Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение ацетилаймалинэстеразы - конечного фермента биосинтеза аймалина в культуре ткани раувольфии змеиной

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение ацетилаймалинэстеразы - конечного фермента биосинтеза аймалина в культуре ткани раувольфии змеиной"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМШШЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ХИШКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

ГБ ОД

? 7 ПНЯ 1Р?7

На правах руколиси

СМИРНОВА МАРИНА ГЕННАДЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ АЦЕТИЛАЙМАЛИНЭСТЕРАЗЫ - КОНЕЧНОГО ФЕРМЕНТА БИОСИНТЕЗА АЙМАЛИНА В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ РАУВОЛМШ ЗМЕИНОЙ

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1096

Работа выполнена на кафедре биологической химии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института.

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор Комов В.П.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор С.Н.Михаилов доктор биологических наук, вед. н.с. Л.В.Пучкова

Ведущая организация: Ботанический институт им.Комарова РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится 199^. в /3г<? час. на

заседании диссертационного Совета К 084.63.01 при Санкт-Петербургском химико-фармацевтическом институте по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат диссертации разослан 1Э9£

Ученый секретарь / ^ »

диссертационного Совета, ^^ / /

кандидат биологических наук Н.В.Кириллова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Представители тропического растения рода Rauwolfia L. семейства Аросупасеае являются продуцентами свыше 100 алкалоидов, многие из которых используются в медицине и обладают ярко выраженным фармакологически активным действием. Корни трех видов раувольфии: R. serpentina Benth, R. canescens L. и R. vomitoria Afz. служат основным лекарственным сырьем для получения ряда высоко эффективных препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний ( резерпин, иохимбин, аймалин, аймалицин). Особое место среди них занимает аймалин, проявляющий высокую противоа-ритмическую активность. Несмотря на важную значимость этого алкалоида для медицинской практики в нашей стране он не производится. Его получение было налажено на Украине на харьковском НПО "Здоровье трудящихся" из импортных корней раувольфии змеиной и раувольфии рвотной. В настоящее время производство аймалина на Украине прекращено и потребность в препаратах раувольфии в нашей стране удовлетворяется линь частично за счет импорта.

В последние годи определились перспективы для биотехнологического подхода к решению данной проблемы, базирующиеся на методе культуры изолированных тканей и органов растений. Так, на базе Ленинградского химико-фармацевтического института (ныне СПХФй) был создан высокопродуктивный штамм К27 каллусной культуры ткани раувольфии змеиной стеблевого происхождения - продуцент аймалина. Однако, основной задачей остается повышение продуктивности культивируемых клеток данного штамма. Одной из причин, приводящих к снижению содержания конечного продукта биосинтеза - аймалина в ткани, выступает сильная аккумуляция его ацетилированных предшественников. По этой причине особенно перспективной и актуальной является проблема изучения ферментных систем, осуществляющих превращение ацетилированных интермедиатов, а также механизмов регуляции этих процессов. В связи с тем, что в штамме К27 культуры ткани раувольфии змеиной наблюдается повышенное, по-сравнению с другими алкалоидами аймалинового пути, накопление ацетил аймалина, наибольший интерес представляет исследование последнего фермента биосинтеза - ацетиаймалинзстеразы (ААЗ), катализирующей реакцию гидролиза ацетилаймалина до конечного продукта биосинтетического пути - аймалина.

Целью работы является изучение активности, свойств и параметров объмена ацетилаймалинэстеразы в штамме К27 культуры ткани раувольфии змеиной.

Задачи исследования

1. Изучение динамики активности ААЭ, концентрации белка, массы ткани, содержания аймалина и индолиновых алкалоидов в процессе культивирования биомассы. Исследование зависимости уровня накопления аймалина от уровня активности ААЭ.

2. Изучение спектра алкалоидов и ферментов их синтеза, относящихся к классу эстераз, в культуре ткани раувольфии змеиной.

3. Разработка метода выделения аймалина из культивируемых клеток.

&. Разработка метода выделения и очистки ААЭ.

5. Изучение физико-химических и кинетических свойств ААЭ.

6. Изучение обмена ААЭ в культуре ткани раувольфии змеиной.

В предлагаемой работе был выделен и охарактеризован последний фермент аймалинового пути, осуществляющий ацетилаймалина с образованием аймалина и уксусной кислоты - ААЭ. Данные, касающиеся исследованию ААЭ, представляют особый интерес, поскольку в нашей стране не проводилось ранее работ, связанных с изучением отдельных ферментов биосинтеза аймалина. и в частности ААЭ, а результаты подученные в институте фармацевтической биологии университета города Мюнхена в Германии в большинстве случаев значительно отличаются от полученных нами.

В диссертационной работе впервые показана зависимость между активностью ААЭ и содержанием аймалина. наличие мембраносвязанной формы данного фермента, аллостерическая природа и сшигомерная структура ААЭ.

В настоящей работе представлены данные по обмену ААЭ в штамме К27 каллусной культуры ткани раувольфии змеиной: определены константы синтеза и деградации, время "полужизни" и концентрация фермента в пассируемой культуре.

Был разработан метод определения суммарной эстеразной активности. позволяющий количественно расчитать содержание ферментов данного класса в биомассе раувольфии змеиной.

С целью установления спектра и количества индивидуальных алкалоидов в исследуемых образцах был предложен способ анализа проб методом ВЖХ.

Разработан новый метод выделения и очистки аймалина из культуры ткачи раувольфии змеиной с использованием колоночной хроматографией на аффинном адсорбенте.

Теоретическая и практическая значимость. Диссертационная работа имеет как практическое, так и теоретическое значение. Первое связано, прежде всего, с разработкой нового метода выделения аймалина из культивируемых клеток раувольфии змеиной с помощью колоночной хроматографии на аффинном адсорбенте (ААТФ) типа азоад-сорбент (АЗС). Предложенный способ выделения этого ал!садоида позволяет значительно сократить число стадий, необходимых для его получения в гомогенном состоянии, существенно уменьшить число операций, требующих использования вредных органических растворителей, а также повысить выход конечного продукта.

Теоретическое значение работы связано с исследованием метаболизма ЛАЗ з штамме К2? культуры ткани раувольфии змеиной. Был впервые исследован обмен ААЗ в пассируемой культуре раувольфии змеиной, результаты которого углубляют наши знания об обмене индивидуальных белков в культуре растительной ткани. Полученные данные содержат информацию о скорости синтеза, распада, времени "полужизни" и содержании фермента в ткани. Результаты исследования физико-химических и кинетических свойств ААЭ, последнего фермента, принимающего участие в формировании аймалина - конечного продукта сложной цепи биосинтетических превращений, дополняют наши представления о путях и механизмах его образования, а также позволяют не только охарактеризовать ЛАЗ, но и предположить определенную регуляторную роль этого фермента в процессе биосинтеза аймалина. Кроме того, оценка метаболизма культивируемых клеток растений создает определенную теоретическую базу для направленного синтеза вторичных соединений, являющихся ценными лекарственными препаратами, а изолирование и изучение свойств ферментов, ведущих основные реакции образования этих метаболитов, может стать необходимой предпосылкой для осуществления внеклеточного синтеза ряда важных фармакологически активных веществ растительного происхождения.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 149 страницах, содержит 14 таблиц и 30 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов

и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, который включает в себя Т'Л наименований, из которых - 103 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа была проведена на стеблевой модели культуры ткани Ra-uwolfia serpentina Benth.- штамме К27. Культивирование осуществлялось следующим образом: ткань в количестве 5г. в возрасте 29-31 суток пересаживали на агаризованную питательную среду, разработанную Воллосовичем А.Г. и соавт. (1977). Культуру выращивали в темноте при температуре 27° и влажности 701.

Для определения содержания индолиновых алкалоидов применяли-метод с использованием концентрированной азотной кислоты, предложенный Воллосовичем А.Г. (1984).

Исследование спектра алкалоидов осуществляли методом ТСХ в системе хлороформ-метанол (9:1).

С целью расчёта количественного содержания аймалина в пробах применяли метод ВЖХ, проводимый на приборе "Милихром-4" (Россия). Для этого пробу объемом 5 мкл наносили на колонку, заполненную сорбентом "Silosorb 600". Здюирование вели ступенчатым градиентом: хлороформ, хлороформ-метанол (10:1). хлороформ-мета-нол-25% NH4OH (10:1:0,2),(10:1:0,4). Регистрация показаний осуществлялась на компьютере "Искра-1030". Обработку результатов количественного содержания аймалина в пробах проводили с использованием программы "Chrom exe".

Спектрофотометрические характеристики аймалина снимали на приборе "Specord M 40" (Германия).

Очистка аймалина из культивируемых клеток осуществлялась по следующей схеме: сушка ткани при Т=60°С, измельчение, экстракция 0,5 H раствором уксусной кислоты, аффинная хроматография на азо-адсорбентах КХ или МРН в ступенчатом градиенте NaCl (0.01М-1М) в 0,1Н НС1. Далее пробы, содержащие аймалин, экстрагировали хлороформом и органический растворитель выпаривали.

Для определения злектрофоретического спектра зстераз использовали метод, предложенных Сафоновым В.И. (1071).

Для выделения и очистки ААЭ из культуры ткани раувольфии змеиной навеску ткани гомогенизировали с 0,1М калий-фосфатным бу-

ферсм (рН=7,5), содержащим ß-меркаптсэтэнол и тритон Х-100, при соотношении ткань-буфер 1:1,6. Гомогенат центрифугировали в тече-ни 40 мин при 32000 s и из полученного супернатанта высаливали ААЗ при насыщении раствора сульфатом аммония от 0,3 до 0,75%. Далее очистку осуществляли гельхроматографией на 6-150 и ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-сефацеде и СМ-сефадексе. Все колонки были уравновешены 0,015 М калий-фосфатным буфером с рН=7,5, содержащим ß-меркаптоэтанол и тритон Х-ICO. Элюирозакие проводили этим же буфером.

Для определения активности МЭ использовали метод, предложенный Stöckigt J. (1986). Исследуемый раствор инкубировали с Н3-ацети~ лаймалином в течении 10 минут при t=3?°C. Реакцию останавливали добавлением раствора активированного угля с концентрацией (60 иг/т), осадок отделяли центрифугированием, а в отобранной алгак-вот8 определяли радиоактивность на жидкостносцинцилляционгом счетчике Mark-HI (Delta Medical .Германия). Белок рассчитывали по методу Lowry (1951).

Злектрофорэтическмй анализ белков проводили в трис-глициновой буферной системе но методу Laemmiy (1970) в 7,5 и 107. ПААГ. Для выявления локализации белковых зон на электрофореграммах при электрофорезе проб, содержащих высокоочищенный фермент, гель фиксировали в 50% ТХУ и пластины окрашивали по методу Ansorge (1982). При определения молекулярной массы ААЗ для обнаружения зон локализации фермента и маркеров использовали 0,1% кумасси R-250.

Для расчета процентного содержания фосфодшшдов в молекуле АДЭ применяли метод Bartlett (1959).

Для изучения обмена ААЭ и тотального белка в культуре ткани раувольфии змеиной использовали радиоизотопный и иммунохимический методы анализа. Радиоизотоп (С14-лейцин) вводили в ткань в асептических условиях стерильной иглой из расчета 150 мкКи на 10 г каллуса. Затем через два часа вносили десятикратное количество немеченного лейцина для предотвращения реутилизации изотопа. Обмен ААЭ и общего белка исследовали на 1-6 сутки после введения С14-лейцина. Радиоактивность проб оценивали на сцинтилляционном счетчике. Содержание фермента рассчитывали исходя из общей активности ААЭ и активности 1 мг гомогенного препарата, полученного в результате выделения и очистки фермента. Константы скоростей син-

теза и распада ААЭ и тотального белка определяли по методу Шимке (Schimke et al.,1975), время "полужизни" - по методу Ариаса (Arias et al.,1969).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили, используя критерий Стьюдента. Различия считались достоверными при уровне вероятности Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И Ж ОБСУЖДЕНИЯ

Изучение динамики накопления аймалина, индолиновых алкалоидов и роста биомассы раувольфии змеиной в процессе культивирования ткани.

В течении 85 дней выращивания культуры ткани раувольфии змеиной каждые 5 дней определяли содержание в клетках аймалина, индолиновых алкалоидов и пророст биомассы ткани. Как видно из рис.1 для исследуемого штамма характерна "З-образная" кривая роста биомассы с промежуточным плато, соответствующим 35-45 сутках культивирования. Замедление темпов увеличения массы ткани на данных сроках роста обусловлено, по-видимому, тем, что в культуре ткани присутствуют клетки разной плоидности, деление которых разобщено во времени. Неравномерность распределения клеток по числу генов за период всего пассажа и разные сроки их деления могут приводить к относительному замедлению, а также скачкам на "5-образной" кривой роста биомассы, который мы и наблюдаем на 50-х сутках культивирования.

Накопление аймалина и индолиновых алкалоидов в клетках до 50-х суток роста ткани было относительно низким. Затем, на 55-х сутках культивирования был отмечен резкий скачок их аккумуляции, отмеченный до 65-70 суток и соответствующий стационарной фазе роста биомассы. Увеличение содержания аймалина в ткани во время экспоненциальной фазы роста на 15-х сутках культивирования может быть вызвано следующими причинами: стрессовыми факторами, обусловленными переносом инокулюма на свежую питательную среду и медленной адаптацией к ней после механического воздействия, а также активно идущими процессами деления или растяжения клетки, которые могут приводить к уменьшению количества алкадоэдов на ранних сроках культивирования (30 сутки) в результате их реутилизации и/или разбавления другими соединениями. Та}сим образом, сопоставляя динамики накопления индолиновых алкалоидов, аймалина и роста биомассы можно сказать, что биосинтез данных алкалоидов подчиняется общим закономерностям, выявленным для обмена вторичных метаболитов в культивируемых клетках растений, а именно, образование в клетках биологически активных веществ, в том числе и алкалоидов, приурочено к определенным фазам клеточного цикла.

в!

гл

I.»

'л

1.0

06

С2

>° к сух. м

* — >—х—л—* —X_

/60

1С

(О

1,0

/С 20 }0 1,0' 50 СО 10 £0 50

сутки

Рис.1 Индолиновые алкалоиды, аймалин, ацетилаймалин и масса ткани в процессе роста культуры

- - масса ткани

— - индолиновые алкалоида

---- - аймалин

-х-* - ацетилаймалин

- и -

Исследование спектра алкалоидов в культуре ткани раувольфии

змеиной.

Изучение состава алкалоидов, содержащихся в культивируемых клетках на 70-х сутках роста, выявило наличие в них 4 алкалоидов, два из которых принадлежали к классу индолиновых - аймалин и аце-тилаймалин, и один к классу иохимбиновых - серпентин. Четвертое основание не идентифицировано. Процентное содержание аймалина на 70-ые сутки культивирования ¡¡о данным эксперимента составляло около 85-90% от общей суммы алкалоидов. Максимальная аккумуляция ацетилаймалина была обнаружена на более ранних сроках роста биомассы (30-35 сут) и соответствовала 40-45% . Изменение спектра алкалоидов в исследуемой ткани в течении всего пассажа выявлено не было.

Выделение аймалина из культуры ткани раувольфии змеиной .

Для выделения аймалина была взята культура в возрасте 70-суток. Предложенный и разработанный нами метод извлечения аймалина из растительного сырья включал в себя следующие стадии: экстракцию суммы алкалоидов раствором уксусной кислоты, колоночную хроматографию на азоадсорбентах аффиного типа КХ или МРН, экстракцию аймалина хлороформом. После удаления растворителя был получен белый кристаллический порошок высокоочищенного алкалоида, спектральные характеристики которого полностью соответствовали характеристикам стандартного аймалина производства "Sigma". На рис.2 представлен профиль элювди алкалоидов с носителя КХ. Чистоту подученного препарата аймалина оценивали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокожидкостной хроматографии (ВЖХ) (рис.3 и 4). Аналогичные результаты были получены при использовании сорбента МРН. Как видно из рис.3 оба сорбента обладают селективностью по отношению к некоторым алкалиодам. Так, было обнаружено отсутствие сорбции таких оснований, как ацетилаймалин и неидентм-фивдрованный алкалоид. Сравнение сорбционной способности азоад-сорбентов МРН, содержащего в качестве лиганда морин, и КХ. в котором роль лиганда выполняет катехин, показало, что второй обладает сорбционной ёмкостью в 5 раз большей по аймалину, чем первый. В результате использования разработанного метода выделения аймалина из каллусной ткани раувольфии змеиной удалось получить из 1,0 г. высушенной мелкодисперсной культуры 70-ти суточного возраста1V47,5 мг алкалоида (выход 72.2%). Данные представлены в

табл. 1.

q¿2 Ш

Ofi

ар

СрЛ

о h

i i

i )

' i

I 1

' l i .

и

'3

ции

Рис.2 Профиль выхода проб при элюированин алкалоидов с КХ ---- сумма алкалоидов, -- аймалин

Таблица 1

Выделение аймалина из культуры ткани р.змеиной на сорбенте КХ

Стадия Концентрация Количество Масса су- Объем, Выход,

выделения алкалоидов, алкалоидов, хой ткани,

мг/мл мг мг мл %

1. Экстракция

2. Фильтрация

и сорбция 0,95

3. Промывка

колонки 0,04

4. Злшрование

0,03 Н NaCl 0,22

400.0 15,0

9,6

0,4

7,1

13,2 100,0

10,0

31,3 72,2

)

t

з

i

i

/я

0 о ( 1

0 0 П А Л

U о и еГ> о

Рис.3 Тонкослойная хроматограбия проб с сорбента КХ

I - суперкатант И - отработанный экстракт

3 - фракция I'1 с КХ

4 - стандартный аймалина

5 - ацетилаймалин

6 - стандартный сеспецтин

7 - фракция $ с КХ

/ 2 1 ь S е ■/

2 4 S g ю i2

2 <■ 6 8 'С /2

JL

2 4 5 it /(7 «

Рис. 4 Исследование проб с сорбента КХ методом ШХ

а) стандартный аймалин; б^ стандартный серпентин в) фракция г) фракция

Динамика изменения активности ацетилаймалинзстеразы и содержания тотального бедка в процессе роста ткани .

Исследование изменения активности ААЭ в течение 85 суток роста культуры показало, что оно описывается кривой с тремя максимумами, приходящимися на 15, 45 и 70 сутки культивирования и совпадающими по времени с концом экспоненциальной и стационарной фазами роста (рис.5). Использование для экстракции неионного детергента тритона Х-100 приводило к увеличению активности ААЭ в супернатанте на 13-48%, что свидетельствовало о наличии в ткани двух форм фермента - мембраносвязанной и цитоплазматической, а также о преимущественном содержании цитоплазматической формы ААЭ.

Из сопоставления динамик активности ААЭ и накопления в ткани продукта её синтеза - аймалина, видно, что подъему активности фермента в клетках соответствует возрастание темпов аккумуляции в ткани аймалина. а приходящийся на 60-70 сутки её максимальный уровень совпадает с максимальным уровнем накопления алкалоидов в культуре. С другой стороны, уменьшение активности ААЭ приводит к снижению содержания аймалина (30 сут) или замедлению темпов его аккумуляции в клетках (50 сут). Выявленная закономерность указывает, что ААЭ занимает особое место в ряду ферментов, участвующих в биосинтезе аймалина.

Сравнение динамики активности ААЭ и концентрации белка в процессе культивирования ткани показало, что снижение уровня активности фермента сопровождается увеличением концентрации белка, и наоборот, повышение активности ААЭ соответствовало уменьшению прироста содержания белка в биомассе. Как известно, механизмы и условия, блокирующие клеточную пролиферацию и активный рост ткани. являются одновременно и механизмами, обеспечивающими синтез и активацию ферментов вторичного метаболизма. Таким образом, нами была установлена взаимосвязь между биосинтезом аймалина, активностью ААЭ и процессами основного метаболизма ответственными за рост растительной ткани.

Исследование электрофоретического спектра зстераз в штамме К27 культуры ткани раувольфии змеиной.

Было получено 9 зон локализации ферментов, обладающих эсте-разной активностью. Они были представлены на злектрофореграммах в области выстромигрирующих - 2 зоны, среднемигрирующих - 4 зоны и

ю го л? чС ¡о ¿о '?о ¿V

сутки

Рис.5 Активность ААЭ и концентрация белка в процессе роста ткани

- - активность ААЭ (буйер с тритоном Х-100)

- - - активность ААЭ (буфер без тритона Х-10СЛ ---- - концентрация белка

медленномигрирующих к аноду форм ферментов - 3 зоны.

Выделение и очистка ААЭ из культивируемых клеток раувольфии

змеиной.

Выделение и очистку ААЭ из биомассы раувольфии змеиной проводили по следующей схеме: получение клеточного гомогената, высаливание, гель-хроматография на G-150, ионообменная хроматография на ДЕАЕ-сефаделе и СМ-сефадексе. В результате были получены две фракции ААЭ с высокой степенью очистки и (210 и 400 раз) и удельной активностью 25-54 106 DFM/мг (табл.2). Методом электрофореза было установлено, что обе фракции идеинтичны и содержат по две изоформы ААЭ. Используя предложенную схему выделения ААЭ, из 20 г. ткани было получено 0,3 мг гомогенного фермента. Содержание ААЭ на грамм ткани составило 44,5 мкг, а доля по отношению к общему белку - 0,3%.

Исследование физико-химических свойств ААЭ

Методом электрофореза в 7,5% ПААГ были установлены молекулярные массы двух изоформ ААЭ, которые составили 130i5 и 140±5 кДа. Электрофорез в денатурирующих условиях в пластинах с 10% ПААГ выявил наличие двух субъединиц фермента с массой 33*3 и 38*3 кДа. Из сопоставления молекулярных масс субъединиц и олигомеров следует, что одна из изоформ фермента состоит из одинаковых мономеров. а другая, по-видимому, гетерогенна. Тот факт, что две исследуемые изоформы ААЭ имеют разный набор субъединиц позволяет предположить, что они могут иметь различия на уровне первичной структуры, т.е. являются изоферментами, однако, наиболее вероятно, что одна изоформа является продуктом посттрансляционной модификации, связанной, по всей вероятности, с действием специфических протеаз. Изучение кинетики ААЗ показало, что исследуемая нами эстераза относится к аллостерическому типу ферментов. На рис. 6 показан сложный характер "S-образной" кривой насыщения фермента субстратом, выражающийся в наличие промежуточного плата. Появление промежуточного плата на кривой зависимости v от S может быть обусловлено рядом причин. Чаще всего это связано с наличием в системе нескольких форм аллостерического фермента, характеризующихся различной степенью кинетической кооперативности по субстрату. или относительно медленной изомеризацией фермента под действием субстрата. Кроме этого, причиной наличия промежуточного

Таблица 2

Выделение ААЭ из культуры ткани раувольфии змеиной

Стадия Суммарная Удельная ак- Белок Степень ВЫХОД,

очистки активность фермента, тивность , очистки

DFM DFM/мг мг X

Гомогенизация

ткани и цен-

трифугирова- 34 760 ООО 121 ООО 288,00 - 100,0

ние

Высаливание 17 400 ООО 99 220 175,40 0,82 50,0

Гель-хрома-

тография на

Б-150 1 пик 1 460 ООО 766 600 1,80 6,4 л о ■±, «с.

2 пик 15 700 500 242 ООО 64,60 2,0 40,3

Концентрат

1 и 2 пита

с 6-150 13 600 ООО 220 400 61,70 1,8 39,1

Очистка на

ДЕАЕ-сефа-

цел 1 пик 15 300 ООО 968 ООО 16,30 8,0 45,5

2 пик 3 800 ООО 25 410 ООО 0,16 210,0 10.9

Концентрат

1 пика с

ДЕАЕ-сеф. 10 850 ООО 748 200 14,50 6,2 31,2

Очистка на

Ш-сефад.

1 пик 883 220 6 292 ООО 0,15 52,0 2.6

2 пик 6 530 400 54 420 ООО 0,13 399,6 17,5

Рис. 6 Зависимость скорость ферментативной реакции от концентрации субстрата

плата может являтся особый характер взаимодействия активных центров в молекуле фермента, когда отрицательное кооперативное взаимодействие центров сменяется на положительное по мере насыщения их субстратом. Помимо вышеперечисленных причин образование промежуточного плата может быть вызвано гомотропным механизмом активации фермента, при котором роль положительного аллостерического эффектора выполняет субстрат. Так, как. при электрофоретическом разделении фракций, содержащих высокоочищенный фермент, было обнаружено наличие двух белковых зон, то появление плата на кинетической кривой в нашем случае может быть связано с присутствием в реакционной смеси двух изоформ фермента с разной степенью коопе-ративности по субстрату. Однако, нельзя отрицать и возможность активации ААЭ по гомотропному механизму.

Изучение зависимости активности ААЭ от рН среды показало, что фермент имеет оптимум рН равный 6,0 в калий-фосфатном буфере и 6,5 в цитратном, причем, уровень активности ААЕ в первом буфере был выше, чем во втором. Данный эффект возможно связан с влиянием ионов солей буферных систем на состояние функциональных групп активного центра в молекуле фермента (рис.7). Кроме того, была выявлена резкая активация ААЭ при кислых значениях рН. Как извест-

но, кинетическая кооперативность по субстрату для аллостерических ферменов также является функцией от рН и увеличение кислотности среды может приводить к усилению положительной кооперативное™ по аллостерическим лигандам.

Зависимость активности ААЗ от температуры описывается кривой с двумя максимумами на 15°и 40° (рис.8). Наличие двух температурных оптимумов может быть связано с присутствием в растительных клетках двух изоформ фермента. Установлено, что мсмбраносвязанная

Рис.? Зависимость активности ААЗ от рН среды

ААЭ имеет небелковый компонент, который может оказывать существенное влияние на термостабильность этой изоформы фермента.

Исследование небелкового компонента мембраносвязанной ААЗ выявило, что он является фосфолипидом и его доля составляет около 1 У. от общей массы белка.

Изучение влияние продуктов реакции на активность ААЗ показало, что увеличения концентрации аймалина в реакционной смеси (О - 20 тМ) и уксусной кислоты (О - 90 йМ) не приводили к снижению активности фермента (табл.3).

Протекторные свойства аймалина в отношении ААЭ были изучены на примере тепловой денатурации. Присутствие в реакционной среде алкалоида в концентрации 10 тМ обеспечивало 100%-ое сохранение

ферментативной активности при инкубации фермента как при 1=40° в

зоо

200

/00 -

о л? ~го Хь ~еЬ Т^Б

Рис 8. Зависимость активности ААЭ от температуры

Таблица 3. Влияние продуктов реакции на активность ААЭ

Концентрация Температура, Время инкубации, Остаточная в пробе. активность

ШМ °С мин X

аймадин

40 20 100

5 40 20 100

10 40 20 100

15 40 20 100

"20 40 20 100

уксусная кислота

40 20 100

10 40 20 100

30 40 20 100

60 40 20 100

00 40 20 100

Таблица 4. Протекторная роль аймалина при температурной

инактивации ААЭ

Концентрация Температура, Время ин- Остаточная К активности

аймалина, кубации, активность, до инкубации,

m м °С мин X %

- - - - 100

- 20 60 100 100

10 20 60 113 113

- 40 60 100 87

10 40 60 115 100

- 55 90 100 53

10 55 90 187 100

течение 1 часа, так и при 1=55° в течение 1,5 часов. Причем, в последнем случае, добавление в реакционную среду аймалина предохраняло фермент почти от 50%-ой инактивации (табл.4). Обнаруженный нами эффект стабилизации ААЭ обусловлен, по-видимому, способностью аймалина, связываясь с активным центром фермента, способствовать стабилизации его комформации и предотвращать тем самым снижение каталитической активности фермента в условиях тепловой денатурации, а также наличием некоторых зффекторных свойств этого алкалоида по отношению к ААЭ.

8 работе было изучено влияние ингибитора сульфгидрильных групп ларагидроксимеркурийбензоат натрия (ПГМВ) и гидроксигрупп -метилфенилсульфофшуорита (МФСФ) на активность ААЭ. Оба этих соединения способны, связываясь с определенными функциональными группами активного центра, приводить к снижению или паяной потери активности фермента. Показано, что ПГМВ и МФСФ оказывают ингиби-руювдй эффект (табл.5). Однако, как видно из таблицы, ПГМВ в концентрациях от 1 до 5 тМ снижал активность ААЭ на 30%, в то время как ШСФ при концентрации 5 тМ ингибировал фермент на ЮОХ, а при концентрации 1 тМ не оказывал воздействие на ААЭ. "Из полученных данных

следует, что для проявлений ферментом каталитической активности необходимо наличие ОН-групп, т.е. в состав активных центров ААЭ входят аминокислотные остатки серина. во-вторых, принимая во внимание большую степень ингибирующего воздействия метилфенилсуль-фофлуорита по сравнению с парагидроксимеркурийбензоатом натрия, можно предположить, что сериновые группы локализованы в основном в каталитическом участке активного центра, в то время как цистеи-новые группы находятся, главным образом, в контактном участке или играют роль в поддержании комформационной структуры белковой молекулы фермента.

Наличие в активном центре ААЭ аминокислотных остатков серина, относящихся к нуклеофильныы группам ферментов, может свидетельствовать о том, что ускорение реакции деацетшшрования 17-0-ацетилаймалина протекает по механизму ковалентного нуклеофильного катализа.

Таблица 5. Влияние некоторых ингибиторов на активность ААЭ

Ингибитор Концентрация ингибитора Остаточная фермента-в пробе, т М тивная активность, %

100,0

ПГМБ 1,00 70,8

2.00 70.5

2,50 70,3

5,00 70,0

Ш 1,00 100,0

2.00 51,2

2,50 10.3

5,00 0,0

В результате сравнения полученной нами ЛАЗ и АЛЗ, выделенной из суспензионной культуры ткани раувольфии змеиной и охарактеризованной J.Stockigt (1986) было показано, что оба фермента обладают разной структурой, клеточной локализацией, физико-химическими и кинетическими характеристиками. Так, ААЗ из суспензионной культуры ткани проявляла максимальную активность при pH равном 7,5 в калий-фосфатном буфере, температуре 37°, обладала кинетикой, подчиняющейся закону Михаэлисз и Ментена, являлась мономером и имела исключительно цитоплазматическую локализацию. Отмеченные нами различия в свойствах ферментов обусловлены скорее всего тем, что они выделены из разных штаммов клеточных культур. Так, как уже отмечалось, предметом исследования немецких ученых был дикий штамм суспензионной культуры ткани раувольфии змеиной. Мы работали с каллусной культурой стеблевого происхождения суперпродуцента по аймалину - штаммом К 27, полученным в результате прямого воздействия мутагенов и подбором питательной среды путем моделирования трофики клетки. Это привело, по всей видимости, к значительной дес.табализиции генома, в результате которой белковых метабо-дизм полученного штамма стал сильно отличаться от дикого. Эти отличия и выявили результаты наших экспериментов. Не исключено, что и посттрансляционные процессы также претерпели существенное изменение.

Изучение параметров кругооборота ААЗ и общего белка в культуре ткани раувольфии змейкой.

В работе по изучению обмена фермента использовали антитела к нему из сыворотки иммунизированного ААЭ кролика. Радиальная т-мунодиффзия в агаровом геле подтвердила моноспецифичность полученных антител. Исследование методом электрофореза в 10% ПААГ с SDS преципитатов, полученных после инкубации антисыворотки с су-пернатантом, и окрашивание пластин Cumassi R-250 выявили наличие на электрофореграммах- четырех белковых зон, соответствующих двум субъединицам ААЭ, а также тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов.

С целью изучения обмена ААЭ использовали радиоизотопный метод, основанный на определении внутриклеточного уровня введенного in vitro радиоизотопа. По изменению количества аминокислот, содержащих радиоактивный изотоп в составе исследуемых полипептидов,

Таблица 6. Параметры обмена ААЗ, СОД и альдолазы в культуре ткани pay воль фии змеиной

Параметр обмена ААЭ Кислая вакуоляр-СОД ная протеаза Альдо-лаза Общий белок

Концентрация фермента, мкг/г 58,68 347,70 10,00 325,00 16500,00

Время полужизни, Ьц/г, сут 5,46 3,65 2.25 час 3,42 10,73

Константа деградации, Ка. сут-1 0,12 0,19 7,44. 0,21 0,07

Константа синтеза. К3. мкг/г-сут 7.45 66.06 697.20 70,21 1072,50

расчитывали степень деградации общего белка и ААЭ в течение определенного промежутка времени. Исходя из полученных экспериментальных данных по скорости распада и концентрации фермента и белка в ткани были расчитаны скорости их синтеза и времена полуобновления. В табл.6 представлены данные по обмену ААЗ и общего белка в сравнеии с аналогичными параметрами для супероксиддисму-тазы (СОД) (Воробьева. 1989) и альдолазы (Комов и соавт. 1987), полученными из этого же штамма.

Из сопоставления приведенных значений видно, что количество СОД превышает количество ААЭ в 6 раз, альдолазы в 5.5 раз. а содержание вакуолярной протеазы в ткани в 6 раз меньше, чем содержание ААЭ. Заслуживает внимания то. что скорость обмена ААЭ является самой низкой из по сравнению со взятыми для сопоставления ферментами. Так. время её "полужизни" составляет 5.46 суток. для СОД равняется 3.65. альдолазы 3,42, а для протеиназы этот параметр соответствует всего 2,25 часам. Для ААЭ характерно, соот-

ветственно наименьшая константа деградации и.наименьшая среди указанных в таблице ферментов константа синтеза. Таким образом, из представленных данных видно, что необходимая.концентрация ААЭ в клетке поддерживается за счет достаточно низких по сравнению с

другими ферментами асоростей распада и синтеза этого фермента и достаточно длительной времени его "полужизни". Так как, в литературных источниках отсутствует достаточное количество данных по обмену ферментов вторичного метаболизма в культуре растительной ткани, нам сложно интерпретировать полученный результат как общую закономерность, характерную для ферментов, участвующих в синтезе вторичных соединений. Как известно, высокими скоростями деградации и синтеза обладают ферменты, выполняющие ключевые, регулятор-ные функции основного обмена клетки. По-видимому ферментам вторичного метаболизма, даже в случае наличия и них определенной ре-гуляторной роли, вышеуказанная особенность не свойственна. Из представленных в таблице б данных следует, что содержание ААЭ в штамме К27 культуры ткани раувольфии змеиной значительно меньше, чем СОД и альдолазы, но несколько больше, чем вакуолярных протеи-наз.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый метод выделения и очистки аймалина из культуры ткани раувольфии змеиной, позволяющий получить из 1г. сухой биомассы 17-17,5 мг высокоочищенного аймалина с выходом 70%.

2. Изучена динамика изменения активности ААЭ и содержания аймалина и индолиновых алкалоидов в культуре ткани раувольфии змеиной. Показана зависимость между степенью аккумуляции аймалина и уровнем активности фермента.

3. Предложен способ выделения и очистки ААЭ. Из 20 г. культивируемых клеток получено 0,3 мг гомогенного фермента со степенью очистки 210-400 раз. Выявлена аллостерическая природа фермента, установлено наличие мембраносвязанной и цитоплазматической форм ААЭ. Фермент проявлял максимальную активность при рН=б,5 в цитратном буфере, рН=б,0 в калий-фосфатном буфере, температуре 15 и 40 °С, шел молекулярную массу 130 и 140 кДа, массу субъединиц 33 и 38 кДа.

4. Обнаружены протекторные свойства аймалина по отношению к ААЭ при тепловой денатурации фермента.

5. Впервые исследованы параметры кругооборота ААЭ в культуре ткани раувольфии змеиной, определены скорости синтеза и деградации фермента, его концентрация и время "полужизни".

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Смирнова М.Г., Кириллова Н.В., ФирсоваВ.И., Комов В.П. "Выделение и очистка 17-0-ацетилаймалинэстеразы - ключевого фермента биосинтеза аймалина", тезисы, Всеросийская научная конференция "Химия и технология лекарственных веществ". Санкт-Петербург, Россия, 1994, с.20.

2. Смирнова М. Г., Кириллова Н. В., ФирсоваВ.И., Комов В.П. Исследование ацетилаймапинзстеразы - конечного фермента биосинтеза аймалина. М., 1996. 12 с. - Деп. ВИНИТИ 25.05. <996 900 - В 66

3. Смирнова М.Г., Кириллова Н.В., Комов В.П. Выделение аймалина из культивируемых клеток раувольфии змеиной. М., 1996. 8 с. - Деп. ВИНИТИ 25.Од. /956 ¿59-В 96