Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активные формы кислорода и азота в митохондриях сердца и модельных системах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Активные формы кислорода и азота в митохондриях сердца и модельных системах"

На правах рукописи

Заббарова Ирина Валерьевна

АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И АЗОТА В МИТОХОНДРИЯХ СЕРДЦА И МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ

Специальность 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-2004

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова,

в НИИ экспериментальной кардиологии ГУ РКНПК Минздрава России, в Институте фармакологии и токсикологии Университета ветеринарной медицины (г. Вена, Австрия).

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор

Рууге Энно Куставич

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор

Петрусевич Юрий Михайлович

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Иванова Марина Валентиновна

Ведущая организация:

Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН

Защита диссертации состоится 14 октября 2004 г. в 'А-/ ч. на заседании Диссертационного совета К 501.001.08 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М. В. Ломоносова, Физический факультет, аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 501.001.08 кандидат физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Образование активных форм кислорода (Ор, ОН', Н2О2) в результате процессов жизнедеятельности организма является неотъемлемой составляющей аэробного метаболизма. Образование свободных радикалов кислорода в биологических системах происходит постоянно и является как прямым результатом функционирования ряда специальных ферментативных систем, так и следствием побочного процесса множества окислительно-восстановительных реакций в клетке. Значительный интерес в отношении короткоживущих свободных радикалов обусловлен, прежде всего, их высокой химической активностью.

Основным потребителем кислорода в клетках сердечной мышцы является дыхательная цепь митохондрий - более 90 % всего потребляемого клеткой кислорода восстанавливается до воды с участием цитохром с оксидазы митохондрий, поэтому способность митохондрий к одноэлектронному восстановлению кислорода представляет наибольшую опасность. В обычных условиях, когда скорость побочного образования активных форм кислорода относительно невысока (< 2 %), антиоксидантная система клетки эффективно защищает от развития окислительного стресса. В условиях пониженного энергетического метаболизма, в состоянии 4 митохондриальной дыхательной цепи, при существенном увеличении внутриклеточной концентрации кислорода, происходят также значительные сдвиги в редокс-состоянии электронных переносчиков, способствующие резкому возрастанию скорости генерации свободных радикалов кислорода.

Участие свободных радикалов, а также других токсических форм кислорода в развитии патологических состояний сердечной мышцы после длительной ишемии в настоящее время является доказанным. Ишемия характеризуется как неадекватное снабжение ткани кислородом и необходимыми метаболитами и обусловлена нарушениями в системе кровообращения. Было' обнаружено, что следующая за длительной ишемией

РОС. ПЛИНСНАЛЬНАЯ М";ЛМРТЕКА

ОктерСург ОЭ "00/. акт

миокарда реперфузия сопровождается значительными тканевыми повреждениями и нарушениями сократительной способности - появлением аритмий и временной механической дисфункции. Это явление, получившее название «кислородный парадокс», обусловлено резким усилением генерации активных форм кислорода при восстановлении нормального уровня внутриклеточного кислорода.

Адаптация к ишемии (ишемическое прекондиционирование) - краткая серия непродолжительных циклов ишемии-реперфузии, предшествующая длительной ишемии - привлекает внимание в силу оказываемого им защитного действия на миокард, его адаптации к ишемическому стрессу. В силу того, что основным повреждающим фактором реперфузии сердечной мышцы являются активные формы кислорода, представляет большой интерес влияние ишемического прекопдиционирования на активность генерации свободных радикалов кислорода митохондриями. Очевидно, что защитный эффект реализуется в период длительной ишемии на основании тех изменений, которые происходят в кардиомиоцитах в результате адаптации к ишемии. Представляет интерес вопрос о том, в течение какого времени длительной ишемии проявляется защитный эффект адаптации. Известно, что степень ишемических повреждений миокарда определяется длительностью ишемии. Так как супероксидные радикалы вносят основной вклад в повреждения миокарда после ишемии, величина постишемической генерации активных форм кислорода должна быть пропорциональна длительности ишемии.

Супероксидный анион-радикал, образующийся в митохондриях, является предшественником более токсичных активных форм кислорода и азота. Действительно, при взаимодействии супероксида и оксида азота возникает пероксинитрит который далее распадается с образованием таких

сильнейших окислителей как гидроксильный радикал и радикал диоксида азота.Известно, что пероксинитрит может приводить к окислительной модификации компонентов митохондриальной дыхательной цепи, в том числе коэнзима Q, флавопротеинов и железо-серных белков. В то же время

пероксинитрит может быть субстратом цитохромокисдазы и нейтрализовываться специфическими митохондриальными перокси-редоксинами, обладающими пероксидазной активностью белками. С другой стороны, N0 может эффективно ингибировать перекисное окисление липидов, то есть, является антиоксидантом. Важную роль в антиоксидантном действии оксида азота, по-видимому, играют динитрозильные комплексы железа (Б№С), образующиеся при взаимодействии N0 с ионами железа и тиолами. В связи с тем, что N0, генерируемый митохондриальной N0-синтазой, способен превращаться как в пероксинитрит так и в Б№С, весьма важным является изучение взаимодействий между метаболитами оксида азота и активными формами кислорода. Эти исследования особо актуальны, так как данные взаимодействия могут определять баланс антиоксидапшых и прооксидантных процессов в митохондриях и в целом в клетке. Цель и задачи исследования

Целью работы являлось изучение механизмов регуляции процессов образования и гибели активных форм кислорода и азота в кардиомиоцитах -сократительных клетках сердечной мышцы - в условиях, моделирующих окислительный стресс и защитное действие антиоксидантных систем клетки. Исходя из общей цели, в диссертации решались следующие задачи:

1. Изучение влияния ишемии различной длительности и реперфузии на функциональную активность митохондрий сердца и кинетику образования ими свободных радикалов кислорода.

2. Исследование роли экзогенного коэнзима при защите клеток сердечной мышцы от повреждений, вызванных окислительным стрессом.

3. Изучение антиоксидантных свойств динитрозильных комплексов железа в условиях моделируемого окислительного стресса, в том числе в условиях перекисного окисления в митохондриях сердца крысы.

4. Исследование антиоксидантных свойств Б№С в условиях генерации феррилмиоглобина и органических свободных радикалов. Изучение влияния

супероксидных радикалов на образование DNIC с участием ферритина и тиолов.

Научная новизна диссертации

1. С помощью метода спектроскопии ЭПР проведено исследование кинетики образования и табели активных форм кислорода и азота и их метаболитов в условиях варьируемого содержания кислорода в среде инкубации.

2. Впервые проведено исследование зависимости функциональной активности дыхательной цепи митохондрий и генерации ими активных форм кислорода от длительности ишемии и реперфузии сердечной мышцы.

3. Показано, что диета с коэнзимом Q приводит к уменьшению необратимых повреждений клеток миокарда в результате окислительного стресса и способствует сохранению энергетического метаболизма и сократительной функции сердечной мышцы.

4. Показано антиоксидантное действие метаболитов оксида азота в условиях, моделирующих окислительный стресс в ходе ишемии-реперфузии сердечной мышцы.

5. При исследовании антиоксидантных свойств динитрозильных комплексов железа - метаболитов оксида азота - впервые продемонстрировано их взаимодействие с активными формами кислорода и азота.

6. Установлено, что динитрозильные комплексы железа эффективно восстанавливают оксоферрилмиоглобин, образующийся в условиях, моделирующих окислительный стресс при ишемии и последующей реперфузии сердечной мышцы.

Научно-практическая значимость исследования

Представленные в диссертации экспериментальные данные могут быть использованы для выяснения молекулярных механизмов процессов, влияющих при нарушениях сократительной функции миокарда на сопряжение митохондриального дыхания и энергизации, а также на образование активных форм кислорода и азота в клетках сердечной мышцы.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы докладывались на 11 всероссийских и международных конференциях, в том числе, на международной конференции «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода» (Пущино, 2000), международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2001» (Москва, 2001), XI международной конференции «Магнитный резонанс в химии и биологии» (Звенигород, 2001), на «I Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии» (Москва, 2001), Национальной научно-практической конференции с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, 2001), «5th Workshop on EPR Applications in Biology and Medicine» (Krakow, 2001), International Symposium «Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Diagnostic, Preventive and Therapeutic Values» (St. Petersburg-Kizhi, 2002), Российском национальном конгрессе кардиологов «От исследований к стандартам лечения» (Москва, 2003), International conference «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health» (Smolensk, 2003), Научной конференции «Ломоносовские чтения» (Москва, 2004) и на III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004). Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 24 печатных работ, в числе которых 6 статей в российских и международных научных журналах.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора- литературы (глава 1), методической части (глава 2), описания собственных результатов и их обсуждения (главы 3, 4), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем работы составляет 114 страниц, включая 36 рисунков, 2 таблицы и библиографию из 156 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы. Обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

Первая глава содержит литературный обзор, посвященный активным формам кислорода и азота в биологических системах. Изложены данные об образовании свободных радикалов и других токсических метаболитов кислорода и азота митохондриями сердца и о возможных путях их дальнейшего метаболизма. Кратко описаны экспериментальные методы исследования, используемые при изучении генерации активных форм кислорода и азота. Изложены современные представления о прооксидантной и антиоксидантной роли метаболитов оксида азота. Отдельное внимание уделено вопросам участия свободных радикалов в развитии клеточных повреждений при определенных патологических состояниях, связанных с нарушениями кислородного обмена -при ишемии и гипоксии, анализу современных представлений о механизмах защитного свойства ишемического прекондиционирования, предшествующего длительной ишемии.

Во второй главе представлены методы и материалы исследования. В разделе 2.1 приводится описание методики выделения митохондрий. Митохондрии изолировали из сердец крыс по стандартной методике (Hogeboom, 1955) в различных экспериментальных условиях: без предварительной обработки сердца и сразу после завершения физиологической части эксперимента. В разделе 2.2 описывается физиологическая обработка сердец, предшествующая выделению митохондрий в экспериментах, посвященных исследованию влияния ишемического прекондиционирования, ишемии и реперфузии на митохондрии кардиомиоцитов. В процессе этой обработки сердца крыс линии Wistaг перфузировали при 37°С ретроградно по методу Лангендорфа в изоволюмическом режиме модифицированным раствором Кребса-Хензелейта (рН 7,4), насыщенным карбогеном (95% О2 + 5% СО2). Для измерения внутрижелудочкового давления в полость левого желудочка вводили катетер с

б

латексным баллончиком, заполненным жидкостью. В качестве параметров сократительной функции работающего сердца были выбраны систолическое, диастолическое и развиваемое давление, которое определялось как разность между систолическим и диастолическим давлением. Ишемия достигалась путем полного прекращения потока перфузата через систему. Ишемическое прекондиционирование заключалось в последовательном чередовании четырех коротких (5 мин) периодов ишемии и реперфузии. Затем следовал период длительной (15, 30, 45 или 60 мин) ишемии. Восстановление сократительной способности миокарда наблюдали в течение 45 мин. Контрольную группу сердец подвергали только аэробной перфузии, длительной ишемии и реперфузии. Раздел 23 посвящен описанию подготовки животных и физиологической обработки их сердец в экспериментах по изучению действия экзогенного убихинона. Животные экспериментальной группы кроме обычного рациона получали убихинон в гидрофильной форме. Перфузия сердец проводилась, как описано выше, раствором Кребса-Хензелейта, содержащим субстраты, обеспечивающие максимальную работоспособность сердца. Схема опыта включала определение максимальной интенсивности сократительной функции (ИСФ), представляющей произведение развиваемого давления и частоты сокращений, при градуальном повышении скорости перфузии. Максимальная работоспособность сердца в данных условиях достигалась при введении в перфузат изопротеренола, после чего на фоне прежней скорости перфузии и продолжающегося введения изопротеренола оценивали состояние системы антиоксидантной защиты миокарда посредством введения в перфузат перекиси водорода в качестве индуктора свободнорадикального окисления. В разделе 2.4 приводится методика определения скорости потребления кислорода митохондриальной дыхательной цепью с помощью электрода Кларка на полярографе Oxygen Monitor Model 53 фирмы YSI (США). Раздел 2.5 посвящен описанию методов получения препаратов, используемых в экспериментах по изучению путей метаболизма оксида азота, определяющих баланс прооксидантных и антиоксидантных процессов в митохондриях. В разделе 2.6

описывается методика регистрации спектров ЭПР, производимой на спектрометре Е-109Е фирмы Varían (США). Определение скорости генерации свободных радикалов кислорода митохондриями проводилось с использованием спиновой ловушки TIRON (4,5-диоксибензол-1,3-дисульфонат натрия) при комнатной температуре. Образовавшиеся в митохондриях супероксидные радикалы окисляют спиновую ловушку TIRON до семихинонной формы, интенсивность сигнала ЭПР которой определяется скоростью генерации радикалов 0'2~. Суспензию митохондрий помещали в тонкостенный тефлоновый капилляр, что позволило проводить инкубацию митохондрий непосредственно в резонаторе спектрометра ЭПР при непрерывной оксигенации образца (газовая среда - воздух). Содержание кислорода в среде инкубации определяли по ширине компонент спектра ЭПР нитроксильного радикала TEMPONE-I5N-D16 (4^кс»-2Д,6,6-тетраметил-шгаервдин-01б-1-оксил-15Ы). Абсолютные, значения скорости образования- митохондриями определяли по интенсивности сигнала ЭПР спиновой ловушки TIRON, а калибровочную кривую подсчитали с помощью супероксид-генерирующей. системы ксантиноксидаза-ксантин. Концентрацию динитрозильных комплексов железа (DNIC) также определяли методом спектроскопии ЭПР. Для этого используемую димерную форму DNIC, не обнаруживаемую методом ЭПР, переводили в мономерную ЭПР-детектируемую форму. Образцы помещались в стеклянные или газопроницаемые капилляры, спектры регистрировались при комнатной температуре.

Статистическую обработку полученных результатов производили по t-тесту и тесту ANOVA Результаты представлены как среднее значение ± средняя ошибка . Различия между экспериментальными данными считали

достоверными, если Р < 0,05.

В третьей главе представлены собственные результаты, касающиеся влияния ишемии разной длительности, ишемического прекондиционирования и окислительного стресса, как такового, на функциональное состояние сердца, митохондрий и скорость генерации ими активных форм кислорода и их

обсуждение. Раздел 3.1 посвящен исследованию сократительной функции сердец, подвергаемых ишемическому прекондиционированию и/или тотальной ишемии длительностью 15 или 30 мин. Ишемическое прекондиционирование не влияло на функциональное состояние сердца: параметры сократительной функции уменьшались незначительно и не отличались от параметров в контрольной группе. Однако после длительной (30 мин) ишемии и последующей реперфузии в функциональной способности сердец двух групп появлялись значительные различия. Диастолическое давление, отражающее в изоволюмическом режиме степень напряжения миокардиальных волокон (контрактуру), начинало возрастать в группе, адаптированной к ишемии, раньше, чем в контрольной группе (рис. I).

Динамика контрактуры в обеих группах была одинакова, но степень её как на максимуме, так и к концу ишемии, была значительно ниже в группе прекондиционированных сердец. В начальном периоде реперфузии в обеих группах наблюдали значительный подъем

диастолического давления. В течение реперфузии этот повышенный уровень

практически сохранился в контрольной группе, но существенно снизился. до предреперфузионного уровня в группе, адаптированной к ишемии (рис. 1). В серии опытов, где длительность ишемии составляла 15 мин, не было отмечено каких-либо функциональных различий между группами. Этот факт указывает, что защитное действие адаптации сопряжено с процессами, которые происходят

после первых 15 мин ишемии Известно, что период 2 5-30 мин является критическим для восстановления насосной функции изолированного сердца крыс. Вероятно, в этот период в кардиомиоцитах происходят необратимые изменения мембран саркоплазматического ретикулума и митохондрий в связи с активацией кислых протеаз и происходит избыточное накопление в

клетках. В разделе 3.2 представлены результаты измерений скоростей потребления кислорода в третьем и четвертом состояниях дыхательной цепи митохондрий (рис. 2). Митохондрии, выделенные из сердец без предварительной обработки ишемическим инсультом, имели высокий дыхательный контроль по ADP. 15-минутная ишемия не приводила к заметным изменениям.

Рпс 2. Скорость дыхания митохондрии, изолированных из сердец после тотальной ишемии различной длительности в состояниях 3 и 4

Митохондрии, перенесшие 30-минутную ишемию, обладали высокой скоростью потребления кислорода в отсутствие субстратов фосфорилирования. На дыхательную цепь митохондрий, выщеленнык из сердец, перенесших 45-минутную ишемию, не действовали разобщители, что говорит о нарушении целостности мембран и функции АТР-синтетазы. В случае ишемии длительностью 60 мин скорость дыхания быша очень низкой и не подавлялась

полностью ингибиторами, дыхательной, цепи. Это говорит о сильных повреждениях комплексов переносчиков дыхательной цепи. Прекондиционирование не оказывало существенного влияния на функциональные характеристики митохондрий: дыхательный контроль митохондрий,. выделенных из прекондиционированных сердец до длительной ишемии, был равен по величине его значению в контрольной группе. Различия появлялись после длительной (30 мин) ишемии и реперфузии. Так, скорости потребления кислорода в третьем и четвертом состояниях дыхательной цепи митохондрий контрольной группы в конце реперфузии имели более высокие и практически равные значения. В прекондиционированной группе характеристики митохондрий были значительно лучше как после ишемии, так и после реперфузии

В разделе 33 представлены результаты экспериментов по измерению скоростей генерации супероксидных радикалов митохондриями. На рис. 3 показаны величины сигналов ЭПР TIRON, записанных через 10 мин после введения суспензии митохондрий в газопроницаемый тефлоновый капилляр. В

Рис 3. Зависимость величины сигнала ЭПР TIRON от присутствия в суспензии митохондрий субстратов окисления и ингибиторов дыхательной цепи. Добавки: сукцинат (1), сукц. и ротенон (2), сукц. и антимицин А (3), сукц., антимицин А и ротенон (4), глутумат, малат, и сукц. (5), глутумат, малат, сукц. и ротенон (б), глутумат, малат, сукц. и антимицин А (7), глутамат, малат, сукц., антимицин А и ротенон (8).

отсутствие субстратов окисления (в первом состоянии дыхательной цепи митохондрий) сигнал ЭПР TIRON не регистрировался. В четвертом состоянии дыхательной цепи, в присутствии сукцината в качестве субстрата, величина скорости генерации супероксидных радикалов, рассчитанная по приведенным

2 3 4

6 7 8

выше калибровочным кривым, оказалась равной - 0,03 нмоль 0~/ мин / мг белка. Величина сигнала ЭПР от TIRON сильно возрастала в присутствии антимицина А - ингибитора bei комплекса дыхательной цепи, блокирующего на матриксной стороне митохондриальной мембраны перенос электрона от цитохрома bs« на окисленный коэнзим Q. Сукцинат-зависимое окисление TIRON замедлялось при добавлении в среду инкубации ротенона - ингибитора комплекса I дыхательной цепи. При использовании сукцината в качестве субстрата окисления образование существенной части супероксидных радикалов связано с обратным переносом электронов от сукцината на Ротенон

блокирует обратный перенос электронов в комплексе I и, тем самым, ограничивает локализацию центров генерации радикалов Oj" bci сегментом дыхательной цепи. Образование супероксидных радикалов в bci сегменте происходит благодаря прямой реакции с кислородом нестабильной фракции семихинонов коэнзима Q. Добавление ротенона в присутствии глутамата и малата в инкубационной среде приводило к заметному увеличению величины сигнала ЭПР. Это является свидетельством того, что супероксидные радикалы в комплексе I образуются по субстратную сторону от места действия ротенона.

В присутствии другого ингибитора Q-цикла - миксотиазола - сигнал уменьшался до нерегистрируемого уровня. Супероксидцисмутаза и цианид подавляли сукцинат-зависимое окисление TIRON на 90 + 95%, что свидетельствует об образовании семихинонов TIRON за счет реакции с кислородными радикалами, генерируемыми дыхательной цепью. Максимального значения скорость сукцинат-зависимой генерации кислородных радикалов митохондриями достигала в присутствии антимицина А и была равна 0,9 ± 0,2 нмоль 0'2~/ мин / мг белка.

На рис. 4. представлены результаты измерений скорости генерации супероксидных радикалов митохондриями, выделенными после тотальной ишемии разной длительности. Видно, что с увеличением длительности ишемии до 30 мин увеличивается значение скорости генерации супероксидных

радикалов, что говорит о зависимости степени повреждения миокарда от продолжительности ишемического инсульта. Значительное снижение скорости генерации О^" при дальнейшем увеличении длительности ишемии до 60 мин, возможно, объясняется

необратимыми повреждениями мембран митохондрий. Эти результаты соответствуют предположению о существовании «порогового» значения длительности ишемии, превышение которого влечет такие тяжелые повреждения, что даже реперфузия не может их усилить.

Корреляция между улучшением сократительной функции миокарда и увеличением образования кислородных радикалов во время кратких периодов ишемии - реперфузии, также обнаруженного нами, свидетельствует в пользу предположения об участии супероксидных радикалов в запуске защитных механизмов ишемического прекондиционирования. В группе прекондициоштрованных сердец скорость генерации супероксидных радикалов была достоверно ниже, чем в контрольной группе сердец, перенесших 30-минутную ишемию как в митохондриях, выделенных сразу после ишемии, так и в случае их выделения после последующей 45-минутной реперфузии.

В разделе 3.4 представлены результаты исследований сердец, подверпгутых окислительному стрессу. Показано, что скорость сукцинат-зависимой генерации супероксидных радикалов в присутствии антимицина А в

митохондриях, выделенных из сердец крыс, получавших убихинон (Зю, была в 4 раза ниже, чем в митохондриях из сердец контрольной группы, тогда как скорости дыхания были очень низкими и почти одинаковыми в обеих группах.

Четвертая глава посвящена результатам изучения путей метаболизма оксида азота, определяющих баланс прооксидантных и антиоксидантных процессов в митохондриях.

Антиоксвдантные свойства предполагают прямое взаимодействие исследуемых комплексов N0 с активными формами кислорода, азота и липцдными радикалами. На рис. 5 продемонстрированы полученные нами кинетики деструкции Б№С при их взаимодействии с супероксцдным радикалом и свободными радикалами трет-бугила.

Т-'-1-1-1-1-I-■-1-----1-■-1-'-Г

О 10 20 30 40 0 10 20 30

Время, мин

Рис 5. Кинетики деструкции DNIC в условиях ферментативной генерации супероксида: А - 1 мМ ксантина, 0,2 ед/мл ксантиноксидазы, 120 мкМ DNIC, ОД мМ DTPA; В - А + 200 ед/мл каталазы. Кривые 2А и 2Б отражают распад DNIC в присутствии 100 мкМ метмиоглобина

Каталаза практически полностью снимала эффект усиления деструкции DNIC под действием миоглобина в условиях ферментативной генерации супероксида системой ксантин-ксантиноксидаза, что говорит о существенном вкладе гидроксильного радикала, возникающего при катализируемом миоглобином распаде перекиси водорода, в деструкцию DNIC (рис. 5). Перекись водорода, в

и

свою очередь, образуется в ходе дисмутации супероксида. Также обнаружено, что DNIC способны перехватывать супероксидный радикал, генерируемый при декомпозиции супероксида калия. В то же время в наших экспериментах супероксид был способен стимулировать происходящее с участием ферритина образование DNIC. В этих условиях супероксид, по-видимому, увеличивал выход ионов железа из ферритина и тем самым вызывал рост концентрации DNIC.

При генерации супероксида митохондриями в присутствии сукцината и антимицина нами также было обнаружено снижение концентрации DNIC, что указывает на их возможную антиоксидантную функцию в физиологических условиях, например при ишемическом поражении сердечной мышцы (рис. 6).

Рис. 6. Деструкция DNIC при генерации супероксида митохондриями. 1 - антимицин + сукщшат + 140 мкМ DNIC + 5,5 мМ цистеин; 2-12 мин инкубации митохондрий с ан' тимицином и сукцинатом после чего добавлены DNIC и цистеин. 3-3 мин инкубации митохондрий с антимицином и сукцинатом далее 6 мин инкубации с DNIC после чего добавлялся цистеин.

Время,

При ишемии и реперфузии биологических тканей активные формы кислорода, генерируемые митохондриями, могут приводить к перекисному окислению липидов и гибели клеток по пути апоптоза или некроза. В связи с этим необходимо отметить, что DNIC эффективно ингибируют перекисное окисление мембран митохондрий из сердца крысы, индуцированное гидропероксидом трет-бутила и метмиоглобином или сочетанием метмиоглобина с ферритином. Эффективное ингибирование перекисного окисления митохондрий в

присутствии ферритина сочетанием 8-нитрозогутатиона и глутатиона, вероятно, обусловлено синтезом ОМС в этих условиях. При взаимодействии гидропероксида трет-бутила с метмиоглобином генерируются алкоксильные и алкилпероксильные радикалы. В связи с этим следует отметить, что динитрозильные комплексы железа и, в меньшей степени, 8-нигрозоглюгатион ингибируют окислительную деструкцию Р-каротина под действием перекисных и алкоксильных радикалов. Перехват этих радикалов, вероятно, лежит в основе антиоксидантного действия БШС. Это предположение согласуется с обнаруженым нами быстрым снижением концентрации БШС в условиях генерации свободных радикалов трет-бутила. Установлено, что Б№С также эффективно ингибируют окисление (^-каротина пероксинитритом, причем их антиоксидантное действие значительно выше, чем у О8К0. Нами показано, что пероксинитрит, как и другие окислители, разрушает Б№С, причем деструкция динитрозильных комплексов предотвращается глутатионом.

Таким образом, нитрозильные комплексы железа являются эффективными антиоксидантами, способными перехватывать активные формы кислорода и пероксинитрит, являющийся, как и сами Б№С, метаболитом N0.

Известно, что в патологических процессах, возникающих в ходе окислительного стресса, наряду со свободнорадикальными интермедиатами, важную роль играют феррилформы гемопротеидов. Последние образуются при взаимодествии между гемом и гидропероксидами липидов или перекисью водорода. В ряде работ показано, что оксид азота снижает прооксидантное действие феррилгемопротеидов и восстанавливает их до ферриформы.

В наших экспериментах накопление феррилмиоглобина количественно ингибировалось Б№С (рис. 7, кривые 4-7). Интересно отметить, что, как и в экспериментах с перикисным окислением липидов, 08Ы и GSN0 ингибировали этот процесс более чем на порядок слабее, чем Б№С (рис. 7, кривые 1-4) В условиях генерации свободных радикалов трет-бутила наблюдали быстрое снижение концентрации Б№С. В восстановлении оксоферрилмиоглобина и перехвате свободных радикалов трет-бутила могут участвовать находящиеся в

1б

равновесии с DNIC молекулы N0 и тиолов. В реакционной среде, содержащей

Ряс 7. Кинешка образования феррилмиогшбина в процессе взаимодействия 0,4 мМ гидро-пероксида трет-бугала и 0,1 мМ метмиоглобина (1), а также кинетические кривые накопления фер-рилмиоглобина в присутствии 360 мкМ 08М0 (2), 360 мкМ глутатиона(З) или 25,60,120 и 200 мкМ ОМС (4, 5, 6, 7) соответственно.

метмиоглобин, гидропероксид трет-бутила и глутатион, мы наблюдали образование характерного аддукта тиильного радикала со спиновой ловушкой БЕРМРО (рис 8, спектр 1). Тем не менее, тиильные радикалы не возникали при

Рис. 8: Спектры ЭПР спин-аддукт-ов тиильного радикала с DEPMPO. Реакционная среда - 20 мМ' DEPMPO, 0,1 мМ метмиоглобина, 1,6 мМ щцропероксида трет-бути-ла, 1 мМ DTPA, 1+1,6 мМ GSH; 2 + 0,8 мМ DNIC; 3 + 0,8 мМ DNIC и 1,6 мМ GSH; 4 - суперпозиция спектров спин-аддуктов DEPMPO с радикалами трет-бутила.

добавлении в реакционную среду БКК вместо в8И (рис 8, спектр 2). Более того, сами Б^ТС в этих условиях действовали как типичный антиоксидант, значительно ингибируя образование аддукта БЕРМРО с тиильными радикалами свободного в8И (рис 8, спектр 3), а также аддуктов БЕРМРО с радикалами трет-бутила (рис 8, спектры 2 и 4).

Тем не менее, при- восстановлении феррилформы миоглобина не происходило столь существенного снижения концентрации БШЦ как в системе, содержащей дополнительно щдропероксвд трет-бутила, то есть, в условиях генерирования алкоксильных и алкилпероксильных радикалов. Данный эффект, по нашему предположению, связан с регенерацией тиолами нитрозильных комплексов из продуктов их взаимодействия с оксоферрилгемом.

В заключении подведены основные итоги диссертационной работы и сформулированы выводы.

выводы

1. Дыхательная активность митохондрий сердца, сопряжение процессов переноса электронов и синтеза АТР и скорость образования митохондриями свободных радикалов кислорода зависит от продолжительности ишемии: необратимые изменения в митохондриальных мембранах сердец крыс происходят в промежутке от 15 до 30 мин ишемии.

2. Ишемическое прекондиционирование не вносит значимых изменений в сократительную функцию сердца, дыхательную активность митохондрий и кинетику генерации ими супероксидных радикалов при 15-минутной ишемии, однако, оказывает существенное защитное действие при 30-минутной ишемии.

3. Длительная диета с коэнзимом Qj0 приводит к уменьшению нежелательных последствий окислительного стресса и способствует сохранению сократительной функции и энергетического метаболизма сердца.

4. Динитрозильные комплексы железа являются эффективными антиоксидантами в системах, моделирующих протекание окислительного стресса в клетках сердечной мышцы в условиях ишемии/реперфузии.

5. Прооксидантные свойства ферритина и миоглобина могут инвертироваться в антиоксидантные под действием динитрозильных комплексов железа и S-нитрозоглутатиона. Этот эффект может играть особо важную роль для поддержания равновесия антиоксидантных и прооксидакнтных процессов в условиях гипоксии и реоксигенации в мышечной ткани.

Результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. E.K.Ruuge, I V.Zabbarova. O.V.Korkina, AN.Khatkevich, V.L.Lakomkin,

A.A.Timoshin, Oxidative stress and myocardial injury: spin-trapping and low-temperature EPR study, Current Topics in Biophysics (2002), V. 26, No. 1, P. 145155.

2. Шумаев К.Б., Заббарова ИВ.. Рууге Э.К., Ванин А.Ф., Влияние активных форм кислорода и азота на высвобождение ионов железа из ферритина и синтез динитрозильных комплексов железа, Биофизика (2003), Т. 48, № 1, С. 5-10.

3. Заббарова ИВ., Шумаев К.Б., Ванин А.Ф., Губкин А.А., Петрова Н.Е., Рууге Э.К., Взаимодействие ферритина и миоглобина как индукторов перекисного окисления липидов, роль активных форм кислорода и азота, Биофизика (2004), Т. 49, № С. GSQ-GST.

4. ВЛ. Лакомкин, Г.Г.Коновалова, Е.И.Каленикова, И В.Заббарова. АКТихазе,

B.Г.Цыпленкова, В.ЗЛанкин, Э.К.Рууге, В.И.Капелько, Зашита коэнзимом Q миокарда крыс при окислительном стрессе, индуцируемом пероксидом водорода, Биохимия (2004), Т. 69, № 5, С. 639-646.

5. К.БШумаев, Н.Е.Петрова, И В.Заббарова. АФ.Ванин, АФ.Топунов, В.ЗЛанкин, Э.К.Рууге, Взаимодействие оксоферрилмиоглобина и динитрозильных комплексов железа, Биохимия (2004), Т. 69, № 5, С. 699-705.

6. V.L.Lakomkin, G.G.Konovalova, E.I.Kalenikova, I V.Zabbarova. ALKaminnyi, A.K.Tikhaze, V.Z.Lankin, E.K.Ruuge, V.I.Kapelko, Changes in Antioxidant Status of Myocardium during Oxidative Stress under the Influence of Coenzyme Qi0, Biochemistry (Moscow), Papers in Press, Published on August 15, 2004 as Manuscript BM04-094.

7. О.В.Коркина, И В.Заббарова. АН.Хаткевич, Э.К.Рууге, Образование супероксидных радикалов митохондриями сердца: эффект адаптации к ишемии, Международная конференция «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода», Пущино, 6-9 июня 2000, Сборник тезисов, С. 74-76.

8. Заббарова И.В.. Коркина О.В., Хаткевич АЛ., Генерация супероксидных радикалов митохондриями сердца после ишемии разной длительности, Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2001», секция «физика», Физический факультет МГУ, 2001, Сборник тезисов, С. 101.

9. Шумаев К.Б., Коркина О.В., Заббарова И.В., Гомбоева СВ., Ланкин В.З., Рууге Э.К., Антиоксидантное и прооксидантное действие N0, влияние коэнзима Qio, XI Международная конференция «Магнитный резонанс в химии и биологии», Звенигород, 20-27 апреля 2001, Сборник тезисов, С. 5556.

10. Коркина ОЗ., Заббарова И.В.. Хаткевич А.Н., Капелько В.И., Рууге Э.К., Генерация' супероксидных радикалов в митохондриях сердца: эффект ишемического прекондиционирования, XI Международная: конференция «Магнитный резонанс в химии и биологии», Звенигород, 20-27 апреля 2001, Сборник тезисов, С. 64-65.

11.Заббарова И.В.. Коркина О.В.,-Власова ИМ.,-Хаткевич АЛ., Рууге Э.К., Влияние длительности. ишемии на скорость образования супероксидных радикалов в митохондриях сердца крысы, XI Международная конференция «Магнитный резонанс в химии и биологии», Звенигород, 20-27 апреля 2001, Сборник тезисов, С. 172-173.

12. Рууге Э.К., Коркина О.В., Заббарова И.В.. Власова ИМ., Хаткевич АЛ., Капелько В.И., Сердечная мышца и «кислородный парадокс», I Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии, Москва, 18-22 июня 2001, Сборник тезисов, С. 76-77.

13.Коркина О.В., Заббарова И.В.. Власова И.М., Хаткевич АЛ., Капелько В.И., Рууге Э.К., Митохондрии сердца и «кислородный парадокс», Национальная научно-практическая конференция с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека», Смоленск, 19-22 сентября 2001, Сборник тезисов, С. 124-125.

14. Ruuge E.K, Khatkevich A.N., Korkina O.V., Lakomkin V.L., Timoshin АЛ., Zabbarova I.V.. Oxidative stress and myocardial. injury: spin-trapping and low-temperature EPR study, 5th Workshop on EPR Applications in Biology and Medicine, Krakow, Sep. 29-Oct 3 2001, Book ofAbstracts, P. 52.

15.Ruuge E.K., Korkina O.V., Zabbarova I.V.. Khatkevich A.N., Oxygen free radicals and myocardial damage. International Symposium «Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Diagnostic, Preventive and Therapeutic Values», St.Petersburg-Kizhi, 812 July 2002, Book ofAbstracts, P. 38.

16. Lakomkin V.L., Korkina O.V., Zabbarova I.V.. Tsyplenkova V.G., Timoshin A.A., Kapelko V.I., The preventive effect of hydrophilic form of coenzyme Q10 on the contractility and mitochondrial function of the cardiac muscle, International Symposium «Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Diagnostic, Preventive and Therapeutic Values»,' St.Petersburg-Kizhi, 8-12 July 2002, Book of Abstracts, P. 154.

17. Zabbarova I.V.. Shumaev KB., Ruuge E.K., Kukharchuk V.V., Lankin V.Z., Vanin A.F., Formation of dinitrosyl-iron complexes in model systems: effect of peroxynitrite, ferritin and glutathione transferase, International Symposium «Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Diagnostic, Preventive and Therapeutic Values», St.Petersburg-Kizhi, 8-12 July 2002, Book ofAbstracts, P. 161.

18.Лакомкин В.Л., Цыпленкова В.Г., Каленикова Е.И., Заббарова И.В., Коновалова Г.Г., Тихазе А.К., Ланкин В.З., Рууге Э.К., Капелько В.И., Длительный прием убихинона защищает сердце от последствий окислительного стресса, Российский национальный конгресс кардиологов «От исследований к стандартам лечения», Москва, 7-9 октября 2003, Сборник тезисов, С. 185.

19. Ruuge E.K, Zabbarova I.V.. Shumaev KB., Cellular redox status, iron, reactive oxygen and nitrogen species, International conference «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants, and human health», Smolensk, September 22-25 2003, Book ofAbstracts, P. 29.

20. Shumaev K.B., Zabbarova 1. V.« Topunov A.F., Vanin AJ7., Kosmachevskaya O.V., Ruuge E.K., Reduction of fenylmyoglobin as mechanism of antioxidant effect of dinitrosyl-iron complexes, International conference «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants, and human health», Smolensk, September 22-25 2003, Book ofAbstracts, P. 46.

21.Lakomkin V.L., Zabbarova I.V.. Kalenikova E.I., Tsyplenkova V.G., Ruuge E.K., Kapelko V.I., Effects of coenzyme Q10 enriched diet on deterioration of contractility, mitochondrial function and structure of cardiac muscle caused by oxidative stress, International conference «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants, and human health», Smolensk, September 22-25 2003, Book of Abstracts, P. 64.

22.Pyyre Э.К.. Заббарова И.В.. Свиряева И.В., Шумаев К.Б., Активные формы кислорода и азота в клетках сердечной мышцы. Редокс-цикл железа и ферритин, Научная крнференция «Ломоносовские чтения», секция «Физика», Физический факультет МГУ, апрель 2004, Сборник расширенных тезисов, С. 79-80.

23.Рууге Э.К., Заббарова И.В.. Свиряева И.В., Шумаев К.Б., Редокс-состояние клеток миокарда и гомеостаз железа. Ферритин, активные формы кислорода и азота, Ш съезд биофизиков России, Воронеж, 24-29 июня 2004, Сборник тезисов, С. 568-569.

24.Шумаев К.Б., Петрова Н.Э., Заббарова И.В.. Ванин А.Ф., Тимошин А.А.,

Ланкин В.З., Восстановление оксоферрилмиоглобина динитрозильными комплексами железа как возможный антиоксидантный механизм, Ш съезд биофизиков России, Воронеж, 24-29 июня 2004, Сборник тезисов, С. 599-600.

ООП Физ ф-та МГУ. Заказ 99 -70-04

» 16314

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Заббарова, Ирина Валерьевна

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Активные формы кислорода и некоторые их свойства.

1.1.1 .Активные формы кислорода - медиаторы и передатчики сигналов.

1.1.2. Образование активных форм кислорода митохондриями клеток сердечной мышцы.

1.1.3.Нарушения метаболизма кардиомиоцитов, вызванные ишемией.

1.1.4.Роль активных форм кислорода в повреждениях миокарда.

1.1.5.Ишемическое прекондиционирование.

1.1.6. Участие активных форм кислорода в инициации апоптоза.

1.1.7. Коэнзим Q - переносчик электронов митохондриалъной дыхательной цепи и антиоксидант.

1.2. Активные формы азота.

1.2.1. Источники оксида азота.

1.2.2.Вазодиляторная функция оксида азота.

1.2.3.NO-зависимый апоптоз.

1.2.4. Активные формы азота в митохондриях.

1.2.5.Антиоксидантное действие оксида азота.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Получение изолированных митохондрий.

2.2 Опыты с перфузируемыми сердцами.

2.3 Исследование действия экзогенного коэнзима Q.

2.4 Определение функциональной активности митохондрий.

2.5 Получение препаратов для изучения путей метаболизма оксида азота.

2.6 Индуцированное перекисное окисление митохондрий.

2.7 Регистрация спектров ЭПР.

2.8 Определение абсолютных значений скоростей генерации супероксидных радикалов.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ОБРАЗОВАНИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ КИСЛОРОДА МИТОХОНДРИЯМИ СЕРДЦА.

3.1. Сократительная функция сердца.

3.2. Функциональная активность митохондрий.

3.3. Генерация супероксидных радикалов в митохондриях.

3.4. Влияние диеты с коэнзимом Q10 на митохондрии сердец, подвергнутых окислительному стрессу.

4. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНЫХ И ПРООКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ДОНОРОВ ОКСИДА АЗОТА.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Активные формы кислорода и азота в митохондриях сердца и модельных системах"

Образование активных форм кислорода (<Э'~, ОН', Н202) в результате процессов жизнедеятельности организма является неотъемлемой составляющей аэробного метаболизма. Образование свободных радикалов кислорода в биологических системах происходит постоянно и является как прямым результатом функционирования ряда специальных ферментативных систем, так и следствием побочного процесса множества окислительно-восстановительных реакций в клетке. Значительный интерес в отношении короткоживущих свободных радикалов обусловлен, прежде всего, их высокой химической активностью.

Основным потребителем кислорода в клетках сердечной мышцы является дыхательная цепь митохондрий - более 90 % всего потребляемого клеткой кислорода восстанавливается до воды с участием цитохром с оксидазы митохондрий, поэтому способность митохондрий к одноэлектронному восстановлению кислорода представляет наибольшую опасность. В обычных условиях, когда скорость побочного образования активных форм кислорода относительно невысока (< 2 %), антиоксидантная система клетки эффективно защищает от развития окислительного стресса. В условиях пониженного энергетического метаболизма, в состоянии 4 митохондриальной дыхательной цепи, при существенном увеличении внутриклеточной концентрации кислорода, происходят также значительные сдвиги в редокс-состоянии электронных переносчиков, способствующие резкому возрастанию скорости генерации свободных радикалов кислорода.

Участие свободных радикалов, а также других токсических форм кислорода в развитии патологических состояний сердечной мышцы после длительной ишемии в настоящее время является доказанным. Ишемия характеризуется как неадекватное снабжение ткани кислородом и необходимыми метаболитами и обусловлена нарушениями в системе кровообращения. Было обнаружено, что следующая за длительной ишемией миокарда реперфузия сопровождается значительными тканевыми повреждениями и нарушениями сократительной способности - появлением аритмий и временной механической дисфункции. Это явление, получившее название «кислородный парадокс», обусловлено резким усилением генерации активных форм кислорода при восстановлении нормального уровня внутриклеточного кислорода.

Адаптация к ишемии (ишемическое прекондиционирование) - краткая серия непродолжительных циклов ишемии-реперфузии, предшествующая длительной ишемии - привлекает внимание в силу оказываемого им защитного действия на миокард, его адаптации к ишемическому стрессу. В силу того, что основным повреждающим фактором реперфузии сердечной мышцы являются активные формы кислорода, представляет большой интерес влияние ишемического прекондиционирования на активность генерации свободных радикалов кислорода митохондриями. Очевидно, что защитный эффект реализуется в период длительной ишемии на основании тех изменений, которые происходят в кардиомиоцитах в результате адаптации к ишемии. Представляет интерес вопрос о том, в течение какого времени длительной ишемии проявляется защитный эффект адаптации. Известно, что степень ишемических повреждений миокарда определяется длительностью ишемии. Так как супероксидные радикалы вносят основной вклад в повреждения миокарда после ишемии, величина постишемической генерации активных форм кислорода должна быть пропорциональна длительности ишемии.

Супероксидный анион-радикал, образующийся в митохондриях, является предшественником более токсичных активных форм кислорода и азота. Действительно, при взаимодействии супероксида и оксида азота возникает пероксинитрит (ONOO ), который далее распадается с образованием таких сильнейших окислителей как гидроксильный радикал и радикал диоксида азота. Пероксинитрит может приводить к окислительной модификации низкомолекулярных и макромолекулярных компонентов митохондрий, в том числе коэнзима Q, NADH и белков дыхательной цепи. В то же время пероксинитрит может быть субстратом цитохромокисдазы и нейтрализовываться специфическими митохондриальными пероксиредоксинами, обладающими пероксидазной активностью белками. С другой стороны, NO может эффективно ингибировать перекисное окисление липидов, то есть, является антиоксидантом. Важную роль в антиоксидантном действии оксида азота, по-видимому, играют динитрозильные комплексы железа (DNIC), образующиеся при взаимодействии NO с ионами железа и тиолами. В связи с тем, что NO, генерируемый митохондриальной TVO-синтазой, способен превращаться как в пероксинитрит так и в DNIC, весьма важным является изучение взаимодействий между метаболитами оксида азота и активными формами кислорода. Эти исследования особо актуальны, так как данные взаимодействия могут определять баланс антиоксидантных и прооксидантных процессов в митохондриях и в целом в клетке.

Целью работы являлось изучение механизмов регуляции процессов образования и гибели активных форм кислорода и азота в кардиомиоцитах -сократительных клетках сердечной мышцы - в условиях, моделирующих окислительный стресс и защитное действие антиоксидантных систем клетки.

Исходя из общей цели, в диссертации решались следующие задачи:

1. Изучение влияния ишемии различной длительности и реперфузии на функциональную активность митохондрий сердца и кинетику образования ими свободных радикалов кислорода.

2. Иследование роли экзогенного коэнзима Q}0 при защите клеток сердечной мышцы от повреждений, вызванных окислительным стрессом.

3. Изучение антиоксидантных свойств динитрозильных комплексов железа в условиях моделируемого окислительного стресса, в том числе в условиях перекисного окисления в митохондриях сердца крысы.

4. Исследование антиоксидантных свойств DNIC в условиях генерации феррилмиоглобина и органических свободных радикалов. Изучение влияния супероксидных радикалов на образование DNIC с участием ферритина и тиолов.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Заббарова, Ирина Валерьевна

ВЫВОДЫ.

1. Дыхательная активность митохондрий сердца, сопряжение процессов переноса электронов и синтеза АТР и скорость образования митохондриями свободных радикалов кислорода зависит от продолжительности ишемии: необратимые изменения в митохондриальных мембранах сердец крыс происходят в промежутке от 75 до 30 мин ишемии.

2. Ишемическое прекондиционирование не вносит значимых изменений в сократительную функцию сердца, дыхательную активность митохондрий и кинетику генерации ими супероксидных радикалов при 75-минутной ишемии, однако, оказывает существенное защитное действие при 30-минутной ишемии.

3. Длительная диета с коэнзимом Qw приводит к уменьшению нежелательных последствий окислительного стресса и способствует сохранению сократительной функции и энергетического метаболизма сердца.

4. Динитрозильные комплексы железа являются эффективными антиоксидантами в системах, моделирующих протекание окислительного стресса в клетках сердечной мышцы в условиях ишемии/реперфузии.

5. Прооксидантные свойства ферритина и миоглобина могут инвертироваться в антиоксидантные под действием динитрозильных комплексов железа и S-нитрозоглутатиона. Этот эффект может играть особо важную роль для поддержания равновесия антиоксидантных и прооксидакнтных процессов в условиях гипоксии и реоксигенации в мышечной ткани.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведенное нами исследование четко продемонстрировало возможности использования спектроскопии ЭПР как удобного и чувствительного метода изучения закономерностей образования активных форм кислорода в митохондриях клеток сердечной мышцы и модельных системах, исследования антиоксидантных и прооксидантных свойств метаболитов оксида азота и комплексов железа. Для исследования кинетических характеристик ферментных систем клетки, ответственных за генерацию свободных радикалов кислорода и оксида азота, были использованы спиновые ловушки - TIRON, DEPMPO и Fe-(MGD)i. Регистрация спектров ЭПР семихинонной формы спиновой ловушки TIRON в условиях непрерывной оксигенации образца оказалась наиболее удобным и чувствительным методом определения супероксидных радикалов, генерируемых дыхательной цепью митохондрий сердца. Измерение скорости потребления кислорода митохондриями в среде инкубации, содержащей TIRON или DEPMPO, показало, что обе спиновые ловушки не оказывают заметного влияния на функциональные характеристики митохондрий в различных состояниях дыхательной цепи. Установление кинетики образования свободных радикалов (семихинонов) TIRON в системе с известной скоростью генерации супероксидных радикалов (ксантин-ксантиноксидаза) позволяло провести количественную оценку скорости образования свободных радикалов кислорода в исследуемых образцах.

Скорость генерации супероксидных радикалов митохондриями определялась функциональным состоянием дыхательной цепи и проявляла четкую субстратную зависимость. На основании ингибиторного анализа можно выделить два участка дыхательной цепи, принимающие активное участие в образовании кислородных радикалов: NADH-CoQ редуктазное звено (комплекс I) и Ьс\ сегмент (комплекс III) дыхательной цепи. Образование супероксидного радикала в Ьс\ сегменте обусловлено прямым взаимодействием с кислородом нестабильной фракции свободных радикалов коэнзима Q, локализованной вблизи границы внутренней митохондриальной мембраны с межмембранным пространством. В состоянии пониженного энергетического метаболизма, и, соответсвенно, при высоком значении трансмембранного потенциала митохондрий (состояние 4), скорость генерации супероксидных радикалов в комплексе III была относительно мала. Однако, скорость генерации свободных радикалов кислорода в митохондриях, выделенных из сердечной мышцы после длительной (30-минутной) ишемии, значительно превышала соответствующую величину в митохондриях из нормального миокарда. Длительная ишемия приводила также к значительной потере дыхательного контроля. Изменения в состоянии переносчиков дыхательной цепи митохондрий происходили параллельно с развитием ишемической контрактуры миокарда и значительным снижением величины развиваемого давления.

Митохондрии, выделенные из сердец после ишемического прекондиционирования, характеризовались несколько повышенной скоростью образования кислородных радикалов, однако, практически не отличались по величине дыхательного контроля от митохондрий из сердец контрольной группы. Длительная ишемия приводила к дополнительному небольшому увеличению скорости генерации свободных радикалов кислорода и не оказывала существенного влияния на функциональную активность митохондрий. Скорость генерации кислородных радикалов митохондриями после реперфузии снижалась почти до исходного уровня. При этом происходило увеличение скорости потребления кислорода в состояниях 3 и 4, но величина дыхательного контроля сохранялась почти на прежнем уровне. Обнаруженные результаты позволяют утверждать, что защитный эффект ишемического прекондиционирования, хотя бы частично, обусловлен уменьшением генерации кислородных радикалов дыхательной цепью и сохранением функциональной активности митохондрий.

Полученные нами результаты, а также данные других исследователей, свидетельствуют о необходимости комплексного исследования метаболизма активных форм кислорода и азота. Образование метаболитов оксида азота, обладающих прооксидантными или антиоксидантными свойствами, зависит от взаимодействия N0 с активными формами кислорода и другими редокс-активными компонентами клетки. В условиях одновременной генерации супероксида и NO возникает пероксинитрит, однако, в присутствии ферритина и тиолов в этой системе формируются динитрозильные коплексы железа. Следует отметить, что такой механизм формирования DNIC может обеспечивать регуляцию баланса прооксидантных и антиоксидантных процессов в клетках по принципу обратной связи. При это окислительные свойства супероксида, свободных ионов железа и пероксинитрита компенсируются антиоксидантным действием DNIC. Действительно, динитрозильные комплексы железа с тиольными лигандами взаимодействуют с супероксидными радикалами без образования пероксинитрита, они также нейтрализуют прооксидантное действие самого пероксинитрита и являются эффективными ингибиторами свободнорадикального окисления биологических мембран. Еще одним механизмом антиоксидантного действия DNIC, по-видимому, является взаимодействие с алкоксильными и алкилпероксильными радикалами. Способность DNIC взаимодействовать с оксоферрилмиоглобином и органическими радикалами, возникающими в реакции между гидропероксидом трет-бутила и ферри-формой миоглобина, позволяет предположить, что динитрозильные комплексы железа в сочетании с гемопротеинами могут функционировать как своеобразные пероксидазы, нейтрализующие продукты перекисного окисления липидов. В тоже время, восстановление оксоферрилформы миоглобина под действием DNIC и 5-нитрозоглутатиона указывает на возможную протекторную роль этих метаболитов NO в условиях окислительного стресса, вызванного гипоксией и последующей реоксигенацией ткани сердечной мышцы. На основании проведенных исследований предложен механизм регенерации динитрозильных комплексов из продуктов их взаимодействия с оксоферрилгемом и пероксинитритом. Необходимо отметить, что благодаря регенерации DNIC увеличивается время жизни связанного в этих комплексах оксида азота и снижается вероятность инверсии антиоксидантных свойств динитрозильных комплексов железа в прооксидантные.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Заббарова, Ирина Валерьевна, Москва

1. Владимиров Ю.А., Азизова О.А. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Биофизика. 1991. Т. 29. С. 252.

2. Kellogg E.W., Fridovich I. Superoxide, hydrogen peroxide, and singlet oxygen in lipid peroxidation by a xanthine oxidase system. // J. Biol. Chem. 1975. V. 250 (22). P. 8812-8817.

3. Chance В., Sies H., Boveris A., Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. // Physiological Reviews. 1979. V. 59 (3). P. 527-605.

4. Fridovich I. Biological effect of the superoxide radical. // Arch. Biochem. Biophys. 1986. V.247 (1). P. 1-11.

5. Hayakawa M., Ogava Т., Sigiyama S., Ozava T. Hydroxyl radical and leucotoxin biosynthesis in neutrophyl plasma membrane. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 161 (3). P. 1077-1085.

6. Schubert J. Wilmer J.W. Does hydrogen peroxide exist "free" in biological systems? // Free Rad. Biol. Med. 1991. V. 11 (6). P. 545-555.

7. Pry or W.A. Oxy-radicals and related species: Their formation, lifetimes and reactions. // Ann. Rev. Physiol. 1986. V. 48. P. 657-667.

8. Кулинский В.И. Лекционные таблицы по биохимии. 1994.

9. Farre A.L., Casado S. Heart failure, redox alterations, and endothelial dysfunction. // Hypertension. 2001. V. 38 (6). P. 1400-1405.

10. Lenaz G. Role of mitochondria in oxidative stress and ageing. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1366. P. 53-67.

11. Benzie I.F. Evolution of antioxidant defence mechanisms. // Eur. J. Nutr. 2000. V. 39(2). P. 53-61.

12. Lankin V. The enzymatic systems in the regulation of free radical lipid peroxidation. // Free Radicals, Nitric Oxide, and Inflammation: Molecular, Biochemical, and Clinical Aspects. Amsterdam etc.: IOS Press. NATO Science Series. 2003. V. 344.P.8-23.

13. Зенков Н.К., Кандалинцева Н.В., Панкин В.З., Меныцикова Е.Б., Просенко А.Е. Фенольные антиоксиданты. // Новосибирск.: Изд-во СО РАМН. 2003. С. 328.

14. Duranteau J., Chandel N.S., Kulisz A., Shao Z., Schumacker T. Intracellular signaling by reactive oxygen species during hypoxia in cardiomyocytes. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273 (19). P. 11619-11624.

15. Cadenas E., Davies K.J.A. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. // Free Rad. Biol. Med. 2000. V. 29 (3/4). P. 222-230.

16. Liu S. Generation, partitioning, targetion and functioning of superoxide in mitochondria. // Bioscience Reports. 1997. V. 17 (3). P. 259-271.

17. Dhalla N.S., Temsah R.M., Netticadan T. Role of oxidative stress in cardiovascular diseases. // J. Hypertens. 2000. V. 18 (6). P. 655-673.

18. Singh N., Dhalla A.K., Seneviratne C., Signal P.K. Oxidative stress and heart failure. // Mol. Cell Biochem. 1995. V. 147 (1-2). P. 77-81.

19. Korshunov S.S., Skulachev V.P., Starkov A.A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. // FEBS Lett. 1997. V. 416(1). P. 15-18.

20. McLennan H.R., Esposti M.D. The contribution of mitochondrial respiratory complexes to the production of reactive oxygen species. // J. Bioenerg. Biomembr. 2000. V. 32 (2). P. 153-162.

21. St-Pierre J., Buckingham J.A., Roebuck S.J., Brand M.D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277 (47). P. 44784-44790.

22. Trumpower B.L. The protonmotive Q cycle. Energy transduction by coupling of proton translocation to electron transfer by the cytochrome bcl complex. // J. Biol. Chem. 1990. V. 265 (20). P. 11409-11412.

23. Demin O.V., Kholodenko B.N., Skulachev V.P. A model of 0\ generation in thecomplex III of the electron transport chain. // Mol. Cell. Biochem. 1998. V. 184 (1-4). P. 21-33.

24. Chen Q., Vazquez E.J., Moghaddas S., Hoppel C.L. Production of reactive oxygen species by mitochondria. Central role of complex III. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278 (38). P. 36027-36031.

25. Gille L., Nohl H. The ubiquinone, redox couple regulates mitochondrial oxygen radical formation. // Arch. Biochem. Biophys. 2001. V. 388 (1). P. 34-38.

26. Han D., Antunes F., Canali R., Rettori D., Cadenas E. Voltage-dependent anion channels control the release of the superoxide anion from mitochondria to cytosol. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278 (8). P. 5557-5563.

27. Das D.K., George A. Liu X.K., Rao P.S. Detection of hydroxyl radical in the mitochondria of ischemic-reperfused myocardium by trapping with salicylate. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989. V. 165 (3). P. 1004-1009.

28. Nohl H. A novel superoxide radical generator in heart mitochondria. // FEBS Lett. 1993. V. 214. P. 268.

29. Леденев A.H., Рууге Э.К. Генерация супероксидных радикалов митохондриями сердца в условиях ишемии. // Бюлл. экспер. биол. мед. 1985. Т. 100 (9). С. 1204-1206.

30. McRae D.G., Baker J.E., Thompson J.E. // Plant Cell Physiol. 1982. V. 23. P. 375.

31. Ksenzenko M.Yu., Konstantinov A.A., Khomutov G.B., Tikhonov A.N., Ruuge E.K. Effect of electron transfer inhibitors on superoxide generation in the cytochrome bc\ site on the mitochondrial respiratory. // FEBS Lett. 1983. V. 155 (1). P. 19-24.

32. Леденев A.H., Попова Е.Ю., Константинов А.А., Рууге Э.К., Регистрация образования супероксидных радикалов интактными митохондриями сердца с помощью спиновой ловушки. // Биофизика. 1985. Т. 30 (4). С. 708-709.

33. Леденев А.Н., Пучнина Е.А., Музыкантов В.Р., Рууге Э.К. Метод измерения скорости образования супероксидных радикалов нейтрофилами человека с помощью спиновой ловушки тайрона. // Журнал физической химии. 1990. Т. 64 (11). С. 3087-3093.

34. Hearse D.J. Reperfiision of the ischemic myocardium. I I J. Moll. Cell. Cardiol. 1977. V. 9(8). P. 605-616.

35. Murry C.E., Jennings R.B., Reimer K.A. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. // Circulation. 1986. V. 74 (5). P. 11241136.

36. Dekker L.R.C. Toward the heart of ischemic preconditioning. // Cardiovasc. Res. 1998. V. 37(1). P. 14-20.

37. Yellon D.M., Baxter G.F. Garcia-Dorado D., Heusch G., Sumeray M.S. Ischemic preconditioning: present position and future directions. // Cardiovasc. Res. 1998. V. 37 (1). P. 21-33.

38. Li Y., Whittaker P., Kloner R.A. The transient nature of the effect of ischemic preconditioning on miocardial infarct size and ventricular arrhythmia. // Am. Heart J. 1992. V. 123 (2). P. 346-353.

39. Osada M., Sato Т., Komori S., Tamura K. Protective effect of preconditioning on reperfiision induced ventricular arrhythmias of isolated rat hearts. // Cardiovasc. Res. 1991. V. 25 (6). P. 441-444.

40. Marber M.S., Latchman D.S., Walker J.M., Yellon D.M. Cardiac stress protein elevation 24 hours after brief ischemia or heat stress is associated with resistance to myocardial infarction. // Circulation. 1993. V. 88 (3). P. 1264-1272.

41. Kloner R.A., Jennings R.B. Consequences of brief ischemia: stunning, preconditioning, and their clinical implications: part 1. // Circulation. 2001. V. 104. P. 2981-2989.

42. Kloner R.A., Jennings R.B. Consequences of brief ischemia: stunning, preconditioning, and their clinical implications: part 2. // Circulation. 2001. V. 104. P. 3158-3167.

43. Chandra J., Samali A., Orrenius S. Triggering and modulation of apoptosis by oxidative stress. // Free Rad. Biol. Med. 2000. V. 29 (3-4). P. 323-333.

44. Skulachev V.P. Mitochondria in the programmed death phenomena; a principle of biology: "it is better to die than to be wrong" // IUBMB Life. 2000. V. 49 (5). P. 365373.

45. Liu Z., Li Z., Liu X. Effect of ginsenoside Re on cardiomyocyte apoptosis and expression of BCL-2/Bax gene after ischemia and reperfusion in rats. // J. Huazhong. Univ. Sci. Technolog. Med. Sci. 2002. V. 22 (4). P. 305-309.

46. Eefting F., Rensing В., Wigman J., Pannekoek W.J., Liu W.M., Cramer M.J., Lips D.J., Doevendans P.A. Role of apoptosis in reperfusion injury. // Cardiovasc. Res. 2004. V. 61 (3), P. 414-426.

47. Cook S.A., Poole-Wilson P.A. Cardiac myocyte apoptosis. // Eur. Heart J. 1999. V. 20 (22). P. 1619-1629.

48. Green P.S., Leeuwenburgh C. Mitochondrial dysfunction is an early indicator of doxorubicin-induced apoptosis. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1588 (1). P. 94101.

49. Ambrosio G., Zweier J.L., Becker L.C. Apoptosis is prevented by administration of superoxide dismutase in dogs with reperfused myocardial infarction. // Basic Res. Cardiol. 1998. V. 93 (2). P. 94-96.

50. Piot C.A., Padmanaban D., Ursell P.C., Sievers R.E., Wolfe C.L. Ischemic preconditioning decreases apoptosis in rat hearts in vivo. // Circulation. 1997. V. 96 (5). P. 1598-1604.

51. Ланкин B.3., Тихазе A.K., Беленков Ю.Н. // Кардиология. 2000. Т. 40 (7). С. 48-61.

52. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимические и патофизиологические аспекты. // Москва. МАИК «Наука/Интерпериодика». 2001. С. 343.

53. Landi L., Cabrini L., Sechi A.M., Pasquali P. Antioxidative effect of ubiquinones on mitochondrial membranes. // Biochem J. 1984. V. 222 (2). P. 463-466.

54. Sugiyama S., Takasawa M., Hayakawa M., Ozawa T. Changes in skeletal muscle, heart and liver mitochondria electron transport activities in rats and dogs of various ages. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1993. V. 30 (5). P. 937-944.

55. Langsjoen P.H., Langsjoen A.M. Overview of the use of CoQIO in cardiovascular disease. // Biofactors. 1999. V. 9 (2-4). P. 273-284.

56. Tran M.T., Mitchell T.M., Kennedy D.T., Giles J.T. Role of CoQIO in chronic heart failure, angina, and hypertension. // Pharmacotherapy. 2001. V. 21 (7). P. 797806.

57. Lenaz G., Parenti, Castelli G., Fato, D'Aurelio M., Bovina C., Formiggini G., Marchetti M., Estornell E., Rauchova H. // Mol. Aspects Med. 1997. V. 18 Suppl. P. 25-31.

58. Abe K., Hayashi N., Terada H. Effect of endogenous nitric oxide on energy metabolism of rat heart mitochondria during ischemia and reperfusion. // Free Rad. Biol. Med. 1999. V. 26 (3/4). P. 379-387.

59. Stuehr D.J., Marietta M.A. Induction of nitrite/nitrate synthesis in murine macrophages by BCG infection, lymphokines, or interferon-gamma. // J. Immunol. 1987. V. 139(2). P. 518-525.

60. Bredt D.S., Snyder S.H. Isolation of nitric oxide synthase, a calmodulin-requiring enzyme. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87 (2). P. 682-685.

61. Moncada S., Higgs A. L-Arginine-nitric oxide pathway. // N. Engl. J. Med. 1993. V. 329 (27). P. 2002-2012.

62. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин B.E., Косицын Н.С. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. Москва. Наука. 1998. С. 37-41.

63. Ignarro L.J., Kadowitz P.J. The pharmacological and physiological role of cyclic GMP in vascular smooth muscle relaxation. // Ann. Pharmacol. Toxicol. 1985. V. 25. P. 171-191.

64. Radomski M.W., Palmer R.M.J., Moncada S. The anti-aggregating properties of vascular endothelium: interactions between prostacyclin and nitric oxide. // Br. J. Pharmacol. 1987. V. 92 (3). P. 639-646.

65. Hoog N. // Free Rad. Biol. Med. 2000. V. 28. P. 1478-1486.

66. Patel R.P., McAndrew J., Sellak H., White C.R., Jo H., Freeman B.A., Darley-Usmar V.M. Biological aspects of reactive nitrogen species. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1411 (2-3). P. 385-400.

67. Mathews W.R., Kerr S.W. Biological activity of S-nitrosothiols: the role of nitric oxide. // J. Pharmacol. Exp.Ther. 1993. V. 267 (3). P. 1529-1537.

68. Butler A.R., Rhodes P. Chemistry, analysis and biological roles of S-nitrosothiols. //Anal. Biochem. 1997. V. 249 (1). P. 1-9.

69. Vanin A.F., Stukan R.A., Manukhina E.B. Physical properties of dinitrosyl-iron complexes with thiol-containing ligands in relation with their vasodilator activity. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1295 (1). P. 5-12.

70. Albina J.E., Reichner J.S. Role of nitric oxide in mediation of macrophage cytotoxity and apoptosis. // Cancer Metastasis Rev. 1998. V. 17 (1). P. 39-53.

71. Brune В., Gotz C., Messmer U.K., Sandau K., Hirvonen M.R., Lapetina E.G. Superoxide formation and macrophage resistance to nitric oxide-mediated apoptosis. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272 (11). P. 7253-7258.

72. Borutaite V., Brown G.C. Nitric oxide induced apoptosis via hydrogen peroxide, but necrosis via energy and thiol depletion. // Free Rad. Biol. Med. 2003. V. 35 (11). P. 1457-1468.

73. Ushmorov A., Ratter F., Lehmann V., Droge W., Schirrmaher V., Umansky V. Nitric oxide-induced apoptosis in human leukemic lines requires mitochondrial lipid degradation and cytochrome с release. // Blood. 1999. V. 93 (7). P. 2342-2352.

74. Li J., Billiar T.R., Talanian R.V., Kim Y.M. Nitric oxide reversibility inhibits seven members of the caspase family via S-nitrosylation. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 240 (2). P. 419-424.

75. Umansky V., Rocha M., Breitkreutz R., Hehner S., Bucur M., Erbe N., Droge W., Ushmorov A. Glutathione is a factor of resistance of Jurkat leukemia cells to nitric oxide-mediated apoptosis. // J. Cell Biochem. 2000. V. 78 (4). P. 578-587.

76. Brown G.C., Cooper C.E. Nanomolar concentrations of nitric oxide reversibly inhibit synaptosomal respiration by competing with oxygen at cytochrome oxidase. // FEBS Lett. 1994. V. 356 (2-3). P. 295-298.

77. Kanai A., Peterson J. Function and regulation of mitochondrially produced nitric oxide in cardiomyocytes. // Am. J. Physiol. 2004. V. 286 (1). P. HI 1-H12.

78. Guilivi C. Functional implications of nitric oxide produced by mitochondria in mitochondrial metabolism. //Biochem. J. 1998. V. 332. P. 673-679.

79. Giulivi C. Characterization and function of mitochondrial nitric-oxide synthase. // Free Rad. Biol. Med. 2003. V. 34 (4). P. 397-408.

80. Brudvig G.W., Stevens Т.Н., Chan S.I. Reactions of nitric oxide with cytochrome с oxidase. //Biochemistry. 1980. V. 19 (23). P. 5275-5285.

81. Cooper C.E. Nitric oxide and cytochrome oxidase: substrate, inhibitor or effector? // Trends in Biochem. Sci. 2002. V. 27 (1). P. 33-39.

82. Cooper C.E., Davies N.A. Effects of nitric oxide and peroxinitrite on the cytochrome oxidase Km for oxygen: implications for mitochondrial pathology. // Biochem. Biophys. Acta. 2000. V. 1459 (2-3). P. 390-396.

83. Murray J., Taylor S.W., Zhang В., Ghosh S.S., Capaldi R.A. Oxidative Damage to Mitochondrial Complex I Due to Peroxynitrite. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278 (39). P. 37223-37230.

84. Valdez L.B., Alvarez S., Arnaiz S.L., Schopfer F., Carreras M.C., Poderoso J.J., Boveris A. Reactions of peroxynitrite in the mitochondrial matrix. // Free Rad. Biol Med. 2000. V. 29 (3/4). P. 349-356.

85. Bringold U., Ghafourifar P., Richter C. Peroxynitrite formed by mitochondrial NO-л isynthase promotes mitochondrial Ca release. // Free Rad. Biol. Med. 2000. V. 29 (34). P. 343-348.

86. Poderoso J.J., Lisdero C., Schopfer F., Riobo N., Carreras M.C., Cadenas E., Boveris A. The regulation of mitochondrial oxygen uptake by redox reactions involving nitric oxide and ubiquinol. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274 (53). P. 3770937716.

87. Ma X.L., Gao F., Liu G.-L., Lopez B.L., Christopher T.A., Fukuto J.M., Wink D.A., Feelisch M. Opposite effects of nitric oxide and nitroxyl on postischemic myocardial injury. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96 (25). P. 14617-14622.

88. Radi R., Beckman J.S., Bush K.M., Freeman B.A. Peroxinitrite induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. // Arch. Biochem. Biophys. 1991. V. 288 (2). P. 481-487.

89. Ischiropoulos H., al-Mehdi A.B. Peroxynitrite-mediated oxidative protein modifications. // FEBS Lett. 1995. V. 364 (3). P. 279-282.

90. Brookes P.S., Levonen A.-L., Shiva S., Sarti P., Darley-Usmar V.M. Mitochondria: regulators of signal transduction by reactive oxygen and nitrogen species. // Free Rad. Biol. Med. 2002. V. 33 (6). P. 755-764.

91. Borutaite V., Budriunaite A., Brown G.C. Reversal of nitric oxide-, peroxinitrite-and S-nitrosothyol-induced inhibition of mitochondrial respiration or complex I activity by light and thiols. // Biochem. Biophys. Acta. 2000. V. 1459 (2-3). P. 405412.

92. Chamulitrat W. Nitric oxide inhibited peroxyl and alkoxyl radical formation with concomitant protection against oxidant injury in intestinal epithelial cells. // Arch. Biochem. Biophys. 1998. V. 355 (2). P. 206-214.

93. Joshi M.S., Ponthier J.L., Lancaster J.R. Cellular antioxidant and pro-oxidant actions of nitric oxide. // Free Rad. Biol. Med. 1999. V. 27 (11-12). P. 1357-1366.

94. Shafer F.Q., Wang P.H., Kelley, Cueno K.L., Martin S.M., Buetter G.R. Comparing beta carotene, vitamin E and nitric oxide as membrane antioxidants. // J. Biol. Chem. 2002. V. 383 (3-4). P. 671-681.

95. Padmaja S., Huie R.E. The reaction of nitric oxide with organic peroxyl radicals. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 195 (2). P. 539-544.

96. Kanner J., Harel S., Granit R. Nitric oxide as an antioxidant. // Arch. Biochem. Biophys. 1991. V. 289 (1). P. 130-136.

97. Lipinski P., Drapier J-C. // J. Biol. Inorg. Chem. 1997. V. 2. P. 559-566.

98. Oberle S., Schroder H. Ferritin May Mediate SIN-1-Induced Protection against Oxidative Stress. //Nitric Oxide. 1997. V. 1 (4). P. 308-314.

99. Juckett M.B., Weber M., Balla J., Jacob H.S., Vercellotti G.M. Nitric oxide donors modulate ferritin and protect endothelium from oxidative injury. // Free Rad. Biol. Med. 1996. V. 20 (1). P. 63-73.

100. Puntarulo S., Cederbaum A.I. Inhibition of ferritin stimulated microsomal production of reactive oxygen intermediates by nitric oxide. // Arch. Biochem. Biophys. 1997. V. 340 (1). P. 19-26.

101. Picard V., Epsztejn S., Santambrogio P., Cabantchik Z.I., Beaumont C. Role of ferritin in the control of the labile iron pool in murine erythroleukemia cells. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273 (25). P. 15382-15386.

102. Gutteridge J.M.C., Halliwell B. Free radicals and antioxidants in the year 2000. A historical look to the future. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2000. V. 899. P. 136-147.

103. Halliwell B. Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause or consequence? // Lancet. 1994. V. 344 (8924). P. 721-724.

104. Stadtman E.R., Levine R.L. Protein oxidation. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2000. V. 899. P. 191-208.

105. Reif D.W., Samokyszyn V.M., Miller D.M., Aust S.D. Alloxan- and glutathione-dependent ferritin iron release and lipid peroxidation. // Arch. Biochem. Biophys. 1989. V. 269 (2). P. 407-414.

106. Boyer R.F., Grabill T.W., Petrovich R.M. Reductive release of ferritin iron: a kinetic assay. //Anal. Biochem. 1988. V. 174 (1). P. 17-22.

107. Herold S., Rehmann F.-J. K. Kinetic and mechanistic studies of the reactions of nitrogen monoxide and nitrite with ferryl myoglobin. // J. Biol. Inorg. Chem. 2001. V. 6 (5-6). P. 543-555.

108. Herold S., Rehmann F.-J. K. Kinetics of the reactions of nitrogen monoxide and nitrite with ferryl hemoglobin. // Free Rad. Biol. Med. 2003. V. 34 (5). P. 531-545.

109. McLeod L.L., Alayach A.I. Detection of a ferrylhemoglobin intermediate in an endothelial cell model after hypoxia-reoxygenation. // Am. J. Physiol. 1999. V. 277 (1 Pt. 2). P. H92-H99.

110. Шумаев К.Б., Pyyre Э.К., Ланкин B.3., Ванин А.Ф., Гомбоева С.Б. Беленков Ю.Н. Механизм ингибирования свободнорадикального окисления (3-каротина S-нитрозоглутатионом и динитрозильными комплексами железа. // Докл. РАН. 2001. Т. 379 (6). С. 702-704.

111. Hogeboom G.H. // Meth. Enzymol. 1955. V. 1. P. 16.

112. Коркина O.B., Pyyre Э.К. Генерация супероксидных радикалов митохондриями сердца: исследование методом спиновых ловушек в условиях непрерывной оксигенации. //Биофизика. 2000. Т.45. С. 695-699.

113. Fallen E.L., Elliot W.C., Gorlin R. Apparaties for study of ventricular function and metabolism in the isolated perfused rat heart. // J. Appl. Physiol. 1967. V. 22 (4). P. 836-839.

114. Kitakaze M., Marban E. Cellular mechanism of the modulation of contractile function by coronary perfusion pressure in ferret hearts. // J Physiol (Lond). 1989. V. 414. P. 455-472.

115. Vanin A.F., Huisman A., van Faassen E.E. Iron dithiocarbamate as spin trap for nitric oxide detection: pitfalls and successes.// Methods Enzymol. 2002. V. 359. P. 2742.

116. Шумаев К.Б., Рууге Э.К., Дмитровский A.A., Быховский В.Я., Кухарчук В.В. Влияние антиоксидантов и продуктов перекисного окисления липидов на образование радикала пробукола в липопротеидах низкой плотности. // Биохимия. 1997. Т. 62 (6). С. 769-773.

117. Ledenev A.N., Konstantinov A. A. Popova Е., Ruuge Е.К. A simple assay of the superoxide generation rate with Tiron as EPR-visible radical scavenger. // Biochem. Int. 1986. V. 13 (2). P. 391-396.

118. Miller R.W., Macdowall F.D. The TIRON free radical as a sensitive indicator of chloroplastic photoautoxidation. // Biochem. Biophys. Acta. 1975. V. 387 (1). P. 176187.

119. Khatkevich A.N., Dvoryantsev S.N., Kapelko V.I., Ruuge E.K. The protective effect of ischemic preconditioning depends on the duration of prolonged ischemia. // Exp. Clin. Cardiol. 1999. V. 4 (3). P. 186-194.

120. Bolli R. Oxygen-derived free radicals and myocardial reperfusion injury: an overview. // Cardiovasc. Drugs Ther. 1991. V. 5 (Suppl. 2). P. 249-268.

121. Henry T.D., Archer S.L., Nelson D., Weir E.K., From A.H. Postischemic oxygen radical production varies with duration of ischemia. // Am. J. Physiol. 1993. V. 264 (5 Pt. 2). P. H1478-H1484.

122. Das D.K., Engelman R.M., Maulik N. Oxygen free radical signaling in ischemic preconditioning. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999. V. 874. P. 49-65.

123. Vanden Hoek Т., Becker L.B., Shao Z.H., Li C.Q., Schumacker P.T. Preconditioning in cardiomyocytes protects by attenuating oxidant stress at reperfusion. // Circ. Res. 2000. V. 86 (5). P. 541-548.

124. Ruuge E.K., Zabbarova I.V., Korkina O.V., Khatkevich A.N., Lakomkin V.L., Timoshin A.A. Oxidative stress and myocardial injury: spin-trapping and low-temperature EPR study. // Current Topics in Biophysics. 2002. V. 26 (1). P. 145-155.

125. Vanin A.F., Huisman A., Stroes E.S.G., de Ruijter-Heijstek F.C., Rabelink T.J., Faassen E.E. Antioxidant capasity of mononitrosyl iron - dithiocarbamate complexes: implications for NO trapping. // Free Rad. Biol. Med. 2001. V. 30 (8). P. 813-824.

126. Flogel U., Merx M.W., Godecke A., Decking U.K.M., Schrader J. Myoglobin: A scavenger of bioactive NO. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98 (2). P. 735-740.

127. Arosio P., Levi S. Ferritin, iron homeostasis, and oxidative damage. // Free Rad. Biol. Med. 2002. V. 33 (4). P. 457-463.

128. Biemond P., van Eijk H.G., Swaak A.J., Koster J.F. Iron mobilization from ferritin by superoxide derived from stimulated polymorphonuclear leukocytes. Possible mechanism in inflammation diseases. // J. Clin. Invest. 1984. V.73 (6). P. 1576-1579.

129. Trujillo M., Alvarez M.N., Peluffo G., Freeman B.A., Radi R. Xanthine oxidase -mediated decomposition of S nitrosothiols. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273 (14). P. 7828-7834.

130. Шумаев К.Б., Заббарова И.В., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Влияние активных форм кислорода и азота на высвобождение ионов железа из ферритина и синтез динитрозильных комплексов железа. // Биофизика. 2003. Т. 48 (1). С. 5-10.

131. Mordente A., Martorana G.E., Miggiano G.A., Petitti Т., Giardina В., Littaru G.P., Santini S.A. Free radical production by activated haem proteins: protective effect of coenzyme Q. //Mol. Aspects Med. 1994. V. 15 (Suppl.). P. S109-S115.

132. Giulivi C., Cadenas E. Ferrylmyoglobin: formation and chemical reactivity toward electron-donating compounds. // Methods Enzymol. 1994. V. 233. P. 189-202.

133. Борисенко Г.Г., Осипов A.H., Казаринов К.Д., Владимиров Ю.А. Фотохимические реакции нитрозильных комплексов гемоглобина под действием низкоинтенсивного лазерного излучения в видимом диапазоне. // Биохимия. 1997. Т. 62 (6). С. 774-780.

134. Schafer F.Q., Wang Н.Р, Kelley Е.Е., Cueno K.L., Martin S.M., Buetter G.R. Comparing p-carotene, vitamin E and nitric oxide as membrane antioxidants. // J. Biol. Chem. 2002. V. 383 (3-4). P. 671-681.

135. Erstner L., Dalner G. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1271. P. 195-204.

136. Beckman J.S., Koppenol W.H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: the good, the bad, the ugly. // Am. J. Physiol. 1996. V. 271 (5 Pt. 1). P. C1424-C1437.

137. Galaris D., Eddy L., Arduini A., Cadenas E., Hochstein P. Mechanisms of reoxygenation injury in myocardial infarction: implications of a myoglobin redox cycle. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 160 (3). P. 1162-1168.

138. Заббарова И.В., Шумаев К.Б., Ванин А.Ф., Губкин А.А., Петрова Н.Е., Рууге Э.К. Взаимодействие ферритина и миоглобина как индукторов перекисного окисления липидов, роль активных форм кислорода и азота // Биофизика. 2004. Т. 49 (4). С. 659-665.

139. Шумаев К.Б., Петрова Н.Е., Заббарова И.В., Ванин А.Ф., Топунов А.Ф., Панкин В.З., Рууге Э.К. Взаимодействие оксоферрилмиоглобина и динитрозильных комплексов железа. // Биохимия. 2004. Т. 69 (5). С. 699-705.