Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ионизирующей радиации на белок-синтезирующую активность культуры ткани RAUWOLFIA SERPENTINA BENTH

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние ионизирующей радиации на белок-синтезирующую активность культуры ткани RAUWOLFIA SERPENTINA BENTH"

Министерство здравоохранения и медицинской промышленности РФ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА БЕЛОК-СИНТЕЗИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ RAUWOLFIA SERPENTINA BENTH.

Специальность 03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических на/к

На правах рукописи

БЕСПАЛОВА Елена Вячеславовна

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена на кафедре биологической химии Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Комов В.П.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Комар В.Е.

доктор медицинских наук, профессор Щербак И.Г.

Ведущая организация: Санкт-Петербургский Государственный научно-

исследовательский институт радиационной гигиены.

Защита состоится М_1996 г. в /Л час.

на заседании диссертационного Совета К 084.63.01 при Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат диссертации разослан "7"' 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биологических наук

Общая характеристика работы.

Изучению влияния ионизирующего излучения на различные биохимические процессы в растительных клетках посвящено большое число работ отечественных и зарубежных авторов. Интерес к этой области радиобиологии в значительной степени связан с обнаружением стимулирующего и мутагенного эффектов облучения, которые исследовались преимущественно на растениях, представляющих интерес для промышленности и сельского хозяйства. В последние годы все более пристальное внимание уделяется методам культивирования растительных клеток и тканей. Это связано в первую очередь с перспективностью их использования в качестве продуцентов различных биологически активных веществ, находящих широкое практическое применение. Кроме того, метод культуры тканей позволяет достаточно адекватно оценивать влияние ионизирующих излучений на отдельные клетки или клеточные популяции, выращиваемые в строго контролируемых условиях. Оценка состояния белкового метаболизма в норме и в условиях воздействия стрессовых факторов создает предпосылки для более эффективного развития биотехнологии культивируемых клеток. На кафедре биохимии Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии в течение многих лет проводятся исследования з использованием в качестве объектов промышленных штаммов Ралах ginseng и Rauwolfia serpentina Benth. Данная работа является продолжением исследований сотрудников кафедры в этой области.

Ее цель: изучить влияние рентгеновского излучения на рост и 5елок-синтезирующую способность культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth.- продуцента ценного антиаритмического препарата эймалина.

С точки зрения радиобиологии особый интерес представляет изучение обмена отдельных ферментов в условиях лучевого воздейс-

твия, поскольку ферментные системы играют важную роль в жизнедеятельности организма. В частности, сотрудниками кафедры биохимии СПХФА проведены исследования пострадиационных изменений биосинтеза и молекулярной гетерогенности ряда ферментов из различных органов животных: адьдолазы, каталазы, протеиназы, бутирилхолинэс-теразы [Комов и соавт, 1976-1988]. В данной работе наряду, с оценкой состояния метаболизма общего белка изучено влияние облучения на параметры обмена и молекулярную гетерогенность каталазы - одного из ферментов антиоксидантной защиты организма.

Данные литературы убедительно свидетельствуют о роли каталазы в процессах пострадиационного восстановления.■ Известно, что, активно разлагая перекись водорода, каталаза обеспечивает снижение уровня перекисного окисления липидов в облученных клетках. Кроме того, она повышает эффективность действия эндогенных и экзогенных тиоловых соединений, играющих радиопротекторную роль. Пострадиационные изменения активности этого фермента в различных животных и растительных объектах наблюдали многие исследователи, однако результаты в некоторых случаях противоречивы. Отмечается, что активация каталазы в растительных тканях коррелирует с их быстрым восстановлением, введение экзогенной каталазы значительно уменьшало степень радиационных повреждений в различных системах [Гродзинский,Петров,1969; Ра1,Заиг,19881. Тем не менее, однозначного вывода о роли этого фермента в развитии радиобиологических реакций до сих пор нет. Крайне ограничены также сведения об изменении изоэнзимного спектра каталазы в условиях лучевого воздействия, остается невыясненным и механизм пострадиационных нарушении ее кругооборота. На основании вышеизложенного можно рассматривать предпринятое нами исследование как принципиально новое и актуальное.

Задачи исследования. В работе были поставлены.следующие задачи:

1. Оценить влияние ионизирующего излучения на прирост биомассы в культуре ткани R. serpentina при культивировании на облученной и необлученной питательной среде.

2. Исследовать пострадиационные изменения содержания белка и параметров его обмена в клетках ткани R.serpentina при облучении на 2-е и 25-е сутки роста.

3. Охарактеризовать динамику изменения активности и оценить молекулярную гетерогенность каталазы в процессе роста культуры ткани R. serpentina после облучения с последующей пересадкой или без нее.

4. Выделить и очистить до гомогенного состояния каталазу из культивируемых клеток R.serpentina и получить к ней моноспецифические антитела.

5. Провести сравнительную оценку пострадиационных изменений кругооборота каталазы в культуре ткани R.serpentina, подвергнутой облучению на ранних сроках роста и в период максимальной активности фермента.

Научная новизна. Исследованы пострадиационные нарушения белкового обмена в культуре ткани R. serpentina, подвергнутой облучению на 2-е или 25-е сутки роста. Показано, что в результате лучевого воздействия на зрелую культуру происходит активация белок-синтетических процессов, следствием чего является увеличение концентрации белка в клетках на ранней стадии пострадиационного периода. Наряду с этим сокращается время функционирования белковых молекул. В культуре ткани того же возраста, выросшей из облученного инокулята, параметры обмена белка также превышали контрольные значения, хотя его концентрация в клетках не отличалась

- б -

or нормы.

В работе впервые были изучены и сопоставлены динамика изменения активности, молекулярная гетерогенность и параметры обмена каталазы в облученной культуре ткани R. serpentina. Установлено, что облучение 25-суточной культуры приводит к снижению скорости обмена фермента более чем в 2 раза, тогда как в культуре ткани того же возраста, выросшей из облученного инокулята, константы скоростей.синтеза и распада каталазы превышают норму. Ускорению кругооборота фермента в большей степени способствовало облучение инокулята с последующей пересадкой. Наряду с этим происходят существенные изменения изоэнзимного спектра каталазы, отражающие адаптивные возможности культивируемых клеток.

Проведена сравнительная оценка прироста биомассы в условиях лучевого воздействия в различных дозах и на разных сроках культивирования. Установлено, что радиационное воздействие в дозах 8 и 50 Гр способствует ускоренному росту культивируемых клеток, но не увеличивает конечный выход биомассы. Облучение в дозах 100 и 150 Гр приводит к ускоренному старению и гибели культуры.

Теоретическая и практическая значимость. Выполненная работа является теоретическим исследованием. Полученные данные об изменениях активности и молекулярной гетерогенности каталазы в культуре ткани R. serpentina позволяют расширить представления о роли этого фермента в процессах пострадиационного восстановления и дают основание предполагать, что перекись водорода, образующаяся под действием ионизирующего излучения, является одним из факторов, индуцирующих его биосинтез.

В качестве объекта исследования был выбран штамм, являющийся промышленным продуцентом аймалина - высокоэффективного противоа-ритмического препарата. Установленный нами факт стимуляции роста

rf

t -

гультуры ткани в результате облучения в малых дозах может иметь шределенное практическое значение, поскольку позволяет сократить ;роки культивирования.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на страни-дах, содержит 4 таблицы и 33 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Последний включает в себя 237 наименований, из них 106 - на иностранном языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работу проводили на стеблевой культуре ткани Rauwolfia serpentina, штамм К 27, ВСКК (BP) N 30, культивируемой на твердой агаризованной среде в темноте при 28°С и относительной влажности 7ОХ. Продолжительность одного пассажа составляла 25-30 суток, после чего разрыхленную ткань массой около 9±2 г пересаживали на свежую питательную среду. В работе использовали ткань из 3-4 пассажей.

Облучение проводили на установке РУМ-17 при силе тока 0,5 мА и напряжении 200 В. Мощность дозы составляла 0,83 Гр/мин при фокусном расстоянии 50 см, фильтры Al 1мм + Си 0,5 мм. Культуру подвергали лучевому воздействию в дозах 8, 50, 100 и 150 Гр на 2-е или 25-е сутки роста в зависимости от дели эксперимента. В качестве контроля использовали необлученную культуру. В опытах со сменой среды ее также подвергали пересадке одновременно с облученной.

Для выделения цигозольной фракции навеску сырой ткани в возрасте 25-35 суток гомогенизировали в охлажденной ступке с ОД М Na-фосфатным буфером рН 7,8 из расчета 0,25 мл буфера на 1 г ткани с добавлением тритона Х-100 до конечной концентрации 0,5%. Го-

могенат выдерживали 30 мин при 4°С и центрифугировали при 105000 g в течение 30 мин. В полученном супернатанте определяли активность каталазы перманганатометрическим методом [Бах,1937] и содержание белка по методу Лоури CLowry et al.,19513. Выделение и очистку каталазы проводили, используя методы ионнообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе и гель-фильтрации на Toyopearl HW-50. Гомогенность полученного фермента оценивали при помощи нативного диск-электрофореза в 7,5% ПААГ и электрофореза в денатурирующих условиях в 10% ПААГ. Специфическое окрашивание геля на активность каталазы осуществляли по методу Вудбурга [Woodburg,19711. Молекулярную гетерогенность фермента исследовали методом диск-злектро-фореза в 7%. ПААГ в трис-глициновом буфере (рН 8,2) с последующей гомогенизацией сегментов геля толщиной 2 мм в Иа-фосфатном буфере и определением каталазной активности и концентрации белка в надо-садочной жидкости.

Антисыворотку к каталазе получали иммунизацией кролика выделенным гомогенным препаратом фермента. Специфичность антител оценивали методом иммунодиффузии в 1% агаре Дифко по методу Охтерло-ни [0uchterlony,1949] и диск-электрофорезом преципитатов в денатурирующих условиях.

Для изучения обмена каталазы и общего белка использовали радиоизотопный и иммунохимический методы анализа. Радиоизотоп ([Н3]-4,5 лизин) вносили в 25-суточную культуру стерильной иглой в асептических условиях из расчета 150 мкКи на 10 г ткани. Через час вносили 10-кратное количество стерильного немеченого лизина для предотвращения реутилизации радиоизотопа. Обмен фермента и общего белка оценивали через 9, 20, 25 часов после введения метки. Радиоактивность проб измеряли на сцинтилляционном счетчике (Mark-III, США). Константы скорости синтеза и распада определяли по методу Шимке и Брэдли [Schimke et al.,19753, время "полужизни"

белковых макромолекул (Г1/2) - по методу Ариас [Arias et al.,1969]. Содержание ферментного белка рассчитывали, исходя из активности каталазы в супернатанте и удельной активности очищенного фермента.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили, используя критерий Стьюденга. Различия считали достоверными при уровне вероятности Р< 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Влияние ионизирующего излучения на рост культуры клеток Rauwolfia serpentina.

Инокулят массой 9±2 г подвергали облучению в различных дозах вместе с питательной средой через сутки после посадки. Облучение в дозе 8 Гр не оказало заметного влияния на конечный максимальный выход биомассы в стационарной фазе роста, незначительное снижение этой величины (на 8Z) было отмечено при увеличении дозы до 50 Гр. Лучевое воздействие в дозе 100 Гр привело к сильному угнетению роста: максимальный выход биомассы, отмеченный на 35-е сутки, составил 40% от контроля, а уже на 45-е сутки наблюдали гибель большей части клеток, сопровождавшуюся их потемнением и ослизне-нием. Полное подавление процессов роста и деления клеток, а также ускоренное старение и гибель 100% культуры на 30-е сутки вызвало облучение в дозе 150 Гр (рис.1). Эффект облучения проявился также в изменении длительности лаг-фазы, которая возрастала прямо пропорционально интенсивности радиационного воздействия.

Известно, что в процессе роста культуры ткани меняется соотношение между клетками с различной пролиферативной активностью. Увеличение количества активно растущих клеток обуславливает снижение ее радиорезистентности. Однако в этот период отмечен максимум активности каталазы, которая играет важную роль в процессах

100 т

I

Ъ

1 3 7 11 15 19 23 27 31 35 39 43 Рис.1 Зависимость прироста биомассы в культуре ткани R. serpentina

от дозы облучения

65 cjmM

I

и

0

1

пострадиационного восстановления. Кроме того, низкая мощность излучения создает благоприятные условия для действия систем репарации и восстановления клеточной популяции. Тем не менее, лучевое воздействие в дозе 8 Гр на 25-е сутки роста привело к снижению кончного выхода биомассы в среднем на 15% по сравнению с контролем.

При исследовании влияния ионизирующей радиации на культуру ткани различают ее прямое и непрямое действие, то есть непосредственное воздействие излучения на ткань, и влияние облученной среды. Нами была проведена сравнительная оценка скорости прироста биомассы при культивировании на облученной и необлученной среде после облучения в дозах с минимальным повреждающим эффектом, т.е. 8 и 50 Гр. Пересадка инокулята, облученного в дозе 8 Гр, на свежую питательную среду ускорила рост культуры. В среднем на 5 суток раньше был отмечен выход на стационарную фазу роста, однако максимальный прирост биомассы, определяемый в этой фазе, практически не изменился. Эффект от пересадки после облучения в дозе 50 Гр проявился на более поздних сроках культивирования и был совершенно иным. После 35-ых суток роста скорость накопления биомассы резко снизилась, наблюдалось потемнение и ослизнение части клеток. На 55-е сутки вес пересаженной культуры составлял 55% от контроля, тогда как при выращивании на облученной питательной среде эта величина лишь на 8%. отличалась от нормы. Известно, что облучение повышает чувствительность клеток к различным стрессовым воздействиям, которые, в свою очередь, могут усилить или ослабить повреждающий эффект радиации. Вероятно, в данном случае пересадка, произведенная сразу после облучения, сыграла роль фактора, увеличившего выход радиационных повреждений, что, в свою очередь, повлияло на прирост клеточной массы в культуре.

Пострадиационные изменения концентрации бедка и активности каталазы в культуре ткани R. serpentina.

Содержание водорастворимых белков в клетках культуры R. serpentina в норме тесно связано с динамикой накопления биомассы и достигает максимального уровня в период активного роста на 23 и 37 сутки. Изменение активности каталазы также коррелирует с уровнем содержания белка в клетках и описывается кривой с максимумами на 25-е и 35-е сутки культивирования. Достижение стационарной фазы роста и последующее старение культуры сопровождается снижением концентрации водорастворимых белков в клетках и уменьшением каталазной активности, что может быть связано с уменьшением митотической активности культивируемых клеток и изменением интенсивности кислородного метаболизма [Комов и соавт.,1989].

Лучевое воздействие на инокулят привело к значительной активации фермента, при этом в диапазоне малых доз (8-50 Гр) ее величина была прямо пропорциональна интенсивности лучевого воздействия; в случае облучения в более высоких дозах (100 и 150 Гр) отмечена обратная корреляция (рис.2). Пострадиационное увеличение активности каталазы отражает неспецифическую реакцию клеток на стресс и может быть обусловлено изменением интенсивности процессов дыхания и биологического окисления. Под влиянием ионизирующего излучения индуцируются активные восстановительные процессы , в частности, синтез ферментов репарации и белков для поврежденных структурных компонентов [Ильина и соавт.,1965], кроме того, синтезируется ряд стрессовых белков. Этим можно объяснить увеличение концентрации белка, коррелирующее с активацией каталазы на ранней стадии пострадиационного периода (рис.3).

Степень пострадиационной активации фермента определялась в большей, степени условиями, в которых находились клетки после облучения: в культуре, перенесенной на свежую питательную среду, ее

100 Т

.00

¡00

00

J сутки

облучение

0

Зис.2 Зависимость величины пострадиационной активации каталазы

от дозы облучения.

зеличина была в среднем на 30% ниже, чем при выращивании на облу-1енной среде (рис.3). В пересаженной культуре, достигнув максимума на 7-е сутки, активность фермента резко снизилась и на 17-е ;утки составляла в среднем 177. от нормы. Повторная активация фермента наблюдалась на 27-е сутки после 8 Гр и на 32-е- после 50 "■р. При этом в первом случае она составила 137%, а во втором- не превышала уровня активности в контроле. При выращивании на облу-ieHHOH среде спад активности (до 34 и 65% от контроля после 8 и 50 Гр соответственно) был отмечен на 32-е сутки, в то время как ia протяжении 23-х суток ее уровень заметно превышал норму.

В качестве возможной причины активации фермента на ранней стадии пострадиационного периода мы предполагаем активацию ее биосинтеза под влиянием возросшей концентрации субстрата. Тот факт, что после облучения в дозах 100 и 150 Гр каталага активируется в меньшей степени, можно объяснить радиационным повреждением некоторого числа молекул фермента.

2»

200

150

В

100

50

/"V

3 7 11 \15 И /* 23

ЧУ

Облучение без гмресадхи: Облучение с пересадкой: -

'активность каталазы ---активность каталазы

43

сутки роста

-концентрация бела • концентрация бела

350

сутки роста

Рис.3 Изменение концентрации белка и активности каталазы после облучения: А - в дозе 8 Гр, Б - в дозе 50 Гр.

Влияние облучения на молекулярную гетерогенность каталавы в культуре ткани R.serpentina.

В норме каждый из изоэнзимных спектров каталазы, соответствующих 2-м, 10-м и 25-м суткам культивирования, был представлен тремя' изоформами, их ферментативная активность и электрофорети-ческая подвижность изменялись в процессе роста. В течение суток после облучения инокулята в дозе 8 Гр наблюдалось лишь изменение удельной активности изоформ фермента (рис.4), при этом через 2 часа их суммарная активность несколько снизилось, а к 24 часам ее величина превышала контрольный уровень на 25%- в случае облучения без пересадки, на 8% - после пересадки. Таким образом, пострадиационная активация каталазы, наблюдаемая через сутки после облучения, является результатом увеличения активности всех трех изоформ. Через 2 часа после облучения в дозе 50 Гр суммарная активность изоформ снизилась на 13%, а прирост активности через сутки составил в среднем 127%, но в этом случае было отмечено изменение электрофоретической подвижности и уменьшение количества изоформ фермента до 2-х. Еще большее снижение активности изоформ (на 28%) было отмечено через 2 часа после облучения в дозе 150 Гр, в то время как их количество увеличилось до четырех; спустя 24 часа энзимограмма каталазы показала присутствие трех изоформ, а их активность превышала контроль лишь на 8 %. Возможной причиной изменения молекулярной гетерогенности фермента является нарушение конформации его молекулы, приводящее к изменению ее заряда. Поскольку активность при этом сохраняется, можно заключить, что кон-формационные преобразования не затронули активный центр и не нарушили связей между субъединицами фермента.

В случае облучения 25-суточной культуры в дозе 8 Гр инактивация была более длительной: через сутки после лучевого воздейс-

800 600 400 ■ 200 -0

А

2

4

в

8

10

контроль, 2-е сутки роста

750-т

800 600 400200 О

Л,

О 2 4 в 8 10 2 часа после облучения в дозе 8 Гр

1200 800 600 300

о

0 2 4 6 8

2 часа после облучения в дозе 50 Гр

A,, J

I I I I Л I 'Ч

т-*-Т

4 6 8 10

1600 у 1200 ■• 800 ■ 400 0

О

24 часа после облучения в дозе 8 Гр

24 часа после облучения в дозе 50 Гр

Рис.4 Изменение изоэнзимных спектров каталазы в культуре ткани Я. вегрепйпа на ранних сроках после облучения.

По оси абсцисс- длина ПААГ, мм; но оси эрдпнат-удельная активность, мкмоль/мг мин.

8

2

4

6

твия каталазная активность изоформ все еще не достигла контрольного уровня. Очевидно, высокая радиочувствительность активно про-лиферирующих клеток обусловила большую степень поражения молекул фермента и увеличила интервал времени, в течение которого его активность достигла максимально высокого уровня. При этом количество изоформ в электрофоретическом спектре не изменилось, но подвижность несколько уменьшилась.

Экспериментально установлено, что культивирование на облученной среде способствует большей пострадиационной активации ка-талазы, но не влияет на ее молекулярную гетерогенность. Тем не менее, оценку изменений изоэнзимного спектра фермента в отдаленном пострадиационном периоде проводили в условиях, исключающих влияние облученной питательной среды. На 10-е сутки в культуре ткани, выращиваемой из облученного в дозе 8 Гр инокулята, было обнаружено четыре, а на 25-е - пять изоформ, большинство из которых относились к медленномигрирующим. Увеличение дозы до 50 Гр вызвало уменьшение подвижности и количества изоформ каталазы уже в первые сутки после облучения инокулята. На 10-е и 25-е сутки роста установлено наличие двух, а на 35-е - одной медленномигри-рующей изоформы (рис.5).

Необходимо отметить опредолешгую корреляцию между количест вом выявляемых изоформ каталазы и величиной дозы радиационного воздействия. Известно, что возрастание числа изоформ фермента характеризует возможность адаптации клеток к различным стрессовым факторам [Хочачка.Сомеро, 1977]. Для культуры ткани, облученной в дозе 8 Гр, показана большая молекулярная гетерогенность каталазы, что обеспечивает ее высокую адаптивную способность в условиях радиационного воздействия. Характер изменения изоэнзимных спектров каталазы после облучения в дозе 50 Гр, свидетельствует о снижении адаптивных возможностей в процессе культивирования. Качественные

Контроль: 10-е с/ли роста

25-е сутки роста

Т—I-ПН-1—I—Г—I—I-ГУ-1-1—т—I-1—|-1

О 2 5 8 10 13 2» 28 32

1000 т 800 600 400

200

Л,

0| М I I I I I 1 I' I1 I ^ 1М 0 2 4 в 8 10 12

облучение в дозе 8 Гр

О 2 4 в в 12 26 28 30

750 600

460

300 150

: К к

!л

0 2 4 6 8 10 12 14

облучение в дозе 50 Гр

800 -600 ■ 400 200 о

Рис. 5 Изоэнзимные спектры катапазы в культуре ткани Я эегрепйпа, выросшей из облученного инокулята. По оси абсцисс-длина ПААГ, мм; по оси ординат-удельная активность,мкмоль/мгмин.

и количественные трансформации изоэнзимного спектра кагалазы могут быть обусловлены, с одной стороны, изменениями конформации белковой молекулы самого фермента, а с другой - интенсивностью синтеза и деградации отдельных изоформ от их новообразования до практически полного исчезновения.

Выделение и очистка кагалазы из культуры ткани R.serpentina.

Выла разработана схема выделения и очистки каталазы, включающая- анионнообменную хроматографию на ДЕАЕ- целлюлозе и гель-фильтрацию на Toyopearl HW-50. Выход по белку составил 0,8%, по активности - 51% при степени очистки в 63 раза (таблица 1).

Таблица 1.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА КАТАЛАЗЫ ИЗ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ R.SERPENT INA.

Стадия выделения Белок, мг Ферм.активность Очистка, раз Выход,%

удельная,Ед. ферм./мг мин сумм.,Ед. ферм./мин по белку по ак-тивн.

Супернатант 41,8 155 6461 1 100 100

ДЕАЕ-целлюлоза 0,85 4720 4012 30 2 62

Лиофильная сушка 0,83 3383 2808 22 1,9 44

Toyopearl-HW-50 0,34 9732 3309 63 0,8 51

Влияние ионизирующего излучения на обмен каталазы и общего бедка в культуре ткани Rauwolfia serpentina.

С целью проверки нашей гипотезы о влиянии субстрата каталазы на ее биосинтез была проведена оценка скоростей синтеза и распада фермента в норме и на разных стадиях пострадиационного периода. Культуру ткани подвергали облучению в дозе 8 Гр на 2-е сутки ( с последующей пересадкой и без нее) или на 25-е сутки роста, для изучения обмена использовали 25-суточную культуру, поскольку в этот период наблюдается максимум ферментативной активности. На основании экспериментальных данных были рассчитаны константы скоростей биосинтеза и спонтанной деградации каталазы и тотального белка, а также их концентрация и время функционирования белковых макромолекул.

Непосредственно после лучевого воздействия на 25-суточную культуру константа скорости синтеза каталазы уменьшилась в 2,2 раза, тогда как время функционирования молекул фермента возросло в 2,4 раза (табл. 2). Уменьшение количества синтезированных de novo молекул в пуле ферментного белка и обусловило снижение ката-лазной активности, отмеченное через 24 часа после облучения. Наряду с этим в 3,3 раза возросла скорость процессов синтеза белка, что привело к увеличению его концентрации в клетках на 30%. Время "полужизни" белковых макромолекул уменьшилось в 2,7 раза.

В 25-суточной культуре, выросшей из облученного инокулята, скорость обмена каталазы превышала норму: в случае облучения без пересадки - в 2 раза, с пересадкой - в 6 раз (табл.3). Возросшая скорость оборота привела к увеличению количества вновь синтезированных молекул в пуле ферментного белка, что, возможно, и обусловило активацию каталазы. Проведенная одновременно с этим оценка параметров обмена общего белка показала, что скорости его синтеза и распада также возросли в первом случае в 1,5 , а во втором -

Таблица 2.

ПАРАМЕТРЫ ОБМЕНА КАТАЛАЗЫ И ОБЩЕГО БЕЛКА В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ R. SERPENTINA ПОСЛЕ ОБЛУЧЕНИЯ НА 25-Е СУТКИ РОСТА.

Параметры обмена КАТАЛАЗЫ ОБЩЕГО БЕЛКА

Контроль 8 Гр Контроль 8 Гр

Константа деградации,сут-1 0,399 0,165 0,113 0,309

Константа синтеза,мкг/г сут 718 322 385 1370

Время "полужизни",сут. 1,74 4,18 6,13 2,24

Концентрация белка, мкг/г ткани 1800 1950 3408 4448

почти в 2 раза, тогда как его содержание в клетках практически не отличалось от контрольного уровня (табл.4 ). Наблюдаемое увеличение биосинтетической способности культуры R.serpentina, облученной в дозе 8 Гр, коррелирует с результатами, полученными на других растительных объектах СКоломиец,1982].

Таким образом, первичной реакцией каталазы на лучевое воздействие является уменьшение скоростей ее синтеза, распада и уве-

Таблица 3.

ПАРАМЕТРЫ ОБМЕНА КАТАЛАЗЫ В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ R. SERPENTINA В ОТДАЛЕННОМ ПОСТРАДИАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ.*

Параметры обмена Облучение без пересадки Облучение с пересадкой

Контроль 8 Гр Контроль 8 Гр

Константа деградации,сут-1 0,399 0,672 0,403 2,64

Константа синтеза,мкг/г сут 718 1351 725 4277

Время "полужизни",сут. 1,74 1,04 1,72 0,26

Концентрация ферм, белка, мкг/г ткани 1800 2010 1800 1620

* - облучение проводилось на 2-е сутки, оценка параметров кругооборота - на 25-е сутки роста.

личение времени "полужизни", сопровождаемое снижением ферментативной активности. В процессе пострадиационного восстановления наблюдается активация фермента вследствие увеличения скорости его обмена. Полагаем, что перекись водорода, образующаяся под действием ионизирующего излучения, является одним из факторов, инду-

цирущих биосинтез каталазы. Кроме того, в результате лучевого воздействия наблюдается активация синтеза общего белка в клетках. Более высокая по сравнению с нормой скорость синтетических процессов сохраняется и в отдаленном пострадиационном периоде, что свидетельствует о значительной перестройке клеточного метаболизма под действием ионизирующего излучения. Пересадка облученного ино-

Таблица 4.

ПАРАМЕТРЫ ОБМЕНА ОБЩЕГО БЕЛКА В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ R. SERPENTINA В ОТДАЛЕННОМ ПОСТРАДИАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ.*

Параметры обмена Облучение без пересадки Облучение с пересадкой

Контроль 8 Гр Контроль 8 Гр

Константа деградации,сут-1 0,113 0,174 0,118 0,230

Константа синтеза,мкг/г сут 393 609 415 782

Время "полужизни",сут. 6,13 3,98 5,87 3,0

Концентрация белка, мкг/г ткани 3480 3500 3520 3400

* - облучение проводилось на 2-е сутки, оценка параметров обмена - на 25-е сутки роста.

кулята на свежую питательную среду способствует еще большей активации белок-синтетических процессов.

ВЫВОДЫ

1. Облучение в дозах 8 и 50 Гр способствует ускоренному росту культуры ткани R. serpentina, но не увеличивает конечный выход биомассы в фазе стационарного роста. Дозы 100 и 150 Гр приводят к угнетению роста и ускоренной гибели клеток.

2. Облучение в дозе 8 Гр приводит к активации белкового обмена, что обуславливает увеличение концентрации белка в клетках на ранней стадии пострадиационного периода. С течением времени обнаруживается тенденция к снижению скоростей синтеза и распада белка, выраженная в большей степени в случае облучения без пересадки.

3. После лучевого воздействия на культуру ткани R. sepentina наблюдается кратковременная инактивация каталазы вследствие снижения скорости ее обмена и увеличения времени "полужизни". Степень и длительность периода инактивации прямо пропорциональна возрасту облучаемой культуры ткани. В дальнейшем активность фермента возрастает и в течение 3 недель после облучения значительно превышает контрольный уровень.

4. На поздней стадии пострадиационного периода активность каталазы возвращается к норме, однако скорости синтеза и распада фермента значительно превышают таковые в контроле: в случае облучения без пересадки в 2 раза, с пересадкой - в 6 раз.

5. Характер изменений в изоэнзимном спектре каталазы под действием облучения отражает адаптивные возможности культивируемых клеток и зависит от интенсивности радиационного воздействия. Для культуры ткани, облученной в дозе 8 Гр, показана большая молекулярная гетерогенность фермента, с увеличением дозы до 50 Гр

происходит уменьшение количества и подвижности его изоформ, что свидетельствует о снижении адаптивной способности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Комов В.П., Беспалова Е.В., Стрелкова М.А. Влияние ионизирующего излучения на белок-синтезирующую способность и рост культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth.// Растительные ресурсы. 1996. Вып. 4. С.77-83.

2. Беспалова Е.В., Стрелкова М.А., Марченко А.Л., Комов В.П. Изучение некоторых ферментов антиоксидантной системы в культуре ткани раувольфии змеиной в норме и после рентгеновского облучения.// Актуальные проблемы создания лекарственных средств: Тез. докл. Всероссийской конференции. С-Петербург, 1996.