Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование биосинтеза и стабильности вакуолярной протеиназы из культуры ткани Rauwolfia serpentina

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование биосинтеза и стабильности вакуолярной протеиназы из культуры ткани Rauwolfia serpentina"

Сатгг-Штег'' /ргскип хшкко-фаршдевгический институт

На правах рукописи

САШИН Юрий Александрович

Исследование биосинтеза и стабильности вакуолярной протеинааы из культуры ткани КАЦШЛА ЗЕКРЕНША

специальность 03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕЫТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санет-ПетерСург

Работ выполнена на кафедре биологической химии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института

Научный руководитель-доктор биологических наук, профессор КОШВ В. П.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор ЩЕРБАК И. Г. кандидат биологических наук БОРТАШЕВИЧ Ю. а

Бедушэ- организация: Ботанический институт им Комарова АН ССОР, Санкт-Пзторбург

Защита состоится "Я;1" Ш2 г. в /^^час. на

васедашш специализированного ''Совета К 084.63,01 при Санкт-Петербургском химико-фармацевтическом институте по адресу: 197022, Санкт-Петербург, уд. проф. Попова, 14

С диссертацией южно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат диссертации разослав ^¿-^С^-РЧео Сг.

~7/

Ученый секретарь //

специализированного Совета ^ ' ( /

кандидат биологически? наук Е ЕКириллова

СЕДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАГ'ТЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В последнее ьогмя яабж^эзтея тенденция к углубленному научению биохимических процессов в культивируемых клетках растений. Многие культивируемые растительный ткани ухе сейчас является промышленными продуцентами важных биологически активных вецеств : лчало-идов, гяйкоэидоз, ферментов к т. д. (Бутенхо, 19S6), в связи с чем несомненный практический интерес представляет изучение их метаболизма. Кроме того, при оаботе с культурой ткани имеется уникальная возмолзюсть изучить потенции изолированных клеток. а такте их реакцию на различные вяещгае факторы, не опосредованную другими тканями растения.

Несмотря на довольно интенсивнее физиологические и цито-морфологичеекда исследования в культивируемых клетках растений, в настоядае время имеется совсем немного работ по кругообороту белков растений и особенно его связи со вторичным метаболизмом. Шлду тем, происходящие в дифференцированных клетка»: каллуса изменения метаболизм" белков, а также их биологической активности» сходства к субстратам и т. д.. могут приводить к модификации ряда биохимических процессов (Кошв, 1931 \ Подобные изменения могут привести к потере клетками способности синтезировать некоторые характерные для интактного растения соединения или, напротив, к биосинтезу de novo ранее не обнаруживаемых вторичных "era-болитов. Таким образом, оценка метаболизма культивируемых клеток растений создает определенную теоретическую базу для направленного синтеза вторичных метаболитов, являющихся ценнши лекарственными препаратами.

В Санкт-Петербургском химико-фармацевтическом институте в течение ряда лет ведутся интенсивные работы по научению биохимических процессов з каллусных культурах редких лекарственных растений женьшеня и Раувольфии змеиной (Коков и соавт. ,1981-1990).

Протеолиз является одним га ключевых звеньев регуляции клеточного метаболизма (Bollar & Kendo. 1976; WatUо,

1082). Протеиназы найдены практически 6о всех клеточных ор-ганеллах и принимает участие в самых разнообразных процессах (Noble Ä Dal ling, 1982; Okunuki, ÎS61-, Ûttsen. 1QS7; Ram et al.. 1986). Вместе с тем основной литический потенциал растительной клетки сосредоточен в вакуолях, на долю которых приходится до 80 X протеолитической активности.

В настоящей работе сделана попытка оценить вклад лротео-диза ï регуляции клеточного метаболизма в каллусной культуре Rauvolfia serpentina

Основные задачи исследования. Е работе были поставлены следующие задачи

1) оценить обший протеолитический потен:,-/ал клеток Rauwolfta serpentina и его распределение по органеллам

2) изучить динамику изменения активности различных протеинов в процессе культивирования

3) выделить и очистить до гомогенного состояния вакуляр-ную протеинаэу, охарактеризовать ее физико-химические свойства

4) исследовать параметры кругооборота ^рмента в корме,, а также влияние на метаболизм протеиназы фитогоршнов (ауксинов и цитокининов).

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые был оценен протеолитический потенциал клеток Rauwolfia serpentina, его локализация по органеллам, изучена динамика изменения протеолитической активности и выявлена ее : ¡евид-Hc~i корелляция с изменениям биомассы и тотального белка в процессе культивироваяил.

Быд разработан дагод выделения и очистки до гомогенного состояния кислой вакуолярной протеиназы из 35-дневной культуры, определена ее молекулярная масса, проведена оценка субстратной специфичности, изучены другие физико-химические свойства (фермента.

В ре ,оте i 1ределены константы скоростей синтеза и распада протеиназы, ее концентрация и время "полужизни", а также показано влияние на эти показатели ауксинов и цитокининов, предложена интерпретация регуляторного механизма действия этих гормонов, опосредованного вакуолярной протеиназой.

Практически значимость работы. Работа явл. зтся теоретическим исследованием. Получены данные о физ;,;:охимических свойствах, скоростях синтеза и деградации, внутриклеточной концентрации и времен! "полуяганм" кислой вакуолчрной про-теиназы - первичного метаболита, принимающего участие в регуляции гомеостаза клетки, что дополняет наш знания об обмене индивидуальных белков в культивируемых клетках и его связи со вторичным метаболизмом. Кроме того, основываясь на полученных результатах и данных литературы, нами п; уложена модель регуляторного действия ауксинов и цитокининов, в которой протеиназа играет роль посредника

Структура и объем диссертации. Работа изложена страницах, содержит / таблицы и ^рисунка. Она состоит но введения, обзора литературы, материалов и методов исс: до-ваний, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 281 наименование, из них 251 на иностранном языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Ре.5оту проводили на стеблевой ...одели культуры т;-.ани Ramrolfia serpentina Культивирование ткани осуществляли следущим образом: разрубленную ткань в количестве 5 г в возрасте 40 дней пересаживали на агаризованную питательную среду с высоким содержанием углеводов (Воллосович и соавт., 1382).

Культуру вырадавали в темноте при 26'. В работе использовали фитогормоны кинетин и индолилуксусную кислоту (SIGMA, США), которые вносили в питательную среду при ее приготовлении из расчета 5*10"вг/л кинетика и ю"г/л индоли-луксусной кислоты.

м С-лейцин (удельная радиоактивность 157 ггКи/ммоль) вводили в клетки при помощи инъекционной иглы в асептических условиях из расчета 50 irkKu на 15 г ткани. 'к-рез 2 ч&сз вносили в асептических условиях десятмсрзтксе количество некеченного лейцина для предотвратил реутилизация рхиюи-зотопа.

Для выделения и очистки Qpt Kuvm вакуолей из культура ткани Раувольфил зшиной навеску ткани соогветствушгг© возраста гомогенизировали в течение 2 ыич при 500 g и 4" в ' буфере для гомогенизация при соотношения буфер -ткань 2:1. Буфер имел следующий состав: 20 мМ тр:;с-НС1, рН 7.8; 0.4 M сорбигол; 2 irM EOT А. Гошгенат осзобояяали от неразрушенной ткани однократная фильтрацией через два сдоя капроновой ткани, о? ядер освобождались центрифугированием гомогената в течение 10 шя при 500 g и 4°на центрифуге К-24 (ГДР). Супернатздт наслаивали v цен-^ифуааых пробирках на 0.6 И сахарозу в 20 ыМ ïpiic-HCl буфера. рН V. 8. Ценгрифугирование проводаи в течение 20 шн npïs 1б,0С0 е и 4\ фракции отбирали шприцем с îioaapxiioCKî, раздела согбкт/ сахароза и наслаивали на 0.4M сахарозу, после чего цепгрифугировали 60 ыод при 36,000 г. Вакуоли отбирая! кпрадем с поверхнссш раздела есрйот/сахароза.

Солжбнлиэаци» какуодярнызс цротенназ проводил! путан трехкратного продзвлюшиа фршдак вакуолей через иглу шрмца (0.2 ta) в присутствии 0.1% Тритона Х-100, после чего отделяли солюбоизад центрифугированном в течение 45 мин ври 36,000 е.

»«еденке субклеточных органам проводил:; центрифугированием общего кяа-готаого гомогената а линейном 0.3 ' - 2. ЗМ гродкекте сахарозы (шютясета 1.С5 - 1. Р.Ь) в течение 2 час при 32,000 g б роторе SV-41 (Взекгпзп). Сформировавшиеся зоны оргаавлл отбирала порицай в соогвотстзйя с их плавучими плотностями.

Активность кагалазы определяли но методу Баха (1937), Щ1то.хромок£вдазн - но методу Smith (1965), глкзэзс-б-фоефа-тазы - ио методу îîordlik я Arion (1G65). Активность и'.е.тай фосфатазы оценивали по се способности гддролизоеагь п-нит-рофэаялфесфат. Еаку<5ацию проведан а цитратксм б.-феро, рн 6.0 а течение 1 часа ири iff". Pesr до остаиавдоали 0. ili .ЧаОН, посла чего определяли прирост олхшяской шюхасохи при 400 чм но сразденшо с контролем.

Белок определяли но методу Lowry (1051) и Bredford (1070).

Протеодлтическую активность определили, используя в качестве субстрата "с-ЕСЛ, полученный по методике, предложи-

ной l.feans (1971). Исследуемый раствор содер.тал 160 клл образца, 3 mi« С-БОА и EU мгст 1М ацетатного буфера, píi 4.0. Поело- инку '«яща в течение í часа при 2?*реахцки останавливали добавлением ~0 мкя 50?. ТЖ осадок отделяли центрифугированием. а в алжотах с^иериатаяга (О. 2 мл) определял» радиоактивность на гадкосткосшктллляцтанном счетчике í-'ark-III (Delta í.fedical). Гашение учитывалось применением двух-канального счета.

Электро1'оретический анализ белков проводили в Трясглици-новой буферной система Laemmly (1370). Концентрирующий гель содержи 5Х, a раздеяямдип* - линейный 8 - 207. полкакркла-мид. Перед нанесением образцы подвергали обработке СЛС я Z-меркаптозтанолом при 100° в течение 10 мин. Электрофорез проводили при постоянном токе 20 иА в концентрируюдем к 30 мА в разделяодэм гелях. Окраску белковых вон проводили по Ansorgre (1982),' после-чего гель высушивали.

Хиск-электро^рез в трубках с 10% ПЛАТ в присутствии СДС проводили по метода' Vaber и Osborn (1369). Гели фиксировали в 50% 7ХУ в течение часа, посла чего проводили окрашивание белковых зон в 0.12 Cu ranas i П-250.

Очистку кислой вакуоляряой протеиназы из вакуолярного еолюбилдаата проводили путем ионообменной и аффинной хроматографии. В качестве жгносСменклка использовали Sorvacoi СМ -32. уравновекеннкй 50 мН ацетатным буфером, рН 4.0. пировали линейным (0 - 1Ы) градиентом КаС1. Для аффинной хроматографии использовали гемоглобин-Се фарозу 4В, полуденную по Frith et al. (1G78), уравновешенную 50 Ш ацетатным буфером, рН 4.0. Злиировалн двойным градиентом 50 - С00 мМ ацетатного буфера (градиент рН 4.0 - 5.0).

Для проведения яягибеторяого анализа использовали PW3F, пепстатик, РСШ, EDTA, а тага® АТФ, 2-меркаптозтанол, ионы К/. Mj*V СаП

Субстратную специфичность изучали по отношению к белковым (казеин, гемоглобин, BOA) н синтетическим субстратам., В качестве последних использовали бутилоксикарсонил-паразит-рофениловые эфиры Gly, Met, Phe, Asn, Gin и Leu.

Для изучения кругооборота кислой вакуоллрной протеяиази использовали рздиоизогояний и тлегнохимическлй мэтзды анализа Константы скоростей синтеза и распада определяли по

методу 3hinikô et al. (1375), врекя пслуоСновления - по методу Arias et al. (1969).

Антисывортку к протеиназе получали, иммунизируя кроликов гомогенным препаратом фермента. Специфичность антител оценивали методом ишунодиффузии в IX агаре Dlfko по Ouchterlony (1949). СтеЦемь чистоты выделенных преципитатов оценивали элегсгрофоретическим методом.

Статистическую обработку результатов проводили, используя критерий Стьюдента Различия считали достоверными при Р í 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Общий протеолитический потенциал клетки и его распределение до органеллам.

Для оценки обззэго протеодитическо^о потенциала клетки и его распределения по отдельным компартментам готовили клеточный гомогенат, из которого затем выделяли субклеточные фракции и ь ких определяли г.ротеолктическух1 активность, используя в качестве субстрата бычий сывороточный альбумин,, мэченый 'Ь-формаяьдегвдом. Излученные данные представлены на рис.i, из которого ьидно, что основной протеолитический потенциал культивируема клеток ñaawolfia sorpuntina сосредоточен в ва*уол,1Х, протеол;ггичсскак активность в которых составляет около ¿,i00 cpM/¡¿r белка. Сракции пластид, митохондрий и ядер характеризуется значительно меньшей протео-литнческой активность» (до 500 срм/кг белка). Таким -:jpa-se..., полученные результаты указывают на то, что а культивируемых метках Rauwoifia serpentina вакуоли является основным диткчйским компартментом.

Это вполне соответствует имеющимся данный лстературы (Canut et al. „1985; Lin et ai. ,ltíS5; Wagner et al. ,1981), согласно которым вакуоли участвуют в регуля^ш таких важнейших фенологических процессов, как деградация запасу >х белков при прораст нии годан, йизис клеток при их старении и др.

Изучение зависимости активности вакуодярных протеиназ от рН среды.

Следующим этапом работы было изучение рН-оптимума протеиназ вакуолей. Для этого проводили содюОшшзацию ферментов

к; 4000

3000 2000

1000

Ркс.1 Распределение "леточ- Рис.2 Зависимость активного лротео.т::т:неского по- постл мкусшржх протеи-тегшлала по оргакелдяк : наз о? pif среда.

I- гог.огенат. ядра, 3- вакуол!, -j- пластали» 5- м::тохог1Др;п:„

из вакуолярной фракции, полученной путем диф^реяциального и равновесного ультрацентркфугированш на градиентах сорбит -сахароза как описаю выше. В солибилизате определяли аро-теолитическую активность при различных значениях рН среды. Для работы при значениях рН до 5.5 использовали ацетатную буферную систему, а при значениях рН вше 5.5 - фосфатную. Помученные данные представлены на рис. 2. Оптимальны« значением для вакуолярных протеиназ оказалось рН среды 4.0 , удельная активность при зтом есстаг *яет 4,îjû ери/ гг, При рН 2.0 и 5.5 активность составляет лишь 50 от млксималь-ной.

Динамика изме! жя биомассы, тотального белка и протеолитической активности в вакуолях в процессе культивирования.

Исследования проводили а течение 14 недел: о интервалом в одну недела В навеске ткани кадцого исследуемого срока определяли общий белок и протеолитическу» активность. Слученные результаты представлены на рис. 3. Как видно из кривой изменения биомассы, через 15 дней после посева ткани

- е -

наблюдается аамстмьй прирост этого показателя, продолжш-вдйся вплоть до ЕО-х суток, после чего происходит замедление роста и культура переходит в стационарную Фазу, харак-т^ризущужея незначительными изменениями биокассы. С 65-х суток культивирования начинается постепенное ешмгшта биомасса, вызванное обезвоживанием ткани и активацией автоли-тическш: процессов.

В4" о 1

о '

ЙО

Й а

р<

а I

4000 2CG0

34 91 56

Рис.3 Дшамкйа взманишй бъеыат, ъщ^шае-точного бглга и- про5«ожггч<5сг.с>\ йктгакоста при рИ 4,0 л 6,4 в вакуолях е годе poeto ;ул»*ут '«¡апл.

Сразу же вэел» лврвсева чулмгуры ьрсиехсдиг угтоАчг.зое увеличение дальнего белка, чаккйкуи которого прюгадтася на 35-й сузска роста л составляет сколе. 10 kr/r ткаки. Еадоз вплоть до оутск роста ->т«ечено постесе'тод сдадена» этого воказагем.

В процесса роете я гсульясмгг.уеукх хлопках происходят эначдаельнне ¡гаменекия 1к?ига-т*ги уазжиэс групгг сакуоллр-ных протеина». Так, при рН 4,0 сг»«чонэ два мжгкыума, про-теолагическсй активности (4.1С0 и 3.500 ерм/иг белка), приходящиеся на S5-e и сутки роста Первый .максимум активности протешаз соответствует максй«уыу мцггриклеточ-ного белка и началу снижения зтега показателя, второй максимум активности протеинам - началу снижений биомассы. Очевидна корелляция вышеуказанна событий с активацией кислых

- о -

вакуолариых протедааз в эти сроки.

При рЯ G. О отме»чеи едииственикЯ максздум ^еотеолитичео-. кой активности, приходяккйея на 49-е сутки рое^а, соответствуйте переходу культуры из фазы экспоненциального роста з стационарную фазу, характеризующуюся прекратят/ прироста и стабилизацией биомассы. В этот период их активность возрастает по сравнению с исходной в 5-6 раз. Очевидно, активация нейтральных протешаз и приводит к усиленной деградации белков, стимулировавших активный рост культуры.

Несколько ранее, к концу пятой недели роста, резко возрастает активность кислых протеиназ (в 7 раз по сравнен;;» с исходной), вслед за чем отмечено устойчивое «имение внутриклеточного белка,- продолжающееся далее непрерывно ьплоть до автолиза культуры, что, на наш взгляд, является следствием активации кислых вакуолярных протекназ.

Наконец, начиная с десятой недели роста, в культуре активируются процессы автолиза, . что ведет в конечном счете к снижению биомассы. Кмекко на этот период приходится еще один максимум активности кислых вакуолярных протеиназ.

Таким образом, в работе продемонстрировано участие нейтральных и кислых.вакуолярных лротеиназ в регуляции таких важнейших физиологических процессов в культивируемых клетках Rautrolfia serpentina, как поддержание необходимого уровня внутриклеточ; ого бег<а и переход культуры из одной фазы развития з другую.

Выделение и очистка вакуолярной протеиказы с рН-оптимумом 4.0 из 35-дневнсЛ культуры.

Процедура выделения и очистки исследуемого фермента состояла из следующих этапов: получение клеточного гомогената и его фракционирование; ^олюбклизация вакуолярных ферментов; очйстка протеиназы методами ионообменной и аМикяой хроматографии. Ионообменную хроматографию проводили на колонке размерами 1. 4 * 8 см, заполненной Servacel СМ-22 и уравновешенной оО мМ ацетатным буфером, рН 4.0. ГЬсле эл»>-ции градиентом NaCl фракции, обладавшую наибольшей протео-литической активчостыа (11,000 срм/мг белка, V^-10 юО наносили на колонку с аффинным сорбентом рчзм.ром 1.4 * С см и элшрозали двойным градиентным ацетатнкк бугром. Гг-а.-;;!ки г<л«ади для ионообменной и аМяшой хрсматл-ра^ий пр-гглтзз-

Рис.4 Ионообменная хрома- Рис,5 Лй^кнкая хроматогра-тографкя вакуолярной про- 6'мя гакуолярпой протеиназц теиказн на Сершсел СМ-32 на НЬ-сефароЕс 4В,

лены на рис. 4 и 5 соответственно. При аффинной хроматографии лик яротеоднтической акгквности (85,000 срм/ мг белка) соответствует объему элкщяи 5 мл. Эту фракцию после обессо-дивания подвергали электрофорезу в неденатурирущих условиях для контроля гомогенности и в денатурирующих условиях для определения молекулярной массы протеиназы. В последнем случае два трэка использовали для электрофореза маркерных Оелков и калибровки геля.

Электрофорез в 7. 6% ПААГ в неденатурируюэдх условия;; покатая, что в геле белковая зона представлена единственной полосой, что позволяет говорить о гомогенности препарата, получеш.ого разработанным методом. Аналогичные схемы выделения и очистки применяются для получения протеиназ из таких источников, как ггаеница (Ве1огэгзкуЛ98'), овес (М1ко1а.1072>, маис (Йат.Шб).

В качестве заключительного атапа очистки использовал!! аффинвуу хроматографио на гемоглоЗик-сафарозе 4В, обладающую достаточно высокой селективностью и характеризующуюся малыми потеряш со активности (исходная активность сяизи-

лась лишь на 0.141). В целом зга примененная методика обеспечила 145-кратную очистку при общем выходе по активности 2.26 % (табл.1), что вполне сопоставимо с данными литературы (На11,1933).

• Исследование физико-химических свойств протеиназы.

Для установления субъединичной структуры и определения молекулярной массы выделенной протеиназы проводили ее электрофорез в денатурирующих условиях в пластине ПЛАТ в* присутствии!! 2-меркантозтанола и БОБ. На электрофореграмме, полученной после фиксации и окраски на белок, присутствует лишь одна белковая зона, из чего был сделан вывод о том, что исследуемая протеиназа представлена единственной полипептидной цепью с молекулярной массой около 31,000 Да.

Субстратную специфичность выделенного фермента определяли по отнояенип к бедо»вкм (естественным нефиэиологическим)-м синтетическим (искусственным нефизиологическим) субстратам. В качества белковых субстратов использовали следующие белки: бычий сывороточный альбумин, гемоглобин и казеин. Аягивность определяли нингидриновым методом по приросту

100 '

50 "

!

I

!

БОА

1ГЬ

казеин

0.1 0.05

Гли

Лей

Фал

Т ?,'дт

Т Лс* Глн

I I т

Рис.6 Специфичность протеиназы по отношению к белковым субстратам.

Рис.7 Специфичность протеиназы по отношении к синтетическим субстратам

Стадия общий V» конц. обв&я удельн. I ; j : выход (очи-;

очистки белок белка активн. активн. ,стка

мг мл ИГЛ'Л ерш ерт/ш1 * !

Гомогенат i ;

ткани 323 95 3.4 188575 584 100 1 - I

Сракция ■ 1 i

вакуолей 1.28 4 0.32 5320 4156 2.82 1 7.1 i

Ионообменная ! 1

хроматография 0.40 2 | 0.20 451S 11298 2.40 j 19

Аффинная !

хроматография 0.05 1 ; 0.05 4255 85100 2.26 145

Таблица 1.

Очистка вакуолярной прстеиназы из 35-дневной культуры т'кани Rauwolfia serpentina.

- 13 -

<х-аминогрупп. Согласно полученным данным (рис.6) наибольшую активность выделенная вакуолярная прстеина'за проявляет по отношению к бычьему сывороточному альбумину, несколько меньшую - к гемоглобину (62 % исходной) и наименьшую активность по отношению к казеину (33 X исходной).

В качестве синтетических субстратов для определения субстратной специфичности использовали бутилоксккарбо-нил-аминокислотные эфиры п-нитрофенола Как видно из результатов, представленных на рис.7, наиСольсую активность протеиназа проявляла по относе нив к зфирам в1у (0348-0.098) я Ыи (0343-0.064), а наименьшую - к эфлрам (31п (3348-0.002) И Азп (0343-0.004).

3 работе изучали такте влияние ингибиторов, ионов металлов и некоторых реагентов на активность протеиназа Было-показано, что из всех исследованных шигйоторов и реагентов максимальным кнгкбкружда эффектом обладал ингибитор проте-иназ аспарагипового типа пепстаткн: з концентрации 80 мкы он подавлял 99 X ферментативной активности. Такие ингибиторы проте?а1р.з как дорзхлормеркуробекаоат, фенияметидсульфо-иилфторид и ЕОТд в концентре-дая;' 1, 2 и б «моль соответственно не оказцваги ¡отйбирувдэго действия на протемназу. йонк чЛМз1*!? Саг*. также как лТФ и 2-шркаптоэтанол практически нэ снижали активности теследуе'мого фермента.

Таким сбравси, учитмвя рН-оптимум выделенной вакуолярпоа пг-отс-иазы, а такда дашшэ ингибиторного анализа, мы отнесли йсследуе^ай '¡йриеят к классу кислых (аспарагиновьн) про-то.адяз.

Изучение параметров кругооборота поотеинааы * -1 з присутствии ф'гго! ормонов.

В п.гсотз по изучен»«) обмена фермента использовали антитела к нему из сыворотки иммунизированных протеиназой кроликов. Для доказательства их моноспецифичности и определения титра использовали ¡содьцёвсй тест, радиальную иммунодиффузию в агаровом геле, а также электрофорез в денатурирующих условиях преципитатов антиген-антитело.

Кольцевой тест показал наличие в ангисыворотке антител к протеиназе, а радиальная иммунодиффузия с адиквотами, взятыми на разных этапах очистки фермента (вакуолярный солюби-лизат, ионообменная и аффинная хроматографии), подтвердила

ионоопецифичяосгь полученных антител. Анализ преципитатов, полученных после инкубации ачтисызоротки с вакуолярным со-любилизатом. содержащим г.ротеиназу, проводили при помою? электрофореза в 10 2 ПААГ с SDS. Иммунопрец;;питати тршда промывали раствором, содержаще О, 9 7. N'aCl, 0.1 Z SDS и 0.5 X. Triton Х-100. После проведения электрофореза с последующим окрашвашем Cumassi R-250, было выявлено три белковых зоны, соответствующих тяжелым, легким цепям иммуоглобулк-нов и лротеиназе.

Кругооборот протеиназы изучали в норме (при гырашвании культуры в стандартных условиях) и в присутствии фитогормо-нов. В работе использовали радиоизитопный метод, основанный на определении внутриклеточного уровня введенной in vivo радиоактивной аминокислоты, которая включается г. синтезированные de novo белки. По изменению количества аминокислот, содерзкаида радиоактивные изотопы в составе исследуемых полипептидов, рассчитывали степень деградации белка в течение определенного промежутка времени. Необходимо было предотвратить возможную реутилизации

3H-Leu. с этой целью через два часа после введения s питательную среду изотопа JH-Lc.i (200 wkCu) вносили 8 ыг немэ-ченного лейцина.

Исходя из полученных экспериментальных данных били рассчитаны константы скорости синтеза и деградации протеиназы, а также время ее полуобновления и концентрация, которые вместе с аналогичными параметрами для общего белка и супе-роксиддисмутазы (СОД)(Воробьева, 1989) Rauwolfia serpentina приведет; в табл.2. Из сопоставления приведенных значений видно, что протеиназа составляет всего лишь 1/700 часть общего белка, а количество супероксиддисмутазы превышает количество протеиназы в 35 раз. Однако, скорость кругооборота протеиназы (Ц-2.25 час) намного вше соответствующих параметров для общего белка (Ь^-Г.бб сут) и СОД (t.,-6.13 сут). Для протеиназы характерна также высокая константа скорости деградации (К<( -0.31 час ), превышающая таков, ю для обиего йелкл и СОД в 30 и 40 раз соответственно. Константы скорости синтеза для протеиназы и общего белка близки (Ks-29 и 35 мкг/час соответственно), но почти в 10 раз превышают аналогичный показатель для СОД. Таким образом, очевидно, что не-

- 1Б -

Параметры кругооборота Внутриклеточный белок Вакуолярная прогеиназа - сод

Концентрация фермента, Е. мкг/г ткани 7460 10 347

Бремя "полулгазяи". t^/2. 3.65 сут 2.25 час 6.13 сут

Константа скорости синтеза. мкг/г час ■ 35.1 29.05 !

| Понстанта

i скороати i

: деградации, 0.004 0.31 0.008

1 г, -»

i Kj, час

I

Таблица Сравнительная характеристика параметров кругооборота общего белка, закуолярной протеи-иавы и СОД из культуры ткани Rairaolfia serpentina.

обходимая концентрация кислой вакуоляркой протеиназы тод-дерлдаается за счет строгого баланса нолДУ достаточно высокими (по сравнению с другими белками) скоростяк»: синтеза и распада этого фзрменга, я может быть очень быстро изменена и скорректирована в соответствии с метаболическими потребностями клетки. Бее эти черты, как указывалось в обзоре литературы, характерны для ключевых, регуляториых ферментов обмена. Б настоящей работе было показано, wo 35-е сутки роста для каялусной культуры ткани Rauwoifia serpontina являются важной регуляторной точкой, в которой происходят глубокие изменения клеточного метаболизма -именно в этот период прекращается дальнейшее увеличение внутриклеточного белка и начинается его снижение. О другой стороны, при сопоставлении параметров кругооборота белков в культивируемых клетках и в интактных растен'чх (Marco,197ö; Zielke,1971; Zucker, 1972) становится очевидной еледущзя закономерность: в культивируемых клетках кругооборот белков идет намного интенсивнее, для них характерны меньиие значения времени полужизни и большие значения Ks и Kd , хотя я здесь имеются свои исключения (Nadler, 1970; Surrer,1971).

Общую интенсификацию метаболизма в культивируемых клетках можно объяснить исходят иэ того, что, будучи лишенными контакта с другими органами и тканями растения, каллусные клетки вынуздены сами обеспечивать себя всем необходимым и находятся, образно говоря,, в состоянии "перманентного стресса". То есть активацию метаболизма в данном случае следует рассматривать как нормальную приспособительную реакцию к измененным условиям.

В работе также изучали влияние на обмен фермента таких фитогормонов, как кинетин и индолилуксусная кислота

Известно, что ауксины и цитокинины оказывают выраженное воздействие на белоксинтезируюшцй аппарат клетки. Так, ауксины в ебщэм случав активируют транскипцию и трансляцию, а цитокинины повышают активность РНК-полимераз I и II, что ведет к усилению биосинтеза рРНК и мРНК. то есть, в конечном счете, к стимуляции синтеза белка В работе исследовался кругооборот протеиказы - фермента, который сам участвует в регуляции обмена других белков. Полученные результаты (табл.3) свидетельствуют о том, что оба исследованных фэто-

Параметры !

кругооборота Норма Киаетии ИУК 1

Константа

скорости

деградации, 0.31 0.23 0.22

Ка. час-1

Константа

скорости

синтеза, К*, 29.05 3. £0 5.10

ют/г час ■

Концентрация

борые:гга. Я, 10. 64 0, 93 1.12

ЬЧГ/Г Т!СШ!!{

Броня

"ПОДУЙЯ31Ш", 2.20 .2.39 3.15

•Таблица 3. Влжип» фшсгорлзиоа на кругсг^орсге вакуолярной протеина^?.!.

гормона снижают концентрации протеиназы, сдвигая равновесие между скоростями синтеза и распада фермента, в то вреш как время "полужизки" последнего несколько возрастает,

В целом общая реакция растительной клетки на ауксины -это стимуляция роста расгял,яием. Но увеличение объёма клетки не является простым растяжением клеточной стенки, так как последняя при этом не становится тоньше. Следовательно, рост клеточной стенки сопровождается вклгчением в нее вновь синтезированного материала. Синтез компонентов клеточной >./енки может быть вызван, например, активацией функционирующих синтетаз, увеличением скорости их синтеза или снижением скорости деградации, что, в частности, контролируется протеолитическими ферме! тами клетки. Последнее предположение подтверждается полученными наш результатами. Гак. в присутствии индолилуксусной кислоты наблюдали некоторое снижение Кс1 и значительное уменьшение К1( что приводит к 9-ти кратному падению концентрации протеиназы.

К числу общих реакций клетки на цитокинины относят стимуляций деления клеток и задержку старения. Хороко известно, что в процессе старения клетки происходит снижение содержания белка и тРНК. Это подтверждается полученными результатами: снижением-содержания белка в клетках, начиная с 35-х суток- роста и снижением биомассы с 63-х суток. Введение в питательную среду кинетина практически не влияет на деградацию протеиназы. но резко снижает ее синтез, что выражается в 11-ти кратном снижении концентрации фермента.

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вавод о том, что активация роста растяжением и замедление процессов старения, наблюдаемые при введении в питательную среду фитогормонов, обусловлены, в частности, снижением скорости синтеза и концентпации протеиназы, осуществляющей деградацию внутриклеточных белков. Другими словами, вакуолярную лротеина^у асларагинового типа можно рассматривать как посредника в регулягорном действии фитогормонов на растительную клетку.

Прч проведении экспериментов по выделению и очистке протеиназы было отмечено, что протеолитическая активность свежего гомогената при хранении в определенных условиях возрастает, что, возможно, обусловлено присутствием в исходном

- Iii -

образце ингибитора протеиназы и его последующей диссоциацией. Поведенные предварительные исследования подтвердили это предположение. Таким образом, удалось установить наличие низкомолекулярного ингибитора, относительно легко диссоциирующего при диализе, что приводит к почти двукратному увеличению исходной суммарной активности Фермента, фермент-ингибиторное взаимодействие осуществляется, скорее всего, за счет гидрофобных, а не полярных взаимодействий, о чем свидетельствуют опыты с NaCl и тритоном Х-100 (рис.8).

-о-о~НаС1, М

Рис.8 Влияние различных концентраций Три- ' тона Х-100 и NaCI на протзолитетескузо активность сырого клеточного гомогвпата.

шэдш

1. Изучена динамика изменения прот&олитического птенциала в культуре Rauwolfia serpentina. Установлено валюте двух максимумов активности (35-е и 63-е сутки роста) дли кислы:: и один максимум активности (49-е сутки роста) для нейтральных вакуолярных протеиназ.

2. Разработан метод выделения и очистки вакуолярной протеи-нааы из культивируемых клеток. Полученный фермент относится к классу аспарагиновых протеинаа, име^т молекулярную ыассу 31 kDa, оптимум рН 4. 0.

3. Впервые исследован синтез к распад вакуолярной протеина-еы в культуре ткани Rauvolfla serpentina, определена константы скорости сингева и деградации фермента, .его концентрация и Время "полужэнй".

4. Исследовано влияние на обмен протеиназы индолилуксусной кислоты к кинетина, предложена модель их регуляторного действия, в которой аспарагиновая протеин аза играет роль посредника.

vOHOBHb'a результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Комов Е II, ''й'ршшова Н. В., Стрелкова Ы. к., Чзрноборо-дова Л. С. , Самолин КХ А. Выделение и очистка некоторых фермента« лз культуры растительной ткани при помощи би-оаффинноь хрокчгографии//Сборнж тезисов докл. I Всесо-юзн. симпозиум "Препаративная хроматография фнзиол. акт. в-в на полимерных сорбентах" Л ,1088, стр. 17-18

2. Комов В, П., Стрэлкова М. А., Самолин КХ А. Механизмы про-теолива в культуре ткани Раувольфии змеинпй//Тезисы докл. V Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" Швосибирск,1988.т. I.e. 35

3. Комов В. П. , Стрелкова М. А., Самолин SCl А. Выделение и идентификация протеиназ из культуры ткани Раувольфии змеиной//Тезисы докл. Всесошн. конф. "Результаты и перспективы научных исследований по биотехнологии и фармации" Л.,1989, стр.13

4. Самолин Е А. Роль вакуолярных протеиназ в деградации внутриклеточных белков//Тезисы докд. конф. молодых ученых "Творчество молодых ученых - научно-техническому прогрессу" Л, 1988, стр.37

.6. S.E. Manoilov, Y.P. Konov, N, V. Kirtllova, 11A Strelkova, Yu. A. Samolin, US. Chernoborodova, L. A, Nlcolaeva Chromatographic isolation of primary and secondary metabolites from plant cell culture//Journal of chromatography 440, 1988, pp. 53-64

6, Komov V.P., Sanolin Yu. A. . Strelkova M. A. Studies of biosynthesis and stubility of acid proteir. ¡se from Rauwlofla serpentina cultured cellsZ/rtanta, in press

ШГО в.ЗЯЗ t.100 19,12.9Ir. Уч.ияд.лист-1,0 Бесплатно,