Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизма цитотоксического действия гидроксикобаламина (витамина B12b ) в сочетании с аскорбиновой кислотой на опухолевые клетки in vitro

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лещенко, Виолетта Викторовна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Препараты, генерирующие свободные радикалы, как противоопухолевые агенты

1.2. Аскорбиновая кислота и гидроксикобаламин

1.3. Повреждения клеточных структур активными формами кислорода

1.4. Программируемая клеточная гибель

1.5. Антиоксидантные механизмы защиты клеток

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Клеточные культуры

2.2. Оценка ингибирования пролиферации

2.3. ДНК-электрофорез

2.4. Люминесцентный анализ аберрантного распределения хроматина

2.5. Проточная микроскопия

2.6. Анализ митотической активности

2.7. Оценка синтеза ДНК

2.8. Синхронизация клеток

2.9. Люминол зависимая хемилюминесценция

2.10. Спектрофотометрический анализ

2.11. Полярографический анализ

2.12. Измерение внутриклеточного рН

2.13. Измерение кальциевой емкости митохондрий

2.14. Измерение внутриклеточной окислительной активности

2.15. Измерение уровня внутриклеточного глутатиона и глутатион дисульфида

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение ингибирования пролиферации и гибели различных типов опухолевых клеток под действием витамина В]2ь в сочетании с аскорбиновой кислотой

3.2. Изучение типа гибели клеток, индуцируемой действием витамина В]2ь в сочетании с витамином С

3.3. Изучение чувствительности клеток к сочетанному действию витаминов В \2ъ и С на различных стадиях клеточного цикла

3.4. Изучение роли активных форм кислорода в цитотоксическом действии каталитической пары «гидроксикобаламин - аскорбиновая кислота»

3.5. Исследование влияния витамина Bi2b в сочетании с аскорбиновой кислотой на тиоловые группы, внутриклеточный рН, состояние митохондрий и окислительно-восстановительную систему клетки

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование механизма цитотоксического действия гидроксикобаламина (витамина B12b ) в сочетании с аскорбиновой кислотой на опухолевые клетки in vitro"

В последние годы предлагаются и внедряются в медицинскую практику препараты на основе бинарных каталитических систем. В результате химических реакций с участием компонентов этих систем образуются активные формы кислорода (АФК). Такие бинарные каталитические системы включают аскорбиновую кислоту (АК) в качестве субстрата окисления и органические комплексы металлов с переменной валентностью в качестве катализаторов окисления (Вольпин и др., 1998). Одной из таких систем является сочетание гидроксикобаламина (витамина Bi2b) с АК (витамином С). Ранее было обнаружено, что корриновые комплексы кобальта в сочетании с восстановителями, в частности с аскорбатом, в присутствии молекулярного кислорода обладают нуклеазной активностью (Вольпин и др., 1988). Недавно ряд бинарных каталитических систем на основе корриновых производных кобальта, в частности, витамина Bi2b и фталоцианинов, был испытан и запатентован в качестве противоопухолевых агентов (Вольпин и др., 1998; Борисенкова и др., 1998; Сыркин и др., 1998; Yakubovskaya et al., 1998а,b). Было показано, что каталитическая система, состоящая из витамина Bi2b и АК, в условиях in vitro вызывает гибель ряда опухолевых клеток, таких как клетки аденокарциномы легкого человека А549, клетки лимфомы Беркита Raji, клетки эпидермоидной карциномы гортани человека НЕр-2. На моделях ряда перевиваемых опухолей мышей in vivo (Р388, L1210, LLC, Са755, В16, карциномы Эрлиха) установлено, что сочетание гидроксикобаламина с АК обладает противоопухолевой активностью (Вольпин и др., 1998; Yakubovskaya et al., 1998a,b).

Окислительно-восстановительная система, функционирующая с участием молекулярного кислорода, некоторых корриновых комплексов кобальта и АК, была предложена академиком Вольпиным (Вольпин и др., 1988). Этой же группой исследователей была показана способность «корриновой нуклеазы» катализировать образование Н202 и ОН-радикалов (Румянцева и др., 1989), вызывать образование разрывов в ДНК плазмиды PBR 322 и рибосомальных РНК Е. coli (Вольпин и др., 1991), оказывать ингибирующее действие на дыхание и АТФ-азную активность изолированных митохондрий (Киселева и др., 1990). Имеются данные о том, что применение витамина Bi2b в сочетании с дегидроаскорбиновой кислотой приводило к ингибированию митотической активности клеток лейкемии мышей L1210 in vivo и in vitro (Poydock et al., 1985; Poydock, 1991). Однако механизм цитотоксического действия системы, включающей витамин Bi2b в сочетании с АК, остается не исследованным. Перспектива использования в противоопухолевой терапии каталитической системы, состоящей из витамина Вш и витамина С, выдвигает необходимость изучения механизма их сочетанного действия на опухолевые клетки.

Целью данной работы являлось исследование механизма цитотоксического действия гидроксикобаламина (витамина В]2ь) в сочетании с аскорбиновой кислотой на опухолевые клетки in vitro. В соответствии с целью были поставлены основные задачи:

1. Изучение ингибирования пролиферации и гибели различных опухолевых клеток in vitro под действием витамина Bi2b в сочетании с аскорбиновой кислотой.

2. Изучение типа гибели клеток, индуцируемой действием комбинации витаминов Bi2b и С.

3. Изучение влияния витамина В^ь в сочетании с аскорбиновой кислотой на синтез ДНК и митотическую активность опухолевых клеток, изучение чувствительности клеток к действию комбинации витаминов на различных стадиях клеточного цикла.

4. Изучение роли активных форм кислорода в цитотоксическом действии каталитической системы «гидроксикобаламин - аскорбиновая кислота».

5. Исследование влияния витамина Вх2ь в сочетании с аскорбиновой кислотой на тиоловые группы белков клеточной поверхности, внутриклеточный рН, состояние митохондрий и окислительно-восстановительную систему клетки.

Научная новизна.

Впервые исследованы кинетические особенности гибели ряда опухолевых клеток под действием витамина В^ъ в сочетании с АК in vitro, оценено характерное время инициации необратимого повреждения клеток. Установлено, что цитотоксическое действие системы «В^ь + С» опосредовано сорбцией Впь клетками. Обнаружено, что система «гидроксикобаламин-аскорбиновая кислота» оказывает генотоксическое действие на опухолевые клетки и индуцирует апоптоз в клетках Р388, NS/0, NIH-OVCAR-3, АКЭ и НЕр-2. Показано, что комбинация витаминов В|2ь и С имеет цитостатическое действие. Наиболее чувствительными к этому действию являются пролиферирующие клетки. Установлено, что цитотоксическое действие каталитической системы «гидроксикобаламин-аскорбиновая кислота» на опухолевые клетки in vitro обусловлено генерацией перекиси водорода и осуществляется только в присутствии молекулярного кислорода. Обнаружено, что запуск гибели опухолевых клеток, вызванной действием витамина В]2ь в сочетании с АК, связан с повреждением окислительно-восстановительной системы клеток, а именно с истощением внутриклеточного глутатиона.

Практическое значение.

Данное исследование является необходимым этапом для внедрения этого нового противоопухолевого препарата в медицинскую практику. Работа вносит вклад в развитие представлений о молекулярных и клеточных механизмах цитотоксического действия новых противоопухолевых препаратов - источников активных радикалов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Лещенко, Виолетта Викторовна

107 ВЫВОДЫ

1. Каталитическая система «гидроксикобаламин-аскорбиновая кислота» вызывает гибель опухолевых клеток при таких концентрациях компонентов, при которых они в отдельности нетоксичны. Характерное время инициации необратимого повреждения опухолевых клеток витамином В^ь в сочетании с АК 40-60 минут. Гибель клеток начинается после 4-8 ч воздействия. Цитотоксическое действие «Bi2b + C» связано с сорбцией клеткой В]2Ь.

2. Витамин Bi2b в сочетании с АК имеет генотоксическое действие и индуцирует апоптоз в опухолевых клетках. Фрагментация ДНК происходит во время инициации гибели клеток в результате действия «Bi2b + с».

3. Комбинация витаминов В12Ь и С блокирует синтез ДНК, митотическую активность и обладает более выраженным повреждающим действием на пролиферирующие клетки в S фазе клеточного цикла.

4. Цитотоксическое действие каталитической системы «гидроксикобаламин-аскорбиновая кислота» на опухолевые клетки in vitro обусловлено генерацией перекиси водорода и осуществляется только в присутствии молекулярного кислорода.

108

5. Установлено, что во время инициации гибели клеток в результате сочетанного действия витаминов В^ь и С а) не происходит повреждение SH-групп белков клеточной поверхности; б) не происходит изменение внутриклеточного рН; в) не происходит изменение функциональной активности митохондрий; г) не повышается уровень содержания перекиси водорода в клетке; д) происходит истощение глутатиона в клетке, обусловленное его деградацией или нарушением синтеза, но не окислением.

6. Истощение глутатиона и повреждения ДНК могут быть одними из основных причин гибели опухолевых клеток в результате действия витамина Bi2b в сочетании с витамином С.

110

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лещенко, Виолетта Викторовна, Пущино

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М.: Мир, 1983. 264 с.

2. Акатов B.C., Гробова М.Е., Кошевой Ю.В. Внутриклеточный рН и субстратная зависимость пролиферации фибробластов китайского хомячка // Цитология. 1991. Т. 33, № 7, с. 86-94.

3. Борисенкова С.А., Гиренко Е.Г., Калия О.Л. Механизмы окисления аскорбиновой кислоты и проблемы каталитической (темновой) терапии рака // Российск. химич. журн. 1998. Т. 42, № 5, с. 111-115.

4. Вольпин М.Е., Кнорре Д.Г., Новодарова Г.Н., Тувин М.Ю., Федорова О.С., Фролова Е.И. Хелатные комплексы кобальта как катализаторы расщепления цепей ДНК // ДАН СССР. 1988. Т. 298, № 2, с. 363-366.

5. Вольпин М.Е., Новодарова Г.Н., Крайнова Н.Ю., Крынецкая Н.Ф., Метелев В.Г., Шабарова З.А. Корриновые комплексы кобальта как катализаторы расщепления РНК. Механизмы расщепления нуклеиновых кислот // ДАН СССР. 1991. Т. 317, № 3, с. 650-652.

6. Гамалей И.А., Клюбин И.В. Перекись водорода как сигнальная молекула //

7. Цитология. 1996. Т. 38, № 12, с. 1233-1247.

8. Девис М., Остин Дж., Патридж Д. Витамин С. Химия и биохимия. М.: Мир, 1999. 176 с.

9. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1998. 554 с.

10. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б., Вольский Н.Н., Козлов В.А. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз // Усп. Соврем. Биол. 1999. Т. 119, № 5, с. 440-450.

11. Киселева JI.JI., Новодарова Г.Н., Вольпин М.Е. Гидрофобные производные витамина Bi2 как ингибиторы дыхания и АТФ-азной активности митохондрий // ДАН СССР. 1990. Т. 312, № 2, с. 489-492.

12. Кнорре Д.Г., Федорова О.С., Фролова Е.И. Окислительная деградация нуклеиновых кислот // Успехи химии. 1993. Т. 62, № 1, с. 70-91.

13. Кошевой Ю.В., Акатов B.C., Гробова М.Е. Микроспектрофлуориметр для измерения внутриклеточного рН (МИКрН) // Приборы и оборудование для исследований в области физико-химической биологии и биотехнологии. Пущино. 1990. С. 8-14.

14. Медведев А.И., Король Б.А., Шлектарев В.А., Уманский С.Р. Денситомегрическое определение нуклеиновых кислот в гелях после электрофореза // Прикл. биох. микробиол. 1984. Т.20, № 3, с. 420-427. Мецлер Д. Биохимия. Т.2. М.: Мир, 1980. 606 с.

15. Ю.Ф.Крылов. 2001, с. 1157-1161. Розанов Ю.М. Проточная цитометрия / Методы культивирования клеток.

16. Л.: Наука, 1988, с. 136-146. Румянцева Г.В., Вайнер Л.М., Тувин М.Ю., Новодарова Г.Н., Вольпин М.Е. Генерация ОН-радикалов при окислительно-восстановительных реакциях корриновых комплексов кобальта // Изв. АН СССР, сер. хим. 1989. Т. 12, с. 2679-2683.

17. Соловьева М.Е., Акатов B.C., Лещенко В.В., Кудрявцев А.А. Механизм гибели клеток миеломы NS/0 в культуре // Изв. Акад. Наук, сер. биол. 1998. №2, с. 194-199.

18. Фридович И. Радикалы кислорода, пероксид водорода и токсичность кислорода / Свободные радикалы в биологии. Т. 1. М: Мир, 1979, с. 272-314.

19. Ames B.N., Shigenaga М.К., Hagen Т.М. Oxidants, antioxidants, and degenerative diseases of aging //Pros. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. Vol.90, pp. 7915-7922.

20. Anderson, M.E. Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological samples // Methods Enzyrnol. 1985. Vol. 113, pp. 548-555.

21. Barry, M.A., Eastman, A. Identification of deoxyribonuclease II as an endonuclease involved in apoptosis // Arch. Biochem. Biophys. 1993. Vol. 300, pp. 440-450.

22. Basaga, H.S. Biochemical aspects of free radical // Biochem. Cell Biol. 1990.1. Vol. 68, pp. 989-998.

23. Bell, R.M., Burns, D.J. Lipid activation of protein kinase С // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 266, pp. 4661-4664.

24. Benade, L., Howard, Т., Burk, D. Synergistic killing of Ehrlich ascites carcinoma cells by ascorbate and 3-amino-l,2,4-triazole // Oncology (Basel). 1969. Vol. 23, pp. 33-43.

25. Bergmeyer, H.U. Methods of enzymatic analysis. Verlag Chemie, GMBH, Weinheim/Bergstr, Academic Press, New York & London, 1963. Vol. III, pp. 273-292.

26. Bicknell, G.R., Cohen, G.M. Cleavage of DNA to large kilobase pair fragments occurs in some forms of necrosis as well as apoptosis // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. Vol. 207, pp. 40-47.

27. Bozzi, A., Mavelli, I., Finazzi Agro, A., Strom, R., Wolf, A.M., Mondovi, В., Rotilio, G. Enzyme defense against reactive oxygen derivatives. II. Erythrocytes and tumor cells // Mol. Cell. Biochem. 1976. Vol. 10, pp. 1116.

28. Bram, S., Froussard, P., Guichard, M., Jasmin, C., Augery, Y., Sinoussi-Barre, F., Wray, W. Vitamin С preferential toxicity for malignant melanoma cells // Nature (Lond.) 1980. Vol. 284, pp. 629-631.

29. Briehl, M.M., Cotgreave, I.A., Powis, G. The down regulation of antioxidant genes infers oxidative stress during glucocorticoid-mediated apoptosis // Cell Death and Differentiation. 1995. Vol. 2, pp. 41-46.

30. Burdon, R.H. Superoxide and hydrogen peroxide in relation to mammalian cell proliferation //Free Rad. Biol. Med. 1995. Vol. 18, № 4, pp. 775=794.

31. Bursch, W., Oberhammer, F., Schullte-Hermann. Cell death by apoptosis and its protective role against disease // TiPS. 1992. Vol. 13, pp. 245-251.

32. Burton, G.W., Cheeseman, K.N., Doba, Т., Ingold, K.U., Slater, T.F. Vitamin E as an antioxidant in vitro and in vivo // Giba Found. Symp. 1983. Vol. 101, pp. 4-14.

33. Buttke, T.M., Sandstrom, P.A. Oxidative stress as a mediator of apoptosis // Immunol. Today. 1994. Vol. 15, pp. 7-10.

34. Cathcart, R., Schwier, E., Ames, B.N. Detection of picomole levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay // Anal. Biochem. 1983. Vol. 134, pp. 111-116.

35. Cohen, G.M., Sun, X.M., Fearnhead, H., MacFarlane, M., Brown, D.G., Snowden, R.T., Dinsdale, D. Formation of large molecular weight fragments of DNA is a key committed step of apoptosis in thymocytes // J. Immunol. 1994. Vol. 153, pp. 507-516.

36. Cohen, J.J. Apoptosis // Immunol. Today. 1993. Vol.14, pp. 126-130.

37. Elliott, S.J., Meszaros, J.G., Schilling, W.P. Effect of oxidant stress on calcium signalling in vascular endothelial cells // Free Rad. Biol. Med. 1992. Vol. 13, pp. 635-650.

38. Fridovich, I. The biology of oxygen radicals /7 Science. 1978. Vol. 201, pp. 875880.

39. Fryer, M.J. The mechanism of apoptosis, cell membrane lipid peroxidation and novel in vivo function for antioxidant vitamin E (a-tocopherol) // Redox Rept. 1995. Vol.1, pp. 159-162.

40. Gebicki, S., Gebicki, J.M. Formation of peroxides in amino acids and proteins exposed to oxygen free radicals // Biochem. J. 1993. Vol. 289, pp. 743-749.

41. Gerschenson, L.E., Rotello, R.J. Apoptosis: a different type of cell death // FASEB J. 1992. Vol. 6, pp.2450-2455.

42. Gorman, A., Mcgowan, A., Cotter, T.G. Role of peroxide and superoxide anion during tumour cell apoptosis // FEBS Letts. 1997. Vol.404, pp. 27-33.

43. Gottlieb, R.A., Nordberg, J., Skowronski, E., Babior, B.M. Apoptosis induced in Jurkat cells by several agents is preceded by intracellular acidification // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93, pp. 654-658.

44. Hall, A.G. The role of glutathione in the regulation of apoptosis // Eur. J. Clin. Inv. 1999. Vol. 29, pp. 238-245.

45. Hall, C.A. The uptake of vitamin Bi2 by human lymphocytes and therelationships to the cell cycle // J. Lab. Clin. Med. 1984. Vol. 103, № 1, pp. 70-81.

46. Hall, C.A., Begley, J.A., Green-Colligan P.D. The availability of therapeutic hydroxocobalamin to cells // Blood. 1984. Vol. 63, № 2, pp. 335-341.

47. Halliwell, B. Oxidants and human disease: some new concepts // FASEB J. 1987. Vol. 1, pp. 358-364.

48. Halliwell, В., Foyer, C.H. Ascorbic acid, metal ions and the superoxide radical // Biochem.J., 1976. Vol.155, pp. 697-700.

49. Halliwell, В., Gutteridge, J.M.C. Oxygen free radicals and iron in relation to biology and medicine: some problems and concepts // Arch. Biochem. Biophys. 1986. Vol. 246, pp. 501-514.

50. Hammar, S.P., Mottet, N.K. Tetrazolium salt and electron-microscopic studies of cellular degeneration and necrosis in the interdigital areas of the developing chick limb // J. Cell Sci. 1971. Vol. 8, pp. 229-251.

51. Hecht S.M., ed. Bleomycin, chemical, biochemical, and biological aspects, Springer-Verlag, New York, 1979.

52. Hinshaw, D.B., Sklar, L.A., Bohl, В., Schraufslatter, I.U., Hyslop, P.A., Rossi,

53. M.W., Spragg, R.G., Cochrane, C.G. Cytoskeletal and morphological impact of cellular oxidant injury // Amer. J. Pathol. 1986. Vol. 123, pp. 454-464.

54. Houslay, M.D., Stanley, K.K. Dynamics of biological membrane. Chichester: Wiley, 1982, pp. 92-138.

55. Huang, C-S, Chang, L-S, Anderson, M.E., Meister A. Catalytic and regulatory properties of the heavy subunit of rat kidney gamma-glutamylcysteine synthetase // J. Biol. Chem. 1993. Vol.268, pp. 19675-19680.

56. Jarabak, R., Jarabak, J. Effect of ascorbate on the DT-diaphorase-mediated redox cycling of 2-methyl-l,4-naphthoquinone Л Arch. Biochem. Biophys. 1995. Vol. 318, pp. 418-423.

57. Kane, D.J., Sarafian, T.A., Anton, R., Hahn, H., Gralla, E.B., Valentine, J.S., Ord, Т., Bredesen, D.E. Bcl-2 inhibition of neural death: decreasedgeneration of reactive oxygen species // Science 1993. Vol. 262, pp. 127419771. A / / •

58. Kass, G.E.N., Duddy, S.K., Orrenius, S. Activation of protein kinase С by redox-cycling quinones // Biochem. J. 1989. Vol. 260, pp.499-507.

59. Kerr J.F.C., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics // Br. J. Cancer. 1972. Vol. 11, pp. 239-257.

60. Kerr, J.F.C., Searle, J. Deletion of cells by apoptosis during castration-induced involution of the rat prostate // Virchows Archiv В Cell Pathol. 1973. Vol. 13, pp. 87-102.

61. Kimoto, E., Tanaka, H., Gyotoku, J., Moroshige, F., Pauling, L. Enhancement of antitumor activity of ascorbate against Ehrlich ascites tumor cells by the copper: glycylglycylhistidine complex // Cancer Research 1983. Vol. 43, pp. 824-828.

62. Kondo, H., Iseki, Т., Goto, S., Ohto, M., Okuda, K. Effects of cobalamin, cobalamin analogues and cobalamin binding proteins on P388Dj mouse leukemic cells in culture // Intern. J. Hemat. 1992. Vol. 56, pp. 167-177.

63. Kroemer, G, Dallaporta, B, Resche-Rigon M. The mitochondrial death/liferegulator in apoptosis and necrosis // Annu. Rev. Physiol. 1998. Vol. 60, pp. 619-642.

64. Kroemer, G, Petit, P, Zamzami, N, Vayssiere J.L., Mignotte, B. The biochemistry of programmed cell death // FASEB J. 1995. Vol. 9, pp. 1277-1287.

65. Kueng, W., Silber, E., Eppenberger, U. Quantification of cells cultured on 96-well plates // Anal. Biochem. 1989. Vol. 182. pp. 16-19.

66. Series A: Life Sciences. Plenum Press (New York and London), 1988. Vol. 146. Pp. 167-185.

67. Maniatis, Т., Fritch, E., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual.

68. Mellman, I.S., Youngdahl-Turner, P., Willard, H.F., Rosenberg, L.E. Intracellular binding of radioactive hydroxocobalamin to cobalamin-dependent apoenzymes in rat liver // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74, № 3, pp. 916-920.

69. Mercille, S., Massie, B. Induction of apoptosis in nutrient-deprived culture of hybridoma and myeloma cells // Biotech. Bioeng. 1994. Vol. 44, pp. 11401154.

70. Mimnaugh, E.G., Dusre, L., Atwell, J., Meyers, C.E. Differential oxygen radical susceptibility of Adriamycin sensitive and resistant MCF-7 human breast tumor cells // Cancer Res. 1989. Vol.49, pp. 8-15.

71. Neidle S., Waring M.J., eds. Molecular aspects of anticancer drug action / Topics in Molecular and Structural Biology 3, Macmillan, London. 1983.

72. Novgorodov, S.A., Gudz, T.I. Permeability transition pore of the inner mitochondrial membrane can operate in two open states with different selectivities IIJ Bioenerg. Biomembr. 1996. Vol.28, pp. 139-146.

73. Oberley, L.W., Bize, I.B., Sahu, S.K., Chan Leuthauser, S.W.H., Gruber, H.E. Superoxide dismutase activity of normal murine liver, regenerating liver, and H6 hepatoma // J. Natl. Cancer Inst. 1978. Vol. 61, pp. 375-378.

74. Osmak, M., Kovacek, I., Ljubenkov, I., Spaventi, R., Eckert-Maksic, M. Ascorbic acid and 6-deoxy-6-chloro-ascorbic acid: potential anticancer drugs // Neoplasma. 1997. Vol. 44, pp. 101-107.

75. Packer, J.E., Slater, T.F., Willson, R.L. Direct observation of a free radical interaction between vitamin E and vitamin С // Nature. !979. Vol. 278, pp. 737-738.

76. Park, C.H., Amare, M., Savin, M.A., Hoogstraten, B. Growth supression of human leukemic cells in vitro by L-ascorbic acid II Cancer Res. 1980. Vol. 40, pp. 1062-1065.

77. Perez-Sala, D., Collado-Escobar, D., Mollinedo, F. Intracellular alkalinization suppresses lovastatin-induced apoptosis in HL-60 cells through the inactivation of a pH-dependent endonuclease // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270, pp. 6235-6242.

78. Potselueva, M.M., Chukhlova, E.A., Medvedev, B.I., Evtodienko, Yu.V. Conditions for optimal production of active oxygen forms by rat polimorphnonuclear leukocytes // Biophysics. 1995 Vol. 40, pp. 12771282.

79. Poydock M.E. Effect of combined ascorbic acid and B-12 on survival of mice with implanted Ehrlich carcinoma and L1210 leukemia // Am. J. Clin. Nutr. 1991. Vol. 54, pp. 1261S-1265S.

80. Poydock M.E., Harguindey, S., Hart, Т., Takita, H., Kelly, D. Mitogenic inhibition and effect on survival of mice bearing LI210 leukemia using a combination of dehydroascorbic acid and hydroxycobalamin // Am. J. Clin. Oncol. 1985. Vol. 8, pp. 266-269.

81. Prasad, K.N., Sinha, P.K., Ramamjam, M., Sakomoto, A. Sodium ascorbate potentiates the growth inhibitory effect of certain agents on neuroblastoma cells in culture // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 76, pp. 829-832.

82. Pryor, W.A. Oxy-radicals and related species: their formation, lifetimes, and reactions // Annu. Rev. Physiol. 1986. Vol. 48, pp. 657-667.

83. Quadros E.V., Sai P., Rothenberg S.P. Characterization of the human placental membrane receptor for transcobalamin II-cobalamin // Arch. Biochem.

84. Biophys. 1994. Vol. 308, № 1, pp. 192-199.

85. Quadros, E.V, Jacobsen, D.W. The dynamics of cobalamin utilization in L-121Q mouse leukemia cells: a model of cellular cobalamin metabolism H Biochim. Biophys. Acta. 1995. Vol. 1244, pp. 395-403.

86. Rotello, R.J., Hocker MB., Gerschenson, L.E. Biochemical evidence for programmed cell death in rabbit uterine epithelium // Am. J. Pathol. 1989. Vol. 134, pp. 491-495.

87. Sahu, S.K., Oberley, L.W., Stevens, R.H., Riley, E.F. Brief communication: superoxide dismutase activity of Ehrlich ascites tumor cells // J. Natl. Cancer Inst. 1977. Vol. 58, pp. 1125-1128.

88. Sandstrom, P.A., Tebbey, P.W., Cleave, S.V., Buttke, T.M. Lipid hydroperoxides induce apoptosis in T cells displaying a HIV-associated glutathione peroxidase deficiency // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, pp. 798-801.

89. Spragg, R.G., Hinshaw, D.B., Hyslop, P.A., Schraufslatter, I.U., Cochrane, C.G. Alteration in ATP and energy degree in cultured endothelial and P388Dj cells following oxidant injury // J. Clin. Invest. 1985, Vol. 76, pp. 14711476.

90. Staal, F.J.J., Roederer, M., Herzenberg, L.A., Herzenberg, L.A. Intracellular thiols regulate the activation of nuclear factor Kappa В and transcription of human immunodeficiency vims // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87, pp. 9943-9949.

91. Stefanelli, C., Stanic, I., Bonavita, F., Muscari, C., Pignatti, C., Rossoni, C., Caldera, C.M. Oxygen tension influences DNA fragmentation and celldeath in glucocorticoid-treated thymocytes II Biochem. Biophys. Res. Comm. 1995. Vol. 212, pp. 300-306.

92. Stich, H.F., Wei, L., Whiting, R.F. Enhancement of the chromosome-damaging action of ascorbate by transition metals // Cancer Res. 1979. Vol. 39, pp. 4145-4151.

93. Taper, H.S., Roberfroid, M. Non-toxic sensitization of cancer chemotherapy by combined vitamin С and КЗ pretreatment in a mouse tumor resistant to oncovin//Anticancer Res. 1992. Vol. 12, pp. 1651-1654.

94. Taqui Khan, M.M., Martell, A.E. Metal ion and metal chelate catalyzed oxidation of ascorbic acid by molecular oxygen. I. Cupric and ferric ion catalyzed oxidation // J. Am. Chem. Soc., 1967. Vol. 89, pp. 4176-4185.

95. Thomas, C.E., Reed, D.J. Radical-induced inactivation of kidney Na+/K+-ATPase: sensitivity to membrane lipid peroxidation and the protective effect of vitamin E // Arch. Biochem. Biophys. 1990. Vol. 281, pp. 96-105.

96. Thomas, J.A., Bushsbaum, R.N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ // Biochemistry. 1979. Vol. 18, pp. 2210-2218.

97. Trump, B.F., Berezesky, I .К. The role of altered Ca .j regulation in apoptosis, oncosis, and necrosis // Biochim. Biophys. Acta. 1996. Vol. 1313, pp. 173178.

98. Um, H.D., Orenstein, J.M., Wahl, S.M. Fas mediated apoptosis in human monocytes by a reactive oxygen intermediate dependent pathway // J. Immunol. 1996. Vol. 156, pp. 3469-3477.

99. Urano, S., Yano, K., Matsuo, M. Membrane-stabilizing effect of vitamin E: effect of a-tocopherol and its model compounds on the fluidity of lecithin liposomes // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. Vol. 150, pp. 469475.

100. Vol'pin M.E., Levitin I.Ya., Osinski S.P. 3rd European Conference on Bio-inorganic Chemistry (Noordwijkerhout, The Netherlands; Aug. 4-10, 1996). Proceedings, P2.

101. Vol'pin, M.E., Novodarova, G.N. Some aspects of the relation between homogeneous and enzymatic catalysis: new prospects for using cobalt catalysts as biologically active compounds I I J. Mol. Cat. 1992. Vol. 74, № 1-3, pp. 153-162.

102. Vuillaume, M. Reduced oxygen species, mutation, induction and cancer initiation // Mutation Res. 1987. Vol. 186, pp. 43-72.

103. Walker P.R., Sikorska, M. New aspects of the mechanism of DNA fragmentation in apoptosis // Biochem. Cell Biol. 1997. Vol.75, pp. 287299.

104. Walker, N.I., Harmon, B.V., Gobe, G.C., Kerr, J.F.R. Patterns of cell death //

105. Meth. Ach. Exp. Path. 1988. Vol. 13, pp. 18-54. Walker, P.R., Kokileva, L., LeBlanc, J., Sikorska, M. Detection of the initial stages of DNA fragmentation in apoptosis // Biotechniques. 1993. Vol. 15, pp. 1032-1040.

106. Wyllie, A.H., Kerr, J.F.C., Currie, A.R. Cell death: the significance ofapoptosis // Int. Rev. Cytol. 1980. Vol. 68, pp. 251-306.

107. Xiang, J, Chao, D.T., Korsmeyer, S J. BAX-induced cell death may not requireinterleukin lbeta-converting enzyme-like proteases // Proc. Natl. Acad. Sci.

108. USA. 1996. Vol. 93, pp. 14559-14563.

109. Yakubovskaya, R., Oganesov, V.,- Surgey, V., Kaliya, O., Krainova, N.,

110. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

111. АК — аскорбиновая кислота, витамин С АФК активные формы кислорода ВМ-ДНК - высокомолекулярная ДНК ДМСО - диметилсульфоксид СОД - супероксиддисмутаза ТII - транскобаламин II ТХУ - трихлоруксусная кислота В^ь - гидроксикобаламин, витамин В^ь

112. BCECF/AM ацетоксиметиловый 2,7бис(карбоксиэтил)-5,6карбокси-флуоресцеин

113. DCHFDA 2',7'-дихлородигидрофлуоресцеиндиацетат

114. DTNB 5,5'-дитиобис-2-нитробензойная кислота

115. FBS эмбриональная телячья сыворотка1. FDA -флуоресцеиндиацетат1. GSH глутатион1. GSSG глутатион дисульфид1. SDS додецилсульфат натрия

116. TNB 2-нитро-5-тиобензойная кислота1. ТРР тетрафенилфосфоний