Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Маннан-связывающие лектины из морского червя Serpula vermicularis и GlcNAc/GalNAc-специфический лектин из колониальной асцидии Didemnum ternatanum

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Маннан-связывающие лектины из морского червя Serpula vermicularis и GlcNAc/GalNAc-специфический лектин из колониальной асцидии Didemnum ternatanum"

На правах рукописи

Ли Вэй

Маннан-связывающие лектины из морского червя 8вгр1ёа увгткыЬпз и GlcNAc/GalNAc-специфический лектин из колониальной асцидии Didвmmtm 1вгпа1атт

03. 00. 04. - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВЛАДИВОСТОК 2004

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН

Шучтш рукотодигеж доктор химических наук

П.А. Лукьянов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Э.Я. Костецкий кандидат химических наук, старший научный сотрудник ГА Набережных

Ведущая организация: Институт биологии моря ДВО РАН

Защита с о с т о »парта 2004 г. в 10 часов на заседании

диссертационного совета Д 005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, Проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232)31-40-50.

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, Проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан февраля 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к. х. н., с.н.с. Г.И. Прокопенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Углевод-опосредованное узнавание является одним из центральных событий в функционировании биологических систем. На клеточном уровне такое распознавание обычно осуществляется путем специфического углевод-белкового взаимодействия и предшествует таким важным биологическим процессам как оплодотворение, эмбриогенез, миграция лейкоцитов к месту воспаления, проникновение инфекции в клетки хозяина. Информация об узнавании заключена в углеводных структурах, которые представлены на поверхности клеток в виде гликопротеинов, гликолипидов и полисахаридов. Эту информацию воспринимают углевод-узнающие белки, иначе называемые лектинами, путем специфического связывания с углеводными структурами по типу ключ-замок. Хотя о существовании лектинов известно уже более 100 лет (Sharon and Lis, 1989), идея, что они могут выступать как сигнал-передающие молекулы, до сих пор не утратила актуальности и, более того, интерес к лектинам продолжает расти.

Морские беспозвоночные мало изучены в качестве источника лектинов по сравнению с микроорганизмами, растениями и теплокровными животными. Многие лектины из морских беспозвоночных обладают различной биологической активностью. Так, лектин из морской губки Haliclona cratera токсичен по отношению к опухолевым клеткам линии HeLa и FemX (Pajic et al., 2002), с другой стороны, он обладает митогенной активностью по отношению к другим клеткам. Лектин из морской губки Chondnlla nucula способен тормозить (ингибировать) прикрепление ВИЧ к клетке хозяина (Т-клеткам человека) (Schroder et al., 1990).

Используемые сокращении мм- молекулярная масса, ПХ - лероксмдаза из хрена, AAG - а,-кнслый гликопротеин, Ara - арабиноза, BSM - муцин подчелюстной железы быка, Fue - фукоза. Gal - галактоза, GalNAc - N-ацетил-галактозамии, GaINHi- галактозамнн, GalUA - галактуроновая кислота, GIc - глюкоза, GlcNAc - N-ацетил-глюкозамин, GlcNHi- глюкозамин, GlcUA - глюкуроновая кислота, Man - манноза, ManNAc - N-ацетил-маннозамин, PSM - муцин из желудка свиньи, NANA- N-ацетнл-неПраминовая кислота

GkNAc-специфичный лектин из колониальной асцидии В1(1етпит ГегпаГапит (DTL) ингибирует пролиферацию и изменяет морфологию опухолевых клеток линии HeLa (Белогорцева и др., 1994; Odintsova et а1., 2001), проявляет себя как адгезивный и ростовой фактор по отношению к клеткам морского ежа и мидии (Одинцова и др., 1999)..

К настоящему времени выделенные и охарактеризованные лектины являются эффективным инструментом в исследовании структуры гликоконъюгатов клеточной поверхности и в понимании углевод-зависимых процессов передачи сигнала. Лектины оказались полезным инструментом при исследовании патологически измененных гликоконъюгатов и при диагнозе углевод-зависимых патологий.

Цель и задачи работы. Цель представленной работы - выделение, характеристика и изучение углеводной специфичности лектинов из двух видов морских беспозвоночных - колониальной асцидии В1(1етпит ГегпаГапит (лектин DTL-А) и морского червя 8егри1а уегт1еи1ат (лектины 8^-1 и 8^-2), и выяснение их биологической активности. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) Выделить и охарактеризовать GlcNAc/GalNAc-специфичный лектин DTL-A.

2) Выделить и охарактеризовать маннан-связывающие лектины 8^-1 и 8^-2.

3) Определить цитотоксические свойства этих лектинов в отношении клеток Т-лимфобластоидной линии С8166.

4) Изучить антивирусную активность выделенных лектинов.

Научная новизна. Из колониальной асцидии В1(1етпит ГегпаГапит в дополнение к выделенному ранее GlcNAc-специфичному лектину ф^) был выделен впервые GlcNAc/GalNAc-специфичный, гепарин-связывающий

лектин DTL-A. Из морского червя Serpula vermicularis также впервые были выделены в индивидуальном состоянии два лектина SVL-1 и SVL-2. Оба лектина оказались специфичными к бактериальным маннанам, что позволяет отнести их к группе маннан-связывающих белков. Исследованы основные физико-химические свойства выделенных лектинов. Показано, что SVL-1 и SVL-2 в отличие от других маннан-связывающих белков не требуют присутствия ионов для проявления ими углевод-связывающих свойств

Установлено, что DTL, DTL-A, CGL (лектин из мидии Crenomytilus grayanus), SVL-l и SVL-2 ингибируют процессы инвазии, репликации и синцитиеобразования ВИЧ-1ШВ в клетках Т-лимфобластоидной линии С8166 в экспериментах in vitro. На основании совокупности полученных нами данных можно говорить о том, что DTL, DTL-A, CGL и SVL-2 обладают анти-ВИЧ-1 активностью.

Теоретическое и практическое значение работы. Исследование лектинов морских беспозвоночных с уникальной углеводной специфичностью важно для понимания их биологической функции, филогенетических взаимосвязей и понимания углевод-зависимых процессов передачи сигнала в клетке.

Лектины являются полезным инструментом в исследовании сложных гликоконьюгатов и углевод-зависимых патологических процессов, в этой связи предлагается использовать их в исследовании заболеваний иммунной системы, нарушения процесса гликозилирования при различных патологиях, в том числе, и как эффекторов процесса инвазии ВИЧ.

Апробация работы. Основной материал диссертации был представлен на научной конференции ТИБОХ ДВО РАН «Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего востока» (Владивосток, Россия, 2001), на международном симпозиуме "The twentieth International Lectin Meeting" (Copenhagen, Denmark, 2002), на 3-ем международном симпозиуме "Химия и химическое образование"

(Владивосток, Россия, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы. Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 140 источников. Работа включает 22 рисунка, 12 таблиц и 2 схемы. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Колониальная асцидия Didemmim ternatanum была заготовлена в южных регионах Тихого океана, морской червь Serpula vermiculans был собран на сублиторали залива Петра Великого Японского моря.

Выделение лектинов проводили, используя комбинации аффинной, ионообменной и гель-проникающей хроматографии на различных сорбентах. При исследовании углевод-связывающих свойств и специфичности лектинов использовали реакцию прямой гемагглютинации (РПГА) и ее ингибирование, а также различные варианты твердофазного анализа. Молекулярную массу и субъединичный состав лектинов определяли методом SDS-электрофореза по Лэммли (Laemmli, 1970) и гель-проникающей хроматографии с использованием хроматографа АКТА FPLC (Amersham Pharmacia Biotech, Германия).

Для определения биологической активности лектинов использовали клетки Т-лимфобластоидной линии С8166, а также хронически инфицированные вирусом ВИЧ-1 Шв клетки линии Н9, которые были предоставлены Medical research Council (MRC, AIDS Reagent Project, UK). Жизнеспособность клеток определяли колориметрическим методом с использованием 3,[4,5-диметилтиазол-2-нл]- 2,5-дифенил тетразолий бромида (МТТ) (Amresco, Англия, (Pauvvels et al., 1988). Для оценки противовирусной активности лектинов использовали метод цитопатического эффекта с

помощью инвертированного микроскопа (образование синцитий) и метод ELISA (Luo et al., 1998).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение PTL-A.

Ранее в лаборатории химии неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН из колониальной асцидии Didemnum ternatanum был выделен GlcNAc-специфичный лектин (DTL) (Белогорцева и др, 1994). Нами разработан метод выделения нового GlcNAc/GalNAc-специфичного лектина (DTL-A) из этого же вида асцидии, содержащегося в несвязавшейся с аффинным сорбентом фракции. Из 50 мл сырого экстракта, полученного из 5 г высушенной асцидии, получили 13,6 мг лектина.

По данным гель-проникающей хроматографии лектин в нативном состоянии присутствует в виде агрегатов высокой молекулярной массы (нескольких миллионов), аналогичные результаты о высокомолекулярной агрегации были получены для других гепарин-связывающих лектинов курицы и плаценты человека (Ceri et al., 1981; Konka-Godt and Gabius, 1991). В растворах с высокой ионной силой (1,5 М NaCl) DTL-A способен диссоциировать на димер и мономер (рис. 1А). При проведении РПГА в буферных растворах с высокой ионной силой и димер, и мономер сохраняют гемагглютинирующую активность.

Олигомеризация не определяется образованием дисульфидных связей, поскольку при SDS-электрофорезе DTL-A в присутствии и отсутствии бета-меркаптоэтанола обнаруживается одна полоса с молекулярной массой 14 lcDa (рис. 1Б, линия 1). Способность DTL-A связывать гепарин была подтверждена результатами Вестерн-блоттинга. После электрофореза, электропереноса белка с геля на нитроцеллюлозную мембрану, инкубации в присутствии конъюгата гепарина с пероксидазой из хрена (гепарин-ПХ) и проявления субстратом была выявлена интенсивная полоса на уровне DTL-A

(рис. 1 Б, линия 3).

--94

--67

--43

--30

--20,1

--14,4

Рис. 1. А: Диссоциация DTL-A в присутствии высокой ионной силы. Предварительно DTL-A (2 мг) растворяли в 0,3 мл 0.01 M фосфата натрия, 1,5 M NaCl, pH 7,5 и выдерживали в течение ночи при 4°С. Гель-фильтрацию лектина проводили на колонке с сефадексом G-150 (1,8x90 см) с использованием в качестве элюента того же буферного раствора, фракции собирали по 3 мл. Колонка была калибрована с помощью белков с различной м.м. Б: 15% SDS-электрофорез DTL-A. 1 - DTL-A в невосстанавливающих условиях (в присутствии ß-меркаптоэтанола, также выявляется одна полоса белка с молекулярной массой 14 Ша), 2 - Стандарты молекулярных масс в kDa, 3 - Вестерн-блоттинг DTL-A с конъюгатом гепарина и ПХ.

2. Свойства DTL-A.

Для DTL-A характерно высокое содержание анионных аминокислот: аспарагиновой и глутаминовой кислот; гидрофобных: аланина, изолейцина и лейцина; основных аминокислот: лизина и аргинина. Такое высокое содержание остатков заряженных аминокислот, возможно, определяет высокое сродство к самоассоциации DTL-A за счет образования множественных ионных связей между субъединицами. Общее содержание углеводов составляет менее 1%.

Гомологии в N-концевой аминокислотной последовательности выделенного ранее DTL (Ala Asp Thr Asn Tip Gin Met Leu Gly His) и нового DTL-A (Ser Tyr Gin Ala Glu Phe Asp Thr Asn Gly) не наблюдается, следовательно, это разные лектины, что видно по их физико-химическим

свойствам и углеводной специфичности, обсуждаемым ниже.

DTL-A относится к кальций-независимым лектинам. Гемагглютинирующая активность DTL-A зависит от рН; его максимальная активность наблюдается в интервале рН от 6 до 8. DTL-A является термозависимым лектином; его активность сохраняется после инкубации в течение 1 часа в интервале температур от 4 и до 40°С, при более высоких температурах лектин теряет активность и полная его дезактивация наблюдается при нагревании раствора лектина при 50°С в течение 1 часа.

Очищенный DTL-A агглютинирует как нативные, так и трипсинизированные эритроциты человека в отличие от DTL, который агглютинирует только трипсинизированные эритроциты человека.

Изучение углеводной специфичности лектина проводили методом ингибирования РПГА эритроцитов человека с использованием различных моносахаридов и их производных, олигосахаридов, гликопротеинов, глюкозаминогликанов и сульфатированных полисахаридов (таблица 1).

Как видно из таблицы, среди изученных простых моносахаридов ингибирующей активностью обладают лишь GlcNAc и GalNAc. На основании этого DTL-A был нами определен как GlcNAc/GalNAc-специфичный лектин. Из данных, приведенных в таблице 1, можно предположить, что DTL-A предпочтительно связывает производные ^ацетилгексозаминов, содержащих а-, но не |3- гликозидные связи. ManNAc (эпимер GlcNAc по С-2 углеродному атому, в котором ацетамидная группа находится в аксиальном положении,) не обладает ингибирующей способностью, что указывает на вовлечение экваториальной ацетамидной группы ^ацетил-глюкозамина и ^ацетил-галактозамина при взаимодействии лектина со специфическим моносахаридом.

Таблица 1.

Минимальная ингибирующая концентрация moho-, олиго-, полисахаридов и гликопротеинов (1С, мг/мл), отменяющая гемагглютинацию эритроцитов в присутствии DTL-A____

Ингибитор 1С, мг/мл Ингибитор 1С, мг/мл

GlcNAc 0,28 Мелибиоза н и.

GalNAc 0,43 р-Нитрофенил-a-Gal н.и.

Метил-a-D-GIcNAc 0,625 р-Нитрофенил-p-GaI н.и.

Метил-P-D-GlcNAc н.и. BSM 0,00012

З-О-Метил-G IcN Ac н и. Аснало-BSM 0,000024

4-О-Метил-С IcNAc н.и. Фетуин 0,25

р-Нитрофенил-a-D- GlcNAc 0,092 Асиапо-фетуин 0,0625

р-Нитрофенил-p-D-GlcNAc н.и. AAG н.и.

Хитотриоза н.и. Асиало-AAG н.и.

Бензил-a-D-GlcNAc 1,25 Овалъбумин н.и.

Gaip(l—>4) GalNAc н.и. Овомукоид н.и.

Gaip(l—>3) GalNAc н.и. Декстран-сульфат . 0,0383

Gaip(l—»4) GlcNAc н.и. Хондроитин-4-сульфат 1,625

Лактоза н.и. Каппа-каррагннан 0,75

Гепарин 0,0075

Примечание: н и - не ингибирует. Ara, Xyl, Fue, Glu, Gal, Man, GlcNbb, GalNHî, NANA, ManNAc, GlcUA и GalUA не ингибиругот реакцию гемаггпютинации при концентрации 5 мг/мл.

Вероятно, ориентация ацетамндной группы важна для высокоаффинного взаимодействия углеводного лиганда с лектином. З-0-Me-GlcNAc и 4-O-Me-GlcNAc, а также олигосахариды Са1Р(1—►3)Са1НАс, Саф(1—<-4)Са1НАс, Са1р(1—»4)01сКАс не проявляли ингибирующей активности. Вероятно, заместители гидроксильных групп при С-3 и при С-4 стерически препятствуют образованию специфического комплекса с лектином.

Как видно из таблицы 1, наличие неполярного пара-нитрофенильного агликона в N-ацетил-гексозаминидах усиливает их ингибирующую способность. Вероятно, гидрофобные свойства агликона и (или) наличие диполя нитрогруппы в нем важны для связывания и образования дополнительных контактов с субсайтами лектина. РПГА также ингибировалась некоторыми гликопротеинами, такими как муцин подчелюстной железы быка (BSM) и фетуин, и их десиалированными производными. Среди них асиало-BSM является наилучшим ингибитором. Отсутствие ингибирующей активности у овальбумина и овомукоида объясняется тем, что терминальные остатки ^ацетил^-гексозаминов в их углеводных цепях имеют (3-аномерную конфигурацию (Yamashita et al., 1978; Yamashita et al., 1982; Parente et al., 1982).

Нативный и десиалированный альфа-1-кислый гликопротеин (AAG) также не были активны. Анализ ингибирования РПГА гликопротеинами показал, что потенциальными ингибиторами являются гликопротеины с О-связанными гликанами, такие как BSM; гликопротеины со смешанным типом цепей (фетуин) были менее активны, а альфа- 1-кислый-гликопротеин, имеющий только N-цепи, был не эффективен.

Глюкозаминогликаны и сульфатированные полисахариды (гепарин, декстран-сульфат, хондроитин-4-сульфат, каппа-каррагинан) были эффективными ингибиторами гемагглютинации. Среди них гепарин проявлял наивысшие ингибирующие свойства. Высокоаффинное взаимодействие DTL-A с гепарином было подтверждено твердофазным анализом (Вестерн-блоттинг, рис. 1 Б, линия 3), при этом выявляется полоса с м.м. 14 kDa, т.е. лектин способен взаимодействовать с гепарином в субединичном состоянии.

Исследование специфичности взаимодействия DTL-A с гепарином проводили также методом лектин-ферментного твердофазного анализа (ELLA)

с использованием конъюгата DTL-A с пероксидазой из хрена (DTL-A-ПХ) и гепарина, адсорбированного на планшете. Были подобраны оптимальные условия для взаимодействия лектина с иммобилизованным гепарином. Специфичные для углевод-связывающего сайта (CRD) лектина GlcNAc и GalNAc не ингибируют связывания DTL-A с гепарином, в то время как сам гепарин снижал связывание на 50 % в концентрации 4 мкг/мл. Из этого эксперимента следует, что гепарин-связывающий сайт и CRD на молекуле DTL-A независимы, что согласуется с литературными данными о других гепарин-связывающих лектинах (Kochibe and Matta, 1989; Uelda et al., 1999).

Взаимодействие DTL-A с гепарином дает возможность предположить, что лектин может выполнять в асцидии ту же функцию, что и кластерин у высших животных. Кластерин концентрируется в местах, богатых клеточными осколками и гидрофобными молекулами, за счет взаимодействия с гепарином (Punkhurst et al., 1998). Возможно, DTL-A также служит неким агентом, защищающим клетки асцидии от осколков разрушенных клеток и гидрофобных молекул, которые образуются при повреждении тканей.

В клетках асцидии, образующихся в процессе оогенеза и находящихся на поверхности зиготы в процессе эмбриогенеза, обнаружены сульфатированные полисахариды, в частности гепаран-сульфат (Cavalcante et al., 1999). Предполагается, что эти полисахариды, относящиеся к гликозаминогликанам, защищают личинки асцидии при попадании их на границу воды и воздуха, делая поверхность клеток более гидрофильной. Возможно, DTL-A, связываясь с такими полисахаридами, регулирует процессы адгезии, дифференцировки клеток при развитии организма асцидни. Участие DTL-A в защите организма от бактериальных инфекций, возможно, определяется взаимодействием лектина с гликанами клеточных стенок патогенов, содержащими остатки N-ацетил-гексозаминов.

Наличие двух участков связывания у DTL-A, вероятно, дает лектину возможность выступать в роли адгезивной молекулы, которая формирует многокомпонентный комплекс, включающий отрицательно заряженные полисахариды и различные гликоконъюгаты, содержащие GlcNAc и GalNAc. Такая специфичность лектина позволяет предположить, что природные лиганды для DTL-A имеют сложное строение. Наряду с этим можно предположить, что мультивалентное взаимодействие лектина с углеводными лигандами определяет его другие биологические функции.

3. Выделение и очистка лектинов из Serpula vermicularis.

Нами проведен скрининг морских беспозвоночных Японского и Охотского морей как источников лектинов. Всего нами исследовано более 20 видов, относящихся к различным типам морских беспозвоночных (губки, моллюски, черви и др.), в суммарных экстрактах шестнадцати из них обнаружена гемагглютинирующая активность с различной углеводной специфичностью. В трех видах губок (MyxШa incrnstans, Coelosphaera sp, Biemna variantia) и в одном виде червя Serpula vermicularis нами обнаружены маннан-связывающие белки (МВР).

Из морского червя Serpula vermicularis сочетанием методов аффинной, ионообменной и гель-проникающей хроматографии выделены и охарактеризованы два новых лектина, названных нами SVL-1 и SVL-2. Из 150 мг суммарного экстракта получили 3,2 мг SVL-1 и 2,1 мг SVL-2, соответственно. Выделенные лектины предпочтительнее агглютинируют нативные и трипсинизированнные эритроциты человека групп А, В, О.

Молекулярная масса по данным SDS-электрофореза SVL-1 и SVL-2 (рис. 2) составляет 31 kDa (линия 2) и 25,5 МСа (линия 5), соответственно. При SDS-электрофорезе в присутствии Р-меркаптоэтанола в случае SVL-1 выявляется одна полоса с м.м. 15,5 kDa (линия 3), для SVL-2 — одна полоса с

м.м. 12,7 kDa (линия 8), что указывает на наличие в SVL-1 и SVL-2 двух субъединиц, связанных между собой дисульфидными связями.

1 2 3 4

— - а

•и»

Ж

•и»

—

J

kDa

94 67 43

30 20,1 14,4

5 6

—л

Щ

•м»

ч Ч

kDa

94 67

43 30

20,1 14,4

Рис. 2. SDS-электрофорез SVL-1 и SVL-2 в 15 % полиакриламидном геле. 1, 4, 6 и 7 -стандарты молекулярных масс в kDa; 2, 3 - SVL-1; 5, 8 - SVL-2; 3, 8- электрофорез в восстановливающих условиях в присутствии Р-меркаптоэтанола.

Для определения молекулярной массы нативных лектинов изучали поведение лектинов при гель-проникающей хроматографии на колонках Superdex 75 HR 10/30 и Superose 6 HR 10/30 в PBS. При хроматографии на колонке Superdex 75 HR 10/30 нативного SVL-1 молекулярной вес составляет 65 kDa. Исходя из молекулярной массы, определенной при SDS-электрофорезе, в восстанавливающих условиях - 15,5 kDa и в невосстанавливающих - 31 kDa, можно предположить, что этот лектин представляет собой тетрамер, в котором две субъединицы связаны дисульфидными связями и между собой организованы в тетрамер. Кроме того, в нативных условиях лектин существует и в виде высокомолекулярных агрегатов с молекулярной массой более 100 kDa (предел эксклюзии колонки), на что указывает пик, выходящий в области свободного объема (Vo). Аналогично, молекулярная масса низкомолекулярного олигомера SVL-2 составляет 50 kDa, что также соответствует тетрамеру, как и в случае с предыдущим лектином. Для него

также характерна способность образовывать высокомолекулярные агрегаты. Аналогичные результаты по надмолекулярной организации SVL-2 были получены при гель-фильтрации на колонке Superóse 6 HR 10/30 (предел эксклюзии 5 MDa), нативный молекулярный вес тетрамера SVL-2 также составляет 50 kDa.

4. Свойства лектинов из Serpula vermicularis.

В отличие от других маннан-связывающих белков (МВР), исследуемые лектины относятся к Са2+-независимым лектинам, их гемагглютинирующая активность сохраняется при удалении двухвалентных катионов с помощью EDTA и не меняется при добавлении Са2+.

SVL-1 является термолабильным белком; нагревание лектина при температуре выше 30°С сопровождается уменьшением активности, полная необратимая потеря активности отмечается при инкубации в течение 2 часов при 50°С. Лектин сохраняет активность в диапазоне рН 6-8.

SVL-2 устойчив в диапазоне рН 6-9, при более низких и высоких значениях рН быстро теряет активность. Он также является термолабильным белком, нагревание лектина при температурах выше 30°С сопровождается уменьшением активности.

Для определения углеводной специфичности SVL-1 и SVL-2 использовали набор моно-, олиго-, полисахаридов и гликопротеинов, в частности маннанов, выделенных из морских бактерий Bacillus subtilis (маннан N1), Bacillus pumilus (маннан N2) и Marinomonas mediterranea (маннан N3), которые представляют собой высокоразветвленные гомополисахариды, построенные из а(1—+2) и а(1—>6)-связанных остатков D-маннопиранозы (Горшкова и др., 1992). Эффективное ингибирование РПГА наблюдалось именно для этих препаратов маннанов. В случае SVL-1

наивысшую ингибирующую активность среди исследованных маннанов проявляли маннан N1 и N3, а для SVL-2 - маннан N2 (таблица 2).

Таблица 2.

Минимальная ингибирующая концентрация moho-, олиго-, полисахаридов и гликопротеинов (1С, мг/мл), отменяющая гемагглютинацию эритроцитов в присутствии SVL-1 и SVL-2.

Ингибитор 1С, мг/мл

SVL-1 (31 kDa) SVL-2 (25,5kDa)

D-Glc н.и. н.и.

D-Gal н.и. н.и.

GalNAc н.и. н.и.

GlcNAc н.и. 1,2

D-Man н.и. н.и.

D-Fuc н.и. н.и.

PSM 0,125 н.и.

Асиало-PSM 0,03 н.и.

Фетуин 0,125 н.и.

Асиало-фетуин 0,5 н.и.

BSM 0,015 н.и.

Асиало-BSM 0,0039 н.и.

Овальбумин н.и. 0,313

Маннан N1 0,0625 н.и.

Маннан N2 н.и. 0,125

Маннан N3 0,03 н.и.

н. и - не ингибирует

Манианы N1, N2 и N3, выделенные из морских бактерий, построены из а(1—>2) а(1—>6)-связанных остатков D-маннозы

Среди ингибиторов РПГА высокую ингибирующую активность для SVL-1 проявили муцины, фетуин и их десиалированные производные. Анализ ингибирования гликопротеинами показал, что потенциальными ингибиторами являются гликопротеины с О-связанными углеводными цепями, такие как муцины, гликопротеины со смешанным типом цепей, например, фетуин, проявляют меньшую активность. В отличие от SVL-1, агглютинирующая активность лектина SVL-2 не ингибируется этими гликопротеинами, но

ингибируется овальбумином. Кроме того, лектин SVL-2 имел незначительное сродство к ^ацетил^-глюкозамину (таблица 2). По-видимому, SVL-2 способен дополнительно связывать остатки «биссектного» глюкозамина, присутствующего в N-гликанах овальбумина.

Высокая специфичность лектинов к разветвленным маннанам, построенным из а(1—>2) и а(1—>6)-связанных остатков D-маннозы, позволяет отнести выделенные лектины к группе маннан-связывающих белков (МВР).

5. Биологическая активность лектинов.

Известно, что МВР млекопитающих ответственны за преиммунный ответ организма-хозяина в борьбе с патогенами, в частности, с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). При этом МВР выступают либо в роли опсонинов, либо запускают работу каскада системы комплемента, выполняя функцию компонента. Предполагается, что подобный механизм защиты является высококонсервативным и имеется как у позвоночных, так и у беспозвоночных.

5.1. Цнтотоксическая активность.

Цитотоксическую активность CGL, DTL, DTL-A, SVL-1 и SVL-2 проверяли на клетках Т-лимфобластоидной линии С8166 в полной культуральной среде RPMI-1640, являющихся клетками-мишенями для вируса иммунодефицита человека. Клетки инкубировали в среде с лектином в течение 3 дней при 37°С в атмосфере с 5 % ССЬ, жизнеспособность клеток определяли колориметрическим методом с использованием МТТ (Pauwels et al., 1988). Цитотоксическая концентрация, вызывающая 50 % гибель клеток (СС50), для DTL, SVL-1 и SVL-2 составляет более 500мкг/мл. СС50 для DTL-A и CGL составляет 123,19 мкг/мл (8,8 мкМ) и 263,37 мкг/мл (14,6 мкМ),

соответственно. СС50 для азидотимидина, используемого как положительный контроль цитотоксичности, составляет более 5мкг/мл (более 18,7 мкМ). Таким образом, исследованные лектины не проявляли токсических свойств в диапазоне концентраций, используемых в анти-ВИЧ тестах (100 мкг/мл и ниже).

5.2. Антивирусная активность.

Лектины DTL, DTL-A, SVL-2 и CGL показывают активность против ВИЧ-1 Шв в экспериментах in vitro по заражению вирусом клеток линии С8166. Из рисунка 3 видно, что DTL в большей степени защищал клетки линии С8166 от цитопатического действия ВИЧ-1Шв с эффективной концентрацией ингибирования процесса на 50% (ЕС5о 0,002 мкг/мл), чем DTL-A (ЕС5о 0,36 мкг/мл), SVL-2 (ЕС50 0,57 мкг/мл) или CGL (ЕС5о 27,88 мкг/мл). Антивирусная активность лектинов была подтверждена в экспериментах по изучению их влияния на репликацию вируса и синтез вирусного антигена р24, выявляемого в культуральной среде зараженных вирусом клеток линии С8166. Как видно из приведенных данных (таблица 3), DTL вызывает 50% ингибирование синтеза антигена р24 с ЕС50 0,006 мкг/мл и не проявляет цитотокснческой активности даже при высоких концентрациях (СС0 выше 500 мкг/мл) и более эффективен, чем азидотимидин. SVL-2, DTL-A, CGL и SVL-1 были менее активны, вызывая 50% ингибирование синтеза вирусного антигена р24 в концентрациях (ЕС50) 0,23, 0,59, 45,7 и 89,1 мкг/мл, соответственно.

О 0013 0 0064 0 032 О 16 0 8 4 Концентрация, мкг/мл

Рис. 3. Ингибирование лектинами образования синцитиев Неинфицированные клетки линии С8166 культивировали с вирусом ВИЧ-1 Шв в присутствии различных концентрации лектинов в течение 3 дней. После инкубации количество синцитиев было определено с помощью микроскопа. ОТЬ ЕСзо: 0.002 мкг/мл; ОТЪ-А ЕС50: 0,36 мкг/мл; СОЬ ЕС50: 27,88 мкг/мл; БУИ ЕС50: >100 мкг/мл, 8УЬ-2 ЕС50' 0,57 мкг/мл; азидотимидин ЕСзо' 0,1 мкг/мл.

Таблица 3.

Цитотоксичность, ингибирование репликации ВИЧ-1 и гемагптютинирующая активность лектинов.

Препарат ЕС зоа мкг/мл СС500 мкг/мл ЕС5ов (нМ) сс50г (мкМ) ГАД мкг/мл АИе м.м. kDa

DTL 0,006 >500 0,2 >18,5 0,9 83333 27

DTL-A 0,59 123 42 8,8 0,007 209 14

SVL-2 0,23 >500 90 >19,6 62,5 >2178 25,5

CGL 45,7 263 2539 14,6 0,45 >6 18

SVL-1 89,1 >500 316548 >16,1 62,5 >4 31

Азидотимидин 0,012 >5 45 >18,7 - >416 0,27

aECjo: Эффективная концентрация соединений необходимая для 50 % ингибирования ВИЧ-1 репликации (определение присутствия вирусного антигена р24 методом ELISA) 6CCso: Цитотоксическая концентрация соединений, необходимая для 50 % снижения количества жизнеспособных клеток линии С8166, определенная МТТ методом. 'ЕС50 и ГСС50 величины, выраженные как нано- и микромолярность. "Минимальная концентрация необходимая для агглютинации - ГА 'Антивирусный индекс - АИ - величина отношения CCso/ECjo •

В зараженных клеточных культурах можно также наблюдать еще один весьма удобный для исследования признак заражения - образование многоядерных синцитиев (1л et а1., 2003). В связи с этим лектины дополнительно тестировали на ингибирование межклеточного слияния и синцитиеобразование между хронически инфицированными ВИЧ-1 клетками линии Н9 и неинфицированными клетками линии С8166. Как видно из рисунка 4, БТЬ эффективно ингибировал синцитиеобразование.

0 0013 0.0064 0 032 0.16 0 8 4 20 100 Концентрация миг/ил

Рис. 4. Ингибирование межклеточного слияния под действием лектинов. Неинфицированные С8166 клетки культивировали с хроническими инфицироваными вирусом ВИЧ-1 Шв Н9 клетками в присутствии различных концентрации лектинов в течение 24 часов. Количество образовавшихся синцитиев определяли с помощью микроскопа. ОТЬ ЕС5о: 1,37 мкг/мл; ОТЬ-А ЕС50: 6,97 мкг/мл; СОЬ ЕС30: 35,12 мкг/мл; БУИ ЕС50: >100 мкг/мл; БУЬ-2 ЕС,0: >100 мкг/мл.

Эффективная концентрация препарата, вызывающая 50 % ингибирование (ЕС50 1,37 мкг/мл), в 1,8 раза ниже концентрации декстран сульфата (ЕСзо 2,45 мкг/мл), используемого в качестве положительного контроля в этом эксперименте. Ингибирующая способность БТЬ-А и CGL была более низкой, ЕС50 составляла 6,97 и 35,12 мкг/мл, соответственно. 8\Ъ-1 и 8\Ъ-2 не проявляли ингибирующего действия на межклеточное слияние и синцитиеобразование между хронически инфицированными Н9/ВИЧ-1 и неинфицированными С8166 клетками даже при высоких

концентрациях (ЕС50 свыше 100 мкг/мл).

Общую степень антивирусной эффективности лектинов определяли вычислением антивирусного индекса (АИ) (Lopez et al., 2003). В таблице 3 приведены результаты экспериментов по определению этих характеристик для исследованных препаратов. Из величин АИ видно, что DTL (АИ более 80000) и SVL-2 (АИ более 2000) по сравнению с азидотимидом (АИ более 416) значительно эффективнее ингибируют репродукцию ВИЧ-1. DTL-A, CGL и SVL-1 имеют более низкие, чем DTL, значения АИ. Сравнение этих результатов с результатами их гемагглютинирующей активности (ГА) показало, что корреляции между анти-ВИЧ активностью и ГА исследованных лектинов не наблюдалось; лектины с наивысшей ГА не всегда более эффективны против ВИЧ инфекции. Эти результаты согласуются с литературными данными по изучению антивирусной активности лектинов из растений (Balzarini et al., 1992; Charan et al., 2000; Lopez et al., 2003; Wright et al., 1999). Результаты исследования показали, что анти-ВИЧ активность in vitro возрастает в ряду CGL, DTL-A, SVL-2, DTL.

Первым этапом в любой вирусной инфекции является связывание вирусной частицы с компонентами мембраны заражаемой клетки. Для ВИЧ роль такого рецепторного компонента играет белок клеточной мембраны, называемый антигеном CD4. Как было установлено, связывание вируса определяется взаимодействием гликопротеинов вирусной оболочки - gpl20 и gp41 с CD4 антигеном внешней поверхности клетки-мишени. Этот факт открывает новую возможность борьбы с ВИЧ инфекцией - можно препятствовать взаимодействию вируса с клеточным рецептором CD4, блокируя вирусные gpl20 или gp41, являющиеся гликопротеинами с высокоманнозным и гибридным типом углеводных цепей, различными маннан-связывающими лектинами.

ВЫВОДЫ

1. Из колониальной асцидии Didemnum ternatanwn впервые был выделен новый GlcNAc/GalNAc-специфичный Са2+-независимый лектин (DTL-A), проявляющий гепарин-связывающие свойства. Установлено, что лектин в нативном состоянии существует в виде высокомолекулярных агрегатов, способных диссоциировать в растворах с высокой ионной силой до димера и мономера.

2. Из морского червя Serpula vermicnlaris выделены и охарактеризованы два новых Са2+-независимых лектина SVL-1 и SVL-2, специфичных к разветвленным маннанам. SVL-1 способен также связывать муцин, фетуин и их десиалированные производные, SVL-2 имеет сродство к овальбумину и ^ацетил^-глюкозамину.

3. DTL, SVL-2 и DTL-A ингибируют адгезию вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1111в к Т-лимфобластоидным клеткам линии С8166 в экспериментах in vitro. DTL, SVL-2 и DTL-A эффективно тормозят репликацию вируса с ЕС50 6-590 нг/мл, антивирусный индекс (СС50/ЕС50) для DTL составляет более 80000, для SVL-2 более 2000 и для DTL-A- более 200.

4. DTL и DTL-A ингибируют межклеточное слияние и образование синцитиев между неинфицированными клетками линии С8166 и хронически инфицированными Н9/ВИЧ-1 Шв клетками с ЕС50 в диапазоне 1,4-7,0 мкг/мл.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Молчанова В.И., Ли В., Белогорцева Н.И., Лукьянов П.А. Выделение и характеристика нового маннан-связывающего лектина из морского червя Serpula vermicularis II Материалы научной конференции "Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего востока": Тез. докл.: Владивосток: Дальнаука, 2001. С. 123-124.

2. Li W., Molchanova V.I., Chikalovets I.V., Kozyrevskaya S.A., Belogortseva N.I. Isolation and characterization of a new D-GlcNAc/D-GalNAc-specific lectin from ascidian Didemniim ternatanum II Abs. The twentieth International Lectin Meeting. Copenhagen. Denmark. 2002. P. 104.

3. Li W., Kobelev S. Elucidation of fine structural organization of GalNAc/Gal-Specific Lectin from the Sea Mussel Crenomytilus grayanns by Laser Raman Spectroscopy // J. Dalian Fish. Univ. 2003. N.3. P. 197-199.

4. Молчанова В.И., Чикаловец И.В., Ли Вэй. Выделение и характеристика лектинов из морского червя Serpula vermicularis // 3-й Международный симпозиум "Химия и химическое образование": Тез. докл.: Владивосток: Изд-во ДВГУ, 2003. С.60-61.

Соискатель Ли Вэй

Благодарности.

Я благодарю директора ТИБОХДВО РАН академика В.А. Стоника за предоставленную возможность проведения запланированных исследований в Институте, зам. директора по научной работе к.б.н. В.А. Рассказова, зав отделоммолекулярной иммунологии чл.-корр. РАНВ.Е. Васьковского.

Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю дх.н. П.А. Лукьянову и научным консультантам ст.н.с. к.х.н. В.И. Молчановой и ст.н.с. к.х.н. НИ. Белогорцевой за неоценимую помощь на всех этапах выполнения и написания даннойработы

Япризнателен также к.х.н. И.В. Чикаловец, к.х.н. А.В. Курике, к.х.н. А.А. Булгакову вед. иною. ИМ. Вахругиевой, ст.лаб.Л.Р. Захаркиной, м.н.с. С.С. Кобелеву, м.н.с. Н.В. Журавлевой и сотрудникам лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН за помощь в проведении исследований и заинтересованное отношение к диссертационной работе. Яхочу выразить благодарность сотрудникам Института зоологии Китайской Академии Наук (КНР, Кунминг) к.б.н. Ю. Т. Чжэну, к.б.н. Ж. X. Вану и к б н. Д.Ю. Ояну за помощь в проведении экспериментов, связанных с исследованием анти-ВИЧ активности лектинов. Также хочу выразить благодарность профессору Э. Ховарду из Вандербилтуниверситета (Теннеси, США) за проведение анализа Nконцевой последовательности аминокислот исследоанныхлектинов.

Ли Boíi

Маннан-связывающие лектины из морского червя Serpula vermicularis и GlcNAc/GalNAc-специфнческий лектин из колониальной асцидии Didemnum ternatanum

АВТОРЕФЕРАТ

ЗАО «Фар ron» Г Владивосток, ул. Алеутская, 28

Tufa« 100 экз Изготовлено с машинописных листов Огпечагано 24 февраля 2004г

»430 7

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ли Вэй

Список сокращений

1. Введение

2. Литературный обзор

2.1. Введение

2.2. Лектины морских беспозвоночных

2.2.1. Происхождение, локализация и биосинтез лектинов

2.2.2. Функции лектинов в организме

2.3. Углеводная специфичность лектинов '

2.3.1. Моносахариды 15 2.3.1.1. GalNAc/GlcNAc специфичные лектины

2.3.2. Олигосахариды и полисахариды 19 2.3.2.1. Маннан-связывающие белки

2.3.3. Углевод-содержащие гетерополимеры 22 2.3.3.1. Гепарин-связывающие лектины

2.4. Строение углевод-связывающих сайтов лектинов

2.5. Биологическая активность лектинов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Маннан-связывающие лектины из морского червя Serpula vermicularis и GlcNAc/GalNAc-специфический лектин из колониальной асцидии Didemnum ternatanum"

Углевод-опосредованное узнавание является одним из центральных событий в функционировании биологических систем. На клеточном уровне такое распознавание обычно осуществляется путем специфического углевод-белкового взаимодействия и предшествует таким важным биологическим процессам как оплодотворение, эмбриогенез, миграция лейкоцитов к месту воспаления, проникновение инфекции в клетки хозяина. Информация об узнавании заключена в углеводных структурах, которые представлены на поверхности клеток в виде гликопротеинов, гликолипидов и полисахаридов. Эту информацию воспринимают углевод-узнающие белки, иначе называемые лектинами, путем специфического связывания с углеводными структурами по типу ключ-замок. Хотя о существовании лектинов известно уже более 100 лет (Sharon and Lis, 1989b), идея, что они могут выступать как сигнал-передающие молекулы, до сих пор не утратила актуальности и, более того, интерес к лектинам продолжает расти.

К настоящему времени выделенные и охарактеризованные лектины являются эффективным инструментом в исследовании структуры гликоконъюгатов клеточной поверхности и в понимании углевод-зависимых процессов передачи сигнала. Лектины оказались полезным инструментом при исследовании патологически измененных гликоконъюгатов и при диагнозе углевод-зависимых патологий.

Морские беспозвоночные мало изучены в качестве источника лектинов по сравнению с микроорганизмами, растениями и теплокровными животными. Изучение лектинов из морских беспозвоночных впервые в мире было предпринято в начале 20 века Ногути Хидэё, который первым опубликовал сообщение об их способности агглютинировать эритроциты. В настоящее время обнаружено присутствие лектинов в различных органах и тканях лимфе, слизи поверхности тела, гонадах и др.) в более чем 300 видов морских организмов (морские водоросли, кишечнополостные, членистоногие, иглокожие, хордовые и др.), но недостаточно известно об их углеводной специфичности, структуре и физиологических функциях (Shimizu and Kamiya, 1983).

Многие лектины из морских беспозвоночных обладают различной биологической активностью. Так лектин из морской губки Haliclona cratera токсичен по отношению к опухолевым клеткам HeLa и клеткам FemX (Pajic et ah, 2002), с другой стороны, он обладает митогенной активностью по отношению к другим клеткам. Лектин из морской губки Chondrilla nucula способен ингибировать прикрепление ВИЧ к клетке хозяина (Т-клеткам человека) (Schroder et ah, 1990). GlcNAc-епецифичный лектин из колониальной асцидии Didemnum ternatanum (DTL) ингибирует пролиферацию, снижает уровень включения [3Н]-тимидина, изменяет морфологию опухолевых клеток HeLa (Белогорцева и др., 1994; Odintsova et ah, 2001) и проявляет себя как адгезивный и ростовый фактор по отношению к клеткам морского ежа и мидии (Одинцова и др., 1999) и др.

Настоящая работа посвящена выделению, характеристике и изучению углеводной специфичности лектинов из двух видов морских беспозвоночных морского червя Serpula vermicularis и колониальной асцидии Didemnum ternatanum. Целью данного исследования является выяснение биологической активности этих лектинов, в частности, как эффекторов процесса инвазии ВИЧ. Охарактеризованные лектины могут быть использованы как полезные инструменты для исследования заболеваний иммунной системы и нарушений процессов гликозилирования при различных патологиях.

2.ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 Введение

Углевод-связывающие белки (пектины) были открыты более 100 лет тому назад (Sharon and Lis, 1989b). Однако, только в последние годы они оказались в центре внимания клеточных биологов, поскольку научные открытия последних лет показали, что углевод-белковое взаимодействие является важным механизмом передачи биологической информации на уровне клетки, то есть передачи информации при взаимодействии клеток друг с другом и межклеточным матриксом. Через углевод-зависимые взаимодействия осуществляются такие важные биологические процессы как оплодотворение, проникновение патогена в клетки хозяина, миграция лейкоцитов к месту воспаления, а также процессы малигнизации и метастазирования.

В настоящее время в различных областях биологических и медицинских исследований, в частности для решения проблем в области мембранологии и гликобиологии, широко используются и изучаются лектины.

Лектины - это общее название белков, обладающих свойством обратимо и избирательно связывать углеводы, не вызывая их химического превращения. Термин лектины (от латинского Legere-выбирать), предложенный У. Бойдом, подчеркивает избирательность их взаимодействия с углеводами. В 70-х годах его начали применять для обозначения • углевод-связывающих белков растительного и животного происхождения. Позже появились сообщения, что лектины широко распространены в биологическом мире, начиная с вирусов и кончая млекопитающими (Kamiya, 1995).

Одним из главных свойств лектинов является их избирательное взаимодействие с углеводами. На сродство лектинов к углеводам обратили внимание исследователи, которые обнаружили, что моносахариды подавляют гемагглютинирующую активность лектинов. Углеводы, выступая в качестве гаптенов, блокируют сайты связывания лектинов. Изучение специфичности взаимодействия лектинов с углеводами проводилось на сходном принципе блокирования активных антител гаптеном.

Одна из первых классификаций лектинов, которая сохранилась и сейчас, основывается на том, что специфичность взаимодействия лектина с углеводом зависит от положения гидроксилов при 3-м и 4-м атомах углерода, а так же D-или L-формы пиранозного цикла углеводов.

В наше время лектины по специфичности подразделяют на четыре типа, первые два из которых наиболее широко представлены в природе: 1) С-тип лектины 2) S-тип лектины 3) Р-тип лектины 4) и другие. С-тип лектинов называется так потому, что для их связывающей активности необходимы ионы кальция. К S-типу относятся лектины способные связывать Р-галактозиды, отсюда их второе название - галектины. Р-тип лектинов является специфичным для гликопротеинов, содержащих остатки маннозо-6-фосфата. Среди других групп следует отметить пентраксины, характеризующиеся пентамерной субъединичной структурой и I-тип лектинов имеющих сходство с иммуноглобулинами.

Различные лектины способны реагировать с редко встречающимися в обычной практике углеводами и их производными, содержащими N- и О-ацетильную группу, сиаловыми и уроновыми кислотами, дигалактозидами, пентозами, фосфорилированными и сульфатированными углеводами.

Аминокислотный состав лектинов, особенно из эволюционно отдаленных организмов, существенно различается. Поэтому говорить об одном характерном типе аминокислотного состава для лектинов не представляется возможным.

В качестве кофакторов, поддерживающих их третичную и четвертичную структуру, лектины могут содержать углеводы и ионы металлов Са , Мп , в меньшей степени Zn , Mg и прочие. Удаление их из молекулы лектина приводит к потере их биологической активности. Вместе с тем, для некоторых лектинов ионы металлов не являются обязательным компонентом и не влияют на их биологическую активность (Луцик, 1981).

Количество углеводов в различных лектинах колеблется в широких пределах от 3% до 80%, но в типичных случаях составляет 3-10%. Моносахариды, образующие основные олигосахаридные цепи, представлены, как правило, И-ацетил-О-глюкозамином (GlcNAc) и D-маннозой (Man). Из всех известных лектинов только конканавалин А (сопА) и лектин гороха не содержат углеводной компоненты.

Для выполнения своих биологических функций лектин либо содержит 2 и более углевод-связывающих доменов в молекуле, либо имеет способность к олигомеризации мономеров, содержащих один углевод-связывающий сайт (CRD). Это свойство позволяет лектинам перекрестно сшивать клетки (агглютинировать). Агглютинация эритроцитов, или гемагглютинация, - это главное свойство лектинов, которое позволяет обнаружить и охарактеризовать их (Lis and Sharon, 1998).

Четвертичная структура большинства известных лектинов построена из нескольких полипептидных цепей или субъединиц. Компоновка субъединиц в молекуле лектина весьма разнообразна. Для лектинов характерно явление множественности форм, т.е. наличие изолектинов в одном организме, необходимых для проявления мультифункциональности их действия в сложном организме. Множественные формы могут быть построены из различных видов субъединиц. Наиболее простым вариантом структуры молекулы является димер или тример, построенный из субъединиц одного типа, что характерно для растений. Более сложным вариантом структуры молекулы лектина являются олигомеры, построенные из субъединиц разного типа, характерные для высших организмов. Существенную роль в стабилизации третичной и четвертичной структуры лектинов играют дисульфидные мостики. Если же они отсутствуют, то субъединицы способны к самоассоциации за счет гидрофобных и водородных связей, в некоторых случаях за счет коллаген-подобных доменов по типу «подобное взаимодействует с подобным».

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ли Вэй

5. ВЫВОДЫ

1. 1. Из колониальной асцидии Didemnum ternatanum впервые был выделен новый GIcNAc/GalNAc-специфичный Са -независимый лектин (DTL-A), проявляющий гепарин-связывающие свойства. Установлено, что лектин в нативном состоянии существует в виде высокомолекулярных агрегатов, способных диссоциировать в растворах с высокой ионной силой до димера и мономера.

2. Из морского червя Serpula vermicularis выделены и охарактеризованы два новых Са -независимых лектина SVL-1 и SVL-2, специфичных к разветвленным маннанам. SVL-1 способен также связывать муцин, фетуин и их десиалированные производные, SVL-2 имеет сродство к овальбумину и Ы-ацетил-О-глюкозамину.

3. DTL, SVL-2 и DTL-A ингибируют адгезию вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1 Шв к Т-лимфобластоидным клеткам линии С8166 в экспериментах in vitro. DTL, SVL-2 и DTL-A эффективно тормозят репликацию вируса с ЕС50 6-590 нг/мл, антивирусный индекс (СС50/ЕС50) для DTL составляет более 80000, для SVL-2 более 2000 и для DTL-A-более 200.

4. DTL и DTL-A ингибируют межклеточное слияние и образование синцитиев между неинфицированными клетками линии С8166 и хронически инфицированными Н9/ВИЧ-1 Шв клетками с ЕС50 в диапазоне 1,4-7,0 мкг/мл.

Благодарности.

Я благодарю директора ТИБОХДВО РАН академика В.Л. Стоника за предоставленную возможность проведения запланированных исследований в Институте, зам. директора по научной работе к.б.н. В.А. Рассказова, зав. отделом молекулярной иммунологии чл.-корр. РАН В.Е. Васьковского.

Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю д.х.н. П.А. Лукьянову и научным консультантам ст.н.с. к.х.н.

B.И. Молчановой и ст.н.с. к.х.н. Н.И. Белогорцевой за неоценимую помощь на всех этапах выполнения и написания данной работы.

Я признателен также к.х.н. И.В. Чикаловец, к.х.н. А.В. Курике, к.х.н. А.А. Булгакову, вед. инж. Н.М. Вахрушевой, ст. лаб. JJ.P. Захаркиной, м.н.с.

C.С. Кобелеву, м.н.с. Н.В. Журавлевой и сотрудникам лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХДВО РАН за помощь в проведении исследований и заинтересованное отношение к диссертационной работе. Я хочу выразить благодарность сотрудникам Института зоологии Китайской Академии Наук (КНР, Кунминг) к.б.н. Ю.Т. Чжэну, к.б.н. Ж. X. Вану и к.б.н. Д.Ю. Ояну за помощь в проведении экспериментов, связанных с исследованием анти-ВИЧ активности лектинов. Также хочу выразить благодарность профессору Э. Ховарду из Вандербилт университета (Теннеси, США) за проведение анализа N-концевой последовательности аминокислот исследоанных лектинов.

4.6. Заключение

В процессе исследования лектинов морских беспозвоночных, были выделены и охарактеризованы новые лектины из двух видов морских беспозвоночных. Нами выделен новый лектин (DTL-A) из колониальной асцидии Didemnum ternatanum последовательной аффинной хроматографией на перекрестно-сшитом овальбумине, GlcNAc-агарозе и последующей гель-проникающей хроматографией. Из другого беспозвоночного - морского червя Serpula veramicularis, выделены два новых лектина - SVL-1 и SVL-2 сочетанием методов аффинной хроматографии на перекрестно-сшитом овальбумине с муцином, ионообменной и гель-фильтрационной хроматографий.

DTL-A не взаимодействует с перекрестно-сшитым овальбумином, но связывается с GlcNAc-агарозой. Этот предполагает, что DTL-A не способен узнавать углеводные цепи овальбумина, но способен взаимодействовать с терминальными остатками N-ацетил-глюкозамина. Результаты данных ингибировании гемагглютинации подтверждают это.

Изучение углеводной специфичности DTL-A проводили методом ингибирования РПГА эритроцитов человека и твердофазного анализа с использованием различных моносахаридов и их производных, олигосахаридов, гликопротеинов, гликозаминогликанов и полисахаридов. Среди изученных простых моносахаридов ингибирующей активностью обладают лишь GlcNAc и GalNAc. На основании этого DTL-A был нами определен как GlcNAc/GalNAc-специфичный лектин. С другой стороны, среди полисахаридов гепарин является наилучшим ингибитором. Независимое взаимодействие DTL-A с GlcNAc/GalNAc или гепарином дает возможность предположить, что углевод-связывающий сайт лектина обладает независим от гепарин-связывающего, что придает ему возможность проявлять различные функции в живом организме.

Изучение тонкой углеводной специфичности SVL-1 и SVL-2 показало, что лектины преимущественно взаимодействуют с высокоманнозным типом углеводных цепей, построенных из а-1,2 и а-1,6-связанных остатков D-маннозы, дрожжеподобные высокоразветвленные маннаны морских бактерий являются высокоспецифическими лигандами для этих лектинов. В случае SVL-1 среди исследованных гликопротеинов высокую ингибирующую активность проявляли муцин, фетуин и их десиалированные производные. В отличие от SVL-1 агглютинирующая активность SVL-2 не ингибировалась этими гликопротеинами. В случае SVL-2 наилучшим ингибитором является овальбумин. Кроме того, для SVL-2 выявляется низкоаффинное сродство к

Ы-ацетил-О-глюкозамину, что характерно для некоторых МВР. Этот позволяет отнести выделенные нами лектины SVL-1 и SVL-2 к группе маннан-связывающих белков, которые также имеют незначительное сродство GicNAc.

Для выявления биологической активности изучаемых в лаборатории лектинов против вируса иммунодефицита человека нами проведены эксперименты по определению цитотоксичности этих лектинов для клеток, используемых в тест-системах. DTL-A и CGL показали слабую цитотоксичность для клеток Т-лимфобластоидной линии С8166 в экспериментах in vitro. В области концентраций, используемой в анти-ВИЧ тест-системах, они были не токсичны для клеток. Лектины DTL-A, SVL-2, DTL и CGL обладают анти-ВИЧ-1IIIB активностью при концентрации (ЕС5о) 0,59, 0,23, 0.006, и 45,7 мкг/мл, соответственно. DTL-A, DTL и CGL аффективно ингибируют межклеточное слияние между клетками линии С8166 и хронически инфицированными клетками линии Н9/ВИЧ-1 Шв

DTL и SVL-2 были значительно эффективнее, по сравнению с азидотимидом, в ингибировании репродукции ВИЧ-1. DTL-A и CGL проявляют более слабое ингибирующее действие на репликацию вируса, чем DTL. SVL-1 не проявлял такой активности. Сравнение этих результатов с данными по их гемагглютинирующей активности показало низкую корреляцию между анти-ВИЧ активностью и лектинной активностью исследованных лектинов; высоко аффинные к эритроцитам человека лектины, например DTL-A, не столь эффективны против ВИЧ инфекции. Этот факт открывает новую возможность борьбы с ВИЧ инфекцией — можно препятствовать взаимодействию вируса с клеточным рецептором CD4, блокируя вирусные gpl20 или gp41, являющиеся гликопротеинами с высокоманнозным и гибридным типом углеводных цепей, различными маннан-связывающими лектинами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ли Вэй, Владивосток

1. Белогорцева Н.И., Оводова Р.Г., Мороз С.В.Одинцова Н.А., Ермак А.В., Оводов Ю.С. Выделение и общая характеристика лектина из асцидии Didemnum ternatanum II Биоорган, химия. 1994. Т.20. N.8 9. С. 975 - 983.

2. Булгаков А.А., Елисейкина М.Г., Петрова И. Ю., Вахрушева Н.М., Свойства маннан-связывающего лектина из целомической жидкости трепанга Stichopus japonicus II Биология моря. 1999. Т.25. N.2. С.91 93.

3. Булгаков А.А., Назаренко Е.Л., Петрова И. Ю., Елисейкина М.Г., Вахрушева Н.М., Зубков В. А. Выделение и свойства маннан-связывающего лектина из целомической жидкости голотурии Cucumariajaponica И Биохимия. 2000. Т.65. N.8. С.75 82.

4. Гафуров Ю.М., Булгаков А.А., Рассказов В.А. // Тез. докл. Научн. конф. ТИБОХ ДВО РАН. Исследования в области физико-химимической биологии и биотехнологии. Владивосток. 1998. С. 147 148.

5. Горшкова Р.Н., Исаков В.В., Командрова Н.А., Иванова Е.Р., Оводов Ю.С. Структурное исследование биогликанов, продуцируемых Baclluspumilus И Биоорган, химия. 1992. Т. 18. N.4. С.413 417.

6. Луцик М.Д., Панасюк У.Н., Луцик А.Д. Лектин // Вища школа. Львов 1981. С.7 62.

7. Одинцова Н.А., Белогорцева Н.И., Ермак А.В., Лукьянов П.А. Новый адгезивный и ростовой фактор для клеток морских беспозвоночных // ДАН 1999. Т.364. N.2. С.271 -273.

8. Руослахти Э. Иммуносорбенты в очистке белков // Медицина, М. 1979. Степаненко Б.И. Химия и биохимия углеводов (полисахариды). М.1978.

9. Amano Т., Kawabata Н., Yochisato К. Characterisation of metamorphicchanges in anuran larval epidermis using lectins as probes // Develop. Growth. Differ. 1995. V.37. P.211 -220.

10. Ambrosio A.L., Iglesias M.M., Wolfentein-Todel C. The heparin binding lectin from ovine placenta: purification and. Identification as histon H4 // Clycoconj. J. 1997. V.14. N.7. P.831 836.

11. Azumi K., Ozeki S., Yokosawa H., Ishii S. A Novel lipopolysaccharide-binding hemagglutinin isolated from hemocytes of the solitary ascidian, Holocynthia roretzi it can agglutinate bacteria // Dev. Сотр. Immunol.1991. V.15. P.16-23.

12. Beintema J.J., Peumans W.J. The primary structure of stinging nettle (Urtica dioica) agglutinin. A two-domain member of the hevein family // FEBS Lett.1992. V.299. P. 131 134.

13. Belogortseva N.I., Molchanova V.I, Kurika A.V., Skobun A.S., GlazkovaV.E Isolation and characterization of new GalNAc/Gal-specific lectin from the sea mussel Crenomytilus grayanus I/ Сomp. Biochem. Physiol. 1998a. V.119C. N.l. P. 45 50.

14. Belogortseva N., Molchanova V., Glazunov V., Evtushenko E., Luk'yanov P., N-Acetyl-glucosamine-specific lectin from the ascidian Didemnum ternatanum /I Biochim. Biophys. Acta 1998b. V.1380. P.249 256.

15. Beutler J.A., McMahon J.B., Johnson T.R., O'keefe B.R., Buzzell R.A., Robbins D., Gardella R., Wilson J., Boyd M.R. High throughput screening for cyanovirin-N mimetics binding to HIV-1 gp41 // J. Biomol. Screen. 2002. N.7. P.105 110.

16. Bonaterra G.A., Aoki A. Isolation of a frog lectin using polylysine to reduce non-specific interactions with heparin binding ligand //Biocell. 1998. V.22. P.163 -166.

17. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V.72. P.248 -254.

18. Bretting H., Kabat E.A., Liao J., Pereira E.A. Purification Characterization of the agglutinins from the sponge Aaptos papillata and a study of their combining sites // Biochemistry, 1976. V.15. N.23. P.5029 5038.

19. Carred P. Harboe M., Oettinger Т., Koch C., Svejgaard A. Dual role mannan-binding protein in infection another case of heterocyst // Eur. J. Immunogenetics. 1994. V.21. N.2. P. 125 - 131.

20. Cavalcante C.M., Mourao A.S., Pavao S.G. Isolation and characterization of a highly sulfated heparan sulfate from ascidian test cells // Biochim. Biophys. Acta 1999. N. 1428. P.77 87.

21. Ceri H., Kobiler D, Barondes S.H. Heparin inhibitable lectin. Purification from chicken liver and embryonic chicken muscle // J. Biol. Chem. 1981. V.256. N.l. P.390 - 400.

22. Ceri H., Roberts D. Endogenous lectins in normal and dystrophic muscle development // Muscle Nerve. 1985. V.8. N.8. P.710 713.

23. Chang N.C.A., Hung S.I., Hwa K.Y., Chen J.E., Liu C.H., Chang A.C. A macrophage protein, Yml, transiently expressed during inflammation is a novel mammalian lectin // J. Biol. Chem. 2001. V.276. N.20. P.17497 17506.

24. Charan R.D., Munro M.H.G., O'keefe B.R., Sowder II R.C., McKee T.C., Currens M.J., Pannell L.K., and Boyd M.R. Isolation and Characterization of

25. Myrianthus holstii lectin, a Potent IIIV-1 inhibitory protein from the plant Myrianthus holstii // J. Nat. Prod. 2000. V.63. P.l 170 1174.

26. Chay C.H., Pienta K.J. Evidence for lectin signaling to the nuclear matrix: cellular interpretation of the glvcocode//J. Cell Biochem. 2000. V.35. P.l 23 129.

27. Corbeau P., l laran M., Binz H., Devaux C. Jacalin, a lectin with anti-HIV-1 properties, and HIV-1 gpl20 envelope protein interact with distinct regions of the CD4 molecule // Moi. Immun. 1994. V.31. P.569 575.

28. Dam Т.К., Sarkar M., Ghosh J., Choudhury A. A novel galactosyl-binding lectin from the plasma of the blood clam, Anadara granosa (L) and a study of its combining site//Mol. Cell. Biochem. 1992. V.U7. P.l 9.

29. Dam Т., Bondyopadhyay В., Sarkar M., Ghosa J., Bhattacharya A., Choudhury A. Purification and partial characterization of a heparin-binding lectin from marine clam Anadara granoza II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V.203. N.l. P.36 45.

30. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton I.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of the sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. V.28. P.350 356.

31. Eloumami H., Bladier D., Caurty J., Caron M. Soluble heparin-binding lectins from human brain: purification, specificity and relationship to an heparin binding grows factor// Int. J. Biochem. 1990. V.22. N.5. P.539 540.

32. Engel M., Bachman M., Schroder H.C., et al. A novel galactose- and arabinose-specific lectin from the sponge Pellina semitubulosa: isolation, characterization and immunobiological properties // Biochimie. 1992. V.74. P.527 -537.

33. Emsley J., White H.E., O'Hara B.P., Oliva G., Srinivasan N., Tickle I.J., Blundell Т., Pepys M.B., Wood S.P. Structure ofpentameric human serum amyloid P component//Nature. 1994. V.367(6461). P.338 345.

34. Gabius H.J. Concepts of tumor lectinology // Cancer Investig. 1997. V.15. P.454 464.

35. Gabius H.J. Probing the cons and pros of lcctin-induced immunomodulation: case studies for the mistletoe lectin and galectin-1 // Biochimie 2001. V.83. P. 659 -666.

36. Gamulin V., Rinkevich В., SchackeH., Kruse M., Muller I.M., Werner E.G. Cell adhesion receptor and nuclear receptors a highly conserved from the lowest Metazoa (Marine Sponges ) to vertebrates // Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1994. V.375. P.583 588.

37. Gilljam G. Envelope glycoproteins of HIV-1, HIV-2, and SIV purified with Galanthus nivalis agglutinin induce strong immune responses // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1993. N.9. P.431 438.

38. Gold M., Balding P. Plant and animal lectins. In: Receptor-specific proteins. Excerpta Medica. Amsterdam. 1975. P.123 130.

39. Goldstein I.J., Poretz R.D. Properties, functions and applications in Biology and Medicine. In:The lectins. Liener I.E., Sharon N., Goldstein I.J. Eds. Academic Press. Inc. Orlando. 1986. P.35.

40. Hall J.L., Rowlands D.R. Heterogeneity of lobster agglutinins specifisity of agglutinin-erythrocyte binding // J. Biochem. 1974. V.13. N.4. P.828-832.

41. Hatakeyama Т., Himeshima Т., Komatsu A., Yamasaki N. Purification and characterization of two lectins from the sea cucumber Stichopus japonicus II Biosci. Biotech. Biochem. 1993. V.57. N.10. P. 1736 1739.

42. Hatakeyama Т., Kohzaki H., Nagatomo H., Yamasaki N. Purification andл .characterization of four Ca -dependent lectins from the marine invertebrate, Cucumaria echinata И J. Biochem. 1994. V.l 16. P.209 214.

43. Holt P., Holmskov U., Thiel S., Teisner В., Hojrup P., Jevisenius J.C. Purification and characterisation of mannan-binding protein from mouse serum // Scand. J. Immun. 1984. V.39. N.2. P.202 208.

44. Horak P., Grubhoffer L., Mikes L., Ticha M. Lectins of Trichobilharzia szidati cercariae I I Parasite. 1997. V.4. N. 1. P.27 35.

45. Johson V.A., Walker B.D. HIV-infected cell fusion assay. In: Techniques in HIV research. Aldovini A., Walker B.D. eds. Stockton. New York. 1990. P.92 94.

46. Johnson V.G., Byington R.E. Quantitative assay for virus infectivity. In: Techniques in HIV research. Aldovini A., Walker B.D. eds. Stockton. New York. 1990.P.71-76.

47. Kamiya H. Possible multiple factions of the invertebrate humoral lectins // Fish pathology. 1995. V.30. N.2. P. 129 139.

48. Kamo Т., Furukawa K.S., Akazawa S., Fujsaa K., Tada-Kikuchi A., Nonaka I., Satayoshi E. Mitogenic heparin-binding lectin-like protein from cloned thymic myoid cells//Cell Immunol., 1986. V. 103. N.l. P. 183 190.

49. Kaoru H.-A., Yokosawa H.and Ichii S. // Сотр. Biochem. Physiol. 1987. V.88B. N.l. P. 375 381.

50. Kawagishi H., Yamawaki M., Isobe S., Usui Т., Kimura A., Chiba S. Two lectins from the marine sponge Halichondria okadai I I J. Biol. Chem. 1994. V.269. N.2. P.1375 1379.

51. Kitagaki H., Inda N., Matsumoto I., Seno N. Carbohydrate-binding specificity of silkworm lectin // Carbohydr. Res. 1986. V.151. P.271 278.

52. Kobelev S., Molchanova V., Belgortseva N., Luk'yanov P. Interaction of a lectin from the mussel Crenomytilus grayanus with polyvalent neoglycoconjugates // GLYCO XVI Symposium.The Hague. 2001. C26.6. P. 100.

53. Kochibe N., Matta K.L. Purification and properties of an N-acetylglucosamine specific lectin from Psathyrella velutina mushroom // J. Biol. Chem. 1989. V.264. P. 173 177.

54. Kohnke-Godt В., Gabius H.J. Heparin-binding lectin from human placenta: purification and partial molecular characterization and its relationship to basicfibroblast growtb.factors//Biochemistry. 1989. V.28. N.16. P.6531 6538.

55. Kohnke-Godt В., Gabius H.J. Heparin-binding lectin from human placenta: further characterization of ligand binding and structural properties and its relationship to histones and heparin-binding growth factors // Biochemistry. 1991. V.30. N.l. P.55 65.

56. Koppel R., Litvak M., Solomon B. Affinity purification of a mannose-binding protein, a sensitive tool in the diagnostics of IgM, via site-directed phosphorylated mannan bound to alumina // J. Chromatogr. B. 1994. V.662. P.191 196.

57. Mandal S., Mahajan R.GLactose- and heparin-inhibitable agglutinin from human fetal brain // J. Neurochem., 1990. V.54. N.l. P.288 293.

58. Matsumoto I., Kitagaki H., Iida N., Saito Y., Seno N. Mammalian kidney lectin// Carbohydr. Res., 1986. V.151. P.261 270.

59. Matsushita M. et al. Complement-related serine proteases in tunicates and vertebrates // Curr. Opin. Immunol. 1998. N.10. P.29 35.

60. Matsushita M. et al. Complement-activating complex of ficolin and mannose-binding lectin-associated serine protease // J. Immunol. 2000.'V. 164. P.2281 -2284.

61. Mebs D., Weiler I., Heinke F., Bioactive proteins from marine sponges: screening of sponge extracts for hemagglutinating, hemolytic, ichthyotoxic and lethal properties and isolation and characterization of hemagglutinins // Toxicon. 1985. N.6.R955 -962.

62. Menozzi F., Mutombo R., Renauld G., Gentiez C. Heparin- inhibitable lectin activity of the filamentous hemagglutinin adhesion of Bordetella pertussis И Infect. Immun. 1994. V.62. N.3. P.769 778.

63. Mikes L, Horak P. A protein with lectin activity in penetration glands of

64. Diplostomum pseudospathaceum cercariae // Int. J. Parasitol., 2001. V.31. N.3. P.245 252.

65. Mikheyskaya L.V., Evtushenko E.V., Ovodova R.G., Belogortseva N.I., Ovodov Yu.S. Isolation and characterization of a new P-galactose-specific lectin from the sea worm Chaetopterus variopedatus II Carbohydr. Res. 1995. V.275. N.l. P. 193 200.

66. Misra R.R., Pinsky P.F., Srivastava S. Prognostic factors for hematologic cancers // Hematol. Oncol. Clin. North Am. 2000. N.14. P.907 924.

67. Mody R., Joshi S., Chaney W. Use of lectins as diagnostic and therapeutic tools for cancer//J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 1995. V.33. P.l 10.

68. Muramoto K., and Kamiya H. The amino-acid sequence of multiple lectins of the acron barnacle Megabalanus rosa and its homology with animal lectins // Biochim. Biophys. Acta. 1990a. V.1039. P.42-51.

69. Muramoto K., and Kamiya H. The position of the disulfide bonds and the glycosylation site in a lectin of Inhibition of the growth of the acorn barnacle Megabalanus rosa И Biochim. Biophys. Acta. 1990b. V.1039. P.52-60.

70. Muramoto K., Kado R., Takei Y., Kamiya H. Seasonal changes in the multiple lectin compositions of the acorn barnacle Megabalanus rosa as related to ovarian development // Сотр. Biochem. Physiol. 1991. V.98B. P.603-607.

71. Muramoto K., Yako H., Kamiya H. Multiple lectins as major proteins in the coelomic fluid of the acorn barnacle Megabalanus rosa II Сотр. Biochem. Physiol. 1994. V.107B.P.395 399.

72. Nakagawa H., Yamaguchi C., Sakai H., Kanemaru K., Hayashi H., Araki Y., Shinomora M., Ohura K., Kitagawa H. Biochemical and physiological properties of pedicellarial lectins from the toxopneustid sea urchins // J. Nat. Tox. 1999. V.8. N.3. P. 297 308.

73. Nisizawa K., Yamaguchi Т., Handa N., Maeda M., Yamazaki H. Chemical nature of a uronic acid-contating polysaccharide in the peritrophic membrane of the silkworm // J. Biochem. 1963. V.54. P.419 426.

74. Norgaard-Pedersen В., Toftager-Larsen К., Philip J. Concanavalin A reactivity pattern of human amniotic fluid AFP examined by crossed * affinoimmunoelectrophoresis. A define test for neural tube defect // Clin. Genet.1980. V. 17. N.5. P.355 362.

75. Odintsova N.A., Belogortseva N.I., Khomenko A.V., Chikalovets I.V., Luk'yanov P. A. Effect of lectin from the ascidian on the growth and the adhesion of HeLa cells // Mol. Cell Biochem. 2001. V.221. P. 133 138.

76. Ohta M. and Kawasaki T. Complement-dependent cytotoxic activity of serum mannan-binding protein towards mammalian cells with surface-exposed high-mannose type glycans // Glycoconj. J. 1994. N.ll. P.304 308.

77. Ortega-Barria E., Boothroyd J.C. A Toxoplasma lectin-like activity specific for sulfated polysaccharides is involved in host cell infection // J. Biol. Chem. 1999. V.274.N.3. 1267- 1276.

78. Pajic I., Kljajic Z., Dogovic N., Sladic D., Juranic Z., Gasic M.J. A novel lectin from the sponge Haliclona cratera: isolation, characterization and biological activity // Сотр. Biochem. Physiol. 2002. V.132C. P.213 221.

79. Parente J.P., Wieruszeski J.M., Strecker G., Montreuil J., Fournet В., van Halbeek H., Dorland L., Vliegenthart J.F.G. A novel type of carbohydrate structure present in hen ovomucoid //J. Biol. Chem. 1982. V.257. N.22. P.l 3173 13176.

80. Pauwels R., Balzarini J., Snoeck R., Herdewijin P., Desmyter J., De Clercq E. Rapid and automated tetrazolium-based colorimetric assay for the detection of anti-HIV compounds // J. Virol. Methods. 1988 V.20 N.4. P.309-21.

81. Petitou M., Herault J.P., Bernat A., Driguez P.A., Duchaussoy P., Lormeau J.C., Herbert JM.Synthesis of thrombin-inhibiting heparin mimetics without side effects //Nature. 1999. V.398. P.417 422.

82. Punkhurst G.J., Bennet C.A., Easterbrook-Smith S.B. Characterization of the heparin-binding properties of human clusterin // Biochem. 1998. V.37. P.4823 -4830.

83. Quiocho F.A. Probing the atomic interactions between proteins and carbohydrates // Biochem-,Soc. Trans. 1993. V.21. P.442'

84. Ratanapo, S., Chulavatnatol, M. Monodin, a new sialic acid specific lectin from black tiger prawn (Penaeus monodon) I I Сотр. Biochem. Physiol. 1990. V.97. N.3. P.515 520.

85. Reed A., Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints //Amen J. Hyg. 1938. V.27. P.493 498.

86. Rini J.M. Lectin structure //Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995. V.24. P.551 -577.

87. Robertson M.M., Ceri H., Shadle P.J., Barondes S.H. Heparin inhibitable lectin: marked similarities in chicken and rat// J. Supramol. Struct. Cell Bioch. 1981. V.15.N.4. P. 395 -402.

88. Saito F., Yamada H., Sanada Y., Hori H.,Shimizu Т., Matsumara K. Characterization of a 30kDa peripheral nerve laminin and heparin // J. Biol. Chem. 1997. V. 17. P. 26708-26713.

89. Sallay I., Hatakeyama Т., Yamasaki N. Studies on the carbohydrate binding sites of the hemolytic lectin CEL-III isolated from the marine invertebrate

90. Cucumaria echinata H Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998. V.62. N.9. P.1757 -1761.

91. Sato Т., Endo Y., Matsushita M., Fujita T. Molecular characterisation of a novel serine-protease involved in activation of the complement- system by mannose-binding protein // Int. Immunology. 1994. V.6. N.4. P. 665 669.

92. Satoh F., Nakagawa H, Yamada H, Nagasaka K, Nagasaka T, Araki Y, Tomihara Y, Nozaki M, Sakuraba H, Ohshima T, Hatakeyama T, Aoyagi H.Fishing for bioactjve substances from scorpionfish and some sea urchins // J. Nat. Tox. 2002. V.11.N.4.P.297-304.

93. Schwarz F.P., Misquith S., Surolia A. Effect of substituent on the thermodynamics of D-glucopyranoside binding to concanavalin A, pea {Pisum sativum) lectin and lentil {Lens culinaris) lectin // Biochem. J. 1996. V.316. P. 123 -129.

94. Semenov A.V., Mazurov A.V., Preobrazhenskaya M.E., Ushakova N.A. Sulfated polisaccharides as inhibitors of P-selectin ligand interaction // Voprosy Meditsinskoi Khimii.1998. W28. V.144. P. 135 144.

95. Shaanan В., Lis H., Sharon N., Structure of a legume lectin with an ordered N-linked carbohydrate in complex with lactose // Science. 1991. V.254. P.862 866.

96. Sharon N., Lis H. Lectins as cell recognition molecules // Science. 1989a. V.246. P.227 234.

97. Sharon N., Lis H. Lectins. Chapman and Hall: London. 1989b. P. 127.

98. Shimizu Y., Kamiya H. Bioactive biopolymers. In: Marine Natural Products. Scheuer P. eds. Academic Press. New York. 1983 V.5. P.391 428.

99. Sinay P. Sugars slide into heparin activity //Nature. 1999. V.398. P.377 378.

100. Solis D., Feizi Т., Yuen C.T., Lawson A.M., Harrison R.A., Loweless R.W.

101. Differential recognition by conglutinin and mannan-binding protein of N-glycans presented on neoglycolipids and glycoproteins with special reference to complement glycoprotein C3 and ribonuclease В //J. Biol. Chem. 1994. V.269. P. 11555 11562.

102. Takamatsu N., Takeda Т., Kojima M., Heishi M., Muramoto K., Kamiya H., Shiba T. Acorn barnacle Megabalanus rosa lectin (BRA-3): cDNA cloning, gene structure and seasonal changes of mRNA and protein levels // Gene. 1993. V.128. P.251 -255.

103. Tan S.M., Chung M.C.M., Kon O.L., Thiel S., Lee S.H., Lu J. Improvements on the purification of mannan-binding lectin and demonstration of its Ca2+-independent association with a Cls-like serine protease // Biochem. J. 1996. V.319. P.329 332.

104. Ticha M., Cechova D., Janakova V. Saccharide-binding properties of boar AQN spermadhesins and DQH sperm surface protein // Folia Biologica 1998. V.44. P.15-21.

105. Toone E.J. Structure and energetics of protein-carbohydrate complexes // Curr. Opin. Struct. Biol. 1994. V.4. P.719 728.

106. Tsutsui S, Tasumi S, Suetake H, Suzuki Y. Lectins homologous to those of monocotyledonous plants in the skin mucus and intestine of pufferfish, Fugu rubripes. // J. Biol. Chem. 2003. V.278. N.23. P. 20882 20889.

107. Uelda H., Saitoh Т., Kojima K. And Ogawa H. Multi-Specificity of a Psathyfella velutina lectin: heparin/pectin binding occurs at a site different from the

108. N-acetylglucosamine/N-acetylneuraminic acid-specific site // J. Biochem. 1999. V.126. P.530 537.

109. Uemura K., Yokota Y., Kozusumi Y., Kawasaki T. A unique CD45 glycofonn recognized by the serum mannan-binding protein in immature thymocytes //J. Biol. Chem. 1996. V.271. 4581 4584.

110. Unlenbruck G., Pardoe G.I., Prokop O., Ishiyama I. The serological specificity of snail agglutinins. // Biochem. 1983. N.3. P. 125 139.

111. Vasta G. R. The multiple biological roles of invertebrate lectins: Their participation in nonself recognition mechanisms In: Phylogenesis of immune functions. CRC Press. Boston. 1991. P. 73 101.

112. Van Damme E.J.M., Allen A.K., Peumans W.J. Isolation and characterization of a lectin with exclusive specificity towards mannose from snowdrop (Galanthus nivalis) bulbs // FEBS Lett. 1987. V.215. P.140 144.

113. Van Damme E.J.M., Allen A.K., Peumans W.J. Related mannose-specific lectins from different species of the family Amaryllidaceae // Physiol. Plant 1988. V.73. P.52 57.

114. Vandermulen D.L., Prasad V.V.T.S., Moskal J.R. The identification of glioblastoma-associated, fucose-containing glycoproteins induced by retinoic acid // Mol. Chem. Neuropathology. 1994. V.21. N.2-3. P.311 327.

115. Walker B.D., Kowalshi M., Goh W.C. Inhibition of human immunodeficiency virus syncytium formation and virus replication by castanospermine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V.84. P.8120 8124.

116. Wang K.Y., Xu Q. Lectins and toxins // Acta Biochim. Biophys. Sinica. 2000. V.32. N.3.P.201 -205.

117. Weber P., Zimmermann D.R., Winterhalter K.H., Vaughan L. Tenascin-C Binds Heparin by Its Fibronectin Type III Domain Five //J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.4619 4623.

118. Weis W., Drickamer K. Structural basis of lectin-carbohydrate recognition // Ann. Rev. Biochem. 1996. V.65. P.441.

119. Wiseman Т., Williston S., Brandts J. F., Lin L.-N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter // Anal. Biochem. 1989. V.179. P.131.

120. Yamashita K., Kamerling J.P., Kobata A. Structural study of the carbohydrate moiety of hen ovomucoid. Occurrence of a series of pentaantennary complex-type asparagine-1 inked sugar chains // J. Biol. Chem. 1982. V.257. N.21. P.12809- 12814.

121. Yamashita K., Tachibana Y., Kobata A. The structures of the galactose-containing sugar chains of ovalbumin // J. Biol. Chem. 1978. V.253. P. 3862 -3869.