Активированная хемилюминесценция как метод изучения свободнорадикальных реакций в клетках и тканях

Матвеева, Наталья Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Активированная хемилюминесценция как метод изучения свободнорадикальных реакций в клетках и тканях
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Активированная хемилюминесценция как метод изучения свободнорадикальных реакций в клетках и тканях"

На правах рукописи

МАТВЕЕВА НАТАЛЬЯ СЕРГЕЕВНА

АКТИВИРОВАННАЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ КАК МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ В КЛЕТКАХ И

ТКАНЯХ

03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2012

005014252

Работа выполнена в Государственном учебно-научном учреяедении факультет фундаментальной медицины «Московского государственного университета нмснн М.В. Ломоносова»

Научный руководитель:

Академик РАМП, доктор биологических

наук, профессор Владимиров Юрий Андреевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Потапенко Александр Яковлевич

ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Мшпдравсоцразвития России, зав. кафедрой медицинской и биологической физики

Доктор биологических наук, Новиков Кирилл Николаевич

МГУ им. М.В. Ломоносова, ведущий научный сотрудник лаборатории физико-химии биомембран биологического факультета

Ведущая организация:

ФГБУН «НИИ Физико-химической медицины ФМБА России»

Защита состоится «02» апреля 2012 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Мшпдравсоцразвития России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «29» февраля 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Н.Г. Потешкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хорошо известно, что в патогенезе многих болезней и патологических процессов важную роль играет оксидативный стресс (т.е. избыточный уровень радикалов в клетке) [ЗресЮг, 1995; №игН, Яаупег е1 а!., 2005; НаШшеП, 2007; ОаткгеМге, МатаггПаУпэЬуШ е1 а1., 2008]. Между тем, прямых методов обнаружения радикалов в клетках и тканях немного, и среди них значительное место принадлежит методу хемилюминесценции (ХЛ) [Владимиров, Проскурнина и др., 2007; Владимиров и Проскурнина, 2009], прежде всего - ХЛ в присутствии химических активаторов люминола и люциге-нина, а также физических активаторов, таких как родамин Ж и производные кумаринов, прежде всего С-525 [Владимиров и Шерстнев, 1989]. В последние годы появилось большое число работ, где активированная хемилюминесценция использовалась в медико-биологических исследованиях и в целях клинического лабораторного анализа. Наибольшее число публикаций в этой области посвящено изучению активности фагоцитов крови методом люминол-зависимой ХЛ и определению общей антиоксидантной активности плазмы или сыворотки крови пациентов при различных заболеваниях. В ряде работ изучалась железо-индуцированная хемилюминесценция сыворотки и плазмы крови как метод определения окисляемости липопротеинов. Однако эти методы, которым можно дать общее название - хемилюминесцентный анализ крови, не получили пока широкого применения в лабораторном клиническом анализе, как нам представляется, в основном из-за отсутствия стандартизации всех процедур и как следствие - плохой сопоставимости данных, полученных в разных лабораториях. Помимо этого каждая группа исследователей использовала, как правило, лишь какой-то один из ХЛ-ых методов, между тем как разные методы дают представление о различных свободнорадикальных реакциях, и использование всего комплекса методов активированной ХЛ на одних и тех же объектах дало бы значительно больше информации об особенностях оксидативного стресса в той или иной конкретной ситуации. Все это делает необходимым разработку унифицированного метода комплексного ХЛ-ого анализа крови пациентов в клинике.

В противоположность анализу крови, методы активированной ХЛ по ряду причин пока не получили практически никакого применения в исследованиях других тканей человека и животных. Между тем, исследование свободно-радикальных реакций именно в определенных тканях чрезвычайно важно для изучения самых различных заболеваний, связанных с оксидативным стрессом.

Цель исследования - разработать хемилюминесцентные методы комплексного анализа свободнорадикальных процессов в крови и тканях человека и животных с использованием химических и физических активаторов хемилюминесценции (люминол, люцигенин, родамин Ж и кумарин С-525).

Задачи исследования.

1. У больных ишемической болезнью сердца в периоперационном периоде прямой реваскуляризации миокарда в условиях искусственного кровообращения изучить динамику: а) люминол-зависимой ХЛ фагоцитов цельной крови; б) антиоксидантной емкости плазмы крови; в) железоиндуцированной ХЛ плазмы крови, активированной родамином Ж.

2. С помощью кумарин-активированной хемилюминесценции исследовать реакции с участием пероксильных радикалов в плазме крови и других системах.

3. Исследовать образование свободных радикалов в изолированных кусочках тканей разных органов крысы, используя метод: а) люминол-активиро-ванной ХЛ; б) кумарин-активированной ХЛ; в) люцигенин-активированной ХЛ.

4. Изучить действие различных антиоксидантов и монооксида азота на образование супероксидных радикалов в изолированных кусочках ткани.

Научная новизна работы. Впервые проведено сравнительное изучение и описана динамика изменения функционального состояния фагоцитирующих клеток цельной крови, антиоксидантной емкости и липидной пероксидации в плазме крови у больных ишемической болезнью сердца в периоперационном периоде прямой реваскуляризации миокарда в условиях искусственного кровообращения. Показано достоверное снижение фагоцитарной функции и липидной пероксидации в период искусственного кровообращения. Выявлена зависимость между снижением активности фагоцитирующих клеток цельной крови и наличием осложнений у пациентов в раннем послеоперационном периоде.

Впервые показано, что сывороточный альбумин связывает кумарин С-525 и снижает квантовый выход люминесценции активатора. Установлено, что невысокая ХЛ плазмы крови в присутствии кумарина, по сравнению с липопротеинами и липосомами, частично обусловлена этим взаимодействием.

Впервые проведено сравнительное изучение хемилюминесценции кусочков тканей органов крысы в присутствии различных активаторов. Установлено, что для изучения свободнорадикальных процессов в тканях наиболее информативен метод люцигенин-активированной ХЛ, который отражает образование супероксидного радикала в митохондриях. Обнаружено, что в присутствии люцигенина ХЛ определяется двумя составляющими; люцигенин-зависимой (кислород-зависимой) ХЛ поверхностного слоя ткани и собственной (кислород-независимой) ХЛ экстракта. Предложен способ оценки скорости потребления кислорода тканью, основанный на измерении скорости затухания ХЛ после прекращения перемешивания среды, которая различна в разных органах. Показано, что биологически значимые концентрации антиоксидантов не оказывают серьезного влияния на образование супероксидного радикала митохондриями ткани.

Практическая значимость. Разработанные в ходе работы подходы комплексного хемилюминесцентного анализа могут быть применены в медицинской практике для мониторинга состояния пациентов (в том числе интраоперационного), в трансфузиологии при переливаниях крови, для оценки состояния тканей при пересадках органов. Предложенная биологическая модель (кусочек ткани и кашица) может использоваться в медико-биологических исследованиях для изучения свободнорадикальных процессов в биоптатах тканей при различных патологических состояниях и выяснения механизма действия разных веществ и условий на образование супероксидного радикала.

Положения, выносимые на защиту.

1. Наиболее информативным к состоянию пациентов ишемической болезнью сердца является метод люминол-зависимой ХЛ фагоцитов цельной крови.

2. Применение кумарина С-525 как активатора железоиндуцированной ХЛ плазмы крови осложнено из-за его связывания сывороточным альбумином.

3. Наиболее перспективным методом исследования образования свободных радикалов в изолированных кусочках тканей разных органов оказался метод активированной люцигенином ХЛ, показывающий образование супероксидного радикала в митохондриях ткани.

4. Биологически значимые концентрации антиоксидантов не оказывают серьезного влияния на образование супероксидного радикала митохондриями ткани.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования используются в медицинской практике Государственного Учреждения «72 Центральная Поликлиника МЧС России» для мониторинга состояния пациентов, являются составной частью лекционных курсов и внедрены в программу практических занятий кафедры медицинской биофизики ГУНУ ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова и кафедры медицинской биофизики МБФ ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международном симпозиуме «Активные формы кислорода и азота: диагностическое, профилактическое и терапевтическое значение» (Санкт-Петербург, 2002); международной конференции «Активные формы кислорода и азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003).

Результаты работы были обсуждены на совместном заседании кафедры медицинской биофизики ГУНУ ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова и кафедры медицинской биофизики МБФ ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России.

Публикации. По результатам исследования опубликовано 5 работ, в том числе, 3 статьи в ведущих научных периодических изданиях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы с описанием результатов работы, обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 375 источников. Иллюстративный материал представлен 58 рисунками и 12 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования.

Клиническая характеристика больных. В исследование были включены 10 больных хронической ишемической болезнью сердца в возрасте 53 ± 10 лет, которым выполнялись плановые операции прямой реваскуляризации миокарда в условиях искусственного кровообращения (ИК). Больные были распределены на две группы. В 1 группе (п=4) до ИК вводили дексаметазон в дозе 1 мг/кг (осложненное течение в после операционном периоде, включая 1 летальный исход). Во II группе (п=6) проводилась коррекция, дексаметазон применяли в дозе 2 мг/кг в сочетании с ацетилцистеином в дозе 100 мг/кг (благополучный исход операции). Благополучный исход операции оценивался по спонтанному восстановлению сердечной деятельности, отсутствию серьезных нарушений кровообращения после окончания операции, индексу оксигенации < 250 мм рт. ст. через 20 часов после окончания операции. Забор крови осуществляли в пластиковую посуду в строго определенные моменты времени. В эти же моменты оценивали показатели клинического анализа крови, коагулограммы и концентрации мочевой кислоты.

Кровь стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении по объему 1:9 или раствором гепарина (в 0,9% №С1) из расчета 10 ед/мл крови. Для получения плазмы 10 мл стабилизированной венозной крови центрифугировали в течение 10 мин при 910 g.

Срезы, кашицы и гомогенаты тканей органов крысы. Эксперименты проводили на самцах белых беспородных крыс возрастом 2-3 месяца и массой около 300 г, содержавшихся на стандартном рационе вивария. Ткани разных органов помещали в физиологический раствор и хранили при температуре 4°С не более 6 часов. Перед измерением острыми ножницами выделяли кусочки тканей органов массой 280 мг ± 40 мг и толщиной около 5 мм (концентрация белка по биуретовому методу составляла 0,39 ± 0,04 мг в 1 мг ткани), к которым добавляли необходимое количество физиологического раствора или буфера и использовали в работе, либо готовили из них кашицу или гомогенат. Кашицу

готовили путём продавливания органа через крупноячеистое сито. Гомогенат готовили путём измельчения кусочка в стеклянном гомогенизаторе в течение

1 минуты в 600 мкл физиологического раствора.

Митохондрии из печени крысы выделяли по методике [Storrie В., 1990] и хранили при температуре 0-4°С (на льду) не более 6 часов в среде, содержащей 10 мМ HEPES, 250 мМ сахарозы, 1 мМ АТФ, 0,08 мМ АДФ, 5 мМ сукцината и

2 мМ К2НР04, рН 7,5. Для измерения ХЛ использовали среду, содержащую: 10 мМ HEPES, 0,9% NaCI, 170 мкМ сукцината, 70 мкМ АДФ, 2 мМ К2НР04.

Эмульсию жирной кислоты готовили путем добавления линолевой кислоты к 50 мМ фосфатному буферу или 10 мМ Tris, рН 12,0, перемешивали до образования прозрачного раствора, затем снижали рН до 9,0 или 7,4. Гидропероксид линолевой кислоты (ГПЛК) получали автоокислением эмульсии линолевой кислоты, рН 9,0, путем инкубирования в течение 40 минут при комнатной температуре и интенсивном перемешивании. По окончании инкубации рН снижали до 7,4.

Экстракцию общих липидов из желтков куриных яиц проводили по методу [Folch J. et al., 1951]. Из этой фракции получали многослойные фосфолипидные липосомы по методу [Bangham A.D et al., 1967].

Методы исследования.

Измерение ХЛ проводились на компьютеризированных хемилюминометрах «Биотоке 7а» (Москва) - клиническая часть, ХЛМ-3 («Бикап», Россия) - работа с тканями, LKB 1251 (WALLAC, Финляндия) - модельные системы. Все эксперименты выполнялись при температуре 37 или 20°С при постоянном или периодическом перемешивании. Схемы экспериментов даны на (рис. 1). Люминол-активированная ХЛ (ЛюмХЛ)

Для измерения ЛюмХЛ фагоцитов цельной крови, стимулированной кристаллами сульфата бария, в кювету наливали 1,1 мл среды (165 мМ NaCI, 15 мМ Tris-HCl, 2,25 мМ СаС12, 25 мМ BaS04 (рН 7,4 ± 0,05)) и 10 мкл 1,13 мМ раствора люминола. В эту систему добавляли 20 мкл цельной крови, стабилизированной цитратом натрия, кювету встряхивали и помещали в

темповую камеру хемилюминометра (рис. 1). Оценивали светосумму ХЛ за 4,5 минуты после добавления крови в кювету.

Фагоциты

,Кровь і 20 мкл

Кусочки ткани

ср Кусочек

Г / ткани

Изотонический ■ буфер с ВаБОд I

— Эритроциты

__ ВаБО,, + Фагоциты

I-ФЭУ-

■ Мешалка

■ Экстракт

Рис. 1. Схемы проведения экспериментов с фагоцитами цельной крови и кусочками тканей.

Хемилюминометр ((Биотоке 1а»

Хемилюминометр «ХЛМ-3»

Для измерения общей антиоксидантной емкости плазмы крови реакционная среда общим объемом 2,26 мл содержала 1,84 мл буфера и 0,02 мл люминола в конечной концентрации 1 мМ, для инициирования свободнорадикального окисления которого добавляли 0.2 мл 2,2'-азобис(2-амидинопропан)гидрохло-рид (АБАГ1) в конечной концентрации 10 мМ. Тролокс, этанол, 0,02 мл плазмы, стабилизированной цитратом натрия, или плазмы, обработанной 5,67 мЕд/мл уриказой, добавляли в систему в виде 0,2 мл буферного раствора при достижении стационарного свечения.

Измерение ЛюмХЛ срезов тканей (мозга, почек, печени и т.д.) проводили в 5 мл буфера Хенкеа с 1% глюкозой (рН 7,4). Срезы тканей инкубировали в аэробных условиях при 37°С. ХЛ активировали добавлением разных концентраций люминола.

Родамином Ж-активированная хемшюминесценция (РХЛ)

К 0,04 мл плазмы добавляли 0,04 мл 1 мМ родамина Ж, перемешивали и добавляли 1,98 мл буфера. ПОЛ инициировали добавлением в кювету 0,2 мл 25 мМ раствора Ре804 * 7Н20. Люцигенин-активированная ХЛ (ЛюцХЛ)

Исследуемый объект (кусочек ткани, кашицу, гомогенат или суспензию митохондрий) помещали в кювету хемилюминометра, добавляли необходимое количество буфера и регистрировали ХЛ. Время записи кинетики варьировало от

15 до 90 минут в разных опытах. Люцигенин добавляли в конечной концентрации ОД мМ, 0,36 мМ или 0,83 мМ на разных стадиях развития кинетики. Перемешивание образцов осуществляли встряхиванием либо с помощью механической мешалки. В некоторых экспериментах в определенные моменты времени кусочек ткани вынимали из кюветы и регистрировали ХЛ экстракта. Оценивали светосумму и максимальное значение интенсивности ХЛ и ее изменение при различных воздействиях на объект или при извлечении объекта из кюветы.

Фракционирование осуществляли центрифугированием кашицы 25 минут при 910 g, инкубированной предварительно в аэробных условиях при 37°С 20 минут в 3-х мл буфера. Затем отбирали 2,3 мл супернатанта или осадок в кювету, содержащую буфер из расчета конечного объема 3 мл, и регистрировали кинетику ХЛ, активированную добавлением 0,1 мМ люцигенина.

Для приготовления насыщенного раствора монооксида азота (NO) 10 мл буфера дегазировали, продувая аргоном в течение 15 мин в герметичной посуде. Затем насыщали буфер газообразным NO в течение 15 мин при 4°С. Насыщенный раствор NO разбавляли буфером до нужной концентрации и добавляли к исследуемому объекту. Облучение объектов 20 мВт He-Cd лазером (441 нм) проводили в течение 5 милут.

Действие антиоксидантов (АО) на ЛюцХЛ кусочков ткани или кашицы печени изучали либо при добавлении разных концентраций АО по ходу эксперимента, либо после предварительной инкубации объекта с АО в кювете хемилюминометра в течение 5 мин. В первом случае люцигенин в систему добавляли сразу, во втором случае после инкубации. В качестве растворителя использовали 98% этанол. В качестве миметика супероксиддисмутазы (СОД) использовали медную модель СОД (C18Hi6N604Cu*l,5H20) [предоставлена Э.А. Парфеновым из Российского Онкологического Научного Центра имени H.H. Блохина].

Кумарин-активированная хелатюминесценция (КХЛ)

Для изучения реакции церия с трет-бутилгидропероксидом (тБГП) или линолевой кислотой (ЛК) к 0,8 мл 2,12 мМ раствору тБГП или ЛК в буфере

добавляли 0,04 мл 2,8 мМ раствора церия в том же буфере и регистрировали кинетику ХЛ. Для активации ХЛ к гидропероксиду добавляли 0,01 мл 0,38 мМ этанольного раствора кумарина С-525. Оценивали амплитуду вспышки ХЛ.

Для измерения КХЛ, сопровождающей окисление фосфолипидных липосом, в кювету хемилюминометра последовательно добавляли: 0,4 мг/мл липосом, 0,1 мкМ С-525, разные концентрации бычьего сывороточного альбумина и 20 мМ Tris-HCI (рН 7,4) до конечного объема 5 мл. Инициирование окисления фосфолипидных липосом осуществляли введением 14,4 мкМ FeS04.

Для измерения КХЛ плазмы крови использовали состав среды и условия измерения аналогичные описанным для РХЛ. Конечная концентрация кумарина С-525 составляла 1,1 мкМ.

Исследование КХЛ тканей проводили в тех же условиях, что и ЛюцХЛ. Кумарин С-525 добавляли в конечной концентрации 4,1 мкМ, 3,3 мкМ или 1,4 мкМ на разных стадиях развития кинетики. В части экспериментов для изучения природы КХЛ использовали экстракт и его фракции, полученные центрифугированием экстракта в течение 15 минут при 910 g или 20 минут при 3600 g. Измерения спектров флуоресценции и поглощения

Спектры возбуждения и испускания флуоресценции С-525 регистрировали на спектрофлуориметре Hitachi MPF-4 (Япония).

Измерение спектров поглощения проводили на спектрофотометре DU-65 ("Beckman", США). Концентрацию диеновых конъюгатов определяли по интенсивности поглощения в области 234 нм (£234=2,95* 104М"'см"'). Статистическая обработка результатов

Результаты представлены в виде значений средней арифметической величины ± стандартная ошибка среднего, рассчитанных по данным не менее трех экспериментов. Анализ значимости различий измеряемых параметров между группами больных проводили с помощью непараметрического Т-критерия Манна-Уитни. Для оценки значимости различий параметров в ходе операции был использован непараметрический W-критерий Уилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение люминол-зависимой ХЛ фагоцитов цельной крови у больных в периоперационном периоде

Для изучения динамики люминол-зависимой ХЛ фагоцитов цельной кр|ови в качестве стимула использовали кристаллы сульфата бария (см. схему на рис. 1). В результате исследований были выбраны оптимальные условия: объем крови 20 мкл, хранение крови не более 90 минут от забора до измерений, использование в качестве стабилизатора цитрата натрия.

Наиболее значимые изменения показателей клинического анализа крови и коагулограммы происходили в период ИК. В начале ИК происходило выраженное статистически значимое снижение интенсивности ХЛ (Р=0,018), которая у большинства пациентов восстанавливалась к концу операции (рис. 2). Изменения интенсивности ХЛ в течение операции были связаны не с разведением крови в период ИК, а с изменением функционального состояния клеток, так как изменения интенсивности ХЛ в расчете на 1000 лейкоцитов аналогичны описанной выше динамике ХЛ. Поскольку существует высокая корреляция нормированной и не нормированной по числу лейкоцитов ЛюмХЛ цельной крови (11=0,93 при Р<0,001), процедуру стандартизации в условиях клинического анализа можно исключить. В группе с осложнениями фагоцитарная активность была достоверно ниже на всех этапах операции, и самые низкие значения были у пациента с летальным исходом (табл. 1). Восстановление

Рис. 2. Типичные кривые изменения ЛюмХЛ фагоцитов цельной крови (снизу вв^рх) в периоперационном периоде. Хемилюми-нометр «Биотоке 7а».

1 сутки после операции

_ конец операции

после введения протамина

конец ИК „ 30 минут ИК начало ИК до операции

X Ш

я ою 5.

о о ш о

0 2 4 6 8 Время от начала стимуляции, мин

активности фагоцитов после операции было лучше выражено в группе пациентов без осложнений.

Таким образом, низкий уровень свечения люминол-зависимой ХЛ фагоцитов и слабое восстановление интенсивности ХЛ в конце операции могут служить показателями возникновения осложнений у пациентов в ближайший период после операций.

Таблица 1. Сравнение активности фагоцитов по светосумме1 люминол-зависимой ХЛ клеток а группах больных

Этап операции Бе з осложнений2 С осложнениями2 Летальный исходs

До операции 28 ±7 12 ± 3 14,3 ±5,1

Начало ИК 9 ± 1 3 ± 1 3,2 ± 0,2

30 минут ИК 31+7 8 ± 2 2,5 ± 0,2

Конец ИК 47 ±29 5 ± 1 3,7 ± 1,0

После введения протамина 29 ±3 6 ± 1 7,1 ±2,2

Конец операции 15 ± 1 6 ± 3 1,5 ±0,1

1 сутки после операции 45 ±4 14 ± 3 —

'Светосумма за 4,5 минуты после начала стимуляции клеток, деленная на 1000.2Среднее и ошибка средней в группе больных. 'Среднее и ошибка средней по результатам нескольких экспериментов для одного больного. Различия между группами на всех этапах исследования статистически значимы (Р < 0,05).

Исследование изменения антиоксидантной емкости плазмы крови у больных в периоперационном периоде

Одним из количественных способов определения антиоксидантной емкости (АОЕ) плазмы крови является метод total reactive antioxidant potentials (TRAP), основанный на свободнорадикальном окислении люминола пероксильными радикалами азоинициатора. Прежде всего, было показано, что длительность латентного периода не зависит от времени добавления тролокса и во всех случаях линейно увеличивается с увеличением концентрации антиоксиданта. Далее были подобраны оптимальные условия анализа АОЕ плазмы крови: объем плазмы, стабилизированной цитратом натрия, 20 мкл, хранение при минус 20°С не более недели до исследования. Антиоксидантная емкость выражалась в тролоксовом эквиваленте.

В экспериментах с уриказой, разрушающей мочевую кислоту, было показано, что АОЕ плазмы крови зависела практически полностью от наличия в ней мочевой кислоты.

Было показано, что в отличие от данных по ХЛ фагоцитов статистически значимых изменений антиоксидантной емкости в течение исследуемого периода не было, хотя у пациента с летальным исходом наблюдались самые низкие значения антиоксидантной емкости (табл. 2).

Таблица 2. Сравнение динамики изменения АОЕ плазмы крови в группах больных

Этап операции Без осложнении' С осложнениями' Летальный исходг

До операции 384 ±82 361 ±49 312 ± 4

Начало ИК 376+ 58 382 + 84 325 + 1

30 минут ИК 354 + 64 353 + 97 299 + 5

Конец ИК 352 + 54 355 + 88 256 + 11

После введения протамина 321 +40 418 ± 71 267 + 4

Конец операции 335 + 22 322 + 90 232 ±8

1 сутки после операции 356 + 23 464 + 110 —

'Среднее и ошибка средней в группе больных. 2Среднее и ошибка средней по результатам нескольких экспериментов для одного больного. Различия между группами на всех этапах исследования статистически не значимые.

Изучение железоиндуцированной ХЛ плазмы крови, активированной родамином Ж, у больных в периоперационном периоде

При исследованиях предрасположенности к атеросклерозу и нарушениях липидного обмена важным показателем является степень окисленности липопро-теинов плазмы крови, для оценки которого мы использовали метод Ре2*-индуци-рованной ХЛ плазмы крови, активированной родамином Ж. Были подобраны условия эксперимента: объем плазмы крови 40 мкл, использование в качестве стабилизатора кристаллического гепарина, хранение замороженной плазмы при минус 20°С не более месяца до исследования.

Динамика изменения интенсивности РХЛ плазмы крови у большинства пациентов была похожа на динамику фагоцитарной активности клеток крови и имела наибольший спад в период искусственного кровообращения (в 2+0,3 раза

при Р=0,062) (рис. 3). Существует достоверная связь между снижением ЛюмХЛ фагоцитов и РХЛ плазмы (11=0,4 при Р<0,05). Кроме снижения интенсивности ХЛ наблюдалось также изменение формы кинетики в виде исчезновения медленной вспышки. После операции происходило восстановление как интенсивности, так и формы кривой ХЛ. Картина сильно отличалась у пациента с летальным исходом.

0 '5 10 15

Время, мин

Наиболее показательным параметром оказалась интенсивность ХЛ на 3-й минуте после добавления соли железа. Наименьшие значения этого параметра наблюдались у пациента с летальным исходом, причем уже в самом начале операции (табл. 3).

Примениение активированной кумарином С-525 ХЛ для изучения реакций с участием пероксильных радикалов в модельных и биологических системах

Ранее было показано, что в липидном слое модельных и биологических мембран кумарин С-525 избирательно усиливал ХЛ, обусловленную реакциями цепного окисления липидов, более, чем на четыре порядка. Можно было ожидать, что С-525 окажется эффективным активатором также в случае Бе-индуцированной ХЛ плазмы крови. Однако оказалось, что добавление С-525 к плазме крови не вызывало существенного увеличения интенсивности ХЛ. Причин отсутствия активирующего действия кумарина С-525 в плазме крови может быть как минимум две: 1. Пероксильные радикалы, образующиеся в

I РеЗО<

Рис. 3. Типичные кривые изменения железо-индуцироеанной ХЛ плазмы крови, активированной родамином Ж (снизу вверх) в периоперационном периоде. 1 - амплитуда быстрой вспышки, 2 - Амплитуда медленной вспышки, 3 - время достижения медленной вспышки, 4 - светосумма свечения, 5 -третья минута после добавления соли железа. Хемилюминометр «Биотоке 7а».

Таблица 3. Сравнение интенсивности ХЛ плазмы крови на 3-й минуте после добавления соли железа в группах больных

Этап операции Без осложнении' С осложнениями' Летальный исход'

До операции 24 + 6 27 ±14 12,8+1,1

Начало ИК 22 + 2 24+15 15,7 ±3,9

30 минут ИК 18 ±4 16 ± 8 8,7 ± 0,4

Конец ИК 17 + 4 18 ± 8 8,0+1,9

После введения протамина 20 ±6 25 + 8 9,6+1,8

Конец операции 31 + 1 17 ± 9 8,1 ± 0,6

1 сутки после операции 18 + 2 27 ±8 —

'Среднее и ошибка средней в группе больных. 2Среднее и ошибка средней по результатам нескольких экспериментов доя одного больного. Различия между группа™ на всех этапах исследования статистически не значимые.

плазме крови при добавлении солей Ре2+, отличаются по химической структуре от перекисных соединений в липопротеинах плазмы крови и в суспензии липосом (где было ранее изучено активирующей действие С-525), и отсутствие активации ХЛ в плазме обусловлено тем, что образование пероксильных радикалов не всегда сопровождается кумарин-активированной ХЛ. 2. В плазме крови кумарин не может быть активатором за счет его связывания белками плазмы, в первую очередь альбумином.

Для проверки первого предположения были проведены эксперименты в двух модельных системах, содержащих третичные и вторичные гидропероксиды: трет-бутилгидропероксид - третичный гидропероксид, в котором радикалы образуются в водной среде под действием сильного окислителя Се4+, и линолевая кислота, содержащая вторичные гидропероксиды, где реакция образования пероксидов под действием Се4+ протекает в липидной фазе мицелл. С ростом концентрации кумарина интенсивность ХЛ в обеих системах увеличивалась (рис. 4, А и Б). Аналогичный эффект наблюдался и по мере увеличения концентрации гидропероксида (рис. 4 В). Активирующий эффект кумарина в липид-содержащей системе был лучше выражен, чем в водной системе. Увеличение интенсивности ХЛ в присутствии кумарина в обеих системах связано, вероятно, с рекомбинацией липидных пероксильных радикалов, так как амплитуда вспыш-

6 9 0 3 6 Концентрация С-525, мкМ

0 1 2 Концентрация тБГП, мМ

Рис. 4. А и Б - концентрационные зависимости интенсивности ХЛ от концентрации С-525 в системе тБГП - Се4* (А) и линолевая кислота - Се4* (Б). В - концентрационная зависимость интенсивности ХЛ от концентрации тБГП в присутствии 4,47 мкМ С-525. Состав среды: 10 мМ Tris, рН 7,4, Т-20°С. Хемилюминометр «LKB 1251».

ки хемилюминесценции возрастает с ростом концентрации окислителя не

линейно, а приблизительно пропорционально квадрату концентрации (рис. 5).

LOO* + LOO* —> Продукты + фотон.

Из полученных результатов следует, что кумарин является активатором свечения не только при образовании радикалов различных гидропероксидов липидов, но и гидропероксидов других органических соединений.

S у = 107,09х2 +41,785х

I 300 -|

0 0,8 1,6 Концентрация церия, мМ

Рис. 5. Концентрационная зависимость

интенсивности ХЛ 3,52 мМ линолевой кислоты (0,27 мМ гидропероксида) в присутствии 4,47 мкМ кумарина С-525 от концентрации церия. Состав среды: 50 мМ ЫаН2Р04, рН 7,4, Т=20°С. Хемилюминометр «¿.КВ 1251».

Таким образом, отсутствие активирующего действия кумарина в плазме крови не связано с природой пероксильных радикалов, образующихся в этой системе при липопероксидации.

Другая возможная причина отсутствия активирующего действия кумарина при железоиндуцированной ХЛ плазмы крови может заключаться в том, что С-525 взаимодействует с сывороточным альбумином и не входит в контакт с окисляющимися в липопротеинах липидами.

Добавление разных концентраций бычьего сывороточного альбумина (БСА) в систему железоиндуцированного окисления липосом вызывало два эффекта: снижение амплитуды медленной вспышки за счет связывания с альбумином и изменение формы кинетики, а именно сокращение латентного периода (рис. 6). Во втором случае наблюдается такое же явление, как при уменьшении концентрации ионов железа в системе. По причине связывания С-525 сывороточным альбумином этот активатор не применим в качестве активатора в методе железоиндуцированной ХЛ плазмы крови, который сейчас довольно широко используется в клинике. На сегодняшний день для определения липидной пероксидации в плазме крови в качестве активатора ХЛ более целесообразно использовать родамин Ж.

10 20 30 Время, мин

0,5 ■

Концентрация БСА, мкМ

Рис. 6. Влияние разных концентраций бычьего сывороточного альбумина на кинетику ХЛ железоиндуцированного окисления фосфолипидных липосом, активируемую кумарином С-525. А - кинетики ХЛ, цифры у кривых обозначают концентрацию БСА (мкМ); Б - зависимость отношения амплитуды медленной вспышки в присутствии альбумина к амплитуде медленной вспышки в отсутствии альбумина (Аи^Ато) от концентрации БСА. Состав среды: суспензия липосом (0,4 мг фосфолипидов на 1 мл), 0,1 мкМ С-525 и 14,4 мкМ Рев04 е 20 мМ Тпв-НС! буфере, рН 7,4. Т=37°С, хемилюминометр «ХЛМ-3».

Применение активированной ХЛ для изучения образования радикалов в кусочках ткани

В настоящее время ХЛ метод в клинике применяется главным образом для оценки свободнорадикальных реакций в крови и других биологических жидкостях. Между тем, в некоторых случаях важно знать уровень образования радикалов в тканях, в частности в биопсийном материале, взятом у больных или

на срезах тканей лабораторных животных. В наших опытах мы использовал« изолированные кусочки тканей разных-органов крысы (рис. 1). Люминол-активированная ХЛ

В первую очередь мы изучили ХЛ, связанную с активными формами кислорода, используя люминол в качестве активатора свечения. На рис. 7 А видно, что ткань обладала собственным свечением, но добавление люминола или не влияло на интенсивность ХЛ или увеличивало ее незначительно. Возможно, это связано с тем, что люминол плохо проникает через клеточные мембраны и не реагирует с радикалами, образуемыми внутри клеток.

2 -

с; х

° Й

0 з

£ £ Н

и О X

1 °

С-525

ШЗ

ҐЧ

Люм

12 8

4 -О

С-525

ШЗ

ткань ^ удалили

20 ■ 10 0

10 20

50 85 120 С Время, мин

Рис. 7. Д - Влияние люминола и С-525 на кинетику ХЛ кусочка мозга. Б и В - Вклад кусочка ткани, экстракта и внутриклеточных фракций ткани (центрифугирование 20 мин при 3600 д) в кумарин-активированную ХЛ. Пунктирной линией обозначен уровень темпового тока. Стрелками показано добавление люминола (Люм), С-525, открытие (ШО) и закрытие (ШЗ) шторки хемилюминометра. Состав среды для А: 10 мкМ Люм и 2,45 мкМ С-525 в 5 мл Хенкса (рН7,4). Состав среды для Б и В: 4,1 мкМ С-525 в 3,05мл 0,9% ЫаС1. Т=37СС, хемилюминометр «ХЛМ-3». Кумарин-активированная ХЛ

Кумарин активировал ХЛ кусочков тканей в несколько раз лучше, чем люминол, при концентрациях в несколько раз меньших (рис. 7 А). Дальнейшие опыты показали, однако, что источником кумарин-активированной ХЛ являлась не поверхность ткани, а среда, в которой находились кусочки. Это видно в опытах с извлечением ткани из кюветы и центрифугированием экстракта (рис. 7, Б и В). Интенсивность ХЛ на первых порах близка у экстракта и супернатанта, но затем кинетика ХЛ снижается более резко в супернатанте (рис. 7 В). Можно сделать вывод, что источником кумарин-активированной ХЛ

являлись не целые клетки, а внутриклеточное содержимое; при этом в присутствии неразрушенных клеток (в неотцентрифугированном экстракте) свечение дополнялось ХЛ того содержимого, которое появлялось по мере разрушения этих клеток.

Таким образом, вопреки ожиданиям, кумарин-активированная ХЛ отражает не липидную пероксидацию в клетках, а скорее процесс их разрушения, и по этой причине не может быть рекомендована для оценки уровня липидной пероксидации в интактных клетках кусочков ткани. Люцигенин-активированная ХЛ

Добавление люцигенина в инкубационную среду приводило к увеличению интенсивности ХЛ, которая достигала максимума примерно через 10 минут, а затем медленно снижалась (рис. 8 А). Добавление СОД и медной модели СОД, плохо проникающих через мембраны, не влияло на кинетику ХЛ (рис. 8 Б). Сравнение кинетики люцигенин-активированной ХЛ кусочка печени и выделенных из нее митохондрий показало, что кривые ХЛ близки по форме и амплитуде, хотя и различаются по скорости развития процесса (рис. 8 В). Нарастание ХЛ после добавления люцигенина к ткани связано с проникновением активатора в митохондрии и его восстановлением до катион-радикала, так как если ткань инкубировали без люцигенина в течение некоторого времени, добавление люцигенина не приводило к мгновенному появлению ХЛ, свечение развивалось во времени всегда примерно с одной и той же скоростью (рис. 8 А). Более быстрое развитие свечения в митохондриях (рис. 8 В) связано с тем, что время проникновения люцигенина в ткань больше, чем время проникновения в митохондрии. Последующий спад ХЛ, идущий примерно с одной и той же скоростью, независимо от времени добавления люцигенина к ткани, может быть связан либо с исчерпанием субстратов дыхания, либо со снижением мембранного потенциала, от которого зависит содержание люцигенина в митохондриях. Из представленных данных можно сделать вывод, что за люцигенин-активированную ХЛ в ткани ответственны митохондрии.

Большое влияние на интенсивность ЛюцХЛ оказывало перемешивание среды инкубации, в которой находился кусочек ткани. Прекращение перемешивания вызывало резкое падение интенсивности ХЛ (рис. 9 А, кривая 1). , А Б В

Время, мин

Рис. 8. Влияние времени добавления люцигенина (А), 0,113 мкг/мл СОД и 3 мкМ медной модели СОД (Б) на кинетику ХП кусочка печени. (В) Кинетика ЛюцХЛ митохондрий, выделенных из печени. Стрелками (i) показаны моменты времени, в которые производилось добавление люцигенина (Люц), СОД и медной модели СОД. остальные обозначения как на рис. 7. Состав инкубационной среды ткани: 0,1 мМ Люц в 3,125 мл буфера Хенкса (рН 7,4). Состав инкубационной среды митохондрий: 20 мкл митохондрий (концентрация белка 107 мг/мл) и 0,1 мМ Люц в 5 мл буфера (10 мМ HEPES, 0,9% NaCI. 170 мкМ сукцината, 70 мкМ АДФ, 2 мМ К:НРО,. рН 7,4). Т=37Ъ, хемилюминометр «ХЛМ-3». Видно также, что свечение снижалось не до нуля, а до некоторого уровня, который постепенно увеличивался в ходе инкубации ткани. В отсутствии люцигенина свечение печени также имело место, но интенсивность свечения была ниже (рис. 9 А, кривая 2). Прекращение перемешивания в этом случае приводило лишь к незначительному падению интенсивности ХЛ. Сопоставляя кривые 1 и 2 можно выделить две составляюгцие свечения: люцигенин-независимая (собственная ХЛ) - свечение под кривой 2 и люцигенин-зависимая - свечение над кривой 2. Собственная ХЛ практически не зависела от кислорода, тогда как люцигенин-зависимая ХЛ целиком зависила от доступа кислорода. Интенсивность люцигенин-активированной ХЛ кашицы печени была значительно выше, чем в ткани, что также связано с лучшим доступом кислорода и люцигенина к клеточным структурам (рис. 9 Б). Описанные две составляющие ХЛ излучались различными структурами, что показано в опыте с извлечением ткани из кюветы (рис. 9 В). Извлечение ткани вызывало драматическое падение

интенсивности ХЛ, а возвращение её обратно - восстановление свечения до прежнего уровня. Свечение омывающего раствора в присутствии люцигенина постепенно нарастало во времени, как и в случае ХЛ без люцигенина.

Без ткани £

8 12 16 0 Время, мин

Рис. 9. Влияние перемешивания омывающего раствора {А, кривая 1-е люцигенином, кривая 2 - без люцигенина), измельчения ткани (Б) и извлечения ткани из кюветы (В) на кинетику люцигенин-активированной ХЛ. Фигурными скобками обозначены эпизоды времени без перемешивания. Состав инкубационной среды: 0,1 мМ люцигенина в 3,12 мл 0,9% ЫаС!. Т=37°С, хемилюминометр «ХЛМ-3».

Таким образом, люцигенин-зависимая составляющая ХЛ ткани полностью определяется тканью и наблюдается только при достаточном доступе кислорода. Люцигенин-независимая составляющая свечения связана с омывающим раствором и слабо зависит от концентрации кислорода.

Кривая затухания люцигенин-зависимой компоненты при прекращении перемешивания представляет собой экспоненту, показатель которой отражает скорость потребления кислорода тканью (рис. 10). В табл. 4 приведены константы скоростей потребления кислорода для разных органов, которые различались у разных тканей. Максимальной она была в ткани мозга, минимальной - в коже.

Известно, что митохондрии содержат МО-синтазу и возможно, комплекс N0 с гем-содержащими переносчиками электронов служит регулятором уровня дыхания в митохондриях. Поэтому было изучено воздействие монооксида азота на процесс образования супероксида митохондриями в ткани. При добавлении одной и той же концентрации N0 на разных этапах инкубации ткани оказалось, что раннее добавление N0 необратимо препятствовало развитию люцигенин-активированной ХЛ (рис. ПА). При более позднем добавлении той же концентрации N0 его эффект был обратим (рис. 11 Б). Необратимое действие

^ = 0,836

|ШЗ

Время, мин

Таблица 4. Константы скоростей потребления кислорода для разных органов

Орган Скорость затухания, мин'

мозг 5,46 ±2,57

селезенка 1,59 + 0,27

кожа 1,13 ±0,13

печень 2,68 ± 0,24

Рис. 10. Метод определения константы скорости потребления кислорода на примере кинетики ЛюцХЛ кусочка печени. { - время измерения от начала прекращения работы мешалки, I - разница между интенсивностью свечения в момент времени ¡ = 0 и минимальным уровнем свечения. Стрелками {-I) показаны моменты времени, в которые производилось перемешивание инкубационной среды, пунктирной линией обозначена независящая от перемешивания составляющая интенсивности ХЛ, остальные обозначения как на рис. 8. Состав инкубационной среды: 0,83 мМ люцигенина в 0,3 мл 0,9% ИаС/. Т=37°С, хемилюми-нометр «ХЛМ-3».

N0 связано, как нам представляется, с одной стороны, с повреждающим действием на ткань и снижением разности потенциалов на внутренней мембране митохондрий, в результате чего концентрация люцигенина в митохондриях снижается; с другой стороны N0 может реагировать с

элементами дыхательной цепи, что приводит к уменьшению восстановления люцигенина до катион-радикала. Обратимое действие N0, по всей видимости, связано с взаимодействием N0 с супероксидным анион радикалом. После того, как весь оксид азота израсходовался, свечение восстанавливается, так как супероксид продолжает вырабатываться.

N0 может взаимодействовать со многими элементами дыхательной цепи митохондрий, образуя нитрозильные комплексы, которые разрушаются облучением лазера. В эксперименте с необратимым ингибированием люци-генин-активированной ХЛ ткани облучение гелий-кадмиевым лазером в дозе 100 мВт не влияло на развитие ХЛ (рис. 11 В). Таким образом, необратимое действие N0 в наших опытах не связано с его влиянием на компоненты дыхательной цепи митохондрий.

ЛЮЦ I

20 40 0 5 10 15 Время, мин

Рис. 11. Влияние времени добавления N0 (А и Б) и облучения лазером (В) на развитие кинетики ЛюцХЛ кусочка ткани печени. Пунктирными линиями обозначены контрольные кривые, фигурной скобкой - период облучения, стрелками (N0) - добавление монооксида азота, остальные обозначения как на рис. 8. Состав инкубационной среды: 0,1 мМ люцигенина в 3 мл буфера Хенкса (рН 7,4). В экспериментах с монооксидом азота использовали концентрацию N0 0,3 мМ. Т=37°С, хемилюминометр «ХЛМ-3».

Известно, что образование свободных радикалов в митохондриях, первым из которых образуется супероксид, играет ключевую роль в развитии апоптоза. Поэтому было проведено исследование действия различных антиоксидантов на образование радикалов супероксида в живой ткани. Антиоксиданты добавляли к изолированным кусочкам печени непосредственно в кювете хемилюминометра, инкубировали в течение 5 минут, а затем вводили люцигенин и регистрировали свечение. Было показано, что за время 5-мин инкубации антиоксидант успевал распределиться между раствором и поверхностным слоем ткани, в котором возникало регистрируемое свечение. Кривые ХЛ в присутствии антиоксидантов во всех случаях характеризовались меньшей интенсивностью, чем контрольная кривая. Наиболее эффективными антиоксидантами оказались кверцетин и 2,4-дшштрофенол. Дигидрокверцетин, тролокс, ионол, нарингенин, СОД и медная модель СОД обладали меньшей активностью (табл. 5). Обращает на себя внимание тот факт, что концентрации антиоксидантов, при которых наблюдалось угнетение люцигенин-зависимой ХЛ, были на два порядка выше тех, при которых наблюдается угнетение образования радикала люминола и радикалов липидов комплексами цитохрома С с кардиолиппном. Можно предположить, что действие этих антиоксидантов в живых организмах

обусловлено их действием на вторичные радикалы, включая радикалы липидов,

а не на первичный супероксидный радикал.

Таблица 5. Влияние антиоксидантов на интенсивность ХЛ

Антиоксидант Интенсивность ХЛ Антиоксидант Интенсивность ХЛ

Контроль 100 Кверцетин 33,9

Нарингенин 81,3 СОД 79,1

Ионол 75,8 медная модель СОД 63,9

Тролокс 73,9 2,4-ДНФ 38,6

ДГК 72,4

Состав среды измерения: 0,1 мМ лкмшгенина в 3,125 мл буфера Хснкса, рН 7,4.

Концентрации антиоксидантов: ионол и 2,4-динитрофенол (2,4-ДНФ) - 0,95 мМ, тролокс,

нарингенин, дигидрокверцетин (ДГК), кверцетин - 0,16 мМ; СОД - 3,7 нМ. медная модель

СОД-0,015 мМ.

ВЫВОДЫ

1. Наиболее информативным о состоянии пациентов в ходе операций на сердце оказался метод люминол-зависимой ХЛ фагоцитов цельной крови. На всех этапах прямой реваскуляции миокарда в группе неблагополучных пациентов интенсивность ХЛ клеток была достоверно ниже, чем у пациентов без осложнений. В период искусственного кровообращения в обеих группах наблюдалось резкое снижение интенсивности ХЛ клеток, которая восстанавливалась в конце операции. В группе неблагополучных пациентов восстановление выражено хуже, чем у пациентов без осложнений. Изменения железоиндуцированной ХЛ плазмы крови, активированной родамином Ж, в обеих группах пациентов были сходны с изменениями люминол-зависимой ХЛ фагоцитов цельной крови у тех же больных.

2. Антиоксидантная емкость плазмы крови мало менялась как в ходе, так и после операции на сердце. Различия между группами больных были статистически не значимы. Таким образом, в данной клинической ситуации метод определения антиоксидантной емкости плазмы крови оказался неинформативным.

3. Было показано, что кумарин С-525 является эффективным активатором свечения не только при образовании радикалов липидов, но и пероксидных

радикалов других органических соединений, при этом степень активации ХЛ зависила от наличия гидрофобной фазы. Применение кумарина как активатора железоиндуцированной ХЛ плазмы крови оказалось невозможным из-за содержащегося в плазме альбумина, который взаимодействует с кумарином и резко снижает интенсивность ХЛ.

4. Люминол и кумарин С-525 оказались малопригодными для исследования образования радикалов в изолированных кусочках ткани в силу связывания С-525 с компонентами омывающей жидкости и плохой проницаемости люминола в клетки.

5. Люцигенин-активированная ХЛ оказалась эффективным методом оценки образования супероксидного радикала в тканях и кашицах, продуцируемого в основном митохондриями. Показаны две составляющие развивающегося свечения: люцигенин-зависимая - ХЛ ткани, регистрируемая только в присутствии кислорода, и люцигенин-независимая - собственная ХЛ омывающего раствора, практически не зависящая от кислорода. Затухание люцигенин-зависимой компоненты при прекращении перемешивания отражало скорость потребления кислорода, которая различна в разных тканях.

6. Биологически значимые концентрации антиоксидантов (<100мкМ) не оказывали серьезного влияния на образование первичных (супероксидных) радикалов в клетках тканей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты проведенных исследований могут быть использованы для мониторинга состояния пациентов с целью своевременной коррекции лечения.

2. Полученные данные могут являться составной частью лекционных курсов и внедрены в программу практических занятий для студентов медицинских ВУЗов.

3. Разработанная биологическая модель может использоваться при проведении медико-биологических исследований для регистрации и оценки действия разных веществ и условий на образование супероксидного радикала.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Матвеева, Н.С. Взаимодействие гипохлорита с гидропероксидом жирной кислоты приводит к образованию свободных радикалов / А.В. Чеканов, О.М. Панасенко, Н.С. Матвеева и др. // Биофизика. - 2005. - № 50 (1) - С. 13-19.

2. Matveyeva, N.S. Interaction of /е/7-butyl hydroperoxide and hypochlorite induces generation of peroxyl radicals, as studied by chemiluminescence in the presence of light enhancer cumarin c-525 / A.V. Chekanov, N.S. Matveyeva, O.M. Panasenko et al. // Inter. Symp. "Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Diagnostic, Preventive and Therapeutic Values". St. Petersburg. - 2002. - P. 165.

3. Matveyeva, N.S. The study of hypochlorite interaction with organic hydro-peroxides by means of chemiluminescence and spin trapping assays / A.V. Chekanov, O.M. Panasenko, N.S. Matveyeva et al. // Abstracts of Intern. Conference "Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health". Smolensk. - 2003. - P. 10-11.

4. Матвеева, Н.С. Активируемая люцигенином хемштюминесценция тканей животных / Н.С. Матвеева, О.Б. Любицкий, А.Н. Осипов и др. // Биофизика. -2007. - № 52 (6) - С. 1120-1127.

5. Матвеева, Н.С. Дигидрокверцетин (таксифолин) и другие флавоноиды как ингибиторы образования свободных радикалов на ключевых стадиях апоптоза / Ю.А. Владимиров, Е.В. Проскурнина, Н.С. Матвеева и др. // Биохимия. - 2009. -№74(3) -С. 372-379.

Напечатано с готового оригинал-макета

ООО «Документ сервис «ФДС»» Подписано к печати 14.02.2012 г. Формат 60x90 1/16. Усл. Печ.л. 5 Тираж 100 экз. Заказ 463. Тел. 935-00-89. Тел./факс 432-99-96 119421, г. Москва, Ленинский проспект, д.99

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Матвеева, Наталья Сергеевна, Москва

61 12-3/757

Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

На правах рукописи

МАТВЕЕВА НАТАЛЬЯ СЕРГЕЕВНА

АКТИВИРОВАННАЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ КАК МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ В КЛЕТКАХ И

ТКАНЯХ

03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: академик РАМН, профессор, доктор биологических наук Владимиров Юрий Андреевич

г. Москва, 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................................................6

1. ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................7

1.1. Актуальность исследования........................................................................7

1.2. Цель и задачи исследования........................................................................8

1.3. Научная новизна...........................................................................................9

1.4. Практическая значимость............................................................................Ю

1.5. Положения, выносимые на защиту.............................................................Ю

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................11

2.1. Первичные и вторичные свободные радикалы..........................................11

2.2. Активные формы кислорода и азота и оксидативный стресс..................12

2.2.1. Активные формы кислорода..............................................................12

2.2.2. Монооксид азота и активные формы азота............... .......................13

2.3. Собственная хемилюминесценция клеток и тканей.................................21

2.3.1. Реакции перекисного окисления липидов........................................23

2.3.2. Кинетика железо-индуцированной хемилюминесценции.............26

2.3.3. Реакции с участием активных форм кислорода..............................27

2.3.4. Реакции с участием пероксинитрита................................................29

2.4. Активированная хемилюминесценция клеток и тканей...........................30

2.4.1. Люминол-активированная ХЛ...........................................................33

2.4.2. Люцигенин-активированная ХЛ.......................................................40

2.4.3. Родамин-активированная ХЛ............................................................51

2.4.4. Кумарин-активируемая ХЛ................................................................54

2.5. Роль АФК, изучаемых методами хемилюминесценции, при различных патологических состояниях................................................................................58

2.5.1. Роль АФК при разных патологических состояниях.......................58

2.5.2. Ишемическое повреждение миокарда и мозга и роль оксидативного стресса............................................................................................................60

2.5.3. Оксидативный стресс у больных ишемической болезнью сердца во время операции прямой реваскуляризации миокарда в условиях искусственного кровообращения................................................................63

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................66

3.1. Объекты исследования.................................................................................66

3.1.1. Клиническая характеристика больных.............................................66

3.1.2. Получение крови и плазмы крови.....................................................67

3.1.3. Срезы, кашицы и гомогенаты тканей органов крысы....................67

3.1.4. Выделение митохондрий...................................................................68

3.1.5. Приготовление эмульсии жирной кислоты и ее гидропероксида.69

3.1.6. Приготовление многослойных фосфолипидных липосом.............69

3.2. Материалы.....................................................................................................70

3.3. Оборудование................................................................................................73

3.4. Методы...........................................................................................................75

3.4.1. Клинические лабораторные методы исследования.........................75

3.4.2. Метод люминол-активированной хемилюминесценции................75

3.4.3. Метод люцигенин-активированной хемилюминесценции............78

3.4.4. Метод родамин Ж-активированной хемилюминесценции............79

3.4.5. Метод кумарин-активированной хемилюминесценции.................80

3.4.6. Флуоресцентный метод............................ ..........................................82

3.4.7. Спектрофотометрический метод...................... .................................82

3.5. Статистическая обработка результатов...................... .................................83

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...............................................................84

4.1. Изучение люминол-зависимой ХЛ фагоцитов цельной крови у больных в периоперационном периоде................................................................................84

4.1.1. Подбор условий измерения люминол-зависимой ХЛ....................84

4.1.2. Изменение показателей клинического анализа крови и коагулограммы у больных в периоперационном периоде.......................88

4.1.3. Изменение функционального состояния фагоцитирующих клеток больных в периоперационном периоде......................................................90

4.2. Исследование изменения антиоксидантной емкости плазмы крови у больных в периоперационном периоде.............................................................93

4.2.1. Подбор условий для измерения АОЕ плазмы крови......................94

4.2.2. Изменение АОЕ плазмы крови у больных в периоперационном периоде...........................................................................;...............................104

4.3. Изучение железоиндуцированной XJI плазмы крови, активированной родамином Ж, у больных в периоперационном периоде................................106

4.3.1. Подбор условий..................................................................................106

4.3.2. Изменение активированной родамином Ж XJI плазмы крови у больных в периоперационном периоде......................................................109

4.4. Применение активированной кумарином С-525 XJI для изучения реакций с участием пероксильных радикалов в модельных и биологических системах ................................................................................................................................113

4.4.1. Изучение образования пероксильных радикалов в плазме крови методом железоиндуцированной КХЛ.......................................................113

4.4.2. Изучение образования пероксильных радикалов методом КХЛ при разложении трет-бутилгидропероксида.....................................................116

4.4.3. Изучение образования пероксильных радикалов методом КХЛ при разложении гидропероксида линолевой кислоты.....................................117

4.4.4. Изучение влияния взаимодействия бычьего сывороточного альбумина с кумарином С-525 на кумарин-активированную ХЛ...........121

4.5. Применение активированной ХЛ для изучения образования радикалов в кусочках ткани.....................................................................................................126

4.5.1. Люминол-активированная ХЛ...........................................................126

4.5.2. Кумарин-активированная ХЛ............................................................126

4.5.3. Люцигенин-активированная ХЛ.......................................................129

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...................................................................146

5.1. Изменения свободнорадикальных процессов у больных в периоперационном периоде................................................................................146

5.2. Применение кумарина С-525 для изучения реакций с участием пероксильных радикалов в модельных и биологических системах...............152

5.3. Применение активированной люминолом ХЛ для изучения образования радикалов в кусочках ткани................................................................................155

5.4. Применение активированной люцигенином ХЛ для изучения образования радикалов в кусочках ткани................................................................................155

6. ВЫВОДЫ.........................................................................................................164

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.........................................................165

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................166

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2, 4-ДНФ - 2,4-динитрофенол АБАП- 2, 2"-азобис (2-амидинопро-пан)гидрохлорид АОЕ - антиоксидантная емкость АОЕ-НМ - антиоксидантная емкость, обусловленная не мочевой кислотой АФА - активные формы азота АФК - активные формы кислорода БСА, СА - бычий сывороточный альбумин, сывороточные альбумин ГПЛК - гидропероксид линолевой кислоты

ДНК - дезоксирибонуклеиновая

кислота

ИК - искусственное кровообращение ЛС - липосомы

ЛПНП - липопротеины низкой

плотности

Люм - люминол

ЛюмХЛ, ЛюцХЛ, КХЛ, РХЛ -люминол-, люцигенин-, кумарин-, родамин Ж-активированная хемшпо-минесценция Люц - люцигенин

НАДФН- восстановленный никотин-

амидадениндинуклеотидфосфат

НФ - нейтрофил, -ы

ПМЛ - полиморфноядерные лейкоциты

ПНЖК- полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ- перекисное окисление липи-дов

РЖ - родамин Ж

СОД - супероксиддисмутаза

СХЛ, ХЛ- собственная хемилюми-

несценция, хемилюминесценция, -ый

шБГП - трет-бутилгидропероксид

ТБКРП - реактивные продукты

тиобарбитуровой кислоты

ТИ - темновая инкубация

Тмв - время нарастания медленной

вспышки до максимума

УФ - ультрафиолет, -овый

ФЛ - флуоресценция, -ый

ФМА - форболмиристатацетат

ФЭУ - фотоэлектронный умножитель

ХЛМ - хемилюминометр

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЭПР - электронный парамагнитный

резонанс

DPI - дифенилениодоний NO - монооксид азота NOC - NO-синтаза

TRAP - total reactive antioxidant potentials

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность исследования

Хорошо известно, что в патогенезе многих болезней и патологических процессов важную роль играет оксидативный стресс (т.е. избыточный уровень радикалов в клетке) [109,115,132,140,158,170,215,227,231,233,240,242,250,251, 293,294,297,304,313]. Между тем, прямых методов обнаружения радикалов в клетках и тканях немного, и среди них значительное место принадлежит методу хемилюминесценции (ХЛ) [349,351], прежде всего - ХЛ в присутствии химических активаторов люминола и люцигенина, а также физических активаторов, таких как родамин Ж и производные кумаринов, прежде всего С-525 [88,267]. В последние годы появилось большое число работ, где активированная хемилюминесценция использовалась в медико-биологических исследованиях и в целях клинического лабораторного анализа. Наибольшее число публикаций в этой области посвящено изучению активности фагоцитов крови методом люминол-зависимой ХЛ и определению общей антиоксидантной активности плазмы или сыворотки крови пациентов при различных заболеваниях. В ряде работ изучалась железо-индуцированная хемилюминесценция сыворотки и плазмы крови как метод определения окисляемости липопротеинов. Однако эти методы, которым можно дать общее название - хемилюминесцентный анализ крови, не получили пока широкого применения в лабораторном клиническом анализе, как нам представляется, в основном из-за отсутствия стандартизации всех процедур и как следствие -плохой сопоставимости данных, полученных в разных лабораториях. Помимо этого каждая группа исследователей использовала, как правило, лишь какой-то один из хемилюминесцентных методов, между тем как разные методы дают представление о различных свободнорадикальных реакциях, и использование всего комплекса методов активированной ХЛ на одних и тех же объектах дало бы значительно больше информации об особенностях оксидативного стресса в той или иной конкретной ситуации. Все это делает необходимым разработку

унифицированного метода комплексного хемилюминесцентного анализа крови пациентов в клинике.

1.2. Цель и задачи исследования

Целью данной работы было разработать хемилюминесцентные методы комплексного анализа свободнорадикальных процессов в крови и тканях человека и животных с использованием химических и физических активаторов хемилюминесценции (люминол, люцигенин, родамин Ж и кумарин С-525).

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. У больных ишемической болезнью сердца в периоперационном периоде прямой реваскуляризации миокарда в условиях искусственного кровообращения изучить динамику: а) люминол-зависимой хемилюминесценции фагоцитов цельной крови; б) антиоксидантной емкости плазмы крови; в) железоиндуцированной ХЛ плазмы крови, активированной родамином Ж.

2. С пмомощью кумарин-активированной ХЛ исследовать реакции с участием пероксильных радикалов в плазме крови и других системах.

3. Исследовать образование свободных радикалов в изолированных кусочках тканей разных органов крысы, используя метод: а) люминол-активированной ХЛ; б) кумарин-активированной ХЛ; в) люцигенин-активированной ХЛ.

1.3. Научная новизна

Впервые проведено сравнительное изучение и описана динамика изменения функционального состояния фагоцитирующих клеток цельной крови, антиоксидантной емкости и липидной пероксидации в плазме крови у больных ишемической болезнью сердца в периоперационном периоде прямой реваскуляризации миокарда в условиях искусственного кровообращения. Показано достоверное снижение фагоцитарной функции и липидной пероксидации в период искусственного кровообращения. Выявлена зависимость между снижением активности фагоцитирующих клеток цельной крови и наличием осложнений у пациентов в раннем послеоперационном периоде.

Впервые проведено сравнительное изучение хемилюминесценции кусочков тканей органов крысы в присутствии различных активаторов. Установлено, что для изучения свободнорадикальных процессов в тканях наиболее информативен метод люцигенин-актиеированной ХЛ, который отражает образование супероксидного радикала в митохондриях. Обнаружено, что в присутствии люцигенина ХЛ определяется двумя составляющими: люцигенин-зависимой (кислород-зависимой) ХЛ поверхностного слоя ткани и собственной (кислород-независимой) ХЛ экстракта. Предложен способ оценки скорости потребления кислорода тканью, основанный на измерении скорости затухания ХЛ после прекращения перемешивания среды, которая различна в разных органах. Показано, что биологически значимые концентрации антиоксидантов не оказывают серьезного влияния на образование супероксидного радикала митохондриями ткани.

1.4. Практическая значимость

Разработанные в ходе работы подходы комплексного хемилюминесцентного анализа могут быть применены в медицинской практике для мониторинга состояния пациентов (в том числе интраоперационного), в трансфузиологии при переливаниях крови, для оценки состояния тканей при пересадках органов. Предложенная биологическая модель (кусочек ткани и кашица) может использоваться в медико-биологических исследованиях для изучения свободнорадикальных процессов в биоптатах тканей при различных патологических состояниях и выяснения механизма действия разных веществ и условий на образование супероксидного радикала.

1.5. Положения, выносимые на защиту

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Первичные и вторичные свободные радикалы

Главным источником всех радикалов в нормально функционирующих клетках животных и человека служит реакция одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода, приводящая к образованию супероксид анион-радикала (■02~). Этот радикал образуется либо НАДФН-оксидазным комплексом цитоплазматической мембраны или мембран эндоплазматического ретикулума [100,102], либо дыхательной цепью внутренней мембраны митохондрий [331]. Второй радикал, имеющий не меньшее значение в жизни клетки, — это монооксид азота (N0), образуемый М>синтазами. Оба радикала образуются ферментными системами и были названы первичными радикалами [10].

Все радикалы весьма реактивны, и первичные радикалы быстро переходят в молекулярные продукты (рис. 1). Специальный фермент супероксиддисмутаза (СОД) превращает -02~ в пероксид водорода НООН (реакция 1). N0 в присутствии -ОТ реагирует с ним с образованием токсичного иона пероксинитрита ОЖЮ- (реакция 2). Супероксид обладает способностью восстанавливать трехвалентное железо, хранимое в ферритине или входящее в состав железно-серных комплексов цепей переноса электронов, до двухвалентного (реакция 3), что и происходит в неблагоприятных для клетки условиях [222,223]. Двухвалентное железо охотно реагирует с НООН или гипохлоритом с образованием чрезвычайно активного радикала гидроксила -ОН (реакции 4-5) [67], а также способно разветвлять цепи окисления липидов, реагируя с липогидропероксидами

Информация о работе

Матвеева, Наталья Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Активированная хемилюминесценция как метод изучения свободнорадикальных реакций в клетках и тканях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы