Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и анализ гибридных клеточных линий видов семейства Apocynaceae

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и анализ гибридных клеточных линий видов семейства Apocynaceae"

V о а • * -

АКАДЕМИЯ НАУК БЖРУССКОЙ ССР

ЖЮТИТУТ ГЕНШШ И ВДГйЮГЮ!

Ва иггавзгругссааск'

КОСТЕВШ Игорь Алексеевич

У Ей 576,032.263:576. ОВг- 2

ПОЛУЧЕНИЕ й ШЛКЗ ГИБРИДЕН* КЖГйЧЕЫХ ЛИНИЯ БШ& СЕШСТВА АРОСШАСЕАЕ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ . дисеертаили на соискание ученой степени кандидата биологических каук

Шнек - 1991

Работа выполнена б отделе шяофигиодогш к клеточной ш:шке-ряи Кастктута клеточной биологии и генетической иигквнериа А11 УССР. .

Научный руководите» - академик АН УССР, доктор биологических

наук, профессор ГЛЕБА Ю. а ' •

Офшгиавьше сшкшенты - доктор биологических наук

давдщшо о, г.

кандидат биологически наук • ШШШС К. Е.

Ведущая организация Настмут физиологии растений к генетккк

М УССР '

, , Занята состойся

иш*Ж_1961 г. в .

£ч час на еаседаняи одеццалиэйровакного .совета К 006.02.01 во еащяе дксее-рзацкЗ на ешенаяке ученой степенк кандидата биологических каук в Кшзтигуте генетики и цитологии АН БССР по аз-, р&еу: 220734, г.Шнгк, ул. Скорины. 27

С диссертацией мошэ саищсоштъся в библиотеке в Цэнтраль-ной научной библиотеке ни. ДКолзса

Автореферат разослан " & ч ,£¿¿¿,9. 1991 г.

Учёный секретарь специализированного совета К 006.02.01, кандидат биологических тук • Е. В. Лобанок

ОЕЗАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Дальность" теш. 1ун даментэльные исследования различных сторон биологии растительной клетки в культуре ткани in vitro открывают новые перспективы в биотехнологии высших растений. Кающиеся на сегодняшний лень сведения позволяют о определенной долей уверености сделать вывод о том, что культивируемые клетки представляют собой новое, отличное от состояния тканей пятактно-го растения, сообщество. Это клеточное сообщество характеризуется определенными отиокваиями, зачастую кило изученными, с.-слады-ваювдшися в процессе культивирования и эв0доди0нирузди?<1и с течением времени.

Культивируемым клеткам свойственна значительная генетическая изменчивость, фенотлпичйски проявляющаяся в широкой фявиологк-ческой и биохш.яческоа зариабкльности. Хотя изначально культивируемыо in vitro растительные клетки тдают- генотип исходного эксплантата, во многих случаях в процессе неорганизованного роста их геном подвергается еудественной качественной и количественной перестройке. С одной стороны, это позволяет исследователю "рас-пвтьюатъ" фундамент наследственности в надежде получить новиг мутагтте Форш, нредсгавлящн-э практический и теоретический интерес, с другой стороны,- высокий -уровень изменчивости в еноте;«« in vitro создает ряд проблем в сохранения стабильности гено-лии--ческой структуры клеточных популяций при длительном культивировании.

Достижения клеточной инменерии, в частности, успехи соматической гибридизации выешх растений, открыли ноькй этап в конструировании искусственны« биологических клеточных систем. Известно, ' что гибридная клетка не является механической смесью структурных и функциональных- элементов родительских форм. .Многообразии? процессы интеграции, взаимодействия и, s частности, несоа-местимости геномов и организация 'различных процессов язрвич;ю?о и î торичяого обмзнз исходных клеток- позволяет говорить о низкой степени кра доказуемости конституции и структуры функшон?и;ькет систем синтетической клетки, ©го обстоятельство ставит соматическую гибридназли» в ряд весьма многообещающих и инторесну* подходов в исследованиях биологии растений-продуцентов, что позволило бы создать источники новых ценных вещэстй вторичного синтеза выспш растений и/или синтезировать линии со свойства» су-'-перпродукшш отдельных метаболитов, родительского тклз.

Шлучекие и подробно«? неучен!«' соматических гибридов .расте-ний-нродуцентов различной талзоноьшческой удаленности является необходимым этапом исследован}® для опенки возможностей парасс-к-суалькой гибридизации в биотехнологии высших растений.

' Вэль и задачи ксследопаякя. Целью ввстояшэй работы явилось подучен®, идентификация и геке^ико-биохишчвское изучение гибридны* кзюточных линий меяду видаьм растений-продуцентов ценник индодяых алкалоидов претквоари-ттскеяо. гкпотешивкого и вд-тостаггического действия иа семейггЕа Аросупасеав.

Эгобходаш било решгь следующие еадачи;

- разработать уояознм аффективного изолирования и культивировали? протопластов видоь кутровых, в том числэ Rsuvolfia serpentina, Vinca minor» Rhazya strícta;

¿ получить соматические гибриди в комбинациях, представлящих наж"юльЕий теоретический и практический интерес, а шенно: Rauvolf 1а + Vinca, Rauwolf la t Calharanthus, Rauvolfia + Rhazya, Catharantftus + Vinca, изучить ж генетическую стабильность, шр-- фгеяетичзский потенциал;

- ясслгдовагь спектр илдо.ьькл- алкалоидов у гибридных клеточных аший, исходных родительских каллусов и ия-шггкых растений.

Еаучаая новшнд уаПсты. PaspaScrasu условия для изолирования ¡¡©звеслособных протопластов fisuvolfla. Vinca, Rh-агуз и их куль-ТЯВИрОШйЮ. С ЕОМОЕ5ЫО штэда е«;.(ЗТКЧвСШЙ гибридизации вяервш •пелучаны гибридные клточгше „шш ккаду видами растений-проду-д*нтов ка семейства кухроных в 4 гндойьч комбинациях. Пзказаао, что получитыз. гкбрадяаа клеточные линчи в условиях неоргаинго-ваяного роста сохраняют гибридную конституцию в течение, по крайиой 2-х лег с момента ¡tx получения. Изучен относитель-у иый водк««С7венииа и качественная состав индольных внутритканевых алкалоидов гибридных клеточных линий, исходных родительских ■' фор« (каллуоиач -тканей и иитактнш растений), Впорвьй идечттифи-пироьакы гибридные клеточные лишга, превосходящие по суммарной •'.продуктивности (по алкалоидам .и по аймалншиу) родительские кал' лусныз лнкми к растения в 2-5 par. Впервые показаны качественный отличия !к* содержанию алкалоидов мекяу гибридными клоками и оо-' хилёяьскиыа форкаш.

Пг^уичцгкал . Шкагаво, что в якани к&даорик гиб-

{¿даных клеточных линий «гёийруякдоотся ¡¡овне Форш алкалоида» • ■ природы, 'не еотряетжя ь кличтх. родитедьских видов, таким об-

разом, продемонстрировало, что соматические гибриды растений- продуцентов ногу? стать источником новых биологически активных векзств. Бзлучены до.'сазательства того, что продуктивность ггэ практически ценным алкалоидам (например, по аймалицину) в результате соматической гибридизации в отдельных случаях моле? быть сусэственно и устойчиво повышена.

Апробация работы. Осповнш положения диссертации доклад ива- > дись и обсуждались на VII Международном Конгрессе пэ йуяьтуре ткаки и клеток растений (Амстердам, 24-29 июня 1900 г,).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 п&чатнух работ.

Структура и объем работы. Диссертация и» додана на 150 страницах мэшнописного текста и состой? из зэедения, 4 глав, закгачз-ния, выводов и списка цитированной литературы; тсявчает 0 таблиц, 32 рисугка. Список литературы содержит, 243 библюграфапег- s ких ссылок, из которых 216 - иностранные.

МАГЕРЙАЛЫ И МЕТОДН -В качестве исходного материала для получения протопласта» использовали каллусньй культуры Raiiwolfia serpentina, Rhazya stricta îî' Catharanthus roseus, a также стерилизованные шюдые Ç1-3 порядков) листья растений Vinca minor. Каллусные линии культивировали в темноте при температуре 2б°С на згаризоваквой питательной среде 4х (Сидоров *л соавт., 1985): 1-иафгилуксуеная • кислота ( ПУК) - О,Б мг/л, 1 -индолииуксусная кксгота (ЯУК) -0,5 мг/л, 2,4-дихдорфенокояуксуная кислота (2,4-Д> - 2 кг/л, кинет® - 0,2 ыг/л. Растения барвинка выращивали в теплице при 16-часовом режиме освещения. НаиуснкЯ шявш раувольфии змеиной (линия А) бш любезно предоставлен член-корр АН СССР Р. Г. Бутенко (Институт физиологии растений АН СССР, г.Москва). Культура ткали Rhaeya strîcta была любезно предоставлена проф. >Л. H. Zonk (Институт фармацевтической биологии, йонхенскнй университет, г. Мюк- : хен, СгРГ). Каллусиая культура катарангуса розового пс лучена нзма в 1987 г. Изолированные протопласты переносили на питательную ■ среду 4х или Мурасите-Скуга, чаши Петри с инокулятами, помещали j в термостат при 26°С. Периодичность дальнейшего пассирования ear висела от интенсивности кадлуеогенеэа и вкесиего вида.первичного.' каллуса и составляла, в среднем, 17-20 сут. . „ .. г,

Дяя получения изолированных протопластов каллусянх 'культур

отбирали активно растутцу» ткань на 5-10-е супа! пассажа, для ферментации каллуснш клеток Rauwoifia serpentina и Catharar.thus roseus использовали ферментную смесь следующего состава: Onozuka R-1Q {"S3rva")-0,15 % , Driselase ("Sisma")-0,20 X, Macerozyme R-10 ("Sirva")-0,10 Z , сахароза (0,45 Ю-50 ил, среда ,V5 (Msdgyesy et al.. 1980) - 50 мл. Протопласты Йтагуа stricta выделяли з ферментном растворе такого состава : Onozuka R-10-0.75X, Cellulysin ("Serva")-0,35%, Macerozyme R-10-0.25X. lacerase ("S0rva")-O,25 Z, сахароза - IX , среда V5 - до 100 ил. Культивировали протопласты при плотности 10* - 105 протоплас-товЛы, «о влажных камерах f термостате при 26°С.

Листья барвинка после стерилизации выдерживали на питательной среде Мурасиге-Скуга (Murashig-e, Skoog, 1962) {сахароза - 20 г/л, кинотин - 0-1 иг/л) в темноте или. на свету (2000 - 3000 лмхче, 16-чеса вой световой день) в течение 1-5' суток, после чего подвергали ферментации в течение 14-18. nacos (Onozuka R-10 -300 мг, Driselase - 400 мг, Macerozyrra R~10 - 200 мг, сахароза - 100 мг, кальций хлористый безводный 55 мг, маниетод (или сорбитол) -0.45 М. вода - до 100 мл), меэофильные протопласты трижды отмывали средой vs. разбавляли питательной средой к переносили в чашки Петри, культивировали в темноте и/или на свету при.£б°С. •

Слияние протопластов во всех комбинациях проводили по методу, предложенному Менцелем (bfenczei et al., 1281). Протопласты партнеров смепдвади в соотношении примерно 2:1 или 1:1 в конечной концентрации 10б-103 протопластов/мл. Смесь родительских протопластов аккуратно перемешивали и в виде капель наносили на дно пластиковых чааэк Петри, б которых проводили слияние. Продукты слияния культивировали в различных питательных средах при температуре 26° С. Для отбора гибридных продуктов применили систему Фи&иологической селекции и Физиологической кошлементаци, используя обработку протопластов одного из,партнеров моноиодацета-том или иодацетедом (Sidorov et al., 1681).

Анализ множественных: юлекулярных форм ферментов проводили с помощь» ПААГ-электрофореза, как это описано ъ Препринте Института ботаники АН УССР (1588), модифицируя отдельные зтапы в соответствии с особенностями наших объектов. Для одтогенетических исследований применяли метод давленых препаратов. Для изучения организации• ядерной ДНК гибридов применили предложенный 3. Cay-

- б -

aepnoü (Southern. "975) метод блст-гибридизации, испо-зьвуа в качестве зонда рДВН плазмидц pUL7, сокеряк^дез фрагнент гена 2SB рТШ лимона (Колот, Фодор, 1885?.

Экстракций алкалоидов из растягедавой ткани проводили по Hsp^-ру в соаэг. (Parr et al., 1Р88), несколько модифицировав его. Качественный и количественный анализ алкалоидных: Фракций прогадали, на жидкостном хроматографе фярмн Du Pont.

РЕЗУЛЬТАТЫ Й бБСУЗДЕНЖ

1. Культивирование протопластов.

На предварительном этапе ;:саледовани£ были шкифпцяровавы и разработаны сшей дадлюлитических фер^нтов для изолирсванн.т яиэнеспособннх . каллусных протопластов Rativolfla, Ehazya a Catharanthus, а такте мевофильша протопластов барвинка малого. Апробировано более £0 питательных сред й их модификаций дет культивирования протолластов этих видов. Протопласты ис-иольао-ьанных в данной работе ендов синтезировали клеточную стенку, де-лклись и образовывали клеточные микроколокии с различной интенсивностью. Для культивирования протопластов раувольфии гмеиноД лучшие результаты были получены при использовании питательных сред Кайоша (Cafcoche, 1980) й 4х (Сидоров и др., 1985) , на которых первые меточные деления иаСлюдатась на "20-25-е сутки, сф:р-мировавшеся клеточные микрсколоши разбавляли звежиыи порокам питательной среды 4х через 15-20 суток, в дальнейшем перекосили их на атаризованную среду того se состава (без машштола).

. Для культивирования протопластов катарантуса розового наиболее благоприятной оказалась питательная среда 4х, дополненная 0,45М маннитолом. На этой среде протопласты катарантуса синтезировали клеточную стекку на 2-3-и сутки ¡сультввироьанкя, а первые деления начинались на 17-20-е сутки , частота делений сгставила приблизительно 2-4Z, сфэрмировавийесч клеточные колонии переносили на атаризованную среду ах через 27-30 суток.

Для куитивкрования протопластов Rhazya str .eta-' оптнмзльпьш оказались среды Кабоша (Cabocho, 1980) и Шгпарда и Тоттена (Shepard, Tottsn, 1975), частота делений на них Сьиа приблизительно одинаковой и составила 0,05-0.50Х ,, одна»» первые клеточные деления на среде №пардз и Тоттена были зафиксированы на 10-12-е сутки, а на среде Кабоша - лита на 17-19-е. Шлученные

клеточные ыикроколояии переносили на эгариэованную питательную среду 4х через 40-50 суток.

Иззофильные протопласты барвинка малого после отыывок перекосили в модифицированную питательную среду Шенка-йшдебравдта Vvíhenk, Hildabrandt, 1SVE) с 0,5 11 иаикктом, в которой окя образовывали клеточную стеаку на 3-4-е сутки, а первые делен»? наблюдались на 17-25-е сутки культивировать. Для лротонластоь этого вида были характерны низкая частота делений (0,1-12), кед-ленный рост образовавшихся клеточных микроколоний, некров клеток в процессе культивирования, плохая переносишеть добавлений све-acix порций питательной средь:. После образования шшроколоиий из 13-20 клеток, их разбавляли порциями с&екей среди того т состава с несколько покиданным осмотическим давлением (0,3 М ыаинитй, на 40-50-е сутки), еиэ через 30-35 суток клеточные колонии перекосили ка агариаованнув' питательную среду, культивировали на сЕету или е темноте. '■

2. Слияние протопластов и отбор гибридных клеточных линий.

Соматические гибриды получали в четырех комбинациях:

1. Rautfolfia serpent ina + Vinca minor.

2. Rauwolfia serpentina + Catharanthus roseas.

3. Rauvrolfia serpentina »■ Rhazya stricta.

4. Catharanthus rose us + Vinca minor.

Б первых трех комбинациях- были получены межгрибние гибриды, а в 4-й - межродовые.

. Для отбора гибридных продуктов в комбинации Rauwolfia + Vinca «спольвовали систему физиологической селекции: на данной питательной среде частота делений протопластов раувольфии была близка к нулю, для элиминация ыезофильных протопластов барвинка малого применяли "жесткую" обработку ГОГсм во б реки слияния. Для ; культивирования продуктов слияния 'применили модифицированную питательную среду №кка и Хильдебрандта. Первые деления наблюдали на 8-12-е сутки после слияния. Культуру разбавляли ¡горцилми све-«ай• питательной среды того же состава после образования клеточных микрокодоиий из 1.0-15 клеток. Через 25-35 суток, клеточные колонии переносили на жидкую среду того же состава с пониженным осмотическим давлением (маянитоя - 0,2-0,3 М) или на агаризован-нук питательную среду того же состава, на которой их в дальнейшем и культивировали.

Для отбора гибридного материала был проведен анализ сгкетотв шюжственпых молекулярных форм зстеравы и аспартатаминотранефе-разы полученных клеточных линий к родительских форм. Ечло д^в-зпаливировано 200 клэточяшг линий, из шя 3% (Рис.1) м»гу? Сеть безусловно отнссели к гибридным по этому признаку, £5,8% проанализированных гаеточних лилий имели ивоаимные спектр» ?рая-

Рке.1.

(листьл),

СП

f

va (is J so I со a os f, 23 entro i юз

i

20

вольфяя змеиная 90, 80, 95. 23, ' 29 - гибридные линии.

Кгозимкые спектры - барк ¡шок fe •• рау-(каллус), 76, 79,103, клеточнт

A^íi Sí529 • V

Рис.2. tfeTaíssHu? хромосомы гибридного клана VR27 íRau-•(folfla Vinca), V-хроцосo~ ш Vtnc3, R-хроюсомн Eau-wolf i a.

сфзрази, сходные с раувэльфией, Л,8Z прсаналиакрованньк кленов продемонстрировали изозииные спектры, характер;«« для листьев и кал луг а V, minor. Анализ мета£азньк пластинок гкзрйднкх'каллусрмх линий, гашусяого штамма раувольфии и апикальной корневой юристе ш барвинка малого позволил сделать вывод о наличии В гкг^ид-ны>: клетках хромолои обоих родителей с кодячеотвеняим прес-бяага-нием хроыооом рауЁольфии (Рис.2).

При -совместном гидролизе рестриктазаш EooRV.h ВалтН.? ядврной ДНК барака малого и раувольфии змеиной и гьбрядивации с чоядом рЫ7 на расиоавтографе выявляются специфичные для какого вид«* наборы фрагментов рибосоиадьноЯ ДЕК (рДНЮ. ¡3 четырех ., из вести проаязлигированных клеточных линия, отселекгщшавннх после ели-лНИ)~ протопластов барвинка и раувольфия, выявляются фрагменты' рЛНК обоих родительских ендов (Рис. 3),

«вир-

«« в«, ггз I

1

. "фПЯк Щ «Ц» чтф. тттт

Шк: ■ Р® «Ж» СЗ

СП из £1 «7 е 19 62 1 23

Рш.

Я5 95 76 103 29 УН

Шот-габрвдизациа идзрнэй ЯНК Сарвилка -малого (¥М). ргуволь-фии гыешюй 1КЭ и гибридных кл$-.точных -линий (05. 76,- 103, 23), гидродизованной реотрцктазг'ш ЕсоЯУ я ВалМ, о зондом р(Л,7, специфичным к р.ЩС,

КЗ

*яа» -13

-55 52

НйЙЬ

1 н •

¡ез»-*-

-09 ЗЛ -2.0

Рчс. 4. йзозшкые спектры ' &спартат«>!йнотрансферазы: СЙ - катарантус розовый, ПЙ -• раувольф!ю 81,«иная, 51, 47, 8, 19, 52. 1, 28 -гибридныэ клеточное линий.

кс

№ — 4.0

'

- 3.4

- зл

- 2Я

-га

й513 5 3 51 52 ся

Ри.\ 5. Б^й?-гибридизация . ядерной ДНЕ рауволь^ш елейно Л (ЙЗ); ката-рантуса репового (СЛ%) и гибридвых клеточных'дшшй {19, 8, 3, Ы, 5Е), гадролиеовакиой рестрикгавами ЕсоКУ и Вап.Н1, с зондом рУ17, сшшфичнш к рлнк.

т

ПН 12 17 13 Г»5

Рис. б. Влот-гибридизация ядерной ДНК ЙашгаШа эагрэпь1т С КЗ), йгзгуа з1псЬд (ЕЯ) и гибридных клеточных линий < 12, 17, 18), гидролизованноЯ рест-риктазами БсоШ и ЕсоЯУ, е ЗОНДОМ "ГАИ,", ОП?ИИфИЧ«Ш к

рда

Ч клеточной линии 76 Фрагмег лы рДНК барвинка слабо выраяены, обнаруживается фрагмент рДНК длиной 3.3 тпн, отсутствующа в геномах и раувольфии, и барвинка. Вэвые варианты повтора рДНК, по сравнению с. родительскими линиями, были выявлены ранее у соматических гибридов Hicotiana tabacum + Atropa belladonna (Borlsyuk et al., 1938). Возникновение новых вариантов рибосомальных повторов мокет быть, видимо, связано с повышенным уровнем рекомбинаций в гибридных клетках.

Для отбора гибридных продуктов в комбинациях Rauralfia + Catharanthus н Raurolfla + Rhazya нспольвоввли систему физиологической комплементации: на использованных питательных средах протопласты раувольфии делились с очень низкой частотой или не делились совсем, а каллусные протопласты соответственно катаран-туса розового и Rhazya обрабатывали щггошюзматическиш яда*©: !Ш или ИЛА Скак описано выше). Восстановление шзнесшссбяости шактивировакных протопластов шгло произойти лишь оа счет сдия-Ш!я с протопластами необработанного партнера - раугольфлгт.

Продукты слияния в комбинации Ram*olfia + Cattiarerithus культивировали на питательной среде •*>:, дополненной 0,45 М макнито-жои-, первые плеточные деления наблюдались на 10-14-е сутки, сформировавшиеся клетошые колонии разбавляли питательной средой 4х через 2-3 подели, впоследствии переносили их на агаризованнуй среду 4х. В зтой комбинации было получено около 200 клеточных лилий, у 100 из них исследовали ивозимнке спектры аспаряагаки-яотранс^ерааы, 46Z из них имел?; маркерные полосы от сбоях родитель craix видов (Рис. 4), у некоторых присутствовала новая полоса, не характерная для изозимяых спектров транс-фэразы обоих' -партнеров. Результаты анализа бдот-гибрвдмвации гидролизовапной зпдо-нуклеааами BamHl и EcoRV ZQIK раувольфии, ¡сатарантуса и гибридных клеточных литий с фрагментом гена 25S РШ лимона (p'JLV) продемонстрировали наличие в треках гибридов отдельных фрагментов от обоих родительских видов (Рис. 5)

Продукты слияния в комбинации RauwlVta + Rhazy« так»* куль-тивироЕаям на питательной среде 4х. Первые клеточные деления отмечена на 15-е сутки посла процедуры слияния, Образовавшийся клеточные иикроколошш разбавляли через 12-1Б суток питательной средой 4х, а еще через Й-3 недели перэнооши их к а кмрмзованву» среду 4х. йэ получзнкьог оолее 80 клонов б зтой кемШшции снзо отобрано 4 клеточные jbwva« ври анализе квозшная спектров игле*; рих установлены признака: гибридности. Ге&уш*»ты слот -гибрида?»--

дай (ДНК родительски форы и гибридов гидролиаовади рвстражгаэа-т EooRí и EcoRV, в качестве зонда использовали фрагменты рДНК л'л.:оиа5 свидетельствуют о присутствии фрагментов.ркбосомальной ДНК обеда партнаров в ДНК гибридных клеточных ;шнкй (Рис. 6). .

Еся отбора гипрядш-к продуктов в комбинации V. minor f 0. roso us текяэ ксшльвозали систеиу физиологической кошиазмеета-iíhü: перед слшшкэм протопласты катаратнтуса розового обрабатываю! Ш« iura КМ, а для элиминации протопластов барвинка »малого' пржгввялк "асгсхву»" обработку ЛЭГои во время слияния.

Для куямдаировазтя продуктов слияния использовали модифицп-■роваяну» якгаг'ельну» среду шйжа и Хидьдебраядта (Schenk, fiBdebraadt, 2.272) - варианты 101 и 104. Первые делэния наблюдали зга В-12-с сутки после слилниз. Культуру разбавляли порошки езадай питательной ерэды того гк состаза посла образования клеточных шфоколояий йз 10-15 клеше. №бридкьй иагариал культи-ззирааалк в вида каллушш ытажш в темноте при 26° С .и/или на свету ,(3000-4000 яшс) при 15-часовой световой дно, йндушровать регекерацив стейлг? нам ш далось, В этой комбинатах было получено 97 клэточных линей. Скрининг югеряала но иаозкынш спеггг-рац жшартатажяоз'раясфграда и зстеразя позволил иденифациро-ватг £72 аз анх как гиЗрзцдада. Вывалено 4 основных та игофер-яактнья спэкгров. S проакажайроватюй в згой комбинации гкбрз.д-кой кгет-очяой лтт. отселзотироБачной послу слияния, выгвдяются спошфетвь»? дла обоих родительских видов реса'ршгиг'з фрагмент': PlíKli (Олоу-гибрадизация с Фрагментом рДШ лиыояа. ДИК гибрида и партнеров предварительно яжуйироваяи с зндонукяеазами EooRV к BaaHl) (Рис:-7). 7

KB

Ш #»

Клот-гибридизация ядерной Д1Е к&тарантуса розового (CR), барвинка малого (Ш/ и гибридной клеточкой яйнш (115), гидролизо-ванной рестриктешами EcoRY и Bacfil, с зондом pUL7. стцифичк»! к рДНК.

CR 115 т

Литература изобилует данными о чрезв№<айжз высоком уровне ва-риабилыгости биологических я геиетпееких характеристик культивируемых растительных' ¡аетоге ( Крт.ах, 1075; ЕауШз-,. i960;. D'Amato» 1SR4 и др. ). ,tó¿ провали гквтарпиэ теоган (спустя 2022' шс. после получения гибридных клеточных лгаиА) на гяЗридноспь огоелеетирозааиого матер-ana.

Анализ изоащдаяс спектров гспартатшяо'грансферззы гибридам; , клонов яскззал, что во всех комбинациях: гибридный каллусныэ клетки сохранили хар&геерньа для них ивофвршнтяке спектры. Wr лучвнта годом раньше . Как и в предыдущих исследованиях,, е^ зтнг "спектре* были идентифицированы как видогоцифгчнш полосы обэих. родительских форм,' так и нов но, не свойственные родительским1 задам.

Для повторных анализов рДНК методой блот-гкбридиэацюг беги отобраны 12 кл&точных линий и комбинации Ratnralfta serpentina-Vinca minor и б клонов в комбинации Rauwolfla serpentina + Cath&ranfchus rosous. В этих экспериментах для веек отобрашмх клеточкьк линий была подтверждена их гкбридность но наличии в их ресчрикщюкикх спектрах ДНК, гибоидизованной с Фрагментом , рЛНК лщона, ввдоспецифичных фрагментов обоих родительских видов. •

Таким образом, была проденонатр'пповзла относительно высокая генетическая стабильность исследованных клоиов з течение 20-22 месяцев кульиширования.

3. Изучение содержания алкалоидов в гибридных клеточных линиях и родительских формах.

С поиошью ВЭЯХ били исследованы экстракты алкалоидной Фракдаи ютеактных растений Rauwolfia serpentina и Vinca minor, а тага® каллусных клеточных линия этих видов, Rhazya striota и Catharanthus rose us. Было покавано, что профили хршатограмч Тгс-страетов кнтактних растений раувольфии и барвинил малого и их каллусных штаммов суцественко отличала, а оОтая иродуктавкосгь -алкалоидов у растений была на 2 iff v'^tme, чем у. каллусиг* клеток. Кроме того, были отмечены качественные и количествеяннз отличия по составу алкалоидов между каллусной линией А (предос- , таелениой ?. Г. Вутенко, ИФР АН СССР) и втаммоы RSW3 (предоотазлей проф. й. Штекигтон, Мгахенскяй университет, г.Моакен, ФРГ).

Pc всех комбинациях на хроматограшах гибридных клэточякх лиг нкй выявлены видоспецифичтие пики обоих партнеров,

¡¡3-й < .'

- *._ а «•

~ ч 1, ,

3

&

а* з а -51

Рис. 8.Хроматографическое разделение агкалоидов листьев (а) и полученног-з из них каллуса (б) бар1иь-<а малого.

Рис. 9. Хроматографичеекое разделение алкалоидов каллуса раувольфии линии А (а) и гибридной клеточной линии УЩ9 (б). новый компонент.

- 13 - '

гкбридкые клоны в комбинации Rauwolfia + Vinca содержали компоненты ал; галоидной природы, не идентифицированные в каллусных клетках родительских видов, но обнаруживаемые в дифзЕерешздрешаз-них тканях интактных растений одного 'из партнеров, йгкотсеые [«змпояенты гибридных клонов не свойственны ни растениям, ни каш~ лусннм линиям родителы..сих фзрм, хотя для более определенны* ваклвчений г этом случае требуются дополнительные исследования1 •(Рис.8,9). В литературе имеются указания на появление у гибридов новых, по отноиешго к родительским видай, соединений (Valler, Kowacki,1978).

В комбинации Rauvolfia +■ Vinca некоторые гибридные кланы превосходя" родительские формы (как калдускые, так и растения) по 'суммарному содержанию алкалоидов в 3-5 pas (Табл.1). Содержание внутриклеточного.айиалицина значительно варьирует в разных гибридных клеточных линиях, достигая в отдельных случаях весьма высоких значений (Табл.1). В ткани клона VR27 содёржание раука4«|г-рицяяа было примерно, в 10 раз вшз, чем в каллусе раувольфпп.

Таблица 1.

Содержание суммы алкалоидов и аЯмаяицина в ткани родительская видов и клеточных линий серки YR (Rar.'olfia serpentina + Чtriers minor).

N Клон Тип Сумма алкалоидов Иол-во Аймалицня

(усд.ед./1 г сухой пиков {мкг/г ткали» _____ткани) _..

1 V. minor каллус 236949 д 108

г V. minor листья 2664505 21 -

3 R. serpentina каллус 397165 , 10 3-59

4 R. serpentina листья 730933 14 349

б VR27 т. 1 7338259 13 1852

б VR29 т. 1 6101&38 17 ; Й01.6

? VR243 Т. 1 5778151 14 ';• •'■. 453

8 VR47 т. 2 5412576 14 ИЗ

9 VR42 т. 2 4.375133 14 ; 456

10 VRS6' т.1 3332180 15 cea

Спустя 7 мс-сяцев были проведены повторт#> анализы содержащм алкалоидов в ткалн гибридных клопов VRP:7, УКЗО и Ш0>: (Тябд. !?,>'.

Были взяты клоны, значительно отличающиеся как по уровню сушы ивдольных алкалоидов, так и по содержанию аймалицкна. Приведенные в таблице 2 данные свидетельству*» о том, что общая суша алкалоидов в васокопродлсгиваом штампе VR27 черев 7 месяцев культивирования заметно снизилась (в 3.66 раза), такая яе тенденция отмечена и для уровня внутритканевого аймалицана (сшдаэ-ше в 1.30 раза), в то те время для клонов VR103 и VR60, изначально менее продуктивных, чем VR27 (в 7.25 и.59.47 рава соответственно), было отмечено возрастание суммарного содержания алкалоидов в 2,60 и 3.12 раза в ¡?авдоы случае (Табл.2).

В дало» модно сделать вывод о том, что характерные особенности профилей хроматограим каэдой клеточной линии сохранились в течение ? месяцев, но количественное соотношение между отдельными компонентами, а такка обдая продуктивность гибридных клеток по алкалоидам мотет ваметно квшияться.

Таблица 2.

Содержание сушы алкалоидов и айкааицива ¡в ткали гибридных клеточных линий VR27, VR60 и VR103 (Rauvolfla serpentina + " Vinoa minor).

N Клон Примечание Суша алкалоидов Кол-во Айнэлищщ

(уол. ед./1 г сухой пиков (ыкг/г ткани) _ткани)__- _

1 VR27 таззгбэ 13 1852

2 VR27 IbBTop. 2005950 14 1421

3 VR103 - 1011539 И 2675

4 VR103 Повтор. 2525325 16 1455

б VR60 - 123401 9 НО

6 VR60 Повтор. 384565 12 . 600

' ШЮШ

1) Разработаны условия изолирования и культивирования протопластов из видов семейства кутровых: Vinca minor, Rhazya stricta, RauTOlfla serpentina.

2) Шлучены кяеточнке линии соматических гибридов в комбинациях ВИДОВ:

- 15 -

Rauwolfla serpentina + Vinca minor;

Rauwolfia serpentina + Catharanthus roseus;

Rauwolfla serpontlna + Rhazya stricta;

■ Catharanthus roseus + Vinca minor.

3) Гибридные каллусние липки сохраняют признаки гибридности по ядерным генам во всех видовых комбинациях в течение, по крайней мере, 20-22 месяцев с момента слияния протопластов,

4) В комбинации Rauwolfla serpentina + Vinca minor в гибридных клетках происходит частичная элиминация генетического материала» преимущественно хромосом барвинка малого.

5) Хроматограммы алкалоидных фракций экстрактов калдусных линий раувольфии и барвинка малого отличается от хроштограмм ин-тактных растений, а профили хроматсграмм гибридных клонов несут элементы видоспецифячных родительских компонентов, в то хэ в ре мл качественно и количественно отличаясь от родительских форм.

6) Некоторые гибридные клеточные линии (VR27, VP29, VR243, VR103), б комбинации Rauvolfta serpentina +■ Vinca minor отличаются высокой продуктивностью по алкалоида«, значительно прегоохо-дяшэЯ родительские виды.

7) Спектры алкалоидных соединений и порядок величин продуктивности клеточных линий VR27, VR103 и VR50 в целом сохр&яяюгся в течение 7-и месяцев культивирования.

8) Гибридные клетки способны синтееировать и 'накапливать вто ричнш соединения, не обнаруживаемые в ткани родительских форм.

Описок работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Костенюк Е А., Любарец О. ф. Глеба Ю. Ю. Культивирование протопластов четырех видов семейства Аросупасеае. // Доклады Ail УССР, серия Б. - 1S90. - J17. - С. 80-83,

2. Kostonyuk I., Lubarotz 0. , Borisyuk N., Voronln V., Cherep N., St6cklgt J., Gleba У. Somatic hybridisation in Apocynacoaa family. // I Hi Vlltb Int. Congress on Plant, Tissue and Cell Culture. ' / ArKtftrdauv Hetheгlands, June 19P0 / Abstr.., MmUivdm. - 1ДО0 -- P. Е1У,

3. Borlr.yuk V. , l-hwf, V. P,, I. A. Kostsnyuk, Lubaretz 0. F. Sleba Yu.'Tu. ГШ5Л rearrangements in tfto' process of sonatio c«U hybrtdi^efcioa /•• hv. VIIth Int Ctangnj&s on 'Plant, tissue ;and Cell CattwV (W-'UreiAm, H-itbirlfitnda,' j'Jiis. Ahstr-,

- 1S30. - P. 174. » " '

' ' - 16 - ■'■ '4. Коетенюк KA-, Любарец О.Ф. , Борисюк Н.Е., Воронин а В., Гл>з£а ЯКУ Соматическая гибридизация кутровых: Raurolfía serpentina t Vmoa minor // Доклщы АН УССР, серия R - 1620. ^ N11. - С.' 73-76. Л

5. Еостенюк Я L, йобарец О.Ф., Борисюк Н.Б., Воронин ЕЕ, Глеба iü К>. Сока.тичес»®я гибрадизаш1Я растений - продуцентов ив ■ceweñcTB£¿ Лросупзсеаз 7/Доклады АН УССР, серия Б. - 1990. т.?. - с. 52-55. ' :

0. Еостенак IL А.. йобарец С. Ф., Воронин а В., Глеба Ю. 1й Клеточная нижгнэрет в биотехнология растений-продуцентов чз семейства кутровнх (Аросупасзае) // Биополимеры и клетка. - 1991.' -ЫЗ. - В печати. ••'.•'

7. Kostenyuk 1., Lubarétz 0,, Borisyuk tí., Yoronin V,, Cherep •J., Stftciagt J., Gleba Y. Isolation arel characterisation of intergenario sosatic '■•.. hybrids in Apocynac&ae family // Theoretical апсГЛррШс! Gsnetlcs. - 1S91. - In press.