Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-биохимические механизмы адаптации травянистых растений в условиях Предбайкалья

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические механизмы адаптации травянистых растений в условиях Предбайкалья"

4852561

Живетьев Максим Аркадьевич

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ ТРАВЯНИСТЫХ РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ ПРЕДБАЙКАЛЬЯ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

' 1 СЕН 2011

Иркутск - 2011

4852561

Работа выполнена в лаборатории фитоиммунологии научного учереждени Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделени Российской Академии Наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Граскова Ирина Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Суворова Галина Георгиевна (СИФИБР СО РАН, г. Иркутск)

доктор биологических наук, проф. Чхенкели Вера Александровна (ИрГСХА, г. Иркутск)

Ведущая организация: Институт биологии Карельского НЦ РАН

Защита диссертации состоится «06» октября 2011 г. в 10 ч. на заседании диссертационного совета ДООЗ.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Факс (3952)510754, e-mail: matmod@sifibr.irk n)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Текст автореферата размещен на сайте Института fwww.sifibr.irk пЛ «03» августа 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета г> й

кандидат биологических наук Г.П. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Исследование современного состояния экосистемы озера Байкал и механизмов ее функционирования методами физико-химической и молекулярной биологии является весьма актуальным. Работа направлена на решение фундаментальной проблемы устойчивости растений к абиотическим стрессам в климатических условиях озера Байкал. Решение этой проблемы связано с пониманием основных молекулярных и физико-химических механизмов, реализуемых в растительных клетках при стресс-адаптации к абиотическим факторам, присущим климату озера Байкал.

Температура окружающей среды является важным фактором, определяющим географическое распространение растений и их продуктивность (Титов и др., 2006; Лось, 2005). В силу этого, внимание ученых все больше концентрируется на изучении механизмов толерантности и адаптации высших растений к гипотермии (Войников, 1987; Кузнецов и др., 1987). Поскольку у растений отсутствуют поведенческие механизмы защиты от действия низкой температуры, основные адаптивные изменения происходят на организменном, и особенно на клеточном уровнях (Чиркова, 2002). В ходе целого ряда исследований выявлена группа неспецифических реакций, к которым относятся, прежде всего, изменение проницаемости клеточных мембран, внутриклеточного рН, накопление защитных веществ, в частности, стрессовых белков, липидов, растворимых углеводов. При этом показано, что одним из самых ранних эффектов при охлаждении растений является окислительный стресс, обусловленный накоплением активных форм кислорода (АФК) (Кулаева, 1982; Тарчевский, 2002). Для защиты от него в растениях существует антиоксидантная система, состоящая из ферментов (супероксиддисмутаз, каталазы, пероксидаз и др.) и низкомолекулярных антиоксидантов. Изменение в спектре защитных белков и экспрессионной активности их генов под влиянием низкотемпературного стресса позволяет выявить физиологические предпосылки устойчивости растений. В связи с открытием сигнальной и защитной роли активных форм кислорода, большое внимание уделяется оксидоредуктазам, регулирующим их уровень в клетке (Тарчевский, 2002). Среди них особый интерес представляют пероксидазы, активность которых коррелирует с развитием устойчивости растений к абиотическим стрессам (Полесская, 2007). Являясь конституционно необходимым, этот фермент участвует в различных биохимических реакциях, происходящих в живом организме (Андреева, 1988). Поскольку пероксидазы представляют собой семейство полифункциональных белков, возникает определенная трудность в разграничении роли отдельных молекулярных форм фермента в различных физиологических процессах растительного организма (Минибаева и др., 1997).

В метаболизме живых растительных клеток ведущая роль, наравне с белками и нуклеиновыми кислотами, принадлежит липидам. Однако вопросы липидного обмена у исследуемых растений совершенно не изучены. Считается, что липиды клеточных мембран играют важную роль в формировании устойчивости растений к неблагоприятным факторам окружающей среды. Эта устойчивость зависит от наличия в клеточных мембранах полиненасыщенных жирных кислот (Лось, 2005).

Озеро Байкал находится в зоне резко-континентального климата, где значительные сезонные и суточные перепады температур заметно влияют на состояние и механизмы функционирования его экосистемы. Действие абиотического стресса, такого как низкие температуры, может привести к активации защитных и приспособительных реакций, в результате которых растение акклиматизируется к новым условиям. В этих условиях может увеличиваться активность ряда ферментов и синтез некоторых биологически активных веществ.

Научная новизна. Впервые была исследована общая, растворимая и слабосвязанная с клеточной стенкой пероксидаза пяти видов травянистых растений, произрастающих на побережье озера Байкал в связи с климатическими особенностями Прибайкалья. Был проведен анализ стрессовых белков в листьях этих растений. Выявлено влияние пероксидазной активности на синтез дегидринов в растительных клетках. Впервые подробно исследован жирнокислотный состав пяти видов лекарственных растений. Проведен анализ изменения состава жирных кислот, степени их ненасыщенности и активности аминоацильных десатураз, осуществляющих преобразование насыщенных связей в молекулах основных жирных кислот в ненасыщенные. Выявлены видоспецифичные и климатообусловленные особенности жирнокислотного метаболизма изучаемых растений. Изучено накопление растворимых Сахаров в листьях растений в течение вегетационного периода и выявлены особенности метаболизма углеводов в зависимости от вида растения и условий произрастания. Прослежено содержание воды в листьях изучаемых растений в течение периода вегетации и выявлены взаимосвязи с внешними условиями окружающей среды и метаболизмом растений. Прослежена суточная, динамика углеводов, белков, жирнокислотного состава манжетки городковатой в осенний период в связи с суточным ходом температуры воздуха. Показаны изменения активности различных аминоацильных десатураз в листьях манжетки в связи с сильными колебаниями температуры атмосферного воздуха в течение суток. Изучено суточное изменение пероксидазной активности и содержания ее субстратов фенольной природы на примере флавоноидов. В целом, всестороннее изучение проблемы адаптации растений к климату Прибайкалья показало серьезные преобразования метаболизма не только в течение летне-осеннего периода вегетации, но и не менее существенные перестройки обмена веществ в течение одних суток. Накопленный экспериментальный материал позволил сделать автоматический корреляционный анализ в программе 81аЙ8Йка 6.0 и выявить закономерности изменения биохимических и климатических параметров друг относительно друга.

Практическое значение работы. Результаты проведенных исследований могут помочь в понимании процессов адаптации высших растений к климатическим особенностям Прибайкалья и Сибири и основных молекулярных и физико-химических механизмов, реализуемых в растительных клетках при стресс-адаптации к абиотическим факторам, присущим климату озера Байкал. Полученные результаты могут быть использованы в курсе лекций по физиологии, биохимии, экологии и географии растений. Полученные результаты могут быть использованы для выработки стратегии природоохранных мероприятий, направленных на

сохранение экосистемы озера Байкал и имеют важное значение в осознании уникальности ее фитоценозов.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, 24-28 августа 2009 г.; Всероссийской конференции с международным участием, посвященной памяти J1.B. Бардунова (1932-2008 гг.) «Проблемы изучения и сохранения растительного мира Евразии», Иркутск, 15-19 сентября 2010 г.; Международной научной конференции и международной школе для молодых ученых «Проблемы экологии: чтения памяти профессора М.М. Кожова», Иркутск, 20-25 сентября 2010 г.; Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс», Москва, 9-12 ноября 2010 г.; Третьем международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений», Казань, 28 июня - 1 июля 2011 г., Съезде физиологов растений «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий», Нижний Новгород, 4-10 июля 2011 г.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов. Список цитируемой литературы включает 290 работы отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 219 страницах и иллюстрирована 53 рисунками и 21 таблицей.

Целью исследования было изучить особенности комплексной адаптации тысячелистника азиатского {Achillea asiatica Serg.), одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.), подорожника большого (Plantago major L.), вероники дубравной (Veronica chamaedrys L.), манжетки городковатой (Alchemilla subcrenata Buser) к осенней гипотермии в условиях Предбайкалья.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать изменения активности и молекулярных форм пероксидазы в тканях исследуемых растений в течение периода вегетации.

2. Изучить жирнокислотный состав, степень ненасыщенности жирных кислот и активность десатураз этих растений в течение периода вегетации.

3. Сравнить содержание стрессовых белков (Hsp60, 70, 101, 17,6, Corl4b, дегидрины) исследуемых растений летом и осенью.

4. Проследить динамику содержания воды и Сахаров в этих растениях в течение периода вегетации.

5. Исследовать эндофитные бактерии изучаемых растений в связи с возможным их участием в адаптации.

6. Выявить изменения в тканях манжетки в течение суток в связи со сменой отрицательных ночных и положительных дневных температур.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили пять видов лекарственных растений: тысячелистник азиатский (Achillea asiatica Serg.), одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale Wigg.), подорожник большой (Plantago major L.), вероника дубравная (Veronica chamaedrys L.), манжетка городковатая (Alchemilla subcrenata Buser). Отбор растений производили соответственно на левом берегу реки Выдриная в 700 м от уреза озера Байкал на территории стационара СИФИБРа и в Иркутске на

территории дендрариума СИФИБРа. Отбирались тысячелистник, одуванчик и подорожник на обеих экспериментальных площадках, а также вероника и манжетка, массово представленные на стационаре «р. Выдриная», но не встречающиеся в Иркутске.

Выделение слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы. Для определения активности фермента пероксидазу выделяли холодным цитратно-фосфатным буфером (pH 5,5) при разреженном давлении (Граскова и др., 2004). Для выделения слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз для последующего электрофоретического разделения использовали 2 мл холодного Sample-буфера, содержащего трис, глицерин и меркаптоэтанол.

Выделение растворимой пероксидазы. Для определения активности навеску ткани после экстракции слабосвязанных пероксидаз растирали в холодном цитратно-фосфатном буфере (Паду, 1995). Для выделения растворимых пероксидаз для последующего электрофоретического разделения использовали 2 мл холодного Sample-буфера, содержащего трис, глицерин и меркаптоэтанол. Определение активности пероксидазы. Активность пероксидаз в листьях растений определяли сразу ■ после выделения ферментов из образцов по изменению оптической плотности (длина волны 580 нм) в реакционной смеси следующего состава: 0,5 мл 0,1 М цитратно-фосфатного буфера (pH 5,5), 0,5 мл 0,3 % перекиси водорода, 0,5 мл 0,05 % гваякол и 0,5 мл пробы (Граскова и др., 2004). Активность фермента рассчитывали по методу Бояркина (Бояркин, 1951). Определение термостабильности пероксидазы. Термостабильность пероксидазы определяли по активности фермента при разной температуре реакционной смеси (шаг 5 "С, диапазон от 0 °С до 50 °С).

Определение оптимальной pH для пероксидазы. Оптимум pH определяли по максимальной активности фермента в цитратно-фосфатном буфере с разными значениями pH (шаг pH 0,2) (Граскова и др., 2004).

Определение молекулярных форм пероксидазы в листьях растений с помощью нативного электрофореза. Электрофорез проводили в блоках полиакриламидного геля в модифицированной системе Лэммли (Laemmli, 1970), на приборе Mini-PRONEAN III Electrophoretic Cell фирмы Bio-Rad (USA) согласно инструкции (Побежимова и др., 2004). Для выявления ферментативной активности в полиакриламидном геле использовали диаминобензидиновый метод в модификации (Лойда и др., 1982).

Определение содержания воды в листьях растений. Содержание воды в листовых пластинках определяли стандартным методом высушивания до постоянного веса при температуре 105 °С.

Определение содержания Сахаров. Для определения общего содержание водорастворимых Сахаров в растительных тканях использовали антроновый метод (Кочетков и др., 1967). Оптическую плотность раствора промеряли на спектрофотометре Soekol -10 («Karl Zeiss», Германия) при длине волны 620 нм. Определение жирнокислотного состава. Использовали методом газожидкостной хроматографии с использованием хромато-масс-спектрометра 5973N/6890N MSD/DS Agilent Technology. Капиллярная колонка HP-INNOWAX (30мм х 250мм х 0.50 мкм). Относительное содержание ЖК определяли в весовых процентах от

общего их содержания в исследуемом образце. Для оценки ненасыщенности ЖК в тканях листьев использовали индекс двойных связей (ИДС): ИДС=£P¡ «/100, где P¡ -содержание ЖК (вес. %) и щ - количество двойных связей в каждой кислоте. Также использовали коэффициент ненасыщенности жирных кислот (К) как отношение суммы ненасыщенных ЖК к сумме насыщенных.

Определение активности десатураз. Активность ацил-липидных со9, соб и мЗ десатураз, катализирующих введение двойных связей в углеродные цепи олеиновой (С 18:1), линолевой (С18:2) и а-линоленовой (С18:3) кислот определялась соответственно как стеароил- (SDR), олеил- (ODR) и линолеил- (LDR) десатуразные отношения, рассчитанные на основании содержания (процентного от суммы ЖК) компонентов С18, как это описано в работах (Jaworski, Stumpf, 1974; Mazliak, 1994; Cartea et al., 1998; Алаудинова, Миронов, 2009).

Электрофорез в ПААГ. Выделение белка осуществляли по стандартной методике (Побежимова и др., 2004). Электрофорез в ПААГ и последующий перенос на нитроцеллюлозную мембрану проводили в модифицированной системе Лэммли (Laemmli, 1970), на приборе Mini-PRONEAN IIIElectrophoretic Cell фирмы Bio-Rad (USA).

Вестерн-блотинг. Нитроцеллюлозную мембрану выдерживали в растворе (1:1000) первичных антител, потом обрабатывали вторичными антителами (1:1000). Окрашивали BCIP и NBT.

Определение содержания флавоноидов. Содержание ФС в исследуемом растворе определяли по стандартной методике (Харборн, 1968) с использованием реактива Фолина - Дениса и последующим измерением оптической плотности при 720 нм с помощью SPECORD S 100 («Analytikjena», Германия).

Определение содержания витаминов. Содержание водорастворимых витаминов определяли методом капиллярного электрофореза в системе G1600AX СЕ 3D (Agilent Technologies, Германия).

Исследование эндофитных бактерий. Бактерии выделяли из листовых пластинок растений после стерилизации их поверхности раствором белизны. Для идентификации полученных культур проводили стандартное описание их роста на плотной питательной среде, и на бульоне, делали тест гидроокисью калия (КОН), определяли каталазную активность, тест на окисление-ферментацию (ОФ) среды, рост на среде Симмонса и восстановление нитратов до нитритов. Также определяли целлюлазную, протеолитическую и амилолитическую активности бактерий, рост на среде Эшби, способность образовывать биопленки и фититоксичность культур. Содержание Сахаров в культуральной жидкости определяли антроновым методом (Кочетков и др., 1967). Все исследования проводились в 3 биологических и трех аналитических повторностях, содержание воды - в пяти биологических повторностях. Полученные результаты обрабатывались статистически: рассчитывались средние арифметические величины, и стандартные отклонения. Статистическая обработка результатов экспериментов проводилась с использованием компьютерных программ StatSoft (Statistica 6.0). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование изменения активности и молекулярных форм пероксидазы, выделенной из тканей исследуемых растений в течение вегетации.

У исследуемых растений были определены оптимальные значения рН для активности и термостабильность растворимой пероксидазы (табл. 1).

Таблица 1. Оптимальные значения активности и термостабильности растворимой пероксидазы листьев растений Прибайкалья, собранных в период вегетации.

Растение Активность растворимой пероксидазы (условн.ед./г. сырой массы) при оптимальных значениях рН Максимальная активность растворимой пероксидазы (условн.едУг. сырой массы), оптимальная температура -1:°С

июль август сентябрь июль август сентябрь

Одуванчик 0.556=1=0.04 рН-4.6 0.709±0.09 рН-5.8 0.470±0.04 рН-5.8 0.550±0.023 1-25 0.720±0.016 1-20 0.588±0.011 1-35

Манжетка 0.130±0.01 рН-6.б 0.121±0.012 рН-6.6 0.101±0.019 рН-6.6 0.196±0.009 Х-25 0.257±0.011 1-30 0.124±0.016 1-25

Тысячелистник 0.518±0.019 _рН-6.2 0.498±0.031 _рН-5.8 1.249±0.023 рН - 5.0 0.680*0.043 1-20 0.688±0.014 1-20 0.894±0.020 1-35

Вероника 0.740±0.069 рН-5.4 0.544±0.050 рН-5.8 0.30б±0.040 рН-6.6 0.661±0.017 1-20 0.801±0.027 1-30 0.389±0.012 1-30

Подорожник 0,261=1=0,017 рН-5,4 0,369±0,024 рН-5,4 0,168=1=0,011 рН-5,4 - -

« ' 1 ' 1 -----------------)

рН для пероксидазы и изменение термостабильности исследуемого фермента у всех изучаемых растений преимущественно в сторону усиления термоустойчивости, за исключением манжетки (табл. 1). Изменение этого показателя может свидетельствовать о том, что температура окружающей среды в месте произрастания растений оказывает существенное влияние на физико-химические свойства фермента.

Была изучена активность растворимых и слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз в исследуемых растениях с учетом температурного режима точек сбора (рис. 1). Наблюдаются преимущественно два пика активности пероксидаз - летом и осенью, что может быть связано с внешними условиями среды обитания и с фазами онтогенеза растений. Осенний пик у иркутских растений смещен на начало октября, а на Байкале он приходится на конец октября, за исключением манжетки, у которой второй пик активности пришелся на конец августа - начало октября. Осенью наступление отрицательных температур в октябре приводило в Иркутске к спаду активности пероксидазы у всех пяти видов растений, а на Байкале, наоборот, к усилению (за исключением манжетки).

Пероксидазы растений имеют множество изоформ, каждая из которых отличается аминокислотными последовательностями и экспрессируется для участия в разных физиологических процессах (Андреева, 1988). Поэтому были изучены молекулярные формы пероксидазы в исследуемых растениях. Максимальное число форм фермента показано у тысячелистника азиатского 31 августа в Иркутске: 13 молекулярных форм, из которых 6 - слабосвязанных с клеточной стенкой и 7 -растворимых. Изоферментный спектр пероксидазы изучаемых видов растений был очень изменчив в течение периода вегетации и содержал лишь по 1-3 стабильных фракции с постоянной электрофоретической подвижностью (11*). Среди форм растворимой пероксидазы имеются как общие для тканей большинства видов растений (Яг 0,58 и 0,62), так и видо- и сезоно-специфические, что может быть связано с разными их функциями в тканях разных растений..

28 2.0

. 23 1« о \ 1 1 va i 1

;■{ i \\ 1

Э 1 jj [ \ Г'

■г * L

J -и 0.0 '

10 августе 31 негуста 9 октябри Юогтября Двти отбора проб

10 августа 31 августа в октября 1В октября Дата отборе проб

Ь" \ jr-rJ

И £|

«3 Г 1

!u J

1" Я г|

* м 0 i ■

10 августа31 августа в октября 19 октября Дата отбора проб

10 августа 31 августа 9 октября 19 октября Дет! игборд проб

¿5 ШЯ :' августа 31 ыдгу^и i октября 11 шггЛрп

дата отбора проб

10 aarycn 31 «густа в октября 1В эгтОря

Дата отбора проб

0 августе 31 августа 9 октября 19 октября Дата отбора проб

10 авгуога 31 августе 9 октября 10 октября Дета отбора проб

Рис. I, Изменение активности растворимых и слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз, выделенных из тканей исследуемых растений в течение вегетации

! - активность слабосвязанных с клеточной стенкой пероксвдаз; 2 - активность растворимых пероксидаз; 3 -максимальная температура воздуха в день отбора проб; 4 - среднесуточная температура воздуха; 5 - минимальная температура воздуха в день отбора проб; 6 - температура почвы на глубине 5 см;. А - одуванчик, р. Выдриная; Б — одуванчик, Иркутск; В - тысячелистник, р, Выдриная; Г-тысячелистник, Иркутск; Д - подорожник, р. Выдриная; Е -подорожник, Иркутск; Ж - вероника, р. Выдриная; 3 - манжетка, р, Выдриная.

Изучение стрессовых белков в листьях травянистых растений.

Дегидрины исследовали в пробах, отобранных в начале августа и в середине октября. Наблюдали усиление синтеза дегидринов к середине октября у большинства исследованных растений - по сравнению с началом августа. Также

синтез дегидринов может происходить в летние месяцы при обезвоживании в жаркую погоду и под действием сильной солнечной радиации.

Было показано наличие белков теплового шока (БТШ) с молекулярными массами 60 и 70 kD в растениях, собранных в начале августа и второй половине октября. С наступлением осенних заморозков наблюдали накопление Hsp70. На р. Выдриная сильнее всего увеличение синтеза Hsp70 происходило у вероники и одуванчика, в Иркутске - у подорожника. Экспрессия Hsp60 так же увеличивалась у всех исследованных растений с осенним понижением температур.

Также были проведены исследования на наличие таких стрессовых белковых молекул как HsplOl, Hspl7,6 и Cor 14b в пробах растений, собранных в начале августа и конце октября. Показано, что HsplOl в листьях манжетки накапливается в августе, когда относительно жарко, у манжетки, а Hspl7,6 - в октябре у манжетки и подорожника, произрастающих на побережье Байкала. СогИЬ выявлены в октябрьских пробах подорожника и тысячелистника в Иркутске и одуванчика на р. Выдриная. У вероники, отличающейся по-видимому высокой терморезистентностью, указанных стрессовых белков не накапливалось.

Таким образом, все виды исследуемых растений в той или иной мере накапливали разнообразный спектр стрессовых белков в ответ на неблагоприятные температуры.

Содержание Сахаров в тканях листьев исследуемых растений в течение периода вегетации.

Показано, что с понижением температур воздуха к концу периода вегетации у всех исследуемых растений происходит накопление Сахаров в листьях (табл. 2).

Таблица 2. Содержание растворимых Сахаров (% сухой массы) в листьях одуванчика, тысячелистника, подорожника, манжетки и вероники

Место отбора Проб Дата отбора проб Одуванчик Подорожник Тысячелистник Манжетка Вероника

Р- Выдриная 24. 06 5,208*0,524 6,510±0,662 3,970±0,081 10,503±0,347 4,283±0,159

06.08 6,949±0,176 4,604±0,350 3,640±0,283 4,279±0,231 3,079±0,145

30.08 7,427±0,280 8,287±0,824 7,305±0,590 5,663±0,085 4,285±0,148

08.10 26,079±0,422 17,241±1,443 19,711±0,919 19,224±0,834 14,533±0,752

16.10 42Д84±1,563 27,797±4,150 38,814±1,810 25,162±0,536 21,436±1,788

Иркутск 25.06 11,120±0Д05 5,115±0,576 1,628±0,027 _

10.08 6,134±0,690 3,440«),094 3,863±0,282 >

31.08 3,578±0,267 2,697*0,096 10,284±0,274 „

09.10 13,298±1,379 20Д46±0,886 12,029±0,564 _

19.10 13,603±0,624 15,967±1,865 25,33б±1,306 - -

----Т Т---1-----------ЧУЛИЛМШ иих^улъу IV II ДЧ/^АУО^рП^Х^

зависимость содержания Сахаров от температуры и составили на р. Выдриная: для тысячелистника г=-0,97, р<0,05, для подорожника г=-0,98, р<0,05, для одуванчика г=-0,99, р<0,05, для манжетки г=-0,98, р<0,05 и для вероники г=-1,00, р<0,05 - а в Иркутске: одуванчик г=-0,94, р<0,05, тысячелистник - г=-0,91, р<0,05, подорожник -г =-0,95,р<0,05.

Изучение состава жирных кислот и активности десатураз пяти видов растений в связи с осенним понижением температуры воздуха

На первом этапе изучения жирнокислотного метаболизма при гипотермии исследован жирнокислотный состав растений, произрастающих на юго-восточном побережье Байкала. Из представленных данных (табл. 3) видно, что высокая степень ненасыщенности ЖК в тканях листьев всех пяти видов обусловлена, в основном, двумя кислотами - линолевой (соб) и а-линоленовой (шЗ). Причем линоленовой ЖК (С18:30>3) статистически достоверно больше наблюдалось у тысячелистника и одуванчика (58,51 и 59,06 % соответственно), чем у остальных трех видов, у которых ее содержание варьировало от 50,43 у манжетки до 52,1 у подорожника). Линоленовой кислоты (С18:2со6) у манжетки так же было статистически меньше (16,61%), чем у других видов (18,82-21,04%). Известно, что именно биосинтез диеновых и триеновых кислот 18:2со6 и 18:ЗсоЗ осуществляет биохимическую адаптацию растений к низкой температуре. Судя по вычисленным коэффициентам СЮЛ и Ь011, активность соответствующих десатураз (со6 и ©3) также имела высокий уровень у представленных видов, особенно активность соб-десатуразы.

Таблица 3. Содержание жирных кислот (% вес суммарных жирных кислот) в листьях растений, р. Выдриная.

Кислота Вероника Манжетка Тысячелистник Подорожник Одуванчик

С14:0 0,79 ± 0,27 0,57 ±0,03 0,58 ± 0,16 0,75 ± 0,09 0,42 ± 0,33

С15:0 0,21 ±0,05 0,23 ± 0,04 0,06 ± 0,01 0,26 ± 0,04 0,20 ±0,11

С16:0 17,81 ± 1,68 13,42 ± 0,64 15,02 ± 0,29 16,94 ± 0,94 16,74 ± 1,49

С16:1(п-9) 0,31 ±0,06 0,22 ± 0,09 0,05 ± 0,03 0,20 ±0,05 0,03 ± 0,01

С16:1(п-7) 0,14 ± 0,01 0,06 ±0,01 0,18 ±0,09 0,08 ±0,03 0,03 ± 0,01

С16:1(п-5) 0,93 ± 0,05 1,02 ±0,14 2,12 ±0,52 1,38 ±0,16 1,68 ±0,42

С16:3(п-3) - 0,54 ± 0,05 - - -

С17:0 0,19 ±0,05 0,19 ±0,03 0,15 ±0,02 0,26 ±0,01 0,15 ± 0,01

С18:0 1,81 ±0,40 5,88 ± 0,63 0,92 ± 0,10 2,17 ± 0,12 0,92 ± 0,07

С18:1(п-9) 1,72 ± 0,43 2,05 ± 0,30 1,54 ±0,30 1,01 ±0,20 0,92 ± 0,15

С18.'1(11-7) 0,31 ± 0,09 0,17 ±0,01 0,13 ± 0,05 0,12 ± 0,04 0,04 ±0,01

С18:2(п-6) 20,27 ± 1,42 16,61 ± 0,55 19,92 ± 0,98 21,04 ± 1,27 18,82 ±3,01

С18:3(п-3) 51,61 ± 4,47 50,43 ± 1,58 58,51 ± 0,81 52,10 ± 2,59 59,06 ±3,55

С18:3(п-6) ■ - ; - - 0,50 ± 0,21 -

С18:4(п-3) - - - 1,25 ± 0,43 -

С20:0 0,57 ±0,06 4,30 ± 0,73 0,18 ±0,09 0,68 ±0,12 0,20 ±0,06

С20:3(п-6) - - - 0,09 ± 0,01 -

С20:4(п-6) - 0,86 ± 0,29 - - -

С22-.0 1,94 ±0,63 3,46 ± 0,65 0,40 ± 0,02 0,83 ±0,07 0,46 ± 0,07

С23:0 0,71 ± 0,24 - 0,23 ± 0,06 0,3 ± 0,02 0,32 ± 0,04

Тетраеновые кислоты обнаружены в небольшом количестве у манжетки и чуть в большем - у подорожника. В литературе нет сведений о наличии у растений тетраеновых кислот, но они свойственны бактериальным клеткам и потому их детекция в тканях исследованных растений, очевидно, связана с наличием эндофитных микроорганизмов и тетраеновые кислоты в пробах имеют не растительное, а бактериальное происхождение.

Далее изучали изменение жирнокислотного состава растений в связи с наступлением осенних холодов. Установлены изменения в активности десатураз в ответ на снижение среднесуточной температуры. Адаптация мембранных липидов к

понижению среднесуточной температуры воздуха у исследованных растений носила видоспецифичный характер и была связана с активностью разных десатураз. Так, у одуванчика по мере снижения температуры возрастала активность ©3-десатуразы (LDR менялся с 0,69 до 0,80) при понижении активности ю9-десатуразы, а высокий уровень ненасыщенности в тканях листьев тысячелистника поддерживается, по всей видимости, активностью <в9 (SDR меняется от 0,46 до 0,63) и шЗ-десатуразы. У манжетки в течение периода вегетации активность всех десатураз существенно не менялась, хотя слабый рост отмечался, что может свидетельствовать о слабой чувствительности этого растения к холоду, например за счет морфологической адаптации. Неизменно высокой у всех изучаемых видов оставалась на протяжении вегетации активность соб-десатуразы.

На третьем этапе исследований кроме растений, произрастающих на побережье Байкала, анализировался состав растений, собранных в Иркутске. Полученные данные (рис. 2) показывают значительное увеличение индекса ненасыщенности ИДС у одуванчика в августе и особенно в начале октября в Иркутске, что, скорее всего, связано с адаптацией к понижению температур. На р. Выдриная, наоборот, в середине лета наблюдали относительно более высокие значения обоих индексов, которые к августу снижались, а осенний пик был смещен на конец октября у одуванчика и на начало октября у подорожника. У тысячелистника в Иркутске отмечалось высокое содержание ННЖК и высокие значения ИДС и К, которое к концу месяца значительно снижалось. На р. Выдриная наблюдались высокие показатели ненасыщенности ЖК тысячелистника в июне, спад к началу августа и постепенный рост к началу октября с минимумом в конце месяца.

Таким образом, у растений, произрастающих в непосредственной близости от Байкала, в июне наблюдалась более сильная адаптация жирнокислотного состава к низким температурам по сравнению с иркутскими растениями, в августе, наоборот, растения на р. Выдриная были приспособлены к более мягкому осеннему климату Прибайкалья и в октябре дольше сохраняли устойчивость к морозам.

Также в сентябрьских пробах были исследованы отдельные классы липидов в изучаемых растениях: нейтральные липиды (HJI) и глико- (ГЛ) и фосфолипиды (ФЛ) мембран. Степень ненасыщенности ЖК распределена неравномерно как по классам липидов, так и по видам растений. В целом, ИДС и К наиболее высоки у гликолипидов, что вполне закономерно, так как эти липиды являются основными состовляющими мембран хлоропластов, которым присуще высокое содержание а-линоленовой кислоты. Менее выражена ненасыщенность ФЛ. Ее значение также максимально у подорожника, а минимально у одуванчика.

Исследование эндофитных бактерий из листьев изучаемых растений

Из тканей одуванчика, манжетки, вероники, тысячелистника и подорожника было выделено 28 культур. Почти все обследованные культуры обладали целлюлолитической и протеолитической активностью, ни у одной не была выявлена амилолитическая активность (табл. 4).

Важным фактором для взаимодействия эндофитных бактерий с растением и обеспечивающим их роль мутуалистов или ассоциативных симбионтов, служит способность фиксировать атмосферный азот. Эта характеристика исследовалась

методом посева культур на среду Эшби, не содержащую азота. 11 культур обладали способностью расти на этой среде, что позволяет предположить азотфиксирующую активность этих микроорганизмов.

А Б

Рис. 2. Индексы двойных связей (ИДС) и коэффициенты ненасыщенности (К) у растений в г. Иркутске и р. Выдриная в течение периода вегетации

А - одуванчик г. Иркутск (Я—О,04, р>0,05), Б - одуванчик р. Выдриная (г=-0,47, р>0,05), В - подорожник г. Иркутск (г=0,95, р<0,05), Г - подорожник р. Выдриная (1=-0,45, р>0,05), Д - тысячелистник Иркутск, Е - тысячелистник р. Выдриная (г=-0,27, р>0,05).

Еще одним фактором, способствующим выживанию и колонизации растений бактериями является образование биопленок. Биопленки это высокоорганизованные бактериальные сообщества, в которых бактерии могут жить прикрепленными к поверхности, где они значительно более устойчивы к действию антибактериальных

препаратов, включая антибиотики, к факторам иммунной защиты организма, а также к воздействию неблагоприятных факторов, таких как изменение температуры, рН среды, осмолярности (Романова и др., 2006; Ермилова, 2007).

Таблица 4. Окраска по Граму (ОГ), форма клеток, наличие каталазной активности (К), определение окисления-ферментации (ОФ), целюлотичическая активность (Ц), протеолитическая активность (П), амилолитическая активность (А), способность к росту на среде Эшби (++ слабый рост, + очень слабый рост), способность утилизировать цитраты (С), способность восстанавливать нитраты (В) культур микрооорганизмов (Н - исследования не проводились).

Растение № культуры/ Дата выделения О Г Форма клеток К ОФтест ц п А Рост на среде Эшби с в

без масла без масл а

Манжетка 15/08 + Палочки + + + + + _ ++ + н

17/08 н Н + Н Н н н н Н + _

18/08 - Палочки + + + + + _ + _

40/9 н н + н н н н н н + _

41/9 - Палочки + + + + + » + + _

42/9 н Н + н н н н н н + _

Вероника 20/8 - Палочки + + + + + - _ + +

22/8 - Изогнутые палочки Н + + + + + н

22-1/8 - Изогнутые палочки н + + + + - - + н

24/8 - Палочки н + + + + _ + н

37/9 - Палочки + + + + + - „ + _

38/9 - Палочки н + + + + + + н

Одуванчик 12/8 н Н + н н н + - - н н

13/8 н Н + н н + + н н

14/8 н Н + н н н + - н н н

27/8 + Кокки +/ + + н + - ++ - +

28/8 н Н + - + + „ ++ _ +/-

34/9 н Н + н н + + _ н н _

35/9 + Палочки н + + + + + _

36/9 + Коккобациллы н - _ + + + _

Тысячелистник 25/8 н Н +/ н н н н н н н н

26/8 - Палочки + + + + + _ „ + _

27/8 н Н н - - н н н н - н

Т1/8 - Палочки н + + + _ + н н

Т2-Х/8 - Палочки н + + - + _ _ н н

Т2-2/ 8 + Палочки н н н + + . ++ н н

30/8 + Коккобациллы н + + + н н ++ _

Подорожник ПЗ/8 - Палочки н + + + н н + + н

В результате проведенных исследований было установлено, что способность к формированию биопленки у исследованных изолятов оказалась различной. Культуры, выделенные из манжетки в августе (№15 и №18), характеризовались достаточной степенью образования биопленки, в то время как культура, выделенная из манжетки в октябре (№41), показала практически контрольный уровень образования биопленки. Культуры, выделенные из вероники, характеризовались слабым уровнем образования биопленок. Культуры, выделенные из тысячелистника, также не обладали выраженной способностью формировать биопленки. Бактериальная культура №36, выделенная из одуванчика, показала наиболее высокую способность формировать биопленки.

Фитотоксичность оценивали методом, предложенным Neto (Neto et al., 2003). Наиболее высокую фитотоксичность на растениях лука проявила культура №18, выделенная из манжетки. Средней фитотоксичностью обладали культуры №Т2-1, №Т2-2, выделенные из тысячелистника обыкновенного. Низкой фитотоксичностью обладали культуры: №22-1, выделенная из вероники, №27, №28 и №36, выделенные из одуванчика и №26, выделенная из тысячелистника. Остальные культуры не оказали фитотоксичного влияния на растения лука. Более того, культура ПЗ, выделенная из подорожника, наоборот, стимулировала рост побега растения. Также была исследована способность культур выделять в безуглеводную культуральную среду растворимые сахара. В растительном организме бактериальные клетки, выделяющие низкомолекулярные углеводы, могут вносить свой вклад в пул этих молекул растительной цитоплазмы и не только «подкармливать» растения ди- и моносахаридами, но и способствовать адаптации к гипотермии. Нами была показана такая способность у ряда культур, в том числе выделенных из подорожника (№П4), тысячелистника (№Т2-1), вероники (№37), манжетки (№41).

Далее изучили, меняется ли секреция Сахаров бактериальными клетками в окружающую среду в зависимости от внешних температурных условий. Из четырех исследованных культур в двух наблюдали изменения в накоплении Сахаров в культуральной жидкости в зависимости от температурного режима культивирования. Причем, если в культуре Т2-2 при температуре культивирования близкой к нулю (4°С) наблюдали понижение секреции низкомолекулярных углеводов микрорганизмами (в два раза), то культура П-3, выделенная из подорожника большого, наоборот, продемонстрировала троекратное увеличение Сахаров в среде культивирования.

Интересно, что именно эта культура (П-3) стимулировала рост побегов растения в опытах на фитотоксичность. Возможно, эти два свойства культуры П-3 тесно взаимосвязаны. Не исключено, что относительно высокая способность (5,1316,33 10"3мг/мл) этой культуры секретировать сахара полезна для растения и этот эндофит выступает в роли симбионта.

Таким образом, показано, что эндофитные микроорганизмы изучаемых растений могут вносить свой вклад в адаптацию растений к гипотермии и другим стрессирующим воздействиям. Они выделяют в ткани растения углеводы, обладают умеренной фитотоксичностью и некоторые даже, наоборот, не только не угнетают растения, а усиливают их рост (культура ПЗ). Способность образовывать биопленку, способствующую выживанию бактерий и повышающую сопротивляемость бактериоценозов фитоиммунитету растений, отличалась не только у разных видов растений, но и изменялась в разные периоды сезона вегетации (у манжетки). Также в манжетке обнаружены микроорганизмы, способные восстанавливать нитраты. Более половины исследованных культур (11 из 21) были способны к азотфиксации.

Адаптация растений к суточным колебаниям температуры воздуха осенью на примере манжетки городковатой

По ночам растения подвергаются сильному гипотермическому воздействию, которое целесообразно исследовать для более полного понимания их адаптационных возможностей в естественных условиях обитания. Для этого отбирались пробы листьев растений 14 октября 2010 года на территории стационара

«р. Выдриная» начиная с 6 часов утра с периодичностью в 3 - 6 часов. За сутки температура изменялась от -4 до + 9 °С. На рисунке ЗА приведены средние значения и стандартные отклонения активности пероксидазы в 6, 9, 15, 20 и 24 часа.

Изучено наличие изоформ пероксидазы в растворимой и слабосвязанной с клеточной стенкой фракциях. Характерная электрофореграмма, окрашенная диаминобензидином, приведена на рисунке ЗБ.

I " А

I 035,

) 0,25 | 2 Т

I: I I I I I

8 00 9.00 15.00 20.00 24.00

Вр»ия оугак

Рис. 3. Изменение активности слабосвязанной с клеточной стенкой (1) и растворимой (2) пероксидазы в листьях манжетки в течение суток 14 октября 2010 г. (А) и изоформы пероксидаз в листьях манжетки в разное время суток, р. Выдриная, октябрь (Б).

1 - слабосвязанная с клеточной стенкой пероксидаза, б00; 2 - слабосвязанная пероксидаза в 900; 3 - слабосвязанная пероксидаза в 1500; 4 - слабосвязанная пероксидаза в 20ю; 5 - слабосвязанная пероксидаза в 24ю; б - растворимая пероксидаза, 6м; 7 - растворимая пероксидаза в 9ю; 8 - растворимая пероксидаза в 15ю; 9 - растворимая пероксидаза в 20°°, 10 - растворимая пероксидаза в 2400

В листьях манжетки наблюдали как слабосвязанную с клеточной стенкой, так и растворимую пероксидазу, с относительной электрофоретической подвижностью Яг 0,75, что согласуется с данными по сезонной динамике. 14 октября 2010 г. в разное время суток растворимой пероксидазы было значительно больше во всех вариантах - по сравнению со слабосвязанной. Оценивая динамику содержания пероксидазы на протяжении суток, можно утверждать, что содержание растворимой пероксидазы в листьях манжетки увеличивается к 6 утра, а пик содержания слабосвязанной - приходится на 6-9 часов утра и более пролонгирован по времени. Минимальное содержание слабосвязанной пероксидазы приходилось на 20 часов, а растворимой на 15. Таким образом, осенью в течение суток увеличение содержания изоформы с 0,75 в растворимой фракции пероксидазы листьев манжетки предшествовало увеличению содержанию изоформы 0,75 в слабосвязанной с

клеточной стенкой фракции.

Был проведен анализ накопления стрессовых белков в листьях манжетки в течение суток в октябре (рис. 4).

Рис. 4. Содержание стрессовых белков в листьях манжетки в течение.суток в середине октября 2010 г., стационар «р. Выдриная»

Показано наличие во всех пробах Нзр70, №р60 и отсутствие Нвр 101. Сог14Ь присутствует только в 6 часов утра, что может свидетельствовать о том, что его белковые молекулы

1 23456789 10

яи 15,00 аодо 24.оа

№р К)! - :.; ■■. - ; •/'•.-• • , ' Ч"' __. ; ■ • •

Сег 14 Ь - ■

Нзр 7(1 : ж*1

---«Г '"•»«ЧМ». «чЧ» ■С ; " ?; . В«;

Н»р 17.6

экспрессируются в холодное время суток и потом элиминируются при повышении окружающей растение температуры. Нзр17,6 выявлен в пробах манжетки, собранных в 9°° и 15с0.

Исследована суточная динамика содержания растворимых Сахаров в листьях манжетки в середине октября (рис. 5).

Рис. 5. Содержание Сахаров в листьях манжетки 14 октября 2010 г., р. Выдриная

В суточной динамике растворимых углеводов, выполняющих крио-протекторную функцию, отмечается увеличение их содержания в вечерние часы и к полуночи. В это время они могут защищать растение от низкотемпературного воздействия. В шесть утра температура воздуха еще продолжает падать, но углеводы к этому времени активно ассимилируются. Очевидно, к утру, а так же во второй половине ночи, низкомолекулярных Сахаров становится мало в цитоплазме, и они перестают выполнять защитную роль. Видимо, к этому времени растение успевает адаптироваться к ночной гипотермии с помощью других молекул: ненасыщенных жирных кислот, синтезируемых десатуразами и, еще более поздним, синтезом белков холодового шока.

Адаптация к ночной гипотермии у растений происходит в том числе за счет увеличения ненасыщенности ЖК мембран. Было исследовано изменение состава жирных кислот в течение суток (14.10.2010 г.) на р. Выдринная (рис. 6). На рисунке видно, что в целом в теплое время суток происходит увеличение содержания насыщенных ЖК. Особенно сильно это выражено в 9 часов утра и 15 дня.

Соответственно, общее содержание ненасыщенных жирных кислот (ННЖК), наоборот, максимально вечером, ночью и ранним утром, а понижается в 9 утра и минимально днем.

Изучено изменение активности 0)9-, соб- и шЗ-десатураз в листьях манжетки. Активность со9-десатуразы была максимальной в 2400 (0,47).

'•о Рис. 6. Содержание насыщенных (1) и

ненасыщенных (2) жирных кислот манжетки (% вес от общего -: к содержания жирных кислот) в

5 зависимости от температуры (3) 14 4 § октября 2010 г., ставионар «Речка ^ Выдриная»

II

о | Этому соответствует

2 ¡? интенсивное образование _ олеиновой кислоты

1 С18:1(п-9). Активность этого фермента остается *»<«<*"' высокой на протяжении

- холодного времени суток

до 6 часов утра (0,43) и уменьшается только с 9 утра, когда воздух начинает

Л ОС 9.00 1500 30.00 34 0Э

.........." п

прогреваться, шб-десатуразная активность, обладает по нашим наблюдениям максимальной стабильностью. Активность соЗ-десатуразы минимальна в девять утра (0,80), к 15 часам возрастает (0,86), немного падает к восьми вечера (0,85) и вновь возрастает в полночь и в шесть утра, достигая суточных максимумов (0,87). Особенности изменения активности десатураз при адаптации манжетки к колебаниям температуры в течение суток на побережье Байкала заключаются в увеличении активности со9- и соЗ-десатураз в холодное время суток, а активность соб-десатуразы остается стабильной в течение суток.

Исследовано изменение содержания витаминов В6, С и РР в листьях манжетки

в течение суток (рис. 7).

Рис. 7. Содержание витаминов В6, С и РР в листьях манжетки в разное время суток в середине октября

Выявлено повышение

содержания витамина С вечером и в полночь. Пик содержания этого витамина приходился на 6 часов утра. Содержание витамина РР, наоборот, было высоким в дневные часы, а вечером и ранним утром минимально. Для витамина Вб такой четкой зависимости от суточного хода температур не прослеживается. Тем не менее, максимум содержания этого витамина приходится на 24ю, а минимум на 9°°.

Таким образом, показано, что во время ночной гипотермии в октябре у манжетки происходит увеличение содержания витамина С при относительно низком содержании витамина РР. Также в полночь выявлен максимум витамина В6. Содержание флавоноидов, выраженное в мг фенольных соединений на грамм сырой массы листа, представлено на рисунке 8. Максимальное содержание флавоноидов наблюдается в ранние утренние часы, сильно уменьшается днем и снова возрастает вечером. Учитывая фенольную природу флавоноидов, их содержание в клетке должно регулироваться ферментом пероксидазой (Ьау1с1 е! а1., 2001). Максимумы активности пероксидазы и содержания флавоноидов строго не совпадают и смещены по времени друг относительно друга (рис. 3-А, рис. 7).

Рис. 8. Изменение содержания флавоноидов в листьях манжетки в течение суток 14 октября 2010, стационар «р. Выдриная»

Динамика содержания флавоноидов более близка к динамике содержания слабосвязанной фракции перокидазы, чем ее растворимых форм. Так, в шесть утра наблюдали очень высокие содержания флавоноидов при относительно низкой активности обеих пероксидаз. К девяти часам утра резко снижается содержание флавоноидов при увеличении активности

7 ! .: § , 1 И п», I 1:! ! 1.1. 1

■СО 6 03 15.С0 3000 24.СС Время суток

пероксидазы. В послеполуденные часы содержание флавоноидов продолжает снижаться, хотя активность растворимых пероксидаз увеличивается слабо, а растворимых - заметно снижается. К восьми часам вечера активность всех пероксидаз достигает минимума, и наблюдали заметный рост содержания флавоноидов. К полуночи флавоноидов становится чуть больше, хотя статистически различия не достоверны. Возможно, рост содержания фенолов сдерживается активностью пероксидаз, возрастающей к полуночи. За ночь активность пероксидазы снова падает, а фенолы к утру накапливаются.

Полученные результаты и сделанные выводы не противоречат литературным данным, согласно которым растения с высокой активностью пероксидазы содержат много полифенолов вообще и флавоноидов в частности (Ьау1с1 е1 а1., 2001).

Таким образом, на примере манжетки показана адаптация растительного метаболизма и суточные изменения при смене дневных положительных температур на ночные отрицательные. При этом в течение суток происходит не только адаптивное изменение обмена углеводов, изменение насыщенности жирных кислот и активности ферментов, но и изменяется степень накопления тех или иных стрессовых белков.

Основываясь на результатах проведенных исследований можно предложить схему, отражающую взаимосвязи изученных в исследуемых растениях соединений и наиболее вероятную последовательность включения механизмов адаптации при воздействии гипотермии (рис. 9). Низкие температуры быстрее всего могут влиять на активность ферментов. Ряд из них (пероксидазы, десатуразы) осуществляют под своим контролем дальнейшую адаптацию растений к отрицательному действию гипотермии. На начальных этапах адаптации растения накапливают сахара. С небольшим отставанием по времени происходит синтез ненасыщенных жирных кислот. Позднее в условиях гипотермии развертываются защитные механизмы за счет накопления стрессовых белков. Тем не менее, весь процесс занимает несколько часов. Одним из субстратов пероксидазы являются фенольные соединения, на содержание которых этот фермент оказывает прямое влияние. Также ФС играют важную роль в борьбе с патогенезом под контролем пероксидазы. Кроме того, фенольные соединения, как и аскорбиновая кислота, могут служить донорами электронов в окислительных реакциях (Рогожин и др., 2004). Витамин С, имеющий свойство антиоксиданта, и пероксидаза вносят вклад в пул активных форм кислорода, которые могут выступать посредниками передачи сигнала о необходимости экспрессии стрессовых белков.

Рис. 9. Взаимосвязи щученных в исследуемых растениях соединений и наиболее вероятная последовательность включения механизмов адаптации при воздействии _—— гипотермии на них

л»к, ПННЖК - полиненасыщенные жирные кислоты, ФС -

фенольные соединения, ПОЛ - пероксидное окисление липидов, АФК - активные формы кислорода

Стрессовые белки Десатуразы, перокндазы dt novo

Жирнокислотный состав растений определяется десатуразами, осуществляющими образование полиненасыщенных жирных кислот из

насыщенных. Пероксидное окисление липидов также может влиять на ЖК-состав при стрессе. Эндофитные микроорганизмы, обитающие во враждебной среде фенольных соединений и других защитных веществ растений, могут секретировать сахара. В ряде случаев им выгодно усиливать секрецию Сахаров при понижении температуры. Витамины играют важную роль в метаболизме растений и могут представлять интерес не только как лекарственный компонент растительного сырья, но и как адаптогенное соединение. Так, витамин В6, или пиридоксин, является коферментом, участвующим, главным образом в реакциях синтеза и расщепления аминокислот. Витамин ВЗ, или РР, участвует в окислительно-восстановительных процессах, обмене белков, углеводов и липидов через обмен пировиноградной кислоты. Также он участвует в более полусотне ферментативных реакций, в том числе в востановлении генетического материала, поврежденного вирусами и другими агентами. Изучение кинетики пероксидазных реакций в присутствии разных концентраций Сахаров показало, что среды с их высоким содержанием понижают активность пероксидазы и ее термостабильность (Рогожин и др., 2004). Таким образом, углеводы окружающей фермент среды могут оказывать серьезное ингибирующее воздействие на пероксидазу, что также отражено на схеме.

Выявленные отличия во времени и силе проявления тех или иных механизмов адаптации растений в Иркутске и в Предбайкалье очевидно связаны с разной силой и сочетанием стрессирующих факторов внешней среды в точках сбора. В частности, на стационаре «р. Выдриная» отмечается более высокая активность пероксидазы у большинства изученных растений по сравнению с Иркутском. Осеннее накопление Сахаров и стрессовых белков, увеличение насыщенности общих липидов в листьях растений сильнее выражено также на Байкале.

ВЫВОДЫ

1. Впервые исследовано изменение активности слабосвязанных с клеточной стенкой и растворимых форм пероксидазы, выделенных из тканей исследуемых растений (тысячелистника азиатского Achillea asiatica Serg., одуванчика лекарственного Taraxacum officinale Wigg., подорожника большого Plantago major L., вероники дубравной Veronica chamaedrys L., манжетки городковатой Alchemilla subcrenata Buser) в зависимости от температурных режимов и места отбора проб. Наступление отрицательных температур в октябре приводило в Иркутске к спаду активности пероксидазы у всех пяти видов растений, а на побережье Байкала - к усилению. Это может свидетельствовать о запуске разных механизмов адаптации в Предбайкалье и в Иркутске — в зависимости от условий окружающей среды.

2. Изоферментный спектр пероксидазы изучаемых видов растений очень изменчив в течение периода вегетации. Максимальное число молекулярных форм у большинства изучаемых растений наблюдалось в последних числах августа. Среди форм пероксидазы имеются как общие для тканей большинства видов растений, так и видо- и сезоно-специфические, что может быть связано с разными их функциями в тканях разных растений в разные периоды жизнедеятельности.

3. Впервые определен жирнокислотный состав пяти видов лекарственных растений и его видовая специфика. Летом на побережье Байкала наблюдалась более высокая насыщенность мембранных липидов растений по сравнению с Иркутском.

4. Активность десатураз, напрямую влияющая на синтез ненасыщенных жирных кислот, демонстрировала зависимость от температурных условий, и менялась с ярко выраженой видоспецифичностью.

5. В Предбайкалье в засушливые дни уменьшается содержание воды в растениях и накапливаются дегидрины в листьях. Усиление синтеза дегидринов происходит в октябре у большинства исследуемых растений. Corl4 b накапливаются в октябре у подорожника и тысячелистника в Иркутске, и у одуванчика на р. Выдриная.

6. Существует видовая специфика по составу и количеству БТШ в зависимости от вегетационного периода. Наибольшее их накопление происходит осенью.

7. С наступлением осенних холодов происходит накопление Сахаров в тканях растений, особенно сильно на р. Выдриная. Накопление Сахаров имеет наиболее высокую корреляцию с осенним понижением температур у всех изученных видов -как в Иркутске, так и на побережье Байкала.

8. Эндофитные микроорганизмы могут участвовать в адаптации к гипотермии за счет способности секретировать сахара в окружающую среду.

9. Адаптация к экстримальным температурам в течение суток в середине октября происходит за счет изменения активности пероксидазы и накопления молекулярных форм этого фермента, изменения содержания растворимых углеводов и накопления стрессовых белков, путем изменения степени насыщенности жирных кислот и активности десатураз, за счет изменения содержания витаминов и флавоноидов.

10. Весь изученный комплекс механизмов можно использовать в качестве маркеров состояния растений в естественных условиях обитания - таких как изменение ростовой активности, диагностика лекарственных свойств растений, развитие адаптации.

Работа выполнена при поддержке Гранта РФФИ 08-04-98040 и Междисциплинарного интеграционного проекта СО РАН №45.

Основные публикации

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Граскова И.А., Живетьев М.А., Кузнецова Е.В., Дударева JI.B., Путилина Т.Е., Маркова Ю.А., Войников В.К. (2009) Растения Прибайкалья: адаптация к низким температурам и антропогенным воздействиям // Экологические проблемы промышленных городов: Сборник научных трудов. Часть 2. - Саратов. С.62-65.

2. Живетьев М.А., Раченко Е.И., Путилина Т.Е., Краснобаев В.А., Граскова И.А., Войников В.К. (2010) Активность и изоферментный спектр пероксидаз некоторых видов растений, произрастающих на берегах озера Байкал, при абиотическом стрессе. // Известия ИГУ. Серия «Биология. Экология». Т.З, №3. С.3-12.

3. Граскова И.А., Живетьев М.А., Путилина Т.Е., Краснобаев В.А., Войников В.К. (2010) Активность и изоферментный спектр пероксидазы листьев некоторых видов травянистых растений, произрастающих на берегах озера Байкал, при

абиотическом стрессе. // Электронный журнал «Исследовано в России», 023, стр. 293-303, http://zhurnal.aDe.relarn.ru/articles/2010/023.pdf

4. Zhivetiev М.А., Rachenco E.I., Putilina Т.Е., Krasnobaev V.A., Graskova I.A., Voinikov V.K. (2010) Activity and isoenzyme spectrum of peroxidases and degydrins of some plant species, growing on the shores of lake Baikal, under abiotic stress // J. stress physiol. biochem. V. 6, N4. P.42-50.

5. Zhivetiev M.A., Graskova I.A., Dudareva L.V., Stolbicova A.V., Voinikov V.K. (2010) Change of fatty-asid composition in plants during adaptation to hypothermia // J. stress physiol. biochem. V. 6, N4. P.51-65.

6. Живетьев M.A., Дударева Л.В., Краснобаев B.A., Граскова И.А., Войников B.K. (2010) Жирнокислотный состав, уровень ненасыщенности жирных кислот, активность десатураз и сезонная динамика этих параметров в связи с осенним понижением температур, в листьях лекарственных растений, произрастающих на берегу озера Байкал // Известия ИГУ. Серия «Биология. Экология». № 4. С. 2-9.

7. Граскова И.А., Дударева Л.В., Живетьев М.А., Столбикова A.B., Соколова H.A., Войников В.К. (2011) Динамика сезонных изменений жирнокислотного состава, степени ненасыщенности жирных кислот и активности ацил-липидных десатураз в тканях некоторых лекарственных растений, произрастающих в условиях Предбайкалья // Химия растительного сырья, (в печати)

8. Живетьев М.А., Дударева Л.В., Краснобаев В.А., Граскова И.А, Войников В.К. (2011) Содержание жирных кислот и активность десатураз у Alchemilla subcrenata Buser в зависимости от суточных колебаний температур // Известия ИГУ. Серия «Биология. Экология», (в печати)

Тезисы в рецензируемых сборниках конференций:

9. Граскова И.А., Живетьев М.А., Кузнецова Е.В., Дударева Л.В., Путилина Т.Е., Войников В.К. Особенности адаптации травянистых растений, произрастающих на берегах озера Байкал к абиотическим стрессам // Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды: Материалы Всероссийской научной конференции, 24-28 августа 2009 г., Иркутск, Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН. - Иркутск- РИО НИ РВХ ВСНЦ СО РАМН, 2009. С. 110-115.

10. Граскова И.А., Живетьев М.А., Соколова H.A., Назарова A.B., Дударева Л.В., Войников В.К. «Характеристика изменения в составе жирных кислот мембранных липидов в некоторых видах травянистых растений, произрастающих на берегах озера Байкал, в ответ на абиотический стресс». Тезисы докладов Международной научной конференции и международной школы для молодых ученых «Проблемы экологии: чтения памяти профессора М.М, Кожова» Иркутск 20-25 сентября 2010. С. 133.

11. Живетьев М.А., Путилина Т.Е., Краснобаев В.А., Граскова И.А., Войников В.К. «Активность и изоферментный спектр пероксидазы листьев некоторых видов травянистых растений, произрастающих на берегах озера Байкал, при абиотическом стрессе». Тезисы докладов Международной научной конференции и международной школы для молодых ученых Проблемы экологии: чтения памяти профессора М.М. Кожова», Иркутск, 20-25 сентября 2010. С. 141. (устный доклад).

12. Граскова И.А., Дударева JI.B., Соколова H.A., Столбикова A.B., Живетьев М.А., Войников B.K. Динамика изменения жирнокислотного состава, уровня ненасыщенности жирных кислот и активности десатураз в тканях травянистых растений, произрастающих на берегах озера Байкал при абиотическом стрессе / Проблемы изучения и сохранения растительного мира Евразии: Материалы Всероссийской конференции с международным участием, посвященной памяти выдающегося ученого Леонида Владимировича Бардунова (1932-2008 гг.), Иркутск, 15-19 сентября 2010 г. С.726-729.

13. Граскова И.А., Кузнецова E.B., Живетьев М.А., Дударева Л.В., Путилина Т.Е., Маркова Ю.А., Войников B.K. «Адаптация к абиотическим стрессам некоторых видов растений, произрастающих на берегах озера Байкал». Тезисы докладов Международной научной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего севера». Апатиты, Мурманская область, 7-11 июня 2009. С.101-102.

14. Граскова И.А., Живетьев М.А., Дударева Л.В., Столбикова A.B., Войников B.K. «Изменение жирнокислотного состава, уровня ненасыщенности жирных кислот и активности десатураз в тканях травянистых растений, произрастающих на берегах озера Байкал при абиотическом стрессе». Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Растение и стресс», 9-12 ноября 2010 г., Москва, Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. KA. Тимирязева РАН. С. 118-119.

15. Живетьев М.А., Граскова И.А., Путилина Т.Е., Войников B.K. «Механизмы адаптации растений, произрастающих на побережье озера Байкал». Тезисы докладов Третьего международного симпозиума «Клеточная сигнализация у растений», 28 июня - 1 июля 2011 г., Казань. С. 64.

16. Живетьев М.А., Граскова И.А., Дударева Л.В., Путилина Т.Е., Войников В.К. «Особенности адаптации растений произрастающих на побережье озера Байкал». Материалы докладов в двух частях VII Съезда физиологов растений «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международной научной школы «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции», 4-10 июля 2011 г., Нижний Новгород; ННГУ им. Н.И. Лобачевского. Часть 1. С. 250-251.

Подписано в печать 3.08.201 Мираж 100 экз. Заказ № 232 Отпечатано в типографии ООО «Весь Иркутск» 664011, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 11, оф. 203, тел./факс: 201-281. е-та^уеэJrkutsk@mail.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Живетьев, Максим Аркадьевич, Иркутск

61 11-3/1173

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН

На правах рукописи

Живетьев Максим Аркадьевич

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ ТРАВЯНИСТЫХ РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ ПРЕДБАЙКАЛЬЯ

03.01.05 - физиология и биохимия растений диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук И.А. Граскова

Иркутск 2011

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................8

1.1. Адаптация растений к среде обитания.............................................................8

1.1.1. Эволюционно-экологическое значение адаптации............................................8

1.1.2. Виды адаптации........................................................................................9

1.1.3. Устойчивость растений к ключевым абиотическим факторам внешней среды.......10

1.1.3.1. Холодостойкость и морозоустойчивость....................................................10

1.1.3.2. Зимостойкость.....................................................................................12

1.1.3.3. Приспособленность растений к гипертермии и недостаточной

влагообеспеченности.......................................................................................14

1.1.4. Стресс, адаптация и деадаптация................................................................19

1.1.5. Неспецифические и специфические стрессовые реакции..................................22

1.2. Восприятие и передача стрессового сигнала в растениях, роль пероксидаз и АФК в этом процессе................................................................................................26

1.2.1. Сенсоры абиотического стресса..................................................................27

1.2.1.1. Рецептороподобные киназы............................................................................27

1.2.1.2. Кальциевые каналы.........................................................................................29

1.2.1.3. Активные формы кислорода............................................................................32

1.2.2. Взаимодействие кальциевой и супероксидсинтазной сигнальных систем..............33

1.2.3. Влияние гормонов и гормоноподобных соединений на работу пероксидазы и генерацию активных форм кислорода (на примере салициловой кислоты).....................36

1.2.4. Передача низкотемпературного сигнала в геном.............................................38

1.2.5. Важная роль пероксидазы в метаболизме полифенолов растений........................40

1.3. Адаптивные реакции при гипотермии............................................................44

1.3.1. Накопление низкомолекулярных протекторов (растворимые углеводы)...............45

1.3.2. Жирные кислоты....................................................................................48

1.3.3. Синтез стрессовых белков.........................................................................52

1.4. Роль эндофитных микроорганизмов в адаптации растения-хозяина.......................60

1.5. Выводы из обзора литературы, цель и задачи исследования..................................61

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...........................................................................66

2.1. Объекты исследования................................................................................66

2.1.1. Систематическое положение выбранных видов растений..................................66

2.1.2. Краткое описание изучаемых видов............................................................68

2.1.2.1. Тысячелистник азиатский..............................................................................68

2.1.2.2. Одуванчик лекарственный...............................................................................69

2.1.2.3. Подорожник большой.....................................................................................70

2.1.2.4. Вероника дубравная........................................................................................71

2.1.2.5. Манжетка городковатая...............................................................................72

2.1.3. Практическая значимость изучаемых видов...................................................73

2.1.4. Химический состав изучаемых растений......................................................75

2.2. Методы..................................................................................................80

2.2.1. Выделение пероксидазы из листьев растений................................................80

2.2.2. Определение активности пероксидазы фотоколориметрическим методом............81

2.2.3. Определение термостабильности пероксидазы...............................................81

2.2.4. Определение оптимальной рН для пероксидазы.............................................81

2.2.5. Определение молекулярных форм пероксидазы в листьях растений с помощью нативного электрофореза..................................................................................82

2.2.6. Определение содержания воды в листьях растений.........................................82

2.2.7. Определение содержания растворимых углеводов в растениях фотоколориметрическим методом......................................................................83

2.2.8. Определение жирнокислотного состава и активности ацил-липидных десатураз в

тканях листьев...............................................................................................83

2.2.8.1. Определение жирнокислотного состава методом газожидкостной хроматографии.........................................................................................................83

2.2.8.2. Определение активности десатураз................................................................84

2.2.9. Определение содержания стрессовых белков в листьях растний.........................85

2.2.10. Определение содержания флавоноидов в листьях растений..............................86

2.2.11. Определение содержания витаминов в листьях растений.................................86

2.2.12. Методы исследования эндофитных бактерий................................................87

2.2.12.1. Растительный материал..............................................................................87

2.2.12.2. Определение гидроокиси калия (КОН) тест....................................................87

2.2.12.3. Определение каталазной активности............................................................88

2.2.12.4. Определение окисления ферментации (ОФ) среды...........................................88

2.2.12.5. Рост на среде Симмонса...............................................................................88

2.2.12.6. Восстановление нитратов до нитритов........................................................89

2.2.12.7. Определение целлюлазной активности бактерий............................................89

2.2.12.8. Определение протеолитической активности.................................................90

2.2.12.9. Определение амшолитической активности...................................................90

2.2.12.10. Рост на среде Эшби...................................................................................91

2.2.12.11. Образование биопленок...............................................................................91

2.2.12.12. Определение оптической плотности бактериальной суспензии......................92

2.2.12.13. Влияние эндофитных бактерий на прорастание и развитие семян растений... 92

2.2.12.14. Определение фитотоксичности бактерий....................................................92

2.2.12.15. Определение содержания Сахаров в культуралъной жидкости........................93

2.2.13. Статистическая обработка полученных данных.............................................93

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...................................................................94

3.1. Климатические показатели в точках отбора проб...............................................94

3.2. Исследование изменения активности и молекулярных форм пероксидазы, выделенной из тканей исследуемых растений в течение вегетации.............................................98

3.3. Изучение стрессовых белков в листьях травянистых растений.............................107

3.4. Содержание воды, Сахаров в тканях листьев исследуемых растений в течение периода вегетации...................................................................................................114

3.5. Изучение жирных кислот и активности десатураз пяти видов лекарственных растений в связи с осенним понижением температуры воздуха............................................119

3.6. Корреляционный анализ между климатическими изменениями в течение вегетации растений и изменением биохимических показателей..............................................138

3.7. Исследование эндофитных бактерий из листьев изучаемых растений...................152

3.8. Адаптация растений к суточным колебаниям температуры воздуха осенью на примере

манжетки городковатой.................................................................................158

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................179

ВЫВОДЫ............................................................................................... ...188

ЛИТЕРАТУРА.............................................................................................190

Список используемых в работе сокращений

АБК - абсцизовая кислота

АФК - активные формы кислорода

БТТТТ - белки теплового шока

БХШ - белки холодового шока

ГЛ -гликолипиды

ЖК - жирные кислоты

ИДС - индекс двойных связей

ИН ЖК - индекс насыщенности жирных кислот

ИУК - индолилуксусная кислота

К - коэффициент ненасыщенности жирных кислот

МННЖК - мононенасыщенные жирные кислоты

МПБ - мясопептонный бульон

НЖК - насыщенные жирные кислоты

HJI - нейтральные липиды

ННЖК - ненасыщенные жирные кислоты

ОФ - окисление-ферментация

ПААГ - полиакриламидный гель

ПННЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РПО - растворимая пероксидаза

Реакция СВЧ - реакция сверхчувствительности

СК - салициловая кислота

СОД - супероксиддисмутаза

СОС СС- супероксидсинтазная сигнальная система СС - сигнальная система

ССКСП - слабосвязанная с клеточной стенкой пероксидаза

ФЛ - фосфолипиды

ФС - фенольные соединения

COR-белки - cold regulated proteins

Des - десатураза

Hsp - heat-shock protein

HXK - гексокиназа

LDR - ленолеил-десатуразное отношение

МАР-киназа - митоген-активируемая протеинкиназа

ODR - олеоил-десатуразное отношение

Rf- относительная электрофоретическая подвижность

SDR - стераоил-десатуразное отношение

SFA - saturated fatty acid

SOD - супероксиддисмутаза

SUS - сахарозо-синтаза

USFA - unsaturated fatty acid

ВВЕДЕНИЕ

Температура окружающей среды является важным фактором, определяющим географическое распространение растений и их продуктивность (Лось, 2005; Титов и др., 2006). В силу этого, внимание ученых все больше концентрируется на изучении механизмов толерантности и адаптации высших растений к гипотермии (Войников, 1987; Кузнецов и др., 1987). Поскольку у растений отсутствуют поведенческие механизмы защиты от действия низкой температуры, основные адаптивные изменения происходят на организменном, и, особенно, на клеточном уровнях (Чиркова, 2002). В ходе целого ряда исследований выявлена группа неспецифических реакций, к которым относятся, прежде всего, изменение проницаемости клеточных мембран, внутриклеточного рН, накопление защитных веществ, в частности, стрессовых белков, липидов, растворимых углеводов. При этом показано, что одним из самых ранних эффектов при охлаждении растений является окислительный стресс, обусловленный накоплением активных форм кислорода (АФК) (Кулаева, 1982; Тарчевский, 2002). Для защиты от него в растениях существует антиоксидантная система, состоящая из ферментов (супероксиддисмутаз, каталазы, пероксидаз и др.) и низкомолекулярных антиоксидантов. Изменение в спектре защитных белков и экспрессионной активности их генов под влиянием низкотемпературного стресса позволяет выявить физиологические предпосылки устойчивости растений. В связи с открытием сигнальной и защитной роли активных форм кислорода, большое внимание уделяется оксидоредуктазам, регулирующим их уровень в клетке (Тарчевский, 2002). Среди них особый интерес представляют пероксидазы, активность которых коррелирует с развитием устойчивости растений к абиотическим стрессорам (Полесская, 2007). Являясь конституционно необходимым, этот фермент участвует в различных биохимических реакциях, происходящих в живом организме (Андреева, 1988). Поскольку пероксидазы представляют собой семейство полифункциональных белков, возникает определенная трудность в разграничении роли отдельных

молекулярных форм фермента в различных физиологических процессах растительного организма (Минибаева и др., 1997).

В метаболизме живых растительных клеток ведущая роль, наравне с белками и нуклеиновыми кислотами, принадлежит липидам. Однако вопросы липидного обмена у исследуемых растений совершенно не изучены. Способность травянистых растений переносить низкие температуры напрямую зависит от состояния мембранных компонентов, в первую очередь липидов. Считается, что липиды клеточных мембран играют важную роль в формировании устойчивости растений к неблагоприятным факторам окружающей среды. Эта устойчивость зависит, среди прочего, от наличия в клеточных мембранах полиненасыщенных жирных кислот (Лось, 2005).

Озеро Байкал находится в зоне резко-континентального климата, где значительные сезонные и суточные перепады температур заметно влияют на состояние и функционирование экосистем. Растения, произрастающие в прибрежной зоне озера Байкал, являются неотъемленной частью живой природы Прибайкалья и часто подвергаются действию жестких абиотических стрессоров. В стрессовых условиях рост и развитие растений зависит с одной стороны, от силы и вида стрессового воздействия, с другой - от его устойчивости к данному виду стрессора, которая генетически детерминирована. Действие абиотического стресса, такого как низкие температуры, может привести к активации защитных и приспособительных реакций, в результате которых растение акклиматизируется к новым условиям. В этих условиях может увеличиваться активность ряда ферментов и синтез некоторых биологически активных веществ.

Исследование современного состояния экосистемы озера Байкал и механизмов ее функционирования методами физико-химической и молекулярной биологии является актуальным. Работа направлена на решение фундаментальной проблемы устойчивости растений к абиотическим стрессам в климатических условиях озера Байкал. Решение этой проблемы связано с пониманием основных молекулярных и физико-химических

механизмов, реализуемых в растительных клетках при стресс-адаптации к абиотическим факторам, присущим климату озера Байкал.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Адаптация растений к среде обитания

1.1.1.Эволюционно-экологическое значение адаптации

Структурные и функциональные особенности организма рассчитаны на повышение шансов на выживание и преимущество в конкурентной борьбе с другими организмами за ресурсы, и нацелены на наиболее эффективные процессы жизнедеятельности клеток, на оптимальную реализацию генетической программы и прохождение всех стадий онтогенеза в соответствующем местообитании (Хочачка, Сомеро, 1973). Такие особенности организма являются адаптацией или приспособлением к окружающей среде (Хочачка, Сомеро, 1973).

С появлением эволюционной теории Ч. Дарвина, изучение приспособления к среде обитания стало одним из центральных направлений в биологии. Адаптация к среде наблюдается на всех уровнях биологической организации. На физиологическом уровне - способы осуществления жизненных функций отражают внешние условия, с которыми сталкивается данный вид, популяция, организм (Хочачка, Сомеро, 1977). Приспособленность онтогенеза организма к условиям среды является результатом эволюции (изменчивости, наследственности, отбора). В ходе филогенеза каждого таксона формируются определенные требования живых организмов к условиям существования и приспособленность к обитанию в занимаемой ими экологической нише. У растений влаголюбие и теневыносливость, жароустойчивость и холодостойкость, как и другие особенности конкретных видов, эволюционно сформировались в результате длительного действия соответствующих внешних условий. Наследственность растений создается под историческим влиянием определенных условий внешней среды, но важное значение имеют внешние условия онтогенеза.

1.1.2. Виды адаптации

Адаптация растений к окружающим условиям обеспечивается за счет физиологических механизмов (физиологическая адаптация) и морфологических особенностей {морфологическая адаптация). У растений очевидно отсутствует характерная для животных поведенческая адаптация, когда в зависимости от окружающей обстановки реализуется та или иная модель поведения. Морфологические адаптации представляют собой изменения формы и строения организма, а физиологические адаптации связаны с химическими процессами в живом организме. Многие адаптации представляют собой сочетание разных типов адаптаций, например физиологическая адаптация часто объединена с морфологической. Так, адаптация растений к холоду может включать не только биохимические изменения и соответствующую настройку метаболизма, но и опушение стеблей и листьев, утолщение клеточных оболочек, изменения в строении мембран клеток (Сергеева, 1971). Адаптация к разной обеспеченности растений доступной водой осуществляется как степенью развития кутикулы и механических тканей, так и количеством и размером устьиц, регуляцией работы устьиц, накоплением водоудерживающих молекул (Прокофьев, 1978). Защита от перегрева может включать уменьшенную пигментацию листьев и содержание ферментов сохраняющих свою структуру при повышении температуры и имеющих более высокий или широкий температурный оптимум активности (Культиасов, 1982). Так же растения могут в определенных пределах поддерживать оптимальную температуру тела, регулируя испарение воды устьицами, имеющее охлаждающее действие. Наоборот, при падении температуры в растениях запускаются процессы разобщения дыхания в митохондриях и энергия окисления молекул переходит в тепловую энергию (Войников, 1987). Так же количество

эндогенного тепла в клетке зависит от числа и размеров митохондрий и интенсивности окисления в них.

На популяционном уровне выделяют генетическую адаптацию к условиям окружающей среды, выражающуюся в адаптационном изменении генетического материала в соответствии с требованиями сред�