Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление и изучение биологического действия синтетических пептидов-фрагментов интерферона α на разные популяции иммунокомпетентных клеток человека

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Выявление и изучение биологического действия синтетических пептидов-фрагментов интерферона α на разные популяции иммунокомпетентных клеток человека"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

на правах рукописи

Данилкович Алла Викторовна

УДК 612.017:'57б.535

ВЫЯВЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ - ФРАГМЕНТОВ ИНТЕРФЕРОНА а НА РАЗНЫЕ ПОПУЛЯЦИИ ИММУНОКОМПБГЕНТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

03.00.25 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1991

Работа выполнена на кафедре клеточной физиологии и иммунологии Биологического факультета . Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор ' М.В.ГУСЕВ Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

академик АМН СССР И.П.АШМАРИН доктор биологических наук А.А.КУЩ

Ведущее учреждение: НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР.

на заседании Специализированного Совета Д.053.05.68 при Московском Государственном Университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться р Научной библиотеке им. А.М.Горького, на Биологическом факультете МГУ.

Защита состоится

1992 г. в

час.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Е.Н.Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

)НОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время известно, что

интерферона (ИФН), впервые описанные как противовирусные агенты, наряду с антивирусной обладают антипролиферативной и пммуномодулирущей активностями, и способны проявлять свое действие на разных типах клеток, как в системе In vitro, так и in vivo.

Интересен факт, что несмотря на высокую гомологию по нуклеотидной и аминокислотной последовательностям, в ряду а интерферонов соотношение разных типов биологической активности сильно варьирует. Это позволило предположить существование нескольких функционально важных участков в молекуле интерферона а , a также наличие нескольких молекулярных механизмов, каждый из которых опосредует определенный вид биологической активности, проявляемой интерфероном.

В 1981 году Streuli et al. было выдвинуто предположение, что молекула а интерферона содержит по крайней мере два функционально важных эпитопа, один из которых локализован в N-, а другой - в С-концевой областях молекулы. Многочисленные экспериментальные данные подтверждают гипотезу Streuli, но до настоящего времени не известна локализация С-концевого участка, подобного участку, обнаруженному в N-концевой области молекулы интерферона а, хотя и показана его связь с биологической активностью ИФН.

Таким образом проблема структурно-функциональной организации

молекулы штерферона остается нерешенной и продолжает привлекать к себе внимание исследователей вследствие ее большого теоретического и практического значения.

ИФН а применяется в клинической практике для лечения целого ряда заболеваний ( онкологические, вирусные инфекции и др. ), но его использование ограничено из-за большого количества нежелательных побочных эффектов.

Конструирование новых молекул ИФН а, обладающих заранее предопределенными свойствами, или использование фрагментов его молекулы, обладающих узким спектром биологического действия, может расширить области практического применения ИФН и его производных.

Для решения этой проблемы используются различные методы, такие как, конструирование гибридных молекул, направленный мутагенез, протеолитическая ' фрагментация или химическая модификация молекулы.

Использование синтетических пептидных фрагментов является альтернативным подходом к решению таких задач.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы является выявление и изучение биологической активности ряда синтетических пептидов - фрагментов С-концевой области молекулы интерферона а2 человека в модельной системе 1л vitro на лимфоцитах периферической крови здоровых доноров.

Экспериментальные задачи исследования:

1 .В ряду синтетических пептидов - фрагментов С-концево? области молекулы интерферона а2 человека выявить те, которые

обладают биологической активностью и изучить их влияние на

а. пролиферативный ответ лимфоцитоз периферической крови человека, индуцированный поликлональными активаторами;

б. активность естественных киллерных клеток;

2.Сравнить действие биологически активных пептидов с .действием рекомбинаятного интерферона а2 человека в аналогичных модельных системах.

3.Определить параметры связывания биологически активных пептидов с мембранными структурами лимфоцитов периферической крови человека.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В результате настоящей работы ,впервые выявлено, что пептидный фрагмент 124-138 (2438) аминокислотной последовательности молекулы интерферона а2 человека обладает антипролифзративной активностью на лимфоцитах периферической крови человека In vitro, подобно нативной молекуле интерферона, но не влияет на активность естественных киллерных клеток, в противоположность ИФН а. Таким образом пептид 2438 является иммуномодулятором с более узким, чем у И®, спектром действия.

Показано, что биологически активный пептид 2438 специфически взаимодействует с мембранными структурами, экспрессирувдимися на лимфоцитах человека, и были определены параметры связывания.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Полученные в результате проведенных исследований . данные могут быть использованы при конструировании новых молекул 1Ш а.

облздащих заранее определенными свойствами. Кроме этого возможно практическое использование синтетического пептида 2438 в медицине как иммуномодулятора с антипролиферативнш действием. Результаты работы вносят вклад в понимание стр; ктурно-функциональных особенностей организации молекул ИФН а. Основные результаты диссертационной работы включены в курс лекций для студентов-иммунологов кафедры клеточной физиологии и иммунологии Биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации докладывались на Международном Симпозиуме " Сигналы и сигнальные процессы в иммунологии "(Венгрия, 7-11 августа 198S0, на семинаре кафедры физиологии человека и хгивотных Биологического факультета МГУ, на заседании кафедры клеточной физиологии и иммунологии Биологического факультета МГУ.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 4 печатныг работы.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуздеяия результатов, выводов и списка цитируемой литературы (184 ссылки). Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 22 рисунка.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

МАТЕРИАЛЫ. Пептиды - фрагменты из 124-144 района молекулы интерферона а2 человека были синтезированы в институте молекулярной биологии ( НПО "Вектор", ЫинМедБиоПром СССР, пос.Кольцово Новосибирской области ).

Список и аминокислотные последовательности исследуемых пептидов представлены в таблице I.

Тршептид SKD (аналог С-концевого трипептида молекулы интерферона а2 человека ) был синтезирован в институте эрганического синтеза, г.Рига, АН Латвии .

Рекомбинантные интерлейкин-2 и интерферон а2 человека были любезно предоставлены Г.И.Чипенсом (институт органического • синтеза, г.Рига, АН Латвии).

Остальные используемые в работе реактивы были получены от £ирм Sigma (США) и Serva (ФРГ). В работе использовали радиоактивно меченные реактивы фирмы Amersham ( Англия ). Таблица I.

Синтетические пептида - фрагменты СООН-области интерферона а-2 человека

Пептид Последовательность аминокислот* (в скобках - $ аминокислотного остатка)

2433 (124)R-I-T-L-Y-L-K-E-K-K(133)

2438 (124)R-I-T-L-Y-I-K-E-K-K-Y-S-P-C-A(138)

2444 (124)R-I-T-L-Y-L-K-E-K-K-Y-S-P-C-A-W-E-V-V-R-A(144)

2944 (129 )Ir-K-E-K-K-Y-S-P-C-A-W-E-V-Y-R-Á (144)

2938 (129)L-K-E-K-K-Y-S-P-C-Á(138)

3444 (134)Y-S-P-C-A-W-E-Y-V-R-A(144)

* - дана однобуквенным аминокислотным кодом

ВЫДЕЛЕНИЕ ЛИМФОЦИТОВ ИЗ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ. В проводимых экспериментах использовали популяции

мононуклеарных клеток и Т-лимфоцитов. Мононуклеарные клетю выделяли центрифугированием в градиенте Фиколла-верографина п< методу Воушп. Удаляя из фракции мононуклеарных клеток моноцит сорбцией на чашках Петри и В-лимфоциты адгезией на нейлоново] B£r?e, получали популяцию, обогащенную Т-лимфоцитами.

УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК. Для культивирования клеток везде, если не указано иначе, использовали среду RPMI 1640 содержащую 5% инактивированной СПК, 100 мМ L-глютамина, 51 мкг/мл гентамицина и 10 мкМ 2-меркаптоэтанола. Культивирована клеток проводили при 37° С во влажной атмосфере, содержащей 5!

со2.

Реакции бласттрансформации и определение активности естественных киллерных клеток In vitro проводили микрометодом ! 96-ти луночных планшетах для культивирования клеток в объеме 20i мкл, причем число повторностёй в каждом опыте было не мене! трех.

РЕАКЦИЯ БЛАСТТРАНСФОРМАЦИИ. Суспензии мононуклеарных клето] или Т-лимфоцитов (10® клеток/мл) . инкубировали в среде содержащей поликлональный активатор (конканавалин А -КонА ; мкг/мл или фитогемагглютинин - ФГА 2 мкг/мл или рекомбинантныа интерлейкин-2 -ИЛ-2 20 ЕД/мл) и синтетические пептиды (10~6 М или рекомбинантный ИФН а2 человека (1000 ЕД/мл) в течение 7! часов. Пролиферативный ответ лимфоцитов оценивали по включению :

о

ДНК радиоактивномечешюго предшественника Н-тимидина, которм добавляли в последние 15 часов культивирования.

В качестве контроля. использовали нестимулировании'

толиклональными активаторами клетки и стимулированные, но не эбработанные синтетическими пептидами или МФК а2.

При исследовании концентрационной зависимости тролиферативного ответа лимфоцитов использовали концентрации тептидов от Ю-4 до 10"'2 М, ИНН а2 - от 12.5 до 1000 ЕД/мл.

В некоторых экспериментах клетки инкубировали в присутствии пептидов и ИФН а2 одновременно.

При исследовании влияния пептидов на пролиферативный ответ активированных клеток, лимфоциты предварительно инкубировали (в течение 18-24 часов) с поликлональными стимуляторами (КонА, ФГА или ИЛ-2).

ИНДУКЦИЮ СИНТЕЗА ИЛ-2 в культуре мононутсле арных клеток периферической крови человека (2*106 клеток/мл/лунку) проводили в 24-х луночных планшетах. Клетки инкубировали в течение 40 часов в присутствии КонА (2 мкг/мл) и пептидов или ИФН а2 (10ОО ВД/мл).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ИЛ-2 В КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СУПЕРНАТАНТАХ проводили, используя КонА-бластные клетки мыши.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРНЫХ КЛЕТОК.

В качестве источника естественных киллерных клеток (ЕКК) использовали популяцию мононуклеарных клеток человека.

В' качестве мишеней использовали метки Т-клоточной лимфомы человека М01/Г-4, предварительно меченную радиоактивным изотопом хрома-51.

ЕКК предварительно . инкубировали в присутствии ИФН а2 или синтетических пептидов ( от 2-х до 60-ти часов), после чего

добавляли меченные клетки-мишени (соотношение эффектор:мишень от 6:1 до 100:1) на 4 часа. Активность ЕКК определяли по выходу из лизированных клеток-мишеней в культуральную среду радиоактивного изотопа и расчитывали по формуле: % специфического число ипм.в опыте-число имп.спонтанных

= ------------------------:---------------»100%

лизиса число имп. максим.-число имп.спонтанных

ИОДИРОВАНИЕ ПЕПТИДА 2438 проводили На1251 (0.5 тпС1) в присутствии иодогена как описано (За1ас1пзк1 е1;. а1.,1981).

СВЯЗЫВАНИЕ ИОДИРОВАННОГО ПЕПТИДА 2438 С ЛЕЙКОЦИТАМИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА. Мононуклеарные клетки или Т-лимфоциты ( 2*106 клеток/пробирку) инкубировали с 1-меченным пептидом 2438 (концентрации от Ю-12 до 10-4М) 40 минут при 4° С в среде 199, содержащей 2% бычьего сывороточного альбумина. После инкубации клетки центрифугировали в градиенте 10% сахарозы и измеряли ассоциированную с клетками радиоактивность.

% неспецифического связывания определяли по вытесиенит 1-меченного пептида 2438 (10~11 М) немеченным.

В экспериментах по конкурентному вытеснению клетки инкубировали с 10~11М иодированного пептида в присутствии 100-кратного молярного избытка различных немеченных агентов.

При изучении влияния поликлональных активаторов и ИФН а2 не взаимодействие пептида 2438 с мембранными структурами, I экспериментах использовали мононуклеарные клетки, предварительно инкубированные с КонА (2мкг/мл) или ИФН а2 ( 1000 ЕД/мл) I течение 20 часов.

Кд и число экспрессируемых на клетке участков связывания пептида определяли как описано Langer & Pestka (1986).

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ. Для оценки достоверности различий средних величин применяли t- критерий Стъюдента (р= 0.05). Для определения характера взаимосвязи пролиферативного ответа на митоген и И® а2 или пептид 2438 использовали корреляционный анализ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Многочисленные, полученные ранее экспериментальные данные, подчеркивают важность СООН-концевой области молекулы интерферона а в проявлении им биологической активности.

Шевалье А.Ф. и соавторами были синтезированы б пептидов ,из района 124-144 молекулы интерферона а2 человека и показано, что в противоположность целой молекуле, ни один из синтезированных пептидов не обладал антивирусной активностью. Интересно отметить, что кроличья антисыворотка, полученная против синтетических пептидов, ' представляющих аминокислотные последовательности 124-138 и 129-144 молекулы интерферона а2, способна связываться с нативной мдлекулой и блокировать антивирусное действие интерферона.

Ингибирование пролиферативного отЕета нормальных и опухолевых клеток In vitro и In vivo, а такко способность активировать естественные киллерные клетки, наряду с антивирусной, являются различными видами биологической активности, проявляемыми интерфероном.

В данной работе было изучено влияние синтезированных рзнче

пептидов - фрагментов молекулы интерферона а2 человека на пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови нормальных доноров In vitro, а также их влияние на активность естественных киллерных клеток. Второй частью работы являлось выявление и изучение биологической активности трипептида SKD, являющегося аналогом концевого трипептида молекулы интерферона а2 человека.

На рисунке 1 показано влияние шести синтетических пептидов и рекомбинантного интерферона о2 человека на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов периферической крови человека in vitro. Было обнаружено, что интерферон и пептид, представляющий участок аминокислотной последовательности 124-138 (2438) молекулы интерферона, ингибируют пролиферативный ответ лимфоцитов, индуцированный фитогемагглютинином (ФГА) (рис.1). Аналогичный результат был получен при использовании в экспериментальной модели неразделенной популяции' мононуклеарных клеток, а также конканавалина А и интерлейкина-2 в качестве поликлоналышх активаторов. Прямого цитотоксического эффекта у интерферона и пептида 2438 в зоне используемых концентраций не выявлено.

При анализе полученных данных очевидно, что только интерферон и пептид 2438 проявляют биологическую активность. Другие 5 синтетических пептидов являются биологически инертными в выбранной экспериментальной модели. Интересно отметить, что синтетический пептид, представляирй собой фрагмент 124-144 молекулы интерферона (2444), содержащий в составе пептид 2438, не проявляет антипролиферативной активности. Этот факт можно объяснить конформационными изменениями в пептиде, которые

30 -1 25 20 15 -10 -

Пролиферация Т—лимфоцитов в присутствии ФГА и ИФН или пептидов

имп/мин 1000

К ФГА ИФН 2444 2944 2438 2938 2433 3444

35 30 25 20 15 10

РИС Л

(результаты совместной работы с Шевалье А.Ф.)

влияние ИФН и пептидов на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов, предварительно активированных ФГА в течение 20 часов.

имп/иин 1000

ГТП_

4-

фга 2444 2438 2433 2938 3444 2944 ифн

5

5

РИС.2

'происходят при добавлении 6 аминокислотных остатков, тем более, что три из них являются гидрофобными ( таблица I).

Биологическое действие пептида 2438 и интерферона не выявляется в случаях аномальной индивидуальной чувствительности клеток доноров к действию интерферона. Наблюдается обратная корреляция между уровнями пролиферативного ответа клеток на митоген и интерферон/ пептид 2438: чем выше уровень пролиферативного ответа лимфоцитов под действием митогена, тем менее выражен айтипролиферативный эффект интерферона и пептида.

Антипролиферативное действие как ИФН а2, так и синтетического пептида 2438, носит дозо-зависимый характер ( рис.3 и 4). Молярные концентрации синтетического пептида 2438, вызывающие ингибирование пролиферативного ответа лейкоцитов человека, на 4 порядка превышают молярные концентрации ИФН а2, оказывающие подобный эффект.

По данным многих авторов известно, что протаолитические или синтетические фрагменты молекулы ИФН а, не обладая биологической активностью, способны оказывать влияние на активность ИФН. В связи с этим, интересно было изучить влияние синтетических пептидов на антипролиферативную активность ИФН а2. Для этого была проведена серия экспериментов, в которых использовали одновременную инкубацию клеток в присутствии ИФН и синтетических пептидов. Выявлено, что ИФН а2 и синтетический пептид 2438 способны . взаимно усиливать антипролиферативное действие друг друга (рис.4), в то время как другие пептиды не оказывали влияния на антипролиферативное действие ИФН а2.

Зависимость ФГА-индуцированной пролиферации Т—лимфоцитов от концентрации пептида 2438.

35 имп/иин 1000

3Ü -

25 -

20 -

15 -

10 -

5 -

1—: I 11щи-1—i I чип-1—I I 11ми-1—I ч ч пп

10 "7 10 Ю-5 пеиад

( и )

1- пролиферация в отсутствии пептида

2- пролиферация в отсутствии пептида и ФГА

Зависимость ФГА-индуцированвой пролиферации

Т-лимфоцитов от концентрации ИФН

в присутствии и в отсутствии пептида 2438

иип/мик 1000 50

40

J0

20

10

1000 •

Кона. ИФН ( ЕД/ил )

10 100

— 1 .......г

гт 3 г: > 4

1- ФГА + ИФН

2- ФГА + пептид + ИФН

3- ФГА

4- ФГА + пептид

Полученные результаты не позволяют сделать однозначного вывода. Антипролиферативная активность синтетического пептида 2438 может: 1. опосредоваться теми же механизмами, что и для ИФН ; 2. механизмами, отличными от механизмов антипролиферативного действия ИФН; 3. или возможности, описанные в пунктах 1. и 2., реализуются одновременно.

Предварительная инкубация мононуклеарных клеток (или Т-лимфоцитов) крови человека с ФГА (или другими политональными активаторами) в течение 18-24 часов полностью блокирует антипролиферативное действие как ИФН а2, так и пептида 2438 (рис.2). Эти результаты позволяют предполагать, 4io ИФН и пептид 2438 возможно действуют на ранних стадиях активации клеток, что согласуется с данными, описанными в литературе,

Далее было показано, что ни ИФН а2, ни биологически активный пептид 2438 не изменяли уровня синтеза ИЛ2 клетками крови человека, индуцированный КонА.

Следувдим этапом работы являлось изучение действия синтетических пептидов из 124-144 С-концевой области молекулы ИФН а2 на активность ЕКК человека in vitro.

На рис.5 приведены результаты экспериментов, показывающие, что ни один из синтезированных пептидов, в противоположность иагивной молекуле ИФН а2, не влияет на активность ЕКК человека. Вариацш во времени инкубации ЕКК с пептидами не позволили еыявнть их биологическую активность. •

Изучая взаимодействие биологически активного пептида 2438 с лкмЗсцитзми крови человека были определены некоторые параметры

Влияние ИФН и синтетических пептидов на активность естественных киллерных клеток ¡Г) VI ^ о

% специфического лизйса

К ИФН 2444 2944 2438 2938 2433 3444 ИФН+ ИЛ-2

2438

связывания данного пептида с мембранными структурами. Для этих

чрс

экспериментов использовали пептид, радиоактивно меченный I.

Рис.6 показывает, что пептид 2438 взаимодействует с мембранными структурами, экспрессируемыми лимфоцитами человека. Специфичность взаимодействия демонстрируют эксперименты, в которых при одновременной инкубации лимфоцитов с радиоактивно меченным и немеченным пептидом 2438 происходит конкуренция за участки связывания на клеточной мембране. На долю неспецифического связывания приходилось 20-35$ (рис.7).

Анализируя данные экспериментов по изучению взаимодействия пептида 2438 с мембранными структурами лимфоцитов, была построена кривая в координатах Скэтчарда, которая носила нелинейный характер (рис.8). Это указывает на существование по крайней мере 2-х мембранных структур или же 2-х независимых участков на одной и той же структуре, с которыми взаимодействует исследуемый пептид 2438. Используя результаты анализа данных по Скэгчарду, были определены 2 константы диссоциации Кд!=1.2«10-11М и Кд2=1.2*Ю-10М для высоко- и низко-аффинного сайтов соответственно. Количество участков связывания, экспрессирующихся на мембране лимфоцитов человека составляет 2.0«103/клетку и 1,1*104/клвтку для высоко- и низко -аффинных участков соответственно.

Анализируя известные аминокислотные последовательности белковых молекул и сравнивая их с аминокислотной последовательностью С-ковдевого участка молекулы ИФН а, были обнаружены несколько полшептидов, имеющих гомологичные участки.

Связывание пептида 2438 с мембранными структурами лимфоцитов

Добавленный 10'11(М)

Специфическое вытеснение пептида 2438, связанного с мембранными рецепторами

о/о

Концентрация немеченного пептида ( М )

Связ./Свобод. 10

Связывание пептида 2438 в координатах Скэтчарда

-4

е ю

—15

Связанный пептид 10 (II)

12 14

-15 ,

РИС.8

Связывание пептида 2438 с рецепторами в присутствии 100-кратного молярного избытка ИФН, пептидов или холерного токсина

120 100 во

ВО 40

20

к связывания

пЬ

К 243В 2444 2944 £038 ИФН ОТ КФН+5СГ

3

РИС.?

Так обнаружено, что С-концевая область молекулы ИФН а тлеет гомологичные участки с 0-пептидами В-субъединицы холерного токсина и энтеротоксина, выделенного из E.Coli.

Некоторые из этих веществ, такие как холерный токсин, ИФН и биологически инертные пептиды-фрагменты ИФН, использовали в экспериментах по конкурентному вытеснению радиоактивно меченного пептида 2438. Результаты этих экспериментов, приведенные на рис.9, показали, что ни одно из используемых веществ не конкурирует с пептидом 2438 за участки связывания на мембране лимфоцитов.

Таким образом, ° на основе полученных результатов, можно предположить, что рецепторные структуры для пептида 2438 отличны от рецепторов для ИФН а ' и от" рецепторов для В-субъединицы холерного токсина.

Известно, что рецепторами для В-субъединицы холерного токсина являются ганглиозиды асиало-GMI, и возможно, что эти молекулы являются одам из рецепторов для ИФН а. Тагам образом, по данным проведенных экспериментов можно предположить, что молекулы ганглиозидов асиало-GMI не являются рецепторами пептида 2438.

Также известно, что экспрессия рецепторов для ИФН на мембране клеток может снижаться при инкубации клеток с ИФН. На рисунке 2 показаны результаты экспериментов, демонстрируете, что предварительная инкубация . клеток с поликлональным активатором приводит к блокированию антипролиферативного действия ИФН и пептида 2438.

На основании этих фактов было интересно изучить влияние митогенов и ИФН на экспрессию мембранных структур, с которыми взаимодействует пептид 2438. Для этого была проведена серия экспериментов по изучению взаимодействия пептида 2438 с мембранными структурами лимфоцитов, в которых клетки предварительно (в течение 20 часов) инкубировались с КонА или ИФН а2. По результатам экспериментов были построены кривые в координатах Скэтчарда. В обоих случаях, как для КонА-, так и для ИФН-обработанных клеток, характер взаимодействия пептида 2438 с рецепторными структурами не изменяется.

Полученные результаты позволяют заключить, что":

1. неотвечаемость митоген-активированных клеток на пептид 2438 не связана с исчезновением участков . связывания на клеточной мембране;

2. предобработка лимфоцитов ИФН или митогеном не влияет на взаимодействие пептида 2438 с этими клетками.

По результатам проведенных экспериментов нельзя однозначно утверждать, но ' можно предполагать, что ИФН а2 и его синтетический фрагмент 2438 взаимодействуют с разными мембранными структурами, и соответственно, их механизмы антипролиферативного действия опосредуются различными путями. Вопрос идентичности рецепторных структур для ИФН и пептида 2438 остается нерешенным и требует проведения целой серии разнообразных дополнительных экспериментов.

В настоящее время получен ряд результатов, лемэнстрирущих, что короткие пептидные фрагменты, состоящие

Влияние аугпологичкых эритроцитоб на пролиферацию Т— лимфоцитоб 5 присутствии ФГА и пептиба БКО

25 -) имп/мин 1000

РИА РНА+БКР

+ эритроциты

РИА РН А-1- 5К 0

— эритроциты

РИС.10

из трех полярных аминокислотных остатков ( типа SED, SKE, RKD, RKE, ТКЕ и др.) обладают биологической активностью .

В данной работе ставилась задача изучить действие полярного пептида SKD, являющегося структурным аналогом С-концевого трипептида молекулы ИФН а2 человека, на пролиферативный ответ Т- лимфоцитов крови человека в системе 1л vitro.

Выло показано, что пептид SKD усиливает пролиферативный ответ Т-лимфоцитов в присутствии поликлонального активатора КонА (рис.10). Интересно, что при добавлении к культуре Т-лимфоцитов аутологичных эритроцитов блокировалось стимулирующее действие пептида SKD.

Результаты проведенных экспериментов показывают , что пептид SKD, состоящий из полярных аминокислотных остатков, обладает иммуномодулирующим действием In vitro. Вопрос, происходит ли образование "поляринов" In vivo, в настоящий момент остается не доказанным, но прохождение такого процессг представляется ' тео е ически возможным. Косвенны f.

подтверждением такой возможности является выявлен в пептидов -фрагментов ИФН, а также и других молекул, обладайте биологической активностью.

ВЫВОДЫ.

1.Выявлено, что синтетический пептид - фрагмент 124-13Í (2-138) аминокислотной последовательности молекулы интерферона al человека оказывает антипролиферативное действие In vitro hi лимфоциты периферической крови человека.

2.Выявлено, что тестируемые пептиды-фрагменты ИФН а2 человека не влияют на активность естественных киллерных клэток в тестах in vitro.

3.Антипролиферативное действие синтетического пептида 2438 связано с его влиянием на ранние этапы активации клеток.

4.Антипролиферативное действие синтетического пептида 2438 не связано с ингибированием синтеза интерлейкина-2 в культуре лимфоцитов.

5.Пептид 2438 специфически взаимодействует с мембранными структурами лимфоцитов человека.

Определены параметры связывания пептида 2438 с мембранными' рецепторами лимфоцитов: Кд1=1.2»10-11 М и Кд2=1.2*10~10 М, число сайтов связывания - 2*103 и 1.1*104/клетку, соответственно для высоко- и.низко-аффинных участков.

6.Пептид SKD - аналог концевого тршептида молекулы интерферона а2 человека обладает -иммуномодулирующим действием: усиливает пролиферативный .ответ лимфоцитов, индуцированный поликлональными активаторами in vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Danilkovich A.V., Klrkln A.F., Vegners E.,Rituma I., Sklyarova S.N., Chlpens G. The effect of SKD-peptlde on the lymphocytes from human blood.// Abstract, 6th symposium on sign_il3 • and signal processing in the Immune ays torn -Eger-Hungary august 7-11 1989 - p.14.

2. A. V. Danilkovich, K.V. Freze, A. F. Shevaller. V. V.Samukov, A. F.Klrkln and M. V.Gusev. Synthetic peptide with

aritlprollferatlve activity, a short C-terminal fragment of human interferon a-2 molecule // Immunology Letters. - 1991. -V.^/ -pp -/r-io.

3. A. V. Danllkovlch, A.I. Kcharltonenkov, K.V. Freze, A.F. Shevaller, O.V. Kolosova, T.V. Bularglna, A.F. Klrkln, M.V. Gusev. Interaction of a synthetic peptide of the Interferons C-terrainal part with human blood leukocytes. 1. binding to peripheral blood mononuclear cells // FEBS Letters. -1991. -V. -pp . '

4. A. V. Danllkovlch, A.I. Kcharltonenkov, K.V. Freze, A.F. Shevaller, O.V. Kolosova, T.V. Bularglna, A.F. "Klrkln, M.V. Gasfcv. Interaction of a synthetic peptide of the lnterferon-a2 (¡-terminal part with human blood leukocytes. 2. "Effect on the

pi'ut>;ln tyrosine phosphorylaton //FEBS Letters. -1992. -V.

-pp