НОВЫЕ СВОЙСТВА УГЛЕВОДСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ: ЛЕКТИНА ИЗ МИДИИ CRENOMYTILUS GRAYANUS И ГАЛЕКТИНА-З ЧЕЛОВЕКА

Фуртак, Вячеслав Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
НОВЫЕ СВОЙСТВА УГЛЕВОДСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ: ЛЕКТИНА ИЗ МИДИИ CRENOMYTILUS GRAYANUS И ГАЛЕКТИНА-З ЧЕЛОВЕКА
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "НОВЫЕ СВОЙСТВА УГЛЕВОДСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ: ЛЕКТИНА ИЗ МИДИИ CRENOMYTILUS GRAYANUS И ГАЛЕКТИНА-З ЧЕЛОВЕКА"

Ж-Мт

На правах рукописи

Фуртак Вячеслав Анатольевич

Новые свойства углеводсвязывающих белков: пектина из мидии Сгепот^Ни$ дгзуапиз и галектина-З человека

03.00 04 * биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВЛАДИВОСТОК 2С03

Л».-''

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биооргэнической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук (В пади восток У и Meharty Medical College (Nas Will е. TN, США)

Научный руководитель: Кандидат химвеских наук,

старший научный сотрудник КуржаА.В

Официальные оппоненты: Дсктор биологических наук, профессор Исаева 6 .В.,

кандидат биологических наук, доцент Санина Н.М

Защита состоится «15» января 2004 г. в ДЗ часов, на заседании диссертационного совета Д 005.005,01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г Владивосток, Проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТМБОХ ДВО РАН Факс:{42^2) 31-40-50.

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (Владивосток, Проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВОРАМ).

Ведущая организация:

В ладив осток ский посуд арственный медицинский университет

Автореферат разослан « л декабря 2003 г. Ученый секретарь

диссертационного совета, кхн.СНС

Прокопенко Г.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на значительные успехи здравоохранения и медицины среди различных заболеваний ведущее место занимают онкологические болезни. Более половины злокачественных опухолей удается успешно лечить, однако no-лрежнему остаются нерешенными проблемы лечения рака молочной железы и толстой кишки. Методы ранней диагностики и лечения этих заболеваний крайне неудовлетворительны.

Особый интерес представляет исследование специфических изменений клеточных рецепторов (лигакдов) при о нхотран сформ а ции. Исследование функций гликоконъюгатов как составной части клеточных рецепторов убедительно продемонстрировали ключевую роль углеводной составляющей при опухолевом процессе. В настоящее время наметились два подхода для выявления углеводного профиля гликогтротеинов - это использование монокпональных антител к углеводным детерминантам и углевод связывающих Белков - пектинов, специфичных к определенным углеводным структурам. Лести ны, выделенные из различных источников, являются полезным инструментом в исследованиях клеточных структур и позволяют получить данные о содержании тех или иных гликоконъгатов в клетках и тканях. Однако и сами эндогенные пектины представляют интересный объект исследований, поскольку они способны участвовать в самых разнообразных клеточных реак^ях.

Одной из этих реакций может быть модуляция клеточной адгезии. При профессии опухоли трансформированные клетки приобретают способность открепляться от субстрата и циркулировать с током крови и лимфы, в конечном счете, давая метастазы. Гликоконъюгаты клеточной поверхности вместе с эндогенными лектинами и белками межклеточного матриксз обеспечивают многочисленные адгезивные реакции, связанные с онкогенезом. Соответственно, изучение молекулярных механизмов онкогене?а на модели клеточной адгезии может дать ценную информацию для разработки новых терапевтических подходов по лечению онкологических заболеваний.

Таким образом, пектины как маркеры позволяют обнаружить те или иные углеводные структуры е клетках и тканях, а лектины в экспериментах по исследованию клеточной адгезии дают возможность определить, какую функцию могут выполнять эти структуры.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является изучение локализации гликоконъюгатов - лигандоа Gal/GatNAc-слецифичного пектина из мидии Crenomytilus grayanus (CGL) на гистологических препаратах нормальных и трансформированных тканей толстой кишки, а также в спинномозговых ганглиях крыс, определение способности галектина-3 человека и CGL связывать р,-интегрины и другие гликоконьюгаты поверхности клеток карциномы молочной железы человека и модулировать клеточную адгезию. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить гистологические препараты нормального и трансформированного эпителия толстой кишки человека, окрашенные пероксидазным конъюгатом 'CGL

сJ-зто

Определить характер изменений в гликоконьюгатах связанный с он ко тран сформацие й.

2, Определить возможность применения CGL для выявления гликоконъюгатш нейронов типа Б спинномозговых ганглиев крыс.

3, Выделить и очистить рекомбинантный галектин-3 человека.

4, Установить характер воздействия экзогенно добавленного галектина-3 и CGI на адгезию клеточных линий карциномы молочной железы человека.

Положения, выносимые на защиту.

1. CGL специфично реагирует с гликоконъюгатами мукоидного секрета тонкой кишки человека и маркирует метаплазию а дено карцином толстой кишки ворсинчатого типа. CGL также способен селективно связывать мукоидный секрет адено карцином блюд невидного типа, не проявляя активности связывания с секретом нормальных бокаловидных клеток толстой кишки человека.

2. CGL селективно связывает гликоконъюгаты чувствительньк нейронов типа Б спинномозговых ганглиев крыс.

3. Галектин-3 человека выполняет анти-адгезивную функцию в межклеточном магриксе опухолей молочной железы человека при взаимодействии С ßr интегринами клеточной поверхности.

4. CGL, также как и галектин-3, связывает гликоконъюгаты поверхности кпеток карциномы молочной железы. Однако CGL не меняет адгезивные свойства кпеток.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые в гистохимических исследованиях гликоконьюгатов нормальных и трансформированных тканей использован CGL, Показана прогностическая ценность этого пектина как маркера низкодиффереицированных аденокарцином толстой кишки человека и чувствительных Миронов типа Б спинномозговых ганглиев крыс.

Впервые показана способность ßi-интегринов подвергаться эндоцитозу при взаимодействии с галектином-3, но не с CGL В случае галектина-3 установлено, что клетки линий карциномы молочной железы теряют способность прикрепляться и распластываться на белках межклеточного матрикса (ЕСМ), а сам галектин-З может ре циркулировать назад в межклеточный матрикс. Возможен эндоцитоз CGL без изменения адгезивных свойств клеток.

Полученные результаты могут быть использованы в практической онкологии при разработке новых диагностических и лечебных средств.

Апробация работы. Результаты данной работы были доложены на Региональной естествен ко-нау ч ной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (Владивосток, 1997}; Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследовнания в области физико-химической биологии и биотехнологии (Владивосток, 1998); II Дальневосточной региональной конференции с всероссийасим участием "Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке" (Владивосток. 1996); Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока" (Владивосток, 2001), Spirtg Simposium of Research Centers in Minority Institutons (Atlanta, Georgia, USA, 2001),

Публикации. По результатам исследования опубликовано 8 научных работ. Работа выполнена в лаборатории химии не инфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН и лаборатории Dr. Ocfiieng (Meharry Medical College, Nashville, TN, USA),

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 183 публикации. Диссертация изложена на 145 стр. машинописного текста, содержит 15 таблиц и 34 рисунка,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы исследования Объектами исследования в экспериментах с CGL служил операционный материал по поводу аденокарциномы толстой кишки в Краевой клинической больнице г. Владивостока 4 опухоли ворсинчатого и 8 опухолей блюдцевидного типа, а также сопутствующие аденоматозные полипы и прилежащий неизмененный эпителий толстой кишки (сигмовидная и прямая кишка), эпителий тонкой (12-перстной) кишки. Для исследования спинномозговых ганглиев крыс использовали половозрелых самцов и самок линии Вистар (виварий ТИБОХ ДВО РАН), из которых были также получены образцы тонкой (12-перстной) кишки. 8 опытах с гапектином-3 и CGL использовали клеточные линии карциномы молочной железы человека MDA-МВ-231, MDA-MB-435, ВТ-549 и 11-9-1-4, которые были любезно предоставлены доктором А. Rai (Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, США).

Анализ гистологических препаратов CGL. Конъюгат CGL с пероксидазой хрена был получен по методу Луцика и др. (1981), Окрашивание срезов различных тканей проводили по «прямому методу». После деларафинирования в ксилоле срезы обрабатывали в 1% НгОг для блокирования эндогенной пероксидазы, 3.3' -диаминобензидина тетрахлорид (ДАВ) (Sigma, США) использовали как хромоген для визуализации реакции связывания лектинов с компонентами среза. При исследовании симпатических ганглиев крыс дополнительно проводили окраску Gal-специфичным лектином из Griffonia simpticifoüa (GS-IB*). Срезы также докрашивали по Шиффу, апьцианоеым синим или гематоксилином.

Получение рекомбинантного галекгоина-З. Ллазмиды рОТВ7, несущие полную последовательность галектина-3 человека (Invitrogen, IMAGE ID: 3050135) были получены из бактерий Е, coli, которые культивировали в среде Миллера с 12.5 мкг/мл хлорамфеникола. Для выделения плэзмид использовали набор реактивов (Qiagen, США) в соответствии с рекомендациями производителя. После полимеразно-цепной реакции (ПЦР) соответствующую полной молекуле галектина-3 последовательность кДНК клонировали в плаэмиду pQE-80 (Qiagen, США) рОЕ-80 трансформировали ТорЮ компетентные клетки E.coli (Invitrogen, США), которые затем использовапи для экспрессии белков. Очистку белков проводили s соответствии с рекомендациями производителя (Qiagen, США),

концентрацию белков определяли по Смиту (Smith et al, 1985) с набором реагентов (Pierce, США),

Вестерн-блоттинг проводили по методу (Towbin et al., 1979).

Анализ эндоцитоза р,-интегринов на проточном флюоресцентном сортировщике плеток (FACS). Клетки инкубировали с галектином-3 а присутствии или отсутствии различных ингибиторов эндоцитоза. F ITC-меченые антитела (!gG 2«) к CD-29 (ßi-интегринам) добавляли к клеткам и инкубировали 1 ч при 4С'С, То же количество клеток 2-Ю6 инкубировали с FITC-меченым IgG 2a (изотипический контроль). Клетки отмывали 2 раза в ФСБ и фиксировали 2 % параформальдегвдом и анализировали на FACS.

Флюоресцентный анализ эндоцитоза гапеюхна-З , CGL и р,-интвгринов.

Интернализация галектина-3. Клетки линий карциномы молочной железы человека инкубировали с рекомбикатным FITC-меченым галектином-3 в бессывороточиой среде.

Визуализация эндоцитоза CGL. FITC-меченый CGL (0,8 мкМ) добавляли к MDA-МВ-231 клеткам, адгезированным на 4-ка мерных предметных стеклах и инкубировали 20 мин при 37 а отсутствии или присутствии 15 мМ галактозы.

Рециркуляция энзогенно добавленного галектина-3 с меткой из $ гистидинов (6HisTag). Вестерн-блоттинг проводили с использованием пероксидазного конъюгата антител к 6HisTag. К клеткам добавляли галектин-3 с 6HisTag и отбирали 100 мкл среды в различное время, каждый раз заменяя на новую среду (без галектина-3).

Визуализация эндоцитоза ß i-интегринсю, опосредованного галектином-3. Клетки, ад геэированные и распластанные на 4-камерных предметных стеклах, инкубировали с ПТС-анти-СО-29 антителами, отмывали в бессывороточной среде и инкубировали без и с 3,3 мкМ га пектин а-3 в отсутствии или присутствии 15 мМ лактозы.

Клетки отмывали в ФСБ, фиксировали в 2% пара формальдегиде, анализировали на флюоресцентном микросколе.

2. Результаты и обсуждение 2.1. Характеристика аде но кар киком толстой кишки человека

Среди самых разных вариантов организации паренхимы егромы аденокарцином толстой кишки наблюдается тенденций к образованию различных трехмерных трубчатых сетей, которые представляют собой основной паренхимный каркас опухоли. Можно вьщелить следующие уровни организации:

1) первичная трубочка малого диаметра и правильной формы;

2) вторичная трубочка большого диаметра с неправа г soй формой за счет случайного слияния с другими более мелкими трубками;

3) объединения вторичных трубочек в узлы и цилиндрические тяжи, различимые на макропрепзратах:

4) объединение этих узлов и тяжей в единую трехмерную сеть, образующую блюдцевидную плоскость, за смет чего опухоль приобретает морфологическую целостность;

Соединительная ткань толстой кишки подвергается постепенному замещению стромой опухоли при инвазии железистых трубочек в нормальную ткань. Клетки адено карцином, обладая большим ростоеым преимуществом, быстро замещают

крипты эпителия и продолжают рост в лодслизистый и серозно-мышечные слои, одновременно трансформируя соединительную ткань в строму (рис. 1 А). По-видимому, аденокарциномы толстой кишки блюдцевидного типа в

Рис, Í. Л. Организация паренхимы и стромы опухоли блюдиегидного типа t периферической части апухолееого ума. Бэзофильизя ларенхииз (1) состоит из олухопевых желез. Строил не окрашена (2), Участки эпителия a tuds удлиненных крипт (3). Тотальный препарат. Окраска эеыатоксипинои Эрпиха. В. Организация опухоли ворсин va/лого типа. Стрема почти отсутствует. Опухоль состоит ил ¿иперпластических ъорсинок и жвппу

большинстве случаев не способны к стимуляции ангиогенеэа, что приводит к некрозу опухоли в направлении от центральной части к периферии. Аденокарциномы ворсинчатого типа имеют характерный вид цветной капусты vi состоят из гипертрофированных ворсинок и желез (рис, 1 В).

2.2. Лигавдм CGL в толстой и тонкой кишке человека

В нормальных клетках эпителия толстой кишки CGL связывает ком партиен ты клетки в перинуклеарном пространстве и в зоне, прилежащей к внутреннему краю апикальной части цитоплазмы. Все клетки в составе крипты обычно имеют одинаковую локализацию лигандов CGL, что свидетельствует о синхронизации их секреторной функции. По-видимому, лектин выявляет промежуточный этап синтеза гликопротеиное муцинового типа в аппарате Гольджи. Различные элементы толстой и тонкой кишки человека обладают разной активностью с CGL (табл. 1, рис. 2). Особенно интересна реакция CGL с гликоконьюгатами внеклеточного матриксз и базальной мембраны (рис. 2). Наиболее интенсивную реакцию наблюдали с базальной мембраной толстой кишки. Хорошо известные глмопротеины базальной мембраны ламинин и фибонектин, вероятно, могут обуславливать такую реакцию CGL.

Таблица 1. Результаты окрашивания СбЬ эпителия тонкой и толстой кишки

Клеточные и тканевые элементы | Тонкая | кишка Толстая кишка

Бокаловидные клетки + -

Каемчатые энтероииты + +

Бамльмая мембрана крипт -

Бээальнэя мембрана еорсинок (тонкая кишка)

Секрет просвета крипт (т ликопротеины муциноеого типа и гликоэдминогпиканы)

Банальная мембрана кровеносных сосудов + +

Волокна соединительной ткани +■ +

Основное вещество соединительной ткани (гликозаминогпиканы)

положительная либо отрицательная реэкци с * - элемент отсутствует в структуре

Рис. 2 А. Попеперечный срез эпителия толстой кишки Окраска конъюгзтом СО. с лсроксидззой жрана. Просеет гриппу (1) собери амий секретируемые муцины о мукопс.тжахариды на окрашен. Наиболее интенсивно окрашены баззпьные мембраны (2) и волокна яке клеточного матрихса (3). Бокаловидные клетки характеризуются перинуклварной окраской (4). в. Продольный срез еорсинки тонкой кишки человека Секрет бокаловидных клеток дает интенсивное окрашивание (1). Каемчатые энглероциты характеризуются апикальной локализацией лизвидов С01 (2). Соединительная ткань, богатая кровеносными сосудами, окрашена слаба. Окраска бззальных мембран, в отличие от толслтоО кишки, отсутствует. Ув 10x25.

Глмкозаминогликаны. сплошь заполняющие промежутки между криптами и дающие интенсивную окраску с реактивом Шиффа, почти не реагируют с Св!..

Следовательно, гликозаминогликзны как в просвете крипт, так и в межклеточном матриксе не взаимодействуют с Обнаружен совершенно иной тип

взаимодействия ОСЬ с гликоконъюгатами тонкой кишки. Каемчатые энтероциты кишечных ворсинок интенсивно окрашены в апикальной части клетки (рис. 2 В). Интенсивно окрашенный мукоидный секрет бокаловидных клеток ворсинок образует своеобразную защитную капсулу, покрывающую ворсинки.

2.3. Гистопатология пигандов ОСЬ в опухолях толстой кишки человека

Представляет большой интерес изучение гликоконъюгатов аденокарцином толстой кишки человека при помощи Сй!., обладающим высоким сродством к муцинам {Лоенко и др., 1999, Ве^доЛэеуа е1 а!.. 1998). Клетки эпителия толстой кишки богаты гликоконъюгатами, которые содержатся в цитоплазме, мембране и секрете бокаловидных клеток <Кзпе11о$ е( а!., 1989). Известно, что при злокачественной трансформации клеток происходят изменения в процессах гликозилирования, приводящие к образованию более коротких олигосахаридных цепочек, гиперсиалированию или неполному гликозилированию. Следовательно, тестирование таким гистохимическим маркером, как ССЦ доброкачественных и злокачественных новообразований толстой кишки может иметь практический выход для решения проблем диагностики.

Варианты связываний СИ- с компонентами опухолей можно разделить на следующие группы:

1) окрашивание паренхимы опухоли -

а) апикальное, т е а верхней части клетки,

б) перинуклеарное {в околоядерной зоне),

в) цитоллаэматическое (полное окрашивание клетки, за исключением ядра);

2) окрашивание стромы опухоли -

а) связывание с волокнами (колл зге новыми, ретикулярными и. возможно,

эластиновыми),

б) связывание с основным веществом.

Из 7 изученных аденоматоэных полипов в 5 аденомах С01. окрашивает цитоплазму опухолевых клеток, а в 2 случаях обнаружен интенсивный перинуклеарный тип окраски. Характерно отстутствие окрашивания базальной мембраны опухолевых желез. 8 то же время баэальные мембраны нормального эпителия интенсивно окрашены Сй!.. Эксперименты по неполному ингибированию связывающей активности лектина при добавлении в инкубационную смесь ингибирующего сахара - галактозы е концентрации 30 мМ показали, что наибольшей аффинностью обладают гликоконъюгаты перинуклеарной зоны клеток аденомы. 30 мМ раствор галактозы полностью ингибирует связывание лектина с цитоплазмой клеток аденом Предварительное инкубирование срезов в муравьиной кислоте для удаления остатков сиаловых кислот не влияет на окраску.

Характерный для аденом цитоплазматический тип окрашивания можно объяснить преобладанием слабодифференцированных каемчатых энтероцитов в составе опухолевых жепез. Каемчатые энтероциты в криптах нормального эпителия

толстой кишки также имеют интенсивную окраску. Просеет крипт аденомных желез так же, как и в нормальных криптах, не окрашен пектином. Следовательно, синтезируемые аденоматозными клетками гликоконъюгаты не связывают СИ.. Аналогичная картина в криптах нормального эпителия. Основное вещество и волокна стромы зденомзтозных полипов слабо связывают Св!.. Таким образом, единственное отличие в характере окрашивания доброкачественных новообразований толстой кишки по сравнению с нормальным эпителием — отсутствие реакции с базальиыми мембранами аденомных желез.

В случае злокачественной трансформации эпителиальных клеток толстой кишки человека также отсутствует окраска баэальной мембраны опухолевых желез. Для аденокарцином блюд невидного типа наиболее характерен апикальный тип локализации лигандов Св1- Лектин выявляет своеобразные апикальные комплексы везикул, которые окаймляют просвет железистых структур аденокарциномы (рис. 3 А).

Аденокарциномы ворсинчатого типа отличаются очень интенсивной реакцией С01. с цитоплазмой клетки (табл. 2). Таким образом, присутствие гликопротеинов с терминальными остатками галактозы в муцинах тонкой кишки и ворсинчатых аденокарциномах толстой кишки дает основание предполагать, что последние возникли путем метаплазии с образованием гиперплазированных бокаловидных клеток из недифференцированных клеточных элементов толстой кишки. Ворсинки на поверхности защищают подлежащие слои паренхимы и стромы опухоли. Благодаря такому строению, наличию защитной муциновой оболочки, ворсинчатые опухоли менее подвержены некротическим изменениям, т.к. железистые трубочки таких опухолей сильно отличаются от аденокарцином блюдцевидного типа по характеру окраски СО- Даже внутри замкнутых железистых трубочек такой трансформированный эпителий приобретает ворсинчатосгь. Если в блквдцевидных аденокарциномах сегрегируемые гликоконъюгаты более или менее структурированы в вцце везикул или пузырьков различных размеров, то цитоплазма клеток ворсинчатых аденокарцином имеет диффузную окраску цитоплазмы. Строма такой опухоли приобретает характерную для нормальной тонкой кишки ваосуляризацию. Гиперплазия каемчатых энтероцитов и их перерождение в опухолевые клетки приводит к тому, что цитоплазма этих клеток более интенсивно окрашена С01_, а апикальный комплекс занимает всю верхнюю половину клетки.

В то же время опухолевые клетки взаимодействуют с соединительной тканый толстой кишки таким образом, что она приобретает характерные черты внеклеточного матрикса нормальной тонкой кишки. Исходя из того, что опухолевые и нормальные кишечные клетки имеют общие свойства, можно предполагать, что в нормальной ткани знтероциты взаимодействуют с соединительной тканью аналогичным образом, т.е., вероятно, продуцируют биологически активные вещества, определяющие необходимую структуру внеклеточного матрикса.

Таблица 2

[ Компоненты ткани или опухоли

Окраска CGL различных компонентов опухолей толстой кишки

i Клетки | паренхимы : ОПухОЛИ

| Окрас [ Характеристика [ ка окрасу ! CGL

| № \

f ' : Перинуклеарный т*п

i Í

i Окраска CGL в сравнении с

| нормальными сруктурэми

i Более интенсивная окраска по ! сравнению с бокаловидными г клетками толстой кишки

: Отл1*

: чия

; Цито плазматический ¡ тип

Í Секрет { желез

¡ Волокна ; межклеточ , него | матрикса

Клетки

паренхимы

опухоли

интенси вна я окра сха всего секрета

i Слабая окраска

Нет окраски

цитоплазма бокаловидных клеток таюке может бьггь окрашена ÜGl

Секрет крипт толстой кишки не имеет окраски

Волокна соединительной ткани окрашены CGI более интенсивно

Q Й)

JÉ Т

о х

Х- £

< £

; Цигоплазматический тип

Волокна соединительной ткани толстой кишки всегда окрашены CGL

Цитоплазма каемчатых КОЛОНОЦИТОВ толстой кишки немного слабее окрашена CGL

Клетки | паренхимы ' опухоли ¡

Апикальный Tvir>

Окраска интенсивная

Апикальный тип

í CGL- активный апикальный ! хомлекс каемчатых энтероцитса Í намного меньше по размерам

] Стромэ опухоли сильнее | окрашена, чем соединительная ткань толстой кишки

i В клетках колоноцитое толстой i кишки никода не встречается | апикальный комплекс j характерный для железистых I аденокарцином

Ц*топ л а э мати чес ки й тип окраски

Энтероциты топетой мс»ут

быть окрашены ло цитоплазматическому типу

Характерно для менее ¡ Энтероциты толстой книжки ' дифференцированных i обычно имеют окраску CGL Í опухолей | (перину кл а арного или

4 апикального типа)

i 3

j Секрет í j желез I

Волокна

межклеточ

ного

матрикса

: Очень интенсивная . окраска

Интенсивная окраска

\ Секрет крипт эпителия толстой \ кишки очень слабо игш совсем не i связывает CGI

I Волокнистый компонент ! соединительной ткани топстой i кишки также дает скраску CGL

Рис. 3. Окраска конъ&язтон CGL с перохеидаэой крена срезов аденокарцином блюбцееиОного типа. А Высокодифференцироеанная аденокарцинома. Мукоидный секрет интенсивно окрашен (i). Клетки паренхимы опухоли характеризуются апикальной локализацией пиеандов CGL (2) В. Низкодифференцироеанная аденокариинома. Клетки лариняимы характеризуются цитоллазиатическии типои окрашивания CGL (1). Уа. 10x20

Основная особенность связывания CGL со стромой опухоли - реакция с сосудами малого и среднего диаметра. Таким образом, ворсинчатые опухоли оказываются близки к нормальному эпителию тонкой кишки как по морфологическим признакам, так и по окраске CGL. В приведенном гримере клетки опухоли, вероятнее всего, возникли при трансформации нормальных каемчатых энтероцитов толстой кишки или путем метаплазии клеток-предшественников - бокаловидных энтероцитов. Блюдцевидные опухоли толстой кишки как по морфологическим признакам, так и по окраске пектином сильно отличаются от ворсинчатых. Для их клеток характерна апикальная о фаска CGL, который также связывает секрет железистых трубочек аденокарцином. Очевидно, секретируемые такими адено карциномам и гликопротеины муцинового типа отличаются по окраске CGL от секрета Бокаловидных клеток эпителия толстой кишки. Бокаловидные клетки эпителия тонкой кишки синтезируют муцины, дающие интенсивную окраску CGL. Следовательно, бокаловидные клетки в зависимости от микроокружения способны синтезировать либо CGL-активный, либо CGL-неактиеный секрет.

Такая пластичность наблюдается и при опухолевой трансформации, поскольку аденокарцмномы могут содержат как CGt-зктивные, так и, из(:.ьдкз, CGL-неактивные железы. Однако в последнем случае потеря окраски CGL, скорее всего, связана с потерей клеткой признаков дифференцировки, хотя не исключено, что клетки начинают синтезировать секрет, не взаимодействующий с пектином. CGL позволяет оценить, насколько развит секреторный аппарат в клетках аденокарциномы толстой кишки, учитывая содержание гликоконьюгатов с терминальными остатками галактозы. В большинстве случаев локализация и количество лигандов пектина в трансформированной ткани отличается от нормы (табл. 2).

Как видно из табл. 2, злокачественные и доброкачественные новообразования толстой кишки имеют как общие, так и отличительные черты по окраске СвЬ Следует добавить, что выявляемый СОи апикальный комплекс везикул вы со недифференцированных аденокарцином блюд невидного типа имеет своеобразное и уникальное строение, которое не обнаружено в других аденокарциномах (ворсинчатого типа), доброкачественных опухопях и в нормальных тканях. Следовательно, СО. позволяет детектировать своеобразную продукцию муци нового секрета в высокодифференцировэнных аденокарцином ах блюдцевидкого типа. Теория «дедифференцировки» опухолевых клеток как представление об унификации ультраструктурных свойств опухолевой клетки оказывается не соответствующей реальному положению вещей. Даже на примере дифференциальных окрасок С01. можно показать особый тип дифференцировки при опухолевом процессе.

2.4. Лиганды С61. в спинномозговых ганглиях крыс

На срезах симпатических спинномозговых ганглиев СО. маркирует мелкие чувствительные нейроны типа Б и их немиелиновые аксоны, 05-1В4 окрашивает те же клетки и немиелиновые аксоны нейронов (рис 4), отвечающие за болевую чувствительность. Они составляют до 50% от общего числа ганглионарных нейронов и/или менее диффузно распределены между крупными нейронами типа А, которые не окрашиваются обоими лектинами. Интенсивность окрашивания цитоплазмы может меняться от слабой до сильной.

Однако Св!. отличается от С5-1 ЕМ тем, что может давать интенсивное фоновое окрашивание. Это обусловлено связыванием пектина с внеклеточным матриксом спинномозгового ганглия и эндоневрием миелиновых аксонов (табл. 3).

Таблица 3. Селективное связывание различных тканевых структур СБЬ в сравнении с С5-1В4 в спинномозговых ганглиях крыс.

Элементы тканей Концентрация галактозы (тМ) Связывание Связывание

Цитоплазма нейронов тила Б 0 +

30 + +

100 +

200 - 1 I

Безм и ел иновые аксоны 0 +

30 + -

100

Внеклеточный матрице □ +

30 ;

+,'. показывает положительную реакцию иги ее отсутствие

Рис.4 Окраска конъюгагпзми CGL и GS-/Ö4 грудных спинномозговых г&нглиев крысы. Нейроны ггила S ¡жирные с/крепки) нейроны гг.иг.э А /арычные стреляй.', Безииелиновые жены (звездочка) А Окраска яонъюгэлюи CGL с пероксиСазой хрена. В. Окраска конъюгатов GS-IB4 с биотипом и кэнъ<огатом стрелтавибина с перохеидазой хрена Масштабная линейка 20 мхи

CGL представляет собой маркер чувствительных нейронов типа В спинномозговых ганглиев крысы. В отличие от других нейромаркеров пектин CGI-позволяет определять не только тела нейронов типа Б, но и их немиелиновые аксоны

2.5. Клонирование и очистка рекомбинантных белков

Применение CGL показало появление галактозосодержащих гликотопов при злокачественной трансформации эпителия толстой кишки. Аналогичные данные получены при помощи лектина из белковой железы виноградной улитки (НРА) на срезах карцином молочной железы (Brooks et а!., 1998}- Возникает вопрос, какую функцию могут выполнять эти гликотопы? Какое молекулярный механизм биологической активности? На примере гапектина-3 и ßi-интегринов клеток карциномы молочной железы человека мы постараемся ответить на данные вопросы

В результате клонирования полного гэлсетина-З при помощи соответсвующих праймеров и ПЦР были получены:

1. Полный галектин-3 человека с меткой 6HisTag (6 гистидиное на N-конце полипептидной цепи) в системе pQE-80 (Qiagen, США).

2. Полный галектин-3 человека без гистидиноаой метки в системе Рис19 (Novagen. США). Образцы белков анализировали Вестерн-блоттингом (рис 5).

И и

за №

3-0 кДа

Рис, 5. Вестврн-бпоттинг аалектина^З- А, Вестери-блоттинг ¡алектина-З без метки, проявленный попиклональныии антителами к еалектину-3. В. Вестерн -Ъпоттинг ¡апектина-3 проявлен иононлональными антителами к 6№$Тзд. Полная молекула вэпектина-3 • полоса с М,~30 лЛа,

2.6. Эндоцмтоз ^-интегринов и галектина-3 приводит к потере связи клеток с

субстратом

Преинкуба^я клеток с 3,3 мкМ галектина-3 30 мин при комнатной температуре приводит к уменьшению экспрессии С1>29 на клеточной поверхности (рис, 6, жирная черная линия). Экспрессия ргинтегринов не уменьшилась в отсутствие ре комбинат ого галектина-3 (рис. 6, тонкая непрерывная линия).

Рис.6. Эндоиуггнэз ßrunmetpuHoe, опосредованный ¿в.оекгпином-3 ЛЮА-М8-431 линии карциномы молочной железы (2x10°) инкубировало бел (тонкая непрерывная линия) или с 3,3 ыкМ рекомбинаягяного галектттина-З ^ероеека (Тполс.-пля непрерывная линия) а ФСБ О мин при комнатной температуре, после чего FITC-меченые анти-С0-29 антитела инкубировали с метками 1 ч при 4 °С То те количество клеток инкубировали с Р1ТС-иечеными l3Giо нетипичный контролем (тонкая пунктирная линия)

12 3 4

Рис. 7 Эндоцитоз •интегринов и галектина-3 по кэвеолярно-подобному пути 8Т-549 и 11-9-1-4 клеточные линии инкубировали а ФСБ (А. тонкая не прервет а я линия), после чего длбдвпяли г> ТС-знти-С0-29 при 4 "С Клетки также инкубировала в ФСБ с 3,3 мнМ галектина-3 е отсутствии (8, тонная непрерывная линия) или присутствии 4 мм/мл филипина (В. жирная непрерывная линия), после этого инкубировали с РИС- анти-СО-гэ 1 час при 4 'С. К клеткам добавляли филипин О, 1, 2. 3 и 4 мкг/ып (С. линии 1. 2, 3. 4 соответственно)

Следовательно, вклад эндогенного галектина-З в круговорот интегринов не может быть определен проточной цитофотометрией (РАСБ). Кроме того, преинкубация клеток с рекомбинантным галектином-З при 4°С не уменьшает экспрессию (Ь-интегринов на клеточной поверхности.

Для того, чтобы определить путь эндоцитозз эксперимент повторили в новых условиях. Клетки инкубировали с 3.3 мкМ галектика-3 8 отсутствии (рис, 7 В, тонкая непрерывная линия) или присутствии различных ингибиторов эндоцитоза. Препараты, ингибирующие клатрин-заеисимый путь, такие как хлорпромазин (=10 мкМ/мл), не изменяли экспрессию СО-29 в присутствии галектина-З (данные не показаны). Однако филипин (4 мкМ/мл), который ингибирует кавеолин-зависимый путь эндоцитоза, полностью нейтрализовал эффект галектина-З (рис, 7 В, толстая непрерывная линия), что позволяет предполагать, что галектин-3 участвует в интернализации ¡},-интегринов через богатые холестерином микродомены (кавеолярно-псдобный путь). Кроме того, наблюдали накопление галектина-З в инкубационной среде линии 11-9-4 в присутствии филипин а е зависимым от концентрации образом (рис. 7 С).

Максимум накопления лектина при концентрации фипилина 4 мкг/мл наблюдали после 3 ч инкубации в результате блокирования эндоцитоза галектина-З, секретируемого клетками. Сходные данные РАСЗ были получены с ВТ-549, 11-9-1-4 и МОА-МВ-435 клеточными линиями.

[Г

Рис. а визуализация эндоцитоза гал&ктина-З. ПТС меченый галектин-3 (0.8 мкМ) добавляли к МОА-МВ-231 клеткам, адхезированным на 4~камернык предметных стеклах, и инкубировали 20 мин при 37 "С в отсутствии (А) или присутствии (в) 15 иМ лактозы.

Эндоцитоз Р1ТС - меченого галектина-З клетками линий карциномы молочной железы (рис, 8 А) зависит от содержания гликаное на клеточной поверхности, так как этот процесс полностью ингибируется 15 мМ лактозы {рис. 8 В). Интересно, что эндоцитоз гапектина-3 очень сходен с зндоцитозом СС>-29.

ш н г 1.

С' -

• * ' :

Рис. 9. визуализация эндоцитозэ (¡¡-интегринов опосредованного галвктинон-3. МОД-МВ-З31 клетки, гдгезировзмиью и распластанные на 4-камермы< предметных с/пеклах, инкубировали с ЯТС-э«ти-СО-29 антителами 1 ч в бессывороточиой среде при 4 °С. Клетки отмыгали в бвссывороточкой среде и оккупировали вез (Д.) и с (в) мкМ гвлеяти«а-3 е отсутствии (В) или присутствии 15 «М раствора лахтозы (С) при 37 °С 30 мим.

В отсутствие галектина-З антитела к СО-29 окрашивали главным образом клеточную поверхность, где обычно локализован СР-29, в особенности в адгезивных бляшках, как показано стрелками (рис. 9 А). Однако встречали и перинуклеарное окрашивание клеток, что можно объяснить интернапизацией интегринов эндогенным галектином-З, В присутствии 3 мкМ галектина-Э окрашивание наблюдали только во внутриклеточных везикулах (рис.9 В).

Таким образом, интернапизация комплекса СР-29/антитела подтвердила данные РАСв-анализа. 15 мМ раствор лактозы полностью ингибировал этот эндоцитоз {рис. 9 С). Эндоцитоз галектина-3 и СР-29 оказался зависимы« от температуры среды. Интернализацию удалось наблюдать уже через 5 мин, а ее завершение - через 30 мин после качала инкубации при 37 "С, в то время как при 4 °С не замечено каких либо признаков зндоцитоэа даже после 2 ч инкубации (данные не показаны). Клетки других линий карциономы молочной железы человека также эндоци тировал и гапектин-3 и СР-29 как описано выше.

В настоящей работе мы сообщаем о новом явлении эндоцитоза ^-интегринов и галектина-3 клетками карциномы молочной железы. Представленные данные похазывают, что связывание гапектина-3 с клеточной поверхностью инициирует его собственный эндоцитоз и эндоцитоз С0-29, Это интересное явление должно прояснить вопрос о конкретной физиологической роли галектина-3. В предыдущих исследованиях различные линии раковых клеток, преинкубированные С 0.8-3,33 мхМ галектина-3, теряли способность к адгезии к ламинину и коллагену IV (ОсЫепд е1 а!., 1998). Теперь на основе полученных данных мы утверадаем, что Ргинтегрины. представляющие собой лиганды для белков внеклеточного матрикса (ЕСМ), подвергаются эндоцитозу и становятся недоступными для участия в адгезии.

Вестерн-блоттингом была обнаружена рециркуляция галектина-3 в клетках линий карциномы молочной железы человека (рис. 10). После отмывки клеток

йОкДа

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 10. Рециркуляция клетками карциномы иолонной железы человека экэогенно добавленного еалектина-3 с SHisTag. Вестерн-блоттинг с ипользоааниеи пероксидзэноео конъюгата анти-£HisTag. 1 • позитивный контроле, гэлектин-3 с SH¡sT¿g, 2 - содержание гзлектинз-З с eHisTag сразу после отмыехи. Содержание гзлектина-З с SHisTag после инкубации клеток: 3 • 10 мин, 4 - 20 ним, 5 • 40 мин, 6 - 80 иин. 7-160 мин.

смена градиента концентрации приводит к активному выбросу галектина-3 из клеток, который прекращается через 3 ч после начала эксперимента. Характерно появление полосы с Мс-60 кДа, представляющая собой димер галектина-3. По-видимому, проходя через систему внутриклеточных везикул, галектин-3 частично димеризуется.

После рециркуляции галектин-3 и CD-29, возможно, вовлекаются в реорганизацию цитоскелета в процессе клеточной адгезии и распластывания (Warfield et at., 1997). Основанием для данной гипотезы может быть наблюдаемое увеличение распластывания клеток и реорганизация микрофила ментов в течение 30 мин после добавления средних (0,8 мкМ) и округление клеток при высоких (5 мкМ) концентрациях галектина-3. Мы предполагаем, что концентрация галектина-3 во внеклеточной среде tn vivo или в клеточной культуре играет важную роль в движении и перераспределении интегринов на клеточной поверхности, что приводит к увеличению клеточной адгезии и подвижности. При средних уровнях галектина-3 возможно перераспределение мест фокальной адгезии, содержащих другие интегрины, такие как asPa, которые участвуют в ангиогенезе (Nangia-Makker et at., 2000). Однако высокие концентрации галектина-3 (5 мкМ) могут мешать нормальной рециркуляции CD-29 и, возможно, других интегрированных гетеродимеров, лимитируя таким образом их экспрессию на клеточной поверхности,

В общем, галектин-3 участвует в трафике CD-29 и возможно других родственных молекул с клеточной поверхности во внутриклеточные везикулы посредством кавеолярного пути эндоцитоза. Эчдоцитироеанный CD-29. возможно, рециркупируется обратно на клеточную поверхность и участвует в реорганизации цитоскелета и модуляции клеточной адгезии.

2.7. Эндоцитоз Сй!. клетками карциномы молочной железы не меняет их

адгезивность

Сви подвержен эндоцитоз у внутрь клеток линий карциномы молочной железы (рис. 11). Св1. также накапливается в везикулах перинуклеарного

* *

- Ф.

Рис. 11. Визуализация эндоцитоза CGL. F/ГС-мечвчый CGL {0,8 икМ) добавили * MDA-MB-231 клеткам, эдгезирооэнныи на 4-каиерных предметных стеклах, и инкубировали е отсутствии (А) или присутствии (в) 15 мМраствор» галактозы,

пространства, а специфичный ингибитор галактоза отменяет эту реакцию. Можно предположить, что CGL способен перекрестно связывать гликоконъюгаты клеточной поверхности и инициировать тем самым эндоцитоз. После обработки клеток высокими концентрациями лектина они сохранили способность прикрепляться и распластываться на субстрате

2.8. Модель регуляции клеточной адгезии галектином-3 и CGL

В модели, представленной на рис. 12, регуляция адгезии опухолевой клетки к ЕСМ происходит в зависимости от его внеклеточной концентрации. При низкой или средней in vivo внеклеточной концентрации происходит обычная адгезия опухолевых клеток к ЕСМ (рис. 12 АС). На этом уровне галектин-3 может даже стимулировать адгезию клеток к ЕСМ напрямую, соединяя рецепторы клетки с ЕСМ, или опосредованно: образуя кластеры из молекул интегринов, увеличивая, таким образом, их авидность (Kuwabara et al., 1996). При высоких концентраций (3.5 мкМ) галектин-3 связывает интегрины, чем значительно уменьшает клеточную адгезию к ЕСМ и приводит к удалению с клеточной поверхности этих интегринов (Ochieng et al.. 1998; Furtaket al., 2001).

Общий эффект состоит а том, что интегрины становятся недоступными для адгезии и клетки остаются в суспензии (рис. 12 В). Неизвестно, могут ли быть такие высокие концентрации галектинэ-3 /л ото, но вполне возможно, что в определенных микродоменах клеточной поверхности эта концентрация может достигать высоких значений, что достаточно для ингибирования взаимодействия интегринов с лигандами ЕСМ. С другой стороны, если галектин-3 добавлен к уже ад тезированным клеткам (рис. 12 С), ингибирование адгезии не столь велико (рис 12 D), при дальнейшем увеличении концентрации галектина-3 происходит эндоцитоз интегринов и клетки переходят в суспензионное состояние (рис. 12 В), чего не

наблюдали в случае с СИ., который, судя по всему, не взаимодействует с интегринзми клеточной поверхности (рис 12 Е—>Р).

□

ЛШ АМ^Ы ( (11.

Лии» ССЬ

нотсгрииЫ

Рис. 12 Модель, описывающая регуляцию адгезии аалектином-З и С<31. М0А-МВ~435 линии карциномы молочной железы к коллагену IV. Клетки панели А после инкубации с рекомбинантным галехтином^З (100 мхг/ил) помещали * 96 - лубочную пластиковую плату, преОеарительно покрытую коллагеном IV (10 икг/мл) и блокированную 2% БСА. Клетки не адгезировапи (панель В). При добавлении галектина-3 (30 мкг/мп) к уже прикрепленным и распластанным на коллагене IV клеткам (панель С) они лишь частично теряли связь е субстратом (панель О), при дальнейшем увеличении концентрации галектина-3 клетки переход или в суспензию полностью (панель В). При добавлении са к уже распластанным на коллагене IV клеткам (панель Е) н&блюдали эндоцитоз пектина с лигандом (панель О, однако интегрины этом оставались на клеточной поверхности. Следовательно, СвА. взаимодействует с другими гликоконъюгатами, но не с интегрин&ми..

Выводы

Обнаружены следующие ноаые свойства CGL и галектина-З;

1. Лиганды CGL в аденокарциномах толстой кишки блюдце видного типа представляют собой компоненты специфически измене не иных в ходе онкотрансформзции сегрегируемых продуктов клетки. Гликоконъюгаты мутоидного секрета нормальных бокаловидных клеток эпителия толстой кишки, в отличие от эденокарцином, не реагируют с CGL.

2. Аденокзрциномы толстой кишки ворсинчатого типа отличаются более интенсивной окраской клеток, что можно считать признаком метаплазии, поскольку гликоконъюгаты мукоидного секрета ворсинок нормальной тонкой кишки также реагируют с CGI,

3. CGL представляет собой маркер гликоконъюгатоа чувствительных нейронов типа 6 в спинномозговых ганглиях крыс. В отличие от других нейромаркеров ои позволяет определять не только тела нейронов, но и их немиелизированные аксоны.

4. Галектин-3 во внеклеточной среде яеляется медиатором эндоцитоза ßi-интегринов поверхности клеток карциномы молочной железы человека. Это приводит к изменению адгезивных свойств клеток: они теряют способность прикрепляться и распластываться на белках межклеточного матрикса,

5. Галектин-3 способен рециркулцэовать so внеклеточное пространство после эндоцитоза внутрь клетки в зависимости сгт градиента его концентрации в среде.

6. Эндоцитоз CGL клетками карциномы молочной железы не меняет их адгезивность. Это свидетельствует о разном характере лигандов клеточной поверхности, которые связывают галектин-3 и CGL.

Слисок основных публикаций по теме диссертации

1. Фуртак В А Морфологические и иммуноморфологические аспекты колоректальных опухолей человека II Тез. докл. Регион, естественно-научн. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. Владивосток. 1997, С. 86.

2. Фуртак S.A., Чикал овец И.В., Белогорцева НИ., Молчанова В,И„ Курика AB,, Хохлов Е.К,, Хамошин A.B., Рольщинов ИМ, Дифференциальная диагностика колоректальных опухолей человека иммуногистохимическиим методами с онкопреципитинами и пектинами И Тез. докл. 11 Дальневосточной регион, конф, с всерос. участием. Владивосток, 1998. С. 23.

3. Фуртак В А., Курика A.B., Чикал овец ИВ. Хохлов Е.К., Токмакова Н.П , Повещенко ОС. Морфологические и и мм у ном орфо логические исследования колоректальных опухолей человека II Тез, докл. каучн. конф, ТИБОХ ДВО РАН "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии". Владивосток, 1990. С. 126 -127.

4. Фуртак В.А., Курика A.B., Белогорцева Н И., Чикаловец И В., Клещенко Ю.Е. Клеточная локализация рецепторов м у ци нового типа, выявляемых новым GalNacfGal - специфичным пектином из морской мидии Crenomyttlus grayanus в

опухолях толстой киижи человека // Бюлл. экспер, биол и мед. 1959 Т. 128. № 10 С. 441-444.

5. Фу ртах ВА., Тихонов Я.Н., Чикаловец И.В., Лукьянов ПА. Гистопатология рецепторов лектина CGL в спинномозговых ганглиях крыс II Тихоокеанский мед, ж 2000, № 6. С. 41-43.

6 Белогорцева НИ., Молчанова В И , Ч^а ловец ИВ,, Одинцова НА.. ФуртакВ А., Лукьянов ПА. Особенности пектинов из мидии Cfenomytilus grayanus и асцидии Didemnum tematam/m и перспективы их использования //Тез докл научн. конф "ГИБОК ДВОРАН "Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока Владивосток, 2001, С. 20-21,

7. Furtak V, Hatcher F, Ochiervg J. Galectin-3 mediates the endocytosis of beta-1 integnns by breast car a noma cells//Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001, Vol, 289. № 4. P, 845 -850. .

8. Furtak V., Hatchef F., Ochieng J. Galectin-3 as a mediator of Integrin endocytosis U Thesis Spring symposium of res. centers in minority institutions. Atlanta (USA), 2001, P. 26.

4J ■ S

Соискатель ' У/*7*" ФуртакВ A,

Слисок сокращений

CGL - пектин из мидии Crenomytihis grayanus

НРА - пектин белковой железы улитки Helix pomalia

GS-!ЕЦ-пектин Gnffonia simpliafolia

БСА - бычий сывороточный альбумин

ФСБ - фосфат но-со лее ой буфер

ЕСМ- внеклеточный магтрикс

ПЦР - полныеразко-целная реакция

кДНК- кодирующая ДНК

6HisTag - метка из 6 гистидинов