Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение активности фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы С и содержания диацилглицерина в соматических нервах при возбуждении

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изменение активности фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы С и содержания диацилглицерина в соматических нервах при возбуждении"

воронежский государственный университет

i l ü

n -i м»П На правах рукописи

С. I i'.'i/Ul i':>JÍ

грунюшк1ш игорь павлович

ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФОСФОИНОЗИТИД-СПЕЦИФИЧНОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ С И СОДЕРЖАНИЯ ДИАЦИЛГЛИЦЕРИНА В СОМАТИЧЕСКИХ НЕРВАХ ПРИ ВОЗБУЖДЕНИИ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВОРОНЕЖ - 1997

Работа выполнена в лаборатории биофизики кафедры биотехно.' гии Мордовского ордена Дружбы народов государственного универс тета им. Н.П. Огарева.

Научный руководитель-

док гор биологических наук, профессор в.в. ревш1 Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор с.и. л кс киов

кандидат биологических наук М.А. наквасин

Ведущая организация - Московский научно-исследовательский и статут общей патологии и патофизиологии РАМН.

Защита диссертации состоится 9) ] 997 ГОда в /3 ^ ча

на заседании диссертационного Совета Д 063. 48. 11 при Воронежскс государственном университете по адресу 394693, г. Воронеж, Униве ситетская площадь, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библи теке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан « £ » ¡у^л^х Я \ 997 г

Ученый секретарь диссертационного Совета,

кандидат биологических наук, ^^¿^/^Г.А. КОВАЛЕВА

доцент

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Изучение физико-химических процессов, роисходящих в нервном волокне при проведении возбуждения зляется на данном этапе одной из важнейших задач биофизики и сйрофизиолопш.

До настоящего времени нет единого мнения о роли фосфоинози--1ДН0Ю обмена в регуляции транспорта кальция в нерве (Третьяк .Г. и др.. 1976; Ревин В.В. и др., 1992). Известно, что ключевым >еном в этом механизме является фосфоинозитид-специфичная осфолипаза С (ФИ-ФЛС), функциональные характеристики которой ручались в основном на гормонстимулируемых клетках центральной грвной системы (Rhee S.G., Choi K.D., 1992; Landau Е.М., et al., 994; Lee S.B., Rhee S.G., 1995; Tsutsumi T. et al., 1995). В то же время еханизм работы этого фермента в нервном волокне практически не вучен.

Результаты многочисленных исследований показывают, что в эльшинстве случаев для функционирования фосфоинозитид-1ецифичной фосфолипазы С необходимы ионы Са2+ (Crooke S.T., ennett C.F., 1989; Frankhauser Н. et at., 1995 ), но каким образом они стивируют фермент, до сих пор неизвестно, хотя недавнр появились юбщения о том, что некоторые изоформы имеют последовательно-:и, сходные с доменом, обеспечивающим высокоаффинное связыва-ie Са2+ в капьмодулине и некоторых других Са2+ связывающих ;лках (Frankhauser Н. et al., 1995; Nakashima S. et al, 1995). озможно также, что необходимость присутствия Са2+ для проявле-1Я активности фермента объясняется тем, что субстратом для него 1ляются не свободные липиды, а фосфоинозитиды (ФИ) в комплексе Са2+ (Crooke S.T., Bennett C.F., 1989; Авдонин П.В., Ткачук В.А., ?94). Зависимость активности фосфоинозитид-специфичной зсфолипазы С от ионов Са2+ на разных объектах охватывает >статочно широкий спектр концентраций (Chau L.Y., Tai H.H., 1982; :itan М, Parker P.I., 1987; llomma Y. et al, 1988; Crooke S.T., Bennett F., 1989), а в нервном волокне при его переходе из состояния покоя состояние возбуждения содержание этих ионов резко меняется taker P.F., Schlaepfer IK, 1975; Максимов Г.В. и др., 1986; Ревин В.В. др., 1990). В связи с этим нам представлялось интересным устано-ггь, имеется ли необходимость в ионах Са2+ для активации фосфои-

нозитид-специфичной фосфолипазы С нервного волокна и какова i оптимальная концентрация.

Учитывая результаты некоторых исследований (Maximov G. I. al., 199]), показывающие изменение величины pH в нерве ri| проведении возбуждения, мы поставили еще одной своей задач! изучение зависимости активности фосфоипозитид-специфичт фосфолипазы С от величины pH, об оптимуме которого для это фермента среди исследователей существуют значительные разногл сия (Chan L.Y.. Tai H.H., 19S2; Graff G. et al., 1984; Irvine R.F. el a 1984; Wilson D.B. el al., 1984).

В клетках, стимулируемых сигнальными молекулами, активаш ФИ-ФЛС осуществляется через G-белки при их взаимодействии ГТФ (Taylor S.J. erat., 1991; Landau E.M. et al., 1994), однако нервных волокнах существование подобного механизма не обнаруж но. Нет также сведений о наличии на поверхности нерва рсцепторо чувствительных к сигнальным молекулам.

В этой связи представляло интерес выяснить, возможна ли aicn вация фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы С и фосфоиноз: тидного цикла при действии ГТФ на нервное волокно.

До настоящего времени не ясно, где локализована фосфоиноз: тид-специфичная фосфолипаза С в мембране или в цитоплазме, хот есть несколько предположений. Например, цитозольный ферме! может просто представлять собой фракцию фосфоинозйти; специфичной фосфолипазы С, которая в норме ассоциирована плазматической мембраной и переходит в цитозоль при гомогениз; ции клеток. Напротив, фосфолипаза С из цитоплазмы может связь ваться с цитоплазматической стороной мембраны при активаци рецептора (Boyer J.L. et al., 1989).

Цель и задачи исследования.

1. Обнаружить акгивность фосфоинозитид-специфичной фосфс липазы С в покоящихся соматических нервах.

2. Показать изменение активности фермента при переходе нерво в функционирующее состояние и установить факторы, повышающи активность фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы С в условия деполяризации мембраны нервного волокна.

3. Исследовать локализацию фермента и взаимосвязь его актиЕ ности с накоплением диацилглицерина в соматических нервах.

Научная новизна работы. Впервые проведены легальные ис следования механизма - активации фосфоинозитид-специфично

- J -

юсфолипазы С в соматических нервах. Определено место ее окализации в нервном волокне. Установлена взаимосвязь между роцессом возбуждения нерва и активацией фосфоинозитид-пецифичной фосфолипазы с. Впервые показано усиление образова-ия диацилглицерина при деполяризации и изучен его жирнокислот-ый состав.

Научно-практическая значимость работы. Результаты иссле-ования позволяют расширить представление о молекулярных еханизмах возникновения и распространения возбуждения по ервному волокну, о роли фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы ' в этом процессе. Данные могут быть использованы для понимания еханизмов патологических изменений, возникающих при поврежде-ии соматических нервов и для разработки способов репарации ервного волокна.

Апробация работы. Основные результаты диссертации докла-ывались на заседаниях секции биофизики Московского общества спытателей природы (Москва, 1992), на V Всероссийской конферен-ии по патологии клетки (Москва, 1993), на Международном импозиуме «Физико-химические основы функционирования белков их комплексов» (Воронеж, 1995), на Огаревских чтениях в Мордов-ком госуниверситете им. Н.П.Огарева (Саранск; 1990-1996).

Публикации результатов работы. По теме диссертации опуб-иковано 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация объемом ^¿страниц ашинописного текста состоит из введения, 3 глав, заключения, ыводов и списка цитируемой литературы, включающего 33 гечественных и / £ ? зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект и методы исследования. Объектом исследования слу-или седалищные нервы и головной мозг кролика породы Шиншилла Jryctolagus cunicvlus), а также липиды и ФИ-ФЛС, выделенные из их. '

После препаровки по стандартным методам седалищные нервы ролика выдерживали в растворе Рингера, содержащем 0,1 мМ NaCl, мМ КО, 1 мМ CaCh, 1мМ MgS04, 25 мМ А'аН2СОг, 3 мМ NaH2P04, Э мМ сбнцоб в течение 1 часа при температуре 37° с и продувании ислородом. На опыт отбирали нервные волокна, дававшие четкие

потенциалы действия при внеклеточном отведении со следующим параметрами стимуляции: амплитуда 1,5 В, длительность - 0,3 ли частота раздражения 200 гшп/с. Раздражение проводили во влажно термостатируемой камере с двумя парами платиновых раздражающи и отводящих электродов. Стимуляцию осуществляли электрическим! прямоугольными импульсами от стимулятора ЭСЛ-2 (Россия] Потенциал действия наблюдали на экране осциллографа С1-8! (Россия). Нервы помещались так, чтобы на раздражающих электрода: находилась небольшая дистальная часть проводника. Контроле« служили нервные волокна, не подвергавшиеся никакому возденет вию, но выдержанных в аналогичных условиях, что и опытные.

Выделение липидов осуществляли методами Блайя-Дайера (Bligl Е., Dyer W., 1959), Фолча с соавторами (Folch J. et al.,1957) i модификации Прохоровой (Прохорова М.И. и др., 1967), Госвами Гоулда (Goswami S.K., Gould R.M., 1985).

Дня препаративного разделения липидов методом ТСХ применя ли силикагель марки КСК Воскресенского химкомбината и Kieselge 60 gipshalting фирмы «Merk» (Германия).

Кроме пластинок, приготовленных в нашей лаборатории, использовались готовые пластинки фирмы «Merk» (Германия), а такж£ произведенные в Эстонии.

Для лучшего разделения липидов хроматографические пластины импрегнировали 0,3 % оксалатом калия в качестве Са2+-хелатирующего агента (Gonsales-Sastre F. et al., 1968), затем прогревали их в течение 30 мин. при температуре 110-120°С.

Разделение липидов проводили в системах растворителей Роузе-ра (Rouser G. et al., 1967). Для разделения фосфоинозитидов использовали систему Фолча (Folch J. et al, 1957). Диглицериды выделяли по методу Мангольда (Mangold Н.К., 1969). На хроматограммах пятна липидов идентифицировали, используя специфические окрашивающие реагенты (Anker L„ Sonanini D., 1963; Shaw N., 1968; Vaskovsky KE. et al., 1975; Сшютина Н.Ф., 1978; Кирхнер /О., 1981) и стандарты («свидетели»).

Метилирование жирных кислот (ЖК) проводили с помощью раствора трехфтористого бора в метаноле (Morrison W.R., Smith L.M., 1964). Анализ метиловых эфиров ЖК проводили методом газожидкостной хроматографии на газовом хроматографе «Chrom-5» (Чехословакия) с нелинейным программированием температуры. В качестве твердого носителя использовали хромосорб G/AW GMDS

Лнглия) с зернением 0,16-0,2 мм, а в качестве неподвижной жидкой (азы - 1,4-бутандиолсукцинат (3%). Кроме этого использовалась еподвижная жидкая фаза «Silar-10C» (10%) на хромосорбе W/HP с ернением 0,125-0,15 мм (Serva, США).

Количественный анализ полученных хроматограмм проводили в оответствии с описанными в литературе методами (Литвинов Л.Д., 'уденкоБ.А., 1971; Коган Л.А., 1975; Вигдергауз М.С., 1978).

Для обсчета хроматограмм использовали компьютерную про-рамму, специально разработанную сотрудниками нашей лаборато-ии.

Выделение ФИ-ФЛС проводили следующим образом: после фик-}ции жидким азотом нервы гомогенизировали в соответствующем уфере. Неразрушенный остаток удаляли центрифугированием на иьтрацентрифуге «UP-65» (Германия) при 12 000 об/мин. в течение [) минут, а экстракт фильтровали и центрифугировали на той же ентрифуге 90 минут при 38 000 об/мин. В осадке (мембранная ракция) и в супернатанте (цитозольная фракция), определяли стивность ФИ-специфичной фосфолипазы С по модифицированному етоду Палмера (Palmer F., ¡985). Метод основан на последователь-эм проведении двух ферментативных реакций: гидролиз ФИ ФИ-тецифичной фосфолипазой С и гидролиз соответствующего «озитол фосфата (продукт фосфолипазной реакции) щелочной осфатазотГс последующим измерением количества неорганического осфора в, инкубационной среде, которое мы проводили с помощью гактрофотометра «Specol-10» (Германия).

Результаты обрабатывали статистически на персональном ком-.ютере с использованием программы «STAT-2», разработанной в ¿числительном центре нашего университета.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

активность фосфоинозитид-специфичной 'осфолипазы с в нерве в покое и при возбужднии.

Распространение возбуждения по соматическим нервам сопро-ждается значительными изменениями в метаболизме инозитидов евин В'.В. и др. 1992), а в связи с тем, что в обмене ФИ ключевую 'Ль играет ФИ-ФЛС представляло интерес исследовать изменение тивности фермента при возбуждении нерва. Для этого из покоя-

щихся нервов и нервов, подвергнутых 5 минутной стимуляци электрическими импульсами частотой 200 Гц и амплитудой 1,5 £ выделяли цитозольную и мембраносвязанную фракции фермента определяли их активность при использовании в качестве субстрат ТФИ. Нужно отметить, что цитозольная ФИ-ФЛС составлял основную часть от общего количества выделенного фермента.

В состоянии покоя нерва нами была зарегистрирована активност ФИ-ФЛС на уровне 27,1 нМ Р, /мин/мг белка для цитозольно фракции и 11,0 нМ Р;/мин/мг белка для мембранной фракции.

При стимуляции активность фосфолипазы С в цитозольно фракции практически не менялась. В этих же условиях происходил ее увеличение в мембранной фракции на 44% относительно урони покоя (рис.1).

||М И/мим/мг белка

ЗО

25 20 15 Ю 5 О

tgmp! ттл

нитозоль pH 6,1)

мсм&рщ(а pH 7,U

I I покой

1Ш стимуляция 200 нпп/с, Я мин

Рис. 1. Влияние электростимуляции нерва на активность фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы С.

То, что подавляющая часть ФИ-специфичной фосфолипазы С обнаружена нами в цитозольной фракции нерва, в то время Kat фосфоинозитиды локализованы на плазматической мембран« {Eichberg J„ Hauser G., 1973), можно объяснить тем, что фермент связанный с мембранами в интактных аксонах, в цитоплазм) поступает при разрушении нерва в ходе гомогенизации (Boyer J.L. е, ai, 1989).

Необходимо особо отметить, что активация ФИ-специфичной фосфолипазы С происходит именно в мембранах нервного волокна то есть там, где in vivo локализованы фосфоинозитиды и осуществляется их гидролиз.

ВЛИЯНИЕ К"-ДЕПОЛЯРИЗАЦИИ НА АКТИВНОСТЬ ФОСФО-

ИНОЗИТИД-СПЕЦИФИЧНОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ С В НЕРВЕ,

Результаты многих исследований, в том числе и нашей лаборато-ии, свидетельствуют, что деполяризация мембраны приводит к нтенсификации ФИ-цикла, поскольку она сопровождается накопле-ием продуктов метаболизма фосфоинозитидов (диацилглицерина ЦЛГ) и инозитолтрифосфата (ИФз)). Интересным представлялось зучить механизм активации ФИ-ФЛС в этом процессе.

Для решения задачи мы вызывали деполяризацию добавлением в нкубационную среду 100 мМ К+. О факте деполяризации судили по зменению величины потенциала действия. Через 30 минут выделяли з нерва ФИ-ФЛС и определяли ее активность при использовании азных субстратов ( монофосфоинозитидов (МФИ), дифосфоинози-ядов (ДФИ) и трифосфоинозитидов (ТФИ)).

Результаты эксперимента, представленные на рис. 2, указывают а повышение активности фермента при гидролизе всех 3-х фракций нозитидов МФИ, ДФИ, ТФИ, соответственно, на 61%, 27% и 33% о сравнению с активностью ФИ-ФЛС, выделенной из покоящегося грва.

Увеличение активности можно объяснить тем, что при деполяри-щии открываются потенциалчувствительные кальциевые каналы, го приводит к значительному повышению уровня в!гутриклеточного шьция (Максимов Г.В. а др., 1986; Ревин В.В. и др., 1990; Костюк .Г., 1992). Кроме того, из литературных источников известно, что зны калия стимулируют транспорт Са2+ из глионов в межклеточное юстранство (Lazarewicz J.W. et а!., ¡977). Другим объяснением ожег служить ю, что при изменении мембранного потенциала еняется и структурное состояние мембраны, что может облегчить клупность субстрата для фермента (Irvine R.F. et al., 1984).

По всей видимости, все эти механизмы принимают участие в ггивации ФИ-специфичной фосфолипазы С.

Наибольший процент увеличения активности при использовании качестве субстрата МФИ, вероятно, связан с тем, что для гидролиза ого инозитида требуются большие концентрации ионов Са2+, чем 1я распада ПФИ (Crooke S.T., Bennett C.F., /989), что и обеспечивает

К+-деполяризация. В то же время такая концентрация кальция можс оказывать ингибиругощее действие на гидролиз ДФИ и ТФИ (Kata М., Parker Р.1., 1987).

нМ ri/мип/мг белка

60 50 т

40 т

I

30 Т -

20

Ю О | -

l и

МФ11 Д<1>П ТФИ

I Iпокой

+

ЕЗК деполяризация 100 мМ К Рис. 2. Влияние К* деполяризации на активность фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы С.

Таким образом, поступление ионов кальция в нерв при деполяризации, а также происходящие структурные изменения в мембране I частности, в жирнокислотной части фосфолипидов (Николаев В.Т., Ревин В.В.,.1995), являются основной причиной изменения активности фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы С:

ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ ФОСФОИНОЗИТИД-СПЕЦИФИЧНОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ С - ФЕНИЛ МЕТИЛСУЛЬФОНИЛФТОРИДА И НЕОМИЦИПА ПА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТА ПРИ К - ДЕПОЛЯРИЗАЦИИ.

В предыдущих сериях работы было установлено, что в условиях К+-деполяризации происходит интенсификация ФИ-обмена за счет активации ФИ-ФЛС.

Для того, чтобы однозначно заключить, что интенсификация метаболизма ФИ связана именно с их гидролизом ФИ-ФЛС. а не с замедлением биосинтетических процессов, мы поставили опыт в котором деполяризацию проводили при использовании ингибиторов ФИ-ФЛС -фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) и неомицина.

Результаты экспериментов показали, что в условиях К+-1еполяризации ФМСФ снижает активность ФИ-ФЛС при использо->ании в качестве субстратов ДФИ и ТФИ относительно контрольного /ровня на 36 и 38 % соответственно. При гидролизе МФИ нами было ^регистрировано увеличение фосфолипазной активности на 49%, соторое можно объяснить тем, что в процессе распада этого инозити-1а, вероятно принимает участие изоформа, для которой ФМСФ шляется менее специфичным ингибитором, чем для тех, которые саталнзируют распад Г1ФИ.

Нужно отметить, что при действии только калиевой деполяриза-дни активность ФИ-ФЛС при использовании субстратов МФИ, ДФИ, ГФИ увеличилась на 84%; 24,5%; 24,4% соответственно по сравненное покоем (табл. 1). . .

Таблица 1.

Влияние фснилметилсульфонилфторида (ЮмМ) на активность фоефоинозитнд-спепифичной фосфолипазы С в условиях К+-де11олярнзацнн (100мМ К+).

Воздействие Активность фермента (нМ /мин/мг белка)

МФИ ДФИ ТФИ

Покой 11,4 ± 0,40 53,0 ± 3,50 45,0 ± 0,80

деполяризация 21,0 ± 0,40 66,0 ± 2,20 56,0 + 1,00

С"- деполяризация 1- ФМСФ 17,0 ± 0,20 34,0 ± 0,60 28,0 ± 0,70

Полученные нами результаты являются свидетельством того, ч активный распад ФИ при деполяризации мембраны происходит п] непосредственном участии ФИ-ФЛС.

В связи с тем, что изменения, происходящие в метаболизме Ф при проведении возбуждения, имеют принципиальное значение, провели опыт с более специфичным ингибитором ФИ-ФЛС неомицином.

Для этого инкубировали нервы в растворе Рингера, содержаще 2 мМ неомицина, а также 100 мМ ионов К+ + 2 мМ неомицина.

Результаты проведенного исследования представлены в таблш 2, из которой видно, что при использовании в качестве субстрат МФИ неомицин снижает фосфолипазную активность в недеполяр! зованном нерве почти в 3 раза относительно контрольного уровн Ингибирующий эффект во фракциях ДФИ и ТФИ соответствени равен 36% и 47%.

Таблица:

Изменение активности фосфоинозитид-специфичной фосфолмпа зы С при действии неомицина в условиях К+-деполяршации.

Воздействие Активность фермента (нМ Р, /мин/мг белка)

МФИ ДФИ ТФИ

Покой 9,50 ± 0,30 29,5 ± 1,50 40,5 ± 2,50

Неомицин 3,30 ± 0,10 19,0 ± 1,00 21,4 ± 0,60

К+-деполяризация + неомицин 8,30 ± 0,20 22,4 ± 1,60 28,8 ± 3,30

При совместном действии деполяризации и ингибитора мы обна-»ужили, что активность фермента по сравнению с покоем при ^пользовании в качестве субстрата МФИ снижалась на 13%, при идролизе других фракций наблюдали более значительное понижение ;ктивности: ДФИ - на 24%, ТФИ - на 29%.

Сравнивая величины активности ФИ-ФЛС при действии ингиби-ора в условиях деполяризации с результатами опытов, проведенных >ез воздействия ингибитора, можно сделать вывод, что активность )ермента при деполяризации падала на меньшую величину. Значит, |ри совместном воздействии, с одной стороны, наблюдается ктивация фермента К+-деполяризациен посредством ионов Са2 \ с ¡ругой - воздействие ингибитора.

Таким образом, мы можем заключить, что неомицин в концен-рации 2 мМ существенно ингибирует активность фосфоинозитид-пецифичной фосфолипазы С, а фермент является ключевым в зменении состава фосфоинозитидов при возбуждении нерва.

ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ НА АКГИВ-ЮСТЬ ФОСФОИНОЗИТИД-СПЕЦИФИЧНОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ С

Как уже отмечалось выше, в результате деполяризации концен-рация Са2+ в нерве возрастает (Максимов Г.В. и др., 1986; Реенн В.В. др., 1990). Известно также, что ФИ-ФЛС в большинстве объектов сследования является Са2+-зависимым ферментом (Сгооке Б.Т., еппеП С.Р., 1989; РгапкИаизег Н. е1 а!., 1995 ). Поэтому мы провели пыты по изучению влияния разных концентраций ионов Са2+ на ггивность ФИ-ФЛС в нерве.

Для решения этой задачи фосфолипазную реакцию проводили в эеде, содержащей 0,05; 0,1; 0,5; 1; 1,5 и 2 мМ СаС1г, а также в среде, е содержащей свободных ионов Са2+, т.е. в присутствии 1 мМ ДТА. Активность определяли в мембранной и цитозольной ракциях покоящегося седалищного нерва при оптимальных тчениях рН. Данные измерений представлены на рис. 3.

Из рисунка видно, что активность ФИ-ФЛС зависит от концен->ации ионов Са2+ в исследуемом диапазоне.

нМ П/мин/мг белка

-•-Цитозольлая ФЛС ** Мембранная ФЛС

Рис. 3. Зависимость активности фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы Сот концентрации ионов кальция.

Так, повышение уровня СаСЬ в реакционной среде от 0,05 до мМ имеет небольшой стимулирующий эффект на активное! цитозольной фракции. Дальнейшее повышение концентрации ионе Са2+ (до 2 мМ СаС12) слегка ингибирует фермент. В случае мембр; несвязанной ФИ-ФЛС активность максимальна при наличии в сред 0,1 мМ СаСЬ, причем по сравнению с 0,05 мМ концентрацией он увеличилась в 1,8 раза. Более высокие концентрации СаС12 вызываю снижение активности.

Изменение' величины активности мембраносвязанной ФИ-ФЛ( при изменении концентрации Са2+ позволяет сделать вывод о том, чт эта фракция проявляет более четкую кальциевую зависимость, че; цитозольная. Возможно, немаловажную роль в этом случае и грае Са2'-связывающая способность Г1ФИ, локализованных в мембране.

Интересно, что в нашем случае определенный уровень фосфоли пазной активности выявляется и при полном отсутствии свободны ионов Са2+ в среде.

Для исследования активности ФИ-ФЛС в бсскальниевой среде [ри использовании различных субстратов мы пропели следующий ксперимснт. В среду, омывающую нерв, добавили 1 мМ ЭД'ГЛ для олного связывания свободных ионов Са2^. Контролем служили ервы, находящиеся в растворе Риигера, содержащем СаСЬ в онцентрации 1 мМ.

Из результатов эксперимента, представленных на рис. 4, видно, то активность фермента в присутствии ОДТА по сравнению с онтролем уменьшалась мри использовании в качестве субстрата 4ФИ на 57%, ДФИ на 32%. Изменения активности ФИ-ФЛС при идролизе ТФИ недостоверны.

нМ 1'|/м ни/М1 мелка

50

40 30 20 10 О

МФИ

ДФИ

X

*

1

1

тч>н

I 11мМ СаСЛ2

® Бескальциеюя среда

*ис 4. Активности фосфоинозитид-специфичной фосфолилазы С в бескальииевой среде.

На основании этих данных мы предположили, что в нерве со-фжатся формы фосфолипазы С, которые отличаются между собой )одством к ионам Са2+. Кроме того, не исключено, что гидролиз ФИ осуществляет мембраносвязанная форма фермента, а в примем->анном слое концентрация ионов Са2+ выше, чем в цитоплазме и >этому кальцийсвязывающий эффект ЭДТА проявляется здесь в гньшей степени.

ВЛИЯНИЕ ВЕРАПАМИЛА НА АКТИВНОСТЬ ФОСФОИНОЗИТИ: СПЕЦИФИЧНОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ С.

В литературе широко дискутируется вопрос о роли фосфоиноз1 тидов в регуляции транспорта кальция (Третьяк А.Г. и др., 197с Ревин В.В. и др., 1992). В связи с тем, что ключевой фермент реакци гидролиза ФИ кальцийзависим, встает вопрос, через какие мембра1 ные структуры ионы кальция, активирующие ФИ-ФЛС, поступают цитоплазму. Для ответа на нею мы провели опыты, в когоры использовали блокатор Са2+-каналов - вераламил в концентрации 10 М. Исследование проводили в условиях деполяризации.

При блокировании Са2'-каналов в условиях К'-деполяризации М1 наблюдали снижение активности фосфолиназы С по сравнению активностью, регистрируемой в отсутствии верапамила (рис.5).

Следовательно, активация фермента происходит при посту гик нии ионов Са2+ через кальциевые каналы. Уменьшение активност фермента проявляется неодинаково для разных субстратов в эти условиях. Наиболее четко эффект выражен при использовании качестве субстрата МФИ, где мы наблюдали снижение активности н 92%, т.е. фосфолипаза С практически не работала. Это еще од к доказательство необходимости большей концентрации Са2+ дл гидролиза МФИ. Во фракциях ДФИ и ТФИ фосфолипазная актив ность падала на 15% и 12% соответственно (рис. 5).

% КС КАНТршиО

тво —

150 ж

120

ЭО

60 ЗО

О -I Ш

Д<1»И

ТФИ

I I покой

Ш К^леиширнициа ЮОмМ К+

БВ К,л»-1ю-'|Н1Ш(.|ИИЫ ЮОмМ К++1М;ря11яМ11л10^У1

Рис. 5. Влияние верапамила на активность фосфоинозитид-специфичной фосфолиназы С в условиях К+ деполяризации.

Итак, сравнивая результаты по активности фосфоинозитнд-пецифичиой фосфолипазы С при деполяризации и данные по эвместному влиянию деполяризации и всрапамила, можно отметить, го блокировка Са2+-каналов приводит к значительному снижению сгивности фермента. То, что верапамил не полностью подавляет сгивность фосфолипазы С, возможно, объясняется поступлением онов Са2+ через другие ион-транспортные структуры нерва во время 'поляризации, например через Na+ каналы.

ЗАВИСИМОСТЬ АКТИВНОСТИ ФОСФОИЙОЗИТИЛ-СПЕ1ЩФИЧНОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ С ОТ рП СРЕДЫ.

Установлено, что активность ФИ-ФЛС зависит от величины рН, тгимум которого для разных объектов исследования колеблется от О до 7,5 {Chati L.Y., Tai Н.Н., 1982; GraffG. et al, ¡984; Irvine R.F. al., 1984; Wilson D.B. etal, 1984).

Учитывая результаты Максимова с соавторами, показывающие шенения рН в нервном волокне во время проведения возбуждения Aaximov G. V. et al., ¡991), мы предположили, что рН может являться це одним фактором регуляции активности фермента во время ункционирования нерва. Поэтому представлялось интересным (учить зависимость фосфолипазной активности от изменения ¡личины рН.

Как видно из рис. 6, активность фермента, как содержащегося в (тозоле, так и ассоциированного с мембранами, существенно висит от рН. При этом оптимум рН для цитозольной формы »ставляет 6,0, а для мембранной - 7,0. Отклонение от этих величин 1к в одну, так и в другую сторону снижает активность ФИ-ФЛС.

Результаты наших экспериментов хорошо согласуются с данны-л, полученными для ФИ-специфичной фосфолипазы С из цитозоля далищного нерва крысы, рН-оптимум которой выявляется в районе 5 - 6,0 СNatarajan V., SchmidН.Н.О., 1987). 1

Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод о том, о рН может выступать как еще один регулятор активности ФИ-ЛС в нервном волокне. То, что активность цитозольной и мембраной фракций фермента по-разному зависит от рН свидетельствует, о существуют разные изоформы ФИ-ФЛС. Конечно, нельзя ключить, что оптимум рН может меняется при отсоединении ;рмента от мембраны.

рН

-•-Цитозвльная ФЛС Мембранная ФЛС

Рис. 6. Зависимость активности фосфоинозитид-специфичной фосфолмпазы С от pH.

ВЛИЯНИЕ ГТФ НА АКТИВНОСТЬ ФОСФОИНОЗИТИД-СПЕЦИФИЧНОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ С.

Считается, что мембранные рецепторы сопрягаются с фосфол! пазой С через гуанин-нуклеотид связывающий G-белок.

а-субъединица G-белка в комплексе с ГТФ активирует фермент мишень - фосфоинозитид-специфичную фосфолипазу С (Boyer J.L. > al, 1989).

Помимо этого в литературе есть сведения, что ГТФ-связывающи белки могут активировать ФИ-ФЛС путем снятия действия белко! ингибиторов (Camps М. et al., 1990).

Все данные, приведенные выше, были получены при изучени рецепторопосредованной активации фермента. Мы в нашей работ попытались проверить, происходит ли изменение активности ФМ ФЛС при действии ГТФ в соматических нервах, на поверхност которых не обнаружено рецепторов.

В результате эксперимента выявилось, что активность фермента ри использовании' в качестве субстрата МФИ после воздействия ГФ увеличилась на 84,2% по сравнению с контролем. В следующей :рни опытов при добавлении в инкубационную среду в качестве 'бстрата ДФИ величина активности превышала уровень контроля на 1%. Наиболее высокое увеличение активности ФИ-ФЛС зафиксиро-1НО нами при гидролизе ТФИ. В этом случае активность возросла на '% относительно контрольного уровня (рис. 7).

Таким образом в нерве, как и в гормонешчулируемых клетках тивация ФИ-ФЛС может осуществляться при участии Г'ГФ в 'мплексе с О-бслками.

иМ Р1/мин/мг белка

100

80

60

40 20

0

1 [покой Ц<5действие ГТФ МОмкМ

с, 7. Влияние ГТФ на активность фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы С.

Исходя из результатов этого эксперимента, а также из данных «ставленных выше, можно предположить, что в нерве существуют колько изоформ ФИ-ФЛС, рефляция активности которых ществляется двумя способами - при участии ГТФ и деполяризаци-иембраны.

1 й

Т Т

Ш

> « т

__1_. ._■

МФИ ДФИ ТФИ

Дополнительным подтверждением нашего предположения явл ется разная степень активности ФИ-ФЛС при использовании качестве субстрата МФИ и ПФИ.

ВЛИЯНИЕ К' ДЕПОЛЯРИЗАЦИИ НА ОБРАЗОВАНИЕ ДИАЦИЛГЛИЦЕРИНА В НЕРВЕ.

Основное физиологическое значение активации ФИ-ФЛС состо! в образовании вторичного мессенджера - ДАТ, который являсг регулятором транспорта Са2+ в клетку\Nishizbka У., ¡995). Поэто» мы провели, эксперимент по изучению накопления этого линида нерве при деполяризации. Для решения задачи нерв подвергали К деполяризации разной силы и разного времени воздействия. Пос. чего выделяли ДАГ, определяли количество жирных кисло входящих в его состав, и по этому показателю судили о концентрат липида в нерве.

Результаты экспериментов, представленные на рис. 8 и 9, пок зывают, что деполяризация нервного волокна приводит к увеличени в нем количества диацилглицерина. Следует отметить, что че сильнее деполяризующий стимул и больше время его воздействи тем больше ДАГ накапливается в нерве._

. мкг/мг липкдов ; 40

I

; 30 20 ' |

10 т

I ' ШЩ | 0™

! покой 25мМ 50мМ 100мМ

Рис. 8. Влияние силы К^-деполяризации на содержание диацилглицерина в нерве.

мкг/мг ЛИПИДОВ

40 С

покой 15мин ЗОмии

Рис. 9. Влияние времени ^-деполяризации 50 мМ н: накопление диацилглицерина в нерве.

Кроме того, мы обнаружили, что при деполяризации меняеюя оличество индивидуальных жирных кислот, входящих в состав иацилглицерина.

Зафиксированное нами увеличение концентрации диацилглице-ина еще раз доказывает, что деполяризация приводит к активации 'И-специфичной фосфолипазы С в нервном волокне.

На основании данных литератур!,I и результатов собственных ¿следований мы предлагаем следующую схему активации ФИ-ФЛС поступления ионов кальция.

При деполяризации происходит частичное поступление Са"* ;рез Ыа-каналы. Ионы кальция и структурные изменения, происхо-нцие в плазматической мембране нервного волокна, активируют осфоинозитид-сиецифичную фосфолипазу с. При ее активации :иливается распад ФИ, о чем свидетельствует накопление ДАГ во >емя деполяризации. ДАГ активирует протеинкиназу С, которая эсфорялируст белки метаболически-регулируемых Са2+-каналов. В их условиях Са2+ каналы переходят в открытое состояние и кальций )ступает внутрь нервного волокна.

ВЫВОДЫ

1. В состоянии покоя в соматических нервах кролика обнаружи-ется активность фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы С. При юведении возбуждения ее активность возрастает с 11,0 ± 0,8 до ,8 ± 1,3 нМ Р, /мин/мг белка.

2. Активность фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы с в матических нервах зависит от концентрации ионов кальция и личины рН.

3. Активация фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы С осу-;ствляется деполяризацией мембраны нервного волокна и действи-

ионов кальция. Ключевым звеном в этом механизме является шмодействие С-белка с ферментом.

4. Фосфоинозитид - специфичная фосфолипаза С обладает суб-эатной специфичностью к трифосфоинозитидам. Ее функциональ--активный пул обнаруживается преимущественно во- фракции азмагических мембран.

5. При деполяризации усиливается накопление диацилглицернна юрве и меняется его жирнокислотный состав, что свидетельствует

не только о гидролизе основного пула фосфоинозитидов, но и с усилении биосинтетических процессов.

6. На основании данных литературы и результатов собственнь исследований предложена схема активации фосфоинозити. специфичной фосфолипазы с в соматических нервах и поступлеш ионов кальция в нервное волокно.

СПИСОК РЛЬОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕ M к дисстртлпш

1. Ревин В.В., Николаев ВТ., Грунюшкин И.П., Колье O.P. Из; чение жирнокислотного состава компонентов фосфоинозигидног

. цикла в седалищном нерве кролика при перерезке. // Некоторь биофизические аспекты исследования живых систем. M., 1992. С. 7< 83.

2. Грунюшкин И.П., Ревин В.В. Содержание диацилглицерола свободных жирных кислот в нерве кролика при К+ деполяризации. XXII Огаревские чтения. Тез. докл. Морд.ГУ. Саранск 1993.

3. Московкин A.A., Грунюшкин И.П., Ревин В.В. Метаболиз фосфоинозитидов и поглощение Са2+ в нерве кролика при er перерезке. // Тезисы докладов V Всероссийской конференции п патологии клетки. Москва, 29-30 ноября 1993. С.47-48.

4. Грунюшкин И.П. Образование диацилглицерина в нерве пр действии активаторов ФИ-цикла. // XXIII Огаревские чтения. Те докл. Морд.ГУ. 'Саранск. 1994.

5. Анисимова И.А., Грунюшкин И.П., Набокина С М., Ревин В.! Изучение активности фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы i при возбуждении и повреждении седалищного нерва кролика. // XXI' Огаревские чтения. Тез. докл. Морд.ГУ. Саранск 1995.

6. Ревин В.В., Набокина С.М., Анисимова И.А., Грунюшкин И.Г Функционирование фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы с седалищном нерве. кролика. // Материалы международного симпс зиума «Физико-химические основы функционирования белков и и комплексов» Воронеж. ВГУ. 1995. С. 114.

7. Ревин В В., Набокина С.М., Анисимова ИЛ., Грунюшкин И.Г Изучение активности фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы с нерве кролика в покое и при возбуждении. // Биохимия. 1996. То\