Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гликопротеин муцинового типа (муцин-D) в клетках DROSOPНILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гликопротеин муцинового типа (муцин-D) в клетках DROSOPНILA MELANOGASTER"

На правах рукописи

Л

ПОЧЕЧУЕВ А Татьяна Валентиновна

ГЛИКОПРОТЕИН МУЦИНОВОГО ТИПА (МУЦИП-Ц) В КЛЕТКАХ БМЖтША \fELANOGASTER

03 00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

В.А. Гвоздев

кандидат биологических наук А.А.Крамеров

Официальные оппоненты: член-корр. РАН, профессор

И.С.Кулаев

кандидат биологических наук И.А.Гривенников

Ведущая организация: Институт биоорганической химии РАН

Защита состоится 1997г. в час.

на заседании Диссертационного совета Д 051.05.32 при Московском Государственном Университете им.М.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " 6 " 19971

Ученый секретарь Совета кандидат биологических наук

М.В.Иванов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гликопротеины участвуют в обеспечении жизненно важных функций клеток. Показана, в основном на позвоночных, их значительная роль в процессах межклеточного узнавания, цитодифференцировки и морфогенеза. Гликопротеинами являются биологически активные макромолекулы - гормоны, ферменты, иммуноглобулины, групповые вещества крови, транспортные белки, интерферон и др. В последнее время уделяется пристальное внимание изучению гликопротеинов муцинового типа позвоночных, которые, наряду с протеогликанами, являются важным компонентом внеклеточного мат-рикса. Муцины секретируются эпителиями пищеварительного, дыхательного тракта, слюнных желез, почек, половой системы и т.д. Активно исследуется структура, биосинтез и возможные функции муцинов как защитного барьера между клеткой и внешним окружением, и как компонента внеклеточного матрикса, определяющего способность клетки к дифференцировке или пролиферации. Муцины выступают и как маркеры раковых клеток, поскольку структура и свойства муцинов меняются при опухолевом перерождении. Общими биохимическими характеристиками муцинов являются: высокое содержание 0-связанного через N-ацетилгалактозамин с серином или треонином углеводного компонента, а также его микрогетерогенность; аминокислотные повторы, включающие сайты О-гликозилирования и обогащенные серином и треонином; преобладание 5-ти аминокислот (ала-нина, глицина, пролина, треонина, серина); наличие домена, богатого цистеином (Verma & Davidson,1994).

В отличие гликопротеинов позвоночных, гликопротеины насекомых остаются еще мало изученными, а исследования гликопротеинов класса муцинов практически не начаты. В связи с этим представляет интерес исследование структуры и свойств гликопротеина, составляющего главную фракцию новообразованных гликопротеинов, синтезирующихся в культуре клеток Drosophila теlanogaster. В результате настоящей работы он был охарактеризован как гликопроте-ин муцинового типа (куции-D). Таким образом, муциновый гликопро-теин был впервые обнаружен у насекомых. Иммуногистохимические исследования показали широкое распространение муцина-D в различных типах клеток и тканей дрозофилы, что может указывать на его мультифункциональную роль у насекомых.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в биохимической характеристике гликопротеина Drosophila melanogas-

ter, его белкового и углеводного компонентов. В работе также исследовали секрецию и тканевую локализацию муцина-D.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые у насекомых был охарактеризован гликопротеин класса муцинов (му-цин-D). Разработана методика его выделения из культуры клеток дрозофилы, проведено ферментативное дегликозилирование гликопро-теина, проанализированы его белковый и углеводный компоненты, состав и строение которых позволяют отнести исследуемый гликопротеин к классу муциновых гликопротеинов, ранее не описанных у насекомых. Исследована секреция муцина-D в линиях пересеваемых клеток дрозофилы, регулируемая гормоном линьки насекомых - эк-дистероном. Данные иммуногистохикической локализации муцина-D в тканях разного происхождения указывают на его возможную полифункциональную роль у насекомых. Исследование муцина-D позволит расширить представления о структуре и биологической роли этого класса соединений у животных.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на ежегодных научных конференциях ИМГ РАН (Москва, 1992, 1993, 1S94), 14й конференции FECTS (Лион, Франция, 1994).

Объем диссертации■ Материал диссертации изложен на 138 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 5 таблиц. Список цитированной литературы состоит из 201 работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе использовали две пересеваемые культуры клеток Dr.melanogaster (67j25D (Dm) и Schneider-2 (S-2)),a также пересеваемые культуры клеток Dr.virilis, Dr.hydei, клеточная линия тутового шелкопряда В.mori и эмбриональная клеточная линия комара A.aegypti.

Экдистерон (20-гидроксиэкдиэон, "Serva", ФРГ) - 1 мкМ, монен-зин -10 мкг/мл) и брефельдин A ("Sigma", США)-10 мкг/мл добавляли к суспензии клеток (1 млн клеток в мл) при пересеве. Радиоактивный предшественник ([3Н]-GlcNac, .20-30 мкКи/мл;"Изотоп", Санкт-Петербург) добавляли к суспензии клеток при рассеве.

Для получения лизата клетки отмывали от среды в солевом растворе С-15 (Gvozdev et al., 1980), лизировали в 0,5% тритоне Х100 в С-15 и осаждали ядра центрифугированием при 800д 10 мин

при 4°С. Очистку гликопротеина из лизата культуры клеток Dm проводили с использованием ограниченного протеолиза (нроназа Е, 20 мкг/мл, 2 часа при 37°С), преципитации термолабильных белков, препаративного электрофореза по Лэммли с последующей экстракцией из геля (подробнее см."Результаты").

Моноклональные антитела против очищенного гликопротеина были получены клонированием положительных клонов методом конечных разведений по стандартным методикам (Браун, Линг, 1991). Для скрининга клонов использовался метод дот- и блот-анализа.

Электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях проводили по Laemmli (1970) в 0,035 Н трис-глициновом буфере, 0.1 % SDS, pH 8,9 и на минигелях ("PhastSystem", Pharmacia).

Электроблоттинг проводили в 20 мМ Na-боратном буфере, pH 9,2 на нитроцеллюлозную мембрану BA-S5 ("Shleicher &

Shuel1",ФРГ).Блоты окрашивали иммунохимически после инкубации фильтров с моно(1:1000) или поликлональными антителами (1:100), выявляемыми соответствующими вторичными антителами, конъюгиро-ванными с щелочной фосфатаэой (1:1000).

Белок определяли микрометодом Брэдфорда (Bradford, 19В6) .

Радиоактивность фракций после электрофореза выявляли флуоро-ографией гелей, пропитанных 2М салицилатом натрия и высушенных под вакуумом.

В работе был использован полученный А.Крамеровым меченный [1251] препарат гликопротеина.

Очищенный препарат гликопротеина обрабатывали о-гликаназой (эндо-ОС-М-ацетилгалактозаминидазой, К.Ф.3.2.1.97, "Boehringer -Mannheim", Австрия) соотношении 1:100 (в/в) в 50 мМ натрий-фосфатном буфере (pH 7.0) при 37°С , а также трипсином или проте-аэой V8 ("Sigma", США) в молярном соотношении 1:100 при 37°С. Продукты расщепления гликопротеина разделяли гель-хроматографией на сефадексе G-50 в 0,1 М NH4C00H буфере. Элюируемую белковую часть гликопротеина лиофильно высушивали и после кислотного гидролиза в смеси 1:2 трихлоруксусной и соляной кислот при 140°С в течение 1ч использовали для определения аминокислотного состава на аминокислотном анализаторе 835 Hitachi.

Фракции олигосахаридов, полученных как обработкой 0-гликана-зой, так и щелочным элиминированием (с использованием щелочного NaBH4 по Карлсону (Carlsson,1968)) хроматографировали на колонке

TSK-HW-40 (гель-фильтрация), а затем - методом ВЭЖХ - на колонке Ultrasphere С-18 ("Altex", США). Количественный анализ углеводов и аминокислот проводили с использованием анализатора Biotronik. LC-200 (ФРГ) после кислотного гидролиза. Данные углеводного и аминокислотного анализа гликопротеина получены в сотрудничестве с Н.П.Арбатским (Институт органической химии РАН) и Л.А.Барато-вой (Молекулярный корпус МГУ).

Личинки 3-его возраста, куколки и имаго D.melanogaster фиксировали в жидкости Буэна и заключали в гистопласт (' Serva", ФРГ). Депарафинированные срезы отмывали в PBS и инкубировали с иммунной сывороткой. В качестве вторичных антител использовали ан~ ти-кроличьи IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена ("Sigma", США). Аналогичные эксперименты осуществляли с использованием мо-ноклональных антител к гликопротеину дрозофилы. Активность пе-роксидазы выявляли с помощью 2 мМ диаминобензидина ("Sigma", США) в присутствии 0.01% Н20г. Отмытые срезы обрабатывали 0.1% раствором 0s04 и после обезвоживания заключали в канадский бальзам.

Собранные образцы тканей личинок и имаго дрозофилы гомогенизировали стеклянным гомогенизатором и супернатант после центрифугирования (800д 10 мин при 4°С) смешивали с буфером образца для электрофореза (Laemmli, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1■ Очистка гликопротеина и получение его дегликозилирован-ной формы.

Для выделения муцина-D из культуры клеток 67j25D (Dm) был разработан метод, основанный на устойчивости муцина-D к обработке пронаэой, его термостабильности, а также низкой эффективности его переноса из полиакриламидного геля на фильтр. Содержание гликопротеина составляет 50 мкг на 1 млрд клеток линии Dm. Обработка пронаэой Е (20 мкг/мл, 2 часа при 37°С) цитозольного экстракта клеток, меченных [3H]GlcNAc, и последующий прогрев (5 мин, 95°С) позволяли осадить большую часть посторонних клеточных белков. На этом этапе ("надосадок") достигалась 100-кратная степень очистки гликопротеина с выходом около 70%. Дальнейшую

очистку осажденного из супернатанта ацетоном гликопротеина проводили методом электрофореза по Лэммли в 10% полиакриламидном геле с SDS. Чтобы избавиться от белковых примесей, препаративный гель после электрофореза подвергали электроблоттингу (Зч, 100 V, 400 тА). Использование этой стадии связано с низкой, по сравнению с другими белками, эффективностью переноса муцина-D (менее 5%) из геля на фильтр. После блоттинга окраской Кумасси в геле выявлялся практически один муцин-D. Дальнейшая экстракция из геля (0,05 М фосфат натрия, рН 7,5; 0,15% SDS), диализ и упаривание в вакууме позволяли получать очищенные в 1000 раз препараты муцина-D с выходом 10 - 15%. Видимая мол.масса изолированного гликопротеина по данным электрофореза составляла около 90 кДа.

Ферментом, способным отщеплять меченные [3H]-GlcNac углеводные цепи, оказалась 0-гликаназа (эндо-ОС-М-ацетил-О-галактозами-нидаза, К. Ф. 3 . 2 .1. 97) из Diplococcus pneumonia, специфичная в отношении дисахарида Gal$(1-3)GalNac, связанного 0-гликозидной связью с серимом или треонином.В ходе инкубации гликопротеина с ферментом наблюдалось постепенное снижение количества радиоактивности, включившейся в состав углеводного компонента гликопротеина, что сопровождалось падением его видимой молекулярной массы до 70 кДа (рис.1,а). При ферментативном дегликоэилировании иодированного по остаткам тирозина препарата гликопротеина авто-радиографически также выявляется фракция с мол.массой 70 кДа. (рис.1,в).

Узнавание дегликозилированной формы гликопротеина полученными нами моноклональными антителами против очищенного гликопротеина снижено на порядок, что указывает на углеводную природу выявляемого ими эпитопа (рис.1,6). Напротив, использованные в работе поликлональные антитела сохраняли способность выявлять фракцию 70 кДа (рис.1,г).

При расщеплении дегликозилированной формы гликопротеина про-теазами - V8 и трипсином образовывался продукт с мол.массой около 50 кДа (рис.2). Обработка исходного очищенного муцина-D данными протеазами не приводила к его расщеплению. Можно предполагать, что после удаления большей части углеводного компонента, экранирующего белковую часть ГП, она становится доступной для атаки протеаз. Продукт действия протеаз с мол.массой около 50 кДа устойчив к дальнейшему расщеплению трипсином и V8, что пред-

- б -

НКАТ

1234 5678

л .92 — .92

.66 .66

Рис.1. Обработка меченного [3Н]С1сМАс (а,б) и [ I] (в,г) гли-копротеина О-гликаназой (10ми/мл) при 37°С: (а,в) - флуорогра-фия; (б,г) - иммуноблоттинг с использованием моно- (мкАТ) и по-ликлональных (пкАТ) антител, соответственно; 1,5,9,11 - инкубация 16 ч без фермента; 2,6 - 2 часа инкубации с ферментом; 3,7 -4 часа инкубации с ферментом; 4,8,10,12 - 16 часов инкубации с ферментом. Отмечено положение полос калибровочных белков, фосфо-рилазы В (92 кДа) и бычьего сывороточного альбумина (66 кДа) .

.92

:•. л;;-"

'I • I а 6 в г

Рис.2. Обработка меченного [1251] гликопротеина ферментами, флу-орография: а) без обработки; б) инкубация с О-гликаназой; обработка дегликозилированного гликопротеина трипсином (в) и протеа-зой У8 (г) . Отмечено положение полос калибровочных белков (г кДа) .

полагает наличие в гликопротеине фрагмента, вторичная или третичная структура которого затрудняет доступ протеаз к сайтам расщепления.

2. Аминокислотный состав гликопротеина.

Аминокислотный и углеводный состав муцина-D с кажущейся молекулярной массой около 90 кДа приведен в табл.1 (данные были получены в сотрудничестве с Л.А.Баратовой и Н.П.Арбатским). Полипептид обогащен остатками глицина, треонина и серина. Последние формируют узел связи О - гликозидного типа с олигосахаридными цепями у муцинов. Белковый компонент содержит достаточное количество остатков пролина (7,3%), участвующих в формировании сайта 0-гликозилирования при биосинтезе муцинов. Расчеты показывают, что в молекуле имеется 8 остатков цистеина, ответственных за образование S-S связанных димеров исследуемого гликопротеина, описанных ранее (Kramerov et al.,1990).

3. Характеристика углеводного компонента гликопротеина.

Углеводы составляют по весу „40% от общей массы муцина-D, а молекулярная масса его полипептидной части составляет примерно 55 кДа. Преобладающими сахарами являются GalNac и Gal (табл.1), на долю которых приходится более 80% всех Сахаров. Значительно меньше обнаружено GlcNac и Man, присутствие которых свойственно для N-гликанов и может отражать наличие в молекуле муцина-D одной или двух N-связанных углеводных цепей. В следовых количествах обнаруживаются фукоза и рамноза.

4.Анализ олигосахаридных фракций, отщепляемых 0-гликаназой или в результате щелочного элиминирования

Фракцию олигосахаридов,меченных [3Н]С1сЫАс и отщепляемых 0-гликаназой (75% исходной радиоактивной метки), выделяли

Таблица 1

Аминокислотный и углеводный состав гликопротеина

(число остатков на 100 аминокислотных остатков) АМИНОКИСЛОТЫ УГЛЕВОДЫ*

Asp+Asn 7 . 5 Met 1. .1 GlcNAc 1 . 45

Thr 11. .5 lie 2 . . 2 GalNAc 12. 25

Ser 10. .8 Leu 5 . .5 Gal 9.55

Glu+Gln 10. . 5 Tyr 1 , . 4 Man 2.0

Pro 7. . 3 Phe 3 , .5 Fue 0.58

Gly 15. .0 Lys 4. .6 Xyl 1.02

Ala 8 .4 His 0 .9 Glc 2.22

Cys 1 .5 Arg 3 .3 Rha следы

Val 4 .0 Rib следы

* после кислотного гидролиза GalNAc и GlcNAc определяются в деацетилированной форме.

гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50. Gal и GalNAc присутствуют в этой фракции примерно в ток же соотношении, что и в исходном гликопротеине (табл.2). После восстановления NaBH4, де-иониэации на катионите и хроматографии на колонке с TSK HW-40 (гель-фильтрация) (рис.За) основной углеводный материал был обнаружен во фракции А, которая по профилю элюции совпадает со стандартным дисахаридом 2 (Gal-GalNAc-ol).

Обращенно-фазовая хроматография на колонке Ultrasphere С-18 (рис.Зб) показала, что практически вся радиоактивность содержится в олигосахариде (фракция Б), совпадающим по профилю элюции со стандартным дисахаридом 2. Олигосахарид содержал практически эк-вимолярное количество Gal и GalNac-ol (табл.2). Полное восстановление GalNAc указывает на то, что этот моносахарид присутствует в гликопротеине только в узле О-гликозидной связи с гид-роксиаминокислотами. Фракция А содержала также заметное количество GlcNAc (табл.2), однако обнаружить какой-либо GlcNAc-co-держащий компонент не удалось. Таким образом, практически единственным олигосахаридным фрагментом, отщепляемым в результате действия О-гликаназы, является дисахарид Gal{3(1-3)GalNac - наи-

Таблица 2

Относительное содержание углеводов (в нмолях) в исходном гликопротеине и олигосахаридных фракциях, полученных обработкой О-гликанаэой

ФРАКЦИЯ

олигосахаридная восстановленный олигосахарид Сахар исходный ГП фракция фракция А фракция Б

GlcN 18 24 21 следы

GlcN-ol 0 0 5 следы

GalN 170 108 следы 0

GalN-ol 0 0 45 15

Gal 130 82 53 14

Man 30 8 3 следы

Xyl 14 5 следы следы

Fue 8 4 0 0

более распространенный вариант дисахарида, присоединенного к белковой части гликопротеинов муцинового типа у позвоночных.

Отщепление О-свяэанных углеводных цепей муцина-D провели также методом щелочного элиминирования в присутствии NaBH4 по Карлсону (Carlsson, 1968). Основной пик радиоактивности (рис.Зв) обнаруживается во фракции, соответствующей дисахариду 2, небольшое ее количество - в зоне выхода моносахаридов (GalNAc-ol) и, еще меньше - в зоне элюции трисахарида. При хроматографии фракций, соответствующих moho-, ди- и трисахаридам (рис.Зв,фракция В) на колонке Ultrasphere С-18 (рис.Зг) практически вся метка сосредоточена в пике, идентичном по времени элюции дисахариду 2, хотя небольшое ее количество содержится и в плече, совпадающем по времени элюции с GalNAc-ol и трисахаридом 3 (GlcNAc-Gal-GalNAc).

Рис.3. Фракционирование олигосахаридов, полученных обработке гликопротеина о-гликаназой (а,б) и щелочным раствором NaBü (в,г), гель-фильтрацией на колонке с TSK HW-40 (а,в) и ВЭЖХ и колонке Ultrasphere-C18 (б,г). Детекция по УФ-поглощению (- - -

и [3Н]метке (-). Для калибровки колонки использовали Gal

NAc-ol (1) и следующие олигосахариды:

Gal((5l-3 }GalNAc-ol (2), GlcNAc(<Xl-4 )Gal <{5l-3 )GalNAc-ol (3) Fuc(CCl-2)Gal(f5l-3) [GlcNAc(CCl-4)Gal(f3l-4)GlcNAc(Pl-6)]GalNAc-ol(

?аким образом, и при химическом отщеплении О-связанных цепей в :ачестве главного углеводного компонента муцина-0 также обнару-<ивали дисахарид Са1(51-ЗСа1ЫАс, представляющий собой "коровый" фрагмент 1-ого типа, широко распространенный среди О-гликанов юзвоночных.

Учитывая, что кажущаяся молекулярная масса муцина-й составляет >0 кДа, мы провели формальные расчеты на основании данных, приеденных в табл.1 и 2, которые позволяют предположить, что мо-шкула муцина-0 содержит около 50 цепей О-гликанов типа За1(5(1-3)Са1Ыас, присоединенных к остаткам серина или треонина, шсло которых составляет около 100. Таким образом, приблизитель-ю половина всех возможных сайтов 0-гликозилирования несет диса-сарид муцинового типа,

5. Накопление и секреция муцина-0 в культуре клеток.

Ранее было показано, что в культуре клеток От меченый гли-сопротеин накапливается в основном в составе цитоплазматических структур, напоминающих секреторные пузырьки (Кгашегоу et а1., 1986). Однако в культуральной среде не удавалось детектировать ■юченные [3Н]-С1сИас молекулы новосинтезированного гликопротеи-ча, что могло быть связано с низким уровнем его секреции или с тродолжительным лаг-периодом, который предшествует появлению ме-1енного муцина-0 в среде.

Для изучения секреции муцина-0 в культуре клеток были использованы полученные моноклональные антитела, узнающие его углевод-шй эпитоп.

Методом иммуноблоттинга было показано, что количество муци-ла-О, в период с 1-го по 7-ой день культивирования клеток линии Зт, возрастало в расчете на клетку в 4-5 раз (рис.4а), тогда как <оличество общего белка в расчете на клетку с возрастом культуры фактически не менялось. В клетках линии От, обработанных гормо--юм линьки насекомых экдистероном, специфически подавляющим клеточную пролиферацию (Метаковский и др.,1975), заметного накопления муцина-0, выявляемого моноклональными антителами, не происходит (Рис.46).

Количество муцина-0 в среде, выявляемое уже через 1 день после

пересева клеток линии Dm , увеличивалось к 7-му дню примерно в 3-4 раза, достигая около 10% его общего количества в клетке (Рис.4в). В присутствии экдистерона содержание муцина-D в куль-туральной среде не увеличивалось (Рис.4г).

В клетках другой линии, Schneider-2 (S-2), выявляется гликоп-ротеин с меньшей видимой молекулярной массой (80 кДа), чем в линии Dm, что, по-видимому, связано с меньшей степенью гликозили-рования муцина-D в клетках S-2. Накопление гликопротеина в клетках этой культуры происходит в меньшей степени, чем в клетках Dm (Рис.4д). При культивировании клеток линии S-2 в присутствии экдистерона, который ингибировал деления клеток в той же степени, что и в линии Dm, по сравнению с контролем наблюдалось значительное (примерно 3-кратное) увеличение содержания гликопротеина в клетках (рис.4е). Таким образом, экдистерон по-разному влиял на накопление гликопротеина в клетках двух различных линий, усиливая его в клетках линии S-2 и подавляя - в линии Dm. В культу-ральной среде линии S-2 нам не удалось обнаружить гликопротеин как при культивировании контрольных, так и обработанных гормоном клеток.

ингибитор секреции, брефельдин А (BFA) избирательно нарушает процессы, происходящие в дистальных отделах аппарата Гольджи и связанные с внутриклеточной сортировкой и секрецией макромолекул (Klausner et al., 1992; Rothman, 1994). Мы исследовали влияние BFA на биосинтез меченого 3H~GlcNAc муцина-D в клетках линии Dm. В присутствии BFA включение 3H-GlcNAc снижено в 10 раз и обнаруживается лишь в составе фракций с меньшей молекулярной массой (70-80 кДа), соответствующих, по-видимому, не полностью гликози-лированной форме муцина-D (рис.4ж).

6.Накопление и секреция муцина в культурах клеток разных насекомых

С помощью иммуноблоттинга и моноклональных антител мы обнаружили муциновые гликопротеины с кажущейся молекулярной массой 80 кДа, как и в линии клеток S-2, в культурах клеток других видов насекомых (комара - A.aegypti, других видов дрозофилы - D.hydei, D .virilis). Лишь в клетках B.mori (тутовый шелкопряд) обнаружи-

к л е т к и 0а контроль гормон

дни культивирования:

13 5 7

13 5 7

культуральная среда контроль гормон

дни культивирования:

1 3 5 7 1 7

1.92

.92

92

Рис.4. Муцин-И, выявляемый иммуноблоттингом в клетках линии От (а,6} и Э-г (д,е), а также в культуральной среде линии От (в,г), без гормона - а,в,д; с гормоном - б,г,е; ж - меченый 3Н-С1сНас гликопротеин из контрольных клеток (1) и обработанных брефельдином А (0,01 мг/мл) (2)

Отмечено положение полос калибровочных белков (в кДа). Нагрузки на дорожку соответствуют: 50 ООО клеток (а,б,д,е,ж); 300 000 клеток (в,г)

вается гликопротеин с такой же молекулярной массой (90 кДа), как в линии Иш D.ffle.Iaлograster. Муциновые гликопротеины со сходными молекулярными массами выявлялись и в культуральных средах большинства исследованных культур клеток разных видов насекомых, что указывает на их способность секретировать муцины. Описанные гликопротеины составляют семейство секретируемых муциновых гликоп-ротеинов, характеризующихся наличием общего эпитопа углеводной природы, который удалялся после обработки 0-гликаназой.

7. Тканевая локализация муцина-Р.

При иммуногистохимическом исследовании срезов личинок,куколок и имаго 0.те1аподавЬег муцин удается выявить в ряде тканей различного происхождения, обладающих способностью к секреции.Так, он был обнаружен в имагинальных дисках, принимающих участие в образовании имагинальной кутикулы и в эпидермальных клетках молодых мух, формирующих эндокутикулу брюшка (рис.5а). Муцин также выявляется в гемоцитах и эноцитах личинки - клетках, способных к активной секреции. На протяжении всего постэмбрионального развития прослеживается его присутствие в цитоплазме жирового тела, которое представляет собой ткань, продуцирующую многие белки секреторной природы. Наиболее интересным является обнаружение муцина-И в яичниках дрозофилы, в фолликулярных клетках которых он выявляется уже на самых ранних стадиях развития яйцевых камер. По мере развития яйцевых камер муцин-0 накапливается в апикальной части фолликулярных клеток,а позднее экзоцитозом попадает в питающие клетки и в яйцеклетку (рис.56).

С помощью моноклональных антител муцин выявлялся в большинстве исследованных типов тканей. Наиболее значительно содержание му-цина-0 (в расчете на иг белка) - в эмбрионах, яичниках, имагинальных дисках и ганглиях личинок (рис.6). Существенно меньшее количество муцина-0 выявляется в жировом теле и семенниках личинки. В большинстве тканей видимая молекулярная масса гликопро-теина составляет около 80 кДа, тогда как в яичниках выявляется дополнительная фракция с молекулярной массой около 65 кДа(рис.б).

ис.5. Тканевая локализация муцина-О, выявляемая иммуноперокси-азным окрашиванием тонких срезов с помощью моноклональных анти-ел: а) эпидермальные клетки молодых мух; б)яйцевые камеры, ста-ия развития яйца 8-10 (1-ооцит,2-фолликулярные клетки, 3-питаю-ие клетки)

1 2 3 4 5 6 7

ис.6. Иммуноблот-анализ с помощью моноклональных антител ткане-ых экстрактов О.лгeJaпogaster; 1- яичники взрослых мух, 2- эмб-ноны, 3- семенники личинок, 4 - имагинальные диски, 5- жировое ело, б - лизат клеток линии 3-2, 7- лизат клеток линии Бт. Ко-пчество белка на дорожку; 1,2 - 0,2 мг; 3-5 - 0,5 мг; 6,7 -.02 мг клеточных белков

ОБСУЖДЕНИЕ.

Результаты исследования гликопротеина дрозофилы указывают на его сходство с гликопротеинами муцинового типа позвоночных -объектом широкого научного интереса последних лет. Сходство с муцинами прослеживается при анализе аминокислотного состава исследуемого гликопротеина. Согласно расчетам, полипептидная цепь муцина-0 состоит из _500 аминокислотных остатков и обогащена, как и у муцинов, треонином и серином (в сумме составляющих 22%), а также содержит существенное количество остатков пролина (7%). Примерно каждый пятый аминокислотный остаток представлен треонином или серином. Расчеты показывают, что более половины из них несут 0-связанную дисахаридную цепь. В среднем одна углеводная цепь приходится на 8-10 аминокислот.

Углеводный компонент гликопротеина составляет около 40% (у муциновых гликопротеинов позвоночных 40 - 80%) мол.массы. Углеводы могут экранировать значительную часть поверхности белка, что объясняет его относительную устойчивость к действию протеаз. Основной частью углеводного компонента муцина-0 являются О-свя-занные цепи, отщепляемые О-гликаназой. Эти цепи представляют собой дисахарид Са1(5(1-3)Са1Ыас, типичный для муцинов и классифицируемый как " коровый олигосахарид первого типа ". В отличие от гликопротеина дрозофилы, в муцинах млекопитающих дисахарид Са1Р(1-3)Са1Иас обычно включен в состав более сложных и гетерогенных структур - от трисахаридов до 15 - 20 членных разветвленных цепей. Исследуемый нами гликопротеин, вероятно, имеет очень короткие и однородные по размеру дисахаридные цепи, напоминая в этом отношении "антифризный" гликопротеин антарктических рыб, углеводный компонент которого целиком представлен дисахаридом Са1Р(1-3)Са1ЫАс (Оэида & Геепеу, 1978).По данным щелочного гидролиза в составе муцина-0 обнаружено также небольшое количество О-связанных монои трисахаридов.

Структура О-гликанов насекомых в настоящее время практически не исследована. Среди единичных работ, касающихся этого вопроса - исследование углеводного компонента рецептора вителлогенина из

клеток яичника саранчи (Hafer к Ferenz, 1991). На основании связывания этого гликопротеина с лектинами был сделан вывод о наличии в его О-гликанах дисахарида Gal-GalNAc. В главном мембранном гликопротеине из культуры клеток комара наряду с N-связанными олигосахаридами были найдены единичные О-связанные остатки Gal-NAc (Butters & Hudhes, 1981). Эти и другие имеющиеся в настоящее время данные показывают, что изученные О-гликаны насекомых имеют относительно простую структуру и состоят из 1-3 моносахаридных остатков, включая, возможно, остатки сиаловой кислоты (Hafer & Ferenz, 1991).

По результатам нашего исследования in vitro муцин-D является секретируемым. Использование в данной работе высокочувствительных моноклональных антител против углеводного эпитопа муцина-D позволило показать накопление муцина не только в клетках, но и в культуральной среде линий дрозофилы и других насекомых. Секреторная природа гликопротеина дрозофилы - черта, сближающая его с муцинами и отличающая от муциноподобных мембранно-связанных гли-копротеинов (таких, как гликофорин эритроцитов, лейкосиалин лейкоцитов и др.). Уровень секреции гликопротеина клетками in vitro невысок (около 10 % от его общего количества), что может быть следствием нарушений механизмов секреции при длительном культивировании клеток.

В присутствии ингибитора секреторного пути - брефельдина А, специфически подавляющего процессы посттрансляционной модификации гликопротеинов в дистальной части аппарата Гольджи, углеводный компонент муцина-D, по-видимому, в основном представлен моносахаридом, а не дисахаридом. Это позволяет предположить, что большая часть реакций элонгации гликозилирования муцина-D протекает в транс-сети аппарата Гольджи, последнем компартменте секреторного пути.

Накопление муцина-D в культуре клеток регулируется гормоном линьки и окукливания насекомых - экдистероном. Экдистерон по разному влияет на накопление гликопротеина в двух клеточных линиях дрозофилы, усиливая его в линиии Schneider-2 и подавляя - в линии Dm. Можно предполагать,что эти клеточные культуры являются производными различных субпопуляций эмбриональных клеток, отличающихся по характеру физиологического ответа на гормональный стимул.

Результаты иммуногистохимического исследования локализации муцина-D in vivo демонстрируют его "вездесущность" в тканях дрозофилы. Наиболее интересным и неожиданным было обнаружение исследуемого гликопротеина в фолликулярных клетках яичников и его секреция фолликулярными клетками в растущий ооцит в процессе ого созревания. Сходный характер локализации родственного гликопротеина в фолликулярных клетках яичников из куколок В.mori (неопубликованные данные Н.Байковой) может указывать на определенную роль этих соединений в оогенеэе насекомых.

Исследование тканевой локализации муцина-D, показавшее его присутствие в разных типах клеток дрозофилы, указывает на егс возможную полифункциональную роль у насекомых (построение кутикулы, формирование внеклеточного матрикса гемоцитами, оогенез). Дальнейшее изучение муцина-D, связанное с попытками клонирования гена белковой части гликопротеина, позволит подойти к изучение генной регуляции его тканевой экспрессии.

ВЫВОДЫ.

1. Из культуры клеток Drosophila melanogaster очищен гликопротеин, устойчивый к протеазам, с видимой молекулярной массой около 90 кДа. Дегликозилирование гликопротеина с помощью 0-гли-каназы снижает его видимую молекулярную массу до 7 0 кДа, после чего белковый компонент становится чувствительным к протеазам.

2. Основной компонент олигосахаридов гликопротеина идентифицирован как дисахарид Galj$l-3GalNAc, типичный для О-гликанов му-цинового типа позвоночных, в то время как белковый компонент обогащен серином, треонином и пролином. Это позволяет рассматривать исследуемый гликопротеин D.melanogaster как впервые описанный у насекомых гликопротеин муцинового типа (муцин-D).

3. С помощью моноклональных антител показана секреция муци-на-D в культуре клеток дрозофилы, регулируемая гормоном насекомых - экдистероном. Брефельдин А, специфически подавляющий гли-козилирование секретируемых гликопротеинов в дистальной части аппарата Гольджи, блокирует образование зрелой гликозилированной формы муцина-D.

4. С помощью моно- и поликлональных антител показано широкое распространение муцина-D в различных типах клеток и тканей дрозофилы, что может указывать на его мультифункциональную роль у насекомых.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Kramerov A., Mikhaleva Е. Rozovsky Y., Pochehueva Т., Arbats-ky N., Baikova N., Gvozdev V.Insect mucin: biochemical characterization, secretion in cultured cells and tissue localization during Drosophila development. // Abstracts Book XIV FECTS Program Meeting, Lyon, France. 1994 - L12.

2. Крамеров А-А., Арбатский Н.П., Розовский Я.М., Почечуева Т.В.., Михалева Е.А., Дружинина Т.Н., Гвоздев В.А, Шибаев В.Н. Гликопротеин из культуры клеток Drosophila melanogaster содержит 0-связанные углеводные цепи типа Gal(Pl-3)GalNAc. // Биохимия. - 1995. - Т. 60, N 5 - С. 805 - 812.

3. Крамеров А.А., Михалева Е.А., Розовский Я.М., Почечуева Т.В., Байкова Н.А., Гвоздев В.А. Тканевая локализация и секреция муцина-D Drosophila melanogaster, регулируемая гормоном линьки и метаморфоза 20-гидроксиэкдизоном- // Онтогенез. - 1997. - Т.28, N 4, С, 279 - 287.

4. Kramerov A.A., Mikhaleva Е.А., Rozovsky Ya.M., Pochehueva T.V.,Baikova N.A., Arsenjeva E.L., Gvozdev V.A. Insect mu~ cin-type glycoprotein: immunodetection of the O-glycosylated epitope in Drosophila melanogaster cells and tissues. // Insect Biochemistry ic Mol.Biol., - 1997 - Vol.27, N 6, P. 513 -522.