Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль фосфоинозитидов в процессе проведения возбуждения по соматическим нервам

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль фосфоинозитидов в процессе проведения возбуждения по соматическим нервам"

в Ч ' •

РГБ- ОД

— и . •-

ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ На правах рукописи

московкин

Александр Александрович

РОЛЬ ФО'ФОИНОЗИТИДОВ В ПРОЦЕССЕ ПРОВЕДЕНИЯ ВОЗБУЖДЕНИЯ ПО СОМАТИЧЕСКИМ НЕРВАМ

Специальность 03.00.02. - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВОРОНЕЖ 1995

#

Работа выполнена в лаборатории биофизики кафедры биотехнологии Мордовского ордена Дружбы народов государственного университета им. Н. П. Огарева.

Научный руководитель: доктор биологических наук.

профессор В. В. Ревин.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор С.И.Аксенов, кандидат биологических наук М. В. Иванова.

Ведущая организация:

НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

Защита состоится "31" мая 1995 г. в " У " часов на заседании диссертационного совета К 063.48.14 по присуждению ученой степени кандидата наук при Воронежском государственном университете по адресу: 394693. Воронеж, Университетская площадь, 1.

С.диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан "ЫО " апреля 1995 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук, ^

доцент '""Т/^^г! Т.А.Ковалева.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ И

Люгдальносе» пробязш Изучение закономерностей физико-хкми-ческих процессов, сопровождающих генерацию и проведение возбуждения по нервным волокнам, в настоящее время является одной из вакнеЯшей проблем биофизики и нейрофизиологии. -

В течение длительного времени при изучении механизмов возбуждения и его проведения основное внимание уделялось белковой компоненте плазматических мембран. Лигадам же . их индивидуальному составу, отводилась, в основном, роль пассивного изолятора и механического матрикса мембран. Однако роль липидов биомембран в процессах распространения возбуждения исследовалась мало. Наши знания об активной роли фосфолипидов в функционировании мембран, в том числе специализированных возбудимых образованиях, пополнились в последние годы ( Третьяк, Лиморенко, 1978; Ревин,1990; Walt, Larrabl, 1973; Mlchell,1982).

Наибольшего внимания заслуживаю? метаболически активные фосфо-липиды - фосфоинозитиды (ФИ), для которых характерна высокая скорость обмена фосфатных групп. Повышенный интерес к ФИ объясняется еще и тем, что появились данные, указывающие на участие ФИ и продуктов их гидролиза в регуляции транспорта Са ( Mlchell,1982; Hls-hlzuka, 1986; Berrldge, 1993). Эти сведения были получены, в основ-^. ном. на агонистстимулируемых тканях и клетках, а также на недельных системах.

Имеются отдельные сообщения о метаболизме ФИ в нервных проводниках при возбуждении (Hawthorne, White, 1973: White, Larrabee. 1977: Gould, 1985; Goswaml. Gould, 1986: Ревин и др.,1990). Однако работ посвященных детальному изучению роли ФИ в процессах проведения возбуждения явно недостаточно и практически не исследован вопрос об участии ФИ в регуляции транспорта Са в нервных волокнах.

В связи с вышеизложенным представляет интерес изучение состава, распределение, интенсивность обмена компонентов ФИ-цикла и поглощение Са в состоянии покоя нервного волокна и при его переходе в состояние функциональной активности, что. вероятно, позволит установить взаимосвязь между метафлизмом ФИ и поглощением ионов Са в процессе возбуждении нервного волокна.

Проведение возбуждения по нервным проводникам является быстротекущим процессом, поэтому важным является вопрос энергообеспечения этого процесса. В литературе имеются отдельные сообщения, о взаимосвязи энергетического обмена и метаболизма ФИ ( Дворкин. Киселев. 1972; Той et al., 1972; Abdel-Latir.1983:) . Представляло интерес изучить взаимосвязь фосфоинозитидного и энергетического обменов.

Каи игвестко. резкие изиекения Ш обмена приводит к нерувеач» транспорта Са и соответственно нормального метаболизма клетки (АЬ-del-Latif et al., iS3ó) . Поэтому изучение метаболизма ФИ при повреждении нервного •' ствола позволит выяснить участие этих лишков в механизмах нарушения проведения вогбугляш.

¿.л;» u ssecw vacraZocssJxi. Цельь нашей работы 'стало изучение роля £И в рэгуяяцзи поглощения Са• соматическими нгрвкши волокна (-31 '(сйдалнадаые нервы кролика и крисы и нервы конечностей краба) при их функциональной активности.

Для достижения этой цели мы решали следующие задачи:

• 1. .Провести систематическое исследование состава компонентов ФИ-цикла ки&мдозкрэшэтшс и ьемиелинизирозанных соматических нерзных проводников в покое и при перехода их в состояние функциональной активности.

2. Исследовать взаимосвязь между процессами обмена в Ф'Л-цнкле « поглощевк-к Ci соматического нервного волокна, а также' показать кальцийхолатируыдие свойства СИ.

3. Усъашшть зависимость обмена '¡-И от энергетического метаболизма соматических нервов при кх функциональной активности.

4. Изучить изменен,;с интенсивности метаболизма ФИ и поглоще-,-;и:; Са при повреждении нервного волокна.

Научная нооизна рабоаи. Проведено подробнее исследование состава компонентов &И-циг.ла - в соматических миелинизированных и не-шелинизироганнкх нервных ьолокнах при их Функциональной активное» та. Впервые показано, что одним из факторов интенсифицируют»» метаболизм фй ЯВМГ7СГ. Саза деполяризации нервного волокна. Установлена взаимосвязь ь.ежду поглощением ионов-.Са и обменом ФИ. Впервые выявлено, что лзллотся еде одним халывшепоикрумции механизмом нервного волокна. ФИ обкен является составной частью- общего энер гетического обмена первого волокна.

Практическое значеиие работы. Полученные данные позволяй"; расширить представления .о нолскупчрных механизмах генерации и проведения возбуждения, а также дпя понимания патологических процессов, протекавши в соматической нервной системе при ее повреждении. Результаты. полученные на нервах при воздействии некоторых Сизич^ских и химических факторов на метаболизм *ц и на интенсивность поглощения Са, когут быть использованы б экспериментальной в клинической медицине для диагностики состояния нервных клеток в норме и при патологии.

/„:рс,б[.и%1 ртЗоги. Результаты работы ¿оклздагзадчеь на заседа-секцля КОЕП (1'осква. Саранск 1900-1992). на 5 Всероссийской шгТч'рснции по патологии клетка (Москва, 1993), на 6 кегсдуиародком • с:-.п;озпуие по биохищя /ипздов ( С. Петербург, 1394), на 20-22 Ога-рйских чтс;г!лх (Саранск. 1$С;1-1393). на научких. содшграх .бяоло-п:чосксго " акулы ета к хггйе.прн бчою/лолопп! Гордовсксго госуш--гзреитота им. Н. ГГ. Огарева (Сиргкск,1990-1995).

Г:;5г:"лг.".д. По теие дясссрт^"":! оаубликозгяо 3 раЗот. отргга-кпро ей основные шлсиегага. ' •

Г.7 си'эсляся 1 сгжягия.

1. В условиях генераций к презедзшш созбуздешя по уязгкиизк-ро".-я:г::1 и нс:с!е;,::ниг"рова;пг:-: гте^ггч^л прозодашсаа :дпьяе::£зд:фуо:г-ся ОЛ сб:;,?н.

,2. Депсллрпзацнл ::энбран согатпчесхих кервев является одаик из кехшпков, шешвпрдоиД обмен койпонсптсз СЗ-цлиа и поглосз-гпо Са, ■ ■ -

3. ФИ являются кальцпЗдепоикру.^й системой нервного волокна. Кх метаболизм связан о энергетическим еСменсм нервного волокна.

Г. ^.г.^ра а сСхв:х рхЗ&ч. Диссертация изложена н\4Й5?раюп:ах паиишгасного текста и вклзчает введение, обзор литературы, .экпери-нентальную _часть, результаты и их обсуждение, выводы, список литературы, состояний пз^ь отечественных и/¿^зарубежных источников, содерхит&Йшсунков и 12_таблиц. ■

СО ДЕРЗАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

В главе представлен обзор основных работ, посвященных анализу структуры, физико-химических свойств, биосинтезу и внутриклеточной локализации ФИ и продуктов их метаболизма в нервной ткани. Приводятся современные данные о классификации, специфичности и условиях " проявления активности ФИ-специфичной фосфолипазы С и её роли в обмене ФИ. Анализируются сведения об энергетическом аспекте метаболизма ФИ и их участия в энергозависимых процессах клетки. Обобщены на сегодняшний день сведения.о взаимосвязи транспорта, ионов Са и метаболизма ФИ в клетках.

Глава ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Материалы и /¿етоды исследования. Объектом исследования служили нервные волокна ходильных ног черноморского краба (Сагсгтэ та-епаэ) и седалищные нервы (пегуиг {БсМсШсиз) кролика породы Шин-

шилла (Oryctolagus cuniculus), а также белых крыс (Battus norvégiens) линии Wistar и липиды выделенные из них. Поскольку во всех вариантах опыта ш сопоставляли измеряемые параметры в состоянии покоя и функциональной активности нерва, нами выбрана следующая постановка опита. Изолированные нервные стволы выдерживали в соответствующих рингеровоких растворах, На опыт отбирала нервные волокна. показание потенциалы действия при внеклеточном отведении со следующими параметрами стимуляции: для кролика н крысы - амплитуда 1,5 В, длительность - 0,3 кс. частота раздражения 200 имп/с, ■ для краба - амплитуда 1.5 В , длительность 1 мс, частота раздражения 10 имп/с. Раздражение проводили во влщщой термостатируемой камере. Нервы кролика и крысы выдергивали в среде, обогащенной кислородом и стимулировали при температуре 37°С. Стимуляцию осуществляли электрические прямоугольными импульсами от стимулятора ЗСЛ-2. Потенциал действия наблюдали на экране осциллографа С1-83. Контролем служили результата, полученные на волокнах не подвергавшиеся модифицирующему воздействию, но выдержанных в аналогичных условиях, что и опытные (на рисунках обозначается "контроль"). Деполяризация вызывали выдерэкванием нервных волокон в растворе, со-дераащого различную концентрацию (25.50,100 мМ) ионов К+. Деполя-.ризационный эффект регистрировали на осциллографе падением потенциала действия. В отдельных опытах использовали валиномицин {Serva, США ) в концентрации Ю~5М.Для создания'модели патологического процесса мы осуществляли перерезку нерва кролика. По истечении 24 часов нерв извлекали из животного и помещали в соответствующий раствор Рингера.

Кроме основной формы опыта использовали разные варианты, которые описываются при изложении экспериментального, материала. "

Выделение фосфолипидов из нервных волокон осуществляли метода-. ми Блайя-Дайера (Bllgh, Deyer, 1957), Фолча с соавторами (Gonsa-les-Sastre, Folch, ' 1968 ) в модификации Прохоровой ( Прохорова и др.,1967)1 Госвами-Гоулда ( Goswaml, Gould, 1985). Для количественного и качественного анализа смеси липидов применяли метод микротонкослойной и препаративной хроматографии (Vaskovsky, Svetashev, 1972), используя в качестве адсорбента силикагель КСК-или Merck, импрегнируя пластинки 1% оксалагом калия. Разделение ФИ проводили одномерно в системах Даоллеса (Jolies et al., 1988), и двумерно в системах растворителей Броу>ш»юса (Broekhuyse, 1969Ь Для Идентификации индивидуальных фракции 4Й использовали специальные, окрашивающие реагенты (Кейтс, 1975, Vaskovsky. Kostetsky, 1975) и стандарт-

кые образца фирмы Sigma, СИЛ. Количественное определение индивидуальных фракции фссф.олипидов проводили по метод? Васьковского с авторами с использование;» универсального реагента (VaskovsXy et al., 1975) на спектрофотометре Specol-10 с приставкой ЁКМ. Для измерения поглощения кальция нервные волокна кролика и крнси предварительно вЩ5срззвапи в фязпологическом растворе, содержащем изото-пн кальция (15Са) с у;;ельиой радиоактивностью 5-7 мкКп/мл. Для из-керез^я питекс'ЛЕНости об.мзна фосфо/лшшшх ксмпоиентов 'ГИ-цикла сс.52лпгзаэ Kcpsu кролика и крис» вь'дершгвали в физиологическом растворе, содсрг;Х'о:} зготоп Сосфора (згР) с. удельной радюактев-ноотьз 10 г:хКя/ил. Для изучения кальцкйсвязыващей способности на "зделъинх састеках Curzi использованы азеатропаые смеси, в состав которж вхосш хгорофори-метанол-вода. Наличие радиоактивных изотопов в иерпаа волокнах регистрировали методом жидкостной «гпгпшшшш на установках дас-2 отечественного производстна.

Все полученные результаты обрабатывали статистически с пеполь-гевяипег! t-критерия Стьадекта (Лакин, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Состгв 'Л В ce^nrra«. ВЗШЙ2иЗШШ&—И_ШШ__И

T'"r.pf)"s ^д^иностей краба.

В этом разделе т изучали количественный состав индивидуальных фракций ФЯ и ФК седалищных нервоз кролика и крксы, а также нервов когечяоетей краба, находящихся в состоянии покоя. После экстракции ли-. пидоб и их разделения при помощи ТСХ во всех объектах исследования были обнаружены и идентифицированы следующие фосфолипиды: фосфатидилинозитол (№!И), фосфа-тидилинозитол-4-фосфат (ДФИ) фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат П'ФИ) и фосфатидная кислота (ФК).

МКГ Рфи ум Г P.fA

гаэчик криса краб юД«1 tzjM«! а.® к.

Рис.1. Содержание ФИ и ФК в нервах кролика, крысы и краба.

Сегд,1?""^ нерв кролика: Основную часть от исследованных фос-фолнпидов кгрза кролика составляет МФИ-44.4 %. На дола ПФИ приходился 47.6 X. из них: ТФИ -20.1 %, ДФИ-27.4 %. Содержание ФК составляет 8 % от общего количества фосфолипидов ФИ-цикла.

Седяд'дкьгЯ нерв консн: Так не как и в седалищном нерве кролика в седатщцон иерзз крысы основная дохл от исслэдовантк фосфолшш-доб приходите:; на4;ФЙ - 49 %. Доля ТФИ и ДФИ соответствует 7.6 и 8.2 Ял. при зто.ч содержание ФК составляет 35.3 % от общего числа фосфолигшдиых компонентов Фй-цкхла.

Нервы конечностей краба: Нами установлено, что в нерве конечностей краба, в отличие от других объектов исследования наибольшая часть от интересовавших нас фосфолипидоз приходится на ФК-37.7Я. Распределение ®Л было следуюгдим. Большая часть приходится на КФИ - 33 %. содержание ТФИ и ДФИ было равным и соответствовало 14.6 %.

Таким образом, в количественном составе компонентов ФИ-цикла седалищных нервов кролика и крысы и нервных волокон краба обнаружены как черты сходства, так и различия. Обнаруженные количественные различия в распределении ФИ и ФК в исследованных нервных волокнах, возможно, отражают особенности функционирования миелинизированных и немиелинизированных нервов (рис.1).

Влияние возбуждения на метаболизм ФИ в соматических нервных волокнах.

Результаты проведенных иссле дований свидетельствуют.. что при переходе нервных волокон с разной степенью миелинизации в состояние функциональной активности состав фосфолипидов, участвующих в ФИ-цикле. изменяется по разному. Нами обнаружено, что ритмическое возбуждение нерва кролика приводит к 4-х кратному увеличению содержания фракции ТФИ и повышению содержания МФИ на 12.4 % относительно уровня покоя. В этих же условиях обнаружено уменьшение доли ДФИ на 45%. Во фракции ФК достоверных изменений не обнаружено (рис.2). При возбуждении нервного волокна кролика происходит усиление включения

МКГ Р$и/ МГ Р<?л

таи дси мфи ф к

^контроль „-,5035утаение

Рис.2. Изменение содержания ФИ и ФК в нерве кролика при возбуждении.

32Р во фракции ТФИ и ДФИ. В остальных фракциях ФИ-цикла раздравекие нерва не изменяет интенсивность включения 32Р. Таким образом, з нерве кролика при возбуждении происходит активация ФИ-цикла, в частности, усиление биосинтеза высокофосфорилированных форм ФИ.

МКГ Рои/ИГ Ррл

50

30

20

10

К

35 50 100 К+

Изучение влияния К*деполяризации на обмен ФИ периферических нервов.

Возбуждение является быстроп-ротекающим процессом, состоящим из нескольких фаз. Кроме этого, при проведении большого числа импульсов в нервном волокне активно протекают восстановительные метаболические процессы. Поэтому практически невозможно • вычленить связь исследуемого параметра с определенным состоянием нервного волокна. Для установления связи мекду деполяризацией и обменом ФИ мы провели опыты, в которых нервы выдергивали в растворе Рингера в течение 30 минут, содержащем повышенное количество ионов К". Концентрация ионов К* в разных сериях опытов равнялась 25. 50 и 100 мМ.

Седалишный нерв кролика. Деполяризация нерва, индуцированная действием 25 мМ К* приводит к уменьшению фракции ТФИ и ФК на 15 и 37,2 % соответственно, в этих же условиях содержание фракций ДФ'Л и МФИ увеличивается на 34 и 18 %. При повышении концентрации внеклеточного К* до 50 мМ ТФИ возрастает на 34 Ж и ДФИ в 2,5 раза. Содержание МФИ и ФК снижается на 78 и 85 % соответственно. Дальнейшее увеличение концентрации К* в инкубационной среде нерва до 100 кМ приводит к. уменьшению всех исследуемых фракций - ТФИ на 35, ДМ- 9, МФИ- 61 и ФК на 85 %(рис.З). Приведенные результаты показывают, что деполяризация нерва кролика является фактором стимулирующим интенсивность .метаболизма ФИ. В частности, низкие уровни деполяризации приводят к уменьшению только лишь фракций ТФИ и ФК и увеличению количества ДФИ и МФИ. Более сильные деполяризующие стимулы приводят к интенсивному гидролизу всех форм ФИ и ФК.

Рис.3. Влияние К*деполяризации нафостав ФИ и ФК в нерве кролика.

250 200 150 100 50

Седачишный нерв крысы. Обмен ФИ в нерве крысы таете зависит от интенсивности деполяризующего стимула. Так, при действие 25 мМ К* во внеклеточной среде на нерв крысы увеличивается содераание ТФИ, МФИ и ФК на 20%, в 2,5 и 2,4 раза , фракция ДФй уменьшилась на 20%. Выдерживание нерва в среде, содержащей 50 мИ К+, приводит к падению уровня ТФИ~и-ДОИ на 21 и 48 %% соответственно к увеличению содержания МФИ иг 43 % и 4К на 58%. Деполяризация, индуцированная 100 мМ внеклеточного К* приводит к дальнейшему гидролизу ПФИ - ТФИ на 40% и ДФИ на 57% , и увеличению доли МФИ на 81% к ФК

- в 2,8 раза

В связи с тем, что в основе,_,-___-------

проведения возбуждения по миелино-вым и немиелиновыц нервным волокнам лезкат разные механизмы, мы провели опыты, в которых попытались изучить характер изменений в обмене' ФИ на немиелинизированных нервах краба. Деполяризация нерва, вызванная действием 50 мМ ионизированного К* привела к уменьшению содержания всех компонентов ФИ-цикла: фракции ТФИ и ДФИ на 7 и 6,3 %% соответственно, а МФИ и ФК

- на 37,9 и 20, 5 % (рис.4). Возможно это объясняется тем. что для возникновении деполяризации слабо-миелинизированных нервных проводников необходимы меньшие концентрации внеклеточного К*. Таким образом, результаты полученные на ми-елинизированных и немиелинизированных нервах позволяют утверждать, что деполяризация является одним из основных стимулов, вызывающих интенсификацию обмена компонентов ФЙ-цикла во всех типах исследованных нервов. Изменения ФИ-обыена зависят от величины деполяризующего стимула и типа нервов.

1_

Т<!И ДОИ

ГОмил

са

МОИ <К{ К+аепол.

Рис.4. Содерзание ФИ и ФК в нервных стволах краба при действии 10 мМ верапамила в условиях ¡С деполяризации.

Изучение взаимосвязи обмена и регуляции транспорта Са з

цмоаь Са/кг су)юго юр&а

100

50

кролик крыса

г~1г*ДНТ1РрА Ь Щ^ Д ч ^ СД.

Рис.5. Поглощение Са нервами кролика и крысы при ^деполяризации.

Для выяснения влияния ионов 150 Са на метаболизм ФИ нервного волокна в условиях его функционирования мы инкубировали нервы кролика и крысы в течение 30 минут в растворе Рингера, содерзвдгЛ 45Са. В состоянии покоя поглощение Са нервным волокном кроллка составило 68 пмоль/мг сухого веса нерва, а в нервной волокне крысы в аналогичных условиях поглощение Са равнялось 77 пмоль/мг су-аго веса нерва. В условиях К*деполяризации нерва наблюдается увеличение поглощения Са: ,в нерве кролика на

82.3 % (124 пколь/мг сухого нерва) и крнсы 212% (163.2 пмоль/мг сухого нерва) (рис.5). Таким образом, в условиях К*деполяризации нерва интенсифицируется не только ФИ обмен, но и усиливается поглощение Са. МКГ Ран /МГ Р-фл

Для выяснения вклада проникаквдх в клетку ионов Са на метаболизм ФИ при деполяризации нерва кролика мы применяли блокатор Са-каналов ве-рапамил. .При блокировке Са-каналов наблюдался гидролиз всех форм ФИ и ФК (рис.6). В связи с тем, что ве-рапамил осуществляет блокировку только потенциалуправляекых Са-каналов Ь-типа. поэтому поступление Са в клетку продолжается через другие типы каналов, а также по

_ гт-п_ _

кей^ь к+~цт 6ер~57^мил быстрым Иа-канапам (Костюк и

Рис.6. Изменение содержания др. 1386: Максимов и др.. ' 1992).

ФИ и ФК в нерве кролика при Поступиьиего количества Са доста-

действии 10 мМ вфапамила точно стимуляции обмена ФИ.

в условиях К*деполяризации.

Несколько иной характер изменений состава ФИ и ФК обнаружен наки в нервных волокнах краба при их деполяризации и действии ве-рапамила. Если сильный деполяризующий стимул приводит к уменьшения всех исследуемых нами фосфолипидэв, то блокировка Са каналов не влияет на гидролиз ТФИ, индуцированный К*деполяризацией , но праподкт к интенсивному синтезу других фосфолипидов (рис.4). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что частичная блокировка тока Са внутрь нервного волокна краба препятствует усиленному гидролизу Фй и ФК, вызванному К*деполяризацией. Возможно это объясняется тем, что верапамил лучше блокирует Са-кака-ла в немкелинкзпрованних' нервах и минимальное количество поступивши ионов Са недостаточно для активации ФИ-специфичных фосфо-липаз С. Но поступившего количества Са достаточно для аткивации феркёнтов, ответственных за биосинтез других ФИ>Для дополнительной оценю? вклада внеклеточного Са на метаболизм ФИ мы изучали интенсивность обмена ФИ и ФК при инкубировании нервных волокон кролика в среде,, содержащей Са в низких концентрациях (0.05 мМ). Установлено, что дефицит Са вызывал усиление биосинтетических процессов компонентов ФИ-цикла в нерве. Содержания всех форм ФИ и ФК возрастало. Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что метаболизм ФИ является Са-зависимым процессом.

Влияние ингибиторов энергетического обмена на ■ . метаболизм ФИ.

В литературе имеются сведения, указывающие на связь между ФИ и энергетическим обменом в различных типах тканей ( Той е! а1.. 1972; Киселев, 1987) . Однако исследований, касающихся взаимосвязи ФИ и энергетического обмена в соматических нервах в условиях их функционирования практически нет. Для изучения связи между ФИ и энергетическим обменом мы количественно оценили содержание всех форм ФИ в нервах кролика и крысы в состоянии покоя и при их активном функционировании в присутствии разобщителей окислительного фосфорилирова-ния и дыхания - ДНФ (10"4М) и арсенатат натрия (АН) (Ю~*М) . Действие ДНФ на нерв кролика приводит к снижению количества ТФИ и ДФИ и увеличению содержания МФИ и ФК относительно контроля. Включение згР во фракции ПФИ при воздействии ДНФ снижалось. Одновременное действие ДНФ и возбуждения на нервы кролика приводит к снижению включения 32Р во все фракции ПФИ. Аналогичные изменения в содержании ФИ ДНФ вызывал в нерве крысы.

Известно, что АН блокирует перенос фосфатных групп, поэтому мы онидали подавление биосинтеза ФИ (Либерман и др. ,1937). Нами установлено, что при действии АН на соматические нервы, происходит снижение количества всех форм ФИ б нерве кролика и ГШ в нерве крысы. В составе фракции МФИ нерва крысы изменения не обнаружено. Значения ФК в обоих типах нервов возрастает. Включение 32Р во фракции ПФН нерза кролика при действии АН также уменьшается.

Таким образом, при действие ингибиторов энергетического обмена на нервные волокна происходит снигение биос::птеза ФИ. Полученные дагане свидетельствуют о прямой связи мезду энергетическим и фосфо-инозитиднин обменом нервного волокна.

4 Изучение Са-связьгааггеей способности Аосбокиозитшюв.

Известно,что при проведении возбуждения происходит увеличение уровня внутриклеточного Са. Кроне основных систем его депонирования - ЭПР и митохондрии- имеются отдельные сведения о том, что в связывании Са могут участвовать и ФЯ (Dawson. 1965). Их хелатирунцие свойства во многом зависят от рН среды, величина которого изменяется при проведении возбуждения по нервному волокну ( Колье, Максимов, 1987).

Рис.7. Влияние лантана на связывание кальция ФИ.

Рис.8. Зависимость Са-связы-вающей способности ФИ от величины рН. 4

!

Для установ,г,з!шя способности ФИ связывать Са мы провели опыты, гдэ наряду с добгаяешег: Са в пробу вводили ого аатагопнот - лантан (10 мМ). За-контроль принимали связывание Са фракциями ФИ при рН 7.4, но без добавления лантана. Б&ло установлено, что в присутствии Ъа в пробе Тйй иктщспвность радиоактивности снижается "ка 56%. Во Фракциях ДФИ и кш леятан сазкзаэ? укепьсегше -радиоактивности на 50% и сойтватс1у&;аю (рис, 7). ¡¡олучеяааз результаты сшдетель-ствувт о то.ч, что все фракции способны связызать Са и особенно интенсивно 1Ш. Изучение рЦ-зависимого связывания Са фракцшши ФИ показало, что наибольшее связывание Са фракцией ТФ'Л регистрируется при значениях рН разных 6,8. Увызачение рН вызывало снижение сбззи-ваСа этой фракции (рис.8), да наиболее интенсивно связывает Са пр:; рП 7,4. Уменьшение и узелпченлз ветчины рН снижало хегатируа-13» способность фракции ДФИ. ГКЛ. каг^кее зарягзикаЗ из ФИ, при кисли значениях рН имеет иагкзньаее связьзгюю Са. Пра подщелачи-вакгл среды радиоактивность МФИ возрастает, что свидетель-

ствует об. узеличснщ хелатирг-^З споса&юста отца ©1. Твхзш образе«. «оано утверздать. что ФИ наряду с ¿"ругни» сксткжш участвует в дзпошфованяи Са внутри нервного волокна. Хедатирукцие свойства И нисат вцраззаюую зависимость от величины рН. По-видимому, это ио^зт слухить одпгм кз основных Физиологических Факторов, регулирующих концеитращш при;.'ембра:п;ого Са в аксопдазме нервного волокна.

S-ÜSSSS щшш гри его перерезке. .

В литературе имеются сведения. указывающие на изменение структуры возбдеаж образований, gg их белковой компоненты и состояния ионных канале® при повреждении -30 нерва / (Ri.täia. 1984; Henry et : 40 al.,1987). Кйевтез отдельные сооб- ; щешш ф участив <Ш и продуктов их j 2D метаболлгзыа в возникновения пато- I логических нарушив (AMel-La-tlf. 1986). Поэтому, представляло интерес изучить метаболизм ФИ и поглощение са при повреждении ' нервных волокон. Возможно, знания Рис.9. Изменение содержания об изменениях в составе ФИ позво- ФИ и ФК в нерве кролика после лят выяснить участие этих фосфоли- перерезки.

ШГ Рфи / Ur'P^A

котчммь .—бсзЗукйЫше

пфьреашисго *ep8a

пидов при нарушении функционировании нерва.

Перерезку нерва кролика осуществляли под неибуталовым наркозом ;хивотяого (40 мг/кг веса). В поврежденной нерве по истечении 24 часов - после перерезки седалищного нерва крошка происходило увеличение относительно контроля количества всех компонентов ФИ-цикла: ТФЯ.ДФЙ и 1Ш соответственно в 3,3 ; 2,7 и 3.3 раза. Содергааяке ФК в этих условиях возрастало на 42.5 % (рис.9). В этих ае условиях наблюдается увеличение поглощения Са с 68 до 77.7 пмоль/нг сухого веса нервов. При стимулировании перерезанного нерва в течение 24 часов с частотой 5 имп/мин происходит гидролиз ПФИ и увеличение низкофосфорилированных форм фосфолипидов, компонентов ФИ-цикла (рис.9 ).

Таким образом, при перерезке нерва происходит интенсификация как ФИ обмена, так и поглощения Са. Однако, характер изменений в метаболизме ФИ и интенсивности поглощения Са при нормальном функционировании и повреждении нерва различен. Резкое накопление всех форм ФИ при перерезке нерва по-видимому обьясняется инактивацией фй-специфичной фосфолипазы С. Увеличение содержания всех форм ФИ приводит к значительному возрастанию заряженных групп в мембране, способных связать дополнительное количество Са и. как следствие этого, усилению поглощения Са. Подтверждению тому служат нави результаты, показывающие увеличение поглощения Са поврежденными нервными волокнами.

ВЫВОДЫ.

- 1. Изучено количественное распределение фосфоинозитидов в мие-линовых и немиелиновых соматических нервах в .покое, при возбуждении и К+деполяризации. Установлено, что ФИ являются наиболее лабильными компонентами мембран.

2. Во время возбуждения и К*деполяризации нерва интенсифицируется метаболизм фосфоинозитидов и поглощение Са.

3. Усиление обмена фосфоинозитидов обусловлено деполяризацией .мембран и поступлением ионов Са в нервное волокно.

4. Фосфоинозитидный и энергетический обмен взаимосвязаны друг с другом. При подавлении энергетического обмена интенсивность обмена фосфоинозитидов снижается.

5. фосфоинозитиды являются еще одной Са-депонирующей системе» нервного волокна, которая регулируется изменением величины внутриклеточного рН.,

С. При повреждении нерва кролика , вызванного его перерезкой,

в вк; значительно усиливается накопление всех кохшонентсз ФИ-цакла. Э'ю, повилкому сшдагельсгаудт о тон, что г.сханпзка регуляции об-ки .СосОоцкозктадов и поглоцэкзя калыия нарушены.

1. ?ев;ш В. b.. Косксзхня A. A., Колье O.P. Поглощение c& при дз-ac«;p:sairs в -иерсрозке сз&уг^й&х кервов кролгиа и кркез. // Биояо-ri\4£c;t:i& ь^ул:. - 1СЭ2. - Ь"2. С. 57-60.

2. îwcîo^cn. Л.д.. Рев;::: Б. В. Изучают поглодаю Са и «et£So-

при К* ¿ополчркзащи седаллцкого нерга крол.1-ка.//Д01!Л. 1л:;Л1. биолог,;л.-1991-1£-Э2г. - С. 43-48.

з. Ксокозкш л.А., Ревин В.В.. Колье O.P. влияние к*деполлр:<.г зацяа на состав фосфоинозитидов в нераз краба. //&o?j..ï.0'.'JI. Общая Ополотая.-1991-19Э2 г. - С.40-42.

4.î:ockqsic;h А. А., Грукь^л И.П., Pes;n; В.В. ЕзтйОолигп фос5ш-позктлдоз a ног;:ос;2:а;с . Са б нерве кролика при его перзрезке; // Тез. докл.. V Всерссс. конф. по патологии глетки. Москва, 29-30 ноября 1993г.

5. Коскозкин А. А. Ревин В.В. Влияние ингибиторов энергетического обисаа ка кзтабодгйа фосфоинозитидов в седалищном нерве крысы.// 22 0гарсвск?с чтезкг.. Тез. долкл. Саранск. Норд.ГУ,- 1993. - С. 148.

6. Косковкин А.А.. Ревин В.В. фосфоинозитиды и их Са-связызазз-цая способность.// Тез. докл. 6 меад.енкп. по биохимии лшшдов.-С.-Петербург, 3-6 октября 1994 г.

7. Ревин В.В., косковкин А.Аг Влияние рН на кальций-связызак-цую способность фосфоинозитидов. //Биофизика.-1995 г. ( в печати).

8. Ревин В.В.. Московкин А.А. Влияние ингибиторов энергетического обмена на метаболизм фосфоинозитидов в периферических нервных волокнах.//Биохимия. -. 1995. -том 60. вып. 4, - С. 74-82.