Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые критерии биологической активности фибронектина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Некоторые критерии биологической активности фибронектина"

КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени В. И. УЛЬЯНОВА-ЛЕНИНА

На правах рукописи САФИНА НЭЛЛЯ АХМЕТОВНА

НЕКОТОРЫЕ КРИТЕРИИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФИБРОНЕКТИНА

03. 00.04—биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ 1993

Работа выполнена в Казанском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ

Научные руководители: Доктор медицинских наук,

профессор Д. №. ЗУБАИРОВ

Кандидат биологических наук О. Д. ЗИНКЕВИЧ

Официальные оппоненты: Доктор биологнчеп.их наук,

профессор Б. М. КУРИНЕНКО

Доктор медицинских паук Л. Г. ПОПОВА

Ведущее учреждение: Российский Кардиологический научны;! центр АМН Российской Федерации

Защита состоится « сие^с? Ю93 г. в

на заседании Специализированного учёного Совета по присуждению учёной степени кандидата биологических наук в Казанском ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственном университете им. В. И. Ульянова-Ленина по адресу: 42С008, г. Казань, ул. Ленина, 18

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского Казанского государствеиного университета им. В. И. Ульянова-Ленина

Автореферат разослан „_: -у " ам^ш^а юра г

С

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

А. Н. АСКАРОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность.проблемы. В последние года,благодаря рязнооб -разию своих биологических свойств, фибронектин стап предметом многочисленных экспериментальных и клинических исследований. Являясь полифункциональным гликопротеином, он вовлекается во многие физиологические и патологические процессы.

ОдноА иэ наиболее важных функциС фибронектина является его способность медиировать фагоцитарные реакции моноцитов, макрофагов, неРтрофилов (Poraaler С. 1984, Toroi J. 1986, Gude-}

vrlcï t. 19ST, Cornette J. 1968, Yang X. 1988 c 'зыва-

ясь с коллагеном, агрегатами фибрина, иммунными комплексами,

различными микроорганизмами, фибронектин способствует их выведению из кровеносного русла клетками системы мононуклеарных фагоцитов ( 8аЪа Т. 1969, Blumenetock Р., 1982, Cornette J. 1988 ).

Несмотря на многочисленные публикации, посещённые изучению роли фибронектина в фагоцитарных реакциях, механизмы его функционирования до сих пор остаются не шясненннми. Недоста -точно данных о взаимодействии фибронектина с другими опсонииа-ми, в частности с антителами.

Всё вышеизложенное свидетельствует о перспективности проведения комплексных исследований, по изучению функций фибронек -тина, его участия в патогенезе•различных заболеваний, а также по созданию лечебных препаратов фибронектина для заместитель -ноР терапии. Одним из условий, необходимых для проведения та -ких исследование, является наличие точных и пригодных для клинического применения экспресс-методов определения уровня плазменного фибронектина.

В исследовательской практике широкое применение получили методы, основанные на определении фибронектина как антигена: 'ттоунонефелочетряч,■имчуно-энзичныР метод, ракетны? иммуноэлек-

- 'с -

трофорез.

Между тем, существуют литературные данные о том, что при такта патологических состояниях, как ревматоидной артрит у людей, экспериментальная злокачественная опухоль у животных, наблюдаются значительные расхождения между биологической актив -ностыо фибронектина и его концентрацией как антигена ( ВаЬь т.

1980 ). Одной из причин такого расхождения может быть циркуляция в кроЕИ функционально неполноценного фибронектина, его фрагментов или комплексов, которые, однако, сохраняют иммуно -химическую реактивность.

Одновременное определение уровня фибронектина как анги -гена и его биологической активности должно позволить более правильно оценивать его участие в патогенезе различных заболеваний, обеспечивая объективную клиническую интерпретацию полученных результатов для выбора правильной тактики лечения. Но до настоящего времени не имеется простых в исполнении, хорошо воспроизводимых методов количественной оценки биологической активности фибронектина.

Цель работы - отобрать объективные критерии биологической активности, фибронектина и на этой основе создать экспресс-метод определения концентрации биологически активной формы это -го белка.

Основные задачи исследования:

1. Изучить воздействие нативного и денатурированного фибронектина на полиморфонуклеарные лейкоциты в реакции лтаинол-зави-симой хемилюминесценции.

2. Разработать метод определения концентрации биологически активного фибронектина.

3. Изучить возможности метода определения концентрации биологически активного фи.бгюнектина в эксперименте и медицинской . проктите.

- -

Научная новизна работы. Впервые показано, что нативный фибронектин способен*дозо-зависимо усиливать кис.чородниР метаболизм полимгрфпнуклеарныу леРкоют^ог» только после «по взаимодействия с объектом фагоцитоза. Дпя фибронектин-опосредотнной активации клеток необходимы ионы кальция; реализация действия кальция осуществляется при участии к.чльццевьтх канн лов.

При изолированной черепно-мозговой травме у гаросльгх и заболеваниях органов дыхания у детей концентрация биологически активного фибронектина в плазме изменяется параллельно имчуно-реактивному. При чгфепно-чоз говоР травмй, сочетанчоР с повреждением опорно-двигательного аппарата, а также при внутривенном введении ппепаратои «елстиноля происходит значительное снижение .уровня биологически активного фибронектина при незначительном падении гго концентрации кейс антигене.

Практическая ценность. Разработал способ получения устоГ-ччвых ппи длитетьном хранении желатинирированных микрочасгии для определения концентрации биологически актипного фибронектина. Предлочентае критерии нативности фибронектина позмолчли разработать те^нологио получения пастеризованного препарата этого белка с сохраненном биологической активности.

Параллельное определение уровня фибронектина в тесте агрегации желатинизированннх ликроче.стяц и одним из иммунохнмичес -ких методов позволило рекомендовать хирургам отказаться от применения желатиноля для гнутривеннкх инфузий как агента, блоки -рукщего фуккцион&льнуо активность фибронектина.

Положения, вчносимке на защиту:

I. Фибгюнекгш при в.чаимодеРетвии с золотистым стлф^локо-гком и желатинизированнк^и микрочастицами проявляет опсоничес-куп активность, вызывая '-тимулячко кислооод-злеисиг/ого уетабо-

- 4 -

лизма полиморфонуклеарных лейкоцитов.

'¿. Агрегация желатинизированных микрочастиц под действи -ем фибронектина специфична и количественно отражает содержание биологически активного белка.

Апробация щботы. Результаты работы докладывались на научно-практической конференции "Современные методы диагностики и лечения в условиях многопрофильной больницу" ( Казань, 1987 ), на конференции молодых учёных ( НИИЭМ им.Пастера, Ленинград, 1988 ), на II Всесоюзном семинаре по фибронектину (Москва,1989), на XII Всесоюзном съезде детских врачей ( Москва, 1989 ).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ.

Внедрение результатов исследования. На I изобретение получено положительное решение, на I изобретение - авторское свидетельство ( М 1775907 ). Разработаны: экспериментально-производственный регламент, временная фармакопейная статья и инструкция по применении фибронектина на препарат "Фибронектин. Глазные ' капли". Документация утверждена йармкомитеточ России ( протокол заседания № II от 25.06.92 ).

Разработаны: экспериментально-производственный регламент и временная фармакопейная статья на получение лекарственной формы фибронектина из отходов производства преааратов крови. Документация утверждена на учёном Совете КНИИЭМ ( протокол Р 8 от 9.11. 90 ).

Оформлены временная фшмгжопейная статья, инструкция по применений к регламент на производство диагностикума "Жела-книзированные микрочастицы". Документация рассмотрена на засед-зиии учёного Совета КНИИЭМ ( протокол № 4 от 31.04.89 )'. Представлены ь Зарч-'. ксмитет га России. 1990.

Сформлзнн методические рекомендации " Диагностика гипо- ги -

перфибронектинемии", рассмотрены на учёном Совете КНИИЭМ (протокол 10 от 1.10.90 ), представлены с Государственный комитет санитарно-эпидемиологич!. :кого надзора для утверждения ( январь 1992 ).

Структура и объём диссертации. Диссертация состоят из введения, обзора литературы, изложения методов исследования, собственных исследований, обсуждения полученных резулъатов, списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на страницах, приведено 20 рисунков, 10 таблиц.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение полиморфонуклеашкх "ейкотгитов (ПМНЛ). ПМНЛ выделяли по Боям (1968) в нашей модификации. В качестве источника лейкоцитов использовали све>гую кровь- здоровых доноров. Кровб брали из срединной локтевой вены в пластиковую пробирку, Стабилизированную цитратом натрия кровь смешивали с ей раствором декстрана Т-500 и оставляли под углом 45° при комнатной температуре на 40-45 минут. После осаждения эритроцитов надосадоч-ную взвесь, богатуп лейкоцитами, отсасывали и дважды промывали физиологически?.! раствором.

Получение УЕибронекгина. 5ибронектин выделяли из свежеполу-ченной или свежеразмороженной плазмы здоровых доноров на желатиновом сорбенте С Зинкевич О.Д.', 1992 ).

Определение концентрации фибронектина. Концентрацию фибронектина в плазме крови определяли ракетнмм иммуноэлектрофоре -зом ( Аксельсен Н., 1977 ). Для проведения иммуноэлектрофореза использовали гипериммуннуи антисыворотку против фибронектина человека. В качестве контроля использовали разведения стандартно г-о раствора фибронектина с известным его содержанием. Концентрация очищенного препарата фибронектина определяли спектрофо-

тометрически'с использованием коэффициента аиптинкции 1,28 ( 0,1$ ) при длине волны 280 им ( Ыоввяаоп Ы.1975 )•

Идентификация и определение чистоты фибронектина. Идентификацию фибронектина проводили с помощью электрофореза в поли-акриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия без восстановления и с восстановлением f, -м ерк апт о эт гно л ом ( Ьает -и11 1970 ).

Получения тоньргата антител к фибронегтин.у (Ермолин Г.А.и др. 1986 ). Ан"'исыворотку к фибронекгину получала иммунизацией беспородных к поляков растворами фибронектина "еловекп. в полном адьюванте Фре^кда. Коньогат антител с пероксидгзоЯ хрена готовили путём окисления псроксидазы периодатом натрия. Полученный коньюгат хранили в фосфатном буфере при —'.0°Са

Лшинол-зависимая хомилшинесцснция лейкоцитов ( Дуглас С.Д, 1983 ). Активацию лейкоцитов оценивали в реалии люминол-зави-симой хемилшинесцекции с помощью модифицированного нами счётчика /-частиц. В качестве среды инкубации использовали раствор Хенкса с добавлением 15?'альбумина человека. Зпмер хемилюминес-ценции производили с интервалом в одну минуту до достижения пика. Концентрация используемых в опыте ПШЛ составляла 4 х10экл./ мл.

Статистическая обработка данных. Использовали метод вариационной статистики с расчётом средних показателей, их ошибок. Оценку достоверности проводили по критерию Стьпдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В основе разработанного метода определения концентрации биологически активного Фибронектина лржит его способность ры-зывать агрегацию желатинизированннх микрочастиц. Фибронектин имеет два желатин-связываших саРта, к\ягодяииеся на разных це-

пях молекулы, и то агрегации микрочастиц можно судить о целостности его структуры и сохранности -хелатииовых сайтов ( Cheje I. 1979, McDoïiaîA 19ВО ).

Для при тог) в лен'.: я желатинизишванныс микрочастиц ( !КЧЧ ) d качестве основы били использованы клетки эпидермального стафилококка, votopiie освобождали от слабо чвяэанннх гликолипчдов, белков и липидов последовательной обработкой ИМ мочевиной, ацетоном, этанолом, эфиром, а также С,2% раствором додецилсульфата натрия. Исследования показали, что такая обработка является необходимо^ дпч по тушения стабилып-rx в лечение длительного времени микрочастиц. Приготовленное бея предварительной солг'били-эрции белков л пипидог, микрочастицы значительно снижали свою специфическую активность в точение 3-4 месяцев.-Желатин присоединяли г гэлисахаридному остову поело ого активации йодной ■{полотки и глутярым альдегидом,

Сг-^ц'Лгг'о г ь жолат шизирог-ишн* микрочастиц оценивали дгучя незариеимык методтми:

■ I. '.'ачкм из » е/аткнизироЕОЧюгс микрочастиц обрабатывали кполнчьми патент»-) ротками протии г>пидошш1ыгого стафилококка. Добавление к ним люминесцирущи" антисчвороток против глобу-линор кролика но чтнвало свечения маяког. Это сидетелнсгво-гало об отсутствии гштигент-гх де термигнант, характерных для зпи-дгпмальногс стофнчочокка.

2. Пул п тяз\<ы nrçupowr доноров спегифтчяски истощали па H'jpoHeKTvs'r с по^о'лыо и\..гукног<> сорбента. Отсутствие п г»ламз-ме фибронг^тина тн^ролиропали i помоги л ракетчого иммулоялек--•rraüipeaa. 'ютощёцнхя тате™ образом плаз'.а теряла способнгсть агосгирогк; .-ь келч'-'инизкгтванш.е микрсчастици и ьновь приибре-тчлг после добавления оч генного Либроне-тина.

Агрегацию микрочастиц под действием, фибронектина регистрировали с помощью лазерного нефелометра. Установлено, что скорость агрегации ЙОТ существенным образом зависит от наличвд в среде инкубации гепарина. Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными о кофакторной роли гепарина во многих процессах, обусловленных фибронектином ( Моеаа 1901 ). Предполагается, что гепарин, связываясь с фибронектином, усиливает аффинность желатиновых сайтов ( Сг11£1п 19В6 ). В на -ших експериментах концентрации гепарина 10 ед/мл было достаточно для максимального ускорения реакции агрегации КМЧ. Исследования показали, что оптимальными условиями реакции агрегации ШМЧ, регистрируемой лазерным нефелометром, являются: перемешивание, концентрация ЛОТ I г Ю9 ммкрочастиц/мл и гепарина Юер/ мл, рН раствора 7,2-7,4, время проведения реакции 3 минуты. В этих условиях скорость агрегации ЗМЧ прямо пропорциональна количеству вносимого в реакционную среру фибронектина.

Дгся определения концентрации биологически активного фибронектина в исследуемом образце строили калибровочный график зависимости скорости агрегации ЗШЧ от вносимого в кюгегу не-феюметра эталонного раствора фибронектина. В качестве такого растворх использовали свежеразморожекный пул плазмы от 100 доноров, в котором ракет!шм иъмуноэлектрофорелои определяли концентрацию фибронектина. Его. биологическая активность принима -лась за 100 %.

В тесте агрегации КМЧ бнли проанадизировачь' препарат фибронектина, подвергнутые различному химическом?/ лоздействкю и тепловой денатурации. Установлена, что свежеполученный Фибронек-тин проявлял в данном "-есте Ю$-ную биологт-ескую активность. Препараг фибронектина, полученный из пчазмы, хранившейся 10 су-

ток при комнатной температуре, содержал около 50% фракции, обладающей способностью агрегировать ЖМЧ. Обработка препарата трип -сином или $ -меркаптоэтанолом, который, как известно, восстанавливает дисулъфидные связи, также приводила к утрате его агреги -рущей способности. Прогревание фибронектина в течение 0,5 часа при температуре 58бС приводило к снижению активности препарата на 7055. Прогревание при 60°С в -течение I часа полностью лишало фибронектин способности агрегировать ЯШ ( таблица I ),

Таблица Т

Электрофоратическап и биологическая характеристика препаратов фибронектина

4 препарата фибронектина характеристика ПААГ электрофорезе, кД жеяатин-свя-зывающая активность.^ денатурирущео воздействие

I 100^-440 100 -

И ■ 56^-440 Л4/о-220 50+2,6 получен из плазмы хранившейся 10 суток, 25 С

• III ЗЗГ-220 25Й-160 42%-130 0 переваривание трипсином

..1У 25^-800 7да-220 0 / -меркаптоптанол

У Ж-1000 ЗСЙ-440 ' 30+5,3 нагревание 53°С, 0,5 часа

У1 75&-ЮОО 2х-оеадок (удалено центрифугированием) 13+: 4,1 нагревание 58°С I час

УН 12*-Ю0С 80^-осадок (удалено црнтрифуги- - .рОВЯНИРМ) . 0 нагревание 60°С I час

Эти не препарат анализировали на способность усиливать кислородный метаболизм П'.КЛ. Установлено, что нативний фибронектин до-эо-загисимо стимулирует хемилюминесценцию ГГйШ в отчет на ЖМЧ или золотистый стафилококк. Максимальный ответ клеток г обоих случаях достигался при концентрации фибронектина 50 мкг/мл ( рис.1 ).

«И!. «Ум»:

90 U

Рис. Г; Хемилюминесцентный ответ ПМНЛ, стимулированные

ЕИЧ, в присутствии различных концентраци? фибронектина:

• - 12,5 мкг/мл, а - 25 мкг/мл, о - 50 мкг/мл

а - 100 мкг/мл, о - контроль без фибронектина.

Тепловая и химическая денатурация приводит к снижению активности фибронектина в данной реакции. Фибронекткн, подвергнуты!» действию трипсина, ^-ыеркалтоэтанола и глубокому прогреванию, не вызывал агрегации ЖМЧ и был инертен в реакции лшинол-зависичоР хемилюминесценции ГОВД. Эти результаты свидетельствуют о том, что вызывать агрегацию ЖМЧ, а также усиливать кислородный метаболизм клггок в ответ на ИМЧ или 8« aureus способен только фибронектин с сохранённой двухцепочечной структурой.

В дальнейших экспериментах, посвякённых изучению некоторых аспектов фибронектин-зависимого фагоцитоза, использовали препараты, предварительно тестированные по способности ягрегировать F-'ЛЧ

-Jilt соотвптствуиции в данном тесте 1СХ$-ноЯ активности.

Установлено, что усиление хемилшинесценция наблюдалась при одновременном внесении в реакционную среду ПМНЛ, фибронектина if Ж'.П ( или Э.нигвия ), а также при прздваритечьной олсониэа-ции объектов фа гоцироза. Напротив, предваридельная обработка ПМНЛ фибронекткном не вызывала усиления хемилюмичпсценции ни в ответ на ОТ, ни на 3. aureus

Прямым доказательством взаимодействия фибронектина с объектом фагоцитоза, в частности с микроорганизмами, явились наши исследования по их фибронектнн-свяоывакщвЯ способности.

Клинические изолятн Salaonella связывали $ибронектин, но в значительно меньшей степени, чем З.аигзиз Jft>5. Анализ этих пттммов на способность стимулировать хемилюминесценцию ПЧШ1 в г.рисутстгии фиб^отктина показал, что птаммы, мачо спязывакщиа фибронгктин, спабо стимулируют хемилетикнесценцт.). Эти данные, на пая взгляд,-подтрерждаит точку зрения, что фибронектнн но меха -нилм.у действия относится к oncommw. усиление фагоцитарной ак-тнмтсти клеток происходит после их взпимодействия с опсонизиро-раиннми фиброкектчном частицами. Фибронектнн, не иммобилизован -' ныР на объекте фаиоцитоса, если и взаимодействует со своими рецепторами на ПМНЛ, то это не приводит к активации кислородного метаболизм/'..

Наыи исследования свидетельствуют о том, что для реализации функций фагоцитов, обуслокяенгол фибронлктином, необходимы ионы кя"ыхия. Е «езкалмшевой с.реде ок^ивацил кислородного метаболизма в присутствии опсониэироьанннх фибронектином, но происходило ( рис. " ). Дс бгвлемлг- ггальцт приг^д'ило к дозо-занчлимому усилению х^-илюм:!нгсценгпл ГМЛ. ЗнеклетичныР магний не гчаство-гал ч фибппнектино-аавиегчой активации •г.теток.

Дгя oi'-jTcn^H"! гозмр ".-мх че-'шизмов участия экстраклртотю«

нт.и'/пи*.

о. р+

Рис. 2. Влияние ионов Са и М^ на хемилюминесцент-ный ответ ПМШ1, стимулированных опсонизированннмн фяб-ронектином ( 50 мкг/мл ) КМЧ: в - раствор Хенкса без Ca2+ и 24; л - Са2+ ( 1,2хЮ~3Ы), Ujr+(0,9xI0_3M)}

а - Са*"+( 1,2х1(Г3!.!); д - М<,2+"(0 ,9хКГ3М); о -контроль без фибронектина в полном растворе Хенкса¿

го кальция о активации кислородного метаболизма ПМШ1 были проведаны исследования по влиянию на этот процесс блокатора кальциевых . каналов - вераламила. Установлено, что nej&naMiui вызывал дояо-оа-висимое кнгибировалие хемилвдминесценции стинулированггх оп~

сонизярованными фибронситином КМЧ.

Полученные данные позволяют предположить, что взаимодействие фибронектина'со своими рецепторами на фагоцита)- приводит к открытию кальциевых каналов, в результате чего ответ клетки инициируется повышением концентрации кпльция о цитоооле за счёт его гхождении извне.

Нами {(Ц.ю также изучено совмгсткое воздействие на П.'Щ опсокк-нов двух классос - фибронектина и антител tgQ . При одновременно?

ких дней, и в случае положительного исхода операции, нормали -зовался только на 8-9 сутки. Резкое снижение уровня биологически активного фибренектина трудно было объяснить теоретически, поэтому нами было изучено влияние компонентов перфузионного раствора, котором заполняется аппарат искусственного кровообращения, на биологическую активность фибронектина. Было обнаружено, что входящий в состав гемодилнта желатдаоль блокирует функциональную активность плазменного фибронектина как в тесте аг -регации Е'ЛЧ, так и в тесте люминол-эависимой хемилюминесценции ПМНЛ.

По нашей рекомендации хирургами тголаткноль был исключён из состава перфузионного раствора. С изменённой рецептурой были проведены операции у 21 больного. Динамика уровней фибронокти-на у этих Сольных представлена на рис. 4 Б. При осуществлении операции бея желатиноля уровень биологически активного фибро -нектина но доходит до критического и изменялся параллельно уоов-ню иммуноре.актиЕного. Нормализация кол;гчества плазменного фибронектина по обо.м показатолям наступала также на 8-9 сутки. Наиболее существенным итогом изменен:« рецептуры было уменьшение летальности больных с дг> 11%. По мнению хирургов (проф. Медведев В.Н.), восстаногительнмй период у второй группы больных протекел значительно легче и быстрее, они на 2-3 дня меньше находились и роанкмацчи и на это же время у них отпад,ала необходимость п дренаже.

Апробацию метода агрегации Ю1Ч проводили также на кафедре педиатрии Я I ( зг.в, - проф. Пипу за 0.11.) Казанского медицинского института.

Устаноглено, что при острых заболев*лиях органов дихчния / де^еР происходит сьиженл» уровня ялазмегиого ф-дбронсктиьа. Наибольшее с1По.ение няблюдалгпь у де?ей, больных пневмонией. Зтим

пациентам, наряду с традиционной тэрашоЯ, вводили криопреци-питат, которые, как известно, богат фибронектином. Введение криопренипитата осуществляли под контролем уровней биологически активного и иммунореактивного фибронектина. Эти показатели определяли до и после внутривенной кнфузиипрепарата. Дозы криоппе-ципитата рассчитывались с учётом биологически активного фибронектина так, чтобы его уровень в плазме после пведения дости -гал нормального содержания - 250-300 мкг/клС таблица 3 ).

Таблица 3

Упот'рнь фибронектина у детей, больных пневмонией, до и после введения криопреципитата

боль- иммугореа.^тишпий фибро-ного пектин, и г г/мл

до

после

биологически активный фиС-ронектин, мкг/мл

до

после

ЗГ'0-9,5

Р<0,0Г1

2Лч±Г>,2 450-11,2

\'<0,0',

2001-3,0

424^12,1

Р<0,0Ь

1г73-4,3 360±9,0

Р<0,0&

140+3,5 2-18-5,2

Р<0,05

Р'10,05

220±Ц

М0±7,-1 „ 336^16,Г Р<0,05

Р<0,05

14 3^*18,0

Р<0,05

Г-'0,05

"р1<мечанис: конгентрацил иммунореактивного фибр< нектинч в криопрецниитатах состчапяла 4-Г.'2+С>12 мкг/мл, биологически активного - 2992+1:9 мкг/мл."

Нормализация уровня фибронечтина бы т отмечена сразу *-е после введения криппреципитата, прлчё'| три говтор юм анялизо ч^-рез сутки этот показатель ок-шглся с га';члыгкп. По мнегию клинлгцистое ( проф. "жупа 0.1!. ), длнлмически."» контооль за течением иолегни

г

3

выявил благоприятный терапевтический эффект включения криопре-цкпитата п комплекс лечения детей, больных острой пневмонией.

•Изменения уровня биологически активного и иммунореактил -ного фибронектина было также обнаружено у больных с черепно-мозговыми травмами. Эти исследования проводились на базе Казанского филиала ( директор - докт.мед.наук Х.З.Гпфаров ) Всесоюзного курганского научного центра "Восстановительная травматология и ортопедия". Под наблюдением находилось 30 больных, которое были разделен»,! на две группы: больные с изолированной черепно-мозговой травмой (Ч'-ГГ) и больные с ЧЧТ, сочотанной с повреждением опорно-двигательного аппарата. Показано, что в обеих группах имело место снижение уровня биолоп <ески активного фибронектина, однако, при сочетанной ЧМТ сдвиги носили более выраженный характер. На 3-4 сутки наблюдалось наиболее значительное падение уровня биологически активного фибронектина ( до 05,8-19,8 мкг/мл ) при достаточно высоком содержании его как антигена - 218-35,4 мкг/мл С таблица 4 ).

Одной из причин снижения биологической активности фибронектина при сочетанной Ч\ГГ может быть выход большого количества протеаз, под действием которых образуются фрагменты фибронектина, не способные агрегировать ЕМЧ. Другой причиной циркуляции фибронектина в неактивной форме может быть его комплексирование с обломками клеточных мембран, коллагеном, актином и др., образующимися при массивном поражении тканей.

Проведённые исследования показали,- что параллельное определение уровня фибронектина одним из иммунохимических методов, а т^кже по агрег^гли жолатинизированных микрочастиц, позволяет гняр;;?ь циркуляцию фибронектина в кровеносном русле в биологически неактивно?? форме С например, сочеганная ЧУГ, применение внутри-«енчой инфузяи желатиноля ).

•Таблица 4

Уровень плазменного фибронектина у больных о острой изол^рсгя.тпю* и ссчетанной

черепно-мозговой травмой

Показатели Контрольная Дни исследогагля

фибронектина группа ——;-----

Д-2 3-4 - . 5-6 7-9

Фнбронектил

биоактивный, мкг/мл 341,(^29,2 186Д±59,5 184,5±38,2 194,5+31,2 257,0±44,8

Р - ■ <0.05 <0,05 <0,05 >0,05

1 лммунохимичео-кий, мкг/мл 337,0±22,0 248,1^35,6 238,3+28,9 320,5*42,7 326,1±52,4 Г

Р >0,05 >О7О5 >0,05 >0,05 £

•Еибронектич'" • ' 1

биоактивный, мкг/мл . 341,0^29,2 141,8+47,3 65,8^19,8 195,0+55,7 285,0+60,6

Р . <0,05 <0,05 <0,05 >0,05

иммунохимичес-кий, "«КГ/МЛ 337,0*22*0 242,0+29,7 218,0+35,4 338,0+35,7 422,5+135,6

Р - •>0,05 . <0,05 >0,05 >0,05

чяг.

- 21 -

Это, на на'Л взгляд, может иметь практическое значение в исследованиях по разработке оптимального подхода к восстановлении опсонгическоР активности фибронектина в крови.

ВЫВОДЫ

1. Натигнып фибронектин дозо-зависи«о усиливает хемилюминес-ценцию полиморфонуклеарных лейкоцитов пру олсониэоции желатинизи-рованнтлс микрочастиц и клеток золотистого стафилококка.

2. Тепловая обработка, переваривание трипсином, а также химическая модификация 5 - 3 - групп приводит к снижению актив -ности фибронектина в тесто люминол-зависимой хемилюминееценции полиморфонучлеарных лейкоцитов.

3. Совместная опсонизация стафилококка фибронектином и ан-тистафилококковши антителами приводит к усилении кислородного метаболизма пол!тмсрфонуклеарных лейкоцитов, значительно превы -аагацему сумму их индивидуальных воздействий.

4. Для стгау.тяции кислородного мотчболизка полиморфонукле-арнмх лейкоцчтоп спсонизированными фибронектином желатинизирован-ными микрочастицами необходимы ионы кальция; в реализации этого процесса участвуют кальциевые каналы.

5. Предложенной метод определения концентрации фибронектина по его способности агрегировать желатинизированные микрочастицы специфичен и отражает уровень биологически активного балка.

6. При заболезаниях органов дыхания у детей происходит снижение уровня бголорически активного и ишунореактивного фибронектина в плаэкп крови.

7. Уровень биологически активного фибронектдо.а значительно снижен по сравнешг) а икмунореактиэдым в ¡иазме (ольных с пере.т-но-моэговым'1 травмами, сочэтанными с повреждением опорно-двига -тетьного алл грата.

3. Использование желагиноля г качестве крогезаменитоля при

- И2 -

операциях на сердце с применением искусственного кровообращения приводит к значительному ингнбированию биологической активности фибронектина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Авт.св. » 1775907 А I. Способ обработки фибронектина./ Зинкевич О.Д., Харрасов А.®., Сафина H.A., Зайнуллин A.A. Заявлено 3.10.90, решение 15.07.92.

2. Заявка 4902664/14 (II0279), МКИ А6Ш7/02. Способ выделения фибронектина./ Зинкевич О.Д., Харрасов А.Ф., Сафина H.A. Заявлено 14.11.90, решение 19.02.92.

3. Сафина H.A., Серёдкин С.М., Харрасов А.Ф., Зинкевич О.Д, Люминол-зависимая хемилюминесценция нейтрофилов// Сборник научных трудов КНШЭМ.-1986.-С.П0.

4. Харрасов А.Ф., Сафина H.A. Оибронектин-связыващая активность клинических изолятов шетелл// Сб.тезисов респ. ноушо-прак-тич. конференции. Современные методы диагностики в условиях мне -гопрофильной больницы. Казань.-1987.-С.43.

5. Пикуэа О.И., Зинкевич О.Д., Мерфогель М.С., Харрасов А.S., Сафина H.A. Клиническое значение уровня фибронектина для оценки тяжести и прогноза острых заболеваний органов дыхания у детей.

// Педиатрия.-1988.- V9.-C.I9.

6. Сафина H.A., Мерфогель М.С., Харрасов А.5., Зинкшич О.Д. Показатели фибронектина в оценке течения и прогноза острых пневмоний, осложнивших ОРВИ у детей раннего гозраета // Тезисы докладов XII Всесоюзного съезда детских врачей, 6-8 декабря, г.Чосква.-М.-19С8.-С.Г75.

7. Сафина U.A., Харрасов А.Ч., Зинкевич О.Д. Метод «пределе-ния биологически активное фиброкеьггина // Лаб.дело.-1989.-*4.-С.27.

8. Зубаиров Д.М., Брикман И.В., Зинкевич О.Д., Литвинов Р.И., йбадова С.И., Исаева Р.Т., Харрасов А.Ф,, Сафина H.A., Ермолин Г.А., Котелянский В.Э., Ефремов F,.E., Арзамасцев Е.В. Разработка ле -карственного препарата фибронектина и обоснование его применения для стимуляции заживления роговицы. // Каз.мед.ж.- 1989.

С.48.

9. Медведев В.Н., Зинкевич О.Д., ¡фгинов М.А., Сафина H.A., Харрасов А.Ф. Почему мы отказались от применения желатиноля при искусственном кровообращении // Каз.мед.ж.-1990,-№1.- C.I2.

10. Пикуза О.И., Зинкввич О.Д..Мерфогель М.С., Харрасов А.5., Сафина H.A. Эффективность криолреципитата в комплексном лечении острой пневмонии у детей fj Каз.мед.ж. - I990.-WI.-C.29.

11. Зинкевич О.Д., Сафина H.A., Харрасов А.Ф., Мингазова А.Х. Влияние препаратов фибронектина на хемилюминесцентный ответ ней-трофилов // Вопросы мед.химии.-1990.-С. 53.

12. Зинкевич О.Д., Медведев В.Н., Сафина H.A..Харрасов А.Ф., Мугинов М.А.. Биологические эффекты желатиноля при искусственном кровообращении// Клинич. медицина.- 1990,- W9.-C.66.

13. Анохин В.А., Зинкевич О.Д., Николаев A.M., Харрасов А.Ф., Сафина H.A., Хаертынов Х.С. Плазменный фибронектин и острые респираторные заболевания у детеП раннего возраста // Вопр. охраны материнства я детства.- 1990,- № 2.- С.16.

14. Евсеев S.W., Зинкевич О.Д., Харрасов А.З., Сафина H.A. Динамика плазменного фибронектина у больных с острой изолированной и сочетанной черепно-мозговой травмами // Каз.мед.ж. - 1991.-¥ г.- С.124