Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная и функциональная характеристика маннан-связывающего лектина морского ежа Strongylocentrotus nudus

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Структурная и функциональная характеристика маннан-связывающего лектина морского ежа Strongylocentrotus nudus"

004ь-

у!/ У" "Г

ШАМШУРИНА

Екатерина Валерьевна

Структурная и функциональная характеристика маннан-связывающего лесттша морского ежа 51гоп&>1осеп1гоШ!> пиАия

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

004616362

На правах рукописи

ШАМШУРИНА Екатерина Валерьевна

Структурная и функциональная характеристика маннан-связывающего лектина морского ежа 8а-опуу1осепО-оШ пийиз

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН

Научные руководители:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Елисейкина Марина Геннадьевна

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Булгаков Александр Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Одинцова Нэлия Адольфовна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник. Агафонова Ирина Григорьевна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН

Защита состоится "23" декабря 2010 года в 10 часов та заседании диссертационного совета Д 005.008.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН по адресу: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17.

e-mail: inmmarbio@mail.primorye.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН (690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17). Отзывы просим присылать на e-mail: mvaschenko@mail.ru

Автореферат разослан /9 ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.А. Ващенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Лектины - это обширный класс белков, обладающих общим свойством обратимо и избирательно связывать углеводы и углеводные детерминанты биополимеров без изменения их ковалентной структуры (Королев, 1984). На данный момент лектины обнаружены у организмов, находящихся на разных ступенях эволюции, начиная от наиболее примитивных форм жизни - вирусов и бактерий - до представителей высших позвоночных, что свидетельствует об эволюционной древности и универсальности механизмов, основанных на белок-углеводном распознавании. Известно, что лектины принимают участие во многих биологических процессах, таких как - оплодотворение, развитие, миграция клеток, апоптоз и т.д., а биологическая значимость лектинов определяется значимостью их лигандов - углеводов (Ni, Tizará, 1996). Важную роль играют лектины в реакциях конститутивного или врожденного иммунитета. Являясь составной частью иммунитета позвоночных, лектины осуществляют немедленную, в отличие от системы адаптивного иммунитета, реакцию на инфекцию или повреждение. Наиболее изученными лектинами, выполняющими барьерную функцию, являются лектины С-типа, и, в частности, маннан-связывающие лектины (МСЛ), относящиеся к коллектинам. Исследована структура молекулы МСЛ и установлено наличие в ней консервативного участка, ответственного за связывание с углеводами (углевод-распознающего домена) и эффекторного коллагеноподобного домена. Установлено, что МСЛ в комплексе с сериновыми протеазами участвуют в активации системы комплемента по пектиновому пути (Theal et al., 1997), активизируют фагоцитоз, выступая в роли опсонинов (Kuhlman et al., 1989).

У представителей беспозвоночных животных структура и функции МСЛ исследованы значительно меньше, чем у позвоночных, несмотря на то, что данные лектины обнаружены как у первичноротых (коралловые полипы, моллюски, ракообразные, насекомые), так и у вторичноротых животных (иглокожие, низшие хордовые - асцидии, ланцетник). Вместе с тем, МСЛ - часть древней системы защиты, составляющей основу неспецифического иммунитета беспозвоночных и послужившей предшественником сложного иммунитета позвоночных животных. Поэтому, исследование системы неспецифического иммунитета беспозвоночных, в частности МСЛ, имеет большое значение для понимания процесса формирования и становления функций этого компонента защитной системы в эволюции Metazoa. Для развития эволюционных представлений актуальны исследования, выполненные на иглокожих -примитивных, близких к предковым формам, представителях вторичноротых животных. Иглокожие являются классическим экспериментальным объектом для работ в области биологии развития и сравнительной иммунологии. Ранее у двух представителей голотурий - Cucumaria japónica и Apostichopus japonicus - были обнаружены и охарактеризованы МСЛ, гомологичные МСЛ позвоночных (Булгаков и др., 2000; Bulgakov et al., 2007). Исследована биологическая активность этих лектинов, их роль в иммунной защите. Кроме того, показано, что МСЛ A. japonicus задействованы в процессе регенерации пищеварительного тракта после его эвисцерации, что является доказательством интегративной функции иммунной системы и участия ее компонентов в процессах поддержания структурного гомеостаза организма. В серии предварительных исследований показано наличие лекгинной активности целомической жидкости морского ежа Strongylocentrotus nudus по отношению к маннанам - полисахаридам, построенным из остатков маннозы.

Цель и задачи работы. Целью работы явилось исследование структуры, физико-химических свойств, роли в защитных реакциях и эмбриогенезе нового лектина,

\

выделенного из целомической жидкости морского ежа S. nudus (MCJI-SN) - вероятного гомолога маннан-связывающих лектинов позвоночных. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить основные физико-химические свойства MCJI-SN;

2. Определить аминокислотную последовательность молекулы MCJI-SN;

3. Установить локализацию в организме морского ежа и возможные места биосинтеза MCJI-SN;

4. Исследовать роль MCJI-SN в защитных реакциях и в эмбриогенезе морского ежа S. nudus.

Научная новизна. Из целомической жидкости морского ежа S. nudus выделен и всесторонне охарактеризован новый лектин. Установлена его тонкая углеводная специфичность, определены основные физико-химические свойства и аминокислотная последовательность молекулы. На основании полученных данных лектин был отнесен к маннан-связывающим лектинам С-типа. Установлено наличие в организме морского ежа двух иммунохимически идентичных форм лектина: растворенной в целомической жидкости и связанной, входящей в состав компонентов внеклеточного матрикса. Определены вероятные источники биосинтеза MCJI-SN. Показан широкий спектр биологической активности MCJI-SN: являясь компонентом неспецифического иммунитета и выступая в роли опсонина, лектин задействован в процессе эмбрионального развития, способствуя миграции клеток первичной мезенхимы.

Личный вклад. Материал, положенный в основу диссертационной работы, в основном, получен, обработан и проанализирован автором самостоятельно. Выделение и определение свойств MCJI-SN было выполнено под руководством ст.н.с., к.х.н. A.A. Булгакова и н.с., к.б.н. И.Ю. Петровой. Установление аминокислотной последовательности лектина было проведено совместно с н.с., к.б.н. С.Н. Ковальчук. Основная часть работ по проведению иммуноцитохимических и электронно-микроскопических исследований, а также по установлению функций MCJI-SN в организме морского ежа выполнена при непосредственном участии автора.

Теоретическое и практическое значение работы. У представителя иглокожих обнаружен MCJI-SN, выполняющий защитную функцию и гомологичный MCJI позвоночных животных, что доказывает эволюционную преемственность этого компонента неспецифического иммунитета в ряду вторичноротых. Полученные данные вносят существенный вклад в теорию происхождения системы комплемента - одного из основных механизмов защиты позвоночных. Установлено участие MCJI иглокожих в процессах эмбриогенеза и показана интегративная роль этого компонента врожденного иммунитета. Практическое значение результатов работы связано с возможностью применения нового лектина, функционально и структурно охарактеризованного, обладающего уникальной углеводной специфичностью, в биомедицинских исследованиях.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на симпозиуме с международном участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Россия, Москва, 2007), на XI Международной молодежной конференция по актуальным проблемам химии и биологии (ТИБОХ ДВО РАН, МЭС, 2007), на XII Всероссийской школе конференции по актуальным проблемам химии и биологии (ТИБОХ ДВО РАН, МЭС, 2009) и на годичных конференциях ИБМ ДВО РАН (2008-2010)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 статьи в журналах из списка, рекомендованного ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 5 глав, выводов и списка литературы (167 источников, из которых 157 на английском языке). Работа изложена на 103 страницах, из них 61 машинописного текста, 24 илюстрации (2 таблицы, 14 микрофотографий, 1 электроннограмма, 7 графиков).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объект исследования. Исследования выполнены на морском еже Sírongylocentrotus nudus (Echinoidea, Regularía). Животных собирали в зал. Восток (зал. Петра Великого, Японское море) и содержали в аэрируемых аквариумах.

Биохимические методы. Для выделения MCJ1-SN использовали сочетание трех видов жидкостной хроматографии. На первом этапе применяли колоночную ионообменную хроматографию на сорбенте DEAE TSK 650М. На втором этапе -аффинную хроматографию на синтезированном нами сорбенте маннан-сефарозе, при этом в качестве лиганда использовали бактериальный a-D-маннан, (выделенный из кулыуральной жидкости Vibrio jluvialis, (штамм AQ-00010)). На последнем этапе выделения лектин-содержащий препарат дополнительно очищали с помощью гель-проникающей хроматографии. Наличие лектина в выделенных фракциях, эффективность очистки, а также изучение свойств лектина проводили с использованием реакции прямой гемагглютинации (РПГА). Дня определения углеводной специфичности лектина применяли метод ингибирования РПГА различными углеводами. Определение гомогенности препаратов лектина, его молекулярной массы и субъединичный состав молекулы определяли с помощью электрофореза в денарурирующих условиях в 15% полиакриламидном геле (Laemmli, 1970) и вестерн-блот анализа (Towbin, 1984).

Иммуиохимические методы. Для получения антисывороток к лектину проводили иммунизацию кроликов. Содержание антител к лектину и специфичность сывороток определяли методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони в модифицированном варианте (Khramkova, Abelev, 1961). Иммуноглобулиновую фракцию получали осаждением сульфатом аммония, затем ее диализовали против дистиллированной воды, центрифугировали и супернатант лиофилизовали. Для прижизненного окрашивания эмбрионов S. nudus антителами к MCJI- SN (AT(MCJI- SN)), получали конъюгат антител с FITC. К раствору AT(MCJI-SN) в ТБС (0.01 М Трис-HCl, рН 7.5 и 0.15 М NaCl), рН 8.0 (5 мг/мл) добавляли 400 мкл FITC в безводном диметилсульфоксиде (1 мг/мл) и инкубировали в течение 1 ч при 20°С в темноте при постоянном перемешивании. Затем проводили гель-фильтрацию меченых AT(MCJI-SN) на колонке (10x300 мм) с Сефадексом-025, уравновешенной ТБС. Очищенные меченые AT(MCJ]-SN) хранили при - 20°С в 50% глицерине.

Методы молекулярного клонирования и секвенирования. Выделение суммарной РНК из целомоцитов S. nudus проводили при помощи метода кислой экстракции с использованием гуанидинизотиоцианата и кислого фенола (Chomczynski et al., 1987). кДНК синтезировали с тотальной РНК с помощью SMART cDNA Amplification Kit (Clontech, США). Для амплификации фрагментов кДНК МСЛ использовали вырожденные олигонуклеотидные праймеры (Snl: 5'-GGNCATCTNGT(C/G)TCNAT(C/T)C А-3' и Sn2: 5'-

TA(A/G)TT(G/A)TTNGG(T/C)TCNCC-3"). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в течение 37 циклов при следующих условиях: 95°С - 10 с, 58°С - 25 с, 72°С - 30 с, после чего продукты реакции были клонированы и секвенированы с помощью InsT/A clonePCR Product Cloning Kit (Fermentas, Lithuania) и ABI Prism 310 Genetic Analyzer, соответственно. 3'- и 5'- концевые участки МСЛ были установлены с помощью

метода RACE с применением специфических праймеров (Sn5: 5'-AACTCTTCCACAGGTCAAAG-3' и Sn3: 5'-GATGGGACCCGTATGGACTAC-3") и адаптер- специфического праймера 5 '-GTAATACGACTCACTATAGGG CAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' (Matz et al., 1999). Профиль реакции: (95°С -10 с; 65°С - 20 с; 72°С - 1 мин) - 37 циклов. Анализ установленных последовательностей проводили с помощью веб-сайта NCBI-BLAST. Определение доменной организации белков проводили с помощью сервера SMART, множественное выравнивание аминокислотных и нуклеотидных последовательностей с помощью программы Clustal W 2.0, а вторичную структуру лектинов определяли с помощью программы PS1PRED.

Иммуноцитохимические методы. Методы прямого и непрямого иммуноцитохимического окрашивания использовали для выявления MCJI-SN в эмбрионах и тканях S. nudus. Образцы тканей и суспензию эмбрионов на разных стадиях развития фиксировали в смеси 4% параформальдегида и 0.2% глутарового альдегида на фосфатном буфере (Пар-ФБ), 1 ч при 4°С, затем материал отмывали от фиксатора, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заливали в Парапласт (Sigma, США). Срезы толщиной 3-5 мкм изготавливали на ротационном микротоме НМ-360 (Carl Zeiss, Германия), депарафинировали, промывали фосфатно-солевым буфером (ФБС), обрабатывали 0.1% раствором Тритона Х-100 на ФБС, после чего образцы отмывали ФБС и блокировали 10% раствором БСА на ФБС, содержащем 0.02 Тритона Х-100 (ФБС-Т) в течение 2 ч. Затем срезы инкубировали 24 ч в растворе AT(MCJl-SN) (0.04 мкг/мл), приготовленных на 10% растворе БСА в ФБС-Т, промывали ФБС и на 2 ч наносили раствор вторичных антител к IgG кролика (0.02 мкг/мл), конъюгированных с Alexa 488 (Sigma), приготовленных на 1% растворе БСА в ФБС-Т. Затем срезы отмывали ФБС, наносили раствор DAPI (1/4000) (Sigma), промывали ФБС и заключали в Moviol (Sigma). В качестве контроля использовали срезы, обработанные вместо первичных антител 10% раствором БСА на ФБС.

Прижизненное окрашивание эмбрионов S. nudus AT(MCJ1-SN), коньюгированными с FITC, проводили, помещая эмбрионы в среду, содержащую антитела в концентрации 0.04 мкг/мл, на 15 мин. Затем материал фиксировали 0.2% раствором глутаральдегида.

Локализацию МСЛ-SN в целомоцитах S. nudus определяли с использованием мазков клеток целомической жидкости, а также полутонких и ультратонких срезов сгустка целомоцитов. Для приготовления мазков целомическую жидкость, разбавленную стерильной морской водой в соотношении 1:1, инкубировали при температуре 12°С на предметных стеклах, предварительно обработанных поли-Ь-лизином гидробромидом (м.м. 150 - 350 кДа, Sigma). Затем жидкость удаляли, добавляли на стекло стерильную морскую воду и инкубировали осевшие целомоциты в течение 30 мин при той же температуре, после чего мазки фиксировали Пар-ФБ и проводили иммуноцитохимическое окрашивание AT(MGJI-SN) согласно приведенной ранее схеме.

Препараты анализировали с использованием эпифлуоресцентного микроскопа AXIO IMEDGER (Carl Zeiss), снабженного системой COLIBRI, и лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM 510 (Carl Zeiss).

Для получения сгустка целомоцитов целомическую жидкость отбирали в шприц, содержащий фиксатор Пар-ФБ, и центрифугировали. Образовавшийся сгусток помещали в фиксатор на 4 ч при 4°С, отмывали ФБС, обезвоживали в серии растворов этанола возрастающей концентрации и заключали в среду LR White (Sigma) по общепринятой методике (Миронов и др., 1994). Полутонкие (1 мкм) и ультратонкие срезы изготавливали на ультрамикротоме Leica UC6 (Leica, Германия). Окрашивание полутонких срезов проводили по той же схеме, что и окрашивание мазков целомоцитов.

Ультратонкие срезы для электронной иммуноцитохимии промывали ФБС, содержащем 0.1% Тритона Х-100, затем инкубировали в 10% БСА на ФБС и помещали в раствор AT(MCJI-SN) (0,02 мкг/мл), в 10% БСА на ФБС на 24 ч. После чего промывали в ФБС, содержащем 1% БСА и 0.01% Тритона Х-100, и наносили раствор вторичных антикроличьих антител (0.01 мкг/мл), коньюгированных с коллоидным золотом. Время инкубации составляло 3 ч при 21°С. Затем срезы промывали ФБС, дофиксировали 1% раствором глутарового альдегида в течение 5 мин, отмывали от фиксатора и солей дистиллированной водой, контрастировали водным раствором уранилацетата и анализировали на трансмиссионном электронном микроскопе Libra 120 (Carl Zeiss).

Определение роли MCJI-SN в защитных реакциях и эмбриогенезе. Исследование влияния MCJI-SN на фагоцитарную активность целомоцитов S. rtudus проводили в условиях in vitro. В лунки 24-луночного пластикового планшета для культивирования (ТРР, Швейцария), помещали обработанные поли-Ь-лизином стекла. Затем вносили суспензию целомоцитов (5x105 кл/мл) в растворе CMFSS, содержащем 15 мМ ЭДТА. Планшеты центрифугировали (400g, в течение 5 мин) и оставляли на 30 мин в климатической камере при 18°С. Затем клетки однократно отмывали стерильной морской водой и инкубировали в стерильной морской воде в течение 2 ч при той же температуре. В качестве пищевых моделей использовали фиксированные Пар-ФБ бактерии Yersinia pseudotuberculosis, окрашенные флуоресцентным красителем FITC (Miliukiene et al., 2007). Поверхности бактериальных клеток дополнительно обрабатывали, инкубируя их в течение 2 ч при 18°С в растворе, содержащем 0.1 мг/мл очищенного препарата MCJI-SN (первый вариант пищевой модели), а также в предварительно отцентрифугированной бесклеточной целомической жидкости морского ежа S. nudus (второй вариант пищевой модели). Контролем послужили меченные FITC бактерии с необработанной лектином поверхностью. Суспензию бактерий (2х107 клеток/мл) вносили в культуру целомоцитов и через 10,20,40 и 60 мин в культуральную среду добавляли раствор трипанового синего для гашения метки не поглощенных амебоцитами бактерий, отмывали три раза стерильной морской водой и фиксировали Пар-ФБ в течение 1 ч при 4°С. Затем культуру клеток промывали ФСБ, интенсивность флуоресценции регистрировали при помощи планшетного флуориметра DTX 880 (Bekman Coulter, США) с возбуждающим светофильтром 485 нм и поглощающим 535 нм. Дополнительно препараты анализировали с использованием лазерного конфокального сканирующего микроскопа LSM 510 (Carl Zeiss).

Для изучения роли MCJI-SN в эмбриогенезе было исследовано влияние MCJI и AT(MCJI-SN) на ранние стадии развития морского ежа S. nudus. Конечная концентрация веществ в растворе составляла 0.2, 0.05 и 0.01 мг/мл. Контролем служили эмбрионы и личинки, развивающиеся в стерильной морской воде и в стерильной морской воде, содержащей БСА. Развитие проходило при 20°С. Материал фиксировали через 5 мин (оплодотворенная яйцеклетка), 1.5 ч (два б.частомсра), 8 ч (бластула), 20 ч (средняя гаструла 1), 24 ч (поздняя гаструла 1) и 48 ч (ранний плутеус) после оплодотворения, добавляя 25% глутаровый альдегид до конечной концентрации 0.4%. Материал анализировали с использованием микроскопа Leica DM4500 (Leica).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Физико-химические свойства MCJI-SN

Из целомической жидкости морского ежа S. nudus нами выделен белок, обладающий лектинной активностью - MCJI-SN, с м.м. 32 кДа (по данным ДСН-ПААГ-электрофореза в невосстанавливающих условиях). Проведение ДСН-ПААГ-

электрофореза в восстанавливающих условиях приводит к исчезновению полосы с м.м. 32 кДа и появлению полосы 16 кДа (рис.1 А.). Для подтверждения субъединичного строения данного белка был проведен вестерн-блот анализ очищенного препарата лектина с использованием полученных к димеру лектина антител. Установлено, что антитела окрашивают две полосы - 32 кДа и 16 кДа, что свидетельствует о том, что полоса с м.м. 16 кДа соответствует субъединице молекулы в области полосы с м.м. 32 кДа (рис. 1. Б.).

(А) (Б)

1 2 12

тт 94 к Да Ш»67кДа

■МЗкДа

32кДа тт Шь 32кДа

тт ЗОкДа

• 20.1 кДа

16кДа — -144кДа — 16кДа

Рис. 1. ДСН-ПААГ-электрофорез (А) и вестерн-блот (Б) аффинно-очищенного препарата МСЛ-ЭМ: 1 - в невосстанавливающих условиях, 2 - после восстановления (3-меркаптоэтанолом.

Одной из характеристик, на основании которых строится классификация лектинов, является Са2+ -зависимость их лектинной активности (Эпсатег, 1988). Нами установлено, что МСЛ-вЫ является Са2+-зависимым лектином, а наибольшую углевод-связывающию активность он проявляет при концентрации ионов Са2+ 30 мМ (рис. 2).

300 •

250

200 2

с д. л 150 а Ь И 100

но

1 1 • 1 ' 1 1 1 1

1,5. 2,5. 5. 7,5. 10. 15. 20. Концентрация ионов Са, ммоль/л 30. 40.

Рис. 2. Зависимость активности МСЛ-ЭМ от концентрации ионов Са2+.

Исследование зависимости лектинной активности от рН среды показало, что оптимальным для данного лектина является диапазон значений рН 4.0-7.0. При рН 5.0 и ниже лектин полностью терял способность взаимодействовать с углеводными

Рис. 3. Зависимость активности МСЛ-БЫ от рН

Результаты экспериментов, в которых оценивали зависимость активности МСЛ-ЭЫ от температуры, показали, что в процессе увеличения температуры раствора активность лектина, определенная в РПГА, постепенно снижается. При температуре 4°С наблюдаются наибольшие значения геммаглютинирующей активности, тогда как

дальнейшее нагревание раствора приводит к ее снижению. Причем при нагревании раствора лектина до температуры 60°С наблюдается его полная тепловая денатурация.

Для определения углеводной специфичности MCJI-SN была изучена способность ряда моно-, олиго- и полисахаридов ингибировать взаимодействие данного лектина с углеводными детерминантами трипсинизированных эритроцитов 0-й группы крови человека. В результате проведенных экспериментов удалось установить, что вызванная данным лектином гемагглютинация не отменяется большинством использованных нами в экспериментах моно-, олиго- и полисахаридов. Вместе с тем, MCJI-SN взаимодействует с разветвленными маннанами, выделенными из культуральной жидкости морских гапофильных бактерий: Vibrio Jluvialis (штамм AQ-0002B и AQ-00010А), Alteromonas atlanticus и Pseudoalteromonas atlantica (штамм IAM 14175). Данные маннаны представляют собой гомополисахариды, состоящие из al—>2 и al—>6 связанных остатков D-маннозы и отличаются степенью разветвленное™ и длиной боковых цепей.

Таким образом, лектин, выделенный нами из целомической жидкости морского ежа S. nudus, является лектином С-типа, а установленная углеводная специфичность позволяет отнести его к маннан-связывающим пектинам. Молекулярная масса молекулы MCJI-SN, а также ее димерная организация из двух идентичных субъединиц, соединенных дисульфидными связями, демонстрируют сходство этого лектина с MCJI, обнаруженными у других представителей беспозвоночных - кораллового полипа Acrohora millehora, (Kvennefors et al., 2008), двустворчатого моллюска Codakia orbicularis (Gourdine, Smith-Ravin, 2007) и голотурий - дальневосточного трепанга A. japonicus (Bulgakov et al., 2007) и японской кукумарии С. japonica (Булгаков и др., 2000). У представителей позвоночных животных, молекулярная масса субъединицы выше и составляет 25-67 кДа (Colley et al., 1988; Sekine et al., 2001; Takahashi et al., 2006). Отмеченные различия, вероятно, можно объяснить появлением в составе молекулы МСЛ позвоночных дополнительных доменов, отсутствующих в составе молекулы MCJI-SN. Основные физико-химические свойства MCJI-SN, такие как Са2+-, рН- и температурная зависимость, а также углеводная специфичность доказывают сходство данного лектина с MCJI-CJ японской кукумарии (Булгаков и др., 2000) и MCJI-AJ дальневосточного трепанга (Bulgakov et al., 2007) и, кроме того, позволяют рассматривать MCJI-SN в качестве гомолога MCJI позвоночных.

2. Аминокислотная последовательность и предсказанная пространственная структура молекулы MCJI-SN

Данные об аминокислотной последовательности белков позволяют судить о структурных особенностях молекулы лектина - в частности, о пространственной организации участков, ответственных за взаимодействие с углеводами, что позволяет отнести его к определенной группе углевод-распознающих белков, а также установить степень его гомологии с лектинами других групп животных. На основании этих данных построена принятая в настоящее время классификация зоолектинов (Zelensky, Gready, 2005).

В результате клонирования кДНК, выделенной из целомоцитов S. nudus, установлено наличие трех изоформ MCJI-SN, обладающих высокой степенью гомологии/идентичности по отношению друг к другу. Учитывая, что отличия в нуклеотидных последовательностях были точечными, можно предположить, что изоформы белка образовались путем дупликации одного гена с последующими мутациями по отдельным парам нуклеотидов. Подобное явление отмечено в литературе. Так, для геномов мыши и крысы характерно наличие двух генов, расположенных на

разных хромосомах, кодирующих две изоформы MCJI: MCJ1-A и МСЛ-С (White et al., 1994).

Анализ аминокислотных последовательностей показал, что, подобно MCJI-AJ, молекула МСЛ-SN в своем составе содержит только углевод-распознающий домен С-типа и не имеет коллагеноподобного домена. Отсутствие коллагеноподобного домена характерно для всех известных МСЛ беспозвоночных и низших хордовых, и только начиная с круглоротых, этот домен появляется в составе молекулы. Появление эффекторного коллагеноподобного домена, вероятно, связано с возникновением в процессе эволюции системы комплимента как взаимосвязанного каскада реакций, приводящего к формированию лизирующего комплекса.

Вторичную структуру молекулы МСЛ-SN определяли с помощью программы PSIPRED. Установлено, что данный лектин является ß-структурированным белком, что характерно для лектинов С-типа (Zelensky, Gready, 2005), и состоит из 8 ß-тяжей и двух а-спиралей. Углевод-распознающий домен, исходя из предсказанной вторичной структуры, имеет строение, сходное с таковыми у МСЛ-AJ и MCJI-CJ, а также у МСЛ позвоночных. В его состав входят последовательности "EPN" и "WND", характерные для всех МСЛ и определяющие возможность его взаимодействия с манноз-содержащими углеводами и ионами Са2+ (Weis et al., 1992).

Сравнение первичной структуры МСЛ-SN с другими маннан-связывающими лектинами показало, что они имеют высокую степень гомологии к лектинам S. purpuratus (более 70%, GenBank ХМ_001191913 и ХМ_001175970) и пятнистого палтуса Verasper variegates (50%, GenBank АВ274523, АВ220916, АВ274524). Гомология с маннан-связывающими лектинами иглокожих - голотурий A. japonicus (GenBank ААТ42221) и С. echinata (GenBank ААВ35250) - оказалась значительно ниже и составила около 36% (рис. 4).

Стоит отметить, что низкая степень сходства по аминокислотным последовательностям всей молекулы не является препятствием к тому, чтобы рассматривать данные белки как близкородственные и гомологичные. Например, степень гомологии между МСЛ человека (сывороточная форма) и МСЛ крысы составляет не более 50% (Colley et al., 1988). Вместе с тем, для МСЛ всех групп животных характерно наличие высококонсервативного углевод-распознающего домена и последовательностей "EPN" и "WND" в составе его молекулы. Так, замена хотя бы одной аминокислоты в составе "EPN" приводит к изменению углеводной специфичности белка. В частности, с использованием метода направленного мутагенеза показано, что мутации в "EPN" мотиве углевод-распознающего домена МСЛ приводят к изменению углеводной специфичности белка и появлению сродства к галактозе (Drickamer, 1992; lobst, Drickamer, 1994).

В составе МСЛ-SN содержатся пять цистеиновых остатков, Cys1, Cys35, Cys111 Cys132 и Cys140, наличие которых характерно для всех известных МСЛ беспозвоночных (Hatakeyama et al. 1995; Bulgakov et al., 2007; Gourdine, Smith-Ravin, 2007). Согласно данным ДСН-ПААГ электрофореза, лектин, выделенный нами из целомической жидкости S. nudus, присутствует в организме морского ежа в виде димеров. В создании димерной структуры, вероятно, задействован остаток цистеина Cys1, находящийся на N-конце молекулы. Так, согласно литературным данным, Cys1 участвует в образовании межмолекулярных дисульфидных связей лектина CEL-IV, выделенного из целомической жидкости С. echinata (Hatakeyama et al., 1995).

CEL-IV

МСЛ-AJ

МСЛ-SN

SL-Sp

Coll-Sp

WL-1

Human_MCJI-A Rat_MCJT-A

CEL-IV

МСЛ-AJ

МСЛ-SN

SL-Sp

Coll-Sp

WL-1

Human_MCJI-A Rat_MCII-A

CEL-IV

МСЛ-AJ

МСЛ-SN

SL-Sp

Coll-Sp

WL-1

Human_MCJI-A Rat МСЛ-А

------CLT--SCPPLWTGFNGKCFRLFHNHLNFDNAENACRQFGLASCSGDELATGHLA 52

------CLT--ACPEFWTGFDGKCYRLFHDHLTFTEAEHACRAFKLRSCNGNDLATGHLA 52

------CLSEGCCPERFMQVGDRCYYYNSDRVDWHDARNACNRLG-----------AHLV 4 3

------CLSQGCCPDRFMKVGNRCYYYNSDKVDWHDARHACERLG-----------AHLV 43

------CLAKGCCPEKFMQVGDRCYHFSSYKKTWSDANRECEDLG-----------AHLV 43

------QLQRGNCPMFWFSFNNRCYKYVATQMNWADAELNCVSEG-----------ANLV 43

------------TFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQ-----------ASVA 37

LKSKLELTNKLHAFSMGKKSGKKFFVTNHERMPFSKVKALCSELR-----------GTVA 4 9

SIHSAESQAFLTELVKTSLPDLITG—GWAPQVYIGMKVGSTNSDQTWTDGSSVDYDGWV 110 SIHSSEEQQFLIKLVKQSLPSLINSPSNWDPQVLLGLKVGTTNSDQTWTDGSDVDYTAWF 112

SIHNWDDSREVFDLWKSLADESHTN----DRTYWIGLHDLQTENFFQWSDGTRMDYSLWY 99

SIHNAEDSREVYDLWKSLIDESFLVG—GQRTYWIGLHDVQNENFFEWSDGTPMDYSMWC 101 SFHSSAESEDVYDLWKSFTDVSYADD—GNRAYWIGLNDREYEGSFKWSDGTSVDYYHWQ 101

SIHSLDEENFVKDLIKSTDQT--------EGRTWIGLIDIHKEGSWMWSDGSAVNFTFWL 95

TPRNAAENGAIQNLIK--------------EEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWN 8 3

IPRNAEENKAIQEVAK--------------TSAFLGITDEVTEGQFMYVTGGRLTYSNWK 95

SGEPNNGPNSRGAIAAGDYSRG--SGEPNNLPDSRAAIAAGSHSQG-PGEPNNAE-GEDCVAPYNHGSNDFDRQK] SGEPNNSG-GEDCVSPLSRGSNDFDRQK] SGEPNNDR-GEDCVSPRNYGSSDYDRQKJ

SGEPNNKPPKEDCVHN—NFRTD---KM

EGEPNNAGSDEDCVLLLKNG-------q

KDEPNDHGSGEDCVTIVDNG-

-FWADVYSNNNFKYICQLPCVHYTLE 157 -NWADVFASSSLKYLCMLPCIEYHLE 159

ÍHGCELRKPYFCRRSA------144

IFDCGTRKPYFCRRSATS---- 148

gYDCDENKSFFCYKPFTS---- 148

EYCSVLIPSVCVSRKICPQ-- 140

■VPCSTSHLAVCE---------119

JlSCQASHTAVCE---------131

Рис. 4. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей маннан-связывающих лектинов из Strongylocentrotus nudus (МСЛ-SN); Strongylocentrotus purpuratus (SL-Sp - serum lectin, GenBank XM_001191913 и Coll-Sp - коллектин подсемейства 12, GenBank XM_001175970), Apostichopus japonicus (МСЛ-AJ, GenBank AAT42221), Cucumaria echinata (CEL-IV, GenBank AB35250), Verasper variegates (VVL-1, AB220916), Homo sapiens (Нитап_МСЛ-А, GenBank AAH69338) и Rattus norvegicus МСЛ-А (Rat_MBL-A, GenBank PI9999). Идентичные и гомологичные аминокислотные остатки отмечены серым цветом, EPN мотив, ответственный за сязывание с углеводами и ионами кальция Са2~ - желтым, WND мотив, ответственный за связывания с ионами Са2+ - зеленым.

3. Локализация МСЛ-SN в органах и тканях S. nudus

Методом иммуноцитохимии с использованием AT(MGJI-SN) показано, что этот лектин присутствует в организме невооруженного морского ежа в двух формах: растворенной и связанной (Шамшурина и др., 2010). Растворенная форма лектина входит в состав целомической и гемальной жидкостей. Связанная форма лектина обнаружена в зоне базальных мембран кишечного эпителия и эпителия, выстилающего полость амбулакральных каналов, в составе соединительно-тканной составляющей оболочки гонады и в цитоплазме ооцитов (рис. 5). Кроме того, антитела маркируют содержимое секреторных гранул морулоподобных целомоцитов (рис. 6), очевидно, являющихся местом биосинтеза лектина в организме S. nudus.

Как известно, морулоподобные клетки иглокожих осуществляют синтез компонентов целомической жидкости и основного вещества соединительной ткани (Byrne, 1896; Chía, Hing, 1994; Елисейкина, Магарламов, 2002; Магарламов, 2004). На основании данных ультраструктурных исследований среди морулоподобных целомоцитов морского ежа 5. nudus выделены два основных типа клеток: 1 тип - с

гетерогенными гранулами, имеющими электронно-плотное ядро и рыхлую фибриллярную оболочку; 2 тип - с секреторными вакуолями, заполненными рыхлым фибриллярным содержимым (рис. 7. А, Б). Совокупность данных, полученных в результате иммуноцитохимического окрашивания мазков клеток целомической жидкости, гистологических и ультратонких срезов сгустка целомоцитов, позволяет утверждать, что синтез МСЛ-SN в организме S. audits осуществляют морулоподобные цсломоциты 2 типа (рис. 7. В). Лектин входит в состав их секрета, выделяясь по голокриновому типу в целомическую жидкость. Благодаря сети гемальных лакун он доставляется в соединительную ткань и в эпителии различных органов морского ежа.

Наличие МСЛ-SN в составе структур базальных мембран выстилающего эпителия кишечника и амбулакральной системы может обеспечивать избирательную проницаемость этих мембран для углеводсодержащих биополимеров и способствовать предотвращению проникновения чужеродных частиц в полость организма. Так, для мембранно-связанной формы МСЛ человека установлена его способность осуществлять клиренс «дефектных» гликопротеинов из кровеносного русла (Ashwell, Harford, 1982; Drickamer, 1988). Присутствие МСЛ-SN в составе компонентов соединительной ткани оболочки гонад также может способствовать осуществлению избирательной проницаемости.

4. Участие MCJI-SN в защитных реакциях

Хорошо известна роль МСЛ млекопитающих в процессах фагоцитоза (Neth et al., 2002; Bonar et al. 2005; Jack et al., 2005; Ono et al., 2006; Shiratsuchi et al., 2008). Установленная нами на основании физико-химических свойств и структуры молекулы гомология МСЛ-SN и МСЛ позвоночных предполагает функциональное сходство этих лектинов. Для подтверждения этого предположения, была исследована роль МСЛ-SN в процессах фагоцитоза целомоцитами S. nudus различных пищевых моделей. В экспериментах была использована временная культура амебоцитов -клеток целомической жидкости, ответственных за фагоцитоз. В качестве пищевых моделей применяли FITC-меченные бактерии У. pseudotuberculosis, поверхность которых дополнительно обрабатывали препаратом МСЛ-SN и бесклеточной целомической жидкостью S. nudus. Бактерии с не обработанной дополнительно поверхностью были использованы в качестве контроля. Показано, что обработка бактерий препаратами МСЛ-SN способствует увеличению фагоцитарной активности целомоцитов, причем данный эффект наблюдается уже на первых этапах эксперимента (рис. 8). Обработка К pseudotuberculosis бесклеточной целомической жидкостью оказывает большее воздействие на фагоциты, чем чистый препарат МСЛ-SN, что можно объяснить наличием в целомической жидкости, наряду с пектинами, других факторов, активирующих процессы фагоцитоза. Согласно данным литературы, механизм участия МСЛ млекопитающих в активации фагоцитоза связан с их опсонизирующим действием, при этом углевод-распознающий домен лектина взаимодействует с углеводными детерминантами поверхности патогенных микроорганизмов и грибов, а поверхностные рецепторы макрофагов Clq распознают функциональные коллагенноподобные домены МСЛ, активизируя процессы опсофагоцитоза (Kuheman et al., 1989). Для лектинов иглокожих было показано, что МСЛ-AJ способствует агглютинации бактерий У. pseudotuberculosis, существенно ускоряя процессы их поглощения целомоцитами (Eliseikina et al., 2004). Одновременно ускоряются процессы адгезии бактериальных клеток к поверхности

Рис. 5. Иммунноцитохимическое окрашивание МСЛ в тканях Strongylocentrotus nudus AT (МСЛ) (красная флуоресценция) и ядерной ДНК DAPI (синяя флуоресценция). (А) -кишечник, (Б) - амбулакральный канал, (В) - яичник, (Г) - семенник. Масштаб - 10 мкм. Условные обозначения: ас - полость амбулакрального канала, Ът - базальная мембрана, се - ядра клеток целомического эпителия, ctm - соединительно-тканная составляющая оболочки гонад, gl- гемальная лакуна, тс - морулоподобная клетка, о - ооцит, ie - ядра клеток кишечного эпителия, U - полость кишки. Фотографии получены с использованием лазерного конфокального сканирующего микроскопа LSM 510 (Carl Zeiss).

Рис. 6. Иммуноцитохимическое окрашивание мазков целомоцитов морского ежа Strongylocentrotus nudus AT (MCJT-SN) (красная флуоресценция) и ядерной ДНК DAP1 (синяя флуоресценция). Масштаб - 10 мкм. Стрелками обозначены морулоподобные целомоциты. Фотографии получены с использованием лазерного конфокального сканирующего микроскопа LSM 510 (Carl Zeiss).

Рис. 7. Морулоподобные целомоциты морского ежа Strongylocentrotus nudus. (А) -клетки 1 типа; (Б) - клетки 2 типа; (В) - выявление MCJI-SN в составе секрета морулоподобных целомоцитов 2 типа с помощью AT (MCJI-SN), вторичные антитела мечены коллоидным золотом с размером частиц 10 нм. Масштаб 2 мкм. Фотографии получены с использованием трансмиссионного электронного микроскопа Libra 120 (Carl Zeiss).

СЭ Контроль

сэцж

а мел

Время инкубации. мин

Рис. 8. Фагоцитарная активность временной кулыуры целомоцитов Strongylocentrotus nudus, оцениваемая по изменению интенсивности флуоресценции в ходе фагоцитоза амебоцитами бактерий Yersinia pseudotuberculosis, меченных FITC (контроль), и меченных FITC бактерий Y. pseudotuberculosis, с дополнительно обработанной МСЛ-SN и бесклеточной целомической жидкостью поверхностью (варианты опыта).

фагоцитов, что указывает на опсонизирующий эффект МСЛ-AJ. Сходный механизм, очевидно, лежит и в основе активизации фагоцитоза МСЛ-SN. Можно предположить наличие на поверхности амебоцитов рецепторов к МСЛ-SN, которые задействованы в активации клеточных защитных реакций, однако, взаимодействие лектина с рецептором происходит с участием иных, отличных от молекул МСЛ позвоночных, структур, что связано с отсутствием в составе лектина морского ежа S. nudus молекулы коллагеноподобного домена.

5. Влияние МСЛ-SN на ранний онтогенез морского ежа S. nudus.

Методами ДСН-ПААГ-электрофореза и вестерн-блоттинга показано, что МСЛ-SN присутствует в цитоплазме неоплодотворенных яйцеклеток, в развивающихся эмбрионах и личинках (рис. 9). Наличие МСЛ-SN в яйцеклетках, эмбрионах и личинках морского ежа предполагает его возможное участие в процессах оплодотворения и эмбриогенеза.

Для исследования роли МСЛ-SN и его лигандов в раннем развитии S. nudus проведена серия экспериментов с блокировкой МСЛ-SN специфическими антителами, а также с блокировкой лектином его эндогенных лигандов. В качестве положительного контроля использовали вариант развития эмбрионов в среде, содержащей БСА, а в качестве отрицательного контроля использовали развитие в стерильной морской воде.

Показано, что МСЛ-ЭЫ и его лиганды не задействованы в процессах оплодотворения и не являются компонентом углевод-распознающих центров, осуществляющих процесс адгезии сперматозоида и яйцеклетки у данного вида.

Начиная со стадии средней бластулы 1, в среде, содержащей антитела к МСЛ-БЫ и МСЛ-БН большое количество эмбрионов формируется с задержкой в развитии, причем, по мере увеличения времени инкубации в этой среде, отставание в развитии

31 я П а г А е

*3ийа

II V — ш 1 -

1 X

«•«я

— 64 Ли

азий* ж««*

20.* Фа

1 2

Рис. 9. ДСН-ПААГ-электрофорез (1) и вестерн-блот (2) яйцеклеток, эмбрионов и личинок &гои§>>/осеяй"ой« а - неоплодотворенная яйцеклетка, б -

оплодотворенная яйцеклетка, в - два бластомера, г - бластула, д - поздняя гаструла, е -плутеус. 51 - стандарты молекулярных масс.

становится все более значительным (рис. 10). У эмбрионов в среде, содержащей высокие концентрации веществ (2 мг/мл), блокирующих лектин или его лиганд, полностью прекращается процесс гаструляции.

Известно, что морфогенетические движения, такие как миграция мезенхимных клеток и гаструляция, регулируются взаимодействиями "клетка - клетка" и "клетка -субстрат", которые опосредованы различными углеводными детерминантами и адгезионными молекулами клеток, в том числе и лектинами (ОгеЫ е1 а1., 1995). Исходя из этого, можно предположить, что МСЛ-Э^^ являются структурами, воспринимающими информацию, заложенную в углеводных маркерах делящихся клеток. Этим объясняется торможение процессов дробления при блокировании МСЛ-БК поликлональными антителами. Практически полное торможение гаструляции также является следствием нарушения взаимодействий клеток между собой и с субстратом, в результате чего изменяется не только характер миграции клеток первичной мезенхимы, но и нарушается процесс инвагинации.

С использованием прижизненного окрашивания гаструл морского ежа 51 пиЛт антителами к МСЛ-вЫ установлено, что лектин локализуется на поверхности клеток, выселяющихся в бластоцель (рис. 11). Кроме того, иммуноцитохомическое окрашивание срезов эмбрионов показало, что, помимо поверхностных структур мигрирующих клеток, МСЛ-БИ входит в состав фибриллярного матрикса, образующего сетчатую структуру в полости эмбриона (рис. 12). Очевидно, лиганды МСЛ-БЫ, маннан-содержащие поверхностные гликопротеины, образуют скопления (кластеры) на участках поверхности мигрирующих клеток.

Как известно, огромная роль в процессе формирования личинки морского ежа принадлежит структурам внеклеточного матрикса. Имеется большое количество фактических данных об участии содержащихся в нем белков не только в миграции отдельных клеточных типов и их адгезии, но и в передаче сигналов в цитоплазму клеток. Эти сигналы обеспечивают дальнейшую миграцию, пролиферацию и дифференцировку клеток (Spiegel et al„ 1980; McCarthy, et al. 1987; Bisgrove, Raff, 1993; Katow, 1995; Wessel, 1998; Katow, Washio, 2000; Yamasu et al., 2000; Katow, Sofuku, 2001). Возможно, благодаря наличию сетчатой структуры в бластоцеле, в состав которой входи MCJ1-SN, происходит активация и миграция клеток вторичной мезенхимы. На более поздних этапах формирования архентерона сетчатая структура может выполнять функцию направляющих "балок", обеспечивая строго детерминированную миграцию клеток.

Мор. вода

AT{MO]-SN)

I средняя гаструла 1 I ранняя гаструла 2

□ средняя гаструла 2

□ ранняя гаструла 1 _

Мор. вода

БСА AT(MCJI-SN) МСЛ

I поздняя гаструла I средняя гаструла 1

□ средняя гаструла 2

Рис. 10. Влияние поликлональных антител к MCЛ-SN (0.05 мг/мл) и МСЛ-8Ы (0.05 мг/мл) на развитие личинок 5п-оп%у1осеЫгоХи$ пийи^. (А) - средняя гаструла, (Б) -поздняя гаструла, (В) - плутеус. По оси ординат - доля личинок, %.

w РВИ I \

/

Рис. 11. Локализация МСЛ-SN (стрелки) в гаструлах морского ежа Strongylocentrotus nudus. Прижизненная окраска AT (МСЛ-SN), конъюгированными с FITC. Масштаб 20 мкм. Фотографии получены с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Leica 4500 (Leica).

Рис. 12. Иммуноцитохимическое окрашивание срезов личинок морского ежа Strongylocentrotus nudus AT (MCJT-SN) (красная и зеленая флуоресценция) и ядерной ДНК DAPI (синяя флуоресценция), стадия гаструлы. Стрелками указаны флуоресцентно-меченные сайты связывания антител. Условные обозначения: ет -внеклеточный матрикс, es - клетки первичной мезенхимы. Масштаб 50 мкм. Фотографии получены с использованием эпифлуоресцентных микроскопов АХЮ IMEDGER, оснащенного системой COLIBRI (Carl Zeiss) (А) и Leica 4500 (Leica) (Б).

ВЫВОДЫ

1. Из целомической жидкости морского ежа 81гоп^1осеМгоЧи пис/т выделен новый белок, обладающий лектинной активностью. На основании установленных физико-химических свойств (способность образовывать гомодимеры, Са2+- зависимость, углеводная специфичность к разветвленным а-Э-маннанам) лектин отнесен к группе маннан-связывающих лектинов С-типа.

2. Определена аминокислотная последовательность маннан-связывающего лектина 5. пиАя и установлено, что молекула лектина состоит только из углевод- распознающего домена, включающего 2 а-спиральных участка и 8 Р-тяжей. Лектин представлен в организме 5. пис1ш как минимум тремя высокогомологичными изоформами, различающимися единичными аминокислотными заменами. Степень гомологии маннан-связывающего лектина 51. пи(1ш и МСЛ других групп животных высока в участке, отвечающем за связывание с лигандом и ионами Са2+ ("ЕРЬ!" и "ХУМЭ" мотивы), консервативным является и положение остатков цистеина.

3. Маннан-связывающий лектин присутствует в организме £ пис/ш в двух формах: растворенной в целомической жидкости и в связанной, ассоциированной со структурами соединительнотканного внеклеточного матрикса. Биосинтез лектина осуществляют клетки целомической жидкости - морулоподобные цсломоциты 2 типа.

4. Маннан-связывающий лектин 5. пи&к задействован в осуществлении защитных реакций. Он способствует агглютинации и опсонизации чужеродных частиц, активизируя процессы их фагоцитоза клетками целомической жидкости.

5. Маннан-связывающий лектин обнаружен в цитоплазме яйцеклеток, в эмбрионах (зигота, два бластомера) и личинках на стадиях плавающей бластулы, поздней гаструлы и плутеуса морского ежа 5. пи<к&. Показано, что лектин не влияет на процессы оплодотворения, а механизм его участия в эмбриогенезе связан с осуществлением миграции клеток в ходе гаструляции: являясь компонентом внеклеточного матрикса, заполняющего бластоцель, лектин взаимодействует с лигандами - углеводными составляющими поверхностных рецепторов эмбриональных клеток, обеспечивая их направленную миграцию.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в рецензируемых журналах из списка рекомендованного ВАК:

1. Петрова И.Ю., Булгаков A.A., Назаренко Е.Л., Шамшурина Е.В., Кобелев С.С., Елисейкина М.Г. Маннан-связывающие лектины в целомичеекой жидкости у представителей разных видов дальневосточных иглокожих // Биол. моря. 2009. Т. 35, № 2. С. 147-152.

2. Шамшурина Е.В., Елисейкина М.Г., Петрова И.Ю., Булгаков A.A. Обнаружение двух иммунохимически идентичных форм маннан-связывающих лектинов морского ежа Strongylocentrotus nudus // Биол. моря. 2010. Т. 36, №4. С. 293-299.

Публикации в материалах конференций:

1. Шамшурина Е.В. Исследование защитных реакций целомоцитов иглокожих в условиях временной культуры // Конференция студентов, аспирантов и молодых ученых НОЦ ДВГУ "Морская биота". сборник трудов. Владивосток: ДВГУ, 2006. С. 12-14.

2. Шамшурина Е.В., Елисейкина М.Г., Петрова И.Ю., Булгаков A.A. Маннан-связывающие лектины морского ежа Strongylocentrotus nudus и их роль в эмбриогенезе // XI Международная молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток 11-18 сентября 2007: сборник трудов. Владивосток: ДВО РАН, 2007. С. 43.

3. Елисейкина М.Г., Булгаков A.A., Петрова И.Ю., Шамшурина Е.В., Ламаш Н.Е. Маннан-связывающие лектины иглокожих и их роль в морфогенезах // Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза. Симпозиум с международным участием, Москва, 9-11 октября 2007 г. М: Т-во научных изданий КМК, 2007. С. 58-59.

4. Шамшурина Е.В., Ковальчук С.Н., Елисейкина М.Г, Булгаков A.A. Определение первичной аминокислотной последовательности маннан-связывающих лектинов морского ежа Strongylocentrotus nudus // XII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток 7-14 сентября 2009 г.: сборник трудов. Владивосток: ДВО РАН, 2009. С. 82.

ШАМШУРИНА Екатерина Валерьевна

СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МАННАН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЛЕКТИНА МОРСКОГО ЕЖА STRONGYLOCENTROTUS NUDUS

АВТОРЕФЕРАТ

Подписан в печать 16.11.2010 Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1,39 Уч.-изд. л. 1,29 Тираж 100 Заказ 533 Типография ДВГТУ. 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шамшурина, Екатерина Валерьевна

1. ВВЕДЕНИЕ.:.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2. 1. Классификация зоолектинов.

2.2. Функции лектинов.

2.3. Участие лектинов в процессах морфогенеза.

2. 4. Маннан-связывающие лектины.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материал.

3.2. Приготовление цел омической жидкости.

3. 3. Реакция прямой гемагглютинации (РПГА).

3. 4. Ингибирование РПГА.

3. 5. Определение зависимости активности МСЛ-БМ от температуры.

3. 6. Определение зависимости активности МСЛ-БК от рН.

3. 7. Определение зависимости активности МСЛ-8Ы от концентрации ионов Са2+ вереде.

3. 8. Выделение МСЛ-БИ.

3. 8. 1. Ионообменная хроматография.

3. 8. 2. Аффинная хроматография.

3. 8. 3. Гельфильтрация.

3. 9. Получение антисыворотки и АТ(МСЛ-81чГ).

3. 10. Получение конъюгатов АТ(МСЛ-8М) с Б1ТС.

3. 11. ДСН-ПААГ-электрофорез.

3. 12. Вестерн-блот анализ МСЛ-БЫ.

3.13. Установление первичной структуры МСЛ-8К.

3. 13. 1. Выделение РНК и синтез кДНК.

3. 13.2. Клонирование и секвенирование кДНК.

3. 14. Иммуноцитохимическое выявление МСЛ-БЫ в личинках и тканях 51. пис1ш.

3. 14. 1. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание срезов тканей

S. nudus.

3. 14. 2. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание мазков целомоцитов S. nudus.

3. 14. 3. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание полутонких и ультратонких срезов.

3. 14. 4. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание гистологических срезов и прижизненное прямое иммунофлуоресцентное окрашивание эмбрионов и личинок S. nudus.

3. 15. Исследование влияния MCJI-SN на фагоцитарную активность целомоцитов S. nudus в условиях in vitro.

3.16. Исследование влияния MCJI-SN на ранний онтогенез морского ежа S. nudus.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4. 1. Выделение MCJI-SN из целомической жидкости S. nudus.

4.2. Определение молекулярной массы и субъединичного состава

MCJI-SN.

4. 3. Углеводная специфичность MCJI-SN.

4. 4. Зависимость активности MCJI-SN от концентрации ионов Са , рН и температуры.

4. 5. Установление первичной структуры MCJI-SN.

4. 6. Локализация МСЛ-SN в тканях S. nudus.

4. 7. Влияние МСЛ-SN на фагоцитарную активность целомоцитов S.nudus in vitro.

4. 8. Электрофоретическое выявление МСЛ-SN в эмбрионах и личинках

5. nudus.

4. 9. Локализация МСЛ-SN в личинках S. nudus.

4. 10. Влияние МСЛ-SN и его лигандов на ранний онтогенез морского ежа

5. nudus.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

5. 1. Физико-химические свойства МСЛ-БЫ.

5. 2. Аминокислотная последовательность и предсказанная пространственная структура молекулы МСЛ-8М.

5.3. Локализация МСЛ-8К в органах и тканях 5. пис1ш.

5. 4. Участие МСЛ-БЫ в защитных реакциях.

5. 5. Участие МСЛ-81ЧГ в раннем онтогенезе & писких.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурная и функциональная характеристика маннан-связывающего лектина морского ежа Strongylocentrotus nudus"

Лектины — это обширный класс белков, обладающих общим свойством обратимо и избирательно связывать углеводы и углеводные детерминанты биополимеров без изменения их ковалентной структуры (Королев, 1984). На данный момент лектины обнаружены у организмов, находящихся на разных ступенях эволюции, начиная от наиболее примитивных форм жизни -вирусов и бактерий — до представителей высших позвоночных, что свидетельствует об эволюционной древности и универсальности механизмов, основанных на белок-углеводном распознавании. Известно, что лектины принимают участие во многих биологических процессах, таких как — оплодотворение, развитие, миграция клеток, апоптоз и т.д., а биологическая значимость лектинов определяется значимостью их лигандов - углеводов (N1, Т1гагс1, 1996). Важную роль играют лектины в реакциях конститутивного или врожденного иммунитета. Являясь составной частью иммунитета позвоночных, лектины осуществляют немедленную, в отличие от системы адаптивного иммунитета, реакцию на инфекцию или повреждение. Наиболее изученными лектинами, выполняющими барьерную функцию, являются лектины С-типа, и, в частности, маннан-связывающие лектины (МСЛ), относящиеся к коллектинам. Исследована структура молекулы МСЛ и установлено наличие в ней консервативного участка, ответственного за связывание с углеводами (углевод-распознающего домена) и эффекторного коллагеноподобного домена. Установлено, что МСЛ в комплексе с сериновыми протеазами участвуют в активации системы комплемента по лектиновому пути (ТЬеа1 а1., 1997), активизируют фагоцитоз, выступая в роли опсонинов (КиЫтап е1 а1., 1989).

У представителей беспозвоночных животных структура и функции МСЛ исследованы значительно меньше, чем у позвоночных, несмотря на то, что данные лектины обнаружены как у первичноротых (коралловые полипы, моллюски, ракообразные, насекомые), так и у вторичноротых животных (иглокожие, низшие хордовые - асцидии, ланцетник). Вместе с тем, МСЛ

часть древней системы защиты, составляющей основу неспецифического иммунитета беспозвоночных и послужившей предшественником сложного иммунитета позвоночных животных. Поэтому, исследование системы неспецифического иммунитета беспозвоночных, в частности MCJI, имеет большое значение для понимания процесса формирования и становления функций этого компонента защитной системы в эволюции Metazoa. Для развития эволюционных представлений актуальны исследования, выполненные на иглокожих - примитивных, близких к предковым формам, представителях вторичноротых животных. Иглокожие являются классическим экспериментальным объектом для работ в области биологии развития и сравнительной иммунологии. Ранее у двух представителей голотурий — Cucumaria japónica и Apostichopus japonicus — были обнаружены и охарактеризованы MCJI, гомологичные MCJI позвоночных (Булгаков и др., 2000; Bulgakov et al., 2007). Исследована биологическая активность этих лектинов, их роль в иммунной защите. Кроме того, показано, что MCJI А. japonicus задействованы в процессе регенерации пищеварительного тракта после его эвисцерации, что является доказательством интегративной функции иммунной системы и участия ее компонентов в процессах поддержания структурного гомеостаза организма. В серии предварительных исследований показано наличие лектинной активности целомической жидкости морского ежа Strongylocentrotus nudus по отношению к маннанам -полисахаридам, построенным из остатков маннозы.

Цель и задачи работы. Целью работы явилось исследование структуры, физико-химических свойств, роли в защитных реакциях и эмбриогенезе нового лектина, выделенного из целомической жидкости морского ежа S. nudus (MCJI-SN) — вероятного гомолога маннан-связывающих лектинов позвоночных. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить основные физико-химические свойства MCJI-SN;

2. Определить аминокислотную последовательность молекулы MCJI-SN;

3. Установить локализацию в организме морского ежа и возможные места биосинтеза MCJI-SN;

4. Исследовать роль MCJI-SN в защитных реакциях и в эмбриогенезе морского ежа S. nudus.

Научная новизна. Из целомической жидкости морского ежа S. nudus выделен и всесторонне охарактеризован новый лектин. Установлена его тонкая углеводная специфичность, определены основные физико-химические свойства и аминокислотная последовательность молекулы. На основании полученных данных лектин был отнесен к маннан-связывающим лектинам С-типа. Установлено наличие в организме морского ежа двух иммунохимически идентичных форм лектина: растворенной в целомической жидкости и связанной, входящей в состав компонентов внеклеточного матрикса. Определены вероятные источники биосинтеза MCJI-SN. Показан широкий спектр биологической активности MCJI-SN: являясь компонентом неспецифического иммунитета и выступая в роли опсонина, лектин задействован в процессе эмбрионального развития, способствуя миграции клеток первичной мезенхимы.

Личный вклад. Материал, положенный в основу диссертационной работы, в основном, получен, обработан и проанализирован автором самостоятельно. Выделение и определение свойств МСЛ-SN было выполнено под руководством ст.н.с., к.х.н. A.A. Булгакова и н.с., к.б.н. И.Ю. Петровой. Установление аминокислотной последовательности лектина было проведено совместно с н.с., к.б.н. С.Н. Ковальчук. Основная часть работ по проведению иммуноцитохимических и электронно-микроскопических исследований, а также по установлению функций МСЛ-SN в организме морского ежа выполнена при непосредственном участии автора.

Теоретическое и практическое значение работы. У представителя иглокожих обнаружен МСЛ-SN, выполняющий защитную функцию и гомологичный МСЛ позвоночных животных, что доказывает эволюционную преемственность этого компонента неспецифического иммунитета в ряду вторичноротых. Полученные данные вносят существенный вклад в теорию происхождения системы комплемента - одного из основных механизмов защиты позвоночных. Установлено участие МСЛ иглокожих в процессах эмбриогенеза и показана интегративная роль этого компонента врожденного иммунитета. Практическое значение результатов работы связано с возможностью применения нового лектина, функционально и структурно охарактеризованного, обладающего уникальной углеводной специфичностью, в биомедицинских исследованиях.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на симпозиуме с международном участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Россия, Москва, 2007), на XI Международной молодежной конференция по актуальным проблемам химии и биологии (ТИБОХ ДВО РАН, МЭС, 2007), на XII Всероссийской школе конференции по актуальным проблемам химии и биологии (ТИБОХ ДВО РАН, МЭС, 2009) и на годичных конференциях ИБМ ДВО РАН (2008-2010)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 статьи в журналах из списка, рекомендованного ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 5 глав, выводов и списка литературы (167 источников, из которых 157 на английском языке). Работа изложена на 103 страницах, из них 61 машинописного текста, 24 илюстрации (2 таблицы, 14 микрофотографий, 1 электроннограмма, 7 графиков).

Финансовая поддержка. Работа проведена при финансовой поддержке ДВО РАН (проекты № 09-Ш-А-06-198 и Ю-П-В-06-088) и РФФИ (проекты № 07-04-01247-а и 09-04-98535-рвостока).

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Шамшурина, Екатерина Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Из целомической жидкости морского ежа Б1гоп^1осеМгоШ8 пийиз выделен новый белок, обладающий лектинной активностью. На основании установленных физико-химических свойств (способность образовывать гомодимеры, Са2+- зависимость, углеводная специфичность к разветвленным а-О-маннанам) лектин отнесен к группе маннан-связывающих лектинов С-типа.

2. Определена аминокислотная последовательность маннан-связывающего лектина пискиз и установлено, что молекула лектина состоит только из углевод- распознающего домена, включающего 2 а-спиральных участка и 8 (3-тяжей. Лектин представлен в организме пис1т как минимум тремя высокогомологичными изоформами, различающимися единичными аминокислотными заменами. Степень гомологии маннан-связывающего лектина т^из и МСЛ других групп животных высока в участке, отвечающем за связывание с лигандом и ионами Са ("ЕРЫ" и "ЖЫО" мотивы), консервативным является и положение остатков цистеина.

3. Маннан-связывающий лектин присутствует в организме 5". писЬлБ в двух формах: растворенной в целомической жидкости и в связанной, ассоциированной со структурами соединительнотканного внеклеточного матрикса. Биосинтез лектина осуществляют клетки целомической жидкости - морулоподобные целомоциты 2 типа.

4. Маннан-связывающий лектин & пийт задействован в осуществлении защитных реакций. Он способствует агглютинации и опсонизации чужеродных частиц, активизируя процессы их фагоцитоза клетками целомической жидкости.

5. Маннан-связывающий лектин обнаружен в цитоплазме яйцеклеток, в эмбрионах (зигота, два бластомера) и личинках на стадиях плавающей бластулы, поздней гаструлы и плутеуса морского ежа 51. пийт. Показано, что лектин не влияет на процессы оплодотворения, а механизм его участия в эмбриогенезе связан с осуществлением миграции клеток в ходе гаструляции: являясь компонентом внеклеточного матрикса, заполняющего бластоцель, лектин взаимодействует с лигандами - углеводными составляющими поверхностных рецепторов эмбриональных клеток, обеспечивая их направленную миграцию.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шамшурина, Екатерина Валерьевна, Владивосток

1. Булгаков A.A., Назаренко E.JI., Петрова И.Ю., Елисейкина М.Г., Вахрушева Н.М., Зубков В.А. Выделение и свойства маннан-связывающего лектина из целомической жидкости голотурии Cucumaria japónica // Биохимия. 2000. Т. 65, № 8. С. 1099-1106.

2. Елисейкина М. Г., Магарламов Т. Ю. Морфология целомоцитов голотурий Apostichopus japonicus (Aspidochirota: Stichopodidae) и Cucumaria japónica (Dendrochirota: Cucumariidae) // Биол. моря 2002. Т. 28. № 3. С. 214-219.

3. Королев В.П. Функции лектинов в клетке // Итоги науки и техники. Общие проблемы физико-химической биологии, 1984. Т. 1. С. 53-65.

4. Левин В. С. Дальневосточный трепанг. Владивосток: Дальневост. кн. изд-во, 1982. 191 с.

5. Магарламов Т. Ю., Целомоциты иглокожих и их роль в защитных реакциях: Дис. канд. биол. наук. Владивосток: ДВО РАН, ИБМ. 2004. 133 с.

6. Миронов A.A., Комиссарчик Я. Ю., Миронов В. А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. — Санкт-Петербург: Наука, 1994. с.

7. Объекты биологии развития // Под ред. Астауров Б. Л. М.: Наука. 1975. 580 с

8. Петрова И. Ю., Маннан-связывающие лектины дальневосточных голотурий Apostichopus japonicus (Aspidochiroia) и Cucumaria jponica (Dendrochirota) и их роль в защитных реакциях и морфогенезах: Дис. канд. биол. наук. Владивосток: ДВО РАН, ИБМ. 2002. 168 с.

9. Петрова И.Ю., Булгаков A.A., Назаренко Е.Л., Шамшурина Е.В., Кобелев С.С., Елисейкина М.Г. Маннан-связывающие лектины в целомической жидкости у представителей разных видов дальневосточных иглокожих // Биол. моря. 2009. Т. 35. № 2. С. 147-152.

10. Шамшурина Е.В., Елисейкина М.Г., Петрова И.Ю., Булгаков A.A. Обнарущение двух иммунохимически идентичных форм маннан-связывающих лектинов морского ежа Strongylocentrotus nudus // Биолю моря. 2010. Т. 36. № 4. С. 293-299.

11. Ahuja K.K. Carbohydrate determinants involved in mammalian fertilisation // Amer. J. Anat, 1985. V. 174. № 3. P. 207-223.

12. Alliegro M.C., Alliegro M.A. Echinonectin is a Del-1-like molecule with regulated expression in sea urchin embryos // Gene Expr. Patterns. 2007 V. 7(6) P. 651-656.

13. Appenzeller-Herzog C., Hauri H.P. The ER—Golgi intermediate compartment (ERGIC): in search of its identity and function // J. Cell Sci., 2006. V. 119. № 11. P. 2173-2183

14. Arason G.J. Lectins as defence molecules in vertebrates and invertebrates // Fish and Shellfish Immunol., 1996. V. 6. № 4 P. 277-289.

15. Ashwell G., Harford J. Carbohydrate-specific receptors of liver // Annu. Rev. Biochem. 1982. V. 51. P. 531-554.

16. Avezov E., Frenkel Z., Ehrlich M., Herscovics A., Lederkremer G.Z. ER Mannosidase I Is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5 6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation // Mol. Biol. Cell, 2008. V. 19. № 1. P.216-225

17. Axels en N.M., Kroll J., Weeke B. A manual of quantitative immunoelectrophoresis //Mir, Moskow. 1977. 198 p.

18. Baksh S., Michalak, M. Expression of calreticulin in Escherichia coli and identification of its Ca2+ binding domains // J. Biol. Chem. 1991. V. 266, P. 21458-21465.

19. Baksh S., Spamer C., Heilmann C., Michalak M. Identification of the Zn2+ binding region in calreticulin I IFEBS Lett. 1995. V. 376. №. 1-2. P. 53-57.

20. Ballou C. Advances in microbial physiology // Adv. Microb. Physiol., 1976. V. 14. № 11. P. 93-158.

21. Barondes S.H., Castronovo V., Cooper D.N., Cummings R.D., Drickamer K., Feizi T., Gitt M.A., Hirabayashi J., Hughes C., Kasai K. Galectins: a family of animal beta-galactoside-binding lectins // Cell. 1994. V. 76. P. 597-598.

22. Bisgrove B.W., Raff R.A. The SpEGF III gene encodes a member of the fibropellins: EGF repeat-containing proteins that form the apical lamina of the sea urchin embryo // Dev. Biol. 1993. V.157 № 2. P. 526-38.

23. Borowsky M.L., Hynes R. O. Layilin, a novel talin-binding transmembrane protein homologous with C-type lectins, is localized in membrane ruffles // J. Cell Biol. 1998. V. 143(2) P. 429^142.

24. Butcher S., Arney K. L., Cook G. P. MAFA-L, an ITIM-containing receptor encoded by the human NK cell gene complex and expressed by basophils and NK cells // Eur. J. Immunol. 1998. V. 28. P. 3755-3762.

25. Bycroft M, Bateman A., Clarke J., Hamill S.J., Sandford R., Thomas R.L., Chothia C. The structure of a PKD domain from polycystin-1: implications for polycystic kidney disease IIEMBO J. 1999. V. 18(2). P. 297-305.

26. Byrne M. The ultrastructure of the morula cells of Eupentacta quenquesemita (Echinodermata: Holothuroidea) and their role in the maintenance of the extracellular matrix//J. ofMorphol. 1986. V. 188. №. 2. P. 179-189.

27. Carred P., Harboe M, Oettinger T., Koch C., Svejgaard A. Dual role mannan-binding protein in infection another case of heterosis // Europ. J. of Immunogenetics. 1994. V. 21. № 2. P. 125-131.

28. Chamow S.M., Hedrick J.L. Subunit structure of a cortical granule lectin involved in the block in polyspermy in Xenopus laevis eggs // FEBS Lett. 1986. V. 206. № 2. P. 353-357.

29. Chia F., Xing J. Echinoderm coelomocytes // Zool. Stud. 1996. V. 35. P. 231-254.

30. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorophorm extraction // Anal. Biochem. 1987. V. 162. P. 156-159.

31. Colley K.J., Beranek M.C., Baenziger J.U. Purification and characterization of the core-specific lectin from human serum and liver // Biochem. J. 1988. V. 256. № l.P. 61-68.

32. Colonna M., Samaridis J., Angman L. Molecular characterization of two novel C-type lectin-like receptors, one of which is selectively expressed in human dendritic cells // Eur. J. Immunol. 2000. V. 30 P.697-704.

33. Crocker P. R., Gordon, S. Properties and distribution of a lectin-like hemagglutinin differentially expressed by murine stromal tissue macrophages // J. Exp. Med. 1986. V. 164. P. 1862-1875.

34. Crocker P.R, Feizi T. Carbohydrate recognition systems: functional triads in cell-cell interactions // Curr. Opin. Struct. Biol. 1996. V. 6. № 5. P. 679-691.

35. Crocker P. R, Varki A. Siglecs, sialic acids and innate immunity // Trends Immunol. 2001. V. 22. P. 337-342.

36. Crocker P. R, Varki, A. Siglecs in the immune system // Immunology. 2001. V. 103. P. 137-145.

37. Res. Mol. Biol. 1993. V. 45. P. 207-232. Drickamer K., Fadden A.J. Genomic analysis of C-type lectins // Biochem. Soc.

38. Geider S., Baronnet A., Cerini C., Nitsche S., Astier J.P., Michel R., Boistelle R., Berland Y, Dagorn J.C., Verdier J.M. Pancreatic lithostathine as a calcite habit modifier // J, Biol, Chem. 1996, V. 271. № 42. P. 26302-26306.

39. Geijtenbeek T. B., van Vliet S. J., Engering A., Hart B. A., van Kooyk Y. Self- and nonself-recognition by C-type lectins on dendritic cells // Annu. Rev. Immunol. 2004. V. 22. P. 33-54.

40. Glabe C.G., Grabel L.B., Vacquier V.D., Rosen C.D. Carbohydrate specify of sea urchin sperm binding: a cell surface lectin mediating sperm-egg adhesion // J. Cell Biol., 1982. V. 94. № 1. P. 123-128.

41. Gourdine J.P., Smith-Ravin E.J. Analysis of a cDNA-derived sequence of a novel mannose-binding lectin, codakine, from the tropical clam Codakia orbicularis II Fish Shellfish Immunol. 2007. V. 22. № 5. P. 498-509.

42. Guay C. K., ZalikS. E. Expression of the 14 kDa and 16 kDa galactoside-binding lectins during differentiation of the chick yolk sac // Dev. genes and evol. V. 204. P. 126-140.

43. Hakomori S. Immunochemical and molecular genetics of the histo-blood group ABO (H) and related antigen system // Baillieres Chemical Haematology, 1991. V. 4. №4. P. 957-974.

44. Hartnell A., Steel J., Turley H., Jones M., Jackson D.G., Crocker P.R. Characterization of human sialoadhesin, a sialic acid binding receptor expressed by resident and infl ammatory macrophage populations // Blood. 2001. V. 97. № 1. P. 288-296.

45. Hatakeyama T., Ohuchi K., Kuroki M., Yamasaki N. Amino acid sequence of a C-type lectin CEL-IV from the marine invertebrate Cucumaria echinata II Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. V. 59. № 7. P. 1314-1317.

46. Hauri H.P., Kappeler F., Andersson H., Appenzeller C. ERGIC-53 and traffic in the secretory pathway // J. Cell Sci. 2000. V. 113. P. 587-596.

47. Helenius A., Aebi M. Roles of N-linked glycans in the endoplasmic reticulum // Annu. Rev. Biochem. 2004. V.73. P. 1019-1049.

48. Hibino Т., Loza-Coll M, Messier С., et al. The immune gene repertoire encoded in the purple sea urchin genome // Dev. Biol. 2006. V. 300. P. 349-365.

49. Hirabayashi J., Kasai K. The family of metazoan metal-independent b-galactoside-binding lectins: structure, function and molecular evolution // Glycobiology 1993.V. 3.P. 297-304.

50. Hirohashi N., Lennarz W.J. Role of a vitelline layer-associated 350 kDa glycoprotein in controlling species-specific gamete interaction in the sea urchin // Dev. Growth. Differ. 2001. V. 43. № 3. P. 247-255.

51. Holmskov U., Maholtra R., Sim R.B. et al. Collectins: collagenous C-type lectins of innate immune defence system. // Immunol. Today. 1994. V.15. P. 67-74.

52. Hosokawa N., Wada I., Hasegawa K., Yorihuzi Т., Tremblay L.O., Herscovics A., Nagata K. A novel ER alpha-mannosidase-like protein accelerates ER-associated degradation // EMBO Rep. 2001. V. 2. P. 415-422.

53. Huang H.C., Shi G.Y., Jiang S.J., Shi C.S., Wu C.M., Yang H.Y., Wu H.L. Thrombomodulin-mediated cell adhesion: involvement of its lectin-like domain // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. № 47. P. 46750-46759.

54. Johnson L.V., Calarco P.G. Mammalian preimplantation development: the cell surface // Anat. Rec. 1980. V.196. № 2. P. 201-219.

55. Kamiya Y., Yamaguchi Y., Takahashi N., Arata Y., Kasai K., Ihara Y., Matsuo I., Ito Y., Yamamoto K., Kato K. Sugar-binding properties of VIP36, an intracellular animal lectin operating as a cargo receptor // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P.37178-37182.

56. Katow H. Pamlin, a primary mesenchyme cell adhesion protein, in the basal lamina of the sea urchin embryo II Exp. Cell Res. 1995. V. 218. № 2. P. 469^178.

57. Katow H., Washio M. Pamlin-induced tyrosine phosphorylation of SUp62 protein in primary mesenchyme cells during early embryogenesis in the sea urchin, Hemicentrotus pulcherrimus // Dev. Growth Differ. 2000. V. 42. № 5. P. 519-529.

58. Katow H., Sofuku S. An RGDS peptide-binding receptor, FR-1R, localizes to the basal side of the ectoderm and to primary mesenchyme cells in sand dollar embryos //Dev. Growth Differ. 2001. V. 43. № 5. P. 601-610.

59. Kawamura K., Fujiwara S., Sugino Y.M. Budding-specific lectin-induced in epithelial cell is an extracellular matrix component for stem cell aggregation in extracellular matrix // Development. 1991. V. 133. № 3. P. 995-1005.

60. Kawasaki N., Kawasaki T., Yamashina I. Isolation and characterization of a mannan-binding protein from human serum I I J. Biochem. 1983. V. 94. P. 937-947.

61. Kawasaki T. Structure and biology of mannose-binding protein, MBP, an important component of innate immunity // Biochim. and Biophys. Acta. 1999. V. 1473. P. 186-195.

62. Khramkova N. L, Abelev G. I. Limits of sensitivity of the agar precipitation method // Biull. Eksp. Biol. Med. 1961. V. 52. P. 107-111.

63. Khurrum M., Hernandez A., Eskalaei M., Badali O. Coyle-Thompson C, Oppenheimer SB. Carbohydrate involvement in cellular interactions in sea urchin gastrulation // Acta Histochem. 2004. V. 106. № 2. P. 97-106.

64. Kornfeld R., Kornfeld S. Assembly of asparagine-linked oligosaccharides // Ann. Rev. Biochem. 1985. V. 54. № 3. P. 631-664.

65. Kubo T., Kawasaki K, Nonomura Y., Natori S. Localization of regenectin in regenerates of American cockroach {Periplaneta americana) legs // Int. J. Dev. Biol. 1991. V. 35. № 2. P. 83-90.

66. Kuhlman M., Joiner K., Ezekowitz R.A. The human mannose-binding protein functions as an opsonin // J. Exp. Med. 1989. V. 169. № 5. P. 1733-1745.

67. Kurata H., Sannoh T., Kozutsumi Y., Yokota Y., Kawasaki T. Structure and functions of mannan binding proteins isolated from human liver and serum // J. Biochem. 1994. V.115. №. 6. P. 1148-1154.

68. Mâàttànen P., Gehring K, Bergeron J. J.M., Thomas D. Y. Protein quality control in the ER: The recognition of misfolded proteins // Seminars in Cell & Developmental Biology 2010. V. 21. № 5. P. 500-511.

69. McCarthy R.A., BeckK, Burger M.M. Laminin is structurally conserved in the sea urchin basal lamina //EMBO J. 1987. V. 6. № 6. P. 1587-1593.

70. McEver R. P. Selectins: lectins that initiate cell adhesion under flow // Curr. Opin. Cell Biol. 2002. V. 14. P. 581-586.

71. Miyazawa S., Azumi K, Nonaka M. Cloning and characterization of integrin alpha subunits from solitary ascidian, Halocynthia roretzi II J. Immunol., 2001. V. 166. №3. P. 1710-1715.

72. Mogues T., Ota T., Tauber A.T., Sastry KN. Characterization of the mannose-binding protein cDNAs from rhesus monkey (Macaca mulatto): structure and evolutionary implications // Glycobiology. 1996. V. 6. № 5. P. 543-550.

73. Monroy A., Rosati F., Dale B. Sperm-egg interaction // Boll. Zool. 1984. V. 51. № 1-2. P. 103-119.

74. Mullen M.M., Haan KM., Longnecker R., Jardetzky T.S. Structure of the Epstein-Barr virus gp42 protein bound to the MHC class II receptor HLA-DR1 // Mol. Cell. 2002. V. 9. № 2. P. 375-385.

75. Muramoto K, Kamiya H. The amino-acid sequence of multiple lectins of the acorn barnacle Megabalanus rosa and its homology with animal lectins // Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1039. № 1. P. 42-51.

76. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation//!. Histochem. Cytochem. 1974. V. 22. № 12. P. 1084-1091.

77. Ozeki Y., Yokota Y., Kato K.H., Titani K., Matsui T. Developmental expression of D-galactoside-binding lectin in sea urchin (Anthocidarus crassispina) eggs // Exp. Cell Res. 1995. V. 216. P. 318-324.

78. Perillo N. L., Marcus M. E., Baum, L. G. Galectins: versatile modulators of cell adhesion, cell proliferation, and cell death // J. Mol. Med. 1998.V. 76. P. 402412.

79. Poirier F., Kimber S. Cell surface carbohydrates and lectins in early development // Mol. Hum. Reprod. 1997. V. 3. № 10. P. 907-918.

80. Quarles R.H. Myelin-associated glycoprotein (MAG): past, present and beyond // J. Neurochem. 2007. V. 100. № 6. P. 1431-1448

81. Regan L.J., Dodd J., Barondes S.H., Jessell T.M. Selective expression of endogenous lactose-binding lectins and lactoseries clycoconjugatesin subset of rat sensory neurons // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986. V. 83. № 7. P. 2248-2252.

82. Roberts D.L., Weix D.J., Dahms N.M., Kim J.-J.P. Molecular basis of lysosomal enzyme recognition: three-dimensional structure of the cation-dependent mannose 6-phosphate receptor// Cell. 1998. V. 93. P. 639-648.

83. Roche I. C., Monsigny A.C., Hauri H.P. ERGIC-53 is a functional mannose-selective and calcium-dependent human homologue of leguminous lectins // Mol. Biol. Cell. 1996. V. 7. P. 483-493.

84. Sato T., Endo Y., Matsushita M., Fujita T. Molecular characterisation of a novel serine-protease involved in activation of the complement system by mannose-binding protein // Inter.Immunol. 1994. V. 6. № 4. P. 665-669.

85. Schachner M., Bartsch U. Multiple functions of the myelin-associated glycoprotein MAG (siglec-4a) in formation and maintenance of myelin // Glia. 2000.V. 29. P. 154-156.

86. Schräg J. D., Bergeron J. J., Li Y., Borisova S., Hahn M., Thomas D. Y., Cygler M. The structure of calnexin, an ER chaperone involved in quality control of protein folding//Mol. Cell. 2001. V. 8 P. 633-644.

87. Seyfarth J., Garred P., Madsen H.O. The "involution" of mannose-binding lectin I I Hum. Molec. Genetics. 2005. V. 14. № 19. P. 2859 2869.

88. Shiratsuchi A., Watanabe I., Ju J., Lee B. L. Nakanishi Y. Bridging effect of recombinant human mannose-binding lectin in macrophage phagocytosis of Escherichia coli II Immunology. 2008. V. 124. P. 575-583.

89. Simpson A.J., Smithers S.R. Characterization of the exposed carbohydrates on the surface membrane of adult Schistosoma mansoni by analysis of lectin binding //Parasitology. 1980. V. 81. № 1. P. 1-15.

90. Smith L.C., Shih C. S., Dachenhausen S.G. Coelomocytes express SpBf, a homologue of factor B, the second component in the sea urchin complement system. II J. Immunol. 1998. V. 161. № 12. P. 6784-6793.

91. Smith L.C., Rast J.P., Brocktton D.P., Terwilliger D. P., Nair S. V., Buckley K. M., Majeske A. J. The sea urchin immune system // Invertebrate Survival J. 2006. V. 3. P. 25-39.

92. Spiegel E., Burger M., Spiegel M. Fibronectin in the developing sea urchin embryo //J. Cell Biol. 1980. V. 87. № 1. p. 309-313.

93. Swaminathan G.J., Myszka D.G., Katsamba P.S., Ohnuki L.E., Gleich G.J., Acharya K.R. Eosinophil-granule major basic protein, a C-type lectin, binds heparin // Biochemistry. 2005. V. 44. № 43. P. 14152-14158.

94. Takahashi M., Iwaki D., Matsushita A., Nakata M., Matsushita M., Endo Y., Fujita T. Cloning and characterization of mannose-binding lectin from lamprey (Agnathans) // J. Immunol. 2006. V. 176. № 8. P. 4861-4868.

95. Taylor M. E., Bezouska K, Drickamer K. Contribution to ligand binding by multiple carbohydrate-recognition domains in the macrophage mannose receptor // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 1719-1726.

96. Towbin K, Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. № 9. P. 4350-^1354.

97. Uemura K, Yokota Y., Kozutsumi Y., Kawasaki T. A unique CD glycoform recognized by the serum mannan-binding protein in immature thymocytes // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. № 9. P. 4581^1584.

98. Uemura K, Saka M., Nakagawa T., Kawasaki N., Thiel S., Jensenius J.C., Kawasaki T L-MBP is expressed in epithelial cells of mouse small intestine // J. Immunol. 2002. V. 169. P. 6945-6950.

99. Vas V., Fajka-Boja R., Ion G., Dudics V., Monostori E., Uher F. Biphasic effect of recombinant galectin-1 on the growth and death of early hematopoietic cells // Stem Cells. 2005. V. 23. № 2. P. 279-287.

100. Volanakis J.E. Human C-reactive protein: expression, structure, and function // Mol. Immunol. 2001. V. 38. № 2-3. P. 189-197.

101. Wang Q. C., Feng Z. H., Nie Q. H., Zhou Y. X. DC-SIGN: binding receptors for hepatitis C virus // Chin. Med. J. 2004. V. 117. P. 1395-1400.

102. Watt D.J., Jones G.E., Goldring K. The involvement of galectin-1 in skeletal muscle determination, differentiation and regeneration // Glycoconj. J. 2004. V. 19. №7-9. P. 615-619.

103. Weis WJ., Drickamer K., Hendrickson W.A. Structure of a C-type mannose-binding protein complexed with an oligosaccharide // Nature. 1992. V. 360. № 6400. P. 127-134.

104. Weis WJ., Taylor M.E., Drickamer K. The C-type lectin superfamily in the immune system // Immunol. Rev. 1998. V. 163. P. 19-34.

105. Wessel G.M., Berg L., Adelson D.L., Cannon G., McClay D.R. A molecular analysis of hyaline a substrate for cell adhesion in the hyaline layer of the sea urchin embryo //Dev. Biol. 1998. V. 193. № 2. P. 115-126.

106. Wetering J. K, Lambert M. G. van Golde, Batenburg J. J. Collectins. Players of the innate immune system // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 1229-1249.

107. White R.A., Dowler L.L., Adkinson L.R., Ezekowitz R.A.B., Sastry K.N. The murine mannose-binding protein genes (MBL1 and MBL2) localize to chromosomes 14 and 19 //Mamra. Genome. 1994. V. 5. P. 807-809.

108. WilcockD., Duncan S.A., Traktman P., Zhang W.H., Smith G.L. The vaccinia virus A40R gene product is a nonstructural, type II membrane glycoprotein that is expressed at the cell surface // J. Gen. Virol. 1999. V. 80. P. 2137-2148.&

109. Williams D.B. Beyond lectins: the calnexin/calreticulin chaperone system of theendoplasmic reticulum // J. Cell Sci. 2006. V. 119. P. 615-623. Wilson P.D. Polycystin: new aspects of structure, function, and regulation // J. Am.

110. Glycoconj. J. 2004. V. 19. № 7-9. P. 601-606. ZalikS. E. On the possible role of endogenous lectins in early animal development

111. Anat. Embryol. 1991. V. 183. P. 521-536. Zelensky A. N., Gready J. E. The C-type lectin-like domain superfamily // FEBS J.2005. V. 272. P. 6179-6217. Zhang Y. W., Ding L.S., Lai M.D. Reg gene family and human diseases // World J.