Идентификация и молекулярно-генетический анализ генов Arabidopsis thaliana, контролирующих чувствительность к гербициду ацифлюорфену

Апчелимов, Алексей Андреевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация и молекулярно-генетический анализ генов Arabidopsis thaliana, контролирующих чувствительность к гербициду ацифлюорфену
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и молекулярно-генетический анализ генов Arabidopsis thaliana, контролирующих чувствительность к гербициду ацифлюорфену"

На правах рукописи

Апчелимов Алексей Андреевич

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ АгаЬМорзк ЛаНапа, КОНТРОЛИРУЮЩИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ГЕРБИЦИДУ АЦИФЛЮОРФЕНУ

Специальность 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

0 3 СЕН 2993

003476065

Работа выполнена на кафедре генетики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.ВЛомоносова.

Шестаков Сергей Васильевич

Ежова Татьяна Анатольевна

Кокшарова Ольга Алексеевна Коновалов Федор Андреевич

Центр Биоинженерии РАН ¿я?

Защита диссертации состоится « (/ » _2009г. в ч. на заседании

Диссертационного совета Д 002.214.01 при Учереждении Российской академии наук Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: (499) 132-89-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учереждения Российской академии неук Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3.

Автореферат разослан« 7Ь » 2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор, академик РАН

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: доктор биологических наук, профессор ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук кандидат биологических наук

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Татьяна Аркадьевна Синелыцикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Биосинтез тетрапирролов является одним из центральных процессов у всех фотосинтезирующих организмов. Интенсивное изучение генетического контроля этого процесса у растений проводится на модельном объекте Arabidopsis thaliana, определение полной нуклеотидной последовательности которого стало мощным импульсом развития геномики растений, работ по молекулярно-генетическому картированию, клонированию и идентификации функции генов.

На сегодняшний день все этапы биосинтеза тетрапирролов детально исследованы. Показано что, общими предшественниками синтеза гема и хлорофилла являются порфирины, при чрезмерном накоплении которых происходит генерирование синглетного кислорода на свету, что ведет к фотоокислителыюму стрессу, блоку биосинтеза тетрапирролов и гибели растения (Beale, Weinstein, 1990; Grimm, 1998). Поэтому исследование мутантов устойчивых и чуствительных к гербицидам, способным ингибировать протопорфириногеноксидазу (РРОХ) - фермент, субстратом которого является протопорфирин IX, может пролить свет на молекулярно-генетические механизмы устойчивости к фотодинамическим гербицидам, в частности, к ацифлюофену, который широко применяется на практике. Эти исследования важны для понимания механизмов регуляции генов биосинтеза тетрапирролов.

На кафедре генетики МГУ получены мутанты A.thaliana, толерантные к ингибитору биосинтеза хлорофилла ацифлуорфену, характеризующиеся измененной окраской листа (Ежова и др., 2001). Мутационный и молекулярно-генегический анализ является эффективным подходом для идентификации генов и изучения их функции.

Целью работы является идентификация и структурно-функциональный анализ генов Arabidopsis thaliana, контролирующих устойчивость к гербициду ацифлюорфену на основе анализа мутантов из коллекции кафедры генетики МГУ.

Задачами работы являлись:

1. Морфо-фнзиологический анализ мутантов A.thaliana aciS и aci8, обладающих повышенной устойчивостью к ацифлюорфену.

2. Молекулярно-генетическое картирование и клонирование генов ACI5 и ACI8.

3. Сравнительный анализ уровней транскрипции генов, контролирующих биосинтез тетрапирролов у мутантов aci5, aci8 в целях изучения молекулярно-генетических механизмов толерантности к ацифлюорфену.

4. Изучение функциональных особенностей гена ACI5 и его гомолога на основе анализа их внутри- и межвидового полиморфизма.

Научная новизна. Впервые показано что, ген CHLI1/ACI5 (At4gl8480), кодирующий субъединицу CHLI Mg-хелатазного комплекса, отвечает за устойчивость к ацифлюорфену. На основании анализа генной экспрессии установление что, причиной устойчивости мутанта к ацифлюорфену является увеличение потока токсичных порфиринов в сторону образования гема, за счет повышения уровня транскрипции генов биосинтеза гема - генов Fe-хелатазы FC1 и FC 2.

Установлено, что гомолог гена CHLI 1/ACI5 - ген CHLI 2 (At5g45930) в геноме A.thaliana выполняет второстепенную функцию из-за нуклеотидных замен в 3'-терминальном конце гена. Этот ген не способен компенсировать утрату функции гена CHLI 1/ACI5 при синтезе хлорофилла. Предполагается, что при формировании Mg-хелатазного комплекса белок CHLI 2 из-за измененной последовательности С-конца не может конкурировать с CHLI 1. Анализ внутривидового полиморфизма гена CHLI 2 выявил наличие двух гаплогрупп, одна из которых идет по пути псевдогенезации, а вторая находится под действием стабилизирующего отбора.

Показано что, ген ACI8 идентичен гену ATASE 2 (At4g34740), кодирующему ппотаминфосфорибозилпирофосфат амидотрансферазу (GPRAT). Таким образом впервые выявлена связь пути биосинтеза пуринов de novo с устойчивостью к гербициду. Устойчивость мутанта aci8 к ацифлюорфену обусловлена снижением уровня транскрипции гена CHLH, кодирующего лимитирующий фермент биосинтеза хлорофилла (субъединицу CHLH Mg-хелатазного комплекса).

Научно-практнческаа значимость работы. Изучение функциональных особенностей гомологичных генов A.thaliana CHU 1 и CHLI 2 вносит вклад в создание динамичной имитационной модели системы синтеза тетрапирролов у высших растений. Выяснение механизмов устойчивости A.thaliana к гербициду ацифлюорфену открывает новые возножности для создания трансгенных растений с контролируемым путем биосинтеза хлорофиллов, гемов и фитохромобилинов, для получения линий устойчивых к фотодинамическим гербицидам. Сведения о нуклеотидных последовательностях различных природных рас A.thaliana отправлены в GenBank. Информация о CAPS маркерах aci8caps и aci8snp323, выявляющих полиморфизм между расами Dijon и Columbia, отправлена в базу данных TAIR. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены: на Всероссийской конференции по генетике для молодых ученых (пМосква, Россия 2003), XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых

«Ломоносов-2005» (Москва, 2005), на международной конференции ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), на симпозиумах «Биофизика фотосинтеза. Межклеточная сигнализация и регуляция генов в растениях» (Минск, Беларусь, 2007), «EU-Russía 7th Frame Program Symposium» (Суздаль, 2007), на Российско-Польской конференции «Биотехнология» (президиум РАН, Москва, 2008). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ. Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на ißl страницах, состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы, включающего источника. Работа содержит 57рисунков и 2 2д-аблиц.

Работа поддержана грантами РФФИ (проект 07-04- 12077-офи), ФЦП «Ведущие научные школы» (НШ-4202.2008.4), программой РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы.

В работе использовали линии Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., расы и мутантные линии из коллекции кафедры генетики МГУ, мутанты aci5 и aci8, выделенные из расы Dijon (Dj) после химического мутагенеза с этилметансульфонатом и последующей селекциии па устойчивость к ацифлюурфену (Ежова и др., 2001). Линия es (ch42-2), полученная с помощью инсерционного мутагенеза из расы Columbia (Koncz et al., 1990), любезно предоставлена профессором Б. Гриммом. Были также использованы расы A.thaliana из международного банка семян: Dijon, Enkhiem, Blanes, Koeln, Petergoph, Estland, Columbia, Landsberg erecta, Wassilewskiya, Slavice, Kashmir, Cape Verdi Islands (CVI), Coimbra, Hilversum, Ibel Tazekka, Geleen, Weiningen, Antwerpen, Eriengsboda. Общая схема экспериментов представлена на рисунке 1.

Выращивание растений A.thaliana. Растения выращивали в асептических условиях на агаризованной среде Квитко (Квитко, I960), или в смеси почвы и песка (2:1) при интенсивности освещения 4000 лк и температуре 23- 26°С. Выращивание проводили также в стерильных условиях на среде Moorashige-Skuga при 14 часовом дне и 2%-ом содержании сахарозы (для гомозигот мутанта aciS). В состав среды для регенерации растений A.thaliana входили среда MS, витамины по Гамборгу, гормоны

ВА- 0.5мг/л, ИАА - 0.02мг/л. Семена стерилизовали в смеси 70% этанола и перекиси водорода (3-5%) в течение 90 сек.

Изучение мутантов aciS и ао<Н

Морфо-физиологаческий анализ мутантов

анализ содержа1гия пигментов

кии а

Генетический анализ м;талтов

анализ генной экспрессии

Изучение зависимости фенотипа от освещения и содержания сахарозы в| среде

генетическое и молекулярно-генетическое картирование

з \

качественный анализ транскрипции аллелей \ нутаеотидной и a'acl¡ по иуклеогнапой \ последовательности \

хдик сит \

анализ

аминокислотиой последовательности генов-кандидатов

создание молекулярных кшегрухцкй шбридного гена СИШ/СНШ

анализ уровня транскрипции генов биосинтеза теграпирролов (ОТ-ПЦР. НЦР-РВ) с целью выявления механизмов устойчивости к аилфлгоорфену

анализ полиморфизма филогснтический анализ

Рисунок I. Схема экспериментов по исследованию мутантов aci5 и aci8.

Генетическое картирование с использованием ДНК-маркеров. Использовали CAPS маркеры, выявляющие рестрикционный полиморфизм амплифицированных фрагментов. Для анализа нуклеотидной последовательности генов CHLI 1, CHLI 2 и ATASE2 выделяли ДНК по методу (Dellaporta et al., 1983) с модификациями. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с праймерами, компании "Евроген" и "Синтол" (Россия). Эндонуклеазы рестрикции компании "Сибэнзим" (Россия) использовали для проведения рестрикционного анализа. С помощью горизонтального электрофореза проводили анализ продуктов ПЦР и рестрикции. Частоту рекомбинации рассчитывали по методике Komneef, Stam (1987).

Изучение экспрессии генов. Для анализа экспрессии генов использовали как полуколичественный (ПЦР продуктов обратной транскрипции - ОТ-ПЦР), так и количественный (ПЦР в реальном времени - РВ-ПЦР) методы оценки уровня мРНК в растениях. При выделении РНК использовали набор фирмы «Qiagen» (США). Синтез первой цепи кДНК осуществляли с помощью набора реактивов компании "Силекс" (Россия). Анализировали уровень свечения продукта в агарозном геле при разных циклах ПЦР с использованием специфичных праймеров или с помощью РВ-ПЦР термоциклера компании "Силекс" (Россия). В качестве контроля для оценки

количества выделенной мРГГК определяли уровень транскрипции генов АТР1 (адешшрибозилфосфотрансфераза 1) и EF1 (фактор пролонгации), которые экспрессируются конститутивно в растениях A.thaliana.

Секвенировапие. При подготовке ПЦР-продукта к секвенированию проводили 30 циклов ПЦР. Секвенирование последовательностей ПЦР-продуктов и клонированных фрагментов выполнялось в межинститутском ЦКП «Геном» или на ABI373 Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Компьютерные методы анализа. Информацию о последовательностях генов и их структуре у расы Columbia получали из базы данных «TAIR» (http:// www.arabidopsis.org). На основе той же базы производили подбор CAPS маркеров и рестрикционный анализ. Подбор праймеров осуществляли с помощью программы Web-primer (http://genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/web-primer, SGD,m). Проверку сиквенса выполняли с использованием программы Chromas Lite 1.45 (Technelysium Pty Ltd). Трансляцию in silico последовательностей генов проводили с использованием программы Translate (http://cn.expasy.org/tools1. Для поиска гомологичных белковых и нуклеотидных последовательностей использовали программу BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Множественные и попарные выравнивания нуклеотидных и аминокислотных последовательностей осуществляли с использованием программ ClastalW и Align (http://www.ebi.ac.uk/, Higgins et al., 1996; при условиях similarity matrix BLOSUM, 30; gap open penalty, 10; gap extension penalty, 0.1), визуализацию осуществляли в программе GeneDoc 2.6.002 (Nicholas et al., 1997). Анализ N-терминальной транзитной последовательности осуществляли с помощью программы ChloroP 1.1 (Emanuelsson et al., 1999; параметры по умолчанию). Построение трехмерной структуры белков проводилось с помощью программы Geno3D (http://geno3d-pbil.ibcp.fr/, Combet et al., 2002). Для визуализации и сравнения третичных структур белков использовали программу Swiss-Pdb Viewer 3.7 (Guex, Peitsch, 1997).

Для анализа промоторных последовательностей и идентификации цис-регуляторных элементов использовали базу данных PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/ htdocs/PLACE/). При построении филогенетических дендрограмм методом максимальной экономии использовалась программа PAUP* (Swofford, 2003); оценку достоверности узлов проводили в той же программе с помощью бутсреп анализа. Визуализацию дендрограмм осуществляли в программе Tree View (Page, 1996). Уровень внутривидовой нуклеотидной изменчивости определяли по значениям попарных различий (Pi, Nei, 1987). Отклонения наблюдаемых нуклеотидных вариаций от нейтральной эволюции определяли с помощью значений тестов D (Tajima, 1989) и

D* (Fu and Li, 1993). Неравновесное сцепление полиморфных сайтов (их нерандомное распределение в генах) определяли с помощью теста Z„s (Kelly, 1997). Все вычисления были проведены в программе DiiaSP version 4.0 (Rozas et al., 2003).

Результаты исследований.

1. Морфо-физиологические особенности мутантов aci5 и aci8 Мутация aciS имеет полудоминантный моногенный характер наследования (1:2:1). Гомозиготные мутанты aci5 - растения белого или кремового цвета; содержание хлорофилла а и b у мутанта aci5 находится на уровне следовых концентраций. Гетерозиготные мутанты aci5 - растения светло-зеленого цвета с содержанием хлорофилла а 0.325 мг/1г сырого веса и хлорофилла b 0.08 мг/1г сырого веса, что составляет соответственно 27% и 17% от уровня содержанием хлорофилла в растениях дикого типа Dijon. Общее содержание хлорофилла у гетерозигот aci5 в 1.6 раза ниже, чем у гомозиготного аллельного мутанта es (общее содержание хлорофилла 43% от дикого типа, Koncz et al., 1990). При выращивании гетерозиготных мутантов aciS на среде Квитко с сахарозой и при меньшей интенсивности освещения содержание хлорофилла увеличивается, но остается ниже чем, в диком типе Dijon.

Мутация aci8 имеет рецессивный моногенный характер наследования, с расщеплением 1:3. Гомозиготные мутанты aci8 характеризуются наличием сетчатых симметричных белых пятен на листовой пластинке. Содержание хлорофилла а и b у мутакга aci8 сильно зависит от интенсивности и продолжительности освещения. При выращивании в условиях теплицы (16 часовой день) общее содержание составляет 1 мг/1г сырого веса. При пониженной интенсивности освещения и 8 часовом дне мутант ac¡8 практически не отличим от растений дикого типа. При перемещении таких растений на постоянное освещение образующиеся белые пятна занимают лист практически полностью.

2. Молекулярно-генетнческое картирование генов асг5 и aci8 Анализ фенотипа растений F2 поколения от скрещивания с маркерными линиями показал сцепление мутации aci5 с маркерами хромосомы 4 ар2 (сила сцепления 23 сМ) и сег4 (сила сцепления 11 сМ, рис.2а), а мутации aci8 - с маркером ар2 (сила сцепления 4.4 сМ, рис.2а). Следовательно, ген ACI5 локализован в районе 41-44 сМ генетической карты (рис.2а), а ген ACI8 - в районе 63-66 сМ. В гомологичном районе RI-карты (он примерно соответствует положению 68 сМ и 86 сМ соответственно) локализованы CAPS-маркеры ch42 и ag, а также Jml42, caí2 и Atmyb3R, которые по нашим данным способны выявлять полиморфизм ДНК рас Dijon и Columbia (рис.2б).

Анализ 116 зеленых растений (232 хромосом) из F2 поколения от скрещивания гетерозигот aci5 с растениями расы Columbia выявил 3 растения, гетерозиготные по маркеру ag, что соответствует расстоянию 1.3 сМ между геном aci5 и маркером. Рекомбинантов по маркеру сМ2 среди исследованной выборки обнаружено не было. Расстояние между маркерами ag (расположен в ВАС клоне FI3C5) и ch42 (F28J12) составляет около 185 kb, что примерно соответствует тому генетическому расстоянию, которое выявлено между геном aci5 и маркером ch42 (рис.2в). Следовательно, ген ACI5 должен находиться очень близко к маркеру ch42. Этот CAPS-маркер находится в локусе At4gl8480 (ген CHLI 1), который кодирует субъединицу I Mg-хелатазного комплекса. Ген CHLI 1 может быть кандидатным геном, однако все известные мутанты по нему имеют отличный от мутанта aci5 фенотип и рецессивный характер наследования.

АС/5 О " 1.3

--------------■'■..................4 9

C£R2 Atmyb3R snp323 0.49 acBcaps

myb3R snp323

I I.............f I

ch42 ag 0,73 cal2 rauiï nK?_________________i.4S

L.................-I 'Г41.2В

CHLI1 кшГ........* ATASE2

Рисунок 2. Локализация генов АС/5 и ACI8 на генетической (а), молекулярно-генетической RI (б) и физической (в) картах хромосомы 4 A.thaliana. Жирным шрифтом обозначены CAPS-маркеры, заглавными буквами - морфологические маркеры. На классической карте и молекулярно-генетической RJ-карте снизу отмечено положение маркеров в сМ (в связи с большей длиной RI-карты, положение одних и тех же маркеров на двух типах генетических карт различается); сверху указано расстояние от маркеров до генов ACI5 и ACI8 в сМ. Над физической картой отмечено положение молекулярных маркеров в т.и.н.

Анализ 136 зеленых растений (272 хромосомы) из F2 поколения от скрещивания гетерозигот aci8 с растениями расы Columbia выявил 3, 7, 4, 1 и 2 растения, гетерозиготные соответственно по маркерам Jm¡42, Atmyb3R, aci8caps, cat2 и aci8snp323, что соответствует расстоянию в 2.5, 1.45, 0.49 и 0.73 сМ между геном ACI8 и маркерами (рис.2в). Следовательно, ген ACI8 должен находиться очень близко к маркеру cat2. При анализе открытых рамок считывания (30 ORF) в данном районе (ВАС клон T4L20), был выявлен единственный ген кандидат - At4g34740 (ATASE 2), который кодирует глютаминфосфорибозилпирофосфат амидотрансферазу (GPRAT). Мутанты по этому гену (Hung et al., 2004) схожи по окраске листьев с мутантом aci8.

3. Идентификация генов ACIS/CHLI1 и ACI8IATASE 2

Для выяснения того, имеют ли мутанты aci5 и ac¡8 мутации в генах кандидатах, были амплифицированы и проанализированы геномные последовательности генов CHLI1 и ATASE 2 из мутантов и растений дикого типа. Выявлено 9 полиморфных участков при сравнении последовательностей гена CHLI I/At4gl8480 из рас Dijon и Columbia: 1 замена в 1-ом экзоне, 8 замен в 3-ем экзоне. Между последовательностями мутанта aci5 и растений дикого типа расы Dijon обнаружены различия - 1 замена в промоторной области гена и 1 замена в 3 экзоне (табл. 1).

Таблица I. Полиморфизм гена CHU 1 (At4gl8480)

Положение замены промотор 1экзон 3 экзон

Расы и мутанты -6 15 222 312 321 345 475 420 453 588 718

Dijon А G Т А G G G С Т А G

Columbia А Т А G Т Т А Т G С G

aciS С G Т А G G G С Т А А

Цифрами обозначены положения замен относительно старт кодона.

Обнаруженная замена у мутанта aci5 в промоторной области не затрагивает ни один из выявленных компьютерным анализом регуляторных цис-элементов (wBox, MBS, gARE), и, по-видимому, не является функционально значимой. В пользу этого свидетельствует отсутствие различий в уровне транскрипции гена CHLI I (At4gl8480) у мутанта aci5 и растений дикого типа расы Dijon (см. ст. 15).

Замена оснований GC—>АТ в положении №718, приводит к изменению в аминокислотной последовательности (Asp240—>Asn) - замещению аспарагиновой кислоты на аспарагин. Согласно свойствам этих аминокислот (Норр, Woods, 1981; Formel, 1984; Sweet, Eisenberg, 1983; Kyte, Doolittle, 1982), такая замена приводит к смене заряда на поверхности белка, с отрицательного на нейтральный. Этот тип транзиций соответствует заменам, происходящим под действием высокоспецифичного мутагена этилметансульфоната, что косвенно свидетельствует о том, что мутация вызвана действием мутагена, а не возникла спонтанно.

Сравнение последовательности гена ATASE 2 из мутантных и растений дикого типа выявило замену GC—>АТ в положении №1426 (табл.2), которая приводит к замещению тиразина на метионин (Thr475—»Met). Такая замена может влиять на функциональную активность глутаминазного домена белка.

Дополнительно был проведен тест на аллелизм между мутацией aci5 и мутацией es, которая вызвана инсерцией Т-ДНК в третий экзон гена CHLI I, за 6 пар оснований до стоп-кодона, что удлиняет белок на 11 аминокислот (Koncz et al., 1990).

Таблица 2. Полиморфизм гека ATASE 2 (At4g34740)

Положение замены

Расы и мутанты 215 443 458 461 485 488 668 749 767 1238 1426 1598

Dijon Т С Т С Т G Т Т С Т С С

Columbia G Т С А G Т С G Т G С Т

aciS Т С Т С Т G т Т С Т Т С

Цифрами обозначены положения замен относительно старт кодона.

Мутация характеризуется рецессивным характером наследования и в гомозиготе приводит к желто-зеленой окраске листьев и стебля, сходной с таковой у растений, гетерозиготных по мутации aciS.

Среди 80 гибридов поколения F1 от скрещивания гомозиготных мутантов cs с гетерозиготами по мутации aciS выявлено 43 зеленых растений и 37 белых растений, погибающих на стадии семядолей. Это расщепление соответствует теоретически ожидаемому 1 : 1 (х=0.225; р>0.20) в случае аллелизма данных мутаций. В потомстве F2 от зеленых растений выявлено 30 зеленых и 12 желто-зеленых растений, что говорит о моногешюм рецессивном наследовании желто-зеленой окраски листьев (Но=3:1, х=0.29; р>0.20). Очевидно, что зеленые гибриды FI являлись гетерозиготами по рецессивной мутации cs, а белые растения имели генотип cs/aci5, что свидетельствовало о доминировании аллсля aciS над cs. Отсутствие комплементации мутаций cs и aciS однозначно свидетельствуют об их аллельности. Таким образом, ген ACI5, контролирующий устойчивость к ацифлюорфену идентичен гену CHLI 1, кодирующему субъединицу I Mg-хелатазного комплекса.

При скрещивании мутантных растений aci8 (с маркерами сег-2 и ар-2) к cial-2 (Hisl87Tyr) получены результаты, которые свидетельствуют об аллельности рецессивных мутаций aci8 и cial-2.

4. Анализ молскулярно-гснетичсских механизмов устойчивости к ацифлюорфену

у мутанта aci5

Для выяснения механизмов устойчивости мутанта aci5 к ацифлюорфену определяли уровни транскрипции генов, кодирующих ферменты пути биосинтеза тетрапирролов. Так как при селекции на устойчивость к гербициду отбирались гетерозиготные мутанты, именно они были использованы в анализе.

Известно, что устойчивость может быть связана с увеличением концентрации белка мишени РРОХ (Grimm, 1999), который кодируется двумя генами (HemGl и HemG2). У гетерозиготного мутанта aci5 уровень транскрипции генов HemGl и

Нетй2 практически не изменен (рис.3), т.е. механизм толерантности к ацифлюорфену не связан с увеличением концентрации белка мишени. Следует отметить, что уровень транскрипции генов РРОХ у аллельного Т-ДНК мутанта а с удлиненным С-концом белка СН1Л 1 на 11 аминокислот увеличен по сравнению с мутантом ос/5.

Рисунок 3. Относительный уровень транскрипции генов, кодирующих ферменты биосинтеза тетрапирролов (ПЦР-РВ). Уровень транскрипции генов в растениях дикого типа принят за единицу. Опыт проводили на выборке из 3-х растений.

Были проанализированы уровни транскрипции других генов. Во-первых, генов, контролирующих начальные этапы (до РРОХ) пути биосинтеза тетрапирролов, которые являются общими для синтеза хлорофилла и гема, во-вторых, ключевых генов синтеза гема и в-третьих, генов биосинтеза хлорофилла. Транскрипция генов первой группы (Нета1/Нета2, 6X4) не изменена или повышена. Экспрессия генов второй группы (гены Ре-хелатазы - /-"С/ и РС2) значительно увеличена (более чем в 4.5 раза). Транскрипция генов СНЫ 1, СНЫ 2 и гена циклазы СНЬ27 из третьей группы также повышена, а гена лимитирующего синтез хлорофилла СНЬН не изменена. Отметим, что у мутанта ся, с более высоким содержанием хлорофилла, уровень транскрипции генов Ре-хелатазы РС1 и РС2 также повышен (более чем в 2 и 7 раз, соответственно). Данные об увеличении активности генов биосинтеза гема свидетельствуют о том, что повышенная толерантность мутанта аа5 к ацифлюорфену связана с увеличением потока токсичных порфиринов в сторону образования гема, а не хлорофилла. Большинство исследованных генов у мутанта а экспрессируются на значительно более высоком уровне, чем у мутанта аЫ5. По-видимому, это связано с

влиянием на уровень транскрипции этих генов определенных пороговых концентраций продуктов биосинтеза тетрапирролов.

4. Анализ молекулярно-генетических механизмов устойчивости к ацифлюорфену

у мутанта аы8

Для выяснения механизмов устойчивости мутанта к ацифлюорфену и причин образования белых пятен на листьях мутанта проведен анализ уровня транскрипции генов, кодирующих ферменты пути биосинтеза тетрапирролов.

П aci'8 24ч освещение

aci8 8ч освещение

Рисунок 4. Относительный уровень транскрипции генов, кодирующих ферменты пути биосинтеза тетрапирролов (ПЦР-РВ). Уровень транскрипции генов в растениях дикого типа принят за единицу. Опыт проводили на выборке из 3-х растений.

Наличие белых пятен на листьях могло быть связано со сниженным уровнем синтеза хлорофилла. Поэтому нами были определены уровни транскрипции генов, кодирующих ферменты пути биосинтеза тетрапирролов в растениях мутанта в условиях постоянной освещенности и в условиях 8-ми часовой освещенности. В первом случае РНК выделяли из участков листьев с белыми пятнами. Установлено, что уровень транскрипции генов HemGl и HemG2, кодирующих РРОХ, практически не отличается от уровня дикого типа. При этом гены, контролирующие как более поздние (после РРОХ), так и ранние (до РРОХ) этапы биосинтеза тетрапирролов имеют сниженный уровень транскрипции (рис.4). Почти полностью блокирована активность гена CHLH, кодирующего одну из субъединиц Mg-хелатазного комплекса, которая играет роль лимитирующего этапа биосинтеза хлорофилла. Это, по-видимому, и вызывает образование белых пятен на листьях мутанта. О чем

свидетельствует и отсутствие изменений в профиле экспрессии генов у мутанта, выращенного при 8-ми часовом дне, когда белых пятен на листьях не образуется.

Известно, что конечные продукты биосинтеза пуринов de novo АМФ и ГМФ являются необходимыми субстратами для работы систем транслоконов хлоропластов. При добавлении АМФ в среду роста мутанта по гену ATASE 2 cia-1 происходит восстановление фенотипа (Hung et al., 2004). Вероятно, при нарушении транспорта белков через мембрану пластиды, нарушается связь с ядром и останавливается сиитез ферментов, обеспечивающих поддержание необходимого уровня синтеза тетрапирролов. Косвенным доказательством этого служит накопление зерен крахмала в хлоропластах на границе белых пятен. Т.е., по-видимому, у мутанта aci8 нарушены и фосфоролитический и амилолитический пути транспорта продуктов утилизации крахмальных зерен. Медленное накопление токсичных порфиринов способствует постепенной деградации тилакоидной системы, которая в свою очередь, необходима для взаимодействия многих ферментов пути биосинтеза тетрапирролов и фотосинтеза. При обработке таких растений ацифлюорфеном эффект будет минимальный, т.к. прекращается и так сниженный синтез гема и хлорофилла. Антиоксидантные системы напротив функционируют в мутантных растениях aci8 активнее, чем в растениях дикого типа, что также влияет на уровень устойчивости к ацифлюорфеиу. Таким образом, толерантность к ацифлюорфену мутанта aci8 очевидно связана с общим снижением уровня биосинтеза тетрапирролов в результате изменений в системе биосинтеза пуринов de novo.

5. Изучение функциональных особенностей гена CHLI1 и его гомолога СНЫ 2

В отличие от других растений, в геноме A.thaliana присутствуют две копии гена CIRA. Уникальность фенотипа мутанта albina и полудоминантного характера наследования мутации ос/5 позволяет изучить функциональные взаимоотношения генов, СНЫ 1 и СНЫ 2, обладающих высокой степенью сходства (82%).

Поскольку снижение функции es аллеля гена СНЫ 1 может частично компенсироваться геном СНЫ 2 (Rissler et al., 2002), у гибридов от скрещивания мутантов aciS и es можно было ожидать желтую или светло-зеленую окраску. Полученные гибриды, однако, имели фенотип albina. Таким образом, либо мутация aciS подавляет экспрессию гена СНЫ 1 и гена СНЫ 2, либо продукт гена СНЫ 2 и es -мутантная форма белка CHL I не могут конкурировать с белком мутантного аллеля aciS гена СНЫ 1.

Для определения вклада этих двух генов в развитие фенотипа albina проведен сравнительный анализ уровней транскрипции генов СНЫ1 и СНЫ 2 у гомозиготных белых растений aci5 на стадии образования цветков, а также секвенирование кДНК гена СНЫ 1 из белых cs/aci5 растений.

Растения выращивали на богатой срсдс MS с сахарозой и гормонами. Исследования показали (рис.5), что уровни транскрипции генов СНЫ 1 и CHLI 2 у мутанта и растений дикого типа расы Dijon практически одинаковы.

Рисунок 5. Выравнивание концентрации кДНК по уровню экспрессии гена ЛРТ1 и ПЦР продуктов обратной транскрипции генов СНЫ I и СНЫ 2. Цифрами отмечено число циклов амплификации.

Это указывает на то, что у мутанта, по-видимому, синтезируются полноразмерные мРНК и соответствующие полипептиды. Выявленные точковые мутации не влияют на стабильность мРНК.

Результаты секвенирования кДНК из растений cs/aci5 выявили наличие последовательности аллели aci5 и аллели es. Было проанализировано 9 позиций, 8 из которых однозначно показали гетерозиготность. Очевидно, что в белом растении экспрессируются оба аллеля, и, по-видимому, присутствуют обе формы белка.

Таким образом, мутация es со вставкой Т-ДНК в 3' терминальный конец гена СНЫ 1, приводит к снижению уровня хлорофилла из-за удлиненного С-конца белка (Koncz et al., 1990), который снижает сродство между CHLI субъединицами. Фенотип albina растений cs/aci5 можно объяснить тем, что белок с заменой в каталитическом центре, но с С-концом белка дикого типа (аллель aci5) полностью вытесняет es форму белка. Вероятно, уникальность фенотипа мутанта aci5 связана с функциональными особенностями мутантного аллеля гена СНЫ 1, а именно, с расположением мутангного сайта в высоко консервативном АТФ связывающем/гидролизующем районе и с нормально функционирующей С-концсвой областью. В таком случае продукт гена СНЫ 2 из-за изменений в С-концевом домене не может конкурировать с продуктом гена СНЫ 1 при сборке Mg-хелатазного комплекса.

лгп:

Дккмй тия Dijon и 26 И U 32 35

CHU1:

Дикий тип Dijon 1В nana и

СНО 2; Дикий им Dijon 18 21 23 27 30 15

6. Анализ производной аминокислотной последовательности белков, кодируемых генамн СНЫ 1 и CHLI2 у мутанта aci5 и растений дикого типа

Для оценки различий в аминокислотной последовательности белков, кодируемых генами СНЫ 1 и СНЫ 2 осуществлялось множественное выравнивание известных гомологов CHLI среди растений, бактерий и водорослей, на основе которого строилось филогенетическое древо. Выявлена ассоциированность CHLI 2 A.thaliana с аналогичной последовательностью в геноме сои (G.max). На строгом консенсусном филогенетическом древе CHLI 1 и CHLI 2 A.thaliana образуют неразрешенную группу с геном сои. Анализ неразрешешюго узла показал, что для разных конфигураций дендрограмм уровни поддержки различны. В первом случае (86%) наиболее близкой к предковой копии оказывается последовательность в геноме сои, во втором (14%) -последовательность CHLI 2 A.thaliana. При изучении белкового полиморфизма и функциональной значимости замен в С-концевой области белка CHLI 1 в сравнении с CHLI 2 использовали подход, основанный на консервативности первичной структуры CHLI белков.

Таблица 3. Замены аминокислот в CHLI белках растений дикого типа рас Columbia и

Dijon A.thaliana и других растений

Положение аминокислотных замен

Раса A.thaliana или вид 143 155 159 162 169 178 323 327 361 369 371 382 386 393 394 412 417

Columbia CHLI2 T R С К Q Е Q L D M I Q Q G I M I

Dijon CHLI2 Т R с к Q Е Q L D M I Q Q G I M I

Columbia/Dijon CHLI1 N I F V Е А К D N I T к R A T I V

Glycine max (BAA08291) К Q F V L L к E N I T к N A T I L

Nicotiana tabacum (TO 1790) К D V А R R к E N I T к К A T I V

Oryza saliva (XP 462936) R D V Р L T L D N I T к T A T I L

Hordium vulgare (AAA99720) S Y V Р L T L D N I T к V S T I L

Все замены в CHLI 2 Dj относительно CHLI 2 Col обнаружены в районах со средней (1,3) или низкой (2,4) степенью консервативности (рис. 6). Выявлено 17 замен аминокислот в других участках белков CHLI 2 Col/Dj относительно CHLI 1 Col/Dj и других растений в положениях 143, 155, 159, 162, 169, 178, 323, 327, 361, 369, 371, 382, 386, 393, 394,412,417 (табл.3). Из них 12 находятся в не консервативных районах CHLI белков растений.

Anabaena_ varia bilis

yastucjHtictifvnm'

Sxi1echocysii.4_.sp_pCC

ВшмшщихЬшгшй

Prochlarucuírus

SynahiKi/u'u^eJYH

(¡loeubacter v¡y/uceu\

Trkh oí/em¡i< eruhrucum ganclk-Cxunoj/horu rft/grepfasi fflfoitff ffg. smrn.w rMvrvplas L Porphxrajiurpurra chií/wlaaL (¡uillurJiiL ihetu Л. íhaliana Düon Util 2

A. thaliunu Col Chl / 2 A. íhaliana Col Chl / /

Cb'dne^max Hunleum^Yulgure

Or\'Ti¡_sativa XiMtiunu^tubucum ihloroplasL Chuclusphucridium

Ílhlumxüiímonasj'cinliurdiü MuroplusL Chlurellu. y и!mis

chloroplusl Eu^lenu 4racilis

LhhrüplustJ^íaüüisimiL.Yiridí:

Anabaena^Yuriahitis ^tiK^puactifocmc. SsnKhíK.vXií.spjCC

Gloeobacler vio/aceus

Triclwdewinm_ еЩЬгиент

MuroplQsLQilunteUu_sit\emh chlarapiusL РигрЬхпишгрнгси chloroplusLGuillurdiaj/ieta .1. Ihuliunu Üüua. Chl 12 Л. íhuliana Col Chl i 2 A. íhuliuna Coi Chl I1 Qbsiasjms. HaUeum^Yulxare Oo^sutiru Л 'hmutm^luhacurn chlmpiubLChuetusphumdiHm

Chkmxdumnu!i.reitihardüi (■hlorwltíSLEuglftuLuruali?

Рисунок 6. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей CHLI. Цифрами обозначены положения замен в белке CHLI 2 Dj относительно CHLI 2 Col.

Чтобы сузить область поиска значимых замен, было выполнено множественное выравнивание с последовательностями белков бактерий и водорослей (всего 25 последовательностей). Замены в положениях 159, 371 находятся в высоко консервативных областях; замены в положениях 369, 382, 394, 412 также могут быть значимыми, но находятся в менее консервативных районах (табл.3). Функционально значимой может быть одна из выявленных замен или совокупность замен в С-конце белка. Обнаруженные отличия свидетельствуют о функциональных различиях между

CHLI 1 и CHLT 2 белков, и указывают на сложный характер эволюционной динамики генов CHLI 1 и СНЫ2.

7. Анализ полиморфизма гейов CHLI1 и CHLI2

Для анализа эволюционных аспектов взаимоотношений генов CHLI 1 и CHLI 2 использовали методы оценки внутри- и межвидового нуклеотидного полиморфизма. На первом этапе исследования сравнивали частоты синонимичных (Ks) и несинонимичных (Ка) замен между аллелями генов CHLI 1 и С H 1.12 из рас Col и Dj A.thaliana и гена CHLI сои. Близкие к нулю отношения Ka/Ks для аллелей исследуемых генов CHLI 1 и CHLI 2 A.thaliana свидетельствует о действии стабилизирующего отбора, устраняющего все несинонимичные замены. В то же время, величина и отношение показателей Ks и Ка для аллелей рас Col и Dj гена CHLI I ниже, чем для аллелей гена СНЫ 2 (габл.4). Эти данные указывают на более высокую скорость эволюционных изменений гена CHLI2.

Таблица 4. Частота замен по синонимичным и несинонимичным сайтам и отношение частот для аллелей генов CHLI 1 и CHLI2 A.thaliana из рас Dj и Col и

гомологичных генов сои (G.max) и табака (N.tabacum)

CHLI I CHLI 2 CHU 2 CHLI 2 CHLI

Dj/Col Dj/Col Dj/G.maxl Col/G.max G.max/N.t

(0/9) (4/15) (42/196) (42/193) (43/188)

Ка 0 0.0369 0 0.0051 0.0619 0.08228 0.0717 0.7482 0.09585 0.0717 0.7359 0.09746 0.0709 0.7224 0.09809

Ka/Ks

В скобках приведено количество несинонимичных и синонимичных замен в нуклеотидной последовательности размером 1029 п.н.

Следует отметить, что величина Ka/Ks для аллелей гена CHLI 2 приближается к той, которая наблюдается при сравнении этих аллелей с единственным геном CHLI сои (табл,4). Этот факт можно объяснить ослаблением действия отбора в отношении гена CIILI2, дублирующего ген CHLI I.

Доя изучения микроэволюции гена CHLI2 проведен анализ полиморфизма этого гена на 19 расах A.thaliana. В анализируемую последовательность общей протяженностью 1654 куклеотида входили 3 экзона, 2 интрона, 5'и 3' области. Обнаружено 35 полиморфных позиций, из которых 11 представлены единичными нуклеотидными заменами и 24 информативными сайтами (изменения встречающиеся в нескольких аллелях). Делеций и вставок не обнаружено, все отличия найдены только в пределах третьего экзона и во фланкирующем 3' районе 1560-1654 (рис. 9).

i 5

Рисунок 9. Полиморфные сайты в гене СНЫ 2 A.thaliana. Цифрами обозначены позиции полиморфных сайтов, по которым различаются расы; звездочками отмечены нуклеотиды, не отличающиеся от нуклеотидов расы Col.

Внутривидовое нукпеотидное разнообразие (Pi) для гена СНЫ 2 равно 0.00595, при этом уровень полиморфизма в экзонах и в 3'-области больше, чем в интронах (табл.5). Общий уровень полиморфизма гена СНЫ 2 не отличается от среднего (0,006) для 25 ранее исследованных генов A.thaliana (Koomneef et al., 2004), а уровень «молчащего» полиморфизма (Pi silent 0.01036, табл.5) не отличается от ранее определенного для 17 генов, контролирующих развитие растений (Shepard, 2007).

Таблица 5. Оценка уровня внутривидового полиморфизма в гене СНЫ2 A.thaliana

(Pi и Pi silent) и его отклонения от нейтральности (D, D*)

область полиморфизма общее параметры S Pi Pi silem D» D все последовательности n-19 35 0.00595 0.01036 -0.06786 NS -0.06635 NS последовательности гаплогруппы Dijoa 0^5 15 0.00447 0.00835 0.2031 NS 0.2031 NS последовательностм гаплогрупоы Columbia и*14 9 0.00103 0.00021 -1.81109 NS -1.52793 NS

5' область Pi 0 0 0

3' область Pi 0.01051 0.00833 0.00021

интроны Pi 0 0 0

ЭКЗОНЫ Pi 0.00664 0.00430 0.00136

Pi noa silenl 0.01948 0.01275 0.00048

Pi iileil 0.00265 0.00167 0.00163

S - количество полиморфных позиций; NS - статистически недостоверно

Позиция замены

8 8

tSl

I I I 8 ii

É í

I £ I líB

Col-M Gel-1 Eri-1 Co-1 Kl-M Bla-M Est-M Cvi-0 Wei-0 Sav-0 Pist-M lta-0 Arv1 Hi-0

TGGGTAAAAT T T TACT TGTAAGGGTGTGCTACAAA

А С <3 T

А С G T

А С 6

AC G T

А С <3 T

А А Я

A A A

AAA

A A A

С A T: С G

CAT С G

CATC •

OA; T С G T G

" G T G

Ws Kas-1 Dj-M En-M

G T С А С T G T С А С T G T С А С T

G G • G

В проанализированных последовательностях можно выделить две основные группы аллелей (условно обозначенные как гаплогруппы Dj и Col). Эти гаплогруппы различаются между собой 12 заменами (на рис.9 обозначены серым цветом). К гаплогруппе Col относятся как расы, имеющие консенсусную последовательность в гене CHLI2 (Col, Eri-1, Gel-], Со-1, К1-М, Bla-M, Est-M, Cvi-0, Wei-0 и Sav-0), так и расы с одиночными отличиями (Ita-0, Pet-M, An-1, Hi-0). Гаплогруппа Dj в свою очередь разделена на две подгруппы - расы Dj-M, En-M, Ler и расы Ws, Kas-1. Аллели подгруппы Ws и Kas-1 являются рекомбинантными и показывают сходство с гаплогруппой Col по полиморфным сайтам, расположенным в начале 3-го экзона. Аллель Dj-M является рекомбинантной в 3' области гена CHLI2.

Между гаплогруппами по гену CHLI2 и географической принадлежностью рас связи не обнаружено. В каждой гаплогруппе присутствуют аллели гена, характерные для рас из разных континентов. Эти данные согласуются с гипотезой, согласно которой A.thaliana является относительно молодым видом, быстро распространившимся по планете (King et al., 1993; Price et al., 1994).

Оценка по параметрам D и D* не выявила достоверных отклонений от нейтральной гипотезы эволюции (табл.5). В тоже время, результаты ее проверки на основе показателя ZnS (ZnS = 0.6168, Р<0.025) указывают на неслучайность ассоциации полиморфных сайтов в этом гене. О неслучайной ассоциации полиморфных сайтов свидетельствуют попарные сравнения последовательностей без учета сингатонов (SNP, которые встречаются только у одной расы) с использованием теста %2 (Kelly, 1997). Из общего числа (276) таких сравнений 85% (237 попарных сравнений) показали статистическую значимость ассоциации полиморфных сайтов (Р<0.05). Из этих данных следует, что наличие двух гаплогрупп по гену CHLI 2, по-видимому, является результатом действия балансирующего отбора, который обеспечивает поддержание определенных аллелей, контролирующих признаки, связанные с физиологической адаптацией к локальным условиям среды.

Выявленную картину внутригенного полиморфизма можно было бы объяснить проявлением сильной структурированности популяции. Однако, корреляции гаплогрупп с географической принадлежностью не обнаружено. В пользу этого предположения свидетельствуют результаты анализа полиморфизма внутри гаплогрупп. В гаплогруппе Col уровень нуклеотидного полиморфизма в 4-5 раз ниже, чем в гаплогруппе Dj и среди всей выборки аллелей. Отрицательные значения показателей D (-1.52793) и D*(-l.81109) указывают на некоторый, хотя и статистически недостоверный, избыток низкочастотного полиморфизма в гаплогруппе

Col (табл.5), что можно объяснить действием стабилизирующего отбора, устраняющего все несинонимичные замены. Для аллелей гаплогруппы Dj свидетельств действия стабилизирующего отбора не обнаружено (табл.5). Это может быть связано как с ограниченностью выборки аллелей и реализацией рекомбинационных событий, влияющих на отклонение от гипотезы, так и с тем, что давление отбора на аллели гаплогруппы Dj существенно ослаблено.

Анализ распределения нуклеогидных и аминокислотных замен показывает, что выявленные замены не затрагивают сигнальную последовательность, отвечающую за транслокацию полипептида в хлоропласт, а также функциональные домены Walker А, Walker В и Sensor I, которые участвуют в АТФ гидролизе/связывании. Известно, что при естественном и искусственном отборе может происходить накопление незначимых замен вокруг мишени действия естественного отбора (Tian et al., 2002).

Рисунок 10. Распределение показателя «молчащего» полиморфизма (Pis) по кодирующей последовательности гена СНЫ 2 A.thaliana. Серыми цифрами под структурой полипептида обозначено положение аминокислоты.

Большинство мутаций находится в 3' конце третьего экзона, кодирующего а-спирали 6-10 С-конца субъединицы I (рис.10). В этом участке с двумя значимыми заменами аминокислот (рис.9, в положениях 1216 п.н и 1236 п.н.) предполагается наличие домена, ответственного за межбелковые взаимодействия в Mg-хелатазном комплексе. Выявленная, при сравнении двух гаплогрупп, ассоциация полиморфных сайтов в районе 3-го экзона, кодирующем С-конец, вместе с данными о возможном избытке низкочастотного полиморфизма внутри гаплогруппы Col позволяет предполагать, что стабилизирующий отбор внутри гаплогруппы Col устраняет несинонимичные замены в районе 3-го экзона. Этот участок соответствует а-спирали С-концевого домена, предположительно участвующего в сборке кольца из CHLI субъединиц в функционирующем Mg-хелатазном комплексе.

Отметим, что гаплогруппы Dj и Col кодируют CHLI 2 белки, различающиеся 4 аминокислотами. Заменьг Ser/Ala, Glu/Gin, Asn/Ser (рис.9) могут приводить к изменению свойств белка. Согласно недавно полученным данным (Rissler et al., 2002; Kobayashi et al., 2008) белок CHLI 2 функционально активен, но может лишь частично восполнять функцию белка CHLI 1. По-видимому, ген СНЫ 2 играет в клетке второстепенную роль, что возможно обусловлено структурными различиями между белками CHLI 1 и CHLI 2 в С-концевой области, которая участвует в сборке гетерогексамера CHLI субъединиц Mg-хелатзного комплекса. Другое возможное объяснение обнаруженных различий может быть связано с изменениями в регуляции окислительно-восстановительного потенциала субъедитшпы I необходимого для АТФ гидролиза (Kobayashi et al., 2008). Проведенное нами исследование внутривидового полиморфизма, свидетельствует о действии стабилизирующего отбора на ген CHLI 2 и также указывает на функциональную значимость этого гена.

Как известно (Ohno, 1970), ослабление действия отбора на дуплицированные гены приводит либо к накоплению мутаций и превращение одной из копий в псевдоген, либо к приобретению новой или дополнительной функции. Дупликация гена, кодирующего субъединицу CHLD Mg-хелатзного комплекса, привела к псевдогенезации одной из копий. Псевдоген имеет 69% сходства с геном CHLD A.thaliana, но на белковом уровне составляет 78% гомологии с аминокислотной последовательностью табака (Swiss-Prot entry 024133). Ген CHLI 2 A.thaliana показывает 82% сходства с геном CHLI 1 и, предположительно, вовлечен в дальнейшие эволюционные преобразования. Аллели гаплогруппы Dj возможно находятся на пути к псевдогенезации. В то же время действие стабилизирующего отбора на гаплогруппу Col указывает на неофункционализацшо аллелей гена CHLI 2 этой гаплогруппы, связанную с появлением у кодируемого белка новых возможностей для взаимодействия с другими белковыми партнерами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Исследование мутантов, устойчивых к стрессовым факторам, позволяет идентифицировать гены, контролирующие адаптацию растений к неблагоприятным условиям внешней среды, действию гербицидов. На основе изучения мутантов ac¡5 и aci8, толерантных к ингибитору биосинтеза тетрапирролов ацифлюорфену, в данной работе изучены молекулярно-генетические механизмы, определяющие устойчивость к этому гербициду.

Впервые показано, что ген CHLI I/ACI5 (At4gl8480), кодирующий субъединицу CHLI Mg-хелатазного комплекса, контролирует устойчивость к ацифлюорфену.

Повышение устойчивости к гербициду связано с увеличением активности генов биосинтеза гсма у мутанта ac¡5, что приводит к увеличению потока токсичных порфиринов в сторону образования гема, а не хлорофилла. Иной механизм развития устойчивости обнаружен у мутанта aci8 (мутация находится в гене ATASE 2, кодирующем пнотамин фосфорибозил пирофосфат амидотрансферазу): полностью блокированная транскрипция гена CHLH вызывает образование белых пятен на листьях, а также обуславливает толерантность к ацифлюорфену за счет общего снижения уровня биосинтеза тетрапирролов.

Исследование гомологичных генов CHLI I и CULI 2 позволило определить, что CHLI 2 играет второстепенную роль в биосинтезе тетрапирролов. Это связано с различиями между CHLI 1 и CHLI 2 по структуре С-концевой области, которая может участвовать в сборке гстерогексамера CHLI субьединиц Mg-хелатзного комплекса или/и в регуляции редокс потенциала субъединицы CHLI, необходимого для АТФ гидролиза (Kobayashi et al., 2008). Результаты анализа полиморфизма, свидетельствуют о действии стабилизирующего отбора на ген CHLI 2 и согласуются с данными о функциональной значимости этого гена. Среди исследованных 19 рас выявлены две гаплогруппы (Dj и Col) гена CHLI 2. Аллели гаплогруппы Dj находятся на пути к псевдогенезации, а действие стабилизирующего отбора на гаплогруппу Col указывает на возможную неофункционализацию аллелей этой гаплогруппы. Эти данные свидетельствует о сложной эволюционной динамике генов CHLI 1 и CHLI 2.

Впервые показана связь системы биосинтеза пуринов de novo с устойчивостью к ацифлюорфену. Определение механизмов взаимодействия пути биосинтеза пуринов и биосинтеза тетрапирролов у мутанта aci8 представляется наиболее интересными для последующих исследований, т.к. конечные продукты АМФ и ГМФ являются элементами работы систем транспорта между хлоропластом и цитозолем. Можно предположить, что в этой системе задействованы пластидно-ядерный сигналинг (GUN и ABA гены) или/и дифференцированная регуляция поддержания пула глютамата/ глютамина в жилках листа и листовой пластинке (GOGAT и GDH). Недавно было показано, что белок GPRAT (глютаминфосфорибозилпирофосфат амидотрансфераза) является мишенью гербицида DAS 734, который блокирует биосинтез пуринов de novo (Walsh et al., 2007). Одновременный контроль геном ATASE 2 чувствительности к гербициду DAS 734 и фотодинамическому гербициду ацифлюорфену открывает новые возможности для создания форм растений с перекрестной устойчивостью к гербицидам с различными механизмами действия.

выводы.

1. На основе молекулярно-генетического картировании и позиционного выделения генов идентифицированы гены ACI5 и ACI8, контролирующие устойчивость к ингибитору биосинтеза тетрапироллов гербициду ацифлуорфену.

2. Изучены структурно-функциональные характеристики гена ACI5/CHLI 1, кодирующего 1-субъединицу Mg-хелатазы и его гомолога СНЫ2, локализованного в другой хромосоме.

3. Показано влияние мутации aci5 на уровень транскрипции генов синтеза тетрапирролов (GSA1, HemGl, HemG2), гема (FC 1 и FC 2), хлорофилла (СНЫ 1, CHLI2, CHLH, CHL27) и пластидно-ядерного сигналинга (GUN4).

4. На основе анализа нуклеотидной последовательности генов, мутационного анализа и изучения уровней транскрипции показано, что продукт гена CHL1 2 играет второстепенную роль в образовании Mg-хелатазы из-за изменений в С-концевой области белка.

5. Выяачена сложность структурно-функциональной эволюционной динамики генов СНЫ 1 и CHLI 2 и близость СНЫ 2 к предковой копии гена. Высказано предположение, что после дупликации предковой копии, ген СНЫ 2 имел большую функциональную нагрузку, чем ген СНЫ 1.

6. Показано влияние мутации aci8 на уровень транскрипции генов синтеза тетрапирролов (GSA 2, НетА1/НетА2, HemGl, HemG2), гема (FC 1 и FC 2) и хлорофилла (CHLH, CHLD, CHLI 1, СНЫ 2 и CHL27). Влияние мутации aci8 на уровень транскрипции генов синтеза тетрапирролов зависило от условий выращивания растений.

7. Установлено, что толерантность мутанта aci5 к ацифлюорфену обусловлена превалированием синтеза гема над синтезом хлорофилла в результате повышенной транехипции генов FC 1 и FC 2, у мутанта aci8 - блокированием синтеза хлорофилла на уровне функции гена CHLÏI.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Апчелимов А. А. "Влияние мутации aci5 на функционирование субъединицы I Mg-хелатазного комплекса Arabidopsis thaliana (L.) Heynh." // Международная конференция ВОГиС III "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития." Москва. 2004. Т. 1. С. 147.

2. Солдатова О.П., Апчелимов А. А. "Маркирование генома Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. мутациями индуцированными ЭМС" // Международная конференция ВОГиС III "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития." Москва. 2004. Т. 1. С.279.

3. Апчелимов А.А. "Генетическая модель функционирования Mg-хелатазного комплекса Arabidopsis thaliana (L.) Heynh." // Международная конференция молодых ученых "Ломоносов 2005". Москва. 2005. С. 12.

4. Апчелимов АЛ. "Генетическая модель функционирования Mg-хелатазного комплекса, основанная на исследовании мутантов aci5-l, aciS-2, aciS-3 Arabidopsis thaliana (I.) Heynh. " // Вестник Молодых Ученых. МГУ. 2005. Т. 2. С. 11-19.

5. Soldatova О., Apchelimov A. A., Radukina N., Ezhova Т., Shestakov S., Ziemann V., Hedtke В., Grimm В. "Resistant Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. mutant against protoporphyrinogen oxidase inhibitor acifluorfen shows regulatory change of tetrapyrrole biosynthesis." // Molecular Genetics & Genomics. 2005. V. 273. P. 311-318.

6. Apchelimov A. A., Soldatova O.P., Ezhova T.A., Grimm В., Shestakov S. V. The analysis of the Chll 1 and Chll 2 genes using acifuorfen-resistant mutant of Arabidopsis thaliana // Planta. 2007. V. 225. P. 935-943.

7. Ezhova T.A., Soldatova O.P., Apchelimov A.A., Novokreshenova M.G., Grimm В., Shestakov S. V. 'Identification and analysis of Arabidopsis thaliana genes involved in control of resistance to herbicides inhibiting biosynthesis of chlorophyll and carotenoids." Abstracts of III Belarus-German symposium "Biophysics of photosynthesis. Intracellular signaling and gene regulation in plants. Minsk. Belarus. 2007. P. 35-36.

8. Апчелимов A.A., Ежова T.A., Шестаков C.B. "Эволюционные аспекты внутривидового полиморфизма генов, кодирующих субъединицу I Mg-хелатазного комплекса Arabidopsis thaliana." // Молекулярная биология. 2009. Т. 43 (5).

БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю академику РАН С.В. Шестакову, научному консультанту профессору кафедры генетики доктору биологических наук Т.А. Ежовой и доценту кафедры кандидату биологических наук О.П. Солдатовой за всестороннюю поддержку, неоценимую помощь в работе. Благодарю кандидата биологических наук Пенина А. и кандидата биологических наук Логачеву М. за помощь, советы и идеи по теме работы.

Подписано в печать:

25.08.2009

Заказ № 2390 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Апчелимов, Алексей Андреевич

ВВЕДЕНИЕ 7 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Ведение

I. Биосинтез тетрапирролов у высших растений

1. Общие этапы

2. Биосинтез хлорофилла

3. Биосинтез гема

4. Внутриклеточная локализация ферментов

II. Регуляция биосинтеза тетрапирролов

1. Генетическая регуляция этапов от глутамата до ProtoIX

2. Генетическая регуляция этапов от ProtoIX до гема

3. Генетическая регуляция этапов от ProtoIX до хлорофилла

III. Фотодинамические гербициды

1. Формирование активных форм кислорода в результате ^ нормального функционирования фотосинтетического аппарата

2. Гербициды, повреждающее действие которых зависит от света

3. Ингибиторы протопорфириногеноксидазы

IV. Механизмы устойчивости к ацифлюорфену

1. Неспецифические механизмы устойчивости

2. Специфические механизмы устойчивости

V. Использование трансгенных растений с изменениями в пути ^ биосинтеза тетрапирролов в сельском хозяйстве

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Растительный материал и условия выращивания растений Условия выращивания Состав сред Квитко и MS Морфо-физиологический анализ

2. Виды и штамы бактерий и условия выращивания

Условия выращивания

Состав сред YEB, LB

3. Выделение нуклеиновых кислот Выделение ДНК

Выделение плазмидной ДНК Выделение РНК

Синтез первой цепи кДНК (обратная транскрипция)

Изучение транскрипции генов (ПЦР продуктов обратной транскрипции - ОТ-ПЦР)

Электрофорез в агарозном геле

ЭлюцияДНК из агарозного геля

4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ПЦР в реальном времени Праймеры

Условия проведения ПЦР и ПЦР-РВ Секвенирование

5. Генетическое картирование с использованием ДНК-маркеров

6. Клонирование ПЦР-продуктов и продуктов лигирования Получение компетентных клеток Е. coli и A. tumefaciens GV3101 Лигирование 58 Трансформация

Рестрикция

7. Определение содержания хлорофилла

8. Компьютерные методы анализа 62 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Морфологические и генетические особенности мутантов aci

1. Генетический анализ мутантов aci

2. Анализ нуклеотидной последовательности гена A CI5/CHLI1 у мутантов aci5-l, aci5-2 и aci5

3. Анализ производной аминокислотной последовательности белка, кодируемого геном СНЫ 1 у мутантов aci

4. Изучение фенотипических отличий мутанта aci5 от других мутантов по гену CHLI1 и анализ возможной роли гена CHLI2 в функционировании Mg-хелатазного комплекса

4.1 Анализ взаимодействия мутаций aci5 и cs

4.2 Анализ транскриптов аллелей гена CHLI 1 у белых растений cs/aci

5. Анализ производной аминокислотной последовательности белков, кодируемых генами СНЫ 1 и CHLI

6. Анализ полиморфизма генов CHLI 1 и CHLI

7. Создание конструкции для агробактериальной трансформации с геном CIILI1 на основе бинарной векторной системы pCAMBIAl 305.

7.1 Клонирование гена CHLI l(At4gl8480) в вектор pGEMu pCAMBIAl305.

7.2 Создание рекомбинантного гена CHLI 1/CHLI 2 на основе бинарной векторной системы рСАМВ1А1305.

8. Анализ молекулярно-генетических механизмов устойчивости к ацифлюорфену у мутанта aci5 II. Морфологические и генетические особенности мутанта aci

1. Морфо-физиологические особенности мутанта aci

2. Молекулярно-гепетическое картирование гена ACI

3. Анализ нуклеотидной последовательности гена ACI8/ATASE 2 у мутанта aci

4. Анализ производной аминокислотной последовательности белка, кодируемого tquouATASE 2 у мутантов aci

5. Анализ полиморфизма тъшАТАБЕ

6. Анализ молекулярно-генетических механизмов устойчивости к ацифлюорфену у мутанта aci8 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 151 ВЫВОДЫ 153 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

БЛАГОДАРНОСТИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация и молекулярно-генетический анализ генов Arabidopsis thaliana, контролирующих чувствительность к гербициду ацифлюорфену"

Биосинтез тетрапирролов является одним из центральных процессов у всех фотосинтезирующих организмов. Наиболее активно изучение генетического контроля этого процесса у растений в настоящее время проводится на модельном объекте Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. A.thaliana является классическим генетическим объектом, на котором проведено большинство работ по картированию и идентификации функции генов среди растений за последние десять лет. Это, прежде всего, связано с доступом к полногеномному сиквенсу и широким распространением методов in silico.

На сегодняшний день все этапы биосинтеза тетрапирролов детально исследованы, однако генетическая регуляция этого процесса изучена далеко не полностью. Для большинства фотосинтезирующих организмов гем, сирогем, фитохромобилин и хлорофилл — это конечные продукты пути биосинтеза тетрапирролов, локализованного в хлоропластах, митохондриях, микросомах и цитозоле (Beale, Weinstein, 1990; Tanaka, Tanaka, 2007). Общим предшественником синтеза гема и хлорофилла является протопорфирин IX. Образование гема, участвующего в процессах дыхания и детоксикации клетки, характерно не только для растительных, но и для животных клеток (Beale, Weinstein, 1990; Grimm, 1998). Порфирины способны генерировать синглетный кислород на свету, что ведет к фотоокислительному стрессу, блоку биосинтеза тетрапирролов и гибели растения. Поэтому исследование мутантов, устойчивых и чувствительных к гербицидам, способным ингибировать протопорфириногеноксидазу, может пролить свет как на молекулярно-генетические механизмы устойчивости к фотодинамическим гербицидам, например, ацифлюорфену, который широко применяется на практике, так и на генетические механизмы регуляции генов биосинтеза тетрапирролов.

Мутационный анализ является эффективным подходом для идентификации генов и изучения их функции. На кафедре генетики МГУ 7 получены мутанты, толерантные к ингибитору биосинтеза хлорофилла ацифлюорфену, характеризующиеся измененной окраской побега (Ежова и др., 2001).

Задачами работы являлись:

1. Морфо-физиологический анализ мутантов A thaliana aci5 и aci8.

2. Молекулярно-генетическое картирование и позиционное выделение генов ACI5 и ACI8.

3. Сравнительный анализ уровня транскрипции генов, контролирующих биосинтез тетрапирролов у мутантов aci5, aci8 и растений дикого типа расы Dijon, и изучение молекулярно-генетических механизмов толерантности мутантов к ацифлюорфену.

4. Изучение функциональных особенностей гена ACI5 и его гомолога с использованием данных по их внутри- и межвидовому полиморфизму.

Научная новизна. Впервые показано, что ген CHLI 1/ACI5 (At4gl8480), кодирующий субъединицу CHLI Mg-хелатазного комплекса, отвечает за устойчивость к ацифлюорфену. На основании анализа генной экспрессии установлено, что причиной устойчивости мутанта к ацифлюорфену является увеличение потока токсичных порфиринов в сторону образования гема за счет повышения уровня транскрипции генов биосинтеза гема - генов Fe-хелатазы FC1 и FC 2.

Установлено, что гомолог гена СНЫ 1/ACI5 - ген CHLI 2 (At5g45930) в геноме A.thaliana выполняет второстепенную функцию из-за нуклеотидных замен в 3'-терминальном конце гена, и не способен компенсировать утрату функции гена CHLI 1/ACI5 при формирования хлорофилла. Предполагается, что при формировании Mg-хелатазного комплекса белок CHLI 2 из-за измененной последовательности С-конца не может конкурировать с CHLI 1. Анализ внутривидового полиморфизма гена CHLI 2 выявил наличие двух гаплогрупп, одна из которых идет по пути псевдогенезации, а вторая находится под действием стабилизирующего отбора.

Показано, что ген ACI8 идентичен гену ATASE 2 (At4g34740), кодирующему глутаминфосфорибозилпирофосфат амидотрапсферазу, и таким образом впервые показано влияние биосинтеза пуринов de novo на устойчивость к ацифлюорфену.

Установлено, что устойчивость мутанта aci8 к ацифлюорфену связана со снижением уровня транскрипции гена CHLH, кодирующего лимитирующий фермент биосинтеза хлорофилла (субъединицу Н Mg-хелатазного комплекса).

Научно-практическая значимость работы. Изучение функциональных особенностей гомологичных генов A.thaliana CHLI 1 и CHLI 2 вносит вклад в создание комплексной имитационной модели синтеза тетрапирролов у высших растений. Изучение механизмов устойчивости растений A.thaliana к гербициду ацифлюорфену важно для создания трапсгенных растений с контролируемым путем биосинтеза хлорофиллов, гемов и фитохромобилинов, а также устойчивых к фотодинамическим гербицидам. Полученные сведения о нуклеотидных последовательностях нескольких природных рас отправлены в GenBank. Информация о CAPS маркерах aci8caps и aci8snp323, выявляющих полиморфизм между расами Dijon и Columbia, отправлена в базу данных TAIR.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Введение

Высшие растения синтезируют четыре класса тетрапирролов, а именно, хлорофилл, гем, сирогем, и фитохромобилин. Хлорофилл играет основную роль в фотосинтезе, абсорбируя свет и перемещая энергию света (электроны) к другим молекулам. Высшие растения имеют две разновидности хлорофилла, хлорофилл а и b (рис.1). Метальная группа в позиции С7 хлорофилла а заменена группой формила в хлорофилле Ь. Гем - другой закрытый макроцикл, который содержит железо, и играет также жизненноважную роль в различных биологических процессах, включая дыхание и фотосинтез. Подобный гему, сирогем также содержит железо в закрытом макроцикле. Он играет центральную роль (в составе редуктаз) в ассимиляции азота и серы. Фитохромобилин - это линейный тетрапиррол и хромофор фитохрома, который участвует в передачи сигнала к ядру.

Биосинтез тетрапирролов в растениях протекает в пластидах. Последние этапы биосинтеза гема возможно локализованы и в митохондриях. Биосинтетический путь тетрапирролов разветвлен, часть от глутамата до уропорфириногена является общей для всех четырех классов тетрапирролов в высших растениях. Три последующих реакции от уропорфириногена до протопорфирина IX являются общими для синтеза хлорофилла, гема, и фитохромобилина. Наконец, оставшиеся этапы уникальны для каждой ветви пути. Биосинтез тетрапирролов можно разделить на следующие уникальные ветви: ветвь сирогема, ветвь гема, которая включает биосинтез фитохромобилина, ветвь хлорофилла, и цикл взаимного преобразования хлорофилла а и b (рис.1). Цикл хлорофилла помещают в отдельную категорию, потому что этот цикл регулируется отличным механизмом от тех, которые управляют другими ветвями. Цикл хлорофилла имеет характерную особенность - часть его биосинтетического пути метаболизма (последние две реакции цикла) является также частью пути разложения хлорофилла (по Tanaka, Tanaka, 2007).

В покрытосемянных растениях сложность интеграции пути биосинтеза хлорофилла и его промежуточных продуктов потребовала многих лет идентификации генов, кодирующих ферменты пути биосинтеза тетрапирролов (Beale; 2005; Nagata et al., 2005). Информация, полученная в ходе этих исследований помогает изучать молекулярные структуры ферментов, а структурные модели в свою очередь, помогают детальному пониманию химии ферментов и пути их регуляции.

Все этапы биосинтеза тетрапирролов детально изучены. Показано, что общими предшественниками синтеза гема и хлорофилла являются порфирины, при чрезмерном накоплении которых происходит генерирование синглетного кислорода на свету, что ведет фотоокислительному стрессу (Beale, Weinstein, 1990; Grimm, 1998). Исследование мутантов устойчивых и чувствительных к ацифлюорфену, может помочь понять и использовать на практике молекулярно-генетические механизмы регуляции генов биосинтеза тетрапирролов для контроля устойчивости растений к фотодинамическим гербицидам.

I. Биосинтез тетрапирролов у высших растений

Для детального анализа механизмов устойчивости растений к фото динамическим гербицидам необходимо иметь представление об организации биосинтеза тетрапирролов, его регуляции и взаимодействии с другими клеточными процессами. Ниже представлен обзор биосинтеза тетрапирролов у высших растений, основные этапы которого контролируются ядерными генами.

1.1 Общие этапы

Общая часть пути биосинтеза разных тетрапирролов состоит из девяти ферментативных этапов. Фермент глутамил-тРНКсинтетаза (рис.1: 1) присоединяет молекулу глутаминовой кислоты к tPHKGIu, таким образом происходит активация карбоксильной группы. Для реакции необходимо присутствие АТФ и Mg2+. Затем глутамил-тРНК восстанавливается с помощью НАДФН глутамил-тРНКредуктазы (GluTR, рис.1: 2), продуктом этой реакции является глутамат-1-семиальдегид (GSA). Третий фермент этого пути, глутамат 1-семиальдегид-2,1-аминотрансфераза (GSA-AT, рис. 1: 3), которая осуществляет реакцию образования 5-аминолевулиновой кислоты. Межмолекулярные амино-обменные реакции преобразовывают GSA в 5-аминолевулиновую кислоту (ALA), эта реакция катализируется GSA-AT. ALA - универсальный предшественник биосинтеза тетрапирролов. GluTR и GSA-AT светозависимы и не активны в темноте. Растения, морские водоросли, и большинство бактерий, включая цианобактерии и археи синтезируют ALA из глутамата. Интересно, что структура ALA синтазы напоминает структуру GSA-AT. Так как предполагается, что GSA-AT является более древним ферментом, то возможно, ALA синтаза произошла от GSA-AT (Schulze et al., 2006). Из 5-ALA синтезируется порфобилиноген - первое пиррольное кольцо. Эту реакцию осуществляет фермент порфобилиногенсинтаза (рис.1: 4). Фермент гидроксиметилбилансинтаза (рис.1: 5) объединяет четыре молекулы порфобилиногена в тетрапиррольную цепь (Wettstein et al, 1995). Уропорфириноген-Ш-синтаза (рис.1: 6) сближает концы этой цепи, изомеризуя IV кольцо, которое разворачивается на 180°, при этом меняются местами ацетильный и пропильный радикалы, затем фермент замыкает кольцо, образуя циклическую тетрапиррольную структуру уропорфириногена III. Необходимо отметить, что уропорфириноген и большинство последующих промежуточных молекул пути метаболизма фоточуствительны и могут производить синглетный кислород. Уропорфириноген-Ш-декарбоксилаза (рис.1: 7) превращает все боковые ацетильные группы в метильные, при этом образуется копропорфириноген III. Кислород-зависимая копропорфириноген-Ш-декарбоксилаза окисляющая (СРОХ, рис.1: 8) превращает две пропионовые боковые

12 цепочки в I и II кольцах в винильные радикалы, что ведет к образованию протопорфириногена IX.

Капропорфириноген III Кобаламины (водоросли, э/бактерии)

Н Ветвь биосинтеза сирогема в)! t

Продолжение на следующей странице

Рисунок 1. Биосинтез тетрапирролов в высших растениях (по Beale, 1999 и Tanaka, Tanaka, 2007). Синими стрелками указаны пути биосинтеза, отсутствующие в высших растениях.

Ветвь биосинтеза хлорофилла Цикл хлорофилла

Протогеы Бипивэрдин fXa Фитохромобилмн

Гидроксиметил-хлорофиллид а

16) \

Дивинил Дивинил лротохлорофиплид а хлорофиллид а

Моиоэннил хлорофилл ид а

Хлорофилла

Гидроксимвтил хлорофилл а

Протопорфирии IX

Ветвь биосинтеза гема

Другие соединения гема Фикобилины водоросли.

Mg-npoTonop ин IX

Хлорофилл b 108)

ХлорофидлидЬ

Продолжение

В геноме A.thaliana существует гомолог бактериальной кислород-независимой СРОХ, однако, пока нет доказательств, что этот гомолог кодирует функциональную копропорфириноген-Ш-декарбоксилазу.

Далее в пути биосинтеза протопорфириноген IX-оксидаза (РРОХ) извлекает шесть электронов из протопорфириногена IX, чтобы сформировать протопорфирин IX (ProtoIX). Растительный тип РРОХ - это FAD содержащая оксидаза, молекулярный вес которой - приблизительно 55 kDa (Lermontova et al., 1997; Narita et aL, 1996). Этот тип РРОХ

14 упоминается часто как белок HemY, обнаруженный в Bacillus subtilis, дрожжах и животных. У Escherichia coli есть негомологичный ген, кодирующий РРОХ, названный HemG, молекулярный вес которого - 15kDa. У цианобакгерий предполагают новый тип РРОХ, так как никаких гомологов для генов HemY или HemG в геномах большинства исследованных цианобакгерий не обнаружено (Obornik, Green, 2005).

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Апчелимов, Алексей Андреевич

выводы.

1.Ha основе молекулярно-генетнческого картирования и позиционного выделения генов идентифицированы гены ACI5 и ACI8, контролирующие устойчивость к ингибитору биосинтеза тетрапирролов гербициду ацифлюорфену.

2. Изучены структурно-функциональные характеристики гена АС15/ СНЫ 1, кодирующего 1-субъединицу Mg-хелатазы и его гомолога СНЫ 2, локализованного в другой хромосоме.

3. Показано влияние мутации aci5 на уровень транскрипции генов синтеза тетрапирролов (GSA1, HemGl, HemG2), гема (FC 1 и FC 2), хлорофилла (CHLI 1, CHLI 2, CHLH, CHL27) и пластидно-ядерного сигналинга (GXJN4).

4. На основе анализа нуклеотидной последовательности генов, мутационного анализа и изучения уровней транскрипции показано, что продукт гена CLILI 2 играет второстепенную роль в образовании Mg-хелатазы из-за изменений в С-концевой области белка.

5. Выявлена сложность структурно-функциональной эволюционной динамики генов CHLI 1 и CHLI 2 и близость CHLI 2 к предковой копии гена. Высказано предположение, что после дупликации предковой копии, ген CHLI 2 имел большую функциональную нагрузку, чем ген CHLI 1.

6. Показано влияние мутации aci8 на уровень транскрипции генов синтеза тетрапирролов (GSA 2, НетА1/НетА2, HemGl, HemG2), гема (FC 1 и FC 2) к хлорофилла (CHLH, CHLD, CHLI 1, CHLI 2 и CHL27). Влияние мутации асг8 па уровень транскрипции генов синтеза тетрапирролов зависело от условий выращивания растений.

7. Установлено, что толерантность мутанта aci5 к ацифлюорфену обусловлена превалированием синтеза гема над синтезом хлорофилла в результате повышенной транскрипции генов FC 1 и FC 2, у мутанта aci8 - блокированием синтеза хлорофилла на уровне функции гена CHLH.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Апчелшюв А. А. "Влияние мутации aci5 на функционирование субъединицы I Mg-хелатазного комплекса Arabidopsis thaliana (L.) Heynh." // Международная конференция ВОГиС III "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития." Москва. 2004. Т. 1. С. 147.

2. Солдатова О.П., Апчелшюв А. А. "Маркирование генома Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. мутациями индуцированными ЭМС" // Международная конференция ВОГиС III "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития." Москва. 2004. Т. 1. С.279.

3. Апчелшюв А.А. "Генетическая модель функционирования Mg-хелатазного комплекса Arabidopsis thaliana (L.) Heynh." // Международная конференция молодых ученых "Ломоносов 2005". Москва. 2005. С. 12.

4. Апчелшюв А.А. "Генетическая модель функционирования Mg-хелатазного комплекса, основанная на исследовании мутантов aci5-l, aci5-2, aci5-3 Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. " // Вестник Молодых Ученых. МГУ. 2005. Т. 2. С. 11-19.

5. Soldatova О., Apchelimov A. A., Radukina N., Ezhova Т., Shestakov S., Ziemann К, Hedtke В., Grimm В. "Resistant Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. mutant against protoporphyrinogen oxidase inhibitor acifluorfen shows regulatory change of tetrapyrrole biosynthesis. " // Molecular Genetics & Genomics. 2005. V. 273. P. 311-318.

6. Apchelimov A. A., Soldatova O.R, Ezhova T.A., Grimm В., Shestakov S. V. The analysis of the Chll 1 and Chll 2 genes using acifuorfen-resistant mutant of Arabidopsis thaliana//Planta. 2007. V. 225. P. 935-943.

7. Ezhova T.A., Soldatova O.R, Apchelimov A.A., Novokreshenova M.G., Grimm В., Shestakov S.V. 'Identification and analysis of Arabidopsis thaliana genes involved in control of resistance to herbicides inhibiting biosynthesis of chlorophyll and carotenoids." Abstracts of III Belarus-German symposium "Biophysics of photosynthesis. Intracellular signaling and gene regulation in plants. Minsk. Belarus. 2007. P. 35-36.

8. Апчелимов А.А., Ежова Т.А., Щестаков С.В. "Эволюционные аспекты внутривидового полиморфизма генов, кодирующих субъединицу I Mg-хелатазного комплекса Arabidopsis thaliana.'''' И Молекулярная биология. 2009. Т. 43 (5).

9. Апчелимов А. А., Солдатова О.П. "Ген ATASE 2 контролирует устойчивость растений Arabidopsis thaliana к гербициду ацифлюорфену" // Международная конференция ВОГиС V. Москва. 2009. Т. 1. С.178.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю профессору МГУ и академику РАН С.В. Шестакову. Автор выражает глубокую благодарность научному консультанту доценту кафедры генетики доктору биологических наук Ежовой Татьяне Анатольевне и доценту кафедры генетики кандидату биологических наук Солдатовой Ольге Павловне за всестороннюю поддержку, неоценимую помощь в работе. Благодарю кандидата биологических наук Пенина Алексея и кандидата биологических наук Логачеву Марию за помощь, советы и идеи по теме работы.

Так же автор благодарит всех сотрудников и аспирантов лаборатории генетики Arabidopsis thaliana за помощь и интерес к данной работе.

Отдельная благодарность рецензентам и оппонентам данной работы кандидату биологических наук Коновалову Федору Андреевичу и доктору биологических наук Кокшаровой Ольге Алексеевне за внимательное прочтение и конструктивное обсуждение проблематики поставленных задач и полученных результатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование мутантов, устойчивых к стрессовым факторам, позволяет идентифицировать гены, контролирующие адаптацию растений к неблагоприятным условиям внешней среды и действию гербицидов. В представленной работе на основе изучения мутантов aci5 и aci8, толерантных к ингибитору биосинтеза тетрапирролов ацифлюорфену, а также мутантов cs и cial-2 были изучены молекулярно-генетические механизмы, определяющие устойчивость к этому гербициду.

Было впервые показано, что ген СНЫ 1/ACI5 (At4gl8480), кодирующий субъединицу CHLI Mg-хелатазного комплекса, контролирует устойчивость к ацифлюорфену. Устойчивость к гербициду связана с увеличением активности генов биосинтеза гема у мутанта aci5, что приводит к увеличению потока токсичных порфиринов в сторону образования гема, а не хлорофилла. Иной механизм развития устойчивости обнаружен у мутанта aci8, у которого полностью блокированная транскрипция гена CHLH (одна из субъединиц Mg-хелатазного комплекса). Это вызывает образование белых пятен на листьях мутанта, а также обуславливает толерантность к ацифлюорфену за счет общего снижения уровня биосинтеза тетрапирролов. Механизмы контроля уровня транскрипции генов биосинтеза тетрапирролов требуют дополнительных исследований и в будущем позволят создавать трансгенные растения с управляемой степенью устойчивости к фотодинамическим гербицидам. Определение механизмов взаимодействия пути биосинтеза пуринов и биосинтеза тетрапирролов у мутанта aci8 представляется наиболее интересными для последующих исследований, т.к. одновременный контроль геном ATASE 2 чувствительности к гербициду DAS 734 и фотодинамическому гербициду ацифлюорфену открывает возможности для создания форм растений с перекрестной устойчивостью к гербицидам с различными механизмами действия.

Исследование гомологичных генов СНЫ 1, СНЫ 2 и генов ATASE 1, ATASE 2, ATASE 3 позволило определить некоторые аспекты функционирования Mg-хелатазного комплекса и эволюционные преобразования последовательностей этих генов. Показано, что CHLI 2 играет второстепенную роль в биосинтезе тетрапирролов. Это связано с отличиями CHLI 2 от CHLI по структуре С-концевой области, которая может участвовать в сборке гетерогексамера CHLI субъединиц Mg-хелатазного комплекса или/и в регуляции редокс потенциала субъединицы CHLI, необходимого для АТФ гидролиза (Kobayashi et al, 2008).

Результаты анализа полиморфизма, свидетельствуют о действии стабилизирующего отбора на ген CHLI 2 и согласуются с данными о функциональной значимости этого гена. Среди исследоваиных 19 рас выявлены две гаплогруппы (Dj и Col) гена CHLI 2. Аллели гаплогруппы Dj находятся на пути к псевдогенезации, а действие стабилизирующего отбора на гаплогруппу Col указывает на возможную неофупкциолизацию аллелей этой гаплогруппы. Эти данные свидетельствует о сложной эволюционной динамике генов CHLI 1 и CHLI2.

Результаты анализа полиморфизма генов ATASE 1, ATASE 2 и ATASE 3, свидетельствуют о действии стабилизирующего отбора на ген ATASE 2, и ослабленного отбора не гены ATASE 1 и ATASE 3. Полученные сведения о нуклеотидных последовательностях мутантов и 18 природных рас отправлены в GenBank.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Апчелимов, Алексей Андреевич, Москва

1.верина Н.Г. Механизмы регуляции и внутрипластидная локализация биосинтеза хлорофилла//Биол. мембраны. 1998. Т. 15(5). С. 504-516.

2. Гольдфельд М.Г., Карапетян Н.В. Физико-химические основы действия гербицидов. М.:ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Сер. Биологическая химия. Т.30. 1989.

3. Ъ.Ежова Т.А., Гостимский С.А. Современные методы селекции высших растений на устойчивость к гербицидам // Сельскохозяйственная биология. 1989. (1). С. 25-35.

4. Ежова Т.А., Лебедева О.В., Огаркова О.А., Ленин А.А., Солдатова О.П., Шестаков С.В. Arabidopsis thaliana модельный объект генетики растений // Макс Пресс. 2003.

5. Ежова Т.А., Солдатова О.П., Мамаиова Л.Б., Мусин С.М., Гримм Б., Шестаков С.В. Коллекция мутантов Arabidopsis thaliana с измененной чувствительностью к индукторам окислительного стресса // Известия РАН. 2001(5). С. 533-543.

6. Елисеев А. А. Регуляция биосинтеза тетрапирролов и изопреноидов интегральными мембранными рецепторами семейства МБР/TspO // Успехи биологической химии. 2003. Т. 43. С. 329-364.

7. Квитко КВ. Асептическая культура Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. и перспективы ее использования в ботанических исследованиях // Вестник ЛГУ. 1960. Т. 15(3). серия биол. С. 47-56.

8. Красновский А.А. Преобразование солнечной энергии при фотосинтезе: проблемы и перспективы // Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И.Менделеева. 1986. Т. 31(6). С. 482-488.

9. Красновский А. А. мл. и Неверов К. В. Образование триплетных молекул хлорофилла и его предшественников в обработанных 5-аминолевунолевой кислотой листьях растений // Доклады Академии Наук СССР 302(1) 252-255 1988.

10. Heeepoe К.В., Шалыго Н.В., Аверина Н.Г. и Красновский А.А. мл. Образование триплетного состояния пигментов в зеленых листьях растений, обработанных хелаторами металлов // Физиология растений . 1996. Т. 43(1). С. 62-72.

11. Alawady А.Е., Grimm В. Tobacco Mg protoporphyrin IX methyltransferase is involved in inverse activation of Mg porphyrin and protoheme synthesis. // Plant J. 2005. V. 41. P. 282-290.

12. Atkins C., Smith R, Storer P. Reexamination of the intracellular localization of de novo purine synthesis in cowpea nodules // Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 127-135.

13. Bardot V, Dutrillaux A. M., Delattre J. Y., Vega F., Poisson M., Dutrillaux В., Luccioni C. Purine and pyrimidine metabolism in human gliomas: relation to chromosomal aberrations // Br. J. Cancer. 1994. V. 70. P. 212-218.

14. Bartosz M., Kedziora J., Bartosz G. Antioxidant and prooxidant properties of captopril and enalapril.// Free Radic. Biol. Med. 1997. V. 23(5). P.729-735.

15. В era A.K., Chen S„ Smith J.L., Zalkin H. Interdomain signaling in glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase // J. Biol. Chem. 1999. V. 274(51). P. 36498-36504.

16. Boger P., Sandmann G. Target assays for modern herbicides and related phytotoxic compounds // Lewis Publ. Boca Raton. FL. USA. 1993.

17. Boland M.J., Schubert K.R. Biosynthesis of purines by a proplastid fractionfrom soybean nodules //Arch. Biochem. Biophys. 1983. V. 220(1). P. 179-187.

18. Boldt R., Zrenner R. Purine and pyrimidine biosynthesis in higher plants // Physiol. Plant. 2003. V. 117(3). P. 297-304.

19. Bollivar D.W., Suzuki J.K., Beatty J.T., Dobrowolski J.M. and Bauer C.E. Directed mutational analysis of bacteriochlorophyll a biosynthesis in Rhodobacter capsulatus II J. Mol. Biol. 1994b. V. 237. P. 622-640.

20. Bougri O., Grimm B. Members of a low-copy number gene family encoding glutamyl-tRNA reductase are differentially expressed in barley // Plant J. 1996. V. 9. P. 867-878.

21. Buchanan B.B., Balmer Y. Redox regulation: a broadening horizon // Annu. Rev. Plant. Biol. 2005. V. 56. P. 187-220.

22. Camadro J.M., Matringe M., Scalla R., Labbe P. Target Assays for Modern Herbicides and Related Phytotoxic Compounds // eds Boger P., Sandmann G. CRC/Lewis. P. 29-34. 1993.

23. Caspar Т., Lin T.P., Kakefuda G., Benbow L., Preiss J., Somerville C. Mutants of Arabidopsis with Altered Regulation of Starch Degradation // Plant Physiol. 1991. V. 95(4). P. 1181-1188.

24. Combet C., Jambon M., Deleage G., Geourjon C. Geno3D: automatic comparative molecular modelling of protein // Bioinformatics. 2002. V. 18(1). P. 213-214.

25. AO.Coomber S.A., Chaudri M., Connor A., Britton G., Hunter C.N. Localised transposon Tn5 mutagenesis of the photosynthetic gene cluster of Rhodobacter sphaeroides И Mol. Microbiol. 1990. V. 4. P. 977-989.

26. Cornah J.E., Terry M.J., Smith A.G. Green or red: what stops the traffic in the tetrapyrrole pathway? // Trends Plant Sci. 2003. V. 8(5). P. 224-230.

27. Ab.Dailey H.A. Enzymes of heme biosynthesis // J Biol. Inorg. Chem. 1997. V. 2. P. 411-417.

28. Davison PA., Schubert H.L., ReidJ.D., Iorg C.D., Heroux A., Hill C.P., Hunter C.N. Structural and biochemical characterization of Gun4 suggests a mechanism for its role in chlorophyll biosynthesis // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 7603-7612.

29. Eckhardt U., Grimm В., Hortensteiner S. Recent advances in chlorophyll biosynthesis and breakdown in higher plants // Plant Mol. Biol. 2004. V. 56. P. 1-14.

30. Emanuelsson O., Nielsen IT., von Heijne G. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites //

31. Protein Sci. 1999. V. 8(5). P. 978-984.

32. Fields S., Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions //Nature. 1989340. P. 245-246.

33. Forsthoefel N. R., Yewen W., Schulz В., Bennett M.J., Feldman K.A. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: prospects and perspectives // Aust. J. Plant Physiology. 1992. V. 19. P. 353-366.

34. Foyer C., Rowell J., Walker D. The effect of sucrose on the rate of de novo sucrose biosynthesis in leaf protoplasts from spinach, wheat and barley // Arch Biochem Biophys. 1983. V. 220(1). P. 232-238.

35. SA.Frommel C. The apolar surface area of amino acids and its empirical correlation with hydrophobic free energy // J. Theor. Biol. 1984. V.lll. P. 247-260.

36. Fu Y.-X., Li W.-H. Statistical tests of neutrality of mutations // Genetics. 1993. V. 133. P. 693-709.

37. Gadjieva R., Axelsson E., Olsson U., Hansson M. Analysis of gun phenotype in barley magnesium chelatase and Mg-protoporphyrin IX monomethyl ester cyclase mutants // Plant Physiol. Biochem. 2005. V. 43. P. 901-908.

38. Gibson L.C.D., Jensen P.E., Hunter C.N. Magnesium chelatase from Rhodobacter sphaeroides: Initial characterization of the enzyme using purified subunits and evidence for a Bchl-BchD complex // Biochem. J. 1999. V. 337. P. 243-251.

39. Gibson L. C. D., Marrison J. L., Leech R. M., Jensen P. E., Bassham D. C., Gibson M., and Hunter C. N. A putative Mg chelatase subunit from Arabidopsis thaliana cv C24 // Plant Physiol. 1996. V. 11. P. 161-171.

40. Gorchein A. Magnesium protoporphyrin chelatase activity in Rhodopseudomonas spheroides. Studies with whole cells //Biochem. J. 1972. V. 127. P. 97-106.

41. Grimm B. Novel insights in the control of tetrapyrrole metabolism of higher plans // Current Opinion in Plant Biology. 1998. V. 1. P. 245-250.

42. Grimm B. The metabolic pathway of tetrapyrrole biosynthesis. Peroxidizing herbicides '// Peter Boger, Ко Wakabayashi. Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 1999.

43. Guex N. Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling // Electrophoresis. 1997 V. 18(15). P. 2714-2723.

44. Henningsen K. W. , Boynton J. E. & von Wettstein D. Mutants at xantha and albina loci in relation to chloroplast biogenesis in barley (Hordeum vulgare L.) // Dan. Acad. Sci. Lett. Biol. Skr. 1993. V. 42. P. 1-349.

45. Higgins D.G., Thompson J.D., Gibson T.J. Using Clustal for multiple sequence alignments // Methods Enzymol. 1996. V. 266. P. 383-402.

46. Hudson A., Carpenter R., Doyle S., Coen E.S. Olive: a key gene required for chlorophyll biosynthesis in Antirrhinum majus II EMBO J. 1993. V. 12. P. 3711-3719.

47. Hung W.F., Chen L.J., Boldt R., Sun C.W., Li H.M. Characterization of Arabidopsis glutamine phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferasedeficient mutants // Plant Physiol. 2004. V. 135(3). P. 1314-1323.

48. I(o Т., Shiraishi H., OkadaK., Shimura Y. Two amidophosphoribosyltransferase genes of Arabidopsis thaliana expressed in different organs 11 Plant Mol. Biol. 1994. V. 26(l):529-33.

49. Jensen P.E., Willows R.D., Petersen B.L., Vothnecht U.C., Stummann B.M., Kannangara C.G., von Wettstein D., Henningsen K.W. Genes for Mg chelatase subunits in barley: Xantha-f, -g and -h I I Mol. Gen. Genet. 1996c. V. 250. P. 383-394.

50. Jordan P.M. Highlights in heme biosynthesis // Curr. Opin. Struct. Biol. 1994. V. 4. P. 902-911.

51. Kelly J.К A test of neutrality based on interlocus associations // Genetics. 1997. V. 146. P. 1197-1206.

52. Kliebenstein D.J., Monde R.A., Last R.L. Superoxide dismutase in Arabidopsis: an eclectic enzyme family with disparate regulation and protein localization // Plant Physiol. 1998. V. 118(2). P.637-650.

53. Kobayashi K., Mochizuki N., Yoshimura N., Motohashi K., Hisaboric Т., Masuda T. Functional analysis of Arabidopsis thaliana isoforms of the Mg-chelatase CHLI subunit // Photochem. Photobiol. Sci. 2008. V. 7. P. 1188— 1195.

54. Koncz C., Mayerhofer R., Koncz-Kalman Z, Nawrath C., Reiss В., Redei G.R, Schell J. Isolation of a gene encoding a novel chloroplast protein by T-DNA tagging in Arabidopsis thaliana II EMBO J. 1990. V. 9. P. 1337-1346.

55. Koornneef M., Alonso-Blanco C., Vreugdenhil D. Naturally occurring genetic variation in Arabidopsis thaliana //Annu. Rev. Plant Biol. 2004. V. 55. P. 141172.

56. Krahn J.M., Kim J.H., Burns M.R., Parry R.J., Zalkin H„ Smith J.L. Coupled formation of an amidotransferase interdomain ammonia channel and a phosphoribosyltransferase active site // Biochemistry. 1997. V. 36(37). P. 11061-11068.

57. Kropat J., Oster U., Rudiger IV., Beck C.F. Chlorophyll precursors are signals of chloroplast origin involved in light induction of nuclear heat-shock genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997. V. 94. P. 14168-14172.

58. Lake V., Olsson U., Willows R.D. and Hansson M. ATPase activity of magnesium chelatase subunit I is required to maintain subunit D in vivo II Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 2182-2188.

59. Larkin R. M., Alonso J. M., Ecker J.R., Chory J. GUN4, a regulator of chlorophyll synthesis and intracellular signaling // Science. 2003. V.299 P. 902-906.

60. Lee H.J., Ball M.D., Parham R. and Rebeiz C.A. Chloroplast biogenesis 65: Enzymic conversion of protoporphyrin IX to Mg-protoporphyrin IX in a subplastidic membrane fraction of cucumber etiochloroplasts // Plant Physiol. 1992. V. 99. P. 1134-1140.

61. Lenzen C.U., Steinmann D., Whiteheart S.W. & Weis W.I. Crystal structure of the hexamerization domain of N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein // Cell 1998. V. 94. 525-536.

62. Lermontova I., Kruse E., Mock H.P., Grimm B. Cloning and characterization of a plastidal and a mitochondrial isoform of tobacco protoporphyrinogen IX oxidase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 8895-8900.

63. Lermontova I., Grimm B. Overexpression of plastidic protoporphyrinogen IX oxidase leads to resistance to the diphenyl-ether herbicide acifluorfen // Plant Physiol. 2000. V. 122. P. 75- 83.

64. Luo M., Weinstien J.D. and Walker C.J. Magnesium chelatase subunit D from pea: characterization of the cDNA, heterologous expression of an enzymatically active protein and immunoassay of the native protein // Plant Mol. Biol. 1999. V. 41. P. 721-731.

65. Madamanchi N.R., Alscher R.G. Metabolic Bases for Differences in Sensitivity of Two Pea Cultivars to Sulfur Dioxide // Plant Physiol. 1991. V. 97(1). P. 88-93.

66. Marrs B. Mobilization of the genes for photosynthesis from Rhodopseudomonas capsulata by a promiscuous plasmid // J. Bacterial. 1981. V. 146. P. 1003-1012.

67. Matsunaka S. History and yearly investigatioin of mode of action of peroxidazing herbicides // Peroxidazing Herbicides. Peter Boer, Ко Wakabayashi, Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 1999.

68. McCormac A.C., Fischer A., Kumar A.M., Soil D., Terry M.J. Regulation of HE MAI expression by phytochrome and a plastid signal during de-etiolation in Arabidopsis thaliana II Plant J. 2001. V. 25. P. 549-561.

69. McCormac A.C., Terry M.J. Light-signalling pathways leading to the coordinated expression of HE MAI and Lhcb during chloroplast development in Arabidopsis thaliana 11 Plant J. 2002. V. 32. P. 549-559.

70. Meskauskiene R., Nater M., Goslings D., Kessler F., Op den Camp R., Apel К FLU: A negative regulator of chlorophyll biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 12826-12831.

71. Messenger L.J., Zalkin H. Glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase from Escherichia coli. Purification and properties // J. Biol . Chem. 1979. V. 254(9). P. 3382-3392.

72. Moffat B.A., McWhinne E.A., Agarwhal S.K., Schaff D.A. The adenine169phosphoribosyltransferaseencoding gene of Arabidopsis thaliana // Gene. 1994. V. 143. P. 211-216.

73. Moser J., Schubert W.D., Beier V., Bringemeier I., Jahn D., Heinz D.W. V-shaped structure of glutamyl-tRNA reductase, the first enzyme of tRNA-dependent tetrapyrrole biosynthesis // EMBO J. 2001. V. 20. P. 6583-6590.

74. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth bioassays with tobacco culture // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

75. Nagata N., Tanaka R., Satoh S., Tanaka A. Identification of a vinyl reductase gene for chlorophyll synthesis in Arabidopsis thaliana and implications for the evolution of Prochlorococcus species // Plant Cell. 2005. V. 17. 233-240.

76. Nakayama M., Masuda Т., Sato N. Yamagata H., Bowler C., Ohta H., Shioi Y., and Takamiya K. Cloning, subcellular localization and expression of Chll, a subunit of magnesium-chelatase in soybean // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. V. 215. P. 422-428.

77. Narita S., Tanaka R., Ito Т., Okada K., Taketani S., Inokuchi H. Molecular cloning and characterization of a cDNA that encodes protoporphyrinogen oxidase of Arabidopsis thaliana II Gene. 1996. V. 182. P. 169-175.

78. Natsumeda, Y., Prajda, N., Donohue, J. P., Glover, J. L., Weber, G. Enzymic capacities of purine de Novo and salvage pathways for nucleotide synthesis in normal and neoplastic tissues // Cancer Res. 1984. V. 44. P. 2475-2479.

79. А^ег M. Molecular Evolutionary Genetics // Columbia Univ. Press. 1987. New1701. York. P. 512.

80. Niittyla Т., Messerli G., Trevisan M., Chen J., Smith A.M., Zeeman S.C. A previously unknown maltose transporter essential for starch degradation in leaves // Science. 2004. V. 303(5654). P. 87-89.

81. Nogaj L.A., Srivastava A., van Lis R., Beale S.I. Cellular levels of glutamyl-tRNA reductase and glutamate-l-semialdehyde aminotransferase do not control chlorophyll synthesis in Chlamydomonas reinhardtii II Plant Physiol. 2005. V. 139. P. 389-396.

82. Obornik M., Green B.R. Mosaic origin of the heme biosynthesis pathway in photosynthetic eukaryotes // Mol. Biol. Evol. 2005. V. 22. P. 2343-2353.

83. Ogura T. & Wilkinson A. J. AAA+ superfamily ATPases: common structure diverse function // Genes Cells. 2001. V. 6. P. 575-597.

84. Ohno S. Evolution by Gene Duplication// Springer-Verlag. New York. 1970. P. 160

85. Orr G.L., Hess F.D. Mechanism of Action of the Diphenyl Ether Herbicide Acifluorfen-Methyl in Excised Cucumber (Cucumis sativus L.) Cotyledons : LIGHT ACTIVATION AND THE SUBSEQUENT FORMATION OF

86. A9.Page R.D.M. TreeView: An application to display phylogenetic trees on personal computers // Computer Applications in the Biosciences. 1996 V. 12(4). P. 357-358.

87. Papenbrock J., Mock H.P., Tanaka R., Kruse E. and Grimm B. Role of magnesium chelatase activity in the early steps of the tetrapyrrole biosynthetic pathway//Plant Physiol. 2000. V. 122. P. 1161-1169.

88. Price R.A., Palmer J.D., Al-Shehbaz I.A. Systematic relationships of Arabidopsis: a molecular and morphological perspective. In: Arabidopsis // eds. Meyerowitz E.M., Somervile C.R. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 1994. P. 7-20.

89. Reid J. D„ Siebert C. A., Bullough Per A. and Hunter C. N. The ATPase activity of the Chll subunit of magnesium chelatase and formation of a heptameric AAA+ ring // Biochemistry 2003. V. 42. P. 6912-6920.

90. Reid J.D., Hunter C.N. Magnesium-dependent ATPase activity and cooperativity of magnesium chelatase from Synechocystis sp. PCC6803. J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 26893-26899.

91. Rouiller I., Butel KM, Latterich M., Milligan R.A., Wilson-Kubalek E.M. The major conformational change in the p97 membrane fusion associated AAA ATPase occurs with ATP binding // Mol. Cell. 2000. V. 6. P. 1485-1490.

92. Rowe P.B., McEwen S.E. De novo purine synthesis in cultured rat embryos undergoing organogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80(23). P. 7333-7336.

93. Rozas J., Sanchez-DelBarrio J.C., MesseguerX. DnaSP, DNApolymorphism analyses by the coalescent and other methods // Bioinformatics. 2003. V. 19. P. 2496-2497.

94. Runge S., Sperling U., Frick G., Apel K., Armstrong G.A. Distinct roles for light-dependent NADPH: protochlorophyllide oxidoreductases (POR) A and В during greening in higher plants. Plant J. 1996. V. 9. P. 513-523.

95. Salin M.L. Toxic oxygen species and protective systems of the chloroplast // Physiol Plant. 1988. V. 72. P. 681-689.

96. Santana M.A., Tan F.C., Smith A.G. Molecular characterization of coproporphyrinogen oxidase from Glycine max and Arabidopsis thaliana II Plant Physiol. Biochem. 2002. V. 40. P. 289-298.

97. Yll.Schulze J.O., Schubert W.D., Moser J., Jahn D., Heinz D.W. Evolutionary relationship between initial enzymes of tetrapyrrole biosynthesis // J. Mol. Biol. 2006. V. 358. P. 1212-1220.

98. Shelp B.J., Atkins C.A., Storer P.J., Canvin D.T. Cellular and subcellular organization of pathways of ammonia assimilation and ureide synthesis in nodules of cowpea (Vigna unguiculata L.Walp) // Arch. Biochem. Biophys. 1983. V. 224. P. 429-441.

99. HA.Shen Y.Y., Wang X.F., Wu F.Q., Du S.Y., Cao Z., Shang Y., WangX., Peng C., Yu X.C., Zhu S.Y., Fan R.C., Xu Y.H., Zhang D.P. The Mg-chelatase H subunit is an abscisic acid receptor. Nature. 2006. V. 443. P. 823-826.

100. ShepardK.A. The molecular population genetics of shoot development in Arabidopsis thaliana I I Genetica. 2007. V. 129. P. 19-36.

101. Shepherd M., McLean S., Hunter C.N. Kinetic basis for linking the first two enzymes of chlorophyll biosynthesis // FEBS J. 2005. V. 272. P. 4532-4539.

102. Smith J.L., Zaluzec E.J., Wery J.-P, Niu L., Switzer R.L., Zalkin H., Satow Y. Structure of the allosteric regulatory enzyme of purine biosynthesis // Science. 1994. V. 264. P. 1427-1433.

103. O.Smith A.G., Marsh O., Elder G.H. Investigation of the subcellular location of the tetrapyrrole-biosynthesis enzyme coproporphyrinogen oxidase in higherplants // Biochem. J. 1993. V. 292. P. 503-508.

104. Smith J.L. Self-processing cysteine-dependent N-terminal nucleophile hydrolases // In Barrett A., Rawlings N., Woessner J. eds Handbook of Proteolytic Enzymes. Ed 2. Academic Press. 2004. New York. P. 2049-2052.

105. Smith P.M., Atkins C.A. Purine biosynthesis. Big in cell division, even bigger in nitrogen assimilation // Plant Physiol. 2002. V. 128(3). P. 793-802.

106. Song H.K., Hartmann C., Ramachandran R., Bochtler M., Behrendt R., Moroder L. & Huber R. Mutational studies on HslU and its docking mode with HslV // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. V. 97. P. 14103-14108.

107. Stephenson P.G., Terry M.J. Light signalling pathways regulating the Mg-chelatase branchpoint of chlorophyll synthesis during de-etiolation in Arabidopsis thaliana II Photochem. Photobiol. Sci. 2008. V.7(10). P. 1243-1252.

108. Stich K., Ebermann R. Peroxidase- und Polyphenoloxidaseisoenzyme im Splint- und Kemholz der Eiche // Holzforschung. 1984. V. 38. P. 239-242.

109. Sugiura M., Takeda Y. Nucleic acids // In Buchanan В., Gruissem W., Jones R. eds. Biochemistry and Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Biologists. 2000. Rockville. MD. P. 262.

110. Surpin M, Larkin R. M. and Chory J. Signal transduction between the chloroplast and the nucleus // The Plant Cell 2002. P. 327-338.

111. Susek R.E., Ausubel F.M., Chory J. Signal transduction mutants of

112. Arabidopsis uncouple nuclear CAB and RBCS gene expression from chloroplast development // Cell. 1993. V. 74. P. 787-799.

113. Susek R.E., Chory J. A tale of two genomes: role of a chloroplast signal in coordinating nuclear and plastid gene expression // Aust. J. Plant Physiol. 1992. V. 19. P. 387-399.

114. Swofford D.L. PAUP*. Phylogenetic analysis using parsimony (* and other methods) Version 4 // Sinauer Associates. 2003. Sunderland. Massachusetts.

115. Tanaka R. and Tanaka A. Tetrapyrrole Biosynthesis in Higher Plants //Annu. Rev. Plant Biol. 2007. V.58. P.321-463

116. Terry M.J. Phytochrome chromophore-deficient mutants // Plant Cell Environ. 1997. V. 20. P. 740-745.

117. Tsang E.W., Yang J., Chang Q., Nowak G., Kolenovsky A., McGregor D.I., Keller W.A. Chlorophyll reduction in the seed of Brassica napus with a glutamate 1-semialdehyde aminotransferase antisense gene // Plant Mol. Biol.2003. V. 51. P. 191-201.

118. Usuda H. Adenine nucleotide levels, the redox state of the NADP system, and assimilatory force in nonaqueously purified mesophyll chloroplasts from maize leaves under different light intensities // Plant Physiol. 1988. V. 88. P. 14611468.

119. Vothknecht U.C., Kannangara C.G., von Wettstein D. Barley glutamyl tRNAGlu reductase: Mutations affecting haem inhibition and enzyme activity // Phytochemistry. 1998. V. 47 P. 513- 519.

120. Walker C.J., Mansfield K.E., Smith K.M., Castelfranco P.A. Incorporation of atmospheric oxygen into the carbonyl functionality of the protochlorophyllide isocyclic // Biochem. J. 1989. V. 257 P. 599-602.

121. Walker C. J., Hupp L. R., Weinstein J. D. Activation and stabilization of Mg-chelatase activity by ATP as revealed by a novel in vitro continuous assay // Plant Physiol. Biochem. 1992. V. 30. P. 263-269.

122. Walker C.J., J.D. Weinstein. In vitro assay of the chlorophyll biosynthetic enzyme Mg-chelatase: resolution of the activity into soluble and membrane bound fractions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991. V. 88. P. 5789-5793.

123. Walker C.J., J.D. Weinstein. The magnesium-insertion step of chlorophyll biosynthesis is a two step reaction // J. Biochem. 1994. V. 299. P. 277-284.

124. Walker C.J., Weinstein J.D. Re-examination of the localization of Mg-chelatase within the chloroplast // Physiol. Plant. 1995. V. 94. P. 419-424.

125. Walker C.J., Willows R.D. Mechanism and regulation of Mg-chelatase. Biochem. J. 1997. V. 327. P. 321-333.

126. Walker J. E., Saraste M., Runswick M.J. & Gay N.J. Distantly related sequences in the alpha- and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold // EMBO J. 1982. V. 1. P. 945-951.

127. Walsh T.A., Bauer Т., Neal R., Merlo A.O., Schmitzer PR., Hicks G.R. Chemical Genetic Identification of Glutamine Phosphoribosylpyrophosphate Amidotransferase as the Target for a Novel Bleaching Herbicide in

128. Arabidopsis // Plant Physiol. 2007. V. 144. P. 1292-1304.

129. Weber G., Lui M.S., Natsumeda Y, Faderan M.A. Salvage capacity of hepatoma 3924A and action of dipyridamole // Adv. Enzyme Regul. 1983. V. 21. P. 53-69.

130. Williams P., Hardeman K., Fowler J., Rivin C. Divergence of duplicated genes in maize: evolution of contrasting targeting information for enzymes in the porphyrin pathway // Plant J. 2006. V. 45 P. 727-739.

131. Willows R.D., Gibson L.C.D., Kanangara G.C., Hunter C.N., von Wettstein D. Three separate proteins constitute the magnesium chelatase of Rhodobacter sphaeroides // Eur. J. Biochem. 1996. V. 235. P. 438-443.

132. Willows R.D., Hansson A., Birch D., Al-Karadaghi S. and Hansson M. EM single particle analysis of the ATP-dependent Bch I complex of magnesium chelatase: an AAA+ hexamer // J. of Struct. Biol. 2004.V. 146. P. 227- 233.

133. Yamato S., Ida Т., Katagiri M., Ohkawa H. A tobacco soluble protoporphyrinogen-oxidizing enzyme similar to plant peroxidases in theiramino acid sequences and immunochemical reactivity // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. V.59(3). P. 558-559.

134. Zavgorodnyaya A., Papenbrock J., Grimm B. Yeast 5-aminolevulinate synthase provides additional chlorophyll precursor in transgenic tobacco // Plant J. 1997. V. 12. P. 169-178.

135. TYL.Zsebo K.M., Hearst J.E. Genetic-physical mapping of the photosynthetic gene cluster from Rhodobacter capsulatus II Cell. 1984. V. 37. P. 937-947.

Информация о работе

Апчелимов, Алексей Андреевич
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.15

Диссертация

Идентификация и молекулярно-генетический анализ генов Arabidopsis thaliana, контролирующих чувствительность к гербициду ацифлюорфену - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы