Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование флюорохромов для изучения окислительного метаболизма фагоцитов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Использование флюорохромов для изучения окислительного метаболизма фагоцитов"

министерство здравоохранения рф российский государственный медицинский университет

На правах рукописи.

БИЗЮКИН Андрей Викторович

использование флюорохромов для изучения окислительного метаболизма фагоцитов.

03.00.02 биофизика.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1993.

Работа выполнена в Российском государственном медицинском

университете

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Л. Г. Коркина

Официальные оппоненты:

доктор физ. -мат. наук Г. Е. Добрецов

доктор медицинских наук А. Г. Румянцев

Ведущее учрездение - Московский Государственный Университет

им. М. В. Ломоносова.

Защита состоится _ " _ 1993 г. в спецсовете

К. 084.14.04. при РГМУ в _час. , в аудитории N _

по адресу 117869 Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке университета.

Автореферат разослан "_^ " _ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

И. В. Буромский.

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемны. Исследования последних лет показывают, что способность фагоцитарных клеток выполнять ряд важных физиологических функций неразрывно связана с их способностью продуцировать активные формы кислорода (АФК); супероксидный анион-радикал COg), пероксид водорода (HgOg), гидроксильный радикал СОН } и синглетный кислород (Владимиров Ю. А. с соавт. , 1991; Коркина Л. Г. И др. 1988; Freiburghaus J. et.al.,1991).

Избыточная продукция данных метаболитов приводит к повреждению ядерных структур (Афанасьев И. Б. 1985), инактивации ферментов (Владимиров Ю. А. с соавт. 1989), может бьггь причиной повреждения собственных клеток (Reiiiy p.m. et.al. 1991) и нежелательной альтерации межклеточного вещества (southorn P.A. et.al. 1980).

С изменением активности свободно-радикальных процессов связаны такие патологии как хроническое воспаление (Halliweii в. et. al. 1989), атеросклероз (Владимиров Ю.А. и др. 1991), ишемия (БилеНКОМ.В. 1989D, ИНфарКТ МИОКарда (Chacon Е. et.al. 1991), ревматоидный артрит (Halliweii в. et.al. 1989), пневмокониозы и фиброз (Коркина Л.Г. с соавт. 1988), хронический гранулематоз (Hassan N.F. et.al. 1988), гемоглобинопатии ( de Martino М. et.al. 1984), аутоиммунные состояния (Коркина Л.Г. с соавт. 1988), канцерогенез (Bassaga H.S. et.al. 1990) И старение организма (Dabadie Н. et.al. 1991).

Цель исследования. Традиционно полагают, что образование супероксидного анион-радикала происходит в результате одноэлектрон-ного восстановления кислорода, связанной с плазмалеммой НАДФН-ок-сидазой (Фрейдлин И. С. 1984), поэтому большинство исследований окислительного метаболизма фагоцитов касается внеклеточной гене-

рации активных метаболитов кислорода. Однако, известно, что часть радикалов образуется внутриклеточно, возможно, за счет дыхательной цепи митохондрий и эндоплазматического ретгасулюма (Афанасьев И.Б. 1983, Владимиров Ю. А. с соавт. 1991).

К сожалению, генерируемые внутриклеточно продукты неполного восстановления кислорода, как правило, не определяются традиционными методами (спектрофотометрически по восстановлению цитохрома С или с помощью хемилюминесценции). Перспективным в данном отношении является использование флюоресцентных зондов, способных проникать внутрь фагоцитов и окисляться там активными формами кислрода до флюоресцирующих соединений (Kobzik L. et.al. 1990, Rothe G. et.al. 1988).

Целью данного исследования является разработка и оценка возможностей использования флюорохромов 2,7-дихлорфлюоресцин диаце-тата (2,7-ДХФН-ДА), дигидрородамина 123 СДГР-123) и гидроэтидина (ГЭ) для сравнительного изучения роли вне- и внутриклеточной продукции активных форм кислорода в окислительном метаболизме фагоцитирующих клеток при-различных функциональных состояниях в норме и патологии.

Задачи исследования. 1) Разработать метод изучения окислительного метаболизма фагоцитирующих клеток с использованием флюоресцентных красителей: 2,7-ДХФН-ДА, ДГР-123 и ГЭ ; 1 А) Сравнить чувствительность флюорохромов к активным метаболитам кислорода в модельных системах; 1 Б) Оценить влияние различных клеточных компонент на стабильность флюорохромов и их люминесценцию; 1 BD Разработать метод'измерения соотношения вне- и внутриклеточной продукции активных форм кислорода в фагоцитирующих клетках; 2) Изучить влияние ионов кальция на вне- и внутриклеточный окислительный ме-

таболизм фагоцитов; 33 Сравнить окислительный метаболизм фагоцитирующих клеток крови у пациентов с гемоглобинопатиями и у здоровых доноров.

Научная новизна. Автор сравнивает чувствительность трех флюо-рохромов к различным активным метаболитам кислорода и оценивает вероятность получения ложноположительных результатов. В результате проведенного исследования модифицирован и обоснован метод измерения внутриклеточной и общей продукции радикалов кислорода в фагоцитирующих клетках с использованием витального флюорохрома гидро-этидина.

Представлены оригинальные данные о соотношении вне- и внутриклеточной продукции активных форм кислорода в альвеолярных, пери-тонеальных макрофагах и нейтрофнлах крови.

Впервые обнаружены различные эффекты риосидина и ЭГТА на вне-и внутриклеточную продукцию радикалов кислорода в клетках лейко-массы доноров, стимулированных форболмиристатацетатом (<ША).

Так же впервые представлены данные об усилени внутриклеточной генерации свободных радикалов кислорода в фагоцитирующих клетках пациентов с большой формой /3+-гомозиготной талласемии и у пациента с уникальной формой нестабильного гемоглобннаС"нь-А1езЬа").

Практическая значимость. Результаты диссертационного исследования могут быть внедрены в практику лабораторных и клинических исследований в иммунологии, гематологии, пульмонологии и др. отраслях современной медицины, изучающих свободно-радикальный статус фагоцитов. '

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 2-ом Всесоюзном конгрессе по органам дыхания (Челябинск 1991г. 5 и на объединенной научной конференции сотрудников кафедры биофизики.

лаборатории экспериментальной терапии и патогенеза пневмокониооов РГМУ и лаборатонии свободно-радикальной патологии органов дыхания НИИ Пульмонологии, а так же лаборатории биофизики и биохимиии клеток крови НИИ Детской гематологии (Москва 1992 г. Э.

Обьем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста и содержит 8 схем, 7 таблиц, 11 рисунков. Библиографический указатель включает 169 источников.

Материалы и методы.

Принцип метода измерения внутриклеточной продукции АФК основан на способности витальных фшоорохромов ГЭ, 2,7-ДХФ-ДА и ДГР-123 накапливаться внутри клеток и после взаимодействия с АФК превращаться, соответственно, в этидиум, 2,7-дихлорфлюоресцеин и родамин 123. С схемы 1, 2, 3). Все красители были синтезированы в НИИ Органических Полупродуктов и Красителей. Маточные растворы флюорохромов были приготовлены в диметилформамиде и хранились при -18°С.

Фагоциты в растворе Хенкса без фенолового красного СрН-7,4) инкубировали 13 минут с 10~^М. ГЭ (Kobzik l. et.al.1990, Rothe G. et.ai.1988), тщательно отмывали центрифугированием в избытке раствора Хенкса и окончательно ресуспендировали до концентрации 10® кл/мл. После этого клетки стимулировали ФМА или пептидом формил-ь-метионил-ь-лейцил-ь-фенилаланин СФМЛГО. Образование этидиума из ГЭ в клетках регистрировали, измеряя интенсивность флюоресценции этидиума при длинах Волн Хем-610нм. , хех-473нм. на спектрофлюори-метре MPF-44 (Perkin-Eimer) в сантиметровых кварцевых кюветах,

термостатированных при 37°С и постоянном перемешивании.

Схема 1. Превращение гидроэтидина в этидиум под влиянием АФК.

I II I II

I II I II

Гидроэтидин Этидиум

х.„ - 348 нм. , x__- 421 нм. x - 473 нм. , x - 610 нм.

ех ет ех ет

Для сравнения вне- и внутриклеточной продукции АФК готовили две пробы клеток. Первая - нагруженные ГЭ фагоциты тщательно отмывали от избытка красителя и затем стимулировали ФМА. Таким образом определяли только внутриклеточную генерацию АФК. Вторая проба содержала нагруженные ГЭ клетки, не отмытые от избытка красителя. Клетки активировали такой же концентрацией ФМА. При этом измеряли как внутри- так и внеклеточную Ст. е. суммарную) продукцию АФК.

Для изучения продукции активных кислородных метаболитов использовали так же традиционный метод люминол- и люцигенин--зависимой хемилюминесценции. Измерения производили на отечественном хемилю-минометре ТКЛ-1 в термостатированных при 37°С стеклянных кюветах. Измеряли спонтанную хемилюминесценцию клеток с люминолом Сили лю-цигенином) в раствора Хенкса без фенолового красного СрН-7,4) в гечение 3-5 минут. Затем добавляли активатор СФМА или ФМЛП) и измеряли максимальное значение интенсивности "вспышки" хемилюми-^ecцeнции.

Схема 2. Превращение дигидрородамина 123 в родамин 123 после взаимодействия с АФК.

I II I I

Л Ч^°2СНЭ I II

Дигидрородамин 123 не флюоресцирует

I II Ч:/

Родамин 123

X - 501 НМ. , X - 528 НМ. ех * ет

Схема 3. Превращение 2,7-дихлорфлхюресцин диацегата в а//-д!то1ор(}ш]ооресцин и после взаимодействуя с АФК в 5,7-дихлорфпюоресцеин.

сн3со2ч

л

\ /соон

I II

/2,7-дихлорфшэоресцин диацетат не флюоресцирует

сС' /^¿У \:ь

эстераза н |

✓соон

I II

2,7-дихлорфшооресцин не флюоресцирует

2,7-дихлорфлюоресцеин

- 501 НМ. , X,- 521 НМ. ех ет

Превращение флюорохромов под воздействием свободных радикалов

кислорода изучали в модельных системах: влияние ОН' радикалов - в

модифицированном реактиве Фентона СКоркина Л. Г. с соавт. 1988);

влияние Og радикалов - в ксантин-ксантиноксидазной реакции

(McCord j.m. et.al 1968). Количество радикалов определяли СОД-чув-

ствительному восстановлению цитохрома С, из рассчета, что коэффи-

-1

циент зкстинции цит. = 18500СМ"см.) (McCord j.m. 1983) и одна молекула Og восстанавливает одну молекулу цитохрома С. Источником синглетного кислорода служил раствор NaocL-H2o2 СВладимиров Ю. А. с соавт. 1991). Генерацию эндогенного пероксида водорода моделировали в глюкозо-глюкозооксидазной реакции СНго Т. Т. с соавт. 1988).

Перитонеальные и альвеолярные макрофаги, а так же клетки лейкомассы крови доноров выделяли по общепринятым методикам (BeChard D.E. et.al. 1988, Boyum А. 1968).

Вся статистическая обработка данных производились по программе "Statgraphics" на IBM PC/AT/486.

Результаты исследований и их обсуждение-Часть 1. Выбор флюорохрома.

Когда мы начинали эту работу нас волновал вопрос: не обладают ли используемые нами флюоресцентные красители специфической чувствительностью к какому-либо одному виду кислородных радикалов? Нас так же привлекала возможность использовать вышеперечисленные красители для количественного определения продукции А<Ж в клетках. Поэтому на первом этапе данной работы была изучена чувствительность флюорохромов: 2,7-ДХФН, ДГР-123 и ГЭ к АФК в модельных системах, продуцирующих только какой-либо один вид радикалов, а также К NaOCL И FeS04.

При сравнительном изучении чувствительности ГЭ, 2,7-ДХФН и ДГР-123 к АФК, ось" и Fe+2 в модельных системах получены результаты, что все флюорохромы чувствительны к супероксидным, гидроксиль-ным радикалам, гипохлорным ионам Срис.1.5 и в меньшей степени к пероксиду водорода и Fe+2. С синглетным кислородом люминофоры не взаимодействут С рис. I.D. Самым чувствительным к радикалам, ось'и HgOg оказался ГЭ. На втором месте - ДХФН, а наименее чувствителен к АФК и ось" ДГР-123 Срис.I.D.

Получен интересный результат, что ГЭ взаимодействует с супероксидными радикалами, образующимися в ксантин-ксантиноксидазной системе, в молярном отношении 1:1.

Для оценки вероятности получения ложноположительных результатов была изучена чувствительность ГЭ, ДХФН и ДГР-123 к белкам, фосфолипидам, ДНК и изменению pH среды. Оказалось, что ДГР-123 и ДХФН превращаются в окисленные формы и начинают люминесцировать не только после контакта с А<Ж, но и после взаимодействия с белками. Поэтому использоваие ДХФН-ДА и ДГР-123, по нашему мнению, может привести к получению ошибочных результатов. ГЭ лишен этих недостатков.

Для получения адекватных результатов необходимо было удостовериться, что ГЭ действительно связывается с фагоцитами и не является токсичным для клеток. Поэтому было изучено связывание ГЭ с фагоцитами, а также влияние его на жизнеспособность клеток. Получены данные, что ГЭ за 7-10 минут связывается с фагоцитами и очень медленно вытекает из них С 4,5 % вытекает за 40 минут D. ГЭ в концентрации 10~4М. не влиял на жизнеспособность клеток в течение одного часа.

Предложен количественный способ измерения внутриклеточной

ЕШЭ ооян-123 б£э осрн

еи не

Рис.1. Сравнительная чувствительность 2.7-дихлорфлюоресцина, дигидрородамина-123 и гидроэтидина к активным формам кислорода. Сос1Ш-123 - дигидрородамин 123; бсгн - 2,7-дихлорфлюоресцин; не - гидроэтидин; о2 - супероксид анион-радикал; он - гидроксильный радикал; иаось - гипохлорит на; н202 -пероксид водорода; 102 - синглетный кислород )

продукции АФК путем построения калибровочной кривой, учитывающей влияние клеточных компонент на люминесценцию этидиума. Получены

данные, что после стимуляции перитонеальных макрофагов крыс

—7 + —1 'З

2x10 М. ФМА в одной клетке образуется С7,6 - 0,83x10 молей

этидиума. Обращает на себя внимание тот факт, что внутриклеточная продукция АФК является в значительной степени цианид-чувствительным процессом.

Предложен также способ измерения соотношения вне- и внутриклеточной генерации радикалов. Это соотношение измерено в перитонеальных и альвеолярных макрофагах крыс, а так же в нейтрофи-

лах крови здоровых доноров, стимулированных ФМА С табл.I.D.

Табл.1. Соотношение вне- и внутриклеточной продукции АФК в различных фагоцитирующих клетках, активированных ФМА.

Г 1 Внутриклеточная ! Фагоцита ! генерация АФК в % Внеклеточная генерация АФК в У,

1 Перитонеальные | I макрофаги крыс | 28-5 72-7

! Альвеолярные | + ! макрофаги крыс | 11 - 2 89-5

¡Нейтрофилы крови I . ¡здоровых доноров 1 19-7 81-7

Сравнительный анализ чувствительности и специфичности флюоресцентных красителей: 2,7-ДХФН-ДА, ДГР-123 и ГЭ к различным формам активных метаболитов кислорода выявил накоторые несоответствия с имеющимися литературными данными. Тем не менее использование ГЭ позволяет изучать эндогенную и суммарную продукцию АФК и получить более полную информацию о месте локализации и направленности генерации АФК. Кроме того, ГЭ можно использовать для количественного определения 0g радикалов в системах, генерирующих исключительно супероксидные радикалы, или вычленять супероксид-чувствительную часть реакции, путем введения в систему супероксиддисмутазы.

Применение ГЭ для измерения внутриклеточной продукции АФК может иметь несколько прикладных аспектов. Одно из потенциальных приложений этого красителя - оценка функционирования цитоплазмати-ческих антирадикальных процессов: деструкции пероксида водорода каталазой или глутатионовой системой, а в случае с суперокисными радикалами, с помощью ГЭ определяется активность внутриклеточной СОД. ГЭ является перспективным для оценки функционирования митохондрий in situ без предварительного выделения их, а так же микро-

сомальной цитохром Р-450, содержащей монооксигеназной системы. Гаситель может оказаться полезным и для скрининга антирадикальных свойств новых лекарственных препаратов.

Часть 2. Влияние монов кальция на окислительный метаболизм фагоцитов.

Для изучения роли ионов Са+^ в процессах свободно-радикальной активации фагоцитирующих клеток были использованы ЭГТА в качестве специфического Са "^связывающего агента, не проникающего внутрь клеток, и риосидин (риодипин, производный 1,4-дитадропиридина) -блокатор кальциёвых каналов как на наружной мембранне, так и на внутриклеточных.органеллах СБелевич Г.В. с соавт. 19884, shridi f. et.al.1988); а так же кальциевый ионофор - антибиотик А 23187.

Для измерения внутриклеточной и суммарной продукции активных метаболитов кислорода использовали ГЭ. Для измерения внеклеточного образования кислородных радикалов применяли также метод люминол-и .люцигенин-зависимой хемшиоминесценции.

В качестве объекта исследования были выбраны клетки лейкомас-сы крови здоровых доноров. Анализ клеточного состава лейкомассы показал, что 40 - 6 % составляли лимфоциты, В 1 2 % - моноциты и 54-7 У. нейтрсфиш. Лимфоциты не продуцируют АФК. (Robinson j.p. et .al.- -4988), поэтому среди лейкоцитов, способных продуцировать кислородные радикалы, приблизительно 90 % составляли нейтрофилы.

• $ .Клетки активировали <ША и ФМЛП. Все препараты С А 23187, риосидин и ЭГТА ) в использованных концентрациях не влияли на жизнеспособность лейкоцитов. Они также не влияли на превращение ГЭ в зтидиум, люминесценцию зтидиума, хемшшминесценцию гаоминола и лю-цигёнина и не обладали свойствами "ловушек" радикалов в модельных

системах генерации АФК.

Было показано, что предварительное инкубирование лейкоцитов с риосидином и ЭГТА по-разному влияет на внутриклеточную продукцию АФК в клетках, стимулированных ФМА и ФМЛП.

Риосидин и ЭГТА при активации ФМА усиливали, а при активации ФМЛП ингибировали внутриклеточную продукцию А<Ж в фагоцитирующих клетках крови доноров Срис.2. и рис.3).

Внеклеточную продукцию АФК риосидин и ЭГТА ингибировали независимо от типа активатора СФМА или ФМЛШСрис.2. и рис.3). Результаты о действии риосидина и ЭТТА на экзогенную продукцию АФК, полученные с использованием ГЭ, подтверждены также методом люминол-и люцлгенин-зависимой хемилюминесценции.

Кальциевый ионофор А 23187 стимулировал внеклеточную и отменял внутриклеточную продукцию АФК в лейкоцитах. А 23187 также активировал люминольную и не влиял на люцигениновую хемилюминесцен-цию клеток.

Большинство сведений о роли ионов Са+^, как правило, подразумевают его участие только в активации НАДФН-оксидазы и в метаболизме арахидоновой кислоты. О механизме внутриклеточной генерации АФК н участии в этих процессах ионов кальция до сих пор нет однозначного мнения. Однако, литературные данные позволяют сделать предположение, что если дефицит ионов кальция С вызванный применением риосидина или ЭТТА) будет одинаково влиять как на вне- , так и на внутриклеточную продукцию АФК, то механизм генерации радикалов как внутри, так и снаружи фагоцита один и тот же Ст.е. , вероятно, связан со свободно-радикальными процессами в наружной клеточной мембране). Действительно, именно такие результаты получены при активации фагоцитирующих клеток крови ФМЛП Срис.3).

я

я я и

я и я

150-

100-

50-

Внутриклеточная продукция АФК

-50-

Внеклеточная Продукция АФК

-100

J

Рис. 2. Влияние риосидина и ЭГТА на вне- и внутриклеточную продукцию АФК в фагоцитирующих клетках крови доноров, стимулированных ФМА. По оси ординат отложены значения С(1о - 1к}/1к)х100 %, где 1о - интенсивность люминесценции этидиума в суспензии клеток, сптшулированных ФМА, после предварительной инкубации с риосидином или ЭГТА; 1к - интенсивность люминесценции этидиума в суспензии клеток, стимулированных ФМА, без предварительной инкубации с риосидином или ЭТТА.

Совершенно другая картина получена с ФМА Срис. 2.). Механизмы действия ФМА на внутриклеточные свободно-радикальные процессы слабо освещены в литературе. Нет так же определенного мнения об участии ионов Са+^ в свободно-радикальных процессах в дыхательной цепи митохондрий. Возможное взаимодействие ФМА с митохондриями и роль в этом взаимодействии ионов Са+^ требует специального исследования. К сожалению, проведенные нами эксперименты

50 -1

Внутриклеточная продукция АФК

Внеклеточная продукция АФК

-50-

•100 -1

ЭГТА

Риосидии

ЭГТА

Риосиди н

Рис. 3. Влияние риосидина и ЭГТА на вне- и внутриклеточную продукцию АФК в фагоцитирующих клетках крови доноров, стимулированных ФМЛП. По оси ординат отложены значения СС1о - 1)0/1к)х100%, где Хо — интенсивность люминесценции этидиума в суспензии клеток, стимулированных ФМЛП, после предварительной инкубации с риосидином или ЭГТА; 1к - интенсивность люминесценции этидиума в суспензии клеток, стимулированных ФМЛП, без предварительной инкубации с риосидином или ЭГТА.

не позволяют на данном этапе ответить на вопрос: на какие свободно-радикальные реакции во внутриклеточных органелах действует ФМА? Очевидно, что эти процессы не связаны с НАДФН-оксидазой или метаболизмом арахидоновой кислоты. Вопрос о механизме действия ФМА на внутриклеточную продукцию АФК в фагоцитирующих клетках требует дальнейшего изучения.

Кальциевый ионофор-антибиотик А23187 увеличивает вход ионов

Са+^ внутрь фагоцитов и стимулирует продукцию активных производных кислорода, отличных от супероксидных анион-радикалов Сыегзэтап б.

.а1. 1981). Можно было бы ожидать активирующего эффекта ионофо-ров и на внутриклеточную продукцию АФК за счет активных метаболитов арахидоновой кислоты, продуцируемых с внутренней стороны плаз-малеммы. Однако, А23187 Спо нашим данным) и иономицин Спо данным ОаЫдгеп с. 1987) полностью ингибировали внутриклеточную продукцию АФК в фагоцитирующих клетках крови, активируемых ФМА или ФМЛП. Эти результаты позволяют ожидать наличия антимутагенного эффекта у кальциевых ионофоров. Действительно, такой эффект описан Св1гпЬо1т Н.С. 1988).

Часть 3. Изучение свободно-радикального статуса лейкоцитов крови пациентов с гемоглобинопатиями.

При изучении свободно-радикального статуса лейкоцитов крови было обследованы трое пациентов с гомозиготной формой /3+-талассе-мии пятеро с промежуточной и малой формами гетерозиготной /3-талас-семии, один - носитель уникальной формы гемоглобина С"нь-А1езЬа"). Стабл.2. ) Контрольную группу составили 11 условно-здоровых детей в возрасте 7-15 лет, поступивших в Республиканскую детскую клиническую больницу г.Москвы на плановую операцию - пластика ушной раковины.

Измеряли внутриклеточную и суммарную генерацию АФК в клетках, стимулированных ФМА после предварительной инкубации с Кас.ч и без него.

Получены результаты, что суммарная и внеклеточная продукция АФК в фагоцитирующих клетках крови у пациентов с гемоглобинопатиями и у доноров достоверно не отличаются. Различия были выявлены

" Таблица 2. Характеристика больных.

Пациент Диагноз Возраст нь (г/л) Сывороточный ферритин Смкг/л)

Овс-ян Гомаз. /3+^галассемия (большая форма) 5 67 1866

Али-ва 0,5 65 140

Рах-на • • к 2 48 800

Кос-ва Гетер. /3-талассемия (промежуточная форма) 6 84 564

Ана-ва *• II 12 85 28

Тар-ов • I 1* 17 133 65

Арт-ов Гетер. /3-талассемия (малая форма) 7 111 29

Бал-ян 7 116 96

Фед-ев нь-патия 14 83 144

во внутриклеточной генерации активных метаболитов кислорода. Внутриклеточная продукция АФК была увеличена в фагоцитирующих клетках крови пациентов с гомозиготной формой /3+^галассемии и у пациента с "качественной" гемоглобинопатией ("нь-МеБЬа'О . У пациентов с гетерозиготной формой /3-талассемии увеличение внутриклеточной продукции АФК достоверно не выражено (табл.3).

Данные об усилении внутриклеточной генерации АФК в фагоцитирующих клетках крови, стимулированных ФМА, прямо корелировали с тяжестью клинической картины.

Обращает на себя внимание значительная чувствительность внутриклеточной продукции АФК к цианиду С табл. 3.5.

Большинство авторов, традиционно, связывают развитие гемоли-

Таблица 3. Внутриклеточная продукция активных метаболитов кислорода в фагоцитирующих клетках крови пациентов с гемоглобинопатиями и здоровых доноров.

(Пациент Диагноз Интенсивность с внутри фагоците без NaCN шуор. этидиума эв Сотн. ед.) С NaCN

¡Овс-ян Гомоз. (3+-талассемия Сбольшая форма) 75 9

!Али-ва _ I» _ I» 91 59

¡Рах-на и _ м 50 34

¡Кос-ва Гетер. 13-тапассежя Спромежуточная форма) 51 42

¡Ана-ва _ и _ и __ 37 13

!Тар-ва _ к _ ■• _ 67 51

IАрт-ов Гетер. /3-талассемия Смалая форма) 16 4

!Бал-ян _ • • __ • ■ _ 4 3

¡Фед-ев !Доноры нь-патия 121 90

Здоровые 17 - 42 2-22

тических кризов Схарактерных для выраженных форм гемоглобинопатию с избыточной продукцией радикалов кислорода в эритроцитах (Grinberg L.N. et.al. 1992, Shinar E. et.al. 1990). Однако, радикалы, продуцируемые фагоцитирующими клетками крови, возможно, также принимают участие в патогенезе гемоглобинопатий См. de Martino et.al. 1984&) Авторы также прослеживают корреляцию между интенсивностью продукции радикалов кислорода и концентрацией железа в сыворотке крови пациентов. Полагают, что именно перегрузка организма железом ведет к свободно-радикальному разложению пероксида водорода в реакции Фентона. Образующиеся при этом гидро-

ксильные радикалы обладают очень высокой химической агрессивностью и могут повреждать клеточные структуры.

Полученные результаты дают основание предположить, что кроме традиционно используемых в лечении гемоглобинопатий хелаторов ионов железа, вероятно, необходимо использовать и вещества -"ловушки" радикалов кислорода, которые могли бы уменьшить свободно-радикальное повреждение клеток.

Выводы.

1. Сравнение флюорохромов 2,7-дихлорфлюоресин диацетата, дигидро-родамина 123 и гидраэтидина показало, что наиболее чувствительным и специфичным к активным метаболитам кислорода является гидроэтидин.

2. Гидроэтидин взаимодействует с супероксидными радикалами, образующимися в ксантин-ксантиоксидазной реакции, в молярном соотношении 1:1.

3. При стимулировании фагоцитирующих клеток С перитонеальных и альвеолярных макрофагов крыс и нейтрофилов крови человека ) форболмиристатацетатом большая часть активных метаболитов кислорода С более 70 % ) продуцируется внеклеточно, а остальная часть С менее 30 '/. } - внутриклеточно.

A. Предварительное инкубирование с риосидином и ЭГТА значительно усиливает внутриклеточную продукцию активных метаболитов кислорода в фагоцитирующих клетках крови здоровых доноров, стимулированных форболмиристатацетатом, и ингибирует ее в клетках, стимулированных формил-метионил-лейцил-фенилаланином .

5. Ионофор А 23187 ингибирует внутриклеточную продукцию активных метаболитов кислорода в фагоцитирующих клетках крови здоровых доноров.

B. В фагоцитирующих клетках крови пациентов с гомозиготной формой /3+-талассемии и у пациента - носителя уникальной формы гемоглобина С"НЬ-А1езЬа'0 увеличена внутриклеточная продукция активных метаболитов кислорода при активации лейкоцитов форболмиристатацетатом.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Бизюкин А. В. , Коркина Л.Г. Использование флюоресцентного индикатора гидрозтидина для изучения окислительного метаболизма фагоцитов/ЛОшническая и лабораторная диагностика-1993. -N.S.

С принята в печать ).

2. Бизюкин A.B. , Коркина Л.Г. Соотношение между вне- и внутриклеточной генерацией активных форм кислорода альвеолярными макрофагами крыс//Материалы 2-го Всесоюзного конгресса по органам дыхания 1991г. -С. 64. Сг. Челябинск).

3. Коркина Л. Г. , Бизюкин А. В. , Сметанина Н. С. Новый метод изучения свободно-радикального статуса фагоцитирующих клеток крови у пациентов с гемоглобинопатиями//Гематология и трансфузиология-1994.-N. 2- С принята в печать).

4. Коркина Л.Г. , Ибрагимова Г. А. , Бизюкинн A.B. , Симчук С.Г. , Лурье Б.Л. Исследование экспериментального фиброза легких, индуцированного блеомицином//Материалы 2-ого Всесоюзного конгресса по органам дыхания 1991г. -С.178(г. Челябинск).

5. Bizyukin A.V. and Korkina L.G. Effects of calcium ions on oxygen radical generation inside and outside of macrophages// Free Radicals in biology and Medicine.-1993.-V.10(7).-(принята В печать).