Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование экспрессии муциновых генов в конъюнктиве глаза человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование экспрессии муциновых генов в конъюнктиве глаза человека"

НАЦИОНАЛЬНА АКАДЕМШ НАУК УКРАШИ

^ ШСТИТУТ М0ЛЖКУЛЯРН01БЮЛОГПI ГЕНЕТИКИ <=>

еэ сч|

о_

^ ГУТ 1РИНА ЙОСИФ1ВНА

I I

УДК 577.218 577.21 617.711

ДОСЛЩЖЕННЯ ЕКСПРЕСН МУЦИНОВИХ ГЕН1В В КОН'ЮНКТИВ! ОКА ЛЮДИНИ

03.00.03 - молекулярна бюлопя

АВТОРЕФЕРАТ дисертащУ на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук

КШВ - 2000

Дисертащею е рукопис.

Роботу виконаао на кафедрах офтальмологи Лыйвського державного медичного ушвереите! iM. ДшшлаГалицького, та Брютольського Ушверсигету, Велика Бритаюя.

Науковий кер1вник: доктор медичних наук, професор СЕМЕНОВА Галина Савшна

Льв1вський державний меднчний ушверситет ¡м. Данила Гатацького

Офщшш опоненти: доктор бюлопчних наук, професор

МАЛЮТА Сташслав Сташславоввч 1нститут молекулярноГ бюлоги i генетики HAH Украши, м. Ктв, зав. мдщлу молекулярноГ генетики;

кандидат бюлопчних наук ДРОБОТ Людмила Бориывиа 1нститут SioxiMÜ ¡м. О. В. Палладша HAH Украши, Вцщлення регуляторних систем клггини, зав. вцщшу клшшно! диференщацй Провщна уставова: Кишський нацдональний ушверситет м. Тараса Шевченка, м. Кщ'в

Захист вщбудеться 2000 року о Йодиш

на засданш спещал1зовано1 Вчено! Рада Д 26.237.01 1нституту молекулярно! бюлоги i генетики HAH Украши заадресою: 03143, м. Ки'1'в-143, вул. академка Заболотного, 150.

3 дисертащею можна ознайомитись в oio.lioTeui 1нституту молекулярно!' бюлогц i генетики HAH Украши

Автореферат розюлано ^• 2000 року

Вчений секретар спещашовано"; Вчено!" Ради доктор билопчних наук

Л. Л. ЛУКАШ

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Акгуалыйсть теми. Мукозна оболонка (мукоза) ccaeuiB е захисним бар'ером, який epirae ештетальщ клшти дихального, шлунково-кишкового та репродуктивного тракпв вщ идливих вшндав зовшшнього середовища. Мукоза продукуеться спещал1зованими 1тел1альними юптинами i с в'язким вюкозним секретом, до складу якого входять вода, оргатчт сполуки, ¡муноглобулвд антишкробт речовини, бшки i мукошшеахариди (Gendler, 95).

Одним ¡3 складових компонент мукози е муцини, яп утворююгь гетерогенну трупу сокомолекулярних (>200 кДа) глшопротеМв. На даний час и'дкрито дев'ять тишв муцинових lie (MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7 i MUC8) i ощкуеться (криття нових (Watanabe. Van Klinben, 1998). Грунтуючись на структурних особливостях, а <ож клтшнш локагизаци, ештегаальш муцини подшяють на дв! групи: трансмембранш i феторш (рис. 1).

^ муцини^

ЕШТЕШАЛЬН! МУЦИНИ

ЕНДОТЕЛШШЛ МУЩШИ

трансмембранш муцини

CD34, CD43, GlyCAM, psgi-1, tactile

МУЦИНИ, ЩО НЕ «ОРМУЮТЬ ГЕШ

MUC7

Рие. 1. Киаеиф1кац}я муцшйа

Лналп нуклеотидних i амшокислотних послщовностей вказуе на шдсутшстъ гомологи М1ж ними типами муцинових генш. В той час, було виявлено епшьш особливоеп в оргатзаци псового компоненту муцишв, а саме, наявшеть тандемних повтор1в i численних центр1в для О- i ппкозилювання (Guyonnet-Duperat et al., 1995, Gum et al., 1990). Схематичну структуру

трансмембранного (MUC1) та секреторного (MUC2) муцишв представлено на рис. 2. KioxiMiMi анаш муцишв, видшених з рхзних тканин показав, що до ix складу входить велика юльи (до 75 % в!д загально! ваги) вуглеводав (Gum, 1992).

А HiN

ТРАНСМЕМБРАНННЙ

ттттжщ аоТШк>

127«

СООН

800-1700»«. д1ляны тахдешсах

noaropio ПОЗАЮПГИННИЙ ДОМЕН

I) 227аг

ЦИТОПЛАЗМА ТИЧНЙЙ ДОМЕН (89а I)

НгИ

ЦИСТЕШ БАГАТИЙ ДОМЕН

-'.(СООН

ИЕНТРАПЬНИЙ ДОМЕН 3 ТАНДЕМНЙИИ ПОВТОРАМИ

ЦИСТЕШ ВАГАТИЙ ДОМЕН

т

К-эвтязлет ОШГОСАХЛРИДИ

J О-за'язАШ отгосАхлРВДи

S-S • ДИСУЛАЦН! ЗЕ-ЯЗЕИ

РИС- 2. Схематична структура .трансмембранного MiiCl (Л) та секреторного MTJC2 (Б) м\цши»

На сьогодншшш день штенсивно вивчаються законоьирносп експресн муцинових геш HopMi i при патолопчних станах. Для дослдаень у вказаному налрямку були використаш л методичш пщходи як анашз експресн РНК (Нозерн-блотинг), бшыв (Вестерн-блотм пбридкзацш in situ i полшеразиа лашдогова реакцш. Це дозволило провести деталышй аш експресн трансмембранного (MUC1) i секреторних муцишв (MUC2-8) в р1зних епшоталы тканинах. Видозмшений характер експресй' муцинових гсшв було виявлено при pi3i патолопчних станах, включаючи запапып процсси викликаш бактериальною та BipycH шфекщею (Jany et al., 1997, Adier et al., 1995), системш захворювання, злояюсш новоутворе! (Lalani, 1991) i брошиальну астму (Rose, 1992).

В роботах останшх роив було показано, що рад ендогенних та екзогенних факто]

жрема ростов! фактори, гормони, xímmiií препарата i патогенш М1крооргашзии можуть впливати i екгаресйо муцинових гетв в еттЫальних тканинах (Parry, 1992, Guzman et ai., 1995, An et al., )94, Gollub et al., 1995). Мехашзми контролю екслресп муцинових гетв e досить складнями i ожугь регулюватись на pÍ3imx р1внях, включаючи транскрипщю, сплайсинг мРНК i трансляцш )ohrman et al., 1994, Kovaric etal., 1998).

Внутрппня поверхня íiobík i передня поверхня очного яблука покрита нашвпрозорою розною мембраною. Вщомо, що мукозна оболонка ока виконуе ряд важливих функцщ зорового [ал1затора, а саме: а) шдтримуе гомеостаз в передньому вщр1зку ока; б) е бар'ером, яхий захщцае йтелщ очного яблука ввд пшдливих biuihbíb зовнштього середовшца, включаючи xímÍ4hí i ¡зячш подразним, збудники Bipycimx i бактер!алъних щфекцм; в) е адекватшш оптичним редовищем, що забезпечуе проникненяя свгоювого промшня до фоторецепторних клшщ гк1вки (Дубовская, 1984,Kanski, 1995).

BioxÍMÍ4HÍ i ricTOXÍMÍ4HÍ доапдження останшх роив вказують на те, що основним 1МПОНСИТОМ мукози е муцини, ш продукуються в еште.'иальнсму uiapi кон'юнктиви ока (Dilly, '96). 1снуе ряд патолопчних сташв, яи спричиняють структурш i функцюнальш змши в тсозшй оболонш кон'юнктиви ока людини.

Варто зазначити, що на сьогодш з ештел1альних тканин ока hí один з вдомих муцишв не в ¡зольований, а гени муцишв не були клоноваш. Не було також проведено детального анал)зу cnpeciii муцинових reniB в еште.пальних покривах ока здорово!' людини i при патолопчних юцесах. Все сказане свдаить про актуальность oGpaao'i проблема i необхщщсть подальших слцрсень у цш галузь

Зв'язок робота з науковими програиами, плавами, темами. Дисертащйна робота релщження експреси муцинових гешв в кон'ююспш ока людини" виконувалась за планом уково! робота кафедри офтальмологи Льв1вського державного медичного ушверситету в 1вроб1тництв1 з Бр1стольським Ушверситетом (Велика Британия).

Мета доелвдження. Основною метою робота було достижения експресп гетв ансмембранного (MUC1) та секрегоряих (MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, [JC7 i MUC8) муцишв в koh'iohkthbí ока людини методом пбридизацн in situ.

Завдапня дослщження. Вщповщно до поставлено!' мети було сформуяьовано таи адання:

провести анал13 нуклеотидних i амшокислотиих послвдовностей вадомих муцинових гешв з тою шдбору специф1чних проб для пбридизаци in situ;

отримати радшактивяо-м1чеш олтонуклеотидш дроби та перев1рити ефективтеть íx ридизадй' в тканинах, яи експресують муцинов1 гени у велиий юлькосп; доелгдити експресио траясмембранного (MUC1) та секреторних (MUC2-8) муцинових гетв в

ештетальному inapi кон'юнктиви ока людини.

Наукова новизна та практнчне значения одержали* результата. Вперше показано, с в кон'юнкпм ока людини експресуються три тили мудннових гешв, а саме: MUC1, MUC4 MUC5AC. Поеднання методу пбридизаци in situ з пстох1М1чним анашзом дозволило вивчи-експреспо даних гетв на ттинному piBHi. Експреск мРНК трансмембранного муцину (MUC була виявлена в клггияах сквамозного ештегпю кон'юнктиви i мае плямистий характ мюцезнаходження. На вдашу вщ MUC1, мРНК секреторного муцину MUC4 експресуеться в ус шарах ештелйо, iï експреая с гомогенною i збнаеться з локалаащею Гоблегових клгган. Ццса зазначити, що мРНК MUC5 АС виявляеться тшьки в базалыгому inapi ештелно кон'юнктиви з чга вираженим плямистим характером локал1заци. Отримат дан! е базою для вивчення змш експреса муцинових гешв при патолопчних станах ока, включаю чи запальш процеси, аукймун захворювання, деструктивш злннн спричинеш хЬнчотми та ф1зичними травмами, регенератив процеси та злояюсш новоутворення. Дана робота ввдкривае також: перспектива для пошук> впровадження в практику препарат, яп можугь регулювати експресйо муцимк в кон'юнкпш о людини при патолопчних станах.

Створено бактериальна й вектор для продукци рекомбшантного N-MUC4 (N-инцевий дом MUC4, що мктить тандемш повтори), експреая якого е найбшып вираженою в koh'kjhkthbî ока. Отримано клони бакгерй BL21 (DE3) pLysS, що експресують N-кшпевий домен MUC4 у велик кшькосп (з одного ллра шдукованих бактерш можна отримати бшя 3 мг рекомбшантного бшка) Розроблено методику афшно! очистки N-MUC4 на Talon Сефарозц що дозводяе очистити Н; tag/N-MUC4 практично до гомогенного стану. Наявтсть високоочищених препарат рекомбшантного N-MUC4 дозволило розлочатн роботу з отримання специф1чних моноклональи антитш, проводити дослщження по вивченню 6ioxiMi4Hnx властивостей тандемних повтор даного муцину, а також ¡шщюватн роботу по його кристашзацн з наступним з'ясуванш трьохм1рно1 оргатзацп методом рентгеноструктурного анал!зу.

Апробашя роботи. Основш положения дисертацп доповщались на конференщ Офтальмолопчного товариства Велико!' Британн (1996, 1997), М1жнароднш конференци "Loi Cancer Meeting" (Lorn, Australia, 1998), а також: на заседаниях кафедри офтальмолога i Вчено!'pa, Львшського державного медичного ущверситету та вцщшу Офтальмологи Брютольсько Утверситету.

ПублЫаци. За темою дисертацп опублковано 3 стагп у фахових наукових журналах, також 3 тези конференций.

Структура та обсяг роботи. Дисертацк складаеться ¡з вступу, огляду лггератур матер1алЬ i методов досладження, експериментальшн частини, обговорення результат, висновь та списку використаних джерел лггератури. Дисертацш викладено на 104 сторшках стандартно

ишинолйсу, М1стить 24 рисунки I 5 таблиць. Список використашл лиератури охошпое 93 [айменувань.

Особистпй внесок здобувача. Робота Гут I. Й. € особистим завершении дослщженням. /(етодолопчна основа науково'1 робота вщюввдае мел та завданням дослщження. Автор амостшно провела пошук лггератури за даною тематикою, здшснила експериментальш [ослщження, описала отримаш результата 1 сформулювала висновки експериментальноТ робота.

основнийзшст

МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛЩЖЕНННЯ

Зразки кон'юпктиви повиси i перехшгсн складки ока були отримаш вщ в!сшнаддяти ащотпв пад час xipypr¡4imx втручань з приводу ентрошону, ектротону i птозу. Зразки тканин хпунку, товстоТ i тонко! кишки, щдщелепноГ сливноГ залози, 6poHXÍB i раку молочшн залози були икористаш як позитивний контроль при вивчет експресн муцинових гешв.

За допомогою комп'ютерного аналхзу банив даних Swissprot i ЕМВО та програм для оргвняння бшкових i ДНКових иосладовностей (Bestflt i Fasta) було вщбрано 9 специфгаих лионуклеотидних послщовностей (довжиною 48 нуклеотщцв кожна), що вщповщають андемним повторам дев'яти муцинових гешв.

Олцхэнуклеотидщ проби сиптезували у вщдш Bíoxímíí Бр1стольського Ушверситеггу на (НК-синтезатор1 ф1рми "ABI". Очистку сшггезованих ол!гонуклеотщцв проводили за допомогою роматографц високого тиску у зворотнш фаз i на хроматограф! ф]'рми "Beckman". Для мочения лионуклеотидних проб використовували З'-дезоксинуклеотщпрансферазу ("Boehringer") i [a- S)]ATP, ("Amersham"). MÍ4eHÍ олпонуклеотиди очищали вад вшьного [(a-35S)]ATP за опомогою гель-фшьтрацп на колонках ф1рми "Stratagene". Ефектившсть включения адюактивно! mítkh в олшгауклеотидт проби визначали за допомогою багатоканального ¡чильника ф1рми "Beckman". Пбридизацш in situ отриманих 3pÍ3ÍB кон'юнктиви ока i онтрольних тканин з м1ченими пробами проводили за методом описаним в робой (Wilkinson, 994). Даний метод включав тай етапи: препбридизаццо, пбридизацш i виявлення адюактивного сигналу. Для вивчеиня пбридизацшного сигналу на юптинному pÍBHi икористовували cpiöity емульсш ф^рми "Кодак". Наявшсть радюактивно-активованих cpiÖHHx эанул у зразках анал1зували за допомогою свшгавого микроскопу ф1рми "Zeiss" в темному i свтгеному полях зору. Сиециф^чтсгъ пбридизацйгаого сигналу було тдтверджено анализом канин, в яких експресда муцинових гешв було показано в попередшх дослщженнях, а саме:

шлунок, товста i тонка кишка, щщцелепна слинна залоза, бронхи, трахея i рак молочжя залози.

Для ашшфшаци N-кщцевого фрагмента кДНК MUC4, з метою подальшого клонуванш бактер^алышй експресуючий вектор, було використано полшеразну ланцюгову peaxui Ефектившсть амшпфкацц ДНК MUC4 перев1ряли електрофорезом в агарозному rc;ii. Д створення 6aKTepianbHoro ехспресуючого вектора pET-15b/N-MUC4, амшйфшовану i плазмщ ДНК розщептовали рестриктазами "Ndel i BamHl ф!рм "Gibco BRL" i "New England Bioláb; Очистку фрагмента ДНК з агарозного гелю здшсшовали за дономогою набору для екстрак ДНК ффми "Qiagen". РеакцЬо лпуванпя проводили з використанням ДНК лпази ф1рми "Gib BRL". Компетентш 6ajrrcpianbni клггини пггашв XLl-Blue (¡¡¡рш "Stratagene" i BL21 (DE3) pLy ффми "Novagene" буди використаш для трансформацн продуктами лпування. Очистку плазмда ДНК з бактерШ проводили за допомогою набору "Qiaex" ф1рми "Qiagen". Присутшсть фрагмен кДНК MUC4 в плазмвднш ДНК виявляли рестрикцшним анал1зом i електрофорезом в 1 агарозному reni.

Експреспо рекомбшантного N-MUC4 в ôarrepiax лши BL21 (DE3) pLysS, трансформован плазмвдою pET-15b/MUC4, шдукували 1зопрошл-Р-Д-тюгалактозидом. Наявшс рекомбшантного N-MUC4 в лпатак ¡ндукованих i нешдукованих бактер^альних кшт перев!ряли електрофорезом в пол1акриламдному гсл! i методом шуноблотингу. Очист peKOM6ÍHaHTHoro His-tag/N-MUC4 з jii3ariB шдукованих бактерШ проводили за допомогою афт хроматографа на колонщ, упакованШ hocíem "Talon." ф1рми "Novagen". Рекомбшантний бш елюювали з колонки буфером, до складу якого входило ОД M гмщазолу. Кшьисний i ямсы aaanÍ3 очшценого N-MUC4 проводили спекгрофотометрично i електрофорезом шшакриламщному reni.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛЩЖЕНЬ ТА ÏX ОБГОВОРЕННЯ

АналЬ муцинових renie i niflGip проб для пбрвдизаци in situ. Специфка оргашза муцинових гешв стала основним критерием падбору олшзнуклеотидних проб для пбридшацп situ. У таблищ 1 наведено шдсумок детального анашзу тандемних noBTopiß дев'яти вщом муцшпв, який базувався на використанш бшкового банку даних Swissprot i програм для вивчен гомологи на бшковому i ДНКовому pißHsx (Bestflt i Fasta). Вдабраш олшшуклеотид послщовноот були проаналиоваш в геномному банку даних для пермирки ïx специф1чност ступеня виродженосп.

Таблиця 1

Характеристика тавдемних повторш трансмембранного (MUC1) i секреторних (MUC2-MUC8) муцишв

Муцини Сндаенс тандемиих повтор]в Довжина (ак) KLibKicTb nOBTOpiB

MUC1 PDTRPAPQSTAPPAHGVTSA 20 4-7

MUC2 PTTTPITTTTTVTPTPTPTGTQT 23 8

MUC3 HSTPSPTSSITTTGTTS 17 13

MUC4 TSSASTGHATPLPVTD 16 10

MUC5AC TTSTTSAP 8 не в ¡до мо

MUC5B SSTPGTAHTLTVLTTTATTPTATGSTAT 29 не вадомо

MUC6 один з найдовших повтор1в (169 ак) 169 не виомо

MUC7 CRPKLPPSPNKPPKFPNPHQPPK 23 не ведомо

MUC8 два повтори (довжиною 13 i 41 ак) 13/41 не вшомо

Синтез, очистка i радюактивне М1чення олконуклеотидних проб. Дев'ять пгонуклеотидних проб, що вщповщають тандемним повторам вщповщних муцинових reiiiB, гаи синтезоваш на ДНК синтезатор! i очищеш до гомогенного стану за допомогою хроматографа зворотнш фаз!. Варто зазначитя, що даний етап був необхщним для того, щоб позбутися игонуклеотидав синтез яких не був завершении, осильки наявшсть вкорочених ол!гонуклеотид!в пбридизацШшй cyMiini може призвести до появи неспециф!чного зв'язування i отримання :достов1рних результат!в. М)чеиня олконуклеотидних проб проводили з використанням ct-35S)]ATP i дезоксинуклеотид-трансферази. Mi4em ол!гонуклеотиди вщдщяли вщ [(a-35S)]ATP, о не включився, гель-фшьтращею. В кшцевому результат!, нами були отримат i використан! для юлщжень Mi4em проби з високого нитомою актившстю: вщ 1,4 до 3,7 х 108iMn/xB'V мкг"1.

Дослщження експресн муцинових генш в кон'кшктнв1 ока людини. За допомогою ггоду пбридизацп in situ, було вивчено експресио трансмембранного (MUC1) та секреторних 4UC2, MUC3. MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6. MUC7 i MUC8) муцинових ген!в в кои'юшшш :а людини. Результата даного анализу показали, що в кон'юнктивальяому ештелп експресуються in типи муцинових ген!в, а саме: MUC1, MUC4 i MUC5AC (таблиця 2).

Таблица

Експремя муцинових гешв в кон'юнкгии ока людини. Ршень експреси: (+++) - вясохий, (++) -середшй, (+) - слабкий, (-) не виявляеться

Муциии Ьггепсившсть сигналу Характер сигналу Гнтенсившсть сигналу в контрольное тканинах

MUC1 + плямистий +++ рак молочно? залози

MUC2 - - + тонка кишка

MUC3 - - ++ ш лунок

MUC4 +++ гомогенний +++ бронхи

MUC5AC ++ плямистий + товста кишка

MUC5B - - + бронхи

MUC6 - - + шлунок

MUC7 - - +++ пщщелепна залоза

MUC8 - - +бронхи

а) анал1з експреси грансмембранного MUC1 в кон'юнктнв1 ока. На сьогодш вщом* лише один тип трансмембранного муцину MUC1, експресто якого було виявлено в еттел1альш тканинах майже Bcix оргаив людини, за виключениям яечнигав, Високий ревень експрес гшоглкозильовано! форми MUC1 було показано в пухлинах ештел!ального походженн включаючи рак молочно! залози, шлунку i tobctoi кишки.

При аналЫ зразюв кон'юнкгиви ока людини методом пбридизацц in situ, було виявле! специф1чний пбридизацШний сигнал з меченою MUC1 пробою. Варто зазначити, що в пор1внян з раком молочно1 залози (позитивнкй контроль), експреая мРНК MUC1 в кон'юнтив1 ока е знач! слабшою. Найб1яьш штепсивний пбридизиййний сигнал виявлено в нижшх шар< кон'юнктивального eniraiiio, що прилягають до базальноТ мембрани. Важливо також зазначит що локал1зац!я мРНК MUC1 не с гомогенною, а мае досигь виражений плямистий характе Поеднання пстох1м1чного анал1зу i методу гШридизаци in situ показало, що локалпащя мРН MUC1 не збхгасться з мкщезнаходженням Гоблетових клтш, як! вццгавщають за секрещ основних компонента мукозно! оболонки, включаючи муцини. Мйсроскотчний анал пбридизованих зршв показав, що мРНК MUC1 експресуетьея в клшшах сквамозного епггелда.

Отримаш результата вказують на те, що: а) мРНК MUC1 експресуетьея в ycix шар кон'юнктиви ока людини; б) експрес1я MUC1 е найбшып вираженою в базальному inapi ештелш мае плямистий характер локашзаци; в) мРНК MUC1 експресуеться не в Гоблетовнх клшжах, а сквамозному еттелп.

На шдсташ анашзу po6iT i3 вивчення poni MUC1 в пшшх еплтальних тканинах можна робити припущення, що даний муцин Biairpae важливу роль в функци зорового анатзатора, а аме:

а) разом з секреторними муцинами бере акгивпу участь в стабшзацп сльозово! шнвки. Це южна пояснити специфшого структури MUC1, позаклггинний домен якого включае розгалужет углевода, яи можуть зв'язуватись з секреторними муцинами мукозного шару сльозово1 шпвки;

б) ввдграе роль "якоря", що дозволяе фшсувати мукозний шар кон'юпктиви на апкалыий оверхш ештел1альних клшш. Трансмембранний i цитоплазматичний домени MUC1 утримують [асивний позаклгашшй домен на поверхш адкального ештедоо;

в) розгалужена оргашзаци масивного позаклггаиного домену е там "шкопротешовим келетом", який шдтримуе просторову структуру мукозного шару кон'юнктиви;

г) бере участь в формуванш захисного бар'еру, який попереджуе проникнепня патогенних :кроорган1зм1в i чужорщних тш у нижш шари кон'юнктиви.

б) характеристика експреси секреторних муцитв в koh'iohkthbi ока людини. Метод ¿бридизаци in situ дозволив виявита eKcnpeciio тшьки двох секреторних муцин!в, а саме MUC4 i ШС5АС в ештел1альному niapi кон'юнктиви ока. Mi4CHa MUC4 проба дала силыгай бридизацшний сигнал, який збгаеться з локшшащею кон'юнкгивальпого епиелда (рис. 3).

Мкроскошчний анализ пбридизовшшх 3pi3iB в светлому i темному полях зору виявив аявшсть радюактивно-активованих гранул ср1бла в ycix шарах ештелно кон'юнктиви, як! дповщали мкцезнаходженню м1чеяо1' проби а, вщповщно, i мРНК MUC4. На вщмту в!д MUC1, кспреия мРНК MUC4 мае гомогепний характер локаизацн по веш товщиш кон'юнктивального шелно. 1мунопстох1м1ч1мй анашз пбридизованих 3pi3iB показав, що пбридизацйний сигнал мвлясться в Гоблетових клшшах, як! локалиуються т!льки в ашкальяому mapi ештелио эн'юнктиви.

Експреия мРНК MUC5AC виявляетъея тгльки в базальному mapi кон'юнктивального зггелно. В nopiBiMHHi з MUC4, експреси мРНК MUC5AC мае виражевий плямистий характер гсцезнаходження. Отримаш результата евщчать про те, що MUC4 i MUC5AC експресуються в ¡зних популяц!ях кон'юнктивального еттелпо. За допомогою ricToxiMiniroro анал!зу було оказано, що Гоблетов! секреторн! кштшш не мютять мРНК MUC5AC. Варто також зазначити, що ггенсившсть MUC5AC пбридизащйлого сигналу була набагато слабшою пор!вняно з сигналом, гриманим при пбридизаци з MUC4 м!ченою пробою.

Тканини раку молочно! залози, бронх!в i товсто! кишки людини мали високий р!вень ccnpecii' мРНК MUC1, MUC4 i MUC5AC i булн використан! як позитявний контроль методу бридизацп in situ.

Рис.3. Лсжал1эац1я г1бридизац1й1югч> сигналу МУС4 у зр!з! кон'юнктиви ока людини. Про наявшсть мРНК МЦС4 сйдчать темн! граиули в освггленоыу пол! зору при сильному збШьшешй. Шкала вим1ру - Ю мкм.

Шдсумовуючи отримаш результата з вивчення експреси секреторних муцишв коню'нктив! ока, можна зробита так! висновки: а) в ештелн кон'юнктиви ока люди експресуються тшыш два секретарш муцини - М1ГС4 1 МиС5АС; б) М11С4 експресуеться в ус шарах еттелно кон'юнктиви ока людини, тод1 як МиС5АС - тшыш в базальному шар!; експресш мРНК М11С4 характеризуется гомогешпш характером локал1заци, а мРНК МиС5/ вираженим плямистим; г) р!вень експреси М1ГС4 е набагато вищим пор1вняно з мРНК М1)С5АС Отримаш результата е основою для вивчення змш в експреси муцншв при патолопчн станах, включаючи кон'юнктивки в1русного 1 бактериального походження, регенеративш проце теля х!м1чних та ф1зичних травм, злояккт новоутворення, а також симптом "сухого ока".

Експреоя 1 очистка рекомбшантного М11С4. Зважаючи на те, що експреоя МИС^ найбшьш вираженою в кон'юнкпш ока людини 1 те, що бюхипчт властивоси 1 функщя дан< муцину е слабо внвчешши, було вирнпено експресувата рекомбшантний Ы-юнцевий до\ МиС4, який кодуе тандемш повтори.

На сьогодш ¡снуе ряд систем експресн, ям дозволяють продукувати рекомбшантт бшк велиий киькостк В експерименталынй практищ найчаепше використовуються системи експр( в бактериях, клшшах комах (бакулов1русна система) та клггинах ссавщв.

Для отримання рекомбшантного 1М-МиС4 ми вибрали бактер1альну систему експреси р!

юзроблену Стадаером (Studier 1986) i Розенбергом (Rosenberg 1987). В дашй систем! експрес1я )екомбшантяого бшка знаходиться шд контролем сильного промотора Т7 РНК польмерази. В :вою 4epiy, транскршщю даного гена, яка контролюеться Lac UV5 промотором, шдукують ШТГ. ншою важливою характеристикою aiei' системи е низький р1вень транскрипцШюп активное«, а, йдповщно, i експресц рекомбшантного 6iinca в нешдукованих бактериях. Важливо зазначити, що )яд вектор1в системи рЕТ (рЕТ-15, рЕГ-22, рЕТ-23) дозволяють експресувати рекомбшантний цлок в поеднанш з His-tag епгаопом. Наявшстъ даного ештопу дае можлив5сть очистити >екомбшантний бшок за допомогою афшно! хроматографн.

Стратега кловування ДНК MUC4. Для клонування N-индевого фрагмента ДНК MUC4 в iET-15b вектор, було викоркстано потмеразку ланщогову реакцпо. Стратегио клонування [редставлено на рис. 4.

плр

Nds1

BamH1

Шгування в РЕТ-15Ь вектор

Трансформация коыахетевтнха: бахтерШ

Аватйз плазийднше ДНК на я&этвМстъ MUC4 вставки

4

4

Рис.4. Стратегия клонування N-KiHUesoro фрагменту кДНК MUC4 в рЕТ-15Ь вектор.

Реакщю амптфжадШ-кшцевого фрагмента ДНК MUC4 (1200 нуклеотвдв), рестрикщй переварювання i лнування ампнфжовано! ДНК i рЕТ-15Ь вектора проводили за стандарт!» методом, як описано в "Матер1алах i методах доыиджень". Використання висококомпетентн) юитин штаму XL-1 Blue для трансформаци продуктами лнування (N-MUC4 ДНК i рЕТ-1: вектор) дозволило отримати велику гальюсть ампщилш-резистентних колонШ. Щцрахун юлькосп колошй, яи виросли на чашках nerpi в присутносп амшцилшу показав, що ефектившс лнування N-iVfUC4 ДНК в рЕТ- 15Ь вектор була достатньо високою. Для ¡дентифкацн колонш, i мгстять рЕТ-15Ь вектор b MUC4 вставкою було проведено рестрикщйний анал1з очищен) плазмдашх ДНК з викорисганням Ndel i BamHI рестрикгаз. Результата проведеного анал! показали, що серед 12 вдабраних ампщилш-резистентних колонш, 9 Mi стили рЕТ-15Ь плазмщ ДНК ¡з N-MUC4 вставкою.

Експресш i афшна очистка рекомбшантного N-MUC4. На настушюму еташ необхщ було nepeeipHTH ревень експреси рекомбшантного N-MUC4 в дванаддяти вццбрак бактср1альиих клонах. 1ндукцио експреси здшсшовали за допомогою 1ПТГ. Бшсн тза! бактер1альних юнтин до i теля шдукци роздшялн в 10 % штакриламщному reni i фарбували допомогою Кумам голубого R-250. Анатз отримапоТ електрофореграми показав наявте додатково! смути з мол. масою близько 48 кДа плыш в л1затах шдукованих бактерШ, що бу. трансформоваш рекомбшантним рЕТ-15Ь вектором з MUC4 вставкою. 1муноблоти бактер1альних лдзатш i3 специф1чними антитшами проти His-tag тдтвердив наше припущення, п те що додаткова бикова смута з молекулярного масою 48 кДа вщловщае рекомбшантному Н tag/N-MUC4.

Подальший аналп шдукованнх бактер^альних лаата показав, що рекомбшантний N-MU< експресуеться як детергент-розчинний (Тритон Х-100) бшок. Ця властивкть рекомбшантного MUC4 була важливим фактором для його подалышц очистки за допомогою афпшоТ хроматограф

Таким чином, нами було отримано 9 бактер1альних клошв, яи експресук рекомбшантний N-MUC4. Наявшсть на N-Kiiiui MUC4 шести залишюв пстидину забезпечи можливють очистки рекомбшантного бшеа за допомогою аф1нно1 хроматограф» на Та1 Сефарозь Як видно з рис. 5, за допомогою лише одного етапу очистки на Талон Сефароз1 бу отримано препарат рекомбшантного N-MUC4 з чистотою бшыпе шж 95 %.

На ochobi анализу проведение експерименив можна зробити Taxi висновки: a) 6aicrepiam система експреси бшшв рЕТ-15Ь дозволяе наробляти детергент-розчинний N-MUC4 мшграмових кшькостях; б) за допомогою афщно! хроматографц, His-tag/N-MUC4 мож очистити з л1зат1в бакгер1альних клггин практично до гомогенного стану.

Наявтсть рекомбшантного N-MUC4 дала можливкть розпочати роботу з отримання пещфчних моноклональних антитиг, а також вивчешпо його структури та бюхМчних ластивостей.

Чге.5. Аф!нна очистка His-tag/N-MUC4 на Talon Сефароз1 э 1ндукованих бактерШ niniï pLvsS ЭЕЗ.

- я1эат неищукованих бак.тер1й-. 1 - л1зат 1ндуковаиих бактерШ:

i - фракция бшк)в, 1до не эп'яоалась до Talon Сефарози; 4 - фракция 61лк1в, що вимилась з Talon Сефарози 15 мМ 1и!дазолоы; 5 - фракц1я CLriKiB. яку елюювали з Talon Сефарози 200 мМ м'вдазолом:

1. На основ1 детального анал1зу нуклеотидних та амшокислотних посл1довностей дев'яти уцинових гешв було пдабрано специфгчш оляшуклеотидш проби для проведения досладжень етодом пбридизацн in situ. Специфчтсгь пбридизащйного сигналу з радюактивними пробами speBipeHo на тканинах, в яких експресм муцинових гешв була вивчена раяше.

2. Вперше показано, що в кон'юшгпш ока лзодини експресуються три типи муцинових ;шв, а саме: MUC1, MUC4 i MUC5AC. Експресш трансмембрапного муцину MUC1 виявлено у :ix шарах сквамозного ештелно кон'ююсгиви. Секреторний муцин MUC4 експресуеться в ycix :арах ештелйо кон'юнктиви i ця експреск мае гомогенний характер локал^зацн. мРНК MUC5AC яявляеться лише в базалъному impi кон'юнктивального ештелпо i мае виражений плямистий фактер розповсюдженпя. Отримаш результата е базовими для вивчення змш в експреси уцинових гешв при патололчних станах ока, вюпочаючи зал алый процеси (кон'юнктивгги), (ToiMyHHi захворювання (синдром Спвенса Джонсона, Cicatrical pempliigoid), деструктавш змши ;iMi4Hi та ф1зичш травми), регенеративш процеси та злояысний picT.

kDa 1 2 3 4 S

.»His-tag/N-MUC4

висновки

3. Створено бактер1альний вектор для експресп фрагмента MUC4, що листать тандем] повтори. Отримано клони трансформованих бакгер1Й в яких рекомбшантний бшок експресуеться мшграмових кшькостях.

4. Розроблено методику афшно'/ очистки N-юнцевого фрагмента MUC4 на Talon Сефаро; що дозволяе отримати велику ыльюсть рекомбшантного бшка.

5. Наявшсть рекомбшантного N-MUC4 дозволила розпочатн роботу з отримат специф1чних моноклональних антитш, а також вивчснню 6ioxiMi4HHX властивостей дано! муцину.

СПИСОК РОБ1Т ОПУБЛ1КОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦП

1. Ellingham R.B., Myerscough N., Gout I.I./ Вепу М., Corfield A. Soluble mucins in human aqueoi tears / / Biochemical Society Transactions. -1997,- 25. N 3.- P.12-16.

2. Рут I.I., Елшгем P., Icri Д., Семенова P.C. Вивчения експресн секрегорних муцишв кон'юпкгив1 ока людини//Биополимеры и клетка.-1998.- 14.N 1.- С. 29-38.

3. Gout I.I. Structure and function of epithelial mucins. Review // Биополимеры и клетка,-1998.- 14. 5.- C.410-419.

4. Gout 1.1./ Ellingham R. В., Berry M. Biochemical properties of mucins in the human conjunctiva South Western Ophthalmological Society Meeting. Bristol, United Kingdom, June 1996,- P.72.

5. Gout I.I./ Ellingham R.B., Easty D. In situ hybridisation for MUC genes in human conjunctiva // Sou Western Ophthalmological Society Meeting. Bristol, United Kingdom, June 1997,- P. 132.

6. Gout I.I. Expression of transmembrane mucin MUC1 in human conjunctiva // Lorn Cancer Meetin Lorn, Australia/ February 1998,- P.147.

АНОТАЦП

Гут I И. Дослщжсння експрссн муциновнх гешв в кон'юнктив1 ока людини. -Рукопис

Дисертащя на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук за спещальтст 03.00.03 - молекулярна бюлопя. 1нститут молекулярно! бюлогц i генетики НАН Укра1ни, Кш 2000.

Захищаеться робота, в якш наведено результата дослщжень i3 вивчення експрес муцинових гешв в кон'юнкгив! ока людини методом пбридизацн in situ. Вперше показано, н серед дев'яти вщомих на сьогодт муцинових renie, в ештелн кон'юнктиви експресуюты трансмембранний MUC1 та секретарш (MUC4 i MUC5AC) муцини. Експресш вщповщних ген було дослщжено на юптинному piBHi поеднанням метода пбридизащ! in situ, ricToxiMi'i 1

MiKpocKoniï в темному i освп\леному полях зору. Створено бактер1альну систему експреси', яка дозволяе продукувати рекомбшантний N-кшцеаий фрагмент MUC4 (N-MUC4) у великих кшькостях. Поряд з тим, розроблено методику очистки рекомбшантного N-MUC4 за допомогою афшшн хроматографа. Отримаш результата е базою для виявлення змш в експреси муцинових гешв при патолопчних станах ока, а також проведения дослщженнь з вивчекня бюх1М1чних властивостей секреторного муцину MUC4.

Ключов1 слова: ештелш, кон'юнктива ока, експресш, муцинов1 гени, рекомбщантний

бш>К.

Гут И. И. Исследование экспрессии муциновых генов в конъюнктиве глаза человека. -Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03. - молекулярная биология. Институт молекулярной биологии и генетики HAH Украины, Киев, 2000.

Защищается работа, в которой приведены результаты исследований по изучению экспрессии муциновых генов в конъюнктиве глаза человека методом гибридизации in situ. На эсновапии проведенного анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей девяти пуциновых генов были отобраны специфические олигонуклеотидные пробы, которые юответствуют их тандемным повторам. Специфичность гибридизации радиоактивно-меченных злигонуклеотидних проб проверяли в тканях с высоким уровнем экспрессии муцинов.

Впервые показано, что среди девяти известных на сегодняшний день муциновых генов, в шителии конъюнктивы экспрессируются трансмембранный (MUC1) и секреторные (MUC4 и VÎUC5AC) муцины. Экспрессия даных генов была исследована на клеточном уровне сочетанием летодов гибридизации in situ, гистохимии и микроскопии в темном и освещенном полях зрения, эыло показано, что мРНК трансмембранного муцина MUC1 экспрессируегся в клетках ;квамозпого эпителия конъюнктивы и имеет пятнистый характер локализации. В отличие от vlUCl, мРНК секреторного муцина MUC4 выявляется во всех слоях конъюнктивального эпителия i носит гомогенный характер распределения. мРНК MUC5AC экспрессируется в базалыюм слое :онъюнктивы и имеет пятнистый характер локализации как и MUC1.

Создана бактериальная система экспрессии рекомбинантного N-концевого фрагмента ЛиС4 (N-MUC4), которая позволяет продуцировать рекомбинантный белок в больших юличествах. Вместе с тем, разработана методика очистки рекомбинантного His-tag/N-MUC4 с юмощью афинной хроматографии на Talon Сефарозе. Наличие высокоочшценных препаратов 1екомбинантного N-MUC4 открыло перспективы для получения специфических моноклональных

антител и изучения трехмерной структуры тандемных повторов этого муцина. Получении результаты являются базой для изучения изменений в экспрессии муциновых генов пр патологических состояниях глаз, а также проведения исследований по изучению биохимически свойств секреторного муцина MUC4.

Ключевые слова: эпителий, конъюнктива глаза, экспрессия, муциновые геш рекомбинантный белок.

Gout 1.1. The study of expression of mucin genes in human conjunctiva. -Manuscript.

The thesis is for seeking of a PhD degree in molecular biology.- Institute of Molecular Bioloj and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

The manusript presents the data on the expression of nine mucin genes in human conjunctiva. T1 technique of in situ hybridization was used to demonstrate that only three mucin genes (transmembrai MUC1 and secretory MUC4 and MUC5AC) are expressed in conjunctival epithelium. The combinatic of in situ hybridisation, immunohistochemistry and light microscopy allowed us to study the expressic of these genes on cellular level. At the same time, bacterial expression system was established for tl production of the N-terminal domain of MUC4/ which contains 3 tandem repeats. Recombinant protein could be purified in large quantities and nearly to homogeneity with the use < affinity purification on Talon Sepharose. The obtained data have created the base to study the changes mucin gene expression under pathological conditions and to initiate experiments on biochemic characterisation of secretory mucin MUC4.

Key words: epithelium/ human conjunctiva, expression, mucin genes, recombinant protein.

ff

Высокотемпературный стресс. Молекулярная гетерогенность

Таблица

Rf Суши 7 14 21 28 35 42 49 56 63

0,08 контроль 55,74 69,55 77,57 67,29 65,94 68,14 55,54 56,14

стресс 57,45 74,07 73,86 77,22 59,25 56,16 65,74 60,52 63,03

стресс + адаптация 78,95 80,79 75,13 73,93 77,96 76,29 81,08 80,46 71,58

0,10 контроль 37,13 17,40 19,36 22,50 21,98 22,72 37,03 37,42

стресс 28,72 14,87 14,77 12,88 23,70 25,95 21,93 24,20 25,28

стресс + адаптация 12,64 10,77 15,03 9,74 12,99 14,88 11,58 13,46 21,49

0,14 контроль 5,58 8,71 1,84 8,44 8,24 7,18 5,57 4,69

стресс 11,51 9,89 9,84 7,73 11,85 16,87 10,97 12,10 10,11

стресс + адаптация 5,75 5,87 5,64 4,74 5,19 5,94 4,66 4,59 5,38

ОД 7 Контроль - - - 1,47 - ■ ■

Стресс 1,82 0,87 1,23 1,78 4,74 0,70 1,00 2,69 1,27

Стресс + адаптация 2,11 2,02 3,76 2,37 3,34 4,25 2,32 1,15 1,09

0,26 Контроль 1,55 4,34 1,23 1,77 2,37 1,96 1,86 1,75

Стресс 0,50 0,30 0,30 0,39 0,46 0,32 0,36 0,49 0,31

Стресс +-адаптация 0,55 0,55 0,44 0,22 0,52 0,64 0,36 0„34 0,46

Таким образом, изучение культуры ткани Rauwolfia seipentina показало значительное отличие от контроля в их биосинтетической способности как по отношению к общему белку, так и к пероксидазе, что может указывать на определенные метаболические различия, связанные с обменом кислорода в клетках каллусных культур. Изучение влияния низко- и высокотемпературного стресса на уровень активности, молекулярную гетерогенность и обмен пероксидазы подтвердило данные о повышенной чувствительности этого фермента к действию стресс-факторов и его вкладе в обеспечение функционирования клетки в изменившихся условиях

ВЫВОДЫ

1. В штамме Rauwolfia serpentina установлено наличие максимума активности пероксидазы на 35-е сутки культивирования.

2. Разработан метод выделения и очистки пероксидазы. Выход ферментативного белка составлял 20% при степени его очистки 54 раза. Идентифицированы две молекулярные формы пероксидазы с молекулярными массами 30,5 и 32,7 кДа

3. Впервые изучены синтез и стабильность пероксидазы. Установлено, что в сутки синтезируется 1,06 мг пероксидазы и время ее

4. Изучена белоксинтезирукяцая способность клеток Rauwolfia serpentina. Установлено, что в сутки синтезируется 1,06 мг белка из расчета на 1 г ткани со временем "полужизни" новосинтезированного белка 6,4 суток. Установлен факт секреции белка во внеклеточное пространство.

5. Изучено влияние температурного шока на молекулярную гетерогенность, обмен, и секрецию пероксидазы в культивируемых клетках Rauwolfia serpentina. Установлено снижение скоростей синтеза и распада фермента под действием как высоких так и низких температур.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Комов В.П. Троицкая JI.A. Мулла А. Пероксидаза каллусной культуры ткани Rauwolfia serpentina, штамм К-47 // Тез. докл. Межд. конф. "Фармация в XXI веке: Инновации и традиции." СПб, 1999. С 40.

2. Комов В.П. Троицкая JI.A. Мулла А. Характеристика пероксидазы каллусной культуры ткани Rauwolfia serpentina, штамм К-47 // Растительные ресурсы. 2000. № 4. С. 427-432.