира в качестве фотосенсибилизаторов используются гематопорфирины (фотофрин-1, фотосан). Первую фазу клинических испытаний в настоящее время проходят новые классы фотосенсибилизаторов, таких как фталоцианины и хлорины [Соколов В.В. и др., 1995; Якубовская Р.И. и др., 1997]. ФДТ может быть использована как самостоятельное направление, так и в комплексе с общепринятыми хирургическим лечением, радио- и химиотерапией. Возможно, ФДТ станет значительным шагом в терапии опухолей разного происхождения, так как к фотодинамическому процессу чувствительны клетки любой ткани [Moan J., 1990]. Этот способ лечения, вероятно, поможет решению такой проблемы современной онкологии, как проблема множественной лекарственной резистентности [Сергеева Н.С. и др., 1996]. Преимуществом ФДТ является отсутствие таких осложнений химио- и радиотерапии, как цитопения, интоксикация организма, тканевая атрофия. ФДТ практически атравматична, и единственное в чем нуждается больной из-за наличия небольших болевых ощущений в процессе лечения - это в мягкой постпроцедурной анальгезии. Через несколько дней после облучения опухоль подвергается некрозу, а через 2-3 недели происходит заживление раны путем реэпителизации [Peng Q. et al., 1991 d]. Побочным эффектом ФДТ является повреждение нормальных тканей организма при облучении опухоли и повреждение кожи и глаз естественным светом [Peng Q. et al., 199led]. Снизить риск фотосенсибилизации возможно применением тех препаратов, которые не накапливаются в коже и других нормальных тканях, быстро выводятся из организма, а также повышением избирательности их действия путем использования векторных молекул. Чтобы избежать поражения нормальных тканей при облучении для ФДТ используются лазерные источники, фокусирующиеся непосредственно на опухоль [Novodarova G.N. et al., 1996]. Другим недостатком фотосенсибилизаторов как терапевтических средств является невозможность их применения при локализации опухоли в участках, недоступных для подведения источника света. Использование темновой

48 каталитической) терапии с применением производных фталоцианинового ряда - фталоцианина Со (ФЦ(Со)) и терафтала Со (ТФ (Со)) может значительно расширить возможности метода лечения опухолей более глубокой локализации [Соколов В.В. и др., 1995].

Химическая структура и основные свойства фталоцианипов

На сегодняшний день существуют два поколения фотосенсибилизаторов. Фотосенсибилизаторы первого поколения (фотогемы) представляют собой производные гематопорфирина (ГП), а второго поколения (фотосенсы) -производные фталоцианина и хлорина. В настоящее время фотогемы и ряд фотосенсов проходят 2-ю и 1-ю фазы клинических испытаний соответственно [Соколов В.В. и др., 1995].

Наиболее широко использующимся представителем первого поколения фотосенсибилизаторов является фотофрин. Этот препарат стал первым разрешенным для клинических испытаний фотосенсибилизатором. Несколько тысяч пациентов прошли курс ГП - опосредованной терапии, которая была высоко эффективной для ранних и поверхностно расположенных форм рака [Spikes J.D. et al., 1986; Якубовская Р.И. и др., 1997]. Несмотря на успешное применение этих препаратов в клинике, продолжаются поиски новых фотосенсибилизирующих агентов. Причина поиска заключается, во-первых, в том, что используемое в настоящее время производное гематопорфирина является сложной смесью, в следствие чего метод до сих пор остается весьма эмпирическим. А во-вторых, поиски проводятся с целью повышения эффективности фотодеструкции опухоли, которая может быть достигнута при использовании фотосенсибилизаторов, имеющих полосы поглощения с высоким коэффициентом экстинкции в дальней красной и ближней инфракрасной областях (с увеличением длины волны увеличивается глубина проникновения света в ткани) [Ris H.В. et al., 1993].

Второе поколение фотосенсибилизаторов является более перспективным, так как его представители обладают более оптимальными свойствами для использования в терапии, чем препараты первого поколения, а именно, большей селективностью к опухолевым тканям, меньшей токсичностью и лучшими фотофизическими параметрами [Ris Н.В. et al., 1993]. Так, эти препараты имеют более сдвинутый в правую сторону максимум поглощения (для фталоцианинов

670 нм, для хлоринов - 652 нм) по сравнению с максимумом поглощения ГП (630 нм), что позволяет свету проникать в ткань на большую глубину. Во-вторых, коэффициент молярной экстинкции фотосенсов (для ФЦ(А1) - 95600 М~ ' см"1 при 670 нм) превосходит коэффициент молярной экстинкции компонентов ГП (2-3000 М-1 см"1 при 625 нм). Из группы активно изучаемых фотосенсов одним из наиболее перспективных является фталоцианин А1 (ФЦ(А1)) (рис. 9). Два других представителя фталоцианинового ряда - ФЦ(Со) и ТФ(Со) (рис. 9) могут использоваться для темновой терапии. К преимуществам ФЦ следует отнести то, что они легко синтезируются, резистентны к химическому и фотофизическому разрушению (ФЦ(А1)), низкотоксичны, легко проникают через мембрану клетки. Кроме того, ФЦ(А1) обладает оптимальными фотофизическими параметрами, а именно, продуцируют долгоживущее триплетное состояние и имеет пик поглощения в красной области спектра (670 нм) с высоким коэффициентом экстинкции [Peng Q. et al., 1991abd],

Me = Al : алюминий (II) (дисульфохлорид) фталоцианин Me = Co: кобальт (II) (дисульфохлорид) фталоцианин ноос соон кобальт (Ii) (октакарбокои) фталоцианин (терафтал)

Рис. 9. Химическая структура фталоцианинов.

Механизм действия фотодинамической и темповой (каталитической) терапии

Механизм действия фотосенсибилизаторов разных классов (гематопорфирины, фталоцианины, хлорины) сходен. В основе цитотоксического действия фотосенсибилизаторов лежит их преимущественное накопление в опухолевых тканях и последующая активация препаратов при облучении светом соответствующей длины волны в красной части спектра [Peng Q. et al., 1991Ь]. Цитотоксичность реализуется, главным образом, через фотоокислительные реакции двух типов [Valenzeno D., 1987; Salet С. et al., 1990]. Фотоокисление 1-го типа включает прямую реакцию возбужденного сенсибилизатора с субстратом, что приводит к образованию переходных радикалов, которые далее вступают в реакцию с кислородом. В реакции второго типа энергоперенос происходит из возбужденного триплетного состояния сенсибилизатора на молекулы кислорода с образованием синглетного кислорода [Valenzeno D., 1987], который далее вступает в реакцию с субстратами, поддающимися окислению. Кроме прямого фотохомического воздействия на опухолевые клетки, в процессе деструкции тканей при ФДТ играют роль другие механизмы: нарушение кровоснабжения опухолевой ткани за счет повреждения эндотелия кровеносных сосудов, гипертермический эффект, связанный с активным поглощением света опухолевыми клетками, цитокиновые реакции, обусловленные стимуляцией продукции фактора некроза опухоли, активацией макрофагов, лейкоцитов и лимфоцитов [Gomer C.J. et al., 1984].

Изучение внутриклеточной локализации ФЦ показало, что фотосенсибилизатор преимущественно связывается с мембранами (плазматической, митохондриальной, ядерной и мембраной шероховатого эндоплазматического ретикулума) [Valenzeno D., 1987], накапливается в лизосомах, митохондриях и, в некоторых случаях, в ядре [Salet С. et al., 1990, Rousseau J. et al., 1991; Miller К. et al., 1994]. Избыточное количество синглетного кислорода, образующееся в ходе фотодинамического процесса, приводит к формированию окисленных форм липидов, взаимодействует с индольными кольцами гистидина, триптофана, гуанина, с SH-группами белков. Таким образом, в результате фотодинамического процесса нарушается структура и функция жизненно важных биомолекул, мембран, внутриклеточных

51 органелл, что приводит к гибели клеток [Peng Q. et al., 199lab; Rousseau J. et al., 1991].

Генерация синглетного кислорода зависит от фотофизических свойств фотосенсибилизатора и условий оксигенации ткани. Для перехода кислорода из основного триплетного состояния в синглетное, необходима энергия, равная 94 кДж/моль [Valenzeno D., 1987]. В фотодинамическом процессе эта энергия доставляется фотосенсибилизатором, который под воздействием света определенной длины волны возбуждается до высокоэнергетического состояния. Процесс передачи энергии показан на рис. 10.

Рис. 10 (по [Moan J., 1990]). синглетное состояние фотосенсибилизатора А hv триплетное состояние фотосенсибилизатора

94 кДж

Окисление липидов гуанина триптофана гистидина

Таким образом, эффективными фотосенсибилизаторами являются лишь те, которые способны испускать энергию более 94 кДж/моль, и иметь максимум поглощения при длине волны менее 850 нм [Moan J., 1990]. Для нормального протекания фотодинамического процесса важны и ряд других фотофизических параметров. Один из них - время жизни триплетного состояния фотосенсибилизатора. Если оно короткое, то триплет не сможет эффективно передавать свою энергию кислороду. Другой важный параметр - глубина проникновения света вглубь ткани. Свет с длиной волны, соответствующей красной части видимого спектра (600-850 нм), проникает более глубоко (около 1 см), чем свет, соответствующий более коротковолновой части спектра (400600 нм), который проходит лишь в поверхностный слой ткани. Следовательно,

52 фотосенсибилизаторы, имеющие максимум поглощения в районе 600-850 нм являются наиболее оптимальными для ФДТ и позволят лечить опухоли, находящиеся на глубине около 1 см от облучаемой поверхности [Moan J., 1990].

В основе темновой (каталитической) терапии опухолей лежит использование таких производных ФЦ, как ФЦ(Со) и ТФ(Со). Механизм цитотоксического действия данных ФЦ заключается в их избирательном накоплении в опухолевой ткани и повреждении клеток в результате комбинированного взаимодействия этих препаратов с восстановителем, например, с аскорбиновой кислотой [Gomer C.J. et al., 1984; Novodarova G.N. et al., 1996]. Однако, детальный механизм цитотоксического действия ФЦ(Со) и ТФ(Со) до настоящего времени неясен.

Применение фталоцианина Al в качестве противоопухолевого препарата в клинике

Фталоцианин А1 в настоящее время проходит 1-ю фазу клинических испытаний в МНИОИ им. П.А.Герцена, Москва, Россия [Якубовская Р.И. и др., 1997]. Согласно результатам ФДТ, полной регрессии (ПР) опухоли удалось добиться в 68,1% случаев, частичной регрессии - в 25,5%, ограниченной регрессии - в 5% , терапевтический эффект отсутствовал лишь в 1,4% случаев. Наиболее эффективным метод ФДТ оказывается у больных базальноклеточным раком кожи (ПР в 96,9% случаев) и в группе пациентов с ранними формами рака полостных органов (ПР опухоли у 100% больных при раннем раке полости рта, трахеи, бронхов и мочевого пузыря; у 89%) - при раннем раке пищевода; у 75% - при раннем раке желудка) [Якубовская Р.И. и др., 1997].

Для проведения ФДТ в зависимости от локализации и размеров опухоли применяются три способа подведения лазерного источника излучения к пораженному участку ткани: поверхностное облучение, внутритканевое облучение с внедрением источника в опухолевую ткань и смешанное облучение. Для подведения света к опухолям внутренних органов применяются источники, введенные через канал фиброэндоскопа. Расчет дозы лазерного облучения осуществляется с учетом размеров, локализации опухоли, расстояния между световодом и поверхностью ткани. Основными параметрами воздействия являются: плотность поглощенной световой энергии (в Дж/см2), доза фотосенсибилизатора в (мг/кг), мощность излучения на выходе световода (в

53 мВт), расстояние от световода до опухоли и диаметр светового пятна (в см), время облучения (в мин) [Якубовская Р.И. и др., 1997]. Условия клинических испытаний ФЦ(А1) в сравнении с фотофрином приведены в таблице 3.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гуманов, Сергей Георгиевич, Москва

1. Богуш Т А., Шубина И.Ж., Смирнова Г.Б., Сыркин А.Б., Богуш Е.А. Прижизненная количественная оценка внутриклеточного распределения доксорубицина в опухолевых клетках. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1995. №11. с. 518-521.

2. Никольский И.Н., Соркин А.Д. Сорокин А.Б. Эпидермальный фактор роста. //Л.: Наука, 1987. 200 с.

3. Северин С.Е., Катуков В.Ю., Муйжнек Е.Л., Северин Е.С. Проблемы избирательной регуляции клеточной активности от фундаментальных основ к практическим результатам // Вопр. биол., мед.,фарм. химии. 1998. №1. С. 6-15.

4. Сергеева Н.С., Стороженко И.В., Маршутина Н.В. Множественная лекарственная устойчивость как один из возможных механизмов клинической химиорезистентности опухолей человека. // Российский онкологический журнал. 1996. №3. С. 51-55.

5. Соколов В.В., Страндако Е.Ф., Жаркова H.H. и др. Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей основных локализаций с препаратами фотогем и фотосенс (результаты 3-летних наблюдений) // Вопросы онкологии,- 1995,- т.41,- №2,- С.134-138.

6. Тараховский A.M., Жмарева E.H., Ромоданов С.А. Роль системы образования и детоксикации супероксидных радикалов в механизме противоопухолевого эффекта адриамицина // Бюллетень, экспер. биол. 1983. Т.96. №11. С. 86-88.

7. Тренин A.C. Исследование репарации повреждений ДНК, вызываемых противоопухолевым антибиотиком карминомицином. // Вестн. АМН СССР. 1981. №5. С. 71-75.85

8. Эммануэль Н.М., Богданов Г.Н, Орлов B.C. Свободнорадикальные механизмы в цитотоксическом действии противоопухолевых антибиотиков //Успехи химии. 1984. Т.53. №12. С. 1929-1958.

9. Якубовская Р.И., Соколов В.В., Немцова Е.Р. и др. Влияние фотодинамической терапии на состояние иммунной системыи антиоксидантный статус у онкологических больных // Российский онкологический журнал,- 1997,- №4,- С.27-32.

10. Arcamone F. Doxorubicin, Anticancer antibiotics // New York: Acad. Press, 1981,-369p.

11. Arnon R., Sela M. In vitro and in vivo efficacy of conjugates of daunomycin with antitumor antibodies. // Immunol. Rev. 1982. Vol. 62. P. 5-27.

12. Bachur N.R., Gordon S.L., Gee M.V. et al. NADFH cytochrome P-450 reductase activation of quinone anticancer agents to free radicals // PNAS USA. 1979. Vol. 76(2). P. 954-957.

13. Baldini N., Scotlandi K., Shikita T. et al. Nuclear immunolocalization of P-glicoprotein in multidrug-resistant cell lines showing similar mechanisms of doxorubicin distribution. //Eur J Cell Biol. 1995. Vol. 68. P. 226-239.

14. Baldwin G. S. Epidermal growth factor precursor is related to the translation product of the Moloney sarcoma virus oncogene mos // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. Vol. 82. P. 1921-1925.

15. Barnes D., Colowick S. P. Stimulation of sugar uptake in cultured fibroblasts by epidermal growth factor (EOF) and EGF-binding arginine esterase // J. Cell. Physiol. 1976. Vol. 89. P. 633-640.

16. Barnett C.J., Cullinan G.J., Gerzon K. et al. Structure activity relationship of dimeric Catharanthus alkaloids. Deasacetylvinblastine amide (vindesine) sulfate // J. Med. Chern. 1978. Vol. 21. P. 88-96.

17. Bayssas M., Gouveia J., Ribaud P. et al. Phase II trial with vindesine for regression induction in patients with leukemias and hematosarcomas // Cancer Chemother. Pharmacol. 1980. Vol. 2. P. 247-255.

18. Beguinot L., Lyall R., Willingham M., Pastan I. Down regulation of the epidermal growth factor receptor in KB cells is due to receptor internalization and subsequent degradation in lysosomas // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 2384-2388.86

19. Besenval M., Delgado M., Demaretz J.P. et al. Safety and tolerance of navelbine in phase I-II clinical studies// Semin. Oncol. 1989. Vol. 16. P. 37-41.

20. Binet S., Fellous A. et al. In situ analysis of the action of navelbine on various types of microtubules using immunofluorescence// Semin. Oncol. 1989. Vol.16. P 5-8.

21. Binet S., Chalneau E., Fellous A. et al. Immunofluorescence study of the action of navelbine, vincristine and vinblastine on mitotic and axonal microtubules // Int. J. Cancer. 1990. Vol. 46(2). P. 262-266.

22. Blajman C., Balbiani L., Block J. et al. Navelbine (N) and adriamycin (A) versus FAC in advanced breast cancer // Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 1993. Vol. 12. P.92.

23. Bodey G.P., Yap H.Y., Yap B.S. et al. Continous infusion of vindesine in solid tumors // Cancer Treat. Rep. 1980. Vol. 7. P. 39-47.

24. Boonnstra J, De Laat S.W., Ponec M. Epidermal growth factor receptor exspression related to differentiation capacity in normal and transformed keratinocytes // Exp.Cell.Res. 1985. Vol. 161. P.421-433.

25. Brissenden B. E., Ullrich A., Francke U. Human chromosomal mapping of genes for insulin-like growth factors I and II and epidermal growth factor // Nature. 1984. Vol. 310. P. 781-784.

26. Brown G., Twardzik D. R., Marquardt H., Todaro G. J. Vaccinia virus encodes a polypeptide homologous to epidermal growth factor and transforming growth factor //Nature. 1985. Vol. 313. P. 491-492.

27. Brox L., Gowans B., To R. et al. The effect of anoxia on anthracycline induced DNA damage in the RPMI 6410 human lymphoblastoid cell line // Canad. J. Biochem. 1982. Vol. 60(9). P. 873-876

28. Bruni S.S., Silvestro P., Casparro M.E. et al. Mitoxantrone and vinorelbine in salvage chemotherapy of antracycline refractory advanced breast cancer // Eur. J. Cancer. 1993. Vol. 29A (6). A. 449.

29. Burgess A. W., Lloyd C. I., Nice E. C. Murine epidermal growth factor heterogeneity on high resolution exchange chromatography // EMBO J. 1983. Vol. 2. P. 2065-2069.

30. Burmeister M., Avivi A., Schlessinger J., Soreq H. Production of EGF-containing polypeptides in Xenopus oocytes microinjected with submaxillary gland mRNA // EMBO J. 1984. Vol. 3. P. 1489-1505.

31. Burwen S. J., Barker M, E., Goldman I. S. et al. Transport of epidermal growth87factor by rat liver; Evidence for a nonlysosomal pathway // J Cell Biol. 1984. Vol. 99. P. 1259-1265.

32. Capranico G., Riva A., Tinelli S. et al. Marcedly reduced levels of antracycline-induced DNA strand breaks in resistant P388 leukemia cells and isolated nuclei // Cancer Res. 1987. Vol. 47. P. 3752-3755.

33. Capranico G., Tinelli S., Zunino F. Formation, resealing and persistance of DNA breaks produced by 4-demethoxydaunorubicin in sensitive and resistant P388 cells. // Chemico-biological Interactions. 1989. Vol. 72. P. 113-116.

34. Capranico G., de Isabella P., Penco S., Tinelli S., Zunino F. Role of DNA breakage in cytotoxisity of doxoaibicin, 9-deoxydoxorybicin, and 4- demethyl-6-deoxydoxorubicin in murine leukemia P388 cells. // Cancer Res. 1989. Vol. 49. P. 2022-2025

35. Capranico G, Jaxel C., Roberge M. et al. Nucleosome positioning as a critical determinant DNA topoisomerase II in reconstituted simian virus 40 chromatin. // Nucleic Acid Res. 1990. Vol. 18. P. 4553-4559.

36. Carpenter G. Regulation of EGF receptor activity during the modulation of protein synthesis//J Cell. Physiol. 1979. Vol. 99. P. 101-106.

37. Carpenter G. Cohen S. 125I-labeled human epidermal growth factor (hEGF): Binding, internalization, and degradation in human fibroblasts // J. Cell Sci. 1976. Vol. 71. P. 159-171.

38. Carpenter G., Lembach K. 1., Morrison M. M., Cohen S. Characterization of the binding of 12;,I-labeled epidermal growth factor to human fibroblasts // J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250. P. 4297-4304.

39. Carpentier J.-L., White M. F., Orel L., Kahn R. C. Direct visualization of the phosphorylated epidermal growth factor receptor during its internalization in A431 cells//J. Cell Biol. 1987. Vol. 105. P. 2751-2762.

40. Cersosimo R.J., Bromer R., Licciardello J.T. et al. Pharmacology, clinical efficacy and adverse effects of vindesine sulfate, a new vinca alkaloid // Pharmacotherapy. 1983. Vol. 3. P. 259-274.

41. Cohen S., FavaR. Internalization of functional epidermal growth factor: receptor/ kinase complexes in A431 cells//J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 12351-12358.

42. Comens P. G, Simmer R. L., Baker J. B. Direct linkage of 125I-EGF to cell surface receptor. A useful artifact of chloramine T treatment // J. Biol. Chem. 1982. Vol. 257. P. 42-45.88

43. Cros S., Wright M., Morimoto C. et al. Experimental antitumor activity of navelbine (5'-Noranhydrovinblastine, vinorelbine) // Semin. Oncol. 1989. Vol. 16. P. 15-20.

44. Dabaja B.S. et al. Treatment of metastatic breast cancer with vinorelbine and cisplatin: a clinical phase II trial // Proc. 5th Int. Congress Anti-Cancer Chemother. 1995. P. 241.

45. Daniell M.D., Hill J.S. A history of photodynamic therapy // Austraian and New Zealand Journal of Surgery.- 1991,- 61.-P. 340-348.

46. Das M. Epidermal growth factor receptor and mechanisms for animal cell division // Curr. Top. Membranes Transp. 1983. Vol. 18. P. 381—405.

47. Davis R. I., Czech M. P. Amiloride directly inhibits growth factor receptor tyrosine kinase activity//! Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 2543—2551.

48. Demant E.J.F. Binding of adriamycin-Fe3+ complex to membrane phospholipids //Eur. J. Biochem. 1984. Vol. 142(3). P. 571-575.

49. Depierre A., Lemarie E., Dabouis G. et al. Efficacy of navelbine (NVB) in non-small cell lung cancer (NSCLC) // Semin. Oncol. 1989. Vol. 16. P. 33-36.

50. Depierre A. et al. Result og a phase III randomized study of Vinorelbine (V) versus Vinorelbine-Cisplatin (VP) in non small cell lung cancer (NSCLC) // Proceedings ASCO. 1993. Abst. 1138. P. 340.

51. Diener E. et al. Specific immunosupression by immunotoxins containing daunomycin // Science. 1986. Vol. 231. P. 148-150.

52. Dillman R. O., Jonson D. E., Shawler D. L., Koziol J. A. Superiority of an acid-label Daynorubicin-monoclonal antibody conjugate compared to free drug. // CanserRes. 1988. Vol. 48. P.6097-6102.

53. Doroshow J. H. Effect of anthracycline antibiotics on oxygen radical formation in rat heart // Cancer Res. 1983. Vol. 43(2). P. 460-472.

54. Dyke R.W., Nelson R.L. et al. Vindesine: a short review of preclinical and first clinical data // Cancer Chemother. Pharmacol. 1979. Vol. 2. P. 229-232.

55. Eliot H., Gianni L., Myers C. Oxidative destruction of DNA by the adriamycin-iron complex // Biochemistry. 1984. Vol. 23(5). P. 928-936.

56. Fisher J., Ramakrishnan K., Becvar J.I., Direct enzyme-catalyzed reduction of anthracyclines by reduced nicotinamide adenin dinucleotide // Biochemisry. 1983. Vol. 22(6). P. 1347-1355.89

57. Frey P., Forand R., Maciag T., Shooter E. The biosynthetic precursor of epidermal growth factor and the mechanism of its processing // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 76. P. 6294-6298.

58. Gallego J., Price M. R., Baldwin R W. Preparation of four daunomycin monoclonal antibody 791T/36 conjugates with antitumor activity. // Int. J. Cancer. 1984. Vol 33. P. 737-744.

59. Gause G.F., Dydnik Y.V. Antitumor antibiotics // In Clinical Chemotherapy. Antineoplastic chemotherapy. New York: Thieme Stratton. 1984. Vol.3. P.205-223.

60. Goldin A., Johnson R. K. Antitumor effect of adriamycin in comparison with related drugs, and in combination chemotherapy // In: Adriamycin review. Ghent: European Press Medikon. 1975. P. 37-54.

61. Goldin A., Johnson R. K. Experimental tumor activity of adriamycin. (NSC-123127) //Cancer Chemother. Rep. 1975. Vol. 6(2). P. 137-145.

62. Gomer C.J., Rasum N.J. Acute skip response in albino mice following porphirin photosensitization under oxic and anoxic continions // Photochem. Photobiol -1984.-40.-P. 435-444.

63. Grand A., Gasparro F. Present and future ases of photochemotherapy in medicine // Spectrum.- 1993,- №6.-P. 28-30.

64. Green M. R, Mycock C., Smith C. G, Coachman J. R. Biochemical and ultrastructural processing of 123I epidermal growth factor in rat epidermis and hair fallicles : Accumulation of nuclear label // J. Invest. Dermatol. 1987. Vol. 88. P. 259-265.

65. Gullick W. J., Downward /., Waterfield M. D. Antibodies to the autophosphory-lation sites of the epidermal growth factor receptor protein-tyrosine kinase as probes of structure and function // EMBO J. 1985. Vol. 4. P. 2869—2877.

66. Gutowski M. C., Briggs S. L., Johnson D. A. Epidermal Growhth factor receptor-reactiv monoclonal antibodies: Xenograft antitumor activity alon and as drug immunoconjugates. //Cancer Res. 1991. Vol. 51. P.5471-5475.

67. Haigler H.T., Ash J.F., Singer S.J. Visualization by fluorescence of the binding and internalization of epidermal growth factor in human carcinoma cells A-431 // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. Vol. 75. P. 3317-3321.90

68. Haigler H. T., End D., Kempner E. Molecular size of the epidermal growth factor receptor-kinase as determined by radiation inactivation // J. Biol. Chem. 1985a. Vol. 260. P. 2178-2184.

69. Haigler H. T., Wiley H. S., Moehring }. H., Moehring J. M. Altered degradation of epidermal growth factor in a diphtheria toxin-resistant clone of KB cells // J. Cell. Physiol. 1985b. Vol. 124. P. 322-330.

70. Hollenberg M. D., Gregory H. Epidermal growth factor-urogastrone: biological activity and receptor binding of derivatives // Mol. Pharmacol. 1980. Vol. 17. P. 314-320.

71. Holliday L. A., Savage C. R., Cohen S., Puett D. Conformation and unfolding thermodynamics of epidermal growth factor and derivatives // Biochemistry. 1976. Vol. 15. P. 2624-2633.

72. Hurwitz E., Levy, R., Mavon R. et al. The covalent binding of daunomycin and adriamycin to antibodies with retention of both drug and antibody activities. // Cancer Res. 1975. Vol. 35. P.l 175-1181.

73. Hunter T., Gould K. L., Cooper /. A. Tyrosine protein kinases, viral transformation and the control of cell proliferation // Biochem, Soc. Trans. 1984. Vol. 12. P. 757—759.

74. Hunter T., Karin M. The regulation of transcription by phosphorilation // Cell. 1992. Vol. 70. P. 375-387.

75. Hurwitz E., Wilchek M., Pitha J. Soluble molecules as carriers for dounorubicin. // J. Appl. Biochem. Vol. 32., p. 25-35.

76. Ito F., Ito S., Shimizu N. Transmembrane delivery of polypeptide growth factors bypassing the intrinsic cell surface receptors: synthesis and biological activity of a conjugate of EOF with a,IA // Cell Struct. Funct. 1985. Vol. 9. P. 105-115.

77. Jinno H., Masakazu U., Ozawa S. et al. Epidermal growth factor receptor-dependent cytotoxic effect by an EGF-ribonuclease conjugate on human cancer cell lines. //Cancer Chemother. Pharmacol. 1996. Vol. 38. P. 303-308.

78. Johnson D. A., Baker A. L., Laguzza B. C. et al. Antitumor activity of L/1C2-4-desacetylvinblastine-3-carboxhydrazide immunocojugate in xenografts. // Cancer Res. 1990. Vol. 50. P. 1790-1794.

79. Johnson I. S., Spearman M. E., Todd G. C. et al. Monoclonal antibody drug conjugates for site-directed cancer chemotherapy: Preclinical pharmacology and toxicology studies. // Cancer Treat. Rev. 1987. Vol. 14. P. 193-196.91

80. Kanter P.M., Schwartz H. S. Effects of N-trifluoroacetyladriamycin-14-valerat and related agents on DNA strand damage and thymidine incorporation in CCRF-CEM cells// Cancer Res. 1979 Vol. 39(2). P. 448-451.

81. Kennedy K.A., Stegfried J.M., Sarttorelli A.C. et al. Effect of antracyclines on oxygenated and hipoxic cells// Cancer Res. 1983. Vol. 43(1). P. 54-59

82. Kessel D. Photodynamic therapy and neoplastue disease/ / Oncology Research.-1992,- 4.-P.219-225.

83. Knauer D. /., Cunningham D. D. Epidermal growth factor carrier protein binds to cells via a complex with released carrier protein nexin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. Vol. 79. P. 2310-2314.

84. Kobayashi R., Reeve J. R, Walsh J. H. Isolation and partial characterization of canine epidermal growth factor/urogastrone//Biochem. J. 1985. Vol. 229. P. 611619.

85. Komoriya A., Hortsch M., Meyers C., Smith M., Kanety H., Schlessinger !. Biologically active synthetic fragments of epidermal growth factor: localization of a major receptor-binding region // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 1351-1355.

86. Kourousis C., Kakolyris S. et al. A preliminary report of an active salvage chemotherapy combining vinorelbine paclitaxel and CDDP in antracycline-resistant advanced breast cancer // Proc. Annu. Meet. Am. Soc. Clin. Oncol. 1996. P. 15.

87. Landreth G.E. et al. Association of the epidermal growth factor receptor kinase with the detergent-insoluble cytoskeleton of A431 cells // J. Cell Biol. 1985. Vol. 101. P. 1341-1350.

88. Liao C.W., Hseu T.H., Hwang J. A target-specific chimeric toxin composed of epidermal growth factor and Psedomonas exotoxin A with a deletion in its toxin-bindihg domain// Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. Vol. 43. P.498-507.

89. Liu L.F., Rowe T.C., Yang L., Tewey K M., Chen G.L. Cleavage of DNA topoisomerase II.//J Biol Chem. 1983. Vol. 258. P. 15365-15370.

90. Lown J.V., Hanstock C.C., Joshua A.V. et al. Structure and conformation of saframycin R determined by High field 'H and 13C NMR and its interactions with DNA in solution//J. Antibiot. 1983. Vol. 36(9). P. 1184-1194.

91. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. //J. Biol. Chem. 1951 Vol. 193. P. 265-275.92

92. Magun B. E. Planck S. R., Wagner H. N. Intracellular processing of l25I-epidermal growth factor in rat embryo fibroblasts // J. Cell. Biochem. 1982 Vol. 20. P. 259-276.

93. Marquardt H., Hunkapiller M. W., Hood L. E., Todaro G. Rat transforming growth factor type 1: structure and relation to epidermal growth factor // Science. 1984. Vol. 223. P. 1079-1082.

94. Martin-Perez J., Slegmann M.,Thomas G.,EGF, PDGF 2a and insulin induce the phosphorilation of identical S6 peptides in swiss mouse 3T3 cells: Effects of cAMP on early sites of phosphorylation. // Cell. 1984. Vol. 36. P. 287-294.

95. Mathe G., Reizenstein P. Phase I study a new vinca alkaloid Navelbine // Cancer Letters. 1985. Vol. 27. P. 285-293.

96. Matrisian L. M., Larsen B. R., Finch J. S., Magun B. E. Further purification of epidermal growth factor by HPLC // Anal. Biochem. 1982. Vol. 125. P. 339-351.

97. Mayo K. H. Epidermal growth factor from the mouse. Structural characterization by proton nuclear magnetic resonance and nuclear Overhauser experiments at 500 MHz//Biochemistry. 1984. Vol. 23. P. 3960-3973.

98. Miller K., Reich E., Grau T., Hautmann R. Uptake and phototoxic effects of aluminum-chlorophtalocyanine (AlSPc) in human bladder carcinoma cells // Urol. Res.- 1994,-22,-P. 79-83.

99. Miller K., Beardmore J. et al. Localization of the epidermal growth factor (EGF) receptor within the endosome of EGF-stimulated epidermoid carcinoma (A 431) cells // J. Cell Biol. 1986. Vol. 102. P. 500-509.

100. Minford J., Pommier Y., Filipski J. et al. Isolation of intercalator-dependent protein-linked DNA strand cleavage activity from cell nuclei and identification as topoisomerase II. //Biochemistry. 1986. Vol. 25. P. 9-13.

101. Moan J. Properties for optimal photodynamic therapy sensitizers // Journal of Photochem. And Photobiol.- 1990,- 5,- 521-524.

102. Modjtahedi H., Dean Ch. The receptor for epidermal growth factor and ligands: expression, prognostic value and target for therapy in cancar // Intern. J. Oncol. 1995. Vol. 4. P. 277-296.

103. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays. // J. Immunol. Meth. 1983. Vol. 65, P. 55-63.93

104. Mueller B. M., Wrazidlo W. A., Reisfeld R. A. Antibody cojugates with morfolynodoxorubicin and acid cleavable linkers. // Bioconj. Chem. 1990. Vol. 1. P. 325-330.

105. Myers C.E., Gianni L., Simone C.B. et al. Oxidative destruction of erythrocyte ghost membranes cataiyzed by the doxorubicine-iron complex // Biochemistry. 1982. Vol. 21(8). P. 1707-1713.

106. Neidle S., Sanderson M.R. The interactions of daunomicin and adriamicin with nucleic acids // In: Molecular aspects of anti-cancer drug action/Eds. S. Neidle, M. J. Warring. London: The Mac Millan Press. 1983. P.35-55.

107. Nelson R.L., Dyke R.W., Root M.A. et al. Clinical pharmacokinetics of vindesine // Cancer Chemother. Pharmacol. 1979. Vol. 2. P. 243-246.

108. Nexj) E., Hollenberg M. D., Figuera A., Pratt R. Detection of epidermal growth factor and its receptor during fetal mouse development // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. Vol. 77. P. 2782-2785.

109. Nohl H., Jordan W. OH generation by adriamycin semiquinone and H202: an explanation for the cardiotoxicity of antracycline antibiotics // Biochem biophys. Res. Commun. 1983. Vol. 114(1). P. 197-205.

110. Novak-Hofer L., Thomas G. An activated S6 kinase in extracts from serum and epidermal growth factor-stimulated Swiss 3T3 cells. // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 159. P. 5995-6000.

111. Novodarova G.N., Belkov V.M., Volpin M.E., Shaharova Z.A. The activation of dioxygen and homogeneous catalytic oxidation.- 1996 6th Intern. Symposium, Noordwijkerhout.- P. 215-216.

112. Peng Q., Moan J., Farrants G.W. et al. Location of P-II and A1PC34 in human tumor LOX in vitro and in vivo by means of computerencanced video fluorescence microscopy // Cancer lett.- 1991a 58 - P.37-47.

113. Peng Q., Farrants G.W., Madslien K. et al. Subcellular localisation, redistribution and photobleaching of sulfonated aiuminium phtalocyanines in a human melanoma cells line // Int. J. Cancer.- 1991b.- 49,- P.290-295.94

114. Peng Q., Moan J., Farrants G.W. et al. Localization of patent photosentizers in human tumors LOX by means of laser sanning microscopy // Cancer lett 1991c-58,- P. 17-27.

115. Petersen B.H. et al. The human immune response to KS1/4-desacetylvinblastine (LY256787) and KSl/4-desacetylvinblastine hydraside (LY203728) in sindle and multiple dose clinical studies // Cancer Res. 1991. Vol. 51. P. 2286-2290.

116. Petrides P. E., Bohlen P., Shiveiy 1. E. Chemical characterization of the two forms of epidermal growth factor in murine saliva // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1984. Vol. 125. P. 218-228.

117. Pommier Y., Zwelling L.A., Mattern M.R. et al. Effects of dimethylsulfoxide thiourea upon intercalator-induced DNA single- strend breaks in mouse leukemia (1210) cells. Cancer Res. 1983. Vol. 43(12). P. 5718-5724.

118. Potier P. The synthesis of Navelbine prototype of a new series of vinblastine derivatives // Semin. Oncol. 1989. Vol. 16. P. 2-5.

119. Potmesil M., Israel M., Silber R. Two mechanisms of adriamycin-DNA interaction in L1210 cells // Biochem. Pharmacol. 1984. Vol. 33(20). P. 31373142.

120. Quigley G.J., Wang A.H.-J., Ughetto G. et al. Molecular structure of an anticancer drug-DNA complex: daunomycin plus d(CpGpTpApCpG) // PNAS USA. 1980. Vol. 77(12). P. 7204-7208.

121. Rahmani B., Kleisbauer J.P., Cano J.P. et al. Clinical pharmacokinetics of vindesine infusion // Cancer Treat. Rep. 1985. Vol. 69. P. 839-844.

122. Rakowich-Szulczynska E., Koprowski H. Identification of NGF-receptor in chromatin of melanoma cells using monoclonal antibody to cell surface NGF receptor//BBRC. 1986. Vol. 140. P. 174-180.

123. Rao Ch., Ramani N. et al. Topography of human placental receptors for epidermal growth factor//J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 1705-1710.95

124. Ris H.B., Altermatt H.J., Stewart C.M. et al Photodynamic therapy with m-tetra-hydroxyphenylchlorin in vivo: optimization of the therapeutic index/ / Intern. Journal of cancer 1993,- 55,- P. 245-249.

125. Rogers K. E., Tokes Z A. Novel mode of cytotoxicity obtaind by coupling inactive antracycline to a polymer // Biochem. Pharmacol. 1984. Vol. 33(4). P. 605-608.

126. Rogers K. E., Carr B. I., Tokes Z. A. Cell surface-mediated cytotoxicity of polymer-bond adriamycin against drug-resistant hepatocytes // Cancer Res. 1983. Vol. 43(6). P. 2741-2748.

127. Ross W. E., Zwelling L.A., Kohn K. W. Relationship between cytotoxicity and DNA strand breakage produced by adriamycin and other intercalating agents. // Intern. J. of radiation Oncology, Biology, and Physics. 1979. Vol. 5 P 12211225.

128. Rousseau J., Boyle R.W., Maclennan A.H. et al. Biodistribution and tumor uptake of 67Ga. chlorogalliumtetraoctadecyloxy phtalocyanine and its sulfonation products in tumor bearing C3H mice // Int. J. Rad. Appl. Instrum.- 1991- 18 P. 777-782.

129. Salet C., Moreno G. Photosensitization of mitochondria. Molecular and cellular aspects. // Journal of Photochem. And Photobiol. B: Biol. 1990. Vol. 5. P. 133-150.

130. Savage C. R., Cohen S. Epidermal growth factor and a new derivative: rapid isolation procedures and biological and chemical characterization // J. Biol. Chem. 1972. Vol. 247. P. 7609-7611.

131. Savage C. R., Cohen S. Proliferation of corneal epithelium induced by epidermal growth factor//Exp. Eye Res. 1973. Vol. 15. P. 361-366.

132. Schlessinger J. Allosteric regulation of the epidermal growth factor receptors kinese//J. Cell. Biol. 1986. Vol. 103. P. 2067-2072.

133. Schneck D., Butler F. et al. Phase I studies with a murine monoclonal antibody vinca conjugate (KS1/4-DAVLB) in patients with adenicarcinoma // Antibody Immunoconj. Radiopharm. 1989. Vol. 2. P. 93-115.96

134. Schwartz H. S. Mechanism of selective cytotoxisity of adriamycin, daunomycin, and related antracyclines // In: Molecular aspects of anticancer drug action/Eds. S. Neidle, M. J. Waring. London: Mac Millan Press. 1983. P. 93-125.

135. Shen W. G., Ryser J P. cis-Aconityl spacer between daunomycin and macromolecular carriers: A model of pH sensitive linkage releasing drug from a lisosomotropic conjugate. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981. Vol. 102. P.1048-1054.

136. Shih L. B., Goldenberg D. M., Xuan H. et al. Internalization of an intact doxorubicin immunoconjugate. // Cancer Immunol. Immunother. 1994. Vol. 38. P.92-98.

137. Shih L. B., Goldenberg D. M., Xuan H. et al. Antracycline immunoconjugates prepared by a site-spesific linkage via an amino-dextran intermediate carrier. // Cancer Res. 1991. Vol 51. P. 4192-4198.

138. Semba K., Kamuta N., Toyoshima K., et al. A v-erb protooncogene, c-erb B-2 is distinct from the c-erB-l-EGF-receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. //PNAS. 1985. Vol.82. P.6497-6501.

139. Sinha B. K., Chignell C. F. Interaction of antitumor drugs with human erythrocyte ghost membranes and mastocytoma P815: a spin label study // Biochem. biophys. Res. Commun. 1979. Vol. 86(4). P. 1051-1057.

140. Soderquist A.M., Carpenter G. Glycosilation of the epidermal growth factor receptor in A-431 cells//J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259. P. 12586-12594.

141. Sorensen G.B., Osterlind K., Hansen H.H. Vinca alkaloids in the treatment of non small cell lung cancer // Cancer Treat. Rev. 1987. Vol. 14. P. 29-51.

142. Sorkin A.D. et al. The endocytosis of epidermal growth factor in A-431 cells: a pH of microenvironment and the dynamics of receptor complex dissociation // Exp. Cell Res. 1987. P. 1-14.

143. Spikes J.D., Jori G. Photodynamic therapy of tumors and others disease using porphyrins // Lasers Med. Sci 1986,- 2,- P. 3-15.

144. Starling J. J., Hinson N. A., Marder P. et al. Rapid internalization of antigen-immunocojugate complexes is not required for antitumor activity of monoclonal antibody-drug conjugates. // Antibody Immunoconj. Radiopharm. 1988. Vol. 1. P. 311-324.

145. Taylor J.M. et al. Epidermal growth factor. Physical and chemical properties. //J. Biol. Chem. 1972. Vol. 247. P. 5928-5934.

146. Teslenko L.V., Kornilova E.S. et al. Recycling of epidermal growth factor in A43 1 cells // FEBS Lett. 1987. Vol. 221. P. 105-109.

147. Tewey K. M., Rowe T. C, Yang L. at all. Adriamycin-induced DNA damage mediated by mammalian topoisomerase II. // Scence. 1984. Vol. 226. P.466-469.

148. Tewey K. M., Chen G., L., Nelson E. M., Liu L. F. Interactiv antitumor drugs interfere with the breakage-reunion reaction of mammalian DNA topoisomerase II.- J. biol. Chem. 1984. Vol. 259(14). P. 9182-9187.

149. Tokes Z. A., Rogers K. E., Rembaum A. Synthesis of adriamycin coupled polyglytaraldehyde microspheres and the evaluation of their cytostatic activity // PNAS USA. 1982. Vol. 79. P. 2026-2030

150. Tokunada A., Ouda ML, Okuda T. et al. Clinical significance of epidermal growth factor, epidermal growth factor receptor and c-erb B-2 in human gastric cancer//Cancer. 1995. Vol. 65. P. 1418-1425.

151. Trail P. A., Willner D, Lasch S. J. et al. Cure of xenografted human carcinomas by BR96-doxorubicin immunoconjugates. // Scence. 1993. Vol. 261. P. 212-215

152. Tritton T. R., Yee G. The anticancer agent adriamycin can be actively cytotoxic without entering cells // Science. 1982. Vol. 217. P. 248-250.

153. Tritton T. R. Cell surface actions of adriamycin. // Pharmac.Ther. 1991. Vol. 49. P. 293-309.

154. Valenzeno D. Photomodification of biological membranes with emphasis on singlet oxygen mechanisms // Photochem. Photobiol 1987,- 46,- P. 146-160.

155. Van Hillegersberg R., Kort W.J., Wilson J.M. Current status of photodynamic therapy in oncology//Drugs 1994.-48.-P.510-527.

156. Weber B. et al. A United States multicenter phase II trial of Navelbine in advanced breast cancer // Proceedings ASCO. 1993. Abst n 46. P. 61.

157. Werth D., Pastan I. Vinculin phosphrylation in response to calcium and phorbol esters in intact cells//J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259. P. 5264-5270.

158. Willingham M. C., Haigler H. T., Fitzgerald D. J., Gallo M. G., Rutherford A. V., Pastan I. H. The morphologic pathway of binding and internalization of epidermal growth factor in cultured cells// Exp. Cell Res. 1983. Vol.146. P. 163175.

159. Yarden Y., Gabbay M., Schlessinger J. Primary amines do not prevent the endocytosis of epidermal growth factor into 3T3 fibroblasts // Biochim. biophys. acta. 1981. Vol. 674. P. 188-203.

160. Yang M.M., Reisfeld R.A. Doxorubicin conjugated with a monoclonal antibody directed to a human melanoma-associated proteoglycan supresses the growth of established tumor xenografts in nude mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1988. Vol. 85. P. 1189-1193.

161. Zidovetski R., Yarden G. et al. Microaggregation of hormone-occupied epidermal growth factor receptors on plasma membrane preparations // Eur. Mol. Biol. Org. 1986. Vol. 5. P. 247-250.

162. Zweier J. L. Reduction of O by iron-adriamycin // J. biol. Chem. 1984. Vol. 259(10). P. 6056-6058.

Информация о работе

Гуманов, Сергей Георгиевич
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Получение и изучение биологической активности конъюгатов эпидермального фактора роста с противоопухолевыми химиотерапевтическими препаратами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы