Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хемотаксис нейтрофилов: ключевая роль фосфоинозитид 3-киназы y и Rho-семейства ГТФ-связывающих белков

ВАК РФ 03.00.00, Биологические науки

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидат биологических наук, Катанаев, Владимир Леонидович, Фрибург

62 12/43

Институт Биохимии

Университет Фрибурга (Швейцария)

Хемотаксис нейтрофилов: ключевая роль фосфоинозитид 3-киназы у и Rho-семейства ГТФ-связывающих белков

ДИССЕРТАЦИЯ

представлена Факультету Наук Университета Фрибурга (Швейцария) для получения степени Doctor rerum naturalium

Владимиром JI. Катанаевым из

Красноярска, Россия

Диссертационный номер 1289 Механография Университета Фрибург 2000

Institut de Biochimie Université de Fribourg (Suisse)

Neutrophil Chemotaxis: Crucial Role of Phosphoinositide 3-Kinase y and Rho Family GTP-Binding Proteins

THESE

présentée à la Faculté des Sciences de l'Université de Fribourg (Suisse) pour l'obtention du grade de Doctor rerum naturalium

par

Vladimir L. Katanaev de

Krasnoyarsk, Russie

Thèse No 1289 Mécanography de l'Université Fribourg 2000

Acceptée par la Faculté des Sciences de l'Université de Fribourg (Suisse) sur la proposition du Dr. Matthias P. Wymann, du Prof. Michael Way et du Prof. Verena Niggli.

Fribourg, le 25.01.2000

Le Doyen

Prof. Beat Hirsbrunner

Le directeur de thèse

Dr. Matthias P. Wymann

УДК 577.352.5

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ПЕРЕДАЧА СИГНАЛА ПРИ ХЕМОТАКСИСЕ НЕЙТРОФИЛОВ

Обзор © 2001 г. B.JI. Катанаев

Institute of Biochemistry, University of Fribourg, Rue du Musee 5, CH-1700 Fribourg, Switzerland. Columbia University, College of Physicians and Surgeons, 701 West 168th Street, room 1120, New York, NY10032, USA; Tel: +1 2123053192; Fax: +12123053562; E-mail: vlkll@columbia.edu

Поступила в редакцию 11.08.2000

Обзор рассматривает современные знания о путях внутриклеточной передачи сигнала, контролирующих хемотаксис нейтрофилов и подобных им клеток. Большинство действующих на нейтрофилы хемоаттрак-тантов связывается с рецепторами, имеющими семь трансмембранных спиралей. Эти рецепторы в свою очередь активируют трехсубъединичные G-белки класса G,. В дальнейшей передаче внутриклеточного сигнала принимают участие фосфолипазы Cß, фосфоинозитид 3-киназа у, а также белки, содержащие РН-до-мен. Ключевое значение для способности клеток к движению имеет актиновый цитоскелет, контролируемый GTP-связывакяцими белками семейства Rho. Связующими звеньями между ними и актином могут служить Р1Р5-киназа, LIM-киназа, киназа и фосфатаза легкой цепи миозина, или белки, подобные WASP. В обзоре также представлены новые данные о возможных путях регуляции «компаса» хемотактирующих клеток, составляющими компонентами которого могут являться Cdc42 и некоторые белки, содержащие РН-домен.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: хемотаксис нейтрофилов, внутриклеточная передача сигнала, рецепторы, сопряженные с G-белками, Р13-киназы, белки семейства Rho, полимеризация актина.

I. ФИЗИОЛОГИЯ И МОРФОЛОГИЯ ХЕМОТАКСИСА НЕЙТРОФИЛОВ

Нейтрофилы (полиморфоядерные лейкоциты) составляют более половины циркулирующих белых кровяных клеток у человека и во многом обеспечивают защиту от микроорганизмов. Дисфункции нейтрофилов, такие как различные формы нейтропении [1], дефицит адгезии нейтрофилов [2] или хронический грануломатоз [3], приводят к тяжелым формам подверженности больных бактериальным инфекциям, что подчеркивает ключевую роль нейтрофилов в обеспечении врожденной формы иммунитета. С другой стороны, гиперактивация нейтрофилов также приводит к патологиям. Такие аномалии, как повреждение при реперфузии [4], васкулит [5], синдром дыхательной недостаточности взрослых [6], или гломерулонефрит [7], свидетельствуют о важном медицинском значении гиперактивации нейтрофилов.

В борьбе с бактериями нейтрофилы пользуются богатым набором методов, таких как фагоцитоз [8], образование кислородных радикалов

[9] и секреция различных ферментов деградации

[10]. Неактивные циркулирующие нейтрофилы являются шарообразными клетками диаметром

около 7 мкм [11]. При стимуляции они резко меняют свою форму в результате образования асимметричных выростов, называемых псевдоподиями и необходимых для миграции. Для входа в воспаленную ткань, нейтрофилы покидают кровоток преимущественно в посткапиллярных венулах. Пересечение нейтрофилом эндотелия кровеносного сосуда происходит в несколько этапов (рис. 1). Нейтрофил касается стенки эндотелия и катится по ней некоторое время, затем плотно присоединяется к эндотелию и, наконец, проникает сквозь него (это явление называется диапедез) [12]. При диапедезе нейтрофил протискивается между эндотелиальными клетками сквозь щель в несколько раз уже его собственного диаметра, демонстрируя замечательную гибкость своих мембран и цитоскелета (рис. 1).

Актиновый цитоскелет абсолютно необходим для амебоидного движения клеток, которое является основным способом клеточного движения у многоклеточных организмов. Передний край мигрирующей клетки обогащен свежепо-лимеризованными филаментами актина [13, 14]. Более того, образование псевдоподий в точности совпадает по времени с увеличением количества полимеризованного актина [15]. С дру-

tissue

postcapillary venule

Рис. 1. Схема миграции нейтрофила из кровеносного сосуда в зараженную бактериями ткань. После стимуляции хемоат-трактантами, нейтрофил проходит через несколько стадий взаимодействия с соседними клетками. Эти стадии пронумерованы на схеме и представляют собой: 1) селектин-зависимое перекатывание нейтрофила по поверхности эндотелия; 2) прочная интегрин-зависимая адгезия нейтрофила на эндотелиальных клетках; 3) диапедез или трансмиграция нейтрофила сквозь стенку кровеносного сосуда; 4) хемотаксис через пост-эндотелиальную ткань к источнику бактериальной инфекции; и 5) уничтожение бактерий посредством фагоцитоза, образования кислородных радикалов и высвобождения содержимого антибактериальных гранул

гой стороны, ингибирование полимеризации актина делает хемотаксис невозможным [16—19]. Эти и другие данные явились основой широко распространенной теории, согласно которой полимеризация актина является движущей силой продвижения переднего края мигрирующей клетки [20, 21].

Хемотаксис нейтрофилов изучался in vitro на двумерных поверхностях и в трехмерных гелях. Эти исследования, а также эксперименты с

нейтрофилами в суспензии, позволили обнаружить удивительную периодичность в поведении нейтрофилов после их стимуляции (см. обзор [22]). Оказалось, что суспендированные нейтро-филы при стимуляции каждые 8 с изменяют форму путем осцилляторного вытягивания и втягивания псевдоподий [23]. Та же 8-с периодичность изменения формы была обнаружена и при миграции нейтрофилов по поверхности [24, 25]. В дополнение к быстрым 8-с осцилляциям,

каждые 45-60 с мигрирующий нейтрофил прерывает движение, чтобы возобновить его иногда в ином направлении. Это происходит в результате реполяризация клетки и, по-видимому, необходимо для выбора нейтрофилом правильного направления движения [22]. Таким образом, миграция нейтрофилов контролируется двумя наложенными друг на друга молекулярными часами, обеспечивающими реакцию клеток на разнообразные стимулы.

II. ХЕМОАТТРАКТАНТЫ И ИХ РЕЦЕПТОРЫ В ХЕМОТАКСИСЕ НЕЙТРОФИЛОВ

1. «Неклассические» хемоаттрактанты и их рецепторы. В ходе исследований было идентифицировано большое количество агонистов, вызывающих in vitro у нейтрофилов хемотаксис (направленную миграцию) или хемокинез (миграцию в случайном направлении). «Классические» хемоаттрактанты активируют рецепторы, сопряженные с G-белками. Однако хемотаксис и хемокинез нейтрофилов могут вызывать и стимуляторы, активирующие рецепторы других типов.

Например, фактор колониеобразования гра-нулоцитов (granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF) и фактор колониеобразования грануло-цитов и макрофагов (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) способны вызывать у нейтрофилов хемокинез, но не хемотаксис [26-28]. G-CSF и GM-CSF играют важную роль в гематопоэзе [29, 30]. Они связываются с мономерными (в случае G-CSF) или гетеро-димерными (в случае GM-CSF) рецепторами, активирующими серин-треонин-тирозинкиназы, называемые Janus-киназами (Jaks) [31].

Фактор некроза опухолей a (tumor necrosis factor а, TNFa) может вызывать хемотаксис нейтрофилов [32-34], стимулируя кластерооб-разование рецепторов TNF и внутриклеточную передачу сигнала через множественные некаталитические белок-белковые взаимодействия. На поверхности нейтрофилов имеется два типа рецепторов TNF [35]. Рецептор р75 (CD120b) передает сигнал внутрь клетки с помощью так называемых белков, связанных с рецептором TNF (TNF receptor-associated proteins, TRAPs). С другой стороны, в передаче сигнала от другого рецептора TNF, р55 (CD120a) принимают участие белки, содержащие домен смерти (death-domain) [36, 37]. Рецептор р55 отвечает за хемотаксис макрофагов [38], однако в настоящий момент неизвестно, какой из рецепторов TNF стимулирует хемотаксис нейтрофилов.

Лимфотоксин (TNFP) связывается с тем же рецептором р75, что и TNFa, однако неясно, способен ли он вызывать хемотаксис нейтрофилов [39, 40]. Fas (Apol/CD95) - еще один представитель класса рецепторов, подобных рецепторам TNF. Во многих клетках стимуляция Fas вызывает апоптоз посредством активации белков с доменами смерти (см. обзор [37]). Недавно было продемонстрировано, что растворимый лиганд для Fas способен вызывать хемотаксис нейтрофилов [41, 42], что, однако, происходит при концентрациях, не способных вызывать апоптоз нейтрофилов, и обусловлено механизмом внутриклеточной передачи сигнала, независимым от доменов смерти [41].

Имеются сообщения о стимуляции хемотаксиса и хемокинеза нейтрофилов соответственно тромбоцитарным фактором роста (platelet-derived growth factor, PDGF) [43] и инсулином [44]. Эти белки активируют рецепторы, относящиеся к семейству тирозинкиназных рецепторов. При связывании с лигандом такие рецепторы гомодимеризуются и фосфорилируют сами себя, что приводит к образованию участков связывания специфических белков-передатчиков сигнала [45].

Наиболее активным из известных до сих пор хемоаттрактантов остается трансформирующий фактор роста |3 (transforming growth factor р, TGFP). Он активирует нейтрофилы уже в фем-томолярных концентрациях. TGFp связывается с серинкиназными рецепторами, что приводит к фосфорилированию внутриклеточных белков, называемых Smads (см. обзор [46]). TGFp является «чистым» хемоаттрактантом, так как в отличие от классических хемоаттрактантов не вызывает у нейтрофилов никакой иной реакции, кроме хемотаксиса [47, 48]. Любопытно, что нейтрофилы, обработанные коклюшным токсином, более не способны реагировать на TGFp [49]. Это означает, что в передаче сигнала от TGFp участвуют трехсубъединичные G-белки. Эти белки играют ключевую роль и во внутриклеточной передаче сигнала от «классических» хемоаттрактантов (см. ниже).

2. Хемоаттрактанты, действующие на серпен-тиновые рецепторы. Можно выделить пять групп «классических» хемоаттрактантов, действующих на лейкоциты через рецепторы, сопряженные с G-белками (такие рецепторы называются также серпентиновыми, или рецепторами с семью трансмембранными спиралями) [50] (рис. 2). Это: 1) N-формилированные пептиды, например fMLP, производные бактериальных белков [51]; 2) фактор активации тромбоцитов (platelet-activating factor, PAF), который производится активированными тромбоцитами, нейтро-

1, fMUP

•и-.м

r,J

Z'-i СНГ-Н-.СН с

NH О VCH.-CH—С' ОН

О

...Л. СНз f I снз

, • ■. ...о А

СН3 Н3С N+ а 0 1 'f

2. PAF СИз О-

Рис. 2. Структуры представителей пяти групп хемоаттрактантов, активирующих на нейтрофилах серпентиновые рецепторы. 1. Химическая структура fMLP (N-formyl-methionyl-leucyl-phenilalanine). Обратите внимание на N-формиловую группу на N-конце пептида (сверху), характерную для бактериальных, но не эукариотических белков. 2. Химическая структура фактора активации тромбоцитов (PAF, platelet activating factor). 3. Химическая структура лейкотриена В4. 4. Структура анафилотоксина С5а в растворе. 5. Структуры хемокинов в растворе: СС-хемокин MIP-1(3 (воспалительный белок макрофагов ip) и СХС-хемокин IL-8 (интерлейкин-8). Трехмерные изображения основаны на опубликованных данных ЯМР: [2971 (С5а), [298] (MIP-ip) и [2991 (IL-8)

филами и другими клетками [52]; 3) лейкотриен В4, образующийся в результате метаболизма арахидоновой кислоты различными миелоид-ными клетками [53]; 4) анафилотоксин С5а, продукт гидролиза фактора комплемента С5 [54]; и наконец, 5) хемокины, семейство белков длиной около 100 аминокислот, синтезируемые в различных тканях [55]. Хемокины содержат

четыре консервативных цистеина, связанных дисульфидными мостиками. В зависимости от того, разделены первые два консервативных цистеина одной аминокислотой или нет, различают два подсемейства хемокинов, СС и СХС [56]. Избыточные концентрации хемокинов стимулируют фагоцитоз нейтрофилов, дыхательный взрыв, дегрануляцию, повышение внут-

риклеточной [Са2+|, а также синтез белка. Напротив, для стимуляции хемотаксиса достаточны низкие, наномолярные концентрации хемокинов.

Представители пяти вышеописанных групп хемоаттрактантов схематически представлены на рис. 2. В настоящее время клонированы рецепторы этих молекул. Несмотря на очевидные различия лигандов, их рецепторы гомологичны и относятся к одной подгруппе рецепторов с семью трансмембранными спиралями [57]. Отличительными структурными чертами серпен-тиновых рецепторов вообще является наличие внеклеточного 1Ч-конца и внутриклеточного С-конца, семи трансмембранных спиралей (ТМ), трех внеклеточных (е1-3) и трех внутриклеточных петель (И-3) (см. рис. 3 и [58, 59]). Серпен-

тиновые рецепторы хемоаттрактантов обладают дополнительными отличительными характеристиками. Это 8-8 мостик между петлями е1 и е2, многочисленные фосфорилируемые серины и треонины на С-конце, высокая кислотность N-конца, короткая положительно заряженная петля 13, и общий размер, нетипично малый для серпентиновых рецепторов (около 350 аминокислот) [60, 57]. Высокоспецифическое связывание лиганда рецепторами может опосредоваться их 1Ч-концом (как в случае связывания С5а с его рецептором [61], 1Ь-8 с рецептором СХСЯ1 [62, 63] и МСР-1 с рецептором ССЯ2 [64]), петлей е1 (связывание ШЬР его рецептором [65]), петлей е2 (связывание СЛОа и КАР2 рецептором СХС112 [63]), или петлей еЗ (связы-

л с -)

. шт /Г: :•: X

[Ca2+] rises

Рис. 3. Схема шагов внутриклеточной передачи сигнала, инициируемых активацией рецептора с семью трансмембранными спиралями. Показана только часть передачи сигнала, опосредованная ßy-гетеродимером. См. описание в тексте. GU-GDP и Ga-GTP : a-субъединица трехсубъединичных G-белков, связанная с GDP или GTP. ßy : ßy-субъединицы трехсубъеди-ничных G-белков. PLCß: фосфолипаза Cß. PIP2: фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат. IP3: инозитол-3,4,5-трифосфат. DAG: диацилглицерол. PKCs: протеинкиназы С. Р13Ку: фосфоинозитид-3-киназау. PIP3: фосфатидилинозитол-3,4,5-трис-фосфат. РН: домен гомологии к плекстрину, PH-домен. PDK: фосфоинозитид-зависимая киназа. РКВ: протеинкиназа В. GEFs: факторы обмена гуаниновых нуклеотидов

вание М1Р-1а рецептором ССЯ1 [64]). Некоторые рецепторы, способные прочно связывать лиганд ТЫ-концом, обладают также участками слабого связывания на внеклеточных петлях [63, 64]. Любопытно, что связывания лиганда с этими низкоаффинными участками достаточно для активации рецептора [63, 64]. Возможно, что активация рецептора в конечном счете всегда зависит именно от контакта внеклеточных петель с лигандом, вне зависимости от расположения участков связывания высокого сродства. Такое предположение выглядит правдоподобным, так как активация рецептором О-белков внутри клетки обеспечивается изменением ориентации трансмембранных спиралей, в особенности ТМЗ и ТМ6 [66-68]. Эта реориентация регулируется консервативным остатком аспара-гиновой кислоты в ТМ2, а также трипептидом Асп-Арг-Тир на границе ТМЗ и петли И [57, 69, 70], и приводит к высвобождению участков связывания с О-белками на петле ¡2 [71, 72], ¡3 [73], или С-конце рецептора [71].

III. ПЕРЕДАЧА СИГНАЛА В НЕЙТРОФИЛАХ СЕРПЕНТИНОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ ХЕМОАТТРАКТАНТОВ

1. Активация трехмерных G-белков

Способность серпентиновых рецепторов вызывать хемотаксис нейтрофилов блокируется коклюшным токсином [74-76]. Это указывает на участие трехсубъединичных G-белков класса Gi, таких как Gai2 и Gai3, в передаче сигнала от рецепторов внутрь клетки [77]. Трехсубъединич-ные G-белки локализованы на внутренней стороне плазматической мембраны и состоят из а-субъединицы, содержащей GDP, и субъединиц ß и у [78]. Активированный серпентиновый рецептор связывается с комплексом главным образом через а-субъединицу [66]. Это ведет к замене GDP на GTP субъединицей а и диссоциации комплекса на ßy и Ga-GTP, которые способны независимо передавать сигнал далее. а-Субъединица является СТРазой, и гидролиз GTP на GDP и фосфат приводит через некоторое время к воссоединению начального трех-субъединичного комплекса, готового к принятию нового сигнала [78].

По всей вероятности, серпентиновые рецепторы активируют хемотаксис через гетеродимер ßy, а не GTP-содержащую а-субъединицу, как считалось ранее [79]. Это подтверждается важными экспериментами, проведенными на культурах лимфоцитоподобных и фибробластопо-добных клеток. При экспрессии соответствую-

щих рецепторов эти клетки способны к хемотаксису. Хемотаксис полностью подавляется коклюшным токсином и, что самое важное, связывающими ру белками Оа-трансдуцином и РАЛК-с! [80, 81]. Напротив, ингибирование ру лишь частично уменьшает мобилизацию хемо-аттрактантами внутриклеточного Са2+, подавление аденилатциклазы или активацию МАР-ки-назы [80, 81]. При высвобождении комплекса Ру, необходимость в Сш для хемотаксиса тут же пропадает [82]. Центральная роль Ру была установлена в пе