Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование молекулярных основ Т-клеточного распознавания аллотипической Igk-1b детерминанты иммуноглобулинов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование молекулярных основ Т-клеточного распознавания аллотипической Igk-1b детерминанты иммуноглобулинов"

На правах рукописи

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ОСНОВ

Т-КЛЕТОЧНОГО РАСПОЗНАВАНИЯ АЛЛОТИПИЧЕСКОЙ ДЕТЕРМИНАНТЫ

ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996 г.

Работа выполнена в лаборатории иммунологии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Научный руководитель: кандидат медицинских наук В. Л. Юрин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Р.И. Атауллаханов кандидат химических наук В.А. Несмеянов

Ведущее учреждение - НИИ эпидимиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Защита диссертации состоится . 1996 года в

часов на заседании диссертационного совета Д 098.12. 01 в Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1 Дорожный проезд, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГосНИИге-нетика.

Автореферат разослан . 1996 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение механизмов Т-клеточного распознавания антигенов является одной из наиболее важных проблем иммунологии в связи с ключевой ролью Т лимфоцитов в индукции и регуляции нормальных и патологических иммунных реакций. В результате развития молекулярно-генетических, иммунохимических и клеточных подходов к изучению распознавания антигенов (АГ) В и Т лимфоцитами (Вл и Тл) были выявлены коренные различия функциональных характеристик иммуноглобулиновых (Ig) рецепторов Вл и Т-клеточных рецепторов (ТкР) (Брондз, 19S7. Berzofsky et al, 1987, 1988, Chien, Davis, 1993). Было показано, что, в отличие от Ig-рецепторов Вл, распознающих антигенные детерминанты на поверхности нативной молекулы АГ, рецепторы Тл распознают АГ в форме короткого пептидного фрагмента, связанного с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I или II.

Интенсивные исследования закономерностей формирования тримолекулярного комплекса МНС молекула/пептид/ТкР стали проводиться лишь в последние годы. Были обнаружены существенные различия между пептидами, презентируемыми в контексте молекул МНС класса I и II, а также между путями и механизмами процес-сирования и презентации АГ в контексте молекул МНС класса I и II (Matsumura et al, 1992, Monaco, 1992, Neefjes, Ploegh. 1992, Stern et al, 1994). К настоящему времени более подробно исследованы молекулярные механизмы взаимодействия пептидов с молекулами МНС класса I. Особенности презентации пептидов в контексте молекул МНС класса II стали исследоваться лишь недавно и остаются в настоящее время менее изученными.

Исследования Т-клеточного распознавания АГ пептидов, в контексте молекул МНС класса II проводились в основном с использованием экзогенных АГ. Однако в настоящее время показана способность молекул МНС класса II презентировать пептиды, происходящие из эндогенно-синтезированных молекул. Среди таких пептидов значительную часть составляют пептиды молекул Ig, молекул МНС, инвариантной цепи (II).

Эти пептиды могут играть существенную роль в формировании Т-клеточного репертуара, участвуя в позитивной и. негативной селекции' незрелых Тл в тимусе, а также в регуляции иммунного ответа. Однако механизмы процессирования и презентации таких

пептидов в контексте молекул МНС класса II остаются окончательно не изученными.

В связи с вышеизложенным представляет несомненный интерес исследование структурных закономерностей взаимодействия Ig-пептидов с молекулами МНС класса II. а также изучение особенностей распознавания комплекса Ig-пептид/МНС ИТ клетками.

В качестве маркеров Ig-молекул, способных распознаваться Т клетками, могут выступать аллотипические детерминанты. Существование аллотипических вариантов легких цепей Ig крыс дало возможность создания уникальной системы для изучения роли Ig-пептидов в формировании Т-клеточного ответа (Yurin et al, 1989, Rudensky, Yurin 1989).

Igk-1 локус крыс определяет две аллельные формы к цепей Ig - Igk-la и Igk-lb, которые отличаются 11-ю аминокислотными остатками константного района. Инбредные линии характеризуются экспрессией первого или второго варианта аллотипических детерминант, представленных на 95% сывороточных и мембранных Ig.

Предварительные данные, полученные в нашей лаборатории, показали, что иммунодоминантная Т-клеточная детерминанта расположена во фрагменте Ск 176-214, содержащем три аллотипические замены в 184. 185 и 188 положениях (Yurin et al 1989).

Один из возможных путей дальнейшего исследования распознавания аллотипической детерминанты Ig заключаётся в использовании синтетических пептидов (СП), перекрывающих отдельные фрагменты, характерные для различных аллотипов. Этот подход был применен в настоящей работе.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось исследование структурных основ Т-клеточного распознавания аллотипической Igk-lb детерминанты Ig в контексте молекул МНС класса II, а также изучение роли Ig-пептидов в формировании Т-клеточного антиаллотипического ответа у крыс.

В ходе исследования были поставлены следующие задачи:

- точная локализация иммунодоминантной Igk-lb детерминанты, распознаваемой специфичными Тл;

- исследование особенностей формирования Т-клеточного ответа на различные Ig-пептиды у крыс, конгенных по Igk-1 локусу;

- получение и характеристика клонов Тл (кТл). специфичных к синтетическому пептиду СП. 1Ь. содержащему Igk-lb Т-клеточную

детерминанту;

- определение минимальной длины аллопептида, необходимой для эффективной презентации его молекулами МНС класса II и распознавания специфическими кТл;

- исследование роли отдельных ак остатков в формировании функциональных субобластей ^к-1Ь детерминанты - агретопа и эпитопа, обеспечивающих взаимодействие ее соответственно с молекулами МНС класса II и индивидуальными ТкР специфичных клонов.

Научная новизна. В настоящей работе впервые описаны структурные основы презентации АГ пептидов молекулами МНС класса II крыс на модели аллотипической ^к-1Ь детерминанты. Впервые исследована тонкая специфичность распознавания ^-пеп-тида значительной панелью крысиных кТл, что поззолило выявить большое разнообразие Т-клеточного ответа на короткий пептидный АГ. Среди исследованных СП. 1Ь-специфичных кТл, различающихся по тонкой специфичности индивидуальных ТкР, выявлено два типа реактивности, которые соотнесены с двумя различными субобластями распознавания СП.1Ь. Установлена минимальная длина аллопептида, необходимая для распознавания его специфическими кТл в контексте молекул МНС класса II. Впервые показано, что заряженные ак остатки пептида могут оказывать негативный эффект на распознавание комплекса пептид/МНС рецепторами Т клеток. Получены данные, показывающие, что селекция Т клонов, специфичных к аллотипической детерминанте зависит от способности ^к-1Ь-пепгидов эффективно взаимодействовать с рестриктирующи-ми молекулами МНС класса II.

Практическая ценность работы. Практическая значимость работы заключается в том, что использованная система пролифера-тивного ответа Тл на ^-пептиды может служить моделью для исследования аутоиммунных процессов. Полученные данные могут внести ощутимый вклад в разработку современной стратегии получения вакцин на основе АГ пептидов. Результаты, представленные в работе могут также быть использованы в создании научных рекомендаций по разработке перспективных методов иммунотерапии (пептидная терапия) при аутоиммунных заболеваниях и опухолевых процессах.

Апробация результатов и публикации. Апробация диссертации состоялась на семинаре секции биоинженерии белков и нуклеино-

вых кислот "ГосНИИгенетика". Результаты работы были представлены на 10-м конгрессе Европейской федерации иммунологических обществ (Эдинбург. 1990), на конференции по генетике соматических клеток в культуре (Черноголовка, 1993), на международном симпозиуме по молекулярной и клеточной биологии (Кейстоун, 1994), на III научной конференции ГосНИИгенетика (июнь, 1995). Основные материалы диссертации изложены в 8 печатных работах.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав изложения собственных результатов и их.обсуждения, заключения,, выводов и списка литературы из 186 наименований отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 215 страницах, включая 26 рисунков и 7 таблиц.

Список сокращений. Тл - Т лимфоциты, Вл - В лимфоциты, кТл - клон(ы) Т лимфоцитов, - иммуноглобулин, АГ - антиген, АТ - антитела, МкАТ - моноклональные антитела, МНС - главный комплекс гистосовместимости, НТ-1 - главный комплекс гистосов-местимости крыс, АПК - АГ-презентирующие клетки, КС - клетки селезенки, 1§к-1а и ^к-1Ь - альтернативные аллотипы 1як-1 ло-куса, Ск - константный домен легкой цепи 1ё, ак остаток - аминокислотный остаток, РРИ - очищенная белковая фракция туберкулина, ИС - индекс стимуляции, СП - синтетический пептид, УП -пептид-аналог, укороченный с М- и/или С- конца, ЗП - пептид-аналог с единичными ак заменами, ЭП - показатель эффективности пролиферации кТл, использованы международные однобуквен-ные и трехбуквенные латинские сокращения названий амнокислот.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Животные. В работе использованы крысы линии Aug (RT-1C, Igk-la), WAG (RT-1U, Igk-la) и их гибриды Fl. la (RT-1C/U, Igk-la), а также выведенные в лаборатории иммунологии ГосНИИгенетика конгенные по lgk-1 локусу линии крыс Aug.lb (RT-lc, Igk-lb), WAG.lb (RT-1U, Igk-lb) И гибриды Fl. lb (RT-1C/U, Igk-lb). Кроме того использованы крысы линий Fisher (RT-i1, Igk-lb), MSU (RT-lu?, Igk-lb), а также кролики породы "Шиншилла".

Антигены. В качестве АГ использовали IgG2b(Igk-lb), фрагмент 176-214 константной области к цепей Igk-lb аллотипа (Ск 176-214), а также синтетические пептиды (СП). Фракцию IgG2b

получали из препаратов Ig крыс MSU, Fisher ионнообменной хроматографией на DE-32 целлюлозе (Юрин, Дунаевская, 1980). Фрагмент Ск 176-214 был получен и любезно предоставлен нам Ж. М.Блехман (лаб. иммунологии, ГосНИИгенетика). СП были синтезированы в лаборатории ГНИИ ОЧБП (С-Петербург) с использованием синтезатора Applied Biosystems 430А (табл.1).

Иммунизация. Иммунизацию крыс проводили подкожно в подушечки задних лап смесью АГ в физиологическом растворе с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) H37Ra (Corradin et al, 1977). Дозы составляли для IgG(Igk-lb) - 250 мкг, для фрагмента Ск 176-214 - 10 мкг, для СП.lb - 5 мкг на животное. В некоторых экспериментах при иммунизации СП.lb использовали дозу 50 мкг на животное, что специально оговорено в тексте.

Выделение различных субпопуляций клеток и их обработка in vitro. Тл выделяли фракционированием на колонках с нейлоновой ватой (Julius et al, 1973). Вл выделяли на чашках, покрытых кроличьими AT против Ig крыс (Mage et al, 1977). В пролифера-тивных тестах и при получении кТл в качестве АГ-презентирующих клеток (АПК) использовали освобожденные от эритроцитов клетки селезенки (КС) сингенных линий крыс, облученные в дозе 1000 Рад. АПК, нагруженные СП, получали инкубируя КС с СП (100 мкг/мл) в бессывороточной среде RPMI-1640 в течение 3 часов при 37°С с последующей отмывкой несвязавшегося с клетками СП.

Условия культивирования. Культивирование Т клеток проводили при 37°С, 85% влажности и 5% С02 в среде RPMI-1640. с добавлением 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата Na, 1 Ш заменимых аминокислот, 1 мМ витаминов, 25 мкг/мл гентамицина, 5x10"5 M 2-меркаптоэтанола, 10 мкг/мл тилозина, 10 мМ Нерез-буфера и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (при постановке пролифе-ративных тестов - 5%). Для получения и поддержания кТл в качестве источника интерлейкина-2 (ИЛ-2) добавляли супернатант (7-15 %), полученный при культивировании КС в присутствии кон-канвалина А .

Получение и поддержание в культуре кТл. Иммунные Тл крыс Aug выделяли из суспензии клеток подколенных лимфоузлов через 10-13 дней после иммунизации. Выделенные Тл культивировали во флаконах (1,5хЮ6 клеток/мл) в присутствии облученных сингенных АПК (0,5х106 клеток/мл) и СП (СП.lb или D185) в дозе 7 мкг/мл. Через три дня центрифугированием в одноступенчатом

Таблица 1.

Характеристика синтетических пептидов, используемых в работе.

НАИМЕНОВА-I

НИЕ 1180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 ПЕПТИДОВ I

..........I—..................-...................—-----------------—

СП. 1Ь ISer Leu Thr Lys Val Glu Туг Glu Ar? His Asn Leu Туг Thr Суз СП. la I - - - - Alo Asp - - Ser -I

1147 148 149 150 151 152 153 154 155 158 157 158 159 160 161 162 СП I

147-162 I Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Gin Are Asp Gly Val Leu Asp Ser

УКОРОЧЕННЫЕ ПЕПТИДЫ ( УН )

..........I.....-.........-...........-.......-.....-.......-.........

НАИМЕНОВА-1

НИЕ 1180 181 182 183 184 185 18В 187 188 189 190 191 192 193 194 ПЕПТИДОВ I

..........1------------------------------------------------...........

СП. lb ISer Leu Thr Lys Val Glu Туг Glu Arg His Asn Leu Туг Thr Cys 182-189 I -------182-191 I ........- -

180-192 I......-.....-

182-194 I .............

AA182-194 I Ala Ala - -- -- -- -- -- -181-193 I - -- -- -- -- -- --A181-193AI Alo . ............Ala

......I-------------------------------------------------------—

ПЕПТИДЫ-АНАЛОГИ СП.lb С ЕДИНИЧНЫМИ АМИНОКИСЛОТНЫМИ ЗАМЕНАМИ (ЗП).

НАИМЕНОВА- I

НИЕ (180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 ПЕПТИДОВ I

СЛ. lb ISer Leu Thr Lys Val Glu Туг Glu Arg His Asn Leu Туг Thr Cys

ЗП A181 I - Ala........-'.-.--

ЗП F181 I - Phe -.....-------

ЗП A182 I - - Ala.......-----

ЗП A183 I - - - Ala ----------- -

ЗП A184 I - - - - Ala.........-

ЗП D184 I - - - - Asp.........-

ЗП A184D185I - - - - Ala Asp -......- -

ЗП А185 I.....Ala.......- -

ЗП D185 I ----- Asp.......- -

ЗП A186 I......Ala ------- -

ЭП A187 i ------- Ala ------ -

ЗП S188 I.......- Ser ----- -

ЗП K180 i -------- Lys ----- -

ЗП A189 I - - - -.....Ala - - - - -

ЗП А190 i-----.....Ala - - - -

ЗП A191 I......----- Ala - - -

ЗП А192 I - - - - -.......Ala - -

ЗП F192 i ------------ Phe - -

ЗП A193 I - - - -.........Ala -

ЗП F193 I ------------- Phe -

градиенте ((1=1.077) выделяли лимфобласты и клонировали их методом предельных разведений (от 1 до 30 клеток на лунку) в присутствии АПК (2х10б клеток/мл), СП (3 мкг/мл) и 15% ИЛ-2-содержащей среды в лунках 96-луночных пластин. (ЗгейШ е! а1. 1981, Уиг1п е! а1, 1989). Длительное поддержание кТл в культуре осуществляли рассевами клеток кТл в лунки 96-луночных пластин с одновременной стимуляцией добавлением АПК (1,5хЮ6 клеток/мл), СП (2 мкг/мл) и 8-10 % ИЛ-2-содержащей среды каждые две недели. Для получения большой клеточной массы клоны рассевали в лунки 24-луночных пластин.

ПролиФеративные тесты. Постановку пролиферативных тестов проводили в 96-луночных плоскодонных пластинах в конечном объеме 0,2 мл путем культивирования Т клеток (4х104 клеток/лунку в случае кТл; ЗхЮ5 клеток/лунку в случае поликлональной популяции Тл) в присутствии АПК (105 клеток/лунку) и различных концентраций АГ. Через 24 часа (в случае кТл) и через 72 часа (в случае политонального ответа) добавляли метил-[3Н]-тимидин (1мкКИ/лунку). Через 18-20 часов клетки снимали с помощью клеточного харвестра и определяли включившуюся радиоактивность. В ряде опытов к Тл добавляли АПК, предварительно нагруженные СП. 1Ь или СП. 1а, либо облученные КС крыс Аи®.1Ь, WAG.lt). Fl.lt>. Все культуры ставили в трех параллелях. Результаты представлены как среднее значение включения метки в импульсах в минуту (М±ш), как индексы стимуляции (ИС), где ИС = М в опыте / М в контроле или в виде показателя эффективности пролиферации кТл (ЭП), равного отношению С50% для СП.1Ь к С50% для СП-аналога, где С50% - концентрация пептида, при которой уровень пролиферации равен 50% от максимального уровня ответа данного клона на СП.1Ь.

В опытах по ингибиции пролиферативного ответа МкАТ, нап-равленнными к продуктам НТ-1 генов, к различным разведениям МкАТ добавляли АПК, затем СП.1Ь в постоянной концентрации и Тл или кТл. Дальнейшее культивирование проводили, как описано выше.

Конкурентная ингибишя пролиферативного ответа клона 18-А9 нестимулирующими пептидами-аналогами. Ингибиторы в различных разведениях инкубировали .с АПК в течение 2-3 часов (37°С. 5% С02) в лунках 96-луночных пластин. Затем добавляли стимулирующий пептид (ЗП 0185) в субоптимальной дозе (0,3

мкг/мл) и клетки кТл 18-А9. Данные представлены в % по отношению к контролю - уровню ответа в отсутствие ингибитора.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Локализация аллотипической Т-клеточной детерминанты иммуно глобулинов.

Для точной локализации аллотипической Igk-lb детерминанты Ig, распознаваемой Тл, крыс линии Aug (Igk-la) иммунизировали IgG(Igk-lb), фрагментом Ck 176-214 или пептидами СП.lb и СП 147-162. Пролиферацию иммунных Тл определяли In vitro в присутствии соответствующих АГ и АПК. Как видно из табл.2, иммунизация крыс Aug цельной молекулой IgG(Igk-lb) приводила к генерации Тл, распознающих фрагменты IgG(Igk-lb) - СП.lb и Ck 176-216. Иммунизация крыс Aug Ck 176-214 и СП.lb также приводила к генерации Тл, распознающих СП.lb и Ck 176-216. Б всех описанных случаях регистрировался четко выраженный ответ на КС Aug.lb, несущие на своей поверхности эндогенно-синтезированные Igk-lb детерминанты. О специфичности наблюдаемой пролиферации свидетельствовало отсутствие ответа на контрольный пептид СП. 1а. Пептид СП 147-162, соответствующий области Ck, в которой (частично или полностью) локализован В-клеточный эпитоп Igk-lb детерминанты (Блехман, 1990), оказался неиммуногенным и не стимулировал пролиферативный ответ Тл. специфичных к IgG(Igk-lb). Ck 176-214 и СП.lb. Тл контрольных животных, иммунизированных ПАФ, отвечали только на стимуляцию PPD.

Сравнительный анализ основных характеристик пролифератив-ного ответа Тл крыс Aug, иммунизированных IgG(Igk-lb) и СП.lb, показал, что в обоих случаях ответ рестриктирован по RT-1BC молекулам МНС класса II и основной популяцией клеток, участвующих в презентации Igk-lb-детерминант собственных Ig иммунным Тл являются Вл КС крыс Aug.lb. То есть, при иммунизации крыс Aug пептид СП.lb. соответствующий области 180-194 Ck домена Igk-lb аллотипа, вызывает поликлональный пролиферативный Т-клеточный ответ идентичный ответу на цельную молекулу IgG(Igk-lb).

Таким образом, совокупность полученных данных свидетельствует, что иммунодоминантная Т-клеточная аллотипическая Igk-lb детерминанта локализована в области 180-194 Ck домена Ig(Igk-lb), соответствующей синтетическому пептиду СП.lb, и

Таблица 2.

Специфичность поликлонального пролифвративного ответа Г лимфоцитов крыс August, иммунизированных IgK-lb антигеном и его фрагментами.

I СТИМУЛЯЦИЯ in vitro

ИММУНИЗАЦИЯ I........I........I—.....I........I........I.......|.........

I Ck I СП. 1b I СП.la I СП I PPD I КС I КС I 176-2141 I 1147-162 1 I Augustl August. lb

I I I I I I г I c

125мкг/мл125мкг/мл125мкг/мл125мкг/мл110мкг/мл110 кл/л1 10 кл/л

I?G{Isk-lb) 1 7900 + 116600 + 3600 + 2100 + 138700 + 13800 + 19600 +

1 3Q0 ~ 1 1400 300 200 ~ 1 2700 1 600 800

Ck 176-214 126000 + I31S00 + 5900 + 1 H. 0.*l 53400 + 13800 + 34800 +

1 33D0 1 5100 1000 1 5000 1 900 4200

cn.ib 114700 + 133400 4500 + 5100 + 136500 + 13400 + 18500 +

1 1800 ~ 1 2900 600 500 ~ 1 1300 1 200 1900

СП 147-162 1 H. 0. 1 1900 + 3100 + 2800 + 131400 + 12400 + 1800 +

1 1 200 240 1 250 1 2950 1 220 160

II А 1 1 H. 0. 1 1400 + 1500 + H. 0. 147800 + 11200 + 1300 +

H37Ra 1 1 120 160 1 5000 1 120 150

В таблице представлены данные одного типичного опыта в имп. /мин вклочения 3Н - тимидина (М+т). * Н. 0. - не определяли. ~

При определении пролиферативного ответа на экэогеннодобавленные антигены в качестве АПК использовали облученные КС Аи?изи

Таблица 3.

Влияние дозы СП, 1Ь при иммунизации крыс линий, конгенных по 1?к-1 локусу на поликлональный пролиферативный ответ Т лимфоцитов.

I линия доза иммунизации СП.1Ь (мкг/хив) СТИМУЛЯЦИЯ in vitro

I крыс СП. lb 1 50 мкг/мл1 КС Aug. lb 1 10У кл/л 1 КС HAG.lb 10? кл/л КС Fl. lb 1 105 кл/л 1

1 Au? 5 10,2 1 7,8 1 - l

50 14,0 1 8,5 1 - 1

i Aug. lb 5 1.1 1 0,9 1 - 1

50 1,3 1 1,0 1 - 1

1 WAG 5 1,0 1 0,8 1

50 4,3 1 1,3 1

1 WAG.lb 5 1.3 1 1, 1 1

50 4, 7 1 0,9 1

1 Fl.la 5 7,8 1 - 6,1 1

50 12,4 1 - 8,5 1

1 Fl.lb 5 1,3 1 - 1. 1 1

50 7,0 1 ...........1 - 0,8 1

При определении пролиферативного ответа на экэогеннодобавленные СП ь качестве АПК использовали КС сингенной линии крыс. Данные представлены в виде ИС (для СП.1Ь - относительно СП.1а, для КС Aue. lb, WAG. lb, Fl. lb - относительно Aug, VIAG, Fl.la соответственно).

- 10 -

распознается Тл в контексте RT-1BC молекул МНС класса II.

2. Исследование особенностей Т-клеточного распознавания аллопептидов (СП.lb и СП.1а) у крыс линий. конгенных по Igk-1 локусу.

Ранее (Yurln et al, 1989) было установлено, что способность к иммунному ответу на Igk-lb детерминанту(ы) находится под контролем доминантного аллеля Ir гена, сцепленного с МНС (RT-1) локусом. При иммунизации крыс цельной молекулой IgG(Igk-lb) пролиферативный ответ на Igk-lb детерминанту регистрировался только у крыс Aug (RT-1°, Igk-la) и Fl. la (RT-1C/U, Igk-la), но не у крыс WAG (RT-1U, Igk-la).

Данные, представленные в табл.3 показывают, что при иммунизации крыс линий Aug, WAG, Fl.la пептидом СП.Ib в низкой дозе (5 мкг на животное), также, как и при иммунизации цельной молекулой IgG(Igk-lb), пролиферативный ответ на Igk-lb детерминанту (СП.lb) наблюдался только у крыс Aug и Fl.la, но не у крыс WAG.

Увеличение дозы иммунизации СП.lb до 50 мкг на животное приводило к индукции антиаллотипического пролиферативного ответа также и у линии WAG. Представленные данные показывают, что крысы линии VIAG также, как и крысы линии Aug, имеют в своем репертуаре СП.lb-распознающие Тл. Однако, только иммунизация высокой дозой СП. lb приводит к активации данного пула Тл у крыс WAG.

Ранее (Блехман, 1990) в бесклеточной системе было показано, что Igk-lb детерминанта существенно менее эффективно связывается с молекулами RT-1BU (WAG) по сравнению с молекулами RT-lBc (Aug). В совокупности, эти данные дают основание.заключить, что в основе неотвечаемости крыс WAG на Igk-lb детерминанту при иммунизации цельной молекулой IgG(Igk-lb) и СП.lb в низкой дозе лежит не отсутствие реактивных Тл, а низкая эффективность связывания Igk-lb детерминанты и RT-1BU молекул и, как следствие этого, отсутствие (или недостаточность) комплексов пептид/МНС II. В то же время, при формировании ответа на Igk-lb-детерминанту, увеличение дозы экзопептида может компенсировать низкий аффиннитет связывания и приводить к формированию достаточного количества комплексов пептид/МНС II, способных активировать Тл как In vitro, так и in vivo.

- и -

При исследовании отвечаемости крыс линий Aug.lb, WAG.Ib. Fl. lb на СП.lb, мы показали (табл.3), что иммунизация низкой дозой (5 мкг на животное) не индуцирует Тл, отвечающих на СП.lb, ни в одной из исследованных линий. При увеличении дозы иммунизации СП.lb до 50 мкг на животное наблюдался хорошо выраженный пролиферативный ответ у крыс WAG. lb и Fl. lb, но не у крыс Aug.Ib. То есть крысы WAG.lb и Fl.lb сохраняют в своем репертуаре СП.lb-распознающие Т клетки, несмотря на то, что эти животные имеют Ig(Igk-lb) молекулы в качестве эндогенного, собственного материала.

В то же время, нам не удалось зарегистрировать пролифера-тивного ответа СП.lb-специфичных Тл крыс WAG (и WAG.lb). иммунизированных высокой дозой СП.lb, при стимуляции КС WAG.Ib. Этот факт указывает на отсутствие (или недостаточность) комплексов Igk-lb-nenTiiÄ/RT-lBu на поверхности КС крыс WAG.lb.

Исследование этапа взаимодействия Тл - АПК с использованием иммунных Тл крыс Fl.1а и Fl.lb и АПК различных линий (Aug. WAG, Fl.la), нагруженных СП, также показало, что при иммунизации низкой дозой СП.lb Тл крыс Fl.la способны распознавать СП.lb только в контексте RT-1BC молекул, а при иммунизации высокой дозой - способны распознавать как в контексте RT-1BC, так и в контексте RT-1B" молекул. В то же время. Тл Fl. lb животных, не отвечающие при иммунизации СП.lb в низкой дозе, при иммунизации высокой дозой СП.lb способны распознавать СП. lb только в контексте RT-1B" молекул.

Представленные результаты дают основание считать, что не-отвечаемость крыс Aug.lb на Igk-lb детерминанту может быть обусловлена делецией Igk-lb-распознающих кТл, в то время, как неотвечаемость крыс WAG.lb (и WAG) на Igk-lb детерминанту вызвана неделеционным механизмом. В основе указанных отличий в механизмах формирования неотвечаемости у Aug.lb и WAG.lb (WAG) может лежать эффективность образования • комплексов Igk-lb-nen-тидов с молекулами МНС класса II.

3.Определение минимальной длины аллопептида. необходимой для распознавания его Т лимфоцитами в контексте молекул МНС II'класса.

Определение минимальной длины аллопептида, способного распознаваться Тл в контексте RT-1BC молекул, проводили, ис-

пользуя набор укороченных пептидов-аналогов (УП), отличающихся от основного пептида СП.Ib только длиной (табл.1). В некоторых случаях концевые аминокислотные остатки (ак остатки) в укороченных пептидах были заменены на аланин (Ala).

Исследование пролиферативного ответа поликлональной популяции Тл крыс Aug, иммунизированных СП. Ib или УП, позволило выявить важность Leul81 и необходимость Thrl93 для распознавания СП. ib иммунными Тл. В то же время было показано, что ак остатки Serl80 и Cysl94 не являются необходимыми для распознавания аллопептида специфичными Тл в контексте RT-1BC молекул.

С целью дальнейшего изучения МНС П-рестриктированного антиаллотипического Т-клеточного ответа крыс Aug была получена панель клонов Тл (кТл) (16 клонов), специфичных к пептиду СП.ib. Полученные кТл характеризовались строгой иммунологической специфичностью. Пролиферативный ответ кТл регистрировался только на СП.Ib (ИС 12-115) и не регистрировался на контрольный пептид СП.1а, представляющий собой ту же область (180-194) СК противоположного аллотипа (ИС 0,7-1,3). У всех полученных СП. Ib-специфичных кТл пролиферативный ответ регистрировался также и при стимуляции КС крыс Aug.Ib, несущими на своей поверхности Igk-lb детерминанты, образованные в результате про-цессирования эндогенно-синтезированных Ig(Igk-lb) молекул (ИС 8-85).

Исследование МНС-рестрикции пролиферативного ответа полученных кТл показало, что кТл распознают как экзогенный СП.Ib, так и эндогенно-синтезированную Igk-lb детерминанту на поверхности КС крыс Aug. Ib в контексте RT-1BC молекул.

На рис. 1 представлены данные, характеризующие способность различных кТл пролиферировать в ответ на стимуляцию УП. Из представленных данных видно, что уровень пролиферативного ответа всех клонов на пептид, содержащий Ala вместо Я-концево-го Serl80 и С-концевого Cysl94 (УП А181-193А), не отличался от уровня ответа клонов на СП.Ib. А укорочение СП.Ib на два ак остатка (по одному с W- и С-концов) (УП 181-193) приводило лишь к незначительному уменьшению пролиферативного. ответа у большинства клонов. Таким образом, ак остатки Serl80 и Cysl94 не являются необходимыми для взаимодействия СП.ib с молекулой МНС (RT-1BC) и распознавания комплекса пептид/МНС ТкР СП.Ib-специфичных кТл. В то же время ни один из клонов не рас-

эт 19 оа 1.« 0 10 0>1 пи 1 II 10 00 1 09 010 0 01 ггч 1_Ш1

ЭП юоо ш 011 0)1 Н01 1010 1.10 010 0 31 ггги

ЭП 10 и 1.10 010 011 ГК! эг 1910 1.10 0.10 О 01 МГЦ ЭП 1010 1.01 0.11 0.91 пп 1 1111

М 10» »511 10.11 ЭП 11 01

1.00 0.10 011 1 || 0.11 0 91 .11 1.01 0.11 0.91 1 ||||

10.11 мо 0.19 0.91 ГВС1 1 II ЭП 10.01 1.01 0.10 0 91 №7 .11 эш 10.09 1 90 010 091 ГМ1 111,1

за 10.00 1.оа 0.11 0.11 т! 1 ■) >л 1010 1.10 сю 0,01 (/«II 1 л|| ЭГ 1010 1.90 0.10 0-11 РВС1 1 ||.|

5 ; И а 3 е ® Ё Е Е Ё Е В Е ваияаз5® Ё Е Е е Ё Е Ё 2 ?1?г | ?! 8 » 5 Н 3 ; ; Ё Ё Ё Ё В Ё Ё

ГРУППА 1 ГРУППА 2

Рис. 1. Пролиферативный ответ Т-клеточных клонов, специфичных к СП.1Ь, на укороченные пептиды-аналоги СПЛЬ (УН). По оси ординат - показатель эффективности пролиферации ЭП.

познавал короткие пептиды УП 182-189, УП 182-191, УП 180-192. Таким образом, потеря ак остатка в 193 положении оказалась критичной для всех СП. lb-специфичных кТл.

В зависимости от способности кТл распознавать УП 182-194 (и УП АА182-194) мы выделили две группы клонов, которые, как мы полагаем, распознают разные области СП.1Ь, отличающиеся по длине и расположению (рис.1). Т клоны первой группы или вообще не распознавали УП 182-194 и УП АА182-194 (клоны Р4ВЗ, P4G8, Р5С5, P5D6, Р8С4, Р8Е8), или уровень пролиферации на данные УП по сравнению с уровнем пролиферации на СП. 1Ь существенно падал (больше чем в 100 раз) (клоны P4F11, Р6А4, Р6А7, Р7А11). То есть, для распознавания СП.1Ь клонами этой группы необходимо присутствие Leul8l, и состав минимального пептида Igk-lb алло-типа, распознаваемого кТл первой группы, можно записать следующим образом: LTKVEYERHNLYT (181-193 (13 ак остатков)). Т клоны второй группы сохраняли способность распознавать УП 182-194 и УП АА182-194 ( клоны P2F10, Р2Н5, Р6В4, P7F9, Р8А6, P8G8). Уровень пролиферации на данные пептиды сравним с уровнем про-лиферативного ответа на СП.Ib. Состав минимального пептида Igk-lb аллотипа, распознаваемого Т клонами второй группы, можно записать следующим образом: TKVEYERHNLYT (182-193 (12 ак остатков)).

Оставалось, однако, невыясненным, чем вызвана неспособность полученных кТл распознавать УП 182-189, УП 182-191 и УП 180-192 - отсутствием эффективного взаимодействия последних с рестриктирующими молекулами МНС или особенностями ТкР всех клонов. Для решения этого вопроса с помощью метода конкурентной пептидной ингибиции мы исследовали способность различных УП связываться с молекулами МНС. В качестве модели использовали пролиферативный ответ постороннего кТл - 18-А9, специфичного к синтетическому пептиду ЗП D185, распознаваемому также в контексте молекул RT-1B0. Как было показано ранее, указанный клон не активировался в присутствии СП. 1Ь и его укороченных аналогов. О способности УП к взаимодействию с молекулами МНС RT-1BC судили по снижению в присутствии УП уровня пролифера-тивного ответа клона 18-А9 на ЗП D185. Наблюдаемая в таких условиях ингибиция пролиферативного ответа является следствием эффективного взаимодействия исследуемых пептидов с рестриктирующими молекулами МНС, а отсутствие ингибиции свидетельствует

150

I 100-

н

§

з: а х

Е-1 СО О.

■S

X

■ч

о

50-

СП lb

УП А181-193А УП АА182-194

182-194 УП 180-102 182-191

-1—I I I ГШ|-1—[ II ПП[-1—I I I ПИ)

Ю "' 1 10 10 '

концентрация ингибитора (мкг/мл)

Рис. 2. Ингибиция пролиферативного ответа клона 18-А9 укороченными пептидами-аналогами СП.lb (УП). В качестве АПК использовались облученные КС крыс Aug.

об отсутствии или низкой эффективности взаимодействия соответствующих молекул МНС с исследуемыми пептидами (Allen et al, 1989).

Как видно на рис. 2 УП А181-193А, УП 182-194 и УП АА182-194 эффективно ингибировали пролиферативный ответ клона 18-А9, причем степень ингибиции практически не отличалась от ингибиции ответа пептидом СП. lb. В связи с этим можно полагать, что ак остатки Serl80, Leul8l и Cysl94 не требуются для эффективной презентации аллопептида и неспособность клонов первой группы распознавать пептиды УП 182-194 и УП АА182-194 связана с особенностями их ТкР. Пептиды УП 182-191 и УП 180-192 не вызывали какого-либо снижения пролиферативного ответа клона 18-А9 по сравнению с контролем. Таким образом, УП, лишенные Thrl93, не были способны к эффективному взаимодействию с молекулами RT-1BC.

4. Изучение роли отдельных аминокислотных остатков в Т-клеточном распознавании аллопептида.

Для выявления роли отдельных ак остатков СП.lb в формировании активных субобластей Igk-lb-детерминанты - агретопа и эпитопа, были использованы пептиды-аналоги основного пептида СП.lb (180-194) с единичными заменами ак остатков пептида на А1а и в некоторых случаях на Phe. Кроме того были использованы пептиды-аналоги, которые в положениях 184, 185, 188 отличались от СП.lb заменой одной или двух ак остатков на аминокислоты, присущие СП.1а или на некоторые другие аминокислоты (табл.1, ЗП). Для идентификации ак остатков, являющихся критичньии при распознавании аллопептида специфичными Тл, мы исследовали способность ЗП стимулировать пролиферативный ответ как поликло-нальных популяций СП.lb- и ЗП- специфичных Тл, так и полученных СП. lb-специфичных кТл.

Эффективность распознавания ЗП девятью кТл специфичными к СП.lb, приведена на рис. з. Представленные данные показывают, что ■•полученные .нами кТл характеризуются большим разнообразием их ТкР, проявляющимся в различной чувствительности клонов к заменам единичных' ак остатков пептидного антигена. Они отличались по способности распознавать ряд ЗП, содержащих замены в положениях 182, 184, 185, 190 и 191. В то же время ответ на ЗП F181, ЗП А185, ЗП А186, ЗП S188, ЗП F192, ЗП А193, ЗП F193 был

Рис. 3. Пролиферативный ответ Т-клеточньк клонов, специфичных к СП. 1Ь, на пептиды-аналоги, содерлапдае единичные аминокислотные замены (ЗП).

По оси ординат - показатель эффективности пролиферации ЭЛ.

lili P2H5

PíflO

lili lll

-"I----------- psca lll

« 2о ас а б sa es г sa гг

¿5=5« S» г» S ¡Í5SÍ5.I-

ГРУПП'А 1

« :: ас г: s s <> = Ра

«г

ГРУППА 2

- 18 -

примерно одинаков у всех полученных кТл.

Способность кТл распознавать ЗП, - содержащие аминокислотные замены в положениях 181, 183, 187, 188, 189, 192, позволила объединить их в две основные группы, характеризующиеся принципиально различными типами реактивности. По этому критерию к первой группе были отнесены клоны Р4ВЗ, P4F11, Р5С5, Р6А4, Р6А7, Р7А11, а ко второй - клоны Р2Н5, P2F10, P8G8 (рис.3). При этом, распределение клонов по группам, проведенное с использованием ЗП, совпадает с распределением клонов по группам, проведенным с использованием УП. Это подчеркивает, что, хотя обнаруженный сдвиг в области распознавания СП. Ib оказался минимальным (один ак остаток), он отражает принципиальное отличие в реактивности двух выявленных групп клонов.

Для всех клонов первой группы критичными оказались замены на Ala ак остатков в положениях 181, 187 и 189, а для всех клонов второй группы критичными оказались замены на Ala ак остатков в положениях 188 и 192. Кроме того, замена Lysl83 на Ala не только не отменяла способность клонов первой группы распознавать пептид, но приводила к более эффективной (в 10-100" раз) их стимуляции по сравнению с исходным пептидом СП.Ib. Таким образом, присутствие Lys в положении 183 СП.Ib, очевидно, оказывает негативное влияние на образование тримоле-кулярного комплекса RT-lBc/cn. 1Ь/ТкР в случае взаимодействия с ТкР клонов первой группы. ■ На клоны второй группы аналогичный эффект оказывала замена G1U187 на Ala.

Тот факт, что некоторые ак остатки СП.Ib оказались критичными для распознавания пептида специфическими кТл, может быть обусловлен их участием как во взаимодействии пептида с молекулой МНС, так и в его взаимодействиях с ТкР.,Значение отдельных ак остатков пептида СП.Ib во взаимодействиях пептид/МНС и/или пептид/ТкР мы исследовали с помощью метода конкурентной ингибиции пептидного связывания, используя клон 18-А9, специфично распознающий пептид ЗП D185 в контексте RT-1B0 молекул и не распознающий ни один из исследованных ЗП. Как видно из рис.4, эффективная ингибиция пролиферативного ответа наблюдалась в присутствии'ЗП А181, ЗП А182, ЗП А183, ЗП А185, ЗП А187, ЗП А190, ЗП А191. Можно заключить, что замены соответствующих ак остатков не приводят к существенным нарушениям образования комплекса пептида СП. ib с RT-1BC молекулами.

К

са

& ICO«

a

О -1" I ' I nilj-1 I I МПЦ-1 I I I ШГ)

10 " 1 10 to"

КОНЦШРАШ ИНГИБИТОРА (мкг/нл)

ё юо-

I 50-

"III UlllJ-III! 1IM|-1' 1 I llll.|

10"' 1 10 10* К01ШГГРАЦИЯ ИНГИБИТОРА (мкг/ки)

¡3 50-

i i м ц|ц—i i ) inn)—i i 11пи)

10"' 1 10 10' К0НГЕ1ГГРАШ"ЯИГИБет0РА С м<г/мл)

| 50-

—e—A190 —э—A191 —*—A192 —F192

0-J-Г ' I I I Mill-1 I I ППЦ

10- I 10

1 I 1111Ц 10 '

КОНДЕНГРАГОИ ИНГИБИТОРА (ихг/мл)

Рис. 4. Ингибиция пролиферативного ответа клона 18-А9 пептидами-аналогами СП.lb, содержащими единичные аминокислотные замены (ЗП).

В качестве АПК использовались облученные КС Aug.

Следовательно, отсутствие пролиферативного ответа некоторых кТл на данные ЗП можно объяснить участием соответствующих ак остатков во взаимодействии пептида с ТкР.

Пептиды СП.1а, ЗП А184, ЗП D184, ЗП А186, ЗП S188 и ЗП А192 не обладали ингибирующей активностью, хотя у пептидов с консервативными заменами в положениях 188 и 192 (ЗП К188 и F192) была выявлена способность ингибировать пролиферативный ответ клона 18-А9. ЗП А189 ингибировал пролиферацию кТл 18-А9 только при его добавлении в культуру в высокой концентрации (60-90 мкг/мл). Эти данные говорят о низкой эффективности взаимодействия указанных ЗП с RT-1B0 молекулами.

Таким образом, были выявлены 6 ак остатков, замена которых приводила к уменьшению эффективности взаимодействия СП.lb с молекулами RT-1BC: Val184, Tyrl86, Argl88, Hisl89, Tyrl92 и Thrl93 (рис.5).

Роль Tyrl86 в презентации СП.lb может определяться его взаимодействием с ак остатками, формирующими соответствующий карман в молекуле RT-1BC. Это предположение, безусловно, требует дальнейшего экспериментального подтверждения, однако, оно хорошо согласуется с данными литературы, согласно которым тирозин часто оказывается якорной аминокислотой, необходимой для эффективной презентации пептидов молекулами МНС I и II классов различных гаплотипов (Fremont et al. 1992, Stern et al, 1994).

Для эффективной презентации СП.lb молекулами RT-1BC необходимо также присутствие положительно заряженного ак остатка (Arg или Lys) в положении 188.

Как мы показали ранее, для эффективной презентации пептида СП.lb молекулами RT-1B0 необходимо также присутствие ак остатка в положении 193, так как презентация укороченного пептида УП 180-192 была нарушена. В то же время, замена Thrl93 на Ala или Phe не препятствовала его взаимодействию с молекулами RT-1B0. Эти данные дают основание полагать, что для эффективной презентации пептида СП.lb молекулами RT-1B0 достаточно наличия в 193 положении ак остатка, обладающего гидрофобными свойствами или любого другого аминокислотного остатка. В последнем случае во взаимодействии пептида с молекулой МНС могут участвовать "скелетные" атомы аминокислоты, находящейся в 193 положении.

Определенную роль во взаимодействии аллопептида с реет-

ТкР КЛОНОВ ГРУППЫ 1

tt tt t nrt

SLTKUEYERHNLYTC

Iii

MHC

TtP

КЛОНОВ ГРУППЫ 2

ttt t ttt SLTKUEYERHNLYTC

+ i Ii i1

MHC

Рис. 5. Участие аминокислотных остатков CIL lb в формировании агретопа и эпитопов СП. 1Ь-специфичных клонов первой и второй групп.

яшшф- - ак остатки СП. lb, участвующие во взаимодействии с ТкР всех клонов первой или второй групп,

■ ак остатки СЕlb, участвующие во взаимодействии

с ТкР индивидуальных клонов,

-»■ - ак остатки СП. lb, принимающие основное участие

во взаимодействии с RT-1B0 молекулами МНС класса II, - -- - ак остатки CILlb, участвующие в стабилизации

комплекса CIL Ib/RT-1BC.

ротирующими молекулами КТ-1ВС могут играть ак остатки Уа1184 и Туг192. Хотя ряд СП.1Ь-специфичных кТл распознавал ЗП А184 и ЗП А192, данные пептиды не были способны ингибировать пролифе-ративный ответ клона 18-А9. Нельзя полностью исключить того, что чувствительность использованных в работе методов может быть различной, то есть, для конкурентной ингибиции связывания ЗП 0185 с ЕТ-1ВС молекулами может требоваться более эффективное взаимодействие пептида-аналога с МНС молекулами, чем для стимуляции специфичных клонов. Однако полученные данные позволяют говорить о резком уменьшении эффективности связывания ЗП А184 и ЗП А192 с ШМВС молекулами по сравнению с исходным пептидом СП.1Ь. Можно полагать, что произведенные замены вызывают существенное изменение стабильности образующегося комплекса.

Ак остаток Шз189 также, вероятно, может принимать участие (прямое или опосредованное) в дополнительной стабилизации комплекса СП.1Ь/СТ-1ВС.

Таким образом, из 6 выявленных ак остатков, участвующих во взаимодействии СП. 1Ь с рестриктирующими молекулами МНС, три имеют первостепенное значение: Туг186, А^188, Шг193. Дополнительный вклад в стабилизацию комплекса СП.1Ь/ЕТ-1ВС могут вносить ак остатки Уа1184, Н1з189 и Туг192 (рис.5).

Сравнительное исследование Ы-концевых доменов а- и (5-це-пей молекул МНС II класса КТ-1ВС и НТ-1Ви, проведенные в нашей лаборатории (Н.В.Гороховец, 1995), показало, что молекула РТ-1В° в отличие от НТ-1Ви молекулы характеризуется, прежде всего, наличием отрицательно заряженных ак остатков (Азр28 р-цепи и С1ибб а-цепи) в областях вероятного контакта молекулы 11Т-1ВС с пептидами (рис.6). Этот факт, а также присутствие среди идентифицированных нами в качестве формирующих агретоп СП. 1Ь двух положительно заряженных остатков А^Ш и Н1з189, может объяснять различия в эффективности связывания пептида СП. 1Ь молекулами 1гт-1Вс и ЙТ-1Ви, и, таким образом, лежать в основе описанных нами особенностей формирования Т-клеточного ответа на СП. 1Ь у крыс, конгенных по ^к-1 локусу и различающихся по 1?Т~1В гаплотипу.

В нашей работе мы также определили ак остатки СП.1Ъ, участвующие в формировании эпитопа, т.е. взаимодействующие с ТкР. Для клонов первой группы такими остатками оказались

ноос

HOOG,

CHO

Рис.6. Антиген-связываодие полости RT-1BC и RT-1BU молекул МНС II класа крыс (построено на основе модели молекулы МНС II класса человека HLA-DR1, Brown et al., 1993). Обозначены аминокислотные остатки, боковые цепи которых направлены в пепгид-связывагащую полость МНС молекул и различающиеся у RT-1BC и RT-1BU молекул. Штриховкой выделены области предполагаемых контактов RT-1BC молекулы с аминокислотными остатками Argl88 и H1S189 пептида СП.1Ь.

Leul81, Thrl82, Val184, G1U185. Glul87. Hlsl89, Asrd90, Leul91; для клонов второй группы - Lysl83, Vall84, Glul85, Asnl90, Leul9l, Tyrl92 а также, возможно, Argl88 (рис. 5).

Как видно из представленных данных, ак остатки, необходимые для распознавания пептида ТкР клонов первой группы локализованы в интервале от 181 до 191 остатка, а ак остатки, необходимые для распознавания пептида ТкР клонов второй группы - в интервале от 183 до 192 остатка. Таким образом, область пептида СП.lb, распознаваемая кТл первой группы, сдвинута ближе к N-концу петида, по сравнению с областью, распознаваемой кТл второй группы. Различная локализация распознаваемых детерминант в пределах одного и того же пептидного антигена, видимо, и обусловливает различную роль индивидуальных ак остатков пептидного антигена в распознавании его клонами различных групп.

Сравнивая результаты, полученные при исследовании тонкой специфичности пролиферативного ответа поликлональной популяции СП.lb-специфичных Тл со специфичностью ответа кТл при стимуляции ЗЛ, можно сказать, что ответ поликлональной популяции является суммарным отражением ответа наиболее представленных клонов и, таким образом, дает общее представление о характере распознавания как СП. lb, так и пептидов-аналогов. Таким образом, можно заключить что мы получили достаточно представительную выборку СП. lb-специфичных кТл и можно полагать, что закономерности распознавания аллопептида СП.lb-специфичными кТл in vitro, выявленные в нашей работе, отражают особенности формирования антиаллотипического ответа in vivo.

В целом, представленные в работе результаты раскрывают возможные молекулярные механизмы иммунологического распознавания собственных антигенов в контексте молекул МНС класса II на модели молекул Ig. Они стимулируют изучение роли Ig-пептидов в формировании иммунологической толерантности, репертуара Т лимфоцитов, в обеспечении Т-В клеточных взаимодействий, участвующих в активации как Т, так и В лимфоцитов.

ВЫВОДЫ

1. В составе Ск домена легких цепей иммуноглобулина крыс в области 180-194 была локализована внутривидовая иммунодоми-нантная Igk-lb аллотипическая Т-клеточная детерминанта. Пока-

зано, что синтетический пептид (СП.1Ь), соответствующий этой последовательности вызывает поликлональный пролиферативный Т-клеточный ответ идентичный ответу на цельную молекулу 1ёС(1ёк-1Ь) и воспроизводит структуру пептидного компонента комплекса МНС класс II молекула/АГ пептид, естественно формирующегося у В лимфоцитов ^к-1Ь аллотипа в результате процес-сирования эндогенно-синтезируемых молекул ^(^к-1Ь).

2. Проведено иммуногенетическое исследование, свидетельствующее о влиянии эндогенного ^к-1Ь пептида на формирование Т-клеточного репертуара. Установлено, что элиминация потенциально аутореактивных анти-^к-1Ь Т клеток у August.lb и отсутствие элиминации у №АС. 1Ь линий животных определяется эффективностью взаимодействия эндогенного 1як-1Ь пептида с рест-риктирующими молекулами МНС класса II (КТ-1ВС, ГгТ-1В").

3. Исследована роль отдельных аминокислотных остатков пептида СП.1Ь (180-194) в формировании трехмолекулярного комплекса (МНС класс II молекула/пептид/ТкР):

- выявлены основные аминокислотные остатки СП.1Ь (Туг186, Аг§188, ТЪПЭЗ), определяющие взаимодействие пептида с 1гТ-1Вс молекулой МНС класса II;

- определены аминокислотные остатки СП.1Ь, необходимые для эффективного распознавания комплекса МНС/пептид Т-клеточ-ными рецепторами индивидуальных клонов Т лимфоцитов;

- на основании установленного распределения функций аминокислотных остатков СП.1Ь (180-194), а также информации о строении и 11Т-1Ви молекул определены вероятные области пептид-евязыващей полости ЕТ-1ВС молекулы, контактирующие с "якорными" остатками данной Т-клеточной детерминанты.

4. Получена панель Т-клеточных клонов, специфичных к СП.1Ь. Идентифицированы две основные категории данных Т-клеточных клонов, ТкР которых распознают различные, но перекрывающиеся субобласти пептида СП.1Ь, находящегося в комплексе с МНС молекулой II класса КТ-1ВС. Эти группы Т клонов характеризуются принципиально отличными типами реактивности на набор пептидов-аналогов СП.1Ь, несущих единичные аминокислотные замены. Впервые обнаружен феномен негативного эффекта отдельных аминокислотных остатков СП. 1Ь пептида (ЬуэШ, ИиШ) на эффективность взаимодействия ТкР с комплексом МНС/пептид.

5. Совокупность результатов, полученных в данной экспери-

ментальной системе, может быть использована для построения молекулярной модели образования комплексов молекул МНС II класса с АГ пептидами и описания закономерностей взаимодействия комплексов МНС/пептид с ТкР. Представленные даннные обеспечивают возможность корректного анализа молекулярных основ Т-клеточно-го иммуноспецифического распознавания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Yurin V.L., Rudensky A. Yu., Rabinovich 0. R., Bobreneva R. A., Kulakova O.G. "B lymphocytes as natural antigen-presenting cells (APC) of their own Ig receptors determinants"// Federation Proceedings. 1986. vol.45. - P.499.

2. Blechman J.M., Kulakova 0.G.. Bobreneva 0.G., Yurin V.L. "Identification and analysis of T cell epitope generated by В cell processing of self Ig receptors." // European Federation of Immunological societies 10th Meeting. Abstracts. Edinburgh, 1990. - P.24.

3. Шехтер И.И., Буленков М.Т., Вейко В.П., Ратманова К. И., Кулакова 0. Г., Евдонина Л. В.. ЮринВ.Л.. Дебабов В. Г. "Структурно-функциональные отношения в альфа - интерферонах. Изучение противовирусной активности мутантных форм альфа - интерферона человека."// Докл. АН СССР, 1990. - т.314. -N4. - С. 998-1001.

4. Кулакова О.Г., Еремеев В.В., Юрин В.Л. "Исследование особенностей 1г - генетического контроля пролиферативного ан-тиаллотипического ответа у крыс линий, конгенных по Igk-1 ло-кусу." // Тезисы конференции по генетике соматических клеток в культуре. М., 1993. - С.67.

5. Лядова И.В., Мазель С.М., Кулакова О.Г., Юрин В.Л. "Исследование структурных основ Т-клеточного распознавания Igk-lb аллопептида иммуноглобулинов." // Тезисы конференции по генетике соматических клеток в культуре. М., 1993. - С.68.

6. Yurin V.L., Ljadova I.V., Kulakova O.G., Bobreneva R.A. "Complete dissection of the Igk.lb (180-194) determinant, generated during В cell processing of their own Ig receptors. " // J. of Cell. Biochemistry. Symposia on Molecular and Cellular Biology, 1993. - P.295.

7. Ljadova 1.4., Kulakova O.G., Mazel S.M., Yurin V.1.

"The role of self Ig-derlved peptides in T cell repertoire generation." // 12th European Immunology Meeting. Abstracts. Barcelona, 1994.-P.233.

8. Кулакова О.Г., Лядова И.В., Логунова Н.Н., Олейник Н.В., Юрин В.Л. "Структурные основы иммунологического распознавания пептидного антигена [СП.lb (180-194)] рецепторами Т клеток." //Тезисы III научной конференции. / ГНИИгенетика. М., 1995. - С. 29.