Метаболиты оксида азота и их модуляция при развитии гепатомы Зайделя

Наумов, Андрей Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Метаболиты оксида азота и их модуляция при развитии гепатомы Зайделя
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Метаболиты оксида азота и их модуляция при развитии гепатомы Зайделя"

Наумов Андрей Анатольевич

МЕТАБОЛИТЫ ОКСИДА АЗОТА И ИХ МОДУЛЯЦИЯ ПРИ РАЗВИТИИ ГЕПАТОМЫ ЗАЙДЕЛЯ

03.01.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О НОЯ 2011

Пушино - 2011

4859088

Работа выполнена в секторе функциональной биохимии Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН и в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Путинский государственный естественнонаучный институт».

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Поцелуева Маргарита Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Маевский Евгений Ильин

доктор биологических наук, профессор Новоселова Елена Григорьевна

Ведущая организация:

Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «/¿_» ноября 2011 г. в 15 часов 30 минут на заседании совета Д002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН но адресу: 142290, г.Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан « <У» Зй^я'^сХ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.ф.-м.н.

Ланииа Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность- темы.

Факт образования в организме опухоли означает неэффективность работы специфических механизмов отслеживания и уничтожения трансформированных клеток. Следовательно, возрастает роль неспецифических механизмов защиты организма [Ackermann et al., 1989; Kessel К.P.M.van, Verhoef J. 1990], которая до конца неясна. Рост опухоли сопровождается распространением сигналов, которые активируют компоненты врожденного иммунитета, клеточной составляющей которого, помимо натуральных киллерных клеток, являются полиморфноядерные лейкоциты (в основном, это нейтрофилы и моноциты), а также тканевые макрофаги. Активация данного типа клеток, относящихся к фагоцитам, сопровождается продукцией активных форм кислорода (АФК) и активных форм азота (АФА). При действии иммунных комплексов, активаторов рецепторов, микрочастиц на плазматической мембране фагоцитов происходит сборка и активация НАДФН-оксидазы, работа которой превращает От в супероксид анион (02"~). Дальнейшие превращения (СЬ"-) образуют ряд АФК, таких как гидроксил радикал, перекись водорода и т.д. Индукция другой ферментной системы фагоцитов - ¡NO-синтазы приводит к продукции оксида азота (N0), который является важным регуляторным фактором во многих системах организма, а также обеспечивает цитотокси-ческую активность данного типа клеток [Lepoivre et al.,1991]. Бактерицидное и цитотоксическое действие NO и АФК во многом зависит от продуктов их взаимодействия [Paulluy О, 1996]. Возникающие в таких реакциях активные метаболиты - пероксинитрит, диоксид азота, и др. обладают высокой реакционной способностью и могут повреждать различные клеточные структуры, изменяя их функциональную активность. Так процесс нитрозилирования белков под действием активных форм азота является одним из механизмов регуляции активности некоторых ферментных систем [Kozlov, А.V., Staniek, К., and Nohl, Н.(1999) FEBS Lett., 454, 127-130]. Следует отметить, что некоторые метаболиты N0, такие как S-нитрозотиолы и сам N0, при определённых условиях могут проявлять антиоксидантную активность [Hogg, N., 1993]. Например, оксид азота может связываться с ионами железа, которые катализируют реакции свободно-радикального окисления. Связывание железа вызывает тем самым ингибирование процесса разветвления свободно-радикальной цепи.

Таким образом, для понимания роли реакций неспецифического иммунитета при росте в организме злокачественных опухолей, актуальным является исследование состояния АФК - и NO-генерирующих систем, а также процесса их взаимовлияния в ходе роста опухоли. Активность этих систем определяет баланс антиоксидантных и прооксидантных реакций, как в зоне патологии, так и в кровеносном русле. В частности, это исследование динамики основных внеклеточных метаболитов оксида азота, таких как нитраты/нитриты, пероксинитрит (продукт взаимодействия оксида азота и супероксид аниона) и нитрозотиолы в организме опухоленосителя. Изменение количественного и качественного состава продуцируемых организмом АФК и активных форм азота (АФА) могут выразиться в качественных изменениях поведения системы в целом. При этом с ростом концентрации этих метаболитов растет число потенциальных мишеней - от передачи сигналов до регуляции активности отдельных систем и цитотоксического эффекта.

В настоящее время одновременного исследования уровня метаболитов оксида азота и АФК в двух компартментах опухоленосителя - в плазме крови и в зоне роста опухоли не проводилось. Не выявлены временные параметры образования метаболитов N0 с разными функциональными свойствами. Недостаточно исследовано влияние соотношения между активными формами кислорода и азота на интенсивность опухолевого роста. В связи с этим является актуальным детальное исследование основных метаболитов оксида азота в плазме и асцитной жидкости опухоленосителя, исследование влияния экзо- и эндогенного оксида азота на АФК-генерирующую активность фагоцитирующих клеток (нейтрофилов и макрофагов) и использование модуляторов уровня оксида азота и АФК с целью снижения интенсивности опухолевого роста в организме опухоленосите-

ля.

Цель работы

Исследование временных и количественных характеристик метаболитов оксида азота в крови и асците опухоленосителя, а также возможности их коррекции с целью подавления опухолевого роста.

Задачи исследования

1. Изучить динамику следующих внеклеточных метаболитов оксида азота в крови и асцитной жидкости при развитии гепатомы Зайделя:

а) нитратов/нитритов как конечных продуктов метаболизма короткоживущего соединения

N0;

б) нитротирозина — продукта NO-зависимого окисления тирозина в присутствии 02-;

в) нитрозилированных SH- групп белков как важнейшего маркера нитрозилирующего

стресса;

2. Исследовать роль оксида азота в регулировании АФК-генерирующей активности фагоцитирующих клеток крови и асцита в процессе роста опухоли;

3. В опытах ¡n vivo изучить действие NO- и АФК-модулирующих веществ на развитие нитрозилирующего и окислительного стресса и рост опухоли в организме.

Научная новизна.

В рамках диссертации впервые проведено одновременное исследование динамических параметров крови и асцита, характеризующих поведение неспецифического иммунитета в ответ на развитие асцитной гепатомы Зайделя. Впервые наряду с окислительным стрессом в плазме опухоленосителя показано развитие «нитрозилирующего стресса». Показано, что максимальная концентрация различных метаболитов оксида азота (пероксинитрит, NO-модифицированные белки и нитриты/нитраты) связана с различными фазами роста опухоли и имеет разную кинетику Впервые исследовано влияние эндо и экзогенного донора оксид азота, а также ингибитора NO-синтазы на АФК-генерирующую активность перитониальных макрофагов и лейкоцитов крови в процессе развития опухоли. Впервые проведены исследования по модификации уровня нитрозилирующего стресса в организме опухоленосителя с помощью инъекций доноров N0, ингибитора NO-синтазы и флавоноидов с целью подавления роста опухоли в организме животного.

Практическая ценность.

Представленные в диссертации экспериментальные данные способствуют выявлению закономерностей формирования неспецифического иммунного ответа организма на образование злокачественных опухолей с целью поиска способов управления ими. Показана значительная роль оксида азота и его метаболитов в патогенезе асцитной опухоли, что говорит о необходимости контроля параметров нитрозилирующего стресса при лечении злокачественных процессов с целью улучшения качества терапевтического воздействия. Результаты могут быть использованы для разработки протоколов терапии патологических процессов, связанных с развитием окислительного и нитрозилирующих стрессов с использованием флавоноидов и регуляторов продукции N0.

Апробация работы.

Результаты работы в качестве докладов были представлены на международных конференциях: «Биология-наука XXI века» 2006, 2007, 20011гг. «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» 2009, «Рецепция и Внутриклеточная сигнализация», 2011.

Публикации.

Работа и опубликованные по ней материалы: 6 статей в рецензируемых журналах^ 3 статьи в трудах конференций и 17 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит рисунков и / таблиц. Диссертация изложена на /-^страницах.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования.

Глюкоза, люминол, N-1-нафтилэтилендиамин дигидрохлорид, Н3РО4, сульфаниламид (ДиаэМ, Россия), СаС12 , гепарин (Спофа, Прага), NaCl (Реахим, Россия), краска Романовского (Россия), PERCOL (плотность 1,129 г/мл) (Pharmacia, Швеция),, L-аргинин (Reanal, Венгрия), N-нитро-Ь-аргннин (Fluka, Швейцария), среда RPMI, (ПанЭко, Россия), Cd, HgCl2, ФМА (форбол-12-миристат-13-ацетат), HEPES, дитио-бис-нитробензойная к-та, нитропрусид натрия (SNP) (Sigma, США), глугатион (Sigma, США), набор для иммуноферментного анализа нитротарозина «НВТ» (Нидерланды), дигидрокверцитин (Флавит, Россия), L-глютамин (Sigma, USA), HEPES(Serva, Germany), гентамицин (Россия), 3TC(Brazil).

Объект исследования. Поскольку такие объекты, как асцитные опухоли, особенно удобны в качестве модели для исследования взаимодействия клеток неспецифического иммунитета с развивающейся опухолью, в качестве объекта была использована перевиваемая асцитная гепатома Зайделя (АГЗ). Именно этот вид опухоли наряду с карциномой Эрлиха рекомендован Министерством здравоохранения РФ и фармакологическим государственным комитетом к изучение противоопухолевого действия фармакологических [Руководство по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ, 2001].

Животные. В экспериментах использовали крыс-самцов породы Вистар весом 200 - 220г

Крыс содержали в условиях вивария на стандартном рационе при свободном доступе к воде и пище, при температуре 16-20° С в режиме естественной освещенности.

Формирование экспериментальной опухоли. Для формирования опухоли использовали клетки асцитной гепатомы Зайделя, хранившиеся в криобанке. Подготовка клеток к перевивке осуществлялась следующим образом: после размораживания, трехкратного отмывания от крио-протекгоров и ресуспензирования в солевом буфере, клетки были трансплантированы в брюшную полость животного в объеме 1 мл. Через 10 дней трансплантацию опухолевых клеток проводили с помощью инъекции суспензии клеток гепатомы с концентрацией ~107 кл/мл в брюшную полость животного. Среднее время жизни особей с трансплантированной опухолью составляло 9-11 дней.

Выделение перитоиеальиых макрофагов из полости здоровых животных. Выделение перитонеальных макрофагов осуществляли из декапитированного животного, помещенного на препаровальный столик. Брюшную зону обрабатывали раствором этилового спирта, делали надрез вдоль лапок и внутрибрюшинно вводили стерильный физраствор из расчета 1 мл на 10 г. веса животного. В течение 5-8 минут проводили массирование брюшной полости. Далее экссудат собирали пастеровскими пипетками и помещали в стерильные, охлажденные до 4° С пробирки, которые центрифугировали при 400g в течение 10 мин. Полученный осадок клеток дважды промывали физиологическим раствором. Выделенные клетки ресуспендировали в полной среде КРМ1-1640. содержащей 2 мМ Ь-глютамина, 5% ЭТС, гентамицина и хранили при 4° С до начала эксперимента.

Выделение макрофагов из асцитной жидкости опухолеиоситела Асцитную жидкость для выделения макрофагов собирали из брюшной полости декапитированного животного, переносили в центрифужные стерильные пробирки и центрифугировали при 400g в течение 10 мин. Полученный осадок клеток дважды промывали солевым раствором. Затем клетки наслаивали на градиент Регсо11-№С1 с плотностями 1,04, 1,056, 1,078 и 1,116 и центрифугировали в течение 45 мин при 1600§. Макрофаги распределялись на границе плотностей 1,056 - 1,078 в виде тонкого кольца. Клетки отбирали шприцем и трижды отмывали солевым раствором. Осадок клеток ресуспендировали в полной среде ЯРМ1-1640 и хранили при 4° С до начала эксперимента.

Выделение ПМЯЛ из циркулирующей крови. Кровь, полученную при декапитации животных, собирали в пробирку, содержащую 100 мкл раствора гепарина с 5000 ме/мл. Фракцию лейкоцитов получали путем осаждения клеток методом дифференциального центрифугирования в течение 10 мин при 400£ после лизиса эритроцитов. Лизис эритроцитов вызывали добавлением раствора хлористого аммония (0,87%). Затем клетки наслаивались на градиент плотности РегсоП-№С1 и после центрифугирования в течение 45 мин при 1600ё в зоне плотности 1,112 была отобрана фракция ПМЯЛ. Осадок, содержащий лейкоциты, промывали солевым раствором и повторно центрифугировали в течение 10 минут при 400g. Фракцию лейкоцитов, ресуспендировали в полной среде ЯРМ1-1640, содержащей эмбриональную сыворотку, Ь-глютамин, антибиотик и хранили при температуре 4° С до начала эксперимента.

Подсчёт клеток. Выделенные клетки подсчитывали в камере Горяева. Для определения их жизнеспособности использовали 0,1% спиртовой раствор витального красителя трипанового синего в соотношении 1:20. Процент живых клеток составлял 90-95%. Примесь эритроцитов составля-

ла не более 5%.

Анализ клеточных популяций. Состав клеточных популяций в крови определяли по мазкам, окрашенным Азур П-Эозином по методу Романовского [Меньшиков, 1987] и на гематологическом анализаторе крови [Coulter А Т8, Вескшап]. Состав клеточной популяции в асцитной жидкости определяли по мазкам (окраска по Паппенгейму).

Определение продукции активных форм кислорода фагоцитирующими клетками. Продукцию активных форм кислорода оценивали по уровню активированной хемилюминесцен-ции (ХЛ) фагоцитирующих клеток в присутствии люминола (в качестве люминесцентного зонда). Метод основан на окислении люминола или его производных активными формами кислорода. В результате реакции образуется нестабильная возбужденная форма люминола, время жизни которой мало. Переход возбужденной формы люминола в невозбужденную молекулу аминофталевой кислоты сопряжен с испусканием квантов света в области 420 нм. Интенсивность люминолзави-симой ХЛ регистрировали с помощью люминометра «Биотокс-7а». В термостатированную (37°С) ячейку хемилюминометра помещали 500 мкл солевой среды RPMI с рН 7.6, люминол (0,1 тМ), исследуемое вещество, суспензию клеток (МО6 кл/мл). Клетки инкубировали в течение 10 минут, затем добавляли стимул - РМА (2,8-10д тМ). ХЛ-ответ клеток регистрировали в течение 10 минут.

Приготовление плазмы крови. В качестве антикоагулянта при выделении плазмы использовали гепарин из расчета 100 мкл раствора гепарина с 5000 ме/мл на 5-7 мл крови. Гепаринизиро-ванную кровь центрифугировали в течение 10 мин при 400g. После центрифугирования плазму осторожно собирали пипеткой или шприцом и переносили в стерильные пластиковые пробирки. До проведения измерений образцы плазмы хранили при температуре -27°С.

Приготовление бесклеточной асцитной жидкости. Отобранную асцитную жидкость центрифугировали в течение 10 мин при 400 g. После центрифугирования жидкость осторожно переносили в пластиковые пробирки. До проведения измерений образцы асцитной жидкости хранили при температуре -27°С.

Измерение концентрации нитритов/нитратов в асцитной жидкости и плазме крови. Концентрацию NO измеряли по концентрации нитритов, являющихся конечным продуктом метаболизма короткоживущего соединения NO [Ding et al., 1988; Green et al., 1982]. Так как в физиологических условиях часть нитритов окисляется до нитратов, перед измерением необходимо было перевести образовавшийся нитрат в нитрит. Для этого предварительно замороженные образцы размораживали, содержащиеся в асцитной жидкости белки осаждали раствором сульфата цинка и депротонизировали 1М раствором гидроксида натрия. Затем образовавшийся осадок, содержащий белки и гидроксид цинка, удаляли центрифугированием. К супернатанту добавляли небольшое количество стружек кадмия и помещали на мешалку на 3 часа для проведения реакции восстановления нитратов, затем кадмий удаляли центрифугированием. Количество нитритов в супернатан-тах измеряли с использованием реактива Грисса, содержащего смесь 0,1%-ного раствора N-1-нафтилэтилендиамин дигидрохлорида в 2,5% фосфорной кислоте (Н3РО4) и 1%-ного раствора сульфаниламида в 2,5%-ной фосфорной кислоте, в соотношении 1:1. К 150 мкл супернатанта, перенесенного в лунку в 96-луночныйого плоскодонный ого планшета, добавляли 100 мкл свеже-

приготовленного реактива Грисса и следили за развитием цветной реакции в течение 40 мин при комнатной температуре. Затем измеряли оптическую плотность при длине волны - 546 нм на спектрофотометре (каком). Калибровочная кривая была построена с использованием стандартных растворов нитрита натрия NaN02.

Измерение концентрации S-нитрозотиолов в асциткой жидкости и плазме крови. Метод основан на спектрофотометрическом измерении нитрита, образующегося при добавлении Hg2+' который, действуя как специфический разрушитель S-N связи, катализирует высвобождение из S-нитрозилированных тиолов оксида азота. Последний, окисляясь до N02~, определяется с помощью реактива Грисса при 540 нм. К 0,25 мл опытного исследуемого образца добавляли 0,25 мл 0,2% HgCl2 в 1% растворе сульфаниламида. К 150 мкл исследуемого образца, перенесенного в 96-луночный плоскодонный планшет, добавляли 50 мкл свежеприготовленного 0,2% HgC12 в 1% растворе сульфаниламида и 50 мкл 0,2% раствора N-1-нафтилэтилендиамина. В течение 40 мин следили за развитием цветной реакции при комнатной температуре. Для исследуемого образца также определяли концентрацию нитритов (150 мкл исследуемого образца, 50 мкл 1% раствора сульфаниламида и 50 мкл 0,2% раствора N-1-нафтил-этилендиамина). Затем измеряли оптическую плотность обоих образцов при длине волны - 546 нм. Калибровочная кривая была построена с использованием стандартных растворов нитрита натрия. Концентрацию нитрозотиолов определяли как разность концентраций нитритов в образцах, обработанных и необработанных HgCb

Измерение концентрации нитротирозина в асцитной жидкости и плазме крови. Концентрацию нитротирозина определяли иммуноферментным методом с помощью набора фирмы «НВТ» (Нидерланды).

Измерение концентрации тиоловых групп белков. К плазме крови или асцитной жидкости добавляли раствор ДТНБ (0.025 г/л), 30 минут инкубировали в темноте при комнатной температуре, Затем измеряли оптическую плотность проб при X 412 нм. Расчёт концентрации тиоловых групп производили с учётом коэффициента молярной экстинкции (13*103 М"'см"') .

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программ MS «Excel» и «Origin 8.0». Из совокупности данных рассчитывали среднее квадратичное отклонение (а). Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента для малых выборок (п<30). На графиках представлены средние значения не менее, чем для 5 экспериментов. Корреляционный анализ проводили по методу Спирмана.

Результаты и обсуждение.

В качестве модельного объекта исследования была выбрана гепатома Зайделя, клетки которой трансплантировались в брюшную полость крыс породы Вистар. Развивающаяся после трансплантации асцитная гепатома Зайделя представляет собой жидкую среду в брюшной полости, содержащую размножающиеся опухолевые клетки и клетки иммунной системы. Эта зона патологии носит название асцитной жидкости или асцита. Рост опухоли сопровождается выработкой сигнальных молекул, которые активируют и регулируют компоненты врождённого иммунитета [Chen et al, 2003, Motta et al, 2003, Chang et al, 2004]. Предшествующие исследования в нашей лаборатории показали, что в процессе роста опухоли происходит активация фагоцитов, которая приводит к развитию окислительного стресса в плазме крови и истощению защитных систем организ-

ма [Поцелусва М.М. и др.1999; Пустовидко и др. 2005;Шаталин и др, 2010]. Одними из ключевых компонентов в опухолевом патогенезе являются АФК и АФА. Оксид азота (N0) - это многоцелевая регуляторная молекула, задействованная во многих системах организма, эффекты которой могут быть различны в зоне развития опухоли и в кровеносном русле.

Динамика изменения концентрации опухолевых клеток в асците (рис. 1) имеет обычный вид кривой с насыщением и максимальной скоростью роста в интервале 1-5 сут. Рост числа опухолевых клеток сопровождается увеличением объема асцитной жидкости, который может достигать 60-70 мл для 200г животного (рис.1). Продолжительность жизни подопытных животных в среднем составляла 9-11 суток. При этом масса опухоленосителя значительно не изменяется.

Рис.1 Изменение объема асцитной жидкости и концентрации опухолевых клеток в процессе развития опухоли, кривая I - концентрация опухолевых клеток;

кривая 2 — объем асцитной жидкости.

В процессе развития опухоли из крови вместе с током жидкости в асцит переносится молекулы белка. Потери белков компенсируются их синтезом за счет ресурсов организма. Считается, что поступление жидкости и веществ в асцит связано с увеличение проницаемости капилляров за счет высвобождения гистамина тучными клетками и увеличения синтеза оксида азота эндотелием и макрофагами. Это создаёт условия для облегчённого транспорта крупных молекул и белков, а также миграции клеток иммунной системы [Коряков, 1990]. Ранее на этой модели опухолевого роста нами уже было показано увеличение продукции гистамина тучными клетками. В настоящий момент при анализе результатов по метаболитам оксида азота необходимо учитывать вклад транспортных процессов в состояние системы «кровь-асцит». Динамика различных метаболитов оксида азота при развитии асцитной гепатомы Зайделя.

Развитие опухоли вызывает в системе естественной резистентности или врожденного иммунитета ответные процессы, направленные на уничтожение опухолевых клеток [Kessel К..Р.М. van, Verhoef J.A, Ackermann et. Al., 1989; Kok et. AI. 1990]. В цитотоксическую активность помимо натуральных киллерных клеток вовлекаются фагоцитирующие клетки, к которым, в основном, относятся полиморфноядерные лейкоциты (ПМЯЛ) и макрофаги. Арсенал защитных средств, используемых иммунитетом, включает АФК, АФА и различные протеолитические ферменты. Оксид азота и его метаболиты наряду с АФК является сильным цитотоксическим «оружием» иммунной системы. Оксид азота также активирует Т-лимфоциты [Mills 1991], регулирует синтез интерлей-

кинов, адгезию нейтрофилов и тромбоцитов к эндотелию, способствует увеличению проницаемости сосудов [Манухина Е. Б., 2000, Furlong В., 1987, Lefer А. М. 1991, Sneddon J. М. 1988], способен индуцировать апоптоз [Брюне Б., 1998].Таким образом, отслеживание динамики оксида азота и его превращения в организме являются важным диагностическим фактором. В данной части рабо-NOS NADPH- ты были исследованы изменения уровня ос-

новных метаболитов N0 в плазме крови и RSNP"-»' N0+02"-_к- ONOO* Tyr-N02 асцитной жидкости в процессе роста транс-

плантированной опухоли (рис. 2): перокси-• NO "/NO ' (NO) нитрита - ONOO" (маркером является

- нитротирозин - Tyr-N02), S-нирозотиолов

Рис 2. Основные внеклеточные метаболиты r , 3

оксида азота. (R-SNO) и нитритов/нитратов NO /NO -

(NOx).

Динамика NOx в плазме крови и асцитной жидкости при развитии асцитной опухоли.

В настоящее время общепринятым биохимическим подходом для оценки уровня синтеза оксида азота считается определение концентрации конечных стабильных продуктов распада оксида азота, к которым относятся нитрит анионы (NO*~) и нитрат анионы (NO3"). В совокупности они обозначаются как МОх.

На рис. 3 представлены изменения концентрации NOx в плазме и асцитной жидкости в ходе развития опухоли. Установлено, что при развитии опухоли у животных концентрация N0» в плазме незначительно колеблется в некотором диапазоне и возрастает на заключительном этапе эксперимента.

I/ I

Рис. 3 Изменение концентрации А'Ох в ходе развития опухоли в организме, кривая 1-е плазме крови; кривая 2-е асцитной жидкости. О сутки - здоровое животное

В асцитной жидкости наблюдается более высокий фоновый уровень К'Ох. Этот факт может быть обусловлен работой иммунной системы, в частности, макрофагов, отсутствием гемоглобина, который может связывать нитриты, а также сниженной скоростью утилизации веществ из асцита.

Динамика нитротирозина в плазме крови и асцитной жидкости при развитии опухоли

Нитротирозин образуется в присутствии активных метаболитов N0, таких как пероксинит-рит. В связи с высокой реакционной способностью и малым временем жизни о пероксинитрите судят по его маркеру - нитротирозину. Пероксинитрит образуется в организме при взаимодей-

ствии оксида азота с активными формами кислорода, в частности, супероксид анионом. Благодаря своей высокой реакционной активности, пероксинитрит способен повреждать множество биологических молекул, оказывая сильнейшее цитотоксическое действие. Поэтому в условиях окислительного стресса in vivo важна оценка концентрации нитротирозина как маркера NO-зависимых повреждений.

На рис. 4 представлена динамика уровня нитротирозина в плазме крови (кривая 1) и асцит-ной жидкости (кривая 2) в ходе развития опухоли. Было обнаружено, что при развитии гепатомы Зайделя наблюдается резкое увеличение концентрации нитротирозина (до 10-11 нМ) в плазме крови на 1-2 сутки после трансплантации опухоли, после чего наблюдается ее снижение до уровня ~ 3-6 нМ.

Рис. 4 Изменение концентрации нитротирозина (Туг-Ы02) в ходе развития опухоли в организме, кривая 1-е плазме крови; кривая 2 - в асцитной жидкости. 0 сутки — здоровое животное

того объёма асцитной жидкости неосновании того, что белки в асцитную жидкость поступают из плазмы крови, можно предположить, что концентрация нитротирозина в асците в начальный период также стремительно возрастает. Затем, начиная с 3 суток после трансплантации, концентрация нитротирозина в асците постепенно снижается.

Динамика К-ЯЬ'О в плазме крови и асцитной жидкости при развитии опухоли.

Одним из важнейших производных оксида азота в организме являются Э-нитрозотиолы (Я-5КО). В образовании нитрозильных комплексов участвуют тиоловые группы белков и низкомолекулярные тиолы (цистеин и глутатион). Нитрозилированные тиолы являются достаточно стабильными, но при этом под действием ряда факторов способны высвобождать N0* и тем самым обеспечивать эффекты оксида азота на некотором расстоянии от места его синтеза. Денитрозилирова-ние происходит под действием восстановителей, ионов металлов с переменной валентностью, рН, сдвига р02. [51аш1ег, 1994, Андреева Н.А.,. 2000., У О., 5Ыгакат12000., БПкоП'Р.Е.,. 1998]. Обратимость процесса нитрозилирования позволяет регулировать функции белков по механизму включения/выключения.

На рис. 5. представлена динамика белковых Я-5МО в плазме (кривая 1) и асцитной жидкости (кривая 2) при развитии гепатомы Зайделя. Установлено, что в плазме крови наблюдается рост концентрации в-нитрозотиолов вплоть до 6х суток эксперимента. Затем их концентрация моно

Z 6

Время, сут

В начальный период развития опухоли из-за м возможно оценить динамику метаболитов N0. Однако на

тонно снижается. В асдитной жидкости средняя концентрация нитрозотиолов при развитии опухоли снижена по сравнению с плазмой.

Рис. 5. Изменение концентрации Я- Л'Л'О в ходе развития опухоли в организме опухоленосителя. кривая 1-е плазме крови; кривая 2-е асцитной жидкости. О сутки - здоровое животное

Врв«и, еут.

Анализ динамических характеристик показал высокую корреляцию по Спирману (п= 7; 1^=0,85714; р<0,05) между динамиками КЭ-ЫО в плазме и асцитной жидкости. Данная корреляция может говорить о том, что в процессе роста опухоли нитрозилированые белки поступают из плазмы в асцит.

Известно, что в процессе роста опухоли среда асцитной жидкости приобретает восстановительные свойства [Шаталин и др. 2010], что характеризуется 5-6-кратным ростом содержания белковых БН-групп. Данные условия способствуют отщеплению оксида азота, приводя к увеличению концентрации *Юх в асцитной жидкости, что зарегистрировано на рис.3, кривая 2. Можно сказать, что в результате данных процессов имеет место перенос активных форм азота в асцитную жидкость из кровеносного русла. Высвобождающийся в асцитную жидкость оксид азота способен вызывать как цитотоксические, так и регуляторные эффекты.

Ранее было показано [Пустовидко и др. 1999г; Шаталин и др. 2010] что, при развитии опухоли в крови развивается окислительный стресс. Он вызывает истощение антиоксидантных си-

1*-50,Н ....................~> Я-Б03Н

Рис. 6. Динамика белковых Б!¡-групп и №-N0 в Рис. 7. Модификация 5Н-грут белков в плазме опухоленосителя присутствии АФК и N0

стем и, в частности, снижение концентрации БН-групп белков за счёт их окисления. Анализируя изменение концентраций ЯЭ-ЫО и уровень БН-групп в плазме крови (рис. 6) можно отметить, что в течение первых 5-6 суток эксперимента концентрация БН-групп в плазме практически линейно снижается, а уровень ИЗ-КО - растёт. Причем скорость накопления ЯБ-ЫО составляет -2,5 цМ/суг, а снижения БН - ~ 3,2 цМ/сут, что говорит о высокой доли участия N0 в модификации белков. В результате необратимой окислительной модификации белков (рис. 7) происходит и уменьшение доли нитрозотиолов в плазме на заключительных этапах развития опухоли (после 6-х суток в нашем эксперименте).

Анализируя изменения основных метаболитов оксида азота в плазме и асцитной жидкости опухоленосителя можно заключить, что в плазме крови развивается нитрозилирующий стресс. Причём его проявления в ходе роста опухоли различны. Так на начальных этапах опухоли в плазме наблюдается максимальная концентрация цитотоксического агента пероксинитрита. В середине роста опухоли происходит значительное накопление продуктов модификации белков (Б-нитрозилированные белки). На заключительном этапе роста опухоли отмечено преобладание процесса окисления АФК над нитрозилированием, что является причиной всплеска концентрации КОх. Данные процессы, по-видимому, связаны не только с активацией неспецифического иммунитета, но и с возможным усилением продукции оксида азота эндотелиальными клетками.

В асцитной жидкости нитрозилирующий стресс выражен слабее в виду восстановительных условий. Они складываются из-за сниженного уровня окислительного стресса, ацидоза и развивающейся гипоксии. Всё это говорит о значительной роли N0 в патогенезе опухоли.

Необходимо учитывать, что оксид азота является и регуляторной молекулой. В связи с этим встаёт вопрос о действии N0 на активность фагоцитирующих клеток.

Роль N0 в регуляции АФК-генерирующей активности ПМЯЛ и перитонеальных макрофагов при развитии асцитной опухоли.

Ранее показано [Поцелуева и др,1999; Шаталин и др. 2010], что потенциальная АФК-генерирующая активность ПМЯЛ, локализованных в крови, в ходе роста опухоли увеличивалась в 2,5 - 3 раза. Напротив, в зоне роста опухоли обнаружено постепенное снижение потенциальной АФК-генерирующей активности мононуклеаров.

Исследуя влияние на организм развивающейся опухоли, нами установлено усиление синтеза оксида азота и перераспределение его метаболитов в системе «кровь-асцит». N0 вступает в реакции 5-нитрозилирования с глутатионом, а также с БН-содержащими белками с образованием Б-нитрозотиолов [81а1шег е1 а11., 1997]. Огромное значение имеет 8-нитрозилирование в регулировании активности некоторых ферментов, в частности, НАДФН-оксидазы [81аугоз Бе 1ет¡сЗ¡э, й а11.„ 2007]. Было высказано предположение, что именно этот процесс, возможно, и несёт ответственность за снижение продукции АФК макрофагами асцитной жидкости. С целью изучения роли оксида азота в регулировании активности НАДФН-оксидазы при росте опухоли необходимо было исследовать действие эндо- и экзогенных модуляторов активности МО-синтазы на АФК-генерирующую активность фагоцитирующих клеток. В начале было изучено действие различных

концентраций донора оксида азота нитропрусида натрия (БЫР) на активированную хемилюминес-ценцию фагоцитов здорового животного.

Рис 8. Влияние различных концентраций 5№ на интенсивность ХЛ-ответа фагоцитов здорового животного. Клетки инкубировали с ЖР в течение 10 минут. На графике представлена све-тосумма ХЛ за 10 мин. после добавления ФМА

[ЭМР], цМ

На рис 8. представлено влияние различных концентраций 5МР на интегральную интенсивность ХЛ-ответа фагоцитов за 10 мин. Показано, что увеличение концентрации 8№ угнетает ХЛ как перитонеальных макрофагов, так и ПМЯЛ. Причем ингибирование ХЛ ПМЯЛ является менее выраженным по сравнению с ингибированием ХЛ макрофагов. Так при концентрации 8-105 моль снижает 27 ПМЯЛ на 27-30%, а макрофагов - на 36-39%.

Для оценки вклада ЫО-синтазы в изменение АФК-генерирующей активности фагоцитов в ходе роста опухоли мы инкубировали фагоциты, выделенные в разные периоды развития опухоли, с донором N0, с субстратом Ш-синтазы (аргинином), а также с ингибитором ИО-синтазы (нитро-агинином) и регистрировали интенсивность ХЛ в ответ на стимул.

Установлено, что БЫР снижает продукцию АФК ПМЯЛ в среднем на 27 % (рис. 9) и макрофагов на 30 % (рис. 10). При этом динамика АФК-генерирующей активности в ходе роста опухоли консервативна, т.е. чувствительность фагоцитов к донору N0 в ходе роста опухоли не пре-

I 5

L 1 U

ггригИ

1 сути « cv™ > с*™"

Рис. 9. Действие SNP, Arg и L-NAME на интенсивность ХЛ-ответа ПМЯЛ, выделенных на I, 4 и 8 сутки из крови опухоленосителя. р<0,05*

Рис. 10. Действие SNP. Arg и L-NAME на интенсивность ХЛ-ответа перитонеальных макрофагов, выделенных на 1, 4 и 8 сутки из ас-цитной жидкости опухоленосите.чя. р<0,05*

терпевает значительных изменений. Необходимо отметить, что SNP не оказывает достоверного действия ка ХЛ в бесклеточных модельных системах, генерирующих супероксид анион, что говорит о действии SNP именно на клетки.

В случае инкубирования фагоцитирующих клеток с Arg в концентрации 10"4 M установлено, что активность ПМЯЛ (рис. 9) и перитонеальных макрофагов (рис.10) практически не изменяется в первые сутки развития опухоли. Начиная 4 суток, отмечено достоверное снижение интенсивности ХЛ фагоцитов в присутствие субстрата NO-синтазы. Такая тенденция сохраняется вплоть до гибели опухоленосителя.

Ингибитор NO-синтазы (нитроаргинин) в концентрации 10-4 M в условиях эксперимента не вызывал статистически достоверного изменения АФК-генерирующей активности лейкоцитов и макрофагов (рис 9, 10). Это происходит, по-видимому, из-за того, что NO-синтаза является инду-цибельным ферментом и для ее сборки необходим определенный интервал времени.

На основании полученных данных можно предположить, что при развитии опухоли N0 является не только цитотоксическим агентом, но и регуляторным фактором. Регуляторную функцию N0 осуществляет благодаря процессу нитрозилирования SH-rpynn белков, в основном, альбумина и гемоглобина. Однако этот процесс касается и такого важного фермента, как НАДФН-оксидаза, нитрозилирование р47 фрагмента которой может снижать продукцию О2". [Stavros Seiemidis, et all., 2007]. Это обстоятельство является важным фактором для поддержания тонкого равновесия между N0 и О2" и точного выполнения клеточных функций. Согласно нашим результатам, действие активных форм азота на работу НАДФН-оксидазы является дозо- и время зависимым угнетающим фактором, но при этом результат воздействия зависит от уровня активности самой NO-синтазы.

Действие экзогенных модуляторов уровня оксида азота и флавоноида ДГК на развтие опухоли in vivo.

Установлено, что в процессе роста асцитной гепатомы Зайделя в организме животного в плазме крови развивается нитрозилирующий стресс. При этом оксид азота может оказывать влияние на АФК-генерирующую активность клеток неспецифического иммунитета, снижая продукцию активных форм кислорода. Мы предполагаем, что изменение баланса активных форм кислорода и азота может быть эффективным в регулировании интенсивности опухолевого процесса. С этой целью было исследовано влияние модуляторов уровня оксида азота, таких как донора NO, ингибитора NO-генерирующей системы и сравнить с действием ДГК - флавоноида с антиоксидантными свойствами на развитие окислительного и нитрозилирующего стресса в организме опухоленосителя.

Действие нитроаргинина на уровень метаболитов N0, динамику АФК-генерирующей активности фагоцитов в плазме и асците опухоленосителя и интенсивность роста опухоли in vivo.

В опытах in vitro установлено, что нитроаргинин (блокатор NOS) не оказывает существенного влияние на АФК-генерирующую активность фагоцитов, что, по-видимому, связано с малой протяжённостью эксперимента. В случае систематических инъекций нитроаргинина воз-

можно развитие определённых эффектов в связи с уменьшением общей продукции оксида азота всеми типами ЫО-синтаз.

Г-Ы

6 (

Рис. 11 Динамика различных метаоолитов оксида азота в асцитной жидкости при развитии асцитной гепатомы Зайделя при ежесуточном введении нитроаргинина. Начиная со 2 суток.

кривая 1 - контрольные животные: кривая 2-инъекции 1-ЫАМЕ.

а) Динамика NOx;

б) Динамика нитротирозина; ' ' в) Динамика Я-$N0.

Время, сут. В

В ходе эксперимента подопытным животным, начиная со 2-х суток после транс-плантации опухоли, вводилось 25 мкг/кг нитроаргинина в физрастворе ежесуточно. В ходе эксперимента были изучены изменения динамики основных метаболитов оксида азота, АФК-генерирующей активности фагоцитов и концентрации опухолевых клеток в крови и асцитной жидкости по сравнению с нормальным течением опухолевого процесса. В асцитной жидкости обнаружен ожидаемый спад концентрации метаболитов оксида азота (рис.11а, 116, Ив), обусловленный общим снижением продукции N0 в организме. Так под действием нитроаргинина концентрация нитротирозина была снижена на протяжении всего роста опухоли, достигая максимальных различий с контролем на 6 сутки эксперимента (Рис. 116). Концентрация ЫОх снизилась в среднем на 2мкМ (рис.11а). Динамика концентрации Б-нитрозотиолов в асцитной жидкости (рис. 11 в) лишилась ярко выраженного экстремума на 5-х сутках. Также обнаружено, что в асцитной жидкости наблюдается снижение концентрации 5Н групп белков на заключительной стадии развития опухоли.

В плазме крови также наблюдалось снижение концентрации метаболитов оксида азота (рис. 12а, 12б,!2в) при инъекции ингибитора Ш-синтазы. Концентрация нитротирозина, как и в асците, в среднем снизилась в 1,5-2 раза, но по более пологой, чем в контроле, динамике. При инъекциях Ь-ЫАМЕ динамика ЫОх заметно не изменялась в течение эксперимента. Однако, на за-

ключительной фазе отсутствовал всплеск концентрации нитритов, характерный для нормально развивающейся опухоли (Рис. 12а). Наибольшие изменения отмечены в случае с Б-нитрозотиолами

.....■

Рис. 12 Динамика различных метаболитов оксида азота в плазме крови при развитии асцит-ной гепатомы Зайделя при ежесуточном введении нитроаргинин, начиная со 2 суток., кривая 1 - контрольные животные; кривая 2-инъекции Ь-НАМЕ.

а) Динамика МОх;

б) Динамика нитротирозина:

в) Динамика Я-Б!^.

(рис.12в). Их концентрация значительно ниже, чем в контрольных опухоленосителях и практически не отличается от уровня К-ЗЬЮ здорового животного.

Была исследована динамика АФК-генерирующей активности фагоцитов плазмы и асцита в ходе роста опухоли при ежесуточном введении ингибитора ИО-синтазы. При исследовании ХЛ

Рис. 13 Динамика ХЛ-ответа ПМЯЛ крови и макрофагов из асцитной жидкости на разных этапах развития гепатомы Зайделя при ежесуточном введении нитроаргинина. кривая I-контрольный опухоленоситель; кривая 2 - инъекции Ь-ЫАМЕ. а) ПМЯЛ. б) макрофаги.

макрофагов асцитной жидкости (рис 136) установлено, что при введении нитроаргинина наблюдается тенденция к усилению активированной ХЛ. Однако данный ингибитор не оказывал значительного влияния на продукцию АФК лейкоцитов плазмы крови (рис 13а).

На основании полученных данных можно заключить, что применение нитроаргинина приводит к снижению нитрозилирующего стресса, что ожидаемо. При этом увеличивается АФК-генерирующая активность клеток неспецифического иммунитета, локализированных в асцитной жидкости. Также необходимо отметить, что в крови практически не изменяется АФК-генерирующая активность ПМЯЛ. Данный факт, наряду с увеличением концентрации 5Н-групп (Рис. 14) за счёт снижения процесса нитрозилирования, способствует некоторому снижению окислительного «напряжения» в крови.

1 ]".'

"Т--.1

""Ч

Рис. 14. Изменение концентрации К-БН в ходе развития опухоли в плазме крови опухолей ос ителя при инъекции нитроаргинина, начиная со 2 суток, кривая 1- контрольные животные; кривая 2 - инъекции Ь-МАМЕ.

Время, сут

При исследовании влияния Ь^АМЕ на опухолевый рост (рис.15) было отмечено, что инъекции ингибитора 1\Ю-синтазы способствуют росту концентрации опухолевых клеток, что может быть связано с уменьшением притока жидкости при сохранении скорости пролиферации.

Исходя из полученных результатов, можно заключить, что нитроаргинин снижает нитрози-лирующий стресс в организме, способствует увеличению АФК-генсрирующей активности фагоцитов зоны роста опухоли. Однако в условиях сниженного синтеза оксида азота до 7 суток в орга-

Рис.15. Изменение концентрации опухо-

т т ^ Г _Т левых клеток в ищите при ежесуточ-

' т ном введении нитроаргинина, начиная

* 2 со 2 суток.

кривая 1 - контрольный опухоленоси-тель;

кривая 2 - инъекции Ь-ЫАМЕ.

низме происходит усиление опухолевого роста, что свидетельствует о ключевой роли оксида азота в ограничении прогрессирования гепатомы Зайделя. Резкий спад в дальнейшем концентрации опухолевых клеток может быть обусловлен иными, не обнаруженными в настоящий момент, процессами.

Действие инъекций ЯМР на баланс метаболитов N0, динамику А ФК-генерирующей активности фагоцитов в плазме и асците опухоленосителя и интенсивность роста опухоли.

В экспериментах на выделенных клетках установлено, что донор оксида азота БИР снижает АФК-генерирующую активность клеток неспецифического иммунитета, что, возможно, связано с ингибированием активности 02- генерирующей системы. Было высказано предположение, что инъекции данного соединения должны оказывать значительное воздействие на процесс развития опухоли в организме, так как N0 способен уменьшать активность фагоцитов и индуцировать апоптоз [Луценко. 2001].

В ходе эксперимента подопытным животным, начиная со 2-х суток после трансплантации опухоли, ежесуточно вводили 25 мкг/кг БОТ. При этом были изучены изменения динамики основных метаболитов оксида азота в крови, в асцитной жидкости и рассмотрено воздействие инъекций на активность фагоцитов и интенсивность опухолевого роста.

Установлено, что при введении раствора в асцитной жидкости (рис. 16а, 166 и 16в) наблюдается ожидаемый рост концентрации различных метаболитов оксида азота по сравнению с контрольным опухоленосителем. При этом отмечены наибольшие изменения в динамике ЛОх (рис. 16а) и Я-З-ЫО (рис. 16в) на заключительных этапах развития опухоли.

Время, ерт.

Рис. 16 Динамика различных метаболитов оксида азота в асцитной жидкости при развитии асцитной гепатомы Зайделя при ежесуточном введении ЗЫР.

кривая 1-контрольные животные: кривая 2-инъекции Ь-НАМЕ.

а) Динамика N0x1

б) Динамика нитротирозина;

в) Динамика Л-8МО.

Необходимо отметить, что в случае применения 8ЫР увеличивается миграция клеток иммунной системы в асцит в начальный период роста опухоли, а на заключительном - снижается, по-видимому, за счёт N0 модулированного апоптоза. Также отмечено уменьшение количества доступных 5Н-групп белков вследствие 5-нитрозилирования. Отмечено уменьшение количества доступных БН-групп белков вследствие процесса 8-нитрозилирования. (рис. не представлены).

I .

Рис. 17 Динамика различных метаболитов оксида азота в плазме крови жидкости при развитии асцитной гепатомы Зайделя при ежесуточном введении

кривая ¡-контрольные животные; кривая 2-инъекции ЖУР.

а) Динамика NOx;

б) Динамика нитротирозина;

в) Динамика Я-БЬЮ.

В плазме крови также наблюдается рост концентрации различных метаболитов оксида азота, что является подтверждением усиления нитрозилирующего стресса в плазме крови (Рис. 17а, 176 и 17в). Дополнительно поступающий с SNP оксид азота усиливает процессы S-нитрозилирования (рис.17в), увеличивает концентрацию нитротирозина (рис.176) и низкомолекулярных нитритов (рис. 17а). Развивающийся окислительный и нитрозилирующий стресс в плазме крови вызывает резкое ухудшение состояния опухоленосителя, приводящее в итоге к увеличению процента гибели подопытных животных.

Как и в опытах in vitro при инъекции донора N0 в брюшную полость опухоленосителя была установлена тенденция к снижению АФК-генерирующей активности как ПМЯЛ плазмы крови (рис. 18а), так и макрофагов из асцита (рис. 186).

2 4 6 В 10

Время, сут.

Рис. 18 Динамика ХЛ-ответа ПЬ1ЯЛ крови и макрофагов из асцитной жидкости на разных этапах развития гепатомы Зайделя при ежесуточном введении . кривая 1-контрольный опухоленоси-тель; кривая 2-инъекции и) ПМЯЛ; б) макрофаги

Необходимо отметить, что при инъекции 8ОТ наблюдалось резкое снижение концентрации опухолевых клеток, начиная с 6 суток (рис 19), что, по-видимому, связано с цитотоксическим действием оксида азота, в частности, его способности регулировать клеточную гибель.

Рис.19. Изменение концентрации опухолевых клеток в асците при ежесуточном введении SNP, начиная со 2 суток, кривая 1-контрольный опухоленоси-тель;

кривая 2-инъекции

Время, сут

На основании полученных данных можно утверждать, что БЫР увеличивает проявления нитрозилирующего стресса в организме. При этом его ингибирующее воздействие на синтез АФК в плазме не перекрывает тот отрицательный эффект, который связан с переизбытком N0. Надо отметить, что имел и положительное эффект: резко снижал концентрацию опухолевых клеток, но, к сожалению, уже в необратимой фазе роста опухоли. Возможно, локальное и кратковременное применение доноров оксида азота может иметь более эффективный терапевтический эффект. При этом необходимо контролировать уровень нитрозилирующего стресса в крови опухоле-носителя.

Влияние инъекций ДГК на уровень метаболитов N0, динамику АФК-генернрующей активности фагоцитов в плазме и асците опухоленосителя и интенсивность роста опухоли

Как показали наши исследования [дис. Шаталин, 2008], при развитии асцитной гепатомы Зайделя в организме нарушается баланс между окислительной и антиоксидантной системами. Так при развитии гепатомы Зайделя в крови развивается окислительный стресс, который приводит к разрушению эритроцитов, к выходу гемоглобина в плазму, что ещё больше способствует окислительному повреждению систем организма. В зоне роста опухоли, наоборот, создаются восстановительные условия, характеризующие низким уровнем АФК, высокой концентрацией белковых БН-групп, гипоксией, ацидозом, что не противодействует росту опухоли. В качестве терапии подобных состояний было предложено использовать различные соединения полифенольной природы, в частности, флавоноиды, обладающие как антиоксидантной, так и противоопухолевой активностью [Рог513 Т, е1:.а1., 1997; Са^гопе 5., et.aU 2000]. Считается, что активация эффекторных клеток иммунной системы осуществляется за счет способности флавоноидов стимулировать наработку иммуноглобулинов [Ногпип§ еЫ., 1988]. Флавоноиды способны ингибировать секрецию лизосо-мальных ферментов, метаболизм арахидоновой кислоты, уровень внутриклеточного Са~+ в нейтрофилах [БЫ^еИ и др., 1981], процесс дегрануляции тучных клеток.

На основании этих данных была поставлена задача: изучить действие ДГК на развитие нит-розилирующего стресса при развитии гепатомы Зайделя.

Необходимо отметить, что ДГК непосредственно не реагирует с оксидом азота в физиологических условиях, но его применение вызывает изменение про/антиоксидантного баланса в плаз-

12-

Время, сут

20-

10<

Рис. 20 Динамика различных метаболитов оксида азота в асцитной жидкости при развитии асцитной гепатомы Зайделя при ежесуточном введении ДГК.

кривая 1 - контрольные животные; кривая 2 -инъекции ДГК.

а) Динамика МОх;

б) Динамика нитротирозина;

в) Динамика Я-БЫС).

Время, сут

ме и асците опухоленосителя, что должно изменить соотношение различных метаболитов оксида азота.

Установлено, что при ежесуточной инъекции ДГК в брюшную полость опухоленосителя в асцитной жидкости не обнаружено изменений в концентрации нитритов/нитратов по сравнению с обычным развитием опухоли (рис 20). Однако в этих условиях отмечено увеличение содержания белков, модифицированных активными формами азота (рис 206, 20в). Данный эффект может быть обусловлен тем, что при введении соединения с антиоксидантными свойствами происходит снижение окислительной модификации белков, которая выражена в повышении уровня белковых вН-групп. Увеличение концентрации белков, доступных для модификации с помощью N0, способствует образованию Б-нитрозотиолов (рис. 20в) При этом форма динамической кривой заметно не изменяется, что наряду с динамикой концентрации >Юх может говорить об отсутствии влияния ДГК на синтез оксида азота. Также необходимо отметить, что изменения в концентрации производных оксида азота могут быть также связаны с их транспортом из плазмы в асцит.

. т 10 5

г Ж. 8 1

N. 1 6 & | X 4

-М

Рис. 21 Динамика различных метаболитов оксида азота в плазме крови при развитии асцитной гепатомы Зайделя при ежесуточном введении ДГК.

кривая 1-контрольные животные; кривая 2-инъекции ДГК.

а) Динамика ЫОх;

б) Динамика нитротирозина;

в) Динамика Я-8МО.

В крови опухоленосителя при введении ДГК отмечено заметное увеличение концентрации всех исследуемых метаболитов оксида азота (рис.21). Так значительно (в 2-3 раза) возросла концентрация нитротирозина (рис.216) в середине опухолевого роста, что, по-видимому, связано с уменьшением модификации тирозина активными формами кислорода. Также зафиксирован рост концентрации низкомолекулярных нитратов/нитритов (3-4 раза) (рис. 21а), что свидетельствует о росте продукции N0 в организме, либо об ухудшении процесса выведения нитратов. При этом концентрация 8-нитрозотиолов (рис.21 в) в случае применения ДГК продолжала повышаться

вплоть до окончания эксперимента по сравнению с контрольным опухоленосителем. По-видимому, это связано со снижением окислительного стресса, увеличением немодифицированных $Н-групп белков, способных к дальнейшему нитрозилированию. Необходимо отметить, что происходит практически полное нитрозилирование всех доступных БН групп белков концентрация которых, согласно нашим исследованиям, у здорового животного составляют порядка - 35 цМ. Данные процессы идут на фоне уменьшения окислительного стресса, выраженного в снижении продукции АФК фагоцитами крови и увеличения концентрации 8Н-групп белков.

В случае применения ДГК наблюдалось принципиально значимое для продолжительности жизни опухоленосителя снижение концентрации опухолевых клеток (рис 22), что, по-видимому, связано с проявлением цитотоксического действием ДГК по отношению к данному типу клеток.

3.5x10

С 3

§ 3,0x10'

£ 1,5x10'

У I I

Рис.22. Изменение концентрации опухолевых клеток в асците при ежесуточном введении ДГК. кривая ¡-контрольный опухоленоситель, кривая 2-инъекции ДГК.

На основании полученных результатов можно утверждать, что инъекции ДГК вызывают в крови опухоленосителя значительное усиление нитрозилирующего стресса, выраженного в сильной 1МО-зависимой модификации белков. Этот процесс, по-видимому, связан с резким уменьшением окислительной модификации белков в присутствие активных форм кислорода. Вместе с тем, в зоне роста опухоли усиление нитрозилирущего стресса выражено слабее, по-видимому, из-за практически отсутствия других источников оксида азота, кроме макрофагов и транспорта модифицированных белков из плазмы. Применение данного флавоноида с целью подавления роста ге-патомы Зайделя является оправданным в виду его способности эффективно ограничивать рост данного типа опухолевых клеток. Однако механизм усиления нитрозилирующего стресса в крови остаётся до конца неясным.

выводы

1. Впервые показано развитие нитрозилирующего стресса в плазме крови опухоленоеителя с развивающейся асцитной гепатомой Зайделя, выраженного в образовании внеклеточных метаболитов N0: пероксинитрита, S-нитрозилированных белков и нитритов/нитратов (NOx).

2. Этапы опухолевого роста характеризуются различными соотношениями N0-модифицированных белков в плазме крови: в начале преобладает нитротирозин (увеличение в 3-4 раза) - маркер пероксинитрита, в середине роста опухоли отмечена максимальная концентрация S-нитрозотиолов (увеличение в 5-6 раз), на заключительном этапе процесс окисления белков АФК преобладает над нитрозилированием.

3. При развитии асцитной опухоли имеет место перенос оксида азота из плазмы в асцитную жидкость в форме S-нигрозилированных белков, т.е. R-SNO является запасающей и транспортной формой оксида азота.

4. В опытах ¡n vitro впервые показано увеличение чувствительности лейкоцитов крови и асцита к эндогенному источнику N0 (аргинин) в ходе роста опухоли, подтвержденное снижением АФК-генерирующей активности, активированной ФМА.

5. В опытах in vivo установлено, что:

— инъекции донора NO (SNP) увеличивают уровень метаболитов оксида азота, особенно нитритов и S-нитрозотиолов в асцитной жидкости, снижая концентрацию опухолевых клеток на 6 сутки развития гепатомы;

— инъекции ингибитора NO-синтазы (L-NAME) снижают уровень нитрозилирующего стресса в плазме и асците, но способствует увеличению АФК-генерирующей активности фагоцитов в зоне опухоли, что приводит к нетривиальному характеру роста опухоли — первоначальному усилению и последующему резкому торможению пролиферации клеток гепатомы.

6. Впервые в опытах in vivo показано, что инъекции ДГК усиливают нитрозилирующий стресс в плазме опухоленоеителя, выраженный в увеличении концентраций нитратов/нитритов, пероксинитрита в 2-3 раза и степени S-нитрозилирования белков, резко снижая при этом пролиферацию опухолевых клеток.

Публикации.

Статьи

1. Ю.В. Шаталин, A.A. Наумов, М.М. Поцелуева. Сравнительная характеристика антиокси-дантных свойств гипоксена и дурохииона методом хемилюминесцеиции. Биофизика, 2008, том 55, вып. 1, с. 100-106.

2. A.A. Наумов, Ю.В. Шаталин, Т.К. Сухо.млин, М.М. Поцелуева. Влияние липосом, содержащих антиоксидант, фосфолипид и аминокислоту, на процесс регенерации кожи после химического ожога. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2009, N«2, стр. 96-102.

3. A.A. Наумов, М.М. Поцелуева, Благотворное действие липосомалыюй формы ДГК на процесс регенерации кожи после термического ожога. Цитология, 2010, т.52, N°4, с. 311-316.

4. Наумов A.A., Шаталин Ю.В., Поцелуева М.М., Воздействие нанокомплекса, содержащего антиоксидант, липид и аминокислоту, на раневую поверхность, вызванную термическим ожогом. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010, m 149, N°1, с. 69-73.

5. Ю.В. Шатали». A.A. Наумов, М.М. Поцелуева. Изменение состав клеточных популяций и уровня активных форм кислорода в крови и асцитной жидкости опухоленосителя. Цитология. 2010, т.52, №2, с. 131-135.

6. Наумов А. А., Поцелуева M. М.. Влияние донора NO, субстрата и ингибитора NO-синтазы на А ФК-генерируюи{ую активность фагоцитов в процессе роста асцитной опухоли. Цитология. 2011. 53 (1), 68-74.

Статьи в сборниках конференций

1 Наумов A.A., Шаталин Ю.В., Сухомлин, Т.К., Поцелуева М.М. Нитрующее действие оксида азота в зоне роста асцитной опухали. 2009. Сборник статей: Рецепция и внутриклеточная сигнализация. Пущине. Том 1, стр. 373-377

2. Наумов A.A., Хайретдинова М.М. поцелуева М.М. Влияние различных концентраций перекиси водорода на продукцию активных форм кислорода фагоцитирующими клетками. Рецепция и внутриклеточная сигнаизация. 2011.г Пулцино.

3. Шаталин Ю.В., Наумов A.A., Сухомлин Т.К., Поцелуева М.М. Разнонаправленное изменение

концентраций церулоплазмина и трансферрина в плазме крови и асцитной жидкости опухоленосителя. Сибирский консшиум. 2007. №2, с.59-65.

Течисм в конференциях.

/. Шаталин Ю.В., Шубина B.C., Наумов A.A., Поцелуева М.М. Изменение концентрации ан-тиоксидантов в плазме крови и асцитной жидкости в ходе развития опухоли. Биология -наука XXI века: 10-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сборник тезисов. Пупцино, 2006 г.

2. Наумов A.A., Шаталин Ю.В., Шубина B.C., Парнышкова Е.Ю, Поцелуева М.МОценка скорости продукции пироксинитрита в ходе развития асцитной опухоли в организме животного. Биология - наука XXI века: 10-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сборник тезисов. Пущине, 2006.

3. Shalalin Yu. V., Naumov A.A.. Shubina V.S., Polselueva MM. There is research of cytotoxic action of dihydroquercetine on Ehrlich's carcinoma cells and polymorphonuclear leukocytes. XXXIst Symposium on Hormones and Regulation: Cancer Cell Signalling. Hostellerie du Mont Sainte-Odile, France. Abstract book, 14-17 September. 2006.

4. Шаталин Ю.В., Наумов А.А., Овчинникова К.Н., Парнышкова ЕЮ., Поцелуева М.М. Исследование антиоксидантных свойств производных дигидрокверцитина. VII Всероссийская конференция «Биоантиоксидант» (с международным участием), Москва, 25-26 октября, 2006.

5. Наумов А..А., Парнышкова Е.Ю.. Шаталин Ю.В., Овчинникова К.Н., Поцелуева М.М.Новый подход для оценки антирадикальных свойств антиоксидантов и антиоксидантного статуса биологических жидкостей с помощью системы феназинметасульфат-NADH-люминол. VII Всероссийская конференция «Биоантиоксидант» (с международным участием), Москва, 25-26 октября, 2006.

6. Наумов А..А., Парнышкова Е.Ю.. Шаталин Ю.В. Модуляция содержания активных форм азота в присутствии дигидрокверцитина, ингибитора NO-синтазы и донора оксида азота при развитии гепатомы Зайделя в организме животного. Всероссийская конференция «Фундаментальная наука и клиническая медицина», Санкт-Петербург, Апрель, 2007.

7. Наумов А.А., Шатачин Ю.В., Поцелуева ММ., Влияние антиоксиданта, ингибитора NO-синтазы и донора оксида азота на уровень активных форм кислорода и азота в зоне роста асцитной опухоли, конференция молодых учёных «Биология-наука XXI века», Пуичто, 2007.

8. Наумов А.А., Шатачин Ю.В., Поцелуева М.М., Хемилюминесцентный метод определения антиоксидантной активности биологических жидкостей с использованием системы фе-назинметасульфат — НАДН. Школа - конференция молодых ученых, аспирантов и студентов "Биомедицинская инженерия - 2007, г. Пущино, 2007.

9. Наумов А.А., Шаталин Ю.В., Поцелуева М.М. Хемилюминесцентные методы исследования антиоксидантных свойств липосомальных носителей биологически активных веществ на примере фосфолипид-антиоксидантного нанокомплекса, содержащего дигидрокверцетин. 12-я международная конференция молодых учёных «Биология-наука XXI века», Пуишно, 2008, с. 179-180.

10. Наумов А.А., Шаталин Ю.В., Поцелуева М.М. Зависимость антирадикачьной и антиоксидантной активности липосом, содержащих различные концентрации дигидрокверцетина. III Международная конференция молодых ученых "Биология: от молекулы до биосферы ". Харьков, 18-2! ноября 2008 г., с. 91-92.

ll.Shatalin Yu.V., Naumov А.А., Sukhomlin Т.К., Ermakov G.L., Potselueva MM., Sharipov R.N., Yevshin IS., Kolpakov F.A. Disbalance between innate immunity response and antioxidant defence in blood and ascites: integration of experimental and mathematical modeling. The Sixth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRS'2008). Novosibirsk, Russia, June 22-28, 2008.

12. Наумов A.A., Шатачин Ю.В., Сухомлин Т.К., Сахарова Н.Ю..А.Н. Коновалов, Святушенко А.Н., Поцелуева М.М. Липосомы, содержащие дигидрокверцетин, эффективны для местного лечения ран после термического ожога. Конференция «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток». 18-20 июня, Самара, 2008, р. 63.

13. Shatalin Yu. V., Naumov А.А., Sukhomlin Т.К., Potselueva М.М. Dynamics of change of effector cells in blood and ascetic fluid during Zajdela hepatoma development. Biological motility: achievements and perspectives. Pushchino, V. 2, P.270-271.

14. Наумов A.A., Шаталин Ю.В., Поцелуева М.М. Использование дигидрокверцетина в качестве модулятора уровня активных форм азота в асцитной опухоли на примере гепатомы Зайде.чя. Тезисы конференции: «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» 2009, Крым.

15 Наумов A.A., Хайретдинова М.М. Поцелуева М.М. Влияние различных концентраций, перекиси водорода на продукцию активных форм кислорода фагоцитирующими метками. Рецепция и внутриклеточная сигнаизация. 2011.г Пущине.

16 Наумов A.A. Хайретдинова М.М. Поцелуева М.М. Динамика метаболитов оксида азота в организме опехоленосителя при развитии асцитной гепатомы Зайделя. 2011.г «Биология-наука XXI века», Пущино.

17 Наумов A.A., Хайретдинова М.М., Поцелуева М.М. Нитрозилируюший стресс при развитии гепатомы зайделя как двух стадийный процеесс работы иммунонейроэндокринной системы. «Нейронаука для биологии и медицины» 2011. Крым, Судак.

Подписано в печать: 7.10.11

Обьбм 1,5 усл.п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 503 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Страстной бульвар, 6/1 (495) 978-43-34; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Наумов, Андрей Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Экспериментальные модели опухолевого роста.

1.1. Спонтанные опухоли.

1.2. Индуцированные опухоли.

1.3. Перевиваемые или трансплантируемые опухоли.

1.4 Асцитная гепатома Зайделя.

1.5 Асцит. Формирование асцита.

Глава 2. Характеристика различных пулов миелоидных клеток и их роль в развитии опухоли.

2.1. Два пула макрофагов: М1 и М2.

2.2. Проопухолевые функции опухолъ-ассоциированных макрофагов (ТАМ) и антиопухолевые М1.

Глава 3. Оксид азота - одна из ключевых сигнальных молекул в организме.

3.1. Свойства оксида азота.

3.2. Основные внеклеточные метаболиты оксида азота.

Глава 4. Синтез оксида азота в организме.

4.1. Изоформы NO-синтазы.

4.2. Факторы, влияющие на индукцию NOS.

Глава 5. Мишени действия и физиологическая роль оксида азота.

5.1. Участие NO в регулировании активности ферментов.

5.2. Участие NO в развитие апоптоза.

5.3. Участие NO в функционировании различных систем организма.

5.4. Цитотоксическое действие оксида азота.

Глава 6. Перспективы применения лекарственных веществ, влияющих на уровень N0.

ЧАСТЬ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ.

Глава 6. Материалы и методы исследования.

6.1. Материалы.

6.2. Объект исследования.

6.3. Животные.

6.4. Формирование экспериментальной опухоли.

6.5. Выделение перитонеалъных макрофагов из полости здоровых животных.

6.6. Выделение макрофагов из асцитной жидкости опухоленосителя.

6.7 Выделение ПМЯЛ из циркулирующей крови.

6.8. Подсчёт клеток.

6.9. Анализ клеточных популяций.

6.10. Определение продукции активных форм кислорода фагоцитирующими клетками.

6.11. Приготовление плазмы крови.

6.12. Приготовление бесклеточной асцитной жидкости.

6.13. Измерение концентрации нитритов/нитратов в асцитной жидкости и плазме крови.

6.13. Измерение концентрации Б-нитрозотиолов в асцитной жидкости и плазме крови.

6.14. Измерение концентрации нитротирозина в асцитной жидкости и плазме крови.

6.15. Измерение концентрации тиоловых групп белков.^.

6.16. Статистическая обработка данных.

ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 7. Динамика различных метаболитов оксида азота при развитии асцитной гепатомы Зайделя.

7.1. Динамика NOx в плазме крови и асцитной жидкости при развитии асцитной опухоли.

7.2. Динамика нитротирозина в плазме крови и асцитной жидкости при развитии опухоли.

7.3. Динамика R-SNO и в плазме крови и асцитной жидкости при развитии опухоли.

Глава 8. Изменение АФК-генерирующей активности ПМЯЛ и перитонеальных макрофагов при развитии асцитной опухоли.

8.1. Действие донора оксида азота на хемилюминесценцию фагоцитирующих клеток здорового животного.

Глава 9. Действие экзогенных модуляторов уровня оксида азота и флавоноида ДГК на развитие опухоли in vivo.

9.1. Действие нитроаргинина на уровень метаболитов NO, динамику АФК-генерируюгцей активности фагоцитов в плазме и асците опухоленосителя а интенсивность роста опухоли in vivo.

9.2 Действие инъекций SNP на баланс метаболитов NO, динамику АФК-генерируюгцей активности фагоцитов в плазме и асците опухоленосителя и интенсивность роста опухоли.

9.3. Действие ДГК на баланс метаболитов NO, динамику АФК-генерируюгцей активности фагоцитов в плазме и асците опухоленосителя и интенсивность роста опухоли.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Метаболиты оксида азота и их модуляция при развитии гепатомы Зайделя"

Факт образования в организме опухоли означает неэффективность работы специфических механизмов отслеживания и уничтожения трансформированных клеток. Следовательно, возрастает роль неспецифических механизмов защиты организма [Ackermann et al., 1989; van Kessel et al., 1990], которая до конца неясна. Рост опухоли сопровождается распространением сигналов, которые активируют компоненты врожденного иммунитета, клеточной составляющей которого, помимо натуральных киллерных клеток, являются полиморфноядерные лейкоциты (в основном, это нейтрофилы и моноциты), а также тканевые макрофаги. Активация данного типа клеток, относящихся к фагоцитам, сопровождается продукцией активных форм кислорода (АФК) и активных форм азота (АФА). При действии иммунных комплексов, активаторов рецепторов, микрочастиц на плазматической мембране фагоцитов происходит сборка и активация НАДФН-оксидазы, работа которой превращает 02 в супероксид анион (СЬ*-). Дальнейшие превращения(02*~) образуют ряд АФК, таких как гидроксил радикал, перекись водорода и т.д. Индукция другой ферментной системы фагоцитов - iNO-синтазы приводит к продукции оксида азота (N0), который является важным регуляторным фактором во многих системах организма, а также обеспечивает цитотоксическую активность данного типа клеток [Lepoivre et al., 1991]. Бактерицидное и цитотоксическое действие NO и АФК во многом зависит от продуктов их взаимодействия [Paulluy, 1996]. Возникающие в таких реакциях активные метаболиты - пероксинитрит, диоксид азота, и др. обладают высокой реакционной способностью и могут повреждать различные клеточные структуры, изменяя их функциональную активность. Так процесс нитрозилирования белков под действием активных форм азота является одним из механизмов регуляции активности некоторых ферментных систем [Kozlov, A.V1999]. Следует отметить, что некоторые метаболиты N0, такие как Б-нитрозотиолы и сам N0, при определённых условиях могут проявлять антиоксидантную активность И., 1993].

Например, оксид азота может связываться с ионами железа, которые катализируют реакции свободно-радикального окисления. Связывание железа вызывает тем самым ингибирование процесса разветвления свободно-радикальной цепи.

Таким образом, для понимания роли реакций неспецифического иммунитета при росте в организме злокачественных опухолей, актуальным является исследование состояния АФК - и N0- генерирующих систем, а также процессов их взаимовлияния в ходе роста опухоли. Активность этих систем определяет баланс антиоксидантных и прооксидантных реакций, как в зоне патологии, так и в кровеносном русле. В частности, исследование динамики основных внеклеточных метаболитов оксида азота, таких как нитраты/нитриты, пероксинитрита (продукт взаимодействия оксида азота и супероксид аниона) и нитрозотиолов в организме опухоленосителя является актуальной задачей. Изменение количественного и качественного состава продуцируемых организмом АФК и активных форм азота (АФА) могут выразиться в качественных изменениях поведения системы в целом. При этом с ростом концентрации этих метаболитов растет число потенциальных мишеней - от передачи сигналов до регуляции активности отдельных систем и цитотоксического эффекта.

Цель работы

Целью настоящей работы является исследование временных и количественных характеристик метаболитов оксида азота в крови и асците опухоленосителя, а также возможности их коррекции с целью подавления опухолевого роста.

Задачи исследования

1. Изучить динамику следующих внеклеточных метаболитов оксида азота в крови и асцитной жидкости при развитии гепатомы Зайделя: а) нитратов/нитритов как конечных продуктов метаболизма короткоживущего соединения N0; б) нитротирозина — продукта NO-зависимого окисления тирозина в присутствии О2-; в) нитрозилированных SH- групп белков как важнейшего маркера нитрозилирующего стресса.

2. Исследовать роль оксида азота в регулировании АФК-генерирующей активности фагоцитирующих клеток крови и асцита в процессе роста опухоли.

3. В опытах in vivo изучить действие NO- и АФК-модулирующих веществ на развитие нитрозилирующего и окислительного стресса и рост опухоли в организме.

Научная новизна.

В рамках диссертации впервые проведено одновременное исследование динамических параметров крови и асцита, характеризующих поведение неспецифического иммунитета в ответ на развитие асцитной гепатомы Зайделя. Впервые наряду с окислительным стрессом в плазме опухоленосителя показано развитие «нитрозилирующего стресса». Показано, что максимальная концентрация различных метаболитов оксида азота (пероксинитрит, МО-модифицированные белки и нитриты/нитраты) связана с различными фазами роста опухоли и имеет разную кинетику. Впервые исследовано влияние эндо и экзогенного донора оксид азота, а также ингибитора Ж)-синтазы на АФК-генерирующую активность перитониальных макрофагов и лейкоцитов крови в процессе развития опухоли. Впервые проведены исследования по модификации уровня нитрозилирующего стресса в организме опухоленосителя с помощью инъекций доноров N0, ингибитора ]ЧО-синтазы и флавоноидов с целью подавления роста опухоли в организме животного.

Практическая ценность.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Наумов, Андрей Анатольевич

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано развитие нитрозилирующего стресса в плазме крови опухоленосителя с развивающейся асцитной гепатомой Зайделя, выраженного в образовании внеклеточных метаболитов NO: пероксинитрита, S-нитрозилированных белков и нитритов/нитратов (NOx).

2. Этапы опухолевого роста характеризуются различными соотношениями NO-модифицированных белков в плазме крови: в начале преобладает нитротирозин (увеличение в 3-4 раза) - маркер пероксинитрита, в середине роста опухоли отмечена максимальная концентрация S-нитрозотиолов (увеличение в 5-6 раз), на заключительном этапе процесс окисления белков АФК преобладает над нитрозилированием.

3. При развитии асцитной опухоли имеет место перенос оксида азота из плазмы в асцитную жидкость в форме S-нитрозилированных белков, т.е. R-SNO является запасающей и транспортной формой оксида азота.

4. В опытах in vitro впервые показано увеличение чувствительности лейкоцитов крови и асцита к эндогенному источнику NO (аргинин) в ходе роста опухоли, подтвержденное снижением АФК-генерирующей активности, активированной ФМА.

5. В опытах in vivo установлено, что: инъекции донора NO (SNP) увеличивают уровень метаболитов оксида азота, особенно нитритов и S-нитрозотиолов в асцитной жидкости, снижая концентрацию опухолевых клеток на 6 сутки развития гепатомы; инъекции ингибитора NO-синтазы (L-NAME) снижают уровень нитрозилирующего стресса в плазме и асците, но способствует увеличению АФК-генерирующей активности фагоцитов в зоне опухоли, что приводит к нетривиальному характеру роста опухоли -первоначальному усилению и последующему резкому торможению пролиферации клеток гепатомы.

6. Впервые в опытах in vivo показано, что инъекции ДГК усиливают нитрозилирующий стресс в плазме опухоленосителя, выраженный в увеличении концентраций нитратов/нитритов, пероксинитрита в 2-3 раза и степени S-нитрозилирования белков, резко снижая при этом пролиферацию опухолевых клеток.

Заключение.

В рамках фундаментальной проблемы по изучению роли неспецифического иммунитета при развитии злокачественных новообразований в данной работе были проведены исследования динамических характеристик внеклеточных метаболитов оксида азота в крови и асците опухоленосителя, а также возможности их коррекции с целью подавления опухолевого роста.

Рост опухоли в организме свидетельствует о неэффективности работы специфических механизмов отслеживания и уничтожения малигнантных клеток. В связи с этим возрастает роль неспецифических механизмов защиты организма. Известно, что рост опухоли сопровождается распространением сигналов, которые активируют компоненты врожденного иммунитета. Клеточной составляющей данного типа иммунитета, помимо натуральных киллерных клеток, являются полиморфноядерные лейкоциты (нейтрофилы и моноциты) и тканевые макрофаги. При их активации происходит сборка на плазматической мембране НАДФН-оксидазы, которая является электротранспортной системой, превращающей кислород в супероксид анион. Дальнейшие молекулярные превращения О2" образуют ряд АФК. Индукция другой ферментной системы фагоцитов — ТЧО-синтазы приводит к продукции оксида азота (N0), который является важным регуляторным фактором во многих системах организма. Действие N0 и АФК во многом зависит от продуктов их взаимодействия. Исследование состояния АФК- и МО-генерирующей систем и возможности их коррекции является актуальной задачей для понимания роли врожденного иммунитета при росте злокачественных опухолей в организме.

Для понимания эволюции взаимоотношений в системе «организм-опухоль» необходимо иметь адекватную экспериментальную модель. Такой моделью является рост перевиваемых асцитных опухолей в организме грызунов. Была использована асцитная гепатома Зайделя, трансплантированная в брюшную полость крыс линии Вистар. Объектом исследования являлись фагоцитирующие клетки (полиморфноядерные лейкоциты и перитонеальные макрофаги), внеклеточные метаболиты плазмы и асцита, а также растущие в брюшной полости клетки асцитной гепатомы Зайделя.

В рамках данной работы впервые проведено параллельное исследование динамических параметров плазмы и асцита, характеризующих состояние АФК- и Ж)-генерирующих систем фагоцитов, их взаимовлияние в ходе роста опухоли, а также проведены исследования по использованию модуляторов уровня оксида азота и АФК с целью оценки их влияния на интенсивность опухолевого роста.

Впервые показано, что в процессе роста опухоли в плазме крови помимо окислительного стресса имеет место и нитрозилирующий стресс, который характеризуется увеличением экзогенных метаболитов оксида азота. Причем их динамика в процессе роста опухоли не одинакова. Так на начальный период роста опухоли приходится максимальная концентрация нитротирозина - маркера цитотоксического метаболита оксида азота -пероксинитрита. При этом наблюдается интенсивное Б-нитрозилирование белков плазмы крови, что является наряду с окислением одной из причин снижения концентрации белковых 8Н-групп. Анализируя изменения концентраций Б-нитрозотиолов и уровень ЭИ-групп белков в плазме крови, мы установили высокую долю участия N0 в модификации белков, особенно на начальных этапах опухолевого роста. В дальнейшем в крови создаются значительно более окислительные условия из-за увеличивающейся численности и АФК-генерирующей активности фагоцитов. Это создает условия для необратимого окисления белков, что ведет к уменьшению доли нитрозотиолов в плазме на последних этапах роста опухоли. В результате этих процессов наблюдается рост концентрации нитритов/нитратов как наиболее стабильных метаболитов N0 в данных условиях.

В зоне роста опухоли также отмечается увеличение содержания различных метаболитов N0, причем динамика их концентраций тесно связана с развитием нитрозилирующего стресса в плазме крови. Обнаруженная корреляция между динамиками нитрозотиолов (К8-ЫО) в плазме и асцитной жидкости свидетельствует о значительной роли транспорта нитрозилированных белков из плазмы в асцит в процессе роста опухоли. При этом в асцитной жидкости поступающие 8-нитрозотиолы способны выступать как доноры N0, что, наряду с синтезом N0 макрофагами и замедлением эвакуации веществ из асцита приводит к росту Ж)х на заключительных фазах роста опухоли. Таким образом, оксид азота и его метаболиты активно участвуют в реакции организма на развитие опухоли, затрагивая как зону роста опухоли, так и кровяное русло.

Изменения в уровне оксида азота способны оказывать существенное влияние на функционирование различных систем организма. Так в данной работе было показано, что оксид азота угнетающе влияет на АФК-генерирующую активность клеток • неспецифического иммунитета. Также установлено, что эндогенный источник N0 -аргинин, являющейся субстратом Ж)-синтазы, также снижает продукцию АФК перитонеальных макрофагов и нейтрофилов крови, что мы связываем с усилением активности ПЧ08 в исследуемых клетках в процессе роста опухоли. В результате увеличения внутриклеточной концентрации N0 происходит ингибирование функции множества белков, в том числе НАДФН-оксидазы, что и является

•л причиной снижения продукции О Это обстоятельство является важным фактором для поддержания тонкого равновесия между N0 и О2" и точного выполнения ферментами клеточных функций. Также можно утверждать, что при развитии асцитной опухоли АФК-генерирующая способность фагоцитов находится в обратной зависимости от состояния ИО-генерирующей системы.

Было высказано предположение, что исскуственное изменение сложившегося баланса между активными формами кислорода и азота с помощью модуляторов уровня N0 и антиоксидантов может повлиять на интенсивность опухолевого роста. С этой целью было исследовано действие инъекций ингибитора NO-синтазы, донора оксида азота и флавоноида с антиоксидантными свойствами (ДГК) на развитие асцитной гепатомы Зайделя in vivo.

Показано, что снижение активности NO-генерирующих систем инъекциями ингибитора NO-синтаз - нитроаргинина ожидаемо снижают проявления нитрозилирующего стресса в организме опухоленосителя. При этом блокирование NO-генерирующей системы приводило к увеличению АФК-генерирующей способности макрофагов в зоне опухоли, что снижало опухолевый рост, но, к сожалению, на поздних стадиях. В крови АФК-генерирующая активность лейкоцитов практически не изменялась. Данный факт, наряду с увеличением белковых SH-групп демонстрирует снижение уровня окислительного «напряжения» в крови, что благоприятно для состояния опухоленосителя.

При внутрибрюшинном введении донора оксида азота (SNP) наблюдали усиление нитрозилирующего стресса, о чем свидетельствовал рост концентраций исследуемых метаболитов NO. Как и в опытах in vitro эндогенный и экзогенный донор оксида азота способствовал падению уровня АФК и, что особенно важно, в плазме опухоленосителя, где наблюдался окислительный и нитрозилирующий стресс. Это подтверждает регуляторное действие NO на функционирование АФК-генерирующей системы. SNP способствовал резкому падению концентрации опухолевых клеток, по-видимому, из-за усиления NO-индуцированного апоптоза. Однако, несмотря на эффективное снижение опухолевого процесса, достоверного увеличения продолжительности жизни опухоленосителя не было отмечено.

Для модуляции окислительного и нитрозилирующего стресса в организме опухоленосителя был использован флавоноид дигидрокверцетин (ДГК). Впервые было установлено, что при инъекциях ДГК кроме снижения окислительного стресса в крови наблюдается значительное усиление нитрозилирующего стресса, выраженного в сильной МО-зависимой модификации белков. По-видимому, этот факт обусловлен способностью ДГК активировать синтез оксида азота эндотелиальными клетками, т.к. известно, что флавоноиды стимулируют эндотелиальные клетки к выработке N0 через увеличение уровня внутриклеточного кальция. В тоже время при инъекциях ДГК обнаружено уменьшение окислительной модификации белков в плазме опухоленосителя. Это обусловлено антиоксидантными свойствами ДГК и способностью флавоноидов ингибировать активность НАДФН-оксидазы. В то же время в зоне роста опухоли, как было показано, отсутствуют значительные изменения в уровне метаболитов N0. Такая ситуация обусловлена, по-видимому, ингибирующим действием флавоноидов на синтез индуцибельной МО-синтазы через воздействие на транскрипционный фактор КБ- кВ. В зоне роста опухоли практически отсутствуют другие источники оксида азота, кроме активированных макрофагов и транспорта модифицированных белков из плазмы, а введенный ДГК ингибирует синтез N0 у фагоцитов, снижая тем самым синтез N0 в зоне роста опухоли. Инъекции ДГК не вызывали негативного действия, способствовали увеличению продолжительности жизни опухоленосителя.

Объединяя все известные и полученные эффекты от воздействия ДГК на организм опухоленосителя, можно заключить, что данный флавоноид может быть использован для разработки протоколов терапии патологических процессов, связанных с развитием окислительного и нитрозилирующего стрессов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Наумов, Андрей Анатольевич, Пущино

1. Андреева НА, Шуматова ТА, and Мотавкин ПА. Нитрооксидергические нейроны органов дыхания. Бюл эксперим биологии и медицины 129(2): 222-224, 2000.

2. Брюне Б, Сандау К, and фон Кнетен А. Апоптотическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации и антагонистические сигнальные пути. Биохимия 63(7): 966—975, 1998.

3. Горен АКФ, and Б. М. Универсальная и комплексная энзимология синтазы оксида азота. Биохимия 636(7): 870-880, 1998.

4. Караванова ИД, Банников ГА, and Троянский СМ. Различия в экспрессии прекератина и виментина в органной и монослойной культурах гепатоцитов крысы. Цитология 27(9): 1039-1043., 1987.

5. Луъ\енко СБ, Фельдман НБ, Туманов СГ, and Северин СЕ. Молекулярные механизмы противоопухолевой активности антибиотиков антрациклинового ряда. Вопр мед и фарм химии 2: 3-9, 2001.

6. Малышев ИЮ, and Манухина ЕБ. Стресс, адаптация и оксид азота Биохимия 63(7): 881-904, 1998.

7. Манухина ЕБ, and Малышев ИЮ. Роль оксида азота в сердечнососудистой патологии: взгляд патофизиолога. Российский кардиологический журнал 5: 55-63, 2000.

8. Меньшиков ВВ. Лабораторные методы исследования в клинике. М: Медицина 1987

9. Недоспаев АА. Биогенный NO в конкурентных отношениях. Биохимия 63(7): 881-904, 1998.

10. Попова НА. Модели экспериментальной онкологии. Соросовский образоват журн 6: 33-38, 2000.

11. Поцелуева ММ, Пустовидко АВ, Алабин ВС, and Евтодиенко ЮВ. Генерагщя реактивных форм кислорода полиморфноядерными лейкоцитами в процессе развития гепатомы в брюшной полости животного. Цитология 41(2): 162-166, 1999.

12. Поцелуева ММ, Пустовидко АВ, Ковалева ЕВ, Шаталин ЮВ, Евтодиенко ЮВ. Цитотоксическое действие полиморфноядерных лейкоцитов на опухолевые и нормальные клетки in vitro и in vivo. Цитология 71(1): 57-63, 2005.

13. Реутов ВП, and Сорокина ЕГ. NO-синтазная и нитритредуктазная компоненты цикла оксида азота. Биохимия 63(7): 1029-1040, 1998.

14. Сандау К, and фон Кнетен А. Апоптотическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации и антагонистические сигнальные пути. . Биохимия 63(7): 966-975, 1998.

15. Серов ВВ, and Пауков ВС. Воспаление. М: Медицина 1995.

16. Тэйлор jЕС. Индуцибельная синтаза оксида азота в печени: регуляг^ия «функции». Биохимия 63(7): 905-923, 1998.

17. Шаталин ЮВ, Наумов АА, and Поцелуева ММ. Изменение состава клеточных популяций и уровня активных форм кислорода в крови и в асцитической жидкости опухоленосителя. Цитология 52(2): 131-135, 2010.

18. Abramson SB. Nitric oxide in inflammation and pain associated with osteoarthritis. Arthritis Res Ther 10 Suppl 2: S2, 2008.

19. Ackermann MF, Lamm KR, Wiegand GW, and Luster MI. Antitumor activity of murine neutrophils demonstrated by cytometric analysis. Cancer Res 49: 528-532, 1989.

20. Ackermann R. Comments on the contribution by K.-J. Neumarker et al. Borrelia encephalitis and catatonia in adolescents. Nervenarzt (1989) 60:115-119. Nervenarzt 60: 765, 1989.

21. Albina JE, and Reichner JS. Role of nitric oxide in mediation of macrophage cytotoxicity and apoptosis. Cancer Metastasis Rev 17: 39-53, 1998.

22. Albina JE, Mahoney EJ, Daley JM, Wesche DE, Morris SM, Jr., and Reichner JS. Macrophage arginase regulation by CCAAT/enhancer-binding protein beta. Shock 23: 168-172, 2005.

23. Alvarez B, Rubbo H, Kirk M, Barnes S, Freeman BA, and Radi R. Peroxynitrite-dependent tryptophan nitration. Chem Res Toxicol 9: 390-396, 1996.

24. Arnelle DR, and Stamler JS. NO+, NO, and NO- donation by S-nitrosothiols: implications for regulation of physiological functions by S-nitrosylation and acceleration of disulfide formation. Arch Biochem Biophys318: 279-285, 1995.

25. Balkwill F. Chemokine biology in cancer. Semin Immunol 15: 49-55, 2003.

26. Bermudes D, and Joiner KA. The role of parasites in generating evolutionary novelty. Parasitol Today 9: 458-463, 1993.

27. Billiau AD, Wouters CH, and Lagae LG. Epilepsy and the immune system: is there a link? Eur JPaediatr Neurol 9: 29-42, 2005.

28. Single L, Brown NJ, and Lewis CE. The role of tumour-associated macrophages in tumour progression: implications for new anticancer therapies. J Pathol 196: 254-265, 2002.

29. Bingle L, Singleton V, and Bingle CD. The putative ovarian tumour marker gene HE4 (WFDC2), is expressed in normal tissues and undergoes complex alternative splicing to yield multiple protein isoforms. Oncogene 21: 27682773, 2002.

30. Biswas S, Raoult D, and Rolain JM. Molecular characterization of resistance to macrolides in Bartonella henselae. Antimicrob Agents Chemother 50: 3192-3193, 2006.

31. Biswas SK, and Lopes de Faria JB. Hypertension induces oxidative stress but not macrophage infiltration in the kidney in the early stage of experimental diabetes mellitus. Am J Nephrol 26: 415-422, 2006.

32. Bolat F, Kayaselcuk F, Nursal TZ, Yagmurdur MC, Bal N, andDemirhan B. Microvessel density, VEGF expression, and tumor-associated macrophages in breast tumors: correlations with prognostic parameters. J Exp Clin Cancer Res 25: 365-372, 2006.

33. Boutard V, Havouis R, Fouqueray B, Philippe C, Moulinoux JP, and Baud L. Transforming growth factor-beta stimulates arginase activity in macrophages. Implications for the regulation of macrophage cytotoxicity. J Immunol 155: 2077-2084, 1995.

34. Brown GC, and Cooper CE. Nanomolar concentrations of nitric oxide reversibly inhibit synaptosomal respiration by competing with oxygen at cytochrome oxidase. FEBS Lett 356: 295-298, 1994.

35. Cabrera C, and Bohr D. The role of nitric oxide in the central control of blood pressure. Biochem Biophys Res Commun 206: 77-81, 1995.

36. Caltagirone S, Rossi C, Poggi A, Ranelletti FO, Natali PG, Brunetti M, Aiello FB, and Piantelli M. Flavonoids apigenin and quercetin inhibit melanoma growth and metastatic potential. Int J Cancer 87: 595-600, 2000.

37. Cannon RO, 3rd, Schechter AN, Panza JA, Ognibene FP, Pease-Fye ME,

38. Waclawiw MA, Shelhamer JH, and Gladwin MT. Effects of inhaled nitric oxide on regional blood flow are consistent with intravascular nitric oxide delivery. J Clin Invest 108: 279-287, 2001.

39. Ceradini DJ, Kulkarni AR, Callaghan MJ, Tepper OM, Bastidas N, Kleinman ME, Capla JM, Galiano RD, Levine JP, and Gurtner GC. Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction ofSDF-1. Nat Med 10: 858-864, 2004.

40. Chang CJ, Tai KF, Roffler S, and Hwang LH. The immunization site of cytokine-secreting tumor cell vaccines influences the trafficking of tumor-specific T lymphocytes and antitumor efficacy against regional tumors. J Immunol 173: 6025-6032, 2004.

41. Chang MK, Binder CJ, Miller YI, Subbanagounder G, Silverman GJ, Berliner JA, and Witztum JL. Apoptotic cells with oxidation-specific epitopes are immunogenic and proinflammatory. J Exp Med 200: 13591370, 2004.

42. Condeelis J, and Pollard JW. Macrophages: obligate partners for tumor cell migration, invasion, and metastasis. Cell 124: 263-266, 2006.

43. Cooper CE. Nitric oxide and iron proteins. Biochim Biophys Acta 1411: 290-309, 1999.

44. Cremers B, Flesch M, Sudkamp M, and Bohm M. Effects of the novel T-type calcium channel antagonist mibefradil on human myocardial contractility in comparison with nifedipine and verapamil. J Cardiovasc Pharmacol 29: 692-696, 1997.

45. Culotta VC, Klomp LW, Strain J, Casareno RL, Krems B, and Gitlin JD. The copper chaperone for superoxide dismutase. J Biol Chem 272: 2346923472, 1997.

46. Czapski G, and Goldstein S. The role of the reactions of .NO with superoxide and oxygen in biological systems: a kinetic approach. Free Radic Biol Med 19: 785-794, 1995.

47. Deem S, Gladwin MT, Berg JT, Kerr ME, and Swenson ER. Effects of S-nitrosation of hemoglobin on hypoxic pulmonary vasoconstriction and nitric oxide flux. Am J Respir Crit Care Med 163: 1164-1170, 2001.

48. DeMaster EG, Ouast BJ, Redfern B, and Nagasawa HT. Reaction of nitric oxide with the free salfhydryl group of human serum albumin yields a sulfenic acid and nitrous oxide. Biochemistry 34: 11494-11499, 1995.

49. Deonarain R, Verma A, Porter AC, Gewert DR, Platanias LC, and Fish EN. Critical roles for IFN-beta in lymphoid development, myelopoiesis, and tumor development: links to tumor necrosis factor alpha. Proc Natl Acad Sci USA 100:13453-13458, 2003.

50. Dicks AP, and Williams DL. Generation of nitric oxide from S-nitrosothiols using protein-bound Cu2+ sources. Chem Biol 3: 655-659, 1996.

51. Dirkx ML, de Boer JC, and Heijmen BJ. Improvement of radiotherapy treatment delivery accuracy using an electronic portal imaging device. Radiat Prot Dosimetry 121: 70-79, 2006.

52. EwingJF, and Janero DR. Specific S-nitrosothiol (thionitrite) quantification as solution nitrite after vanadium(III) reduction and ozone-chemiluminescent detection. Free Radic Biol Med 25: 621-628, 1998.

53. Flavahan NA. Atherosclerosis or lipoprotein-induced endothelial dysfunction. Potential mechanisms underlying reduction in EDRF/nitric oxide activity. Circulation 85: 1927-1938, 1992.

54. Fotsis T, Pepper MS, Aktas E, Breit S, Rasku S, Adlercreutz H, Wahala K, Montesano R, and Schweigerer L. Flavonoids, dietary-derived inhibitors of cell proliferation and in vitro angiogenesis. Cancer Res 57: 2916-2921, 1997.

55. Frears ER, Zhang Z, Blake DR, O'Connell JP, and Winyard PG. Inactivation of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 by peroxynitrite. FEBS Lett 381: 21-24, 1996.

56. Fujimori H, and Pan-Hou H. Effect of nitric oxide on L-3H.glutamate binding to rat brain synaptic membranes. Brain Res 554: 355-357, 1991.

57. Furlong B, Henderson AH, Lewis MJ, and Smith J A. Endothelium-derived relaxing factor inhibits in vitro platelet aggregation. Br J Pharmacol 90: 687-692, 1987.

58. Ganster RW, Taylor BS, Shao L, and Geller DA. Complex regulation of human inducible nitric oxide synthase gene transcription by Stat 1 and NF-kappaB. Proc Natl Acad Sci USA 98: 8638-8643, 2001.

59. Goldstein S, and Czapski G. The reaction of NO. with 02.- and H02.: a pulse radiolysis study. Free Radic Biol Med 19: 505-510, 1995.

60. Goldstein S, Squadrito GL, Pryor WA, and Czapski G. Direct and indirect oxidations by peroxynitrite, neither involving the hydroxyl radical. Free Radic Biol Med 21: 965-974, 1996.

61. Gorbunov NV, Osipov AN, Day BW, Zayas-Rivera B, Kagan VE, and Elsayed NM. Reduction of ferrylmyoglobin and ferrylhemoglobin by nitric oxide: a protective mechanism against ferryl hemoprotein-induced oxidations. Biochemistry 34: 6689-6699, 1995.

62. Gordon S. Do macrophage innate immune receptors enhance atherogenesis? Dev Cell 5: 666-668, 2003.

63. Gow AJ, and Stamler JS. Reactions between nitric oxide and haemoglobin under physiological conditions. Nature 391: 169-173, 1998.

64. Granger DL, Hibbs JB, Jr., Perfect JR, and DurackDT. Metabolic fate ofL-arginine in relation to microbiostatic capability of murine macrophages. J Clin Invest 85: 264-273, 1990.

65. Grasemann H, and Ratjen F. Cystic fibrosis lung disease: the role of nitric oxide. Pediatr Pulmonol 28: 442-448, 1999.

66. Grasemann H, Gartig SS, Wiesemann HG, Teschler H, Konietzko N, and Ratjen F. Effect of L-arginine infusion on airway NO in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia syndrome. Eur Respir J13: 114-118, 1999.

67. Grasemann H, Yandava CN, and Drazen JM. Neuronal NO synthase (NOS1) is a major candidate gene for asthma. Clin Exp Allergy 29 Suppl 4: 39-41, 1999.

68. Green LC, Tannenbaum SR, and Fox JG. Nitrate in human and canine milk. N Engl J Med 306: 1367-1368, 1982.

69. Green SJ, Nacy CA, and Meltzer MS. Cytokine-induced synthesis of nitrogen oxides in macrophages: a protective host response to Leishmania and other intracellidar pathogens. JLeukoc Biol 50: 93-103, 1991.

70. Gupta S, Afaq F, Mukhtar H. Involvement of nuclear factor-kappa B, Bax and Bcl-2 in induction of cell cycle arrest and apoptosis by apigenin in human prostate carcinoma cells. Oncogene 2002; 21: 3727-38.

71. Gupta S, and Keane S. Renal enlargement as a primary presentation of acute lymphoblastic leukaemia. Br J Radiol 58: 893-895, 1985.

72. Hayashi T, Yamada K, Esaki T, Kuzuya M, Satake S, Ishikawa T, Hidaka H, and Iguchi A. Estrogen increases endothelial nitric oxide by a receptor-mediated system. Biochem Biophys Res Commun 214: 847-855, 1995.

73. Hayashi T, Yamada K, Esaki T, Mutoh E, and Iguchi A. Effect of estrogen on isoforms of nitric oxide synthase: possible mechanism of anti-atherosclerotic effect of estrogen. Gerontology 43 Suppl 1: 24-34, 1997.

74. Hiratsuka T. The interaction of Phe472 with a fluorescent inhibitor bound to the complex of myosin subfragment-1 with nucleotide. Biochemistry 45: 1234-1241, 2006.

75. Hogg N, and Kalyanaraman B. Nitric oxide and lipid peroxidation. Biochim Biophys Acta 1411: 378-384, 1999.

76. Hogg N, Kalyanaraman B, Joseph J, Struck A, and Parthasarathy S. Inhibition of low-density lipoprotein oxidation by nitric oxide. Potential role in atherogenesis. FEBS Lett 334: 170-174, 1993.

77. Hogg N, Struck A, Goss SP, Santanam N, Joseph J, Parthasarathy S, and Kalyanaraman B. Inhibition of macrophage-dependent low density lipoprotein oxidation by nitric-oxide donors. J Lipid Res 36: 1756-1762, 1995.

78. Hornung RL, Young HA, Urba WJ, and Wiltrout RH. Immunomodulation of natural killer cell activity by flavone acetic acid: occurrence via induction of interferon alpha/beta. J Natl Cancer Inst 80: 1226-1231, 1988.

79. Hughes MN. Chemistry of nitric oxide and related species. Methods in enzymology 02(436): 3-19, 2008.

80. Huie RE, and Padmaja S. The reaction of no with superoxide. Free Radic Res Commim 18: 195-199, 1993.

81. Hunt JA, Moisidis E, and Haertsch P. Initial experience of Integra in the treatment of post-burn anterior cervical neck contracture. Br J Plast Surg 53: 652-658, 2000.

82. Inoue S, and Kawanishi S. Oxidative DNA damage induced by simultaneous generation of nitric oxide and superoxide. FEBS Lett 371: 86-88, 1995.

83. Ischiropoulos H, Zhu L, and Beckman JS. Peroxynitrite formation from macrophage-derived nitric oxide. Arch Biochem Biophys 298: 446-451, 1992.

84. Ischiropoulos H, Zhu L, Chen J, Tsai M, Martin JC, Smith CD, and Beckman JS. Peroxynitrite-mediated tyrosine nitration catalyzed by superoxide dismutase. Arch Biochem Biophys 298: 431-437, 1992.

85. Ishimura N, Bronk SF, and Gores GJ. Inducible nitric oxide synthase up-regulates Notch-1 in mouse cholangiocytes: implications for carcinogenesis. Gastroenterology 128:1354-1368, 2005.

86. Ishimura Y, Gao YT, Panda SP, Roman LJ, Masters BS, and Weintraub ST. Detection of nitrous oxide in the neuronal nitric oxide synthase reaction by gas chromatography-mass spectrometry. Biochem Biophys Res Commun 338: 543-549, 2005.

87. Jourd'heuil D, Gray L, and Grisham MB. S-nitrosothiol formation in blood of lipopolysaccharide-treated rats. Biochem Biophys Res Commun 273: 2226, 2000.

88. Jourd'heuil D, Hallen K, Feelisch M, and Grisham MB. Dynamic state of S-nitrosothiols in human plasma and whole blood. Free Radic Biol Med 28: 409-417, 2000.

89. Kleinert H, Schwarz PM, and Forstermann U. Regulation of the expression of inducible nitric oxide synthase. Biol Chem 384: 1343-1364, 2003.

90. Kosaka H, and Seiyama A. Physiological role of nitric oxide as an enhancer of oxygen transfer from erythrocytes to tissues. Biochem Biophys Res Commun 218: 749-752, 1996.

91. Kozlov AV, Staniek K, and Nohl H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS Lett 454: 127-130, 1999.

92. Langford EJ, Wainwright RJ, and Martin JF. Platelet activation in acutemyocardial infarction and unstable angina is inhibited by nitric oxide donors. Arterioscler Thromb Vase Biol 16: 51-55, 1996.

93. Lee JH, Yang ES, and ParkJW. Inactivation of NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase by peroxynitrite. Implications for cytotoxicity and alcohol-induced liver injury. J Biol Chem 278: 51360-51371, 2003.

94. Lee SC, Dickson DW, Brosnan CF, and Casadevall A. Human astrocytes inhibit Cryptococcus neoformans growth by a nitric oxide-mediated mechanism. J Exp Med 180: 365-369, 1994.

95. Leek RD, and Harris AL. Tumor-associated macrophages in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia 7: 177-189, 2002.

96. Lefer AM, and Lefer DJ. Endothelial dysfunction in myocardial ischemia and reperfusion: role of oxygen-derived free radicals. Basic Res Cardiol 86 Suppl 2: 109-116, 1991.

97. Lefer AM, Johnson G, 3rd, Ma XL, Tsao PS, and Thomas GR. Cardioprotective and endothelial protective effects of Ala-IL8.77 in a rabbit model of myocardial ischaemia and reperfusion. Br J Pharmacol 103: 1153-1159, 1991.

98. Lefer AM, Tsao PS, Lefer DJ, and Ma XL. Role of endothelial dysfunction in the pathogenesis of reperfusion injury after myocardial ischemia. FASEB J 5: 2029-2034, 1991.

99. Lepoivre M, Fieschi F, Coves J, Thelander L, and Fontecave M. Inactivation of ribonucleotide reductase by nitric oxide. Biochem Biophys Res Commun 179: 442-448, 1991.

100. Lepoivre M, Raddassi K, Oswald I, Tenu JP, and Lemaire G. Antiproliferative effects of NO synthase products. Res Immunol 142: 580583; discussion 591-582, 1991.

101. Lewis CE, and Pollard JW. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res 66: 605-612, 2006.

102. Li D, Shirakami G, Zhan X, and Johns RA. Regulation of ciliary beat frequency by the nitric oxide-cyclic guanosine monophosphate signaling pathway in rat airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol 23: 175181, 2000.

103. Liang YC, Huang YT, Tsai SH, Lin-Shiau SY, Chen CF, Lin JK. Suppression of inducible cyclooxygenase and inducible nitric oxide synthase by apigenin and related flavonoids in mouse macrophages. Carcinogenesis 1999; 20: 1945-1952.

104. Lin KT, Xae JY, Nomen M, Spur B, and Wong PY. Peroxynitrite-induced apoptosis in HL-60 cells. J Biol Chem 270: 16487-16490, 1995.

105. Liu SX, Fabisiak JP, Tyurin VA, Borisenko GG, Pitt BR, Lazo JS, andKagan VE. Reconstitution of apo-superoxide dismutase by nitric oxide-induced copper transfer from metallothioneins. Chem Res Toxicol 13: 922-931, 2000.

106. LiuX, Miller MJ, Jos hi MS, Thomas DD, and Lancaster JR, Jr. Accelerated reaction of nitric oxide with 02 within the hydrophobic interior of biological membranes. Proc Natl Acad Sci USA 95: 2175-2179, 1998.

107. Luo Y, and Wei YO. The regulating roles of angiopoietins/TEK-2 in angiogenesis. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi 23: 63-66, 2006.

108. Luo Y, He DL, Ning L, Shen SL, Li L, and Li X Hypoxia-inducible factor-lalpha induces the epithelial-mesenchymal transition of human prostatecancer cells. Chin Med J (Engl) 119: 713-718, 2006.

109. Luo Y, Zhou H, Krueger J, Kaplan C, Lee SH, Dolman C, Markowitz D, Wu W, Liu C, Reisfeld RA, and Xiang R. Targeting tumor-associated macrophages as a novel strategy against breast cancer. J Clin Invest 116: 2132-2141, 2006.

110. Malinski T, Bailey F, Zhang ZG, and Chopp M. Nitric oxide measured by a porphyrinic microsensor in rat brain after transient middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab 13: 355-358, 1993.

111. Malinski T, Kapturczak M, Dayharsh J, and Bohr D. Nitric oxide synthase activity in genetic hypertension. Biochem Biophys Res Commun 194: 654658, 1993.

112. Malinski T, Radomski MW, Taha Z, and Moncada S. Direct electrochemical measurement of nitric oxide released from human platelets. Biochem Biophys Res Commun 194: 960-965, 1993.

113. Malinski T, Taha Z, Grunfeld S, Patton S, Kapturczak M, and Tomboulian P. Diffusion of nitric oxide in the aorta wall monitored in situ by porphyrinic microsensors. Biochem Biophys Res Commun 193: 1076-1082, 1993.

114. Mannick JB, Asano K, Izumi K, Kieff E, and Stamler JS. Nitric oxideproduced by human B lymphocytes inhibits apoptosis and Epstein-Barr virus reactivation. Cell 79: 1137-1146, 1994.

115. Mannick JB, Hausladen A, Liu L, Hess DT, Zeng M, Miao QX, Kane LS, Gow AJ, and Stamler JS. Fas-induced caspase denitrosylation. Science 284: 651-654, 1999.

116. Mantovani A, Bottazzi B, Colotta F, Sozzani S, and Ruco L. The origin and function of tumor-associated macrophages. Immunol Today 13: 265-270, 1992.

117. Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, and Sica A. Macrophage polarization: tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends Immunol 23: 549-555, 2002.

118. Mantovani A. La mala educacion of tumor-associated macrophages: Diverse pathways and new players. Cancer Cell 17: 111-112, 2010.

119. Martin S, Andriambeloson E, Takeda K, Andriantsitohaina R. Red wine polyphenols increase calcium in bovine aortic endothelial cells: a basis to elucidate signalling pathways leading to nitric oxide production. Br J Pharmacol 2002;135: 1579-1587.

120. Maruyama W, Hashizume Y, Matsubara K, and Naoi M. Identification of 3-nitro-L-tyrosine, a product of nitric oxide and superoxide, as an indicator of oxidative stress in the human brain. J Chromatogr B Biomed Appl 676: 153158, 1996.

121. Mayer B, Pfeiffer S, Schrammel A, Koesling D, Schmidt K, and Brunner F. A new pathway of nitric oxide/cyclic GMP signaling involving S-nitrosoglutathione. J Biol Chem 273: 3264-3270, 1998.

122. McCall T, and Vallance P. Nitric oxide takes centre-stage with newly defined roles. Trends Pharmacol Sci 13: 1-6, 1992.

123. McCall TB, Palmer RM, and Moncada S. Interleukin-8 inhibits the induction of nitric oxide synthase in rat peritoneal neutrophils. Biochem Biophys Res Commun 186: 680-685, 1992.

124. McMahon TJ, Exton Stone A, Bonaventura J, Singel DJ, and Solomon Stamler J. Functional coupling of oxygen binding and vasoactivity in S-nitrosohemoglobin. J Biol Chem 275: 16738-16745, 2000.

125. Melillo G, Musso T, Sica A, Taylor LS, Cox GW, and Varesio L. A hypoxia-responsive element mediates a novel pathway of activation of the inducible nitric oxide synthase promoter. J Exp Med 182: 1683-1693, 1995.

126. Melkova Z, and Esteban M. Inhibition of vaccinia virus DNA replication byinducible expression of nitric oxide synthase. J Immunol 155: 5711-5718, 1995.

127. Middleton E, Jr., Kandaswami C, Theoharides TC. The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer. Pharmacol Rev2000; 52: 673-751

128. Mills CD. Molecular basis of "suppressor" macrophages. Arginine metabolism via the nitric oxide synthetase pathway. J Immunol 146: 27192723, 1991.

129. Mohammad Javaid Akhtar FTB, Martin N. Hughes. Reaction of nitric oxide with hyponitrous acid: a hydrogen atom abstraction reaction. Inorg Chem 24 (12): 1934-1935, 1985.

130. Мог E, Tur-Kaspa R, Sheiner P, and Schwartz M. Treatment of hepatocellular carcinoma associated with cirrhosis in the era of liver transplantation. Ann Intern Med 129: 643-653, 1998.

131. Moreno JJ, and Pryor WA. Inactivation of alpha 1 -proteinase inhibitor by peroxynitrite. Chem Res Toxicol 5: 425-431, 1992.

132. Morris SM, Jr. Regulation of enzymes of the urea cycle and arginine metabolism. Annu Rev Nutr 22: 87-105, 2002.

133. Motta M, Ferlito L, Malaguarnera L, Vinci E, Bos со S, Maugeri D, and Malaguarnera M. Alterations of the lymphocytic set-up in elderly patients with cancer. Arch Gerontol Geriatr 36: 7-14, 2003.

134. Muller A, Homey B, Soto H, Ge N, Catron D, Buchanan ME, McClanahan T, Murphy E, Yuan W, Wagner SN, Barrera JL, Mohar A, Verastegui E, and Zlotnik A. Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis. Nature 410: 50-56, 2001.

135. Munder M, Mallo M, Eichmann K, and Modolell M. Murine macrophages secrete interferon gamma upon combined stimulation with interleukin (IL)-12 and IL-18: A novel pathway of autocrine macrophage activation. J Exp Med 187: 2103-2108, 1998.

136. Munoz-Fernandez MA, Fernandez MA, and Fresno M. Activation of human macrophages for the killing of intracellular Trypanosoma cruzi by TNF-alpha and IFN-gamma through a nitric oxide-dependent mechanism.1.munol Lett 33: 35-40, 1992.

137. Mur E, Zabernigg A, Hilbe W, Eisterer W, Halder W, and Thaler J. Oxidative burst of neutrophils in patients with rheumatoid arthritis: influence of various cytokines and medication. Clin Exp Rheumatol 15: 233237, 1997.

138. Murphy ME, and Sies H. Reversible conversion of nitroxyl anion to nitric oxide by superoxide dismutase. Proc Natl Acad Sei USA 88: 10860-10864, 1991.

139. Nathan CF, and Hibbs JB, Jr. Role of nitric oxide synthesis in macrophage antimicrobial activity. Curr Opin Immunol 3: 65-70, 1991.

140. Olszanecki R, Geb ska A, Kozlovski VI, and Gryglewski RJ. Flavonoids and nitric oxide synthase. Journal of physiology and pharmacology : an official journal of the Polish Physiological Society 53: 571-584, 2002

141. O'Sidlivan C, Lewis CE, Harris AL, and McGee JO. Secretion of epidermal growth factor by macrophages associated with breast carcinoma. Lancet 342: 148-149, 1993.

142. Palluy O, and Rigaud M. Nitric oxide induces cultured cortical neuron apoptosis. Neurosci Lett 208: 1-4, 1996.

143. Palmer RM, Ashton DS, and Moncada S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature 333: 664-666, 1988.

144. Palmer RM, Rees DD, Ashton DS, and Moncada S. L-arginine is the physiological precursor for the formation of nitric oxide in endothelium-dependent relaxation. Biochem Biophys Res Commun 153: 1251-1256, 1988.

145. Paulus WJ, Vantrimpont PJ, and Shah AM. Acute effects of nitric oxide on left ventricular relaxation and diastolic distensibility in humans. Assessment by bicoronary sodium nitroprusside infusion. Circulation 89: 2070-2078, 1994.

146. Peet GW, Li J. IkappaB kinases alpha and beta show a random sequential kinetic mechanism and are inhibited by staurosporine and quercetin. J Biol Chem 1999; 274: 32655-32661

147. Pufahl RA, Singer CP, Peariso KL, Lin SJ, Schmidt PJ, Fahrni CJ, Culotta VC, Penner-Hahn JE, and O'Halloran TV. Metal ion chaperone function of the soluble Cu(I) receptor Atxl. Science 278: 853-856, 1997.

148. Pustovidko AV, Potselueva MM, and Evtodienko YV. Generation of reactive oxygen species by polymorphonuclear leukocytes and its modulation bycalcium ions during tumor growth. IUBMB Life 50: 69-73, 2000.

149. Radi R, Beckman JS, Bush KM, and Freeman BA. Peroxynitrite oxidation of sulfhydryls. The cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. J Biol Chem 266: 4244-4250, 1991.

150. Radi R, Beckman JS, Bush KM, and Freeman BA. Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. Arch Biochem Biophys 288: 481-487, 1991.

151. Ramaekers F, Puts J, Moesker O, Kant A, Jap P, and Vooijs P. Demonstration of keratin in human adenocarcinomas. Am J Pathol 111: 213-223, 1983.

152. Rand MJ, and Li CG. Discrimination by the NO-trapping agent, carboxy-PTIO, between NO and the nitrergic transmitter but not between NO and EDRF. Br J Pharmacol 116: 1906-1910, 1995.

153. Rossig L, Fichtlscherer B, Breitschopf K, Haendeler J, Zeiher AM, Mulsch

154. A, and Dimmeler S. Nitric oxide inhibits caspase-3 by S-nitrosation in vivo. J Biol Chem 274: 6823-6826, 1999.

155. S.M. M. Arginine metabolism:boundaries of or knowledge. Jr Nutrition 137(6 Suppl 2): 1602-1609.

156. Saccani A, Schioppa T, Porta C, Biswas SK, Nebuloni M, Vago L, Bottazzi

157. B, Colombo MP, Mantovani A, and Sica A. p50 nuclear factor-kappaB overexpression in tumor-associated macrophages inhibits Ml inflammatory responses and antitumor resistance. Cancer Res 66: 11432-11440, 2006.

158. Saleem M, and Ohshima H. Xanthine oxidase converts nitric oxide to nitroxyl that inactivates the enzyme. Biochem Biophys Res Commun 315: 455-462, 2004.

159. Salgo MG, Stone K, Squadrito GL, Battista JR, and Pry or WA. Peroxynitrite causes DNA nicks in plasmid pBR322. Biochem Biophys Res Commun 210: 1025-1030, 1995.

160. Saran M, Michel C, and Bors W. Reaction of NO with 02-. implications for the action of endothelium-derived relaxing factor (EDRF). Free Radic Res Commun 10: 221-226, 1990.

161. Schioppa T, Uranchimeg B, Saccani A, Biswas SK, Doni A, Rapisarda A,

162. Bernasconi S, Saccani S, Nebuloni M, Vago L, Mantovani A, Melillo G, and Sica A. Regulation of the chemokine receptor CXCR4 by hypoxia. J Exp Med 198: 1391-1402, 2003.

163. Schmidt HH, Hofmann H, Schindler U, Shutenko ZS, Cunningham DD, and Feelisch M. No .NO from NO synthase. Proc Natl Acad Sci USA 93: 14492-14497, 1996.

164. Schwartsburd PM, and Lankin VZ. Endogenous induction of transient oxidant-imbalances in Ehrlich cells as a possible trigger to fast tumor fluid accumulation. Med Oncol 12: 203-207, 1995.

165. Schwartsburd PM, and Lankin VZ. Lipoproteins in hypoxic tumor cells as traps of free radicals. Med Oncol 11: 101-110, 1994.

166. Selemidis S, Dusting GJ, Peshavariya H, Kemp-Harper BK, and Drummond GR. Nitric oxide suppresses NADPH oxidase-dependent superoxide production by S-nitrosylation in human endothelial cells. Cardiovasc Res 75: 349-358, 2007.

167. Selemidis S, Sobey CG, Wingler K, Schmidt HH, and Drummond GR. NADPH oxidases in the vasculature: molecular features, roles in disease and pharmacological inhibition. Pharmacol Ther 120: 254-291, 2008.

168. Selemidis S. Suppressing NADPH oxidase-dependent oxidative stress in the vasculature with nitric oxide donors. Clin Exp Pharmacol Physiol 35: 13951401, 2008.

169. Semenza GL. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med 54: 17-28, 2003.

170. Semenza GL. Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer 3: 721732, 2003.

171. Shafirovich V, and Lymar SV. Nitroxyl and its anion in aqueous solutions: spin states, protic equilibria, and reactivities toward oxygen and nitric oxide. Proc Natl Acad Sci USA 99: 7340-7345, 2002.

172. Shaw AWV, A. J. Solubility of nitric oxide in aqueous and nonaqueous solvents. J Chem Soc Faraday Trans 8: 1239—1244, 1977.

173. Sica A, and Bronte V. Altered macrophage differentiation and immunedysfunction in tumor development. J Clin Invest 117: 1155-1166, 2007.

174. Sica A, Schioppa T, Mantovani A, and Allavena P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised popidation promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. Eur J Cancer 42: 717727, 2006.

175. Silkojf PE, McClean PA, Caramori M, Slutsky AS, and Zamel N. A significant proportion of exhaled nitric oxide arises in large airways in normal subjects. Respir Physiol 113: 33-38, 1998.

176. Sneddon JM, and Vane JR. Endothelium-derived relaxing factor reduces platelet adhesion to bovine endothelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 85: 2800-2804, 1988.

177. Solinas G, Germano G, Mantovani A, and Allavena P. Tumor-associated macrophages (ТАМ) as major players of the cancer-related inflammation. J Leukoc Biol 86: 1065-1073, 2009.

178. Soriano FG, Lorigados CB, Pacher P, and Szabo C. Effects of a potent peroxynitrite decomposition catalyst in murine models of endotoxemia and sepsis. Shock 35: 560-566, 2011.

179. Stamler JS, Goldman ME, Gomes J, Matza D, and Horowitz SF. The effect of stress and fatigue on cardiac rhythm in medical interns. J Electrocardiol 25: 333-338, 1992.

180. Stamler JS, Jaraki O, Osborne J, Simon DI, Keaney J, Vita J, Singel D, Valeri CR, and Loscalzo J. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. Proc Natl Acad Sci U S A 89: 7674-7677, 1992.

181. Stamler JS, Jia L, Eu JP, McMahon TJ, Demchenko IT, Bonaventura J, Gernert K, and Piantadosi CA. Blood flow regulation by S-nitrosohemoglobin in the physiological oxygen gradient. Science 276: 20342037, 1997.

182. Stamler JS, Loh E, Roddy MA, Currie KE, and Creager MA. Nitric oxide regulates basal systemic and pulmonary vascular resistance in healthy humans. Circulation 89: 2035-2040, 1994.

183. Stamler JS, Simon DI, Jaraki O, Osborne JA, Francis S, Mullins M, Singel D, and Loscalzo J. S-nitrosylation of tissue-type plasminogen activator confers vasodilatory and antiplatelet properties on the enzyme. Proc Natl AcadSci USA 89: 8087-8091, 1992.

184. Stamler JS, Singel DJ, and Loscalzo J. Biochemistry of nitric oxide and its redox-activatedforms. Science 258: 1898-1902, 1992.

185. Stamler JS. Redox signaling: nitrosylation and related target interactions of nitric oxide. Cell 78: 931-936, 1994.

186. Stepuro I, Chaikovskaya N, Piletskaya T, and Solodunov A. Glutathione oxidation under the action of sodium nitrite on hemoglobin. Pol J Pharmacol 46: 601-607, 1994.

187. Stone JR, Sands RH, Dunham WR, and Marietta MA. Electron paramagnetic resonance spectral evidence for the formation of a pentacoordinate nitrosyl-heme complex on soluble guanylate cyclase. Biochem Biophys Res Commun 207: 572-577, 1995.

188. Stout NL. Cancer prevention in physical therapist practice. Phys Ther 89: 1119-1122, 2009.

189. Summersgill JT, Powell LA, Buster BL, Miller RD, and Ramirez JA. Killing of Legionella pneumophila by nitric oxide in gamma-interferon-activated macrophages. J Leukoc Biol 52: 625-629, 1992.

190. T. Logager KSaJH. Radiat Phis Chem 97: 5451-5456, 1993.

191. Talks KL, and Harris AL. Current status of antiangiogenic factors. Br J Haematol 109: 477-489, 2000.

192. Tanner P, Onaca O, Balasubramanian V, Meier W, and Palivan CG. Enzymatic cascade reactions inside polymeric nanocontainers: a means to combat oxidative stress. Chemistry 17: 4552-4560, 2011.

193. Tauber AI, Fay JR, Marietta MA. Flavonoid inhibition of the human neutrophil NADPH-oxidase. Biochem Pharmacol 1984; 33:1367-1369.

194. Taylor WF, and Bishop VS. A role for nitric oxide in active thermoregulatory vasodilation. Am J Physiol 264: H1355-1359, 1993.

195. Trichopoulos D, Li FP, and Hunter DJ. What causes cancer? Sci Am 275: 80-87, 1996.

196. Troy CM, Derossi D, Prochiantz A, Greene LA, and Shelanski ML. Downregulation of Cu/Zn superoxide dismutase leads to cell death via the nitric oxide-peroxynitrite pathway. JNeurosci 16: 253-261, 1996.

197. Tsuda Y, Takahashi H, Kobayashi M, Hanafusa T, Herndon DN, and Suzuki F. Three different neutrophil subsets exhibited in mice with different susceptibilities to infection by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Immunity 21: 215-226, 2004.

198. Vanin AF, Malenkova IV, and Serezhenkov VA. Iron catalyzes both decomposition and synthesis of S-nitrosothiols: optical and electron paramagnetic resonance studies. Nitric Oxide 1: 191-203, 1997.

199. Vanin AF, Mordvintcev PI, Hauschildt S, and Mulsch A. The relationship between L-arginine-dependent nitric oxide synthesis, nitrite release and dinitrosyl-iron complex formation by activated macrophages. Biochim Biophys Acta 1177: 37-42, 1993.

200. Vanin AF. Endothelium-derived relaxing factor is a nitrosyl iron complex with thiol ligands. FEBS Lett 289: 1-3, 1991.

201. Virag L, Scott GS, Antal-Szalmas P, O'Connor M, Ohshima H, and Szabo C.

202. Requirement of intracellular calcium mobilization for peroxynitrite-induced poly(ADP-ribose) synthetase activation and cytotoxicity. Mol Pharmacol 56: 824-833, 1999.

203. Wennmalm A, Benthin G, Edlund A, Jungersten L, Kieler-Jensen N, Lundin S, Westfelt UN, Petersson AS, and Waagstein F. Metabolism and excretion of nitric oxide in humans. An experimental and clinical study. Circ Res 73: 1121-1127, 1993.

204. Williams DL. Nitrosating agents: is peroxynitrite a likely candidate? Nitric Oxide 1: 522-527, 1997.

205. Williams DL. S-nitrosothiols and role of metal ions in decomposition to nitric oxide. Methods Enzymol 268: 299-308, 1996.

206. Williams EA, Quinlan GJ, Anning PB, Goldstraw P, and Evans TW. Lung injury following pulmonary resection in the isolated, blood-perfused rat lung. Eur Respir J14: 745-750, 1999.

207. Wizemann TM, and Laskin DL. Effects of acute endotoxemia on production of cytokines and nitric oxide by pulmonary alveolar and interstitial macrophages. Ann N YAcad Sci 730: 336-337, 1994.

208. Wizemann TM, Gardner CR, Laskin JD, Quinones S, Durham SK, Goller NL, Ohnishi ST, and Laskin DL. Production of nitric oxide and peroxynitrite in the lung during acute endotoxemia. JLeukoc Biol 56: 759-768, 1994.

209. Wong PS, Hyun J, Fukuto JM, Shirota FN, DeMaster EG, Shoeman DW, and Nagasawa HT. Reaction between S-nitrosothiols and thiols: generation of nitroxyl (UNO) and subsequent chemistry. Biochemistry 37: 5362-5371, 1998.

210. Wong PS, Hyun J, Fukuto JM, Shirota FN, DeMaster EG, Shoeman DW, and Nagasawa HT. Reaction between S-nitrosothiols and thiols: generation of nitroxyl (HNO) and subsequent chemistry. Biochemistry 37: 5362-5371, 1998.

211. Xie Q, Nathan C. The high-output nitric oxide pathway: role and regulation. J Leukoc Biol 1994; 56: 576-682.

212. Yamagishi S, and Matsui T. Nitric oxide, a janus-faced therapeutic target for diabetic microangiopathy-Friend or foe? Pharmacol Res 64: 187-194, 2011.

213. Yang ES, Richter C, Chun JS, Huh TL, Kang SS, and Park JW. Inactivation ofNADP(+)-dependent isocitrate dehydrogenase by nitric oxide. Free Radic Biol Med 33: 927-937, 2002.

214. Yin K, Lai PS, Rodriguez A, Spur BW, and Wong PY. Antithrombotic effectsof per oxy nitrite: inhibition and reversal of aggregation in human platelets. Prostaglandins 50: 169-178, 1995.

215. Yousefipour Z, Oyekan A, and Newaz M. Interaction of oxidative stress, nitric oxide and peroxisome proliferator activated receptor gamma in acute renal failure. Pharmacol Ther 125: 436-445, 2010.

216. Zhang J, and Snyder SH. Nitric oxide in the nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol 35: 213-233, 1995.

217. Zhu L, Gunn C, and Beckman JS. Bactericidal activity of peroxynitrite. Arch Biochem Biophys 298: 452-457, 1992.1. Благодарности.

218. Я благодарен своим родителям, которые всегда мне помогали и давшие достойное образование. Я благодарен своим друзьям и коллегам за понимание и поддержку, спасибо вам всем.

Информация о работе

Наумов, Андрей Анатольевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Метаболиты оксида азота и их модуляция при развитии гепатомы Зайделя - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Метаболиты оксида азота и их модуляция при развитии гепатомы Зайделя ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Метаболиты оксида азота и их модуляция при развитии гепатомы Зайделя"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Наумов, Андрей Анатольевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Метаболиты оксида азота и их модуляция при развитии гепатомы Зайделя"

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Наумов, Андрей Анатольевич

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Наумов, Андрей Анатольевич, Пущино

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Метаболиты оксида азота и их модуляция при развитии гепатомы Зайделя
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика