Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние фенола и кадмия на сперматогенные и вспомогательные клетки морских ежей Strongylocentrotus nudus и Anthocidaris crassispina

ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Влияние фенола и кадмия на сперматогенные и вспомогательные клетки морских ежей Strongylocentrotus nudus и Anthocidaris crassispina"

Направахрукописи

ЮРЧЕНКО Ольга Викторовна

ВЛИЯНИЕ ФЕНОЛА И КАДМИЯ НА СПЕРМАТОГЕННЫЕ И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ КЛЕТКИ МОРСКИХ ЕЖЕЙ STRONGYLOCENTROTUS NUDUS И ANmOCЮARIS CRASSISPmA

03.00.30 - биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 2004

Работа выполнена в Институте биологии моря ДВО РАН

Научный руководитель:

Доктор биологическихнаук, ведущий научный сотрудник ИБМДВОРАН Реунов Аркадий Анатольевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник ИБМДВОРАН ВараксинАнатолий Алексеевич

Кандидат биологических наук, доцент кафедры клеточной биологии АЭМББТ ДВГУ

Рыбалкина СветланаМихайловна

Ведущая организация:

Институт цитологииРАН

Защита состоится 28 декабря 2004 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.008.01 при Институте биологии моря ДВО РАН по адресу: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря ДВО РАН

Автореферат разослан ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук СОСС4 ^Л^^^С.} М.А. Ващенко

Актуальность проблемы. Рост хозяйственной деятельности в прибрежных районах морских акваторий приводит к повышению уровня содержания в морской среде токсических веществ. Для установления биологических последствий антропогенного загрязнения водной среды целесообразно исследование их действия на гидробионтов. Фенол и кадмий в силу своей распространенности являются модельными токсикантами. Морские ежи традиционно служат объектами научных исследований разных направлений, в том числе в токсикологических работах и программах биомониторинга (Kobayashi, 1995). Использование хронических экспозиций низкими дозами токсикантов способно имитировать экологическую обстановку некоторых загрязненных морских районов. Как показали исследования последних лет, стабильность показателей гонадного индекса и отсутствие патологий при гистологическом анализе не исключают аномалии в ходе сперматогенеза на ультраструктурном уровне ^u et al., 2001). Для выявления достоверных ультраструктурных изменений, спровоцированных действием токсикантов, необходимо иметь четкое представление о процессах протекающих в половых клетках в норме.

В последние годы в исследованиях гаметогенеза морских ежей, особое внимание уделяется не только изучению развития половых клеток, но и вспомогательных. По мнению некоторых авторов, вырабатывающих рекомендации по марикультуре, именно вспомогательные клетки определяют качество «икры» морских ежей (Byrne, 1999; Walker et al., 1998, 2001). Кроме трофической и фагоцитарной функций, вспомогательные клетки морских ежей выполняют роль защитного барьера. Согласно некоторым данным большая часть тяжелых металлов аккумулируется именно в них (Липина, Гнездилова, 1985). Работ по исследованию вспомогательных клеток в условиях искусственной токсикации несоизмеримо меньше, чем исследований половых клеток. Безусловно, для понимания процессов протекающих во вспомогательных клетках морских ежей под действием токсикантов необходимо иметь четкие представления о строении и функционировании данных клеток в норме. До сих пор остается не описанным на ультраструктурном уровне процесс резорбции остаточных гамет, хотя в токсикологических исследованиях активизация резорбции - явяется признаком деструктивных изменений, происходящих в гонаде (Сяси-на, 1988; Сясина и др. 1991; Дуркина, 1992).

В природных условиях гидробионты подвергаются комплексному воздействию загрязняющих веществ. Совместное действие нескольких токсикантов может привести к более пагубным последствиям. Однако необходимо знание механизмов повреждающего

Цель и задачи работы. Цель данной работы состояла в исследовании воздействия фенола и кадмия на сперматогенные и вспомогательные клетки гонад морских ежей 8^оп£у1освМюШ иыёш и Anthocidaris сга8818рта. В связи с тем, что ультраструктура сперматогенных клеток морского ежа А. crassispina в норме и при воздействии кадмия была изучена нашими коллегами из Городского университета Гонконга ранее (Аu et а1., 1998, Аи et а1., 2001Ь), данный вид будет исследован частично.

Для достижения цели предполагалось решить следующие задачи:

1. Исследовать ультраструктурную организацию половых и вспомогательных клеток морского ежа 3. nudus в норме;

2. Исследовать ультраструктурную организацию вспомогательных клеток морского ежа А. crassispina в норме;

3. Определить степень накопления фенола и кадмия в гонадах самцов морского ежа

3. nudus;

4. Провести сравнительный ультраструктурный анализ сперматогенных и вспомогательных клеток обоих видов морских ежей, подвергнутых действию 0.01 и 0.1 мг/л фенола и кадмия в ходе хронической (50 сут) токсикации.

Научная новизна. Впервые на ультраструктурном уровне изучен процесс сперматогенеза у морского ежа 3. nudus.

Впервые изучен процесс посленерестовой резорбции у 3. nudus и А. ст¡¡щ^. Показано, что состав первичных лизосом участвующих в резорбции, у исследованных видов различен. Впервые для морских ежей описан специализированный механизм по-сленерестового уменьшения вспомогательных клеток у А. crassispina, посредством функционирования специализированных аутолизосом. На примере того же вида показано, что деструктивные процессы (резорбция, аутолиз электроноплотных глобул, активность специализированных аутолизосом) завершаются формированием электроносветлых полостей, сжатие которых приводит к уменьшению размеров вспомогательных клеток.

При исследовании влияния токсикантов на сперматогенные клетки обоих видов морских ежей впервые установлено, что фенол и кадмий способны вызывать как сходные, так и отличные ультраструктурные нарушения. Впервые описан механизм деструкции вещества зародышевой плазмы в сперматогониях морских ежей подвергающихся токсикации. На сперматогенных клетках 3. nudus и А. crassispina показано, что особенностью действия фенола является его способность подавлять цитокинез, что приводит к формированию мультиядерных половых клеток. Описан механизм повреждающего дей-РТВИЯ,(ЬСН0ЛАЙ Ш1>1ИЯ на вспомогательные клетки. Показано, что в отличие от спермато-

генных клеток вспомогательные клетки на действие обоих токсикантов отвечают одинаковым набором ультраструктурных реакций, обнаруживая при этом признаки видоспе-цифичности. Видоспецифичность действия токсикантов объясняется особенностями метаболизма вспомогательных клеток, показанными на особях из контрольной группы.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные дают детальную картину процессов резорбции и посленерестовых перестроек во вспомогательных клетках морских ежей. Проведенные исследования показали, что при низком уровне содержания токсикантов (0.1 и 0.01 мг/л) гонадный индекс и гистологические картины гонад не отличаются от контрольных показателей, и, следовательно, не могут достоверно свидетельствовать об уровне загрязнения. Метод электронной микроскопии является более точным для оценки повреждающего действия низких концентраций токсикантов. Полученные ультраструктурные данные могут быть использованы для прогнозирования биологических последствий загрязнения морской среды фенолом и тяжелыми металлами при репродукции морских ежей. Высокая чувствительность половых детерминантов к действию токсикантов, позволяет использовать эту структуру как цитологический маркер загрязнения окружающей среды.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000); на Всероссийской конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2002); на первом съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003); на Международном симпозиуме "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия" (Санкт-Петербург, 2004), на Международном научном семинаре «Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов» (Мурманск, 2004), на ежегодных конференциях Института биологии моря ДВО РАН (1999, 2003); на научном межлабораторном семинаре по морфологии, физиологии и биохимии ИБМ ДВО РАН. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов, списка литературы (186 источника из них 132 на иностранном языке) и приложения. Работа изложена на 137 страницах, из них 97 машинописного текста, 40 рисунков. Благодарности. Автор выражает признательность своему научному руководителю А.А. Реунову за всестороннюю помощь, поддержку и руководство при выполнении настоящей работы. Огромное спасибо за ценные консультации и критические замечания М.А. Ва-

щенко. Я благодарна В.Я. Кавуну и МА. Веселовой, В.В. Юшину и С.Ш. Даутову, Д.В. Фомину А.В. Калачеву Ю.К. Зограф за техническую и методическую помощь.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования и условия экспериментов.

С 1998 по 2002 годы была проведена экспериментальная работа в Городском университете Гонконга и в Институте биологии моря ДВО РАН.

A. crassispina. Для исследования состояния семенников и влияния фенола и кадмия на клетки половой железы морского ежа A. crassispina, был использован материал любезно предоставленный коллегами из Городского университета Гонконга. Для исследования морфофункциональных характеристик гонад сбор морских ежей производился с марта по сентябрь 1998, в зал. Кат О Южно-Китайского моря.

По данным наших коллег (Au et al., 2001b) эксперименты по влиянию токсикантов проводили на A. crassispina в стадии активного гаметогенеза. Подопытные особи проходили недельную адаптацию к лабораторным условиям в 140 литровых непроточных аэрируемых аквариумах по 12 особей в каждом. После адаптации в аквариумы с экспериментальными морскими ежами добавляли исходные маточные растворы фенола и хлорида кадмия, приготовленные на фильтрованной морской воде, конечные концентрации которых доводились до 0.01 и 0.1 мг/л. Таким образом, в экспериментах было по пять групп животных каждого вида (0.01 и 0.1 мг/л фенола, 0.01 и 0.1 мг/л кадмия и контрольная группа). Продолжительность экспериментов составила 50 суток.

S. nudus. Особи S. nudus были собраны в бухте Емар Уссурийского залива Японского моря в 2001 и 2002 г. Сбор производился с апреля по сентябрь. Искусственная ток-сикация была проведена в аквариальной Института биологии моря ДВО РАН с соблюдением условий экспериментов примененных нашими коллегами (см. выше).

Определение содержания кадмия в гонадах. Для морского ежа S. nudus определяли количество кадмия содержащегося в гонадах. Высушенные при 85°С ткани гонад морских ежей минерализовали концентрированной азотной кислотой. Приготовленные из минерализатов растворы анализировали методом атомно-абсорбционной сперктрофо-тометрии в пламенном варианте на приборе Hitachi - 180-70, определяя в них содержание кадмия (Христофорова и др., 1994).

Определение содержания фенола в гонадах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Из образцов гонад морского ежа S. nudus экстрагировали фенольные соединения. ВЭЖХ проводилась на приборе высокого давления Beckman-

Aldrich. Колонка Separan TM SGX C18 3x150 mm, 5 тСистема вода-ацетонитрил (1% уксусной кислоты) в градиенте 0-30 % ацетонитрила в течение 15 минут.

Световая и электронная микроскопия. Кусочки гонад S. nudus фиксировали в 2.5 % глютаральдегиде в 0.1 М какодилатном буфере при рН 7.5 (для A. crassispina - 2.5 глютаральдегид с 1% танниновой кислотой с добавлением сахарозы), затем дофиксиро-вали в 2% четырехокиси осмия. После дегидратации в серии спиртов и ацетонов образцы были заключены в смолы Спурр или смесь Эпон-Аралдит. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим и анализировали на микроскопе Polyvar. Тонкие срезы окрашивали 2 % раствором уранилацет в этаноле и водным раствором цитрата свинца. Срезы изучали в трансмиссионных микроскопах JEM 100В и JEM 100S при 80 кВ. Фиксация гонад морского ежа A. crassispina для электронно-микроскопических исследований была произведена в Городском университете Гонконга. Ультраструктурный анализ состояния сперматогенных и вспомогательных клеток как A. crassispina, так и S. nudus был проведен нами в Институте биологии моря ДВО РАН.

Морфометрия. Для самцов морского ежа S. nudus из каждой группы животных определяли гонадный индекс, который рассчитывали по формуле: ГИ = масса гонады/ масса тела животного 100%. При исследовании состояния гонад экспериментальных животных, подвергнутых действию фенола и кадмия проводили подсчет митохондрий со вздувшимися кистами. Митохондрии со вздувшимися кристами в половых клетках ранних стадий подсчитывались в процентном соотношении к общему числу митохондрий сперматогониев и сперматоцитов на срезе. Аналогично делали подсчет дегенеративных митохондрий в сперматидах и сперматозоидах.

Для оценки уровня резорбции во вспомогательных клетках, производилась панорамная съемка участка ацинуса мужских гонад животных из всех экспериментальных групп, при увеличении электронного микроскопа 5 тыс. раз. Такое увеличение позволяет идентифицировать гетерофагосомы во вспомогательных клетках. Подсчитывали количество гетерофагосом на 2.5 мм2.

Для определения количества неразделившихся половых клеток были исследованы около 500 сперматогониев и сперматоцитов и около 1000 сперматид и сперматозоидов из каждой экспериментальной группы. Процент неразделившихся клеток высчитывался как соотношение неразделившихся сперматогониев и сперматоцитов к общему числу спер-матогониев и сперматоцитов. Аналогично производился подсчет сперма-тид/сперматозоидов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Ультраструктурная организация сперматогенных клеток морского ежа Strongylocentrotus в норме

Исследование сперматогенеза у морского ежа 5. пЫш показало, что признаки дифференциации сперматогенных клеток типичны для других видов морских ежей, исследованных ранее. В цитоплазме сперматогониев 5". пЫш обнаружены половые детерминанты или зародышевая плазма. Первоначально данная субстанция представлена сгустком электроноплотного материала не окруженным мембраной (рис. 2А). По мере рассеивания данный материал взаимодействует с митохондриями. Последние теряют наружную мембрану и преобразуются в глобулы митохондриального матрикса, содержащие кристы (рис. 2Б). В дальнейшем происходит полное рассеивание как цитоплазмати-ческой составляющей зародышевой плазмы, так и глобул митохондриального матрикса (рис. 2В). Подобное явление было описано в сперматогониях морского ежа А. ст!!^^ (Reunov et а1., 2000), а также у представителей голотурий и костистых рыб (Реунов и др., 2004). Взаимодействие материала половых детерминантов и митохондрий является нормальным процессом, предшествующим мейотическому делению.

Аппарат Гольджи, присутствующий в сперматогенных клетках, является компонентом флагеллярного комплекса. В сперматогониях и сперматоцитах диктиосомы формируют мелкие электроносветлые везикулы. Однако наибольшая активность аппарата Гольджи в сперматогенезе 5. пийш и А. сга8818рта (Аu et а1., 1998) отмечена на стадии сперматид, в которых формируются акросомальная везикула и первичные лизосомы, включающиеся в состав резидуального тельца. Резидуальное тельце формируется из остаточной цитоплазмы содержащей везикулы и комплекс Гольджи и располагается в ба-зальной части сперматиды. Показанное для 5. пийш место локализации резидуального тельца характерно для всех исследованных видов морских ежей.

Морфофункциональные характеристики вспомогательных клеток морских ежей Anthocidaris crassispina и Strongylocentrotus в норме

Для вспомогательных клеток 5. nudus и А. crassispina характерны общие морфологические признаки (размеры и место локализации ядра, наличие в цитоплазме гликогена, липидных капель, гетерофагосом, митохондрий, периферического эндоплазматического ретикулума, комплекса Гольджи).

Посленерестовые перестройки вспомогательных клеток заключаются в резорбции остаточных сперматозоидов, которая описана нами для обоих видов морских ежей (рис. 1А, Б). Процесс резорбции начинается с фагоцитоза спермиев и формирования фагосом (рис. 1А 1-3, Б 1,2). В процессе формирования вторичных лизосом нами были отмечены видовые отличия. У морского ежа A. crassispina обнаружено два типа первичных лизосом: электроносветлые (рис. 1Б 3,4), формируемые эндоплазматическим ретикулумом, и электроноплотные (рис. 1Б 5), продуцируемые комплексом Гольджи. Для S. nudus характерны только электроноплотные лизосомы (рис.1 А 4). Два типа первичных лизосом были отмечены ранее у родственного для A. crassispina морского ежа Echinometra lacunter. Оба вида принадлежат к сем. Echinometridae. Поэтому состав первичных лизосом вовлеченных в процесс резорбции, можно использовать как дополнительный таксономический признак. После полной деструкции содержимого вторичных лизосом (рис. 1А 5,6, Б 6,7) на их месте формируются полости (рис. 1А 7, Б 8), которые впоследствии подвергаются сжатию (рис. 1А 8,9, Б 9). Данные полости присутствуют на иллюстрациях в работах многих авторов (Masuda, Dan, 1977; Laegdsgaard et al., 1991; Walker et al., 1998, 2001), но анализ причин их возникновения обычно отсутствует. Наличие полостей было отмечено Шиу при описании гистологического состояния посленерестовых гонад A. crassispina (Chiu, 1988). Вероятно, сдавливание полостей является компенсаторным механизмом, препятствующим чрезмерному увеличению объема клетки в процессе поглощения резор-бируемого материала. В результате сдавливания полостей в цитоплазме остаются их мембранные оболочки, способы утилизации которых у исследованных видов различны. У A. crassispina они исчезают в цитоплазме бесследно (рис. 1Б 10). У S. nudus остаточные мембраны формируют ламеллярные, или мультипластинчатые структуры, которые поглощаются электроноплотными лизосомами (рис. 1А 9,10). Причем лизосомы способны накапливать в себе большое количество ламеллярных структур. Учитывая консерватизм данных образований и особенности их структурной организации, мы склонны считать их остаточными телами.

Литературные данные свидетельствуют о значительном уменьшении размеров вспомогательных клеток A crassispina (Masuda, Dan, 1977). Однако, исследования Варак-синой (1980), проведенные на самках S. nudus показали отсутствие посленерестового сжатия вспомогательных клеток. По нашему мнению, это явление сопряжено с активностью структур, играющих основную роль в механизме редукции цитоплазмы - «аутоли-зосомами, специализированными на уменьшение размера клетки», описанными нами впервые у морского ежа A. crassispina. Присутствие в цитоплазме вспомогательных кле-

ток посленерестовых гонад морфологически сходных образований отмечено также у родственного вида Echinometra lacunter (Beig, Сгш-ЬашИт, 1975). Однако, авторы описали данные структуры как остаточные тела. По нашим наблюдениям, формирование специализированных аутолизосом начинается с объединения электронно-светлых везикул, со скоплениями электроноплотного (гликогеноподобного) материала (рис. 1В 1), затем происходит формирование мембраны (рис. 1В 2). Мы охарактеризовали сформированную структуру, как первичная аутолизосома (рис. 1В 3). Слияние первичной аутоли-зосомы с электроносветлыми везикулами, приводит к образованию концентрических слоев разной электронной плотности внутри аутолизосомы (рис. 1В 4) (что может свидетельствовать о биохимических превращениях внутри данной структуры) и формированию наружного светлого слоя. Постепенное просветление содержимого аутолизосом (рис. 1В 5) приводит к формированию полостей на их месте (рис. 1В 6). Кроме того, показано, что первичные аутолизосомы способны встраиваться в электроноплотные глобулы (рис. 1В 8) и изменять структуру их содержимого (рис. 1В 9). В результате трансформации содержимое глобул становится электроносветлым, что свидетельствует о формировании полости (рис. 1В 10). Последующее сжатие большого количества таких полостей (рис. 1В 7, 11) приводит к уменьшению общего размера вспомогательных клеток, что, вероятно, является необходимым этапом их трансформации, предшествующим началу нового годичного цикла.

Таким образом, наши ультраструктурные исследования показали, что наличие электроносветлых полостей, описанные ранее Шиу в посленерестовых гонадах морского ежа А. crassispina (СЫи, 1988), является следствием трех процессов:

1) деструкции содержимого вторичных лизосом, формирующихся в ходе резорбции (рис. 1 Б);

2) деструкции специализированных аутолизосом (рис. 1В, 4-7);

3) деструкции темных глобул, путем слияния их с первичными аутолизосомами (рис. 1В 8-11).

Процесс посленерестового уменьшения вспомогательных клеток у £. nudus ограничивается сжатием полостей, образовавшихся в результате лизиса содержимого гетеро-фагосом.

Рис. 1. Схема посленерестовых перестроек во вспомогательных клетках морских ежей. А - резорбция остаточных спермиев у пыйт. (1-3) - фагоцитоз спермиев и формирование фагосом; (4) - формирование вторичных лизосом, посредством слияния фаго-сом с темными первичными лизосомами; (5,6) — деструкция содержимого вторичных лизосом; (7) - формирование полости; (8) - сжатие полостей; (9) - формирование мульти-пластинчатых тел; (10) — заключение мультипластинчатых тел в темные лизосомы. Б — резорбция спермиев у А. отазз1зр1па. (1, 2) - фагоцитоз спермиев и формирование фаго-сом; (3-5) - формирование вторичных лизосом, путем слияния фагосом с темными и светлыми первичными лизосомами; (6,7) - деструкция содержимого вторичных лизосом; (8,9) - формирование и сжатие полостей; (10) - деструкция остаточных мембран. В -формирование и трансформация специализированных аутолизосом у морского ежа А. отазз1зр1па. (1-3) - формирование первичной специализированной аутолизосомы; (4) -специализированная аутолизосома с концентрическими слоями разной электронной плотности; (5) - деструкция содержимого аутолизосомы; (6,7) - формирование и сжатие полостей; (8) - электроноплотная глобула, содержащая первичную аутолизосому; (9) -деструкция содержимого аутолизосомы; (10,11) - формирование и сжатие полости.

Влияние фенола и кадмия на общее состояние морских ежей

В ходе экспериментов, как с фенолом, так и с кадмием не наблюдалось ухудшения жизнеспособности морских ежей. Измерения гонадного индекса показали, что его значения у подопытных животных не значительно отличались от контрольных показателей (табл. 1).

Таблица 1

Морфологические показатели влияния фенола и кадмия на сперматогенные и вспомогательные клетки морского ежа З^оп^осеПШт пыйт

Морфологические показатели Контроль Кадмий, мг/л Фенол, мг/л

0.01 0.1 0.01 0.1

Гонадный индекс (%) 11.3±1.1 9.8±0.9 12.2±2.2 10.3±0.8 12.9±1.4

Содержание кадмия в гонадах (мкг/г) 1.3±0.4 2.7±0.5* 8.36±1.6** - -

Содержание фенола в гонадах (мкг/г) 0 - - 0 0

Дегенерация митохондрий спермато-гониев и сперматоцитов (%) 8.2±1.3 13.2±0.8* 19.4±1.5* 11.4±1.0* 17.2±0.7*

Дегенерация митохондрий сперма-гид и сперматозоидов (%) 5.1±0.9 15.1±1.5* 17.3±1.2* 6.1±0.9* 5.9±0.6*

Нераздели вшиеся сперматогонии и сперматоциты (%) 0 0 0 2.4±0.7** 5.3±0.5**

Неразделившиеся сперматиды и сперматозоиды (%) 0 0 0 3.9±0.8** 6.1±1.2**

Количество гетерофагосом на 2,5 мм2) 6 10 12 » ' 9 13

Прим.(-) - не определяли

**Р<0.01;*Р<0.05

Методом атомной абсорбции определяли содержание кадмия в гонадах морского ежа 5. nudus. Накопление тяжелого металла в гонадах носит дозозависимый характер (табл. 1).

Несмотря на то, что в экспериментах с фенолом, содержание фенола в гонадах не было выявлено, ультраструктурное исследование показало наличие выраженных изменений в сперматогенных и вспомогательных клетках. Возможно, данный факт объясняется трансформацией молекул фенола в галогенпроизводные при поступлении в морскую среду. Кроме того, молекулы фенола вступают в реакции окисления с последующим преобразованием в молекулы гидрохинона, хинона и т. д. (Schlosser, 1993).

Влияние фенола и кадмия на сперматогенные клетки морских ежей исследованных видов

Ультраструктурное исследование показало ряд изменений в сперматогенных клетках экспериментальных животных, причем действие токсикантов носило как общий характер, так и индивидуальный. Так, например, установлено, что для сперматогониев всех фаз эксперимента с токсикантами характерно усиление активности аппарата Гольджи. Крупные электроносветлые вакуоли, продуцируемые диктиосомами, захватывают вещество половых детерминантов и митохондриальные производные, формируя аутофагосо-му (рис. 2Г, Д, Е). Данное явление, которое может быть охарактеризовано как уничтожение зародышевой плазмы, ранее никогда не было описано и, вероятно, может обсуждаться как механизм, нарушающий течение профазы мейоза в клетках, поврежденных действием токсиканта. Обнаруженный факт представляет большой интерес и требует дальнейшего исследования. На примере крыс, Кайнцом и соавторами (Каш е! а1., 1988) было показано, что под действием госсипола значительно уменьшается количество пахитен-ных сперматоцитов и сперматид. Значительное уменьшение количества сперматогониев и сперматоцитов у крыс провоцирует кадмий в концентрации 0.6 мг/кг в ходе 6-недельной экспозиции (Aoyagy е! а1., 2002). Применение цитохимических методов показало, что сперматогонии и сперматиды - это клетки, накапливающие кадмий в наибольшей степени и уменьшение количества половых клеток ранних стадий обусловлено накоплением в них тяжелого металла. По нашему мнению, такого рода нарушения могут быть следствием

«стерилизации» клеток, путем блокирования половых

детерминантов (рис. 2).

Рис. 2. Трансформация субстанции зародышевой плазмы в

сперматогониях морских ежей в норме (А-В) и под действием токсикантов (Г-Е). Обозначения: КГ - компактная глобула зародышевой плазмы, М -митохондрия, Я - ядро, РС -рассеянная субстанция зародышевой

плазмы, ГМ - глобула митохондриального матрикса, В - везикула, А - аутофагосома.

Общим эффектом фенола и кадмия можно считать вздутие крист митохондрий сперматогониев, сперматоцитов. Данный тип повреждения типичен для действия многих токсикантов и является следствием нарушения проницаемости мембран (Belyaeva et al., 2001). В нашей работе показано, что митохондрии поздних сперматид и сперматозоидов у обоих видов морских ежей не имеют каких-либо структурных повреждений в эксперименте с фенолом. Кадмий же вызывает вздутие крист митохондрий в половых клетках всех стадий. Существуют данные, показывающие дегенерацию митохондрий сперматозоидов при воздействии высоких доз фенола и его производных (Burgos et al., Au et al., 2000). Таким образом, говорить об устойчивости митохондрий половых клеток поздних стадий к фенолу нельзя. Утверждение об индивидуальности применимо лишь при исследуемых концентрациях (0.01 и 0.1 мг/л) и при данном сроке экспозиции (50 суток).

Ультраструктурное исследование выявило наличие неразделившихся клеток в экспериментах с фенолом (табл. 1, рис. ЗА, Б), тогда как в экспериментах с кадмием число таких клеток было ничтожно мало и не отличалось от такового в контроле. На основании данного наблюдения можно предположить, что способность к нарушению клеточных делений является особенностью действия фенола

Рис. 3. Мультиядерные сперматогенные клетки морских ежей, подвергнутых действию фенола. А - четырехядерная сперматида (5. пЫт, 0.01 мг/л); Б - двуядерный сперматозоид (стрелками показаны жгутики) (Л. crassispina, 0.1 мг/л). Обозначения Я - ядро, М - митохондрия, А - акросома. Масштаб А, Б - 1 мкм.

По литературным данным известно, что ингибирование цитокинеза часто происходит под действием органических или биологически активных веществ (Боровская и

др., 2000). Обычно отсутствие цитокинеза связывают с нарушением формирования кон-трактильного кольца. На основании наших данных можно предположить, что молекулы актина, составляющие структуру кольца, являются уязвимыми и для молекул фенола и его производных. Интересен тот факт, что тубулинпроизводные структуры остаются ин-тактными, о чем свидетельствует нормальное течение кариокинеза. Нами показано, что в сперматидах обоих видов морских ежей нарушается процесс формирования и экскреции резидуального тельца. Возможно, нарушения функционирования цитоскелетных белков обусловлены не только структурными перестройками собственно актина (связывание фенольных групп с сульфгидрильными группами белков), но и повреждением сопутствующих ферментативных систем.

При сопоставлении полученных данных, очевидно, что сперматогенные клетки обоих видов морских ежей одинаково реагировали на действие кадмия или фенола, не обнаруживая признаков видоспецифичных реакций. Это позволило отобразить результаты в таблице (табл. 2) общей для обоих видов.

Таблица 2

Повреждающее действие фенола и кадмия на сперматогенные клетки морских

ежей А. ега8818рта и 5. nudus

Ультраструктурные изменения в сперматогенных клетках Фенол, мг/л Cd2+, мг/л

0.01 0.1 0.01 0.1

Гипертрофия аппарата Голь-джи (формирование вакуолей) + + + +

Изоляция половых детерминантов + + + +

Дегенерация митохондрий сперматогониев и спермато-цитов + + + +

Дегенерация митохондрий в сперматидах и сперматозоидах - - + +

Нарушение клеточного деления (наличие мультиядерных половых клеток) + + - -

Нарушение формирования и экскреции резидуального тельца в сперматидах + + - -

Однако, есть различия, которые проявляются на уровне реакции на собственно токсиканты. Так, на обоих видах морских ежей показано, что фенол в исследуемых кон-

центрациях не оказывает повреждающего действия на митохондрии сперматид и сперматозоидов. В то же время кадмий повреждает митохондрии во всех типах клеток. Нарушения клеточных делений являются характерной особенностью экспериментов с фенолом, но не являются типичными для гонад ежей, подвергнутых действию кадмия.

Влияние фенола и кадмия на вспомогательные клетки морских ежей исследованных видов

Исследование вспомогательных клеток морских ежей позволило выявить видоспе-цифичные реакции на действие токсикантов, которые объяснимы их метаболическими особенностями. Ответная реакция вспомогательных клеток, не зависит от рода токсиканта. Выявлены некоторые общие реакции вспомогательных клеток на действие фенола и кадмия. У животных из всех экспериментальных групп активизируются процессы резорбции сперматозоидов (табл. 1) и сперматогенных клеток ранних стадий (рис. 4А). Повышение уровня резорбции отмечалось ранее у животных как под действием тяжелых металлов (Khristoforova et al., 1984; Сясина, 1988; Дуркина, 1992), органических соединений (Christian, 1996; Боровская и др. 2002), так и у животных обитающих в загрязненных морских акваториях (Lowe, 1988; Сясина и др., 1991; Ващенко и др., 1992). Присутствие в период активного гаметогенеза большого количества гетерофагосом содержащих не только сперматозоиды, но и половые клетки ранних стадий, говорит о способности фенола и кадмия в невысоких концентрациях (0.01 и 0.1 мг/л) стимулировать процессы фагоцитоза.

Рис. 4. Вспомогательные клетки морских ежей под действием токсикантов. А - резорбция неразделившихся сперматогониев вспомогательной клеткой (А. crassispina, 0,1 мг/л фенола). Масштаб - 2 мкм; Б - утилизация цитоплазмы. Обозначения: Сг - сперма-тогоний, Вк - вспомогательная клетка. Масштаб - 1 мкм.

Общим для вспомогательных клеток морских ежей А. crassispina и пМш, также является активизация ЭПР, в результате, чего появляется большое количество электро-носветлых везикул (вакуолизация цитоплазмы). Везикулы путем инвагинации своей поверхности захватывают участки цитоплазмы и формируют аутофагосомы (рис. 4Б). Такой эффект мы связываем с детоксикацией ксенобиотиков и изоляцией или выведением продуктов метаболизма (рис. 5А, В). Еще одной причиной вакуолизации цитоплазмы можно считать формирование микросом. Микросомы содержат целый ряд окислительных ферментов, из которых наиболее известен белок - цитохром Р-450. Однако для клеток кишечника морских ежей 5. nudus и 5. intermedius, подвергнутых действию 0,05 мг/л кадмия, и собранных из загрязненного района показано, что в процессе связывания тяжелых металлов основную функцию выполняют цитозольные ферменты, а фракция микро-сом участвует в детоксикации в меньшей степени (Бельчева, 1988).

Видоспецифичные реакции вспомогательных клеток касаются утилизации содержимого аутофагосом. У А crassispina происходит интенсивная экскреция содержимого аутофагосом за пределы клетки, а также отмечено его накопление в крупных электроно-светлых вакуолях (рис. 5А). Благодаря высокому уровню экскреции наблюдается повышенное содержание электроноплотного материала в межклеточном пространстве (рис. 5Б). В цитоплазме вспомогательных клеток 5. nudus экспериментальных групп отмечено большое количество электроноплотных глобул (рис. 5Г). Утилизация содержимого ауто-фагосом у данного вида, происходит только путем включения их в электроноплотные глобулы (рис. 5В). Тот факт, что электроноплотные глобулы в цитоплазме вспомогательных клеток 5. nudus могут являться как остаточными телами, накапливающими остаточные мембраны ауто- и гетерофагосом, так и первичными темными лизосомами, показанное нами увеличение количества глобул находит объяснение (рис. 5Г). Кроме того, повышенное содержание глобул было отмечено ранее у морских ежей обитающих в загрязненных морских акваториях (Сясина и др., 1991).

Рис. 5. Вспомогательные клетки морских ежей под действием фенола и кадмия. А - схема утилизации цитоплазмы во вспомогательных клетках Л. сг^ирта; Б - накопление электроноплотного материала вблизи базальной мембраны и в межклеточном пространстве (стрелки) морского ежа Л. сга^^^^^^^а; В - схема утилизации цитоплазмы во вспомогательных клетках пЫш; Г - большое количество электроно-плотных глобул в цитоплазме вспомогательных клеток морского ежа пи(т. Обозначения: ПМ - плазматическая мембрана, ЭР - эндоплазматический ретикулум, А -аутофагосома, ЭСВ - электроносветлая вакуоль, Л - лизосома. Масштаб: Б - 1 мкм, Г —10 мкм.

ВЫВОДЫ

1. Ультраструктурная организация сперматогенных клеток 5 пЫш сходна с таковой других видов морских ежей, исследованных ранее.

2. Вспомогательные клетки морских ежей 5. nudus и А. сгаххкрта обнаруживают сходную ультраструктурную организацию, но отличаются по составу первичных ли-зосом, участвующих в резорбции, уровню экскреции и характеру посленерестовых перестроек.

3. При концентрациях кадмия в среде 0.01 и 0.1 мг/л, отмечается его накопление в гонадах самцов морских ежей. Присутствие фенола в гонадах морских ежей не установлено.

4. Действие токсикантов на сперматогенные клетки обоих видов морских ежей не выявило признаков видоспецифичной реакции. Однако реакция на собственно токсиканты отличалась. Фенол в исследуемых концентрациях способен подавлять цитокинез, что приводит к формированию мультиядерных половых клеток. В экспериментах с кадмием данный тип патологии не наблюдался. В отличие от фенола, который вызывает вздутие крист митохондрий только в сперматогониях и сперматоцитах, кадмий вызывает дегенерацию митохондрий сперматогенных клеток всех стадий.

5. Универсальным эффектом фенола и кадмия на гениальные клетки является усиление функции комплекса Гольджи, в результате чего формируется значительное количество аутофагосом, изолирующих материал зародышевой плазмы. Высокая чувствительность половых детерминантов к воздействию токсикантов может быть использована как цитологический маркер загрязнения окружающий среды.

6. Вспомогательные клетки на действие исследуемых доз фенола и кадмия отвечают единым комплексом ультраструктурных реакций (активизация резорбции половых клеток, вакуолизация цитоплазмы, деструкция митохондрий). Видоспецифичные реакции вспомогательных клеток (усиление экзоцитоза электроноплотного материала у А. сгаххкрта и увеличение количества электроноплотных глобул у 5. nudus) основаны на особенностях метаболизма морских ежей из разных семейств. В период активного гаметогенеза отмечена интенсификация процессов, типичных для посленересто-вой стадии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Юрченко О.В., Ау Д.В., Реунов А.А. Электронно-микроскопическое исследование влияния фенола на гаметогенез морского ежа Anthocidaris crassispina // Всероссийский симпозиум "Клеточная биология на пороге XXI века". Тез. докл. - Цитология. 2000. Т. 43, № 4. С. 417.

2. Юрченко О.В., РеуновА.А., АуД.В.Т. Ультраструктурные изменения в герминативном эпителии семенников морского ежа Anthocidaris crassispina, спровоцированные фенолом // Всероссийская конференция «Современные проблемы водной токсикологии». Тез. докл. - Борок: ИБВВ РАН. 2002. С. 73-74.

3. Аи D.W.T., Yurchenko O.V., Reunov A.A. Sublethal effect of phenol on spermatogenesis in sea urchins (Anthocidaris crassispina) // Environmental Research. 2003. V. 93. P. 92-98.

4. Юрченко О.В. Диморфизм сперматозоидов у морского ежа Strongylocentrotus nudus //I съезд Общества клеточной биологии. Тез. докл. - Цитология. 2003. Т. 49, №9. С. 952.

5. ReunovA.A., KalachevА. V., Yurchenko О. V., Аи D. W.T. Selective resorption in nutritive phagocytes of the sea urchin Anthocidaris crassispina II Zygote. 2004. V. 12. P. 71-73.

6. Реунов А.А., Юрченко О.В, Александрова Я.Н., Исаева В.В. Деструкция субстанции зародышевых детерминантов в сперматогенных клетках морских ежей в норме и в условиях токсикации фенолом // Международный симпозиум "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия". Тез. докл. — Цитология. 2004. Т. 46, № 10. С. 936-937.

7. Юрченко О.В., Реунов А.А. Диморфизм сперматозоидов у морского ежа Strongylocentrotus nudus IIБиология моря. 2004. Т. 30, № 5. С. 404-406.

8. Reunov A.A., Yurchenko О. V., Kalachev A. V., Аи D. W.T. An ultrastructural study of phagocytosis and shrinkage in nutritive phagocytes of the sea urchin Anthocidaris crassispina II Cell Tissue Res. 2004. V. 318. P. 419-428.

9. Юрченко О.В., Калачев А.В., Реунов А.А. Ультраструктурные особенности по-сленерестовой резорбции у морских ежей Strongylocentrotus nudus и Anthocidaris crassispina II Международный научный семинар «Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов». Тез. докл. - Мурманск: ММБИ КНЦ РАН. 2004.143-145.

10. Юрченко О.В., Реунов А.А. Ультраструктурное исследование герминативного эпителия морских ежей, подвергнутых действию фенола и кадмия // Международный научный семинар «Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов». Тез. докл. - Мурманск: ММБИ КНЦ РАН. 2004.145-148.

ЮРЧЕНКО Ольга Викторовна

ВЛИЯНИЕ ФЕНОЛА И КАДМИЯ НА СПЕРМАТОГЕННЫЕ И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ГОНАД МОРСКИХ ЕЖЕЙ STRONGYLOCENTROTUSNUDUS И ANTHOC1DARISCRASSISP1NA

Автореферат

Лицензия ПЛД № 63-19 от 02.12.1999г. Зак. №1174 Формат 60х84/и. Усл. п. л. 1,0 Тираж 100 экз. Подписано в печать 23.11.2004г. Печать офсетная с оригинала заказчика.

Отпечатано в типографии ОАО «Дальприбор». 690105, г. Владивосток, ул. Бородинская, 46/50, тел.32-70-49(32-44)

Р2 5 5 5 7