Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Целомоциты иглокожих и их роль в защитных реакциях

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Целомоциты иглокожих и их роль в защитных реакциях"

На правах рукописи

Магарламов Тимур Юсифович

ЦЕЛОМОЦИТЫ ИГЛОКОЖИХ И ИХ РОЛЬ В ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЯХ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 2004

Работа выполнена в Институте биологии моря ДВО РАН и в Институте эпидемиологии и микробиологии СО РАМН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, ст. н. с. Елисейкина Марина Геннадьевна; Консультант:

доктор медицинских наук, зав. лаб. Неля Федоровна Тимченко. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Валерия Васильевна Исаева; кандидат биологических наук Ирина Григорьевна Агафонова. Ведущая организация: Институт цитологии РАН

Защита состоится «28» декабря 2004 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.008.01 при Институте биологии моря ДВО РАН по адресу: 690041, Владивосток, ул. Пальчевского, 17, Институт биологии моря

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря ДВО РАН

Автореферат разослан ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

М.А. Ващенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Необходимым условием существования многоклеточных организмов является их способность защищаться от патогенных микроорганизмов. Многоуровневая иммунная система ответственна за поддержание антигенного гомеостаза организма. В ее основе лежит фундаментальное свойство живого - способность различать «свое» и «не свое». Возникновение иммунной системы связывают с возникновением многоклеточных животных. По мере их усложнения происходит и совершенствование защитных систем, достигающих у позвоночных наибольшего развития (Купер, 1980). В то же время, единственный путь, который позволяет изучить процесс становления отдельных элементов иммунной системы позвоночных и их взаимосвязь и перейти к пониманию явления иммунной защиты в целом, это обращение к более древним формам жизни (Ройт и др., 2000). Актуальным в этой связи представляется исследование защитной системы иглокожих - примитивных представителей вторичноротых животных, близких к предковым формам. Поэтому их иммунную систему гипотетически можно рассматривать в качестве исходной по отношению к иммунной системе эволюционно более продвинутых форм (Кудрявцев, Полевщиков, 2004). Кроме того, ранее было показано, что, несмотря на наличие многих примитивных черт, иммунная система иглокожих обладает и рядом особенностей (МСЛ, наличие компонентов системы комплемента, интерлейкиноподобных белков, и т.д.), которые, по-видимому, и привели к возникновению сложной иммунной системы позвоночных (Matranga, 1995; Smith et al., 1998; Clow et al., 2000; Елисейкина и др., 2001).

Цель и задачи работы. Цель представленной работы: установить механизмы участия целомоцитов иглокожих в защитных реакциях, направленных на поддержание антигенного и структурного гомеостаза организма. В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

1) Охарактеризовать клеточный cocTJbmjiUMUUHiUB' у чпырех видов иглоко-

нОС. НАЦИОНАЛЬНА*

БИБЛИйТИКА С.Пст <i

03 ----------^

жМ

жих, имеющих разное систематическое положение и ведущих различный образ жизни.

2) Изучить роль целомоцитов в защитных реакциях, возникающих в результате воздействия различных факторов, и установить возможную взаимосвязь клеточных и гуморальных компонентов иммунитета.

3) Исследовать механизмы восстановления популяции целомоцитов в ходе регенерации у дальневосточного трепанга.

Научная новизна. Впервые с использованием методов световой и электронной микроскопии и гистохимии проведено комплексное исследование клеточного состава целомической жидкости (ЦЖ) у четырех видов иглокожих: Apostichopus japonicus (Holothuroidea, Aspidochirota), Cucumaria japonica (Holothuroidea, Dendrochirota), Eupentacta fraudatrix (Holothuroidea, Dendrochirota) и Strongylocentrotus nudus (Echinoidea, Regularia). Установлено, что несмотря на различия в систематическом положении и образе жизни, в ЦЖ исследуемых видов присутствуют одинаковые типы клеток - ювенильные клетки, амебоциты, морулярные клетки и жгутиковые клетки, выполняющие сходные и универсальные функции, в частности - защитную. Проведена серия экспериментов по стимуляции защитной системы иглокожих антигенами различной природы. В результате впервые показано закономерное изменение содержания клеточных и гуморальных (на примере маннан-связывающих лектинов - МСЛ) факторов иммунитета. Обнаружена положительная корреляция между концентрациями клеток ЦЖ и лектинов, что указывает на наличие у иглокожих совокупного клеточного и гуморального иммунного ответа. Впервые показано, что восстановление популяции целомоцитов в экстремальных условиях, например, при регенерации, происходит не за счет пролиферации, а за счет миграции и дифференцировки низкодифференцированных клеток, таких как лимфоцитоподобные клетки стенки тела.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные вносят существенный вклад в относительно малоисследованную

область сравнительной иммунологии, связанную с изучением защитной системы иглокожих. Знание механизмов иммунитета важно для развития наших представлений об эволюции системы иммунитета в ряду вторичноротых животных. Кроме того, полученная нами информация является существенной частью знаний по биологии видов и может послужить фундаментом для оценки состояния популяции изученных видов иглокожих, имеющих промысловое значение.

Обнаруженная нами способность Yersinia pseudotuberculosis преодолевать наружные покровы и сохраняться длительное время в организме иглокожих позволяют рассматривать их как природный резервуар этих патогенных для человека бактерий.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на ежегодных конференциях ИБМ ДВО РАН (2000, 2003), на региональных естественнонаучных конференциях ДВГУ (1999-2001), на международном симпозиуме "8-th International Symposium on Yersinia" (Турку, Финляндия, 2002), на конференции «Фундаментальные исследования морской биоты» (НОЦ, ДВГУ, 2002), на международной конференции "11-th International Echinodem Conference" (Мюнхен, Германия, 2003), на ежегодной конференции ЦИН РАН «1-й съезд Общества клеточной биологии» (2003), на семинаре по морфологии, физиологии и биохимии ИБМ ДВО РАН (2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 5 глав, выводов и списка литературы (88 источника, из них 21 на русском языке). Работа изложена на 144 страницах, из них 95 машинописных листов, 52 рисунка (28 электроннограмм, 24 графика).

Работа выполнена при финансовой поддержке Президиума ДВО РАН «Конкурс молодых ученых ДВО РАН2002, 2003».

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на четырех видах дальневосточных иглокожих: Apostichopusjaponicus (Holothuroidea, Aspidochirota), Cucumaria

japonica (Holothuroidea, Dendrochirota), Eupentacta fraudatrix (Holothuroidea, Dendrochirota) и Strongylocentrotus nudus (Echinoidea, Regularia). Отлов животных производили в зал. Восток (Японское море) После отлова животных помещали в аквариумы с аэрируемой морской водой. Эксперименты с использованием бактерий Yeirsinia pseudotuberculosis проводили на базе НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН.

Световая микроскопия. Для морфологических исследований образцы ЦЖ фиксировали 25% глутаральдегидом, так чтобы конечная концентрация фиксатора в образцах составила 2,5%. Материал обезвоживали в этиловом спирте и ацетоне и заливали в смесь аралдита и эпона. Полутонкие срезы, полученные на ультрамикротоме Ultracut E (Reichert), окрашивали 1% раствором метиленового синего на буре. В работе также использовали следующие гистохимические методы: ШИК-реакцию для выявления нейтральных полисахаридов, окрашивание прочным зеленым при рН 2,2 на общие белки, альциановым синим при рН 1 и 2,5 на гликозаминогликаны и судановым черным В на общие липиды (Луппа, 1980).

Электронная микроскопия. Материал фиксировали глутаровым альдегидом (см. выше). Дофиксацию проводили 1% раствором OsO4 в течение 1 часа. Материал обезвоживали в этиловом спирте и ацетоне и заливали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы изготавливали на ультрамикротоме Ulatracut E (Reichert), контрастировали растворами уранилацетата и цитрата свинца. Затем материал анализировали на электронных микроскопах Jem 100 S и Jem 100 В (Jeol).

Микробиологические методы. В качестве бактериальных антигенов в работе использовались 2 вида микроорганизмов: Yersinia pseudotuberculosis и Vibrio sp. Бактерии Y. pseudotuberculosis штамм 2517 (Ш-й серовар, получен от больного, из Международной коллекции, институт Пастера, Париж, Франция) предоставлены музеем живых культур НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Бактерии Vibrio sp. были выделены из особей дальневосточного трепанга, имеющих внешние признаки заболевания (потеря

двигательной активности, изъязвление наружных покровов). Для последующих экспериментов бактерий культивировали на питательном агаре при температуре 6-8°С в течение 36-48 часов, готовили разведения для опытов, согласно стандарту (Государственный институт контроля биологических препаратов им. Тарасевича Л. А.). Для подсчета концентрации бактерий псевдотуберкулеза у дальневосточного трепанга и морского ежа образцы ЦЖ сеяли на дифференциально-диагностическую среду 67 (Серов, 1967). Инкубировали посевы при температуре 37°С и комнатной температуре в течение 36-48 часов. Подсчитывали число выросших колоний.

Биохимические методы. Лектинную активность ЦЖ определяли с использованием реакции прямой гемагглютинации (РПГА) трипсинизированных эритроцитов нулевой группы крови человека (подробное описание см.: Петрова, 2002).

Иммунохимические методы. Определение концентрации маннан-связывающего лектина (МСЛ) в ЦЖ дальневосточного трепанга и морского ежа производили методом иммуноферментного анализа - ИФА (подробное описание см.: Петрова, 2002).

Методы иммуноцитохимии. Для выявления ДНК-синтезирующей активности в тканях и органах регенерирующих особей дальневосточного трепанга в полость тела последним однократно вводили по 1 мл 1% раствора 5-бромо-2'-дезоксиуридина (БДУ). Образцы тканей и ЦЖ фиксировали 4% параформальдегидом на изотоничном фосфатном буфере (ФБС) рН 7,5 через 1, 3, 6, 9, 12, 24 часов. Материал заключали в гидрофильную смолу LR-White (Polisciences), изготавливали полутонкие и ультратонкие срезы на ультрамикротоме Ultracut E (Reichert). Срезы обрабатывали раствором поликлональных антител против БДУ в 0,1 М ФБС, рН 7,5, в течение 24 часов при температуре 4°С и промывали ФБС. Затем на полутонкие срезы наносили раствор вторичных антител, конъюгированных с

флюоресцеинизотиоцианатом (FITC). После промывки срезы заключали в 0,3% раствор пропилгаллата на глицерине. Препараты просматривали на

люминесцентном микроскопе Polivar (Reichert) при длине волны 450 нм. В качестве контроля использовали срезы, обработанные вместо первичных антител к БДУ неиммунной сывороткой крупного рогатого скота.

Для выявления пролиферирующих клеток использовали также антитела против циклинов - белков-маркеров клеточного деления. Материал фиксировали 4% параформальдегидом на ФБС, рН 7,5 через 15, 30, 60 мин, 3 и 24 часа после эвисцерации и заливали в среду LR-White. Полутонкие срезы обрабатывали антителами против циклинов (ICN) на ФБС, рН 7,5 в течение 24 часов при температуре 4°С. Затем материал промывали и обрабатывали вторичными антителами, меченными FITC. В качестве контроля использовали срезы, обработанные вместо первичных антител неиммунной сывороткой крупного рогатого скота. Ультратонкие срезы для электронной иммуноцитохимии обрабатывали раствором антител против циклинов в 0,1 М ФБС, рН 7,5 в течение 24 часов, промывали ФБС, затем наносили раствор вторичных антител, конъюгированных с коллоидным золотом. Препараты просматривали в электронном трасмиссионном микроскопе Jem 100 S (Jeol).

Для исследования защитных реакций у Л. japonicus в качестве антигенов использовали бактерий Y. pseudotuberculosis, а также их лизат и термостабильный токсин. В опыте использовали четыре группы животных по 3-5 особей. Животным первой группы в целомическую полость вводили по 109 кл/мл живых Y. pseudotuberculosis, второй группы - лизат бактерий по 570 мкг, третьей группы - токсин, по 230 мкг на животное. Четвертую группу составили контрольные интактные животные.

Для исследования защитных реакций у S. nudus в качестве антигенов использовали бактерий Y. pseudotuberculosis и Vibrio sp. В эксперименте использовали три группы животных по 3-5 особей. Животным первой группы в целомическую полость вводили по 109 кл/мл живых Y. pseudotuberculosis, второй группы - по 109 кл/мл живых Vibrio sp. Третью группу составили контрольные интактные животные.

Для исследования гуморальных факторов иммунитета отбирали пробы

ЦЖ перед инфицированием (контрольная точка), а затем, через 1 час, и через каждые сутки на протяжении всего эксперимента. Образцы хранили при температуре -18°С. Общую лектинную активность ЦЖ определяли в РПГА, содержание МСЛ - методом ИФА.

Клеточные защитные реакции изучали с использованием метода трансмиссионной электронной микроскопии. ЦЖ отбирали через 1 час и на 1, 3, 6, 10 и 25 сутки после начала эксперимента, фиксировали 25% глутаральдегидом, так чтобы конечная концентрация фиксатора в образцах составила 2,5%. Последующую обработку материала для электронно-микроскопических исследований производили по методике, описанной выше. В ходе эксперимента подсчитывали концентрацию целомоцитов в ЦЖ в камере Горяева (Роскин, 1946). Пробы ЦЖ брали перед заражением (контрольная точка) и затем каждые сутки в течение опыта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. морфология целомоцитов иглокожих 1.1. Ювенильные клетки Наиболее многочисленной разновидностью целомоцитов у изученных нами видов иглокожих являются ювенильные клетки, доля которых у голотурий обычно составляет около 60%, а у морского ежа - 35% от общего числа клеток ЦЖ. Судя по состоянию ядра (плотного гиперхромного без четко выраженного ядрышка) и цитоплазмы (небольшой, электроноплотной), эти клетки являются низкодифференцированными и, вероятно, могут рассматриваться как предшественники по крайней мере некоторых линий дифференцировки целомоцитов. В цитоплазме ювенильных клеток, как правило, содержится хорошо развитый клеточный центр с отходящими от него микротрубочками (Рис. 1 А). Наличие клеточного центра может указывать на недавно прошедшее деление клеток. Характерным признаком этих клеток является наличие ядра каплевидной формы с небольшим углублением, в котором располагаются структуры клеточного центра. Цитоплазма ювенильных клеток слабо развита и почти не содержит органо-

Рис 1. Целомоциты иглокожих А - ювенильная клетка с клеточным центром, Б -ювенильная клетка I разновидности, В - ювенильная клетка II разновидности, Г -амебоцит, Д - вакуолизированный амебоцит, Е - «молодая» морулярная клетка, Ж -морулярная клетка с гетерогенными гранулами (II разновидность) АГ- аппарат Гольджи, м - митохондрии, от - остаточное тельце, се - секреторная вакуоль, сг - секреторная гранула, шэр - шероховатый эндоплазматический ретикулум, кц - клеточный центр, яд -ядро, яр - ядрышко

идов. Однако часть ювенильных клеток имеет более развитую цитоплазму, содержащую либо многочисленные везикулы (ювенильные клетки I разновидности, Рис. 1 Б),либо плотно расположенные цистерны ШЭР (ювенильные клетки II разновидности, Рис. 1 В). Вероятно, первая разновидность дает начало клеткам амебоцитарного, а вторая - морулярного рядов дифференцировки целомоцитов.

1.2. Амебоциты

Вторым по численности типом целомоцитов у изученных видов иглокожих являются амебоциты (Рис. 1 Г), среди которых выделяются субпопуляции мелких и крупных клеток, различающиеся объемом цитоплазмы и степенью развитости гетеросинтетического аппарата. В большей степени он развит у крупных амебоцитов, где представлен длинными концентрически расположенными вокруг ядра цистернами ШЭР и диктиосомами АГ. Очевидно, эти разновидности являются стадиями жизненного цикла клеток одного типа (амебоцитов). Как и у других иглокожих (Edds, 1984), у исследованных нами видов на прижизненных препаратах выявляются две формы амебоцитов - петалоидная и филоподиальная. Полагают, что петалоидные амебоциты ответственны за фагоцитоз чужеродных частиц, а филоподиальные участвуют в заживлении ран и образовании сгустка (Smith, 1981; Коренбаум, 1989). В целом, амебоциты ответственны за клеточные механизмы «иммунитета» иглокожих, осуществляя фагоцитоз чужеродных частиц, участвуя в образовании коричневых тел и формировании сгустка (Karp, Koffaro, 1982; Коренбаум, Воробьев, 1988; Canicatti et al., 1989b; Smiley, 1994; Chia, Xing, 1996; Matranga, 1996). Особая разновидность амебоцитов - это клетки с вакуолизированной цитоплазмой, редко встречающиеся в норме, но в достаточно большом количестве присутствующие в ЦЖ животных, защитная система которых стимулирована введением чужеродных агентов (Рис. 1 Д). По морфологии эти клетки напоминают кальциевые (Smiley, 1994) и, возможно, служат его источником в ЦЖ. Присутствие кальция необходимо

для осуществления многих защитных механизмов, в том числе действия Са2+-зависимых лектинов - одного из основных факторов гуморальной защиты у иглокожих и у беспозвоночных в целом (Arason, 1996).

1.3. Морулярные клетки

Другая гетерогенная субпопуляция целомоцитов у изучаемых видов иглокожих - это гранулосодержащие морулярные клетки (Рис. 1 Е, Ж и 2 А -В). Известно, что эти клетки участвуют в синтезе основного вещества соединительной ткани (Byrne, 1989), образуют «коричневые тела» (Canicatti et al., 1989) и являются местом биосинтеза многих гуморальных факторов иммунитета (Matranga, 1996).

У изученных видов иглокожих нами выявлено несколько разновидностей мурулярных клеток. К «молодым» морулярным клеткам отнесены клетки сравнительно небольшого размера, содержащие немногочисленные секреторные гранулы (Рис. 1 Е). Эти клетки имеют функционально-активное ядро и цитоплазму с хорошо развитым гетеросинтетическим аппаратом, представленным длинными концентрически расположенными вокруг ядра цистернами ШЭР и диктиосомами АГ. Цитоплазма заполнена секреторными везикулами. По мере созревания морулярных клеток происходит нарастание количества секрета. У «зрелых» морулярных клеток свободная цитоплазма отсутствует, и весь ее объем заполнен секреторными гранулами. Ядро у «зрелых» морулярных клеток гиперхромное, часто неправильной формы, пикнотическое (Рис. 1 Ж и 2 А-В). У голотурий наиболее многочисленной разновидностью морулярных клеток являются клетки, которые, согласно Каникатти с коллегами (Canicatti et al., 1989), следует отнести ко II разновидности (Рис. 1 Ж). Цитоплазма клеток заполнена гетерогенными секреторными гранулами, центральная часть которых содержит электроноплотное «ядро» из белков, липидов и нейтральных полисахаридов, окруженное рыхлой фибриллярной оболочкой из кислых полисахаридов. Еще одной разновидностью морулярных клеток являются клетки, содержащие гомогенные гранулы, заполненные фибрил-

Рис. 2. Целомоциты иглокожих. А - морулярная клетка с гомогенными гранулами (I разновидность), Б - морулярная клетка с электроноплотными гранулами (III разновидность), В - вакуолизированная морулярная клетка (III разновидность), Г -кристаллическая клетка, Д - гемоцит. Mm - микротрубочки, от - остаточное тельце, св -секреторная вакуоль, сг - секреторная гранула, яд - ядро.

лярным секретом, состоящим из кислых полисахаридов и белков (Рис. 2 А). Согласно Каникатти с соавторами (Canicatti et в1., 1989), это клетки I разновидности. Кроме того, у дальневосточного трепанга встречаются небольшие клетки диаметром 5,4+0,4 мкм, содержащие либо

электроноплотные гранулы, либо вакуоли с электронопрозрачным содержимым (Рис. 2 Б, Г). Вероятно, они соответствуют морулярным клеткам III разновидности (Canicatti et al., 1989).

1.4. Жгутиковые клетки

В ЦЖ иглокожих, помимо преобладающих по численности амебоцитов и морулярных клеток, присутствуют жгутиковые клетки. Жгутиковые клетки голотурий представляют собой мелкие клетки диаметром 2,5-3 мкм и длинным жгутиком длиной около 40 мкм. Жгутиковые клетки морского ежа S. nudus в отличие от таковых у голотурий, гораздо большего диаметра (5-7 мкм) и содержат в цитоплазме множество мелких везикул. На электроннограммах жгутиковые клетки идентифицировать не удалось. Считается, что жгутиковые клетки иглокожих являются разновидностью ювенильных клеток, давая начало всем или некоторым целомоцитам (Исаева, 1994). Однако некоторыми авторами показано, что жгутиковые клетки морских ежей являются долгоживущей непролиферирующей популяцией клеток ЦЖ (Holland et al., 1965). Кроме того, была показана способность этих клеток благодаря хемотаксису быстро перемещаться в зону воспаления, где они участвуют в коагуляции ЦЖ, осуществляя защитную функцию (Johnson, 1969 а, b).

1.5. Кристаллические клетки

Кристаллические клетки (Рис. 2 Г) были обнаружены только в ЦЖ голотурий. Эти клетки имеют ромбовидную или прямоугольную форму. Гиперхромное ядро серповидной формы располагается на периферии клетки. Большую часть цитоплазмы занимает вакуоль. Согласно нашим наблюдениям, а также литературным данным (Smiley, 1994), эти клетки участвуют в процессе осморегуляции. При изменении осмотического давления происходит обратимая кристаллизация содержимого вакуоли, что, вероятно, приводит к нормализации осмотического давления в ЦЖ.

1.6. Гемоциты

В ЦЖ у некоторых видов иглокожих имеются клетки, содержащие ды-

хательный пигмент и участвующие в газообмене - гемоциты (Smith, 1981; Fontain, Lambert, 1977; Fontain, Holl, 1981). У изученных нами видов гемоциты обнаружены лишь у С. japonica и Е. fraudatrix. Клетки этого типа (Рис. 2 Д) имеют базофильную электроноплотную цитоплазму, содержащую дыхательный пигмент. У A. japonicus, представителя отряда Aspidochirota, и морского ежа S. nudus, гемоциты отсутствуют, а функцию переноса кислорода, вероятно, выполняет пигмент, растворенный непосредственно в ЦЖ.

Таким образом, у всех исследованных нами видов иглокожих в ЦЖ присутствуют сходные типы целомоцитов - ювенильные клетки, амебоциты, морулярные клетки и жгутиковые клетки. Целомоциты этих типов выполняют универсальные функции в организме, обеспечивая его жизнедеятельность. Влияние особенностей образа жизни и характера питания на клеточный состав ЦЖ у исследованных иглокожих выражается лишь в отсутствии гемоцитов у A. japonicus, а также гемоцитов и кристаллических клеток у S. nudus.

2. происхождение и гистогенез целомоцитов ИГЛОКОЖИХ

Целомоциты выполняют в организме иглокожих множесто функций, связанных с запасанием питательных веществ, переносом кислорода и углекислого газа, участием в защитных реакциях и т.д, в результате чего популяция этих клеток постоянно истощается. Кроме того, характерная для некоторых иглокожих сезонная эвисцерация внутренних органов также приводит к потере большей части ЦЖ вместе с содержащимися в ней целомоцитами. Так, у дальневосточного трепанга полное восстановление комплекса внутренних органов после эвисцерации происходит в течение 30 дней (Шукалюк, Долматов, 2000), что делает этих животных удобным объектом для исследования гистогенезов.

Нами установлено, что у особей дальневосточного трепанга сразу же после эвисцерации наблюдается резкое снижение количества клеток в ЦЖ,

что объясняется, с одной стороны, потерей части ЦЖ, а с другой -расходованием целомоцитов в защитных реакциях, связанных с формированием тромба и удалением разрушенных клеток. Через 6 ч количество клеток в ЦЖ уже превышает в несколько раз значения, характерные для нормы (Рис. 3). При этом основную массу целомоцитов составляют ювенильные клетки. В последующие часы содержание разных типов целомоцитов в ЦЖ резко меняется: доля ювенильных клеток уменьшается, а доля амебоцитов и морулярных клеток - растет. Эта тенденция сохраняется и в течение последующих суток (1-4 сут). Уменьшение популяции ювенильных клеток вероятно связано с их дифференцировкой в амебоциты и морулярные клетки. Отсутствие картин митозов на протяжении всего срока наблюдения указывает на то, что восстановление клеточного состава ЦЖ в первые часы после эвисцерации происходит за счет миграции низкодифференцированных клеток из тканей, составляющих стенку тела, и их последующей дифференцировки.

Кл/мл

Время, часы

Рис. 3. Концентрация целомоцитов ЦЖ Л.]аротсых в ходе регенерации.

Это предположение подтверждают и исследования клеточного состава ЦЖ и стенки тела в течение 24 часов после эвисцерации. Показано наличие сходных клеточных типов в ЦЖ и в тканях, образующих стенку тела. Как в целомической полости, так и в соединительной ткани стенки тела имелись

клетки с ядром каплевидной формы, клеточным центром и неразвитой цитоплазмой (Рис. 4 А, Б) - признаками ювенильных клеток.

Рис. 4. Низкодифференцированные клетки в ЦЖ (А) и соединительной ткани стенки тела (Б) у регенерирующих особей А. уарогисж■ Кц — клеточный центр, яд - ядро.

В ходе регенерации происходит заметное уменьшение содержания морулярных и лимфоцитоподобных клеток в соединительной ткани стенки тела, вероятно в результате их миграции и выселения в целомическую полость. В ЦЖ, напротив, происходит увеличение количества клеток.

После эвисцерации миграция охватывает не только лимфоцитоподобные и морулярные клетки, но и другие клеточные элементы, составляющие стенку тела. Так, клетки целомического эпителия открепляются от базальной мембраны и в дальнейшем обнаруживаются в целомической полости. Миграционные процессы затрагивают и мышечные клетки, при этом сократительный аппарат миоцитов дегенерирует и преобразуется в «веретеновидные структуры», которые затем элиминируются. Впоследствии дедифференцированные миоциты, вероятно, могут принимать участие в процессах регенерации, в частности, в восстановлении клеточного состава целомического эпителия, выстилающего полость тела. Это предположение согласуется с концепцией о единстве происхождения целомического эпителия и мышц у иглокожих (Долматов, 1996) и с данными об участии клеток целомического эпителия в регенерации продольных мышечных лент у голотурий (Гинанова, 2000).

Необходимо отметить, что на протяжении всего периода наблюдений в тканях, составляющих стенку тела, также как и в ЦЖ, отсутствуют картины

митозов. Отсутствие пролиферации подтверждают и опыты с использованием БДУ, предшественника синтеза ДНК и антител на циклины - белки, считающиеся маркерами пролиферации.

Таким образом, востановление клеточного состава ЦЖ трепанга в первые часы после эвисцерации происходит за счет миграции клеток из тканей, составляющих стенку тела, в целомическую полость. При этом лимфоцитоподобные клетки соединительной ткани, вероятно, являются предшественниками ювенильных клеток ЦЖ. В свою очередь, ювенильные клетки дают начало клеткам амебоцитарного и морулярного рядов дифференцировки целомоцитов.

3. защитные реакции целомоцитов иглокожих

Защитную систему A. japonicus и 5. nudus стимулировали введением в ЦЖ бактерий Y. pseudotuberculosis, их лизата и термостабильного токсина, а также бактерий Vibrio sp. Нами показано, что введение в целомическую полость A. japonicus и 5. nudus чужеродных агентов, независимо от их природы, вызывает резкое изменение содержания клеток в ЦЖ (Рис. 5). Уменьшение в первые часы эксперимента общей концентрации целомоцитов отражает их использование в ходе защитных реакций, а последующее увеличение связано с выселением в ЦЖ низкодифференцированных клеток и последующей их дифференцировкой в амебоциты и морулярные клетки. В ходе иммунного ответа происходит резкое изменение суммарной лектинной активности и МСЛ в ЦЖ, как следствие их участия в защитных реакциях (Рис. 6). Снижение содержания лектинов на 1-2 сутки после заражения связано с их расходованием в защитных реакциях, в которых они, по-видимому, выступают в роли агглютининов и опсонинов. Наблюдаемый затем рост содержания лектинов указывает на индукцию его синтеза целомоцитами.

При сравнении результатов подсчета целомоцитов разных типов и определения содержания лектинов в ЦД становится очевидным, что количество целомоцитов различных типов, суммарная лектинная активность

Рис. 5. Концентрация целомоцитов в ЦЖ A. japoncus, инфицированного Y. Pseudotuberculosis.

Рис. 6. Суммарная лектинная акшвностъ и содержание МСЛ в ЦЖ A. japoncus, инфицированного Y. pseudotuberculosis.

и содержание МСЛ в ЦЖ в ходе защитных реакций, у исследованных иглокожих изменяются циклически, а характер колебаний индивидуален. Кроме того, установлена ярко выраженная положительная корреляция между общим количеством целомоцитов и содержанием лектинов в ЦЖ дальневосточного трепанга и морского ежа.

Важнейшим защитным механизмом у иглокожих являются клеточные реакции, опосредуемые целомоцитами и направленные на поддержание антигенного гомеостаза (Johnson, 1969; Bertheusen, Seljelid, 1978; Кудрявцев, Полевщиков, 2004). Целомоциты в ответ на проникновение антигена во

внутреннюю среду организма участвуют в реакциях фагоцитоза, инкапсуляции инородного материала и специфического клеточно-опосредованного цитотоксического эффекта (Cooper, 1976). Бактерии У. pseudotuberculosis при попадании в целомическую полость A. japonicus и S. nudus погружаются в рыхлое фибриллярное вещество, в выработке которого принимают участие морулярные клетки (Рис. 7 А, Б). Очевидно, лектины, в том числе МСЛ, являются компонентом этой «молекулярной ловушки». Они органичивают подвижность микроорганизмов и способствуют агглютинации бактерий. Часть бактерий, обнаруженных в агрегатах, лизирована, что связано с действием цитотоксических факторов (Рис. 7 Б). За выработку цитотоксических факторов ответственны как амебоциты, так и морулярные клетки. Затем бактерии, окруженные фибриллярным веществом, адгезируют к поверхности целомоцитов (Рис. 7 В). Адгезия чужеродных частиц к поверхности амебоцитов является первым шагом к фагоцитозу. Амебоциты уже в первые часы после начала эксперимента содержат множество фагосом с заключенными в них бактериальными клетками (Рис. 7 Г).У S. nudus наряду с фагоцитозом в ЦЖ наблюдается формирование агрегатов амебоцитов. У А. japonicus формирование таких агрегатов наблюдалось лишь через 1 сут после начала эксперимента. Как правило, в состав агрегатов помимо амебоцитов входят и морулярные клетки, часть из которых разрушается (Рис. 7 Д). В литературе подобные агрегаты были названы коричневыми телами (Canicatti et al., 1989; Jang et al., 1996). Позднее коричневые тела у S. nudus и А. japonicus окружались несколькими слоями амебоцитов, что описано и для других видов иглокожих (Рис. 7 Г). Коричневые тела являются активными структурами, в которых происходит разложение веществ под действием гидролитических ферментов (Canicatti et al., 1989). Часть фагоцитирующих амебоцитов, не принимающих участие в формировании коричневых тел, сливается друг с другом с образованием крупного многоядерного синцития (Рис. 7 Ж). Фагосомы многоядерных клеток как у A. japonicus, так и у S. nudus, сливаются, образуя одну крупную пищеварительную вакуоль. Форми-

Рис. 7. Защитные реакции целомоцитов иглокожих в ответ на бактериальные антигены. Сг

- секреторная гранула, фп - филоподии, фм - фибриллярный материал, фс - фагосома, яд

- ядро, яр - ядрышко. Стрелками указаны бактериальные клетки.

рование подобных многоядерных клеток в ответ на введение антигенов отмечалось и у других видов иглокожих, а также у представителей других таксономических групп (насекомых, моллюсков и кольчатых червей), являясь общим механизмом, характерным для всех беспозвоночных (Cheng, Galliway, 1970; Canicatti et al., 1989; Silva, Peck, 2000). Слияние клеток с формированием многоядерного синцития отмечено также у позвоночных (Much et al., 1982). Предполагается, что образование многоядерных клеток является одним из путей формирования коричневых тел (Silva, Peck, 2000). Однако, согласно литературным данным (Canicatti et al., 1989) и нашим наблюдениям, амебоциты, образующие коричневые тела, не сливаются. Таким образом, образование многоядерных амебоцитов наравне с коричневыми телами можно рассматривать как отдельный механизм утилизации чужеродного материала у иглокожих.

Реакция целомоцитов Л.japonicus и S. nudus на Vibrio sp. в первые часы наблюдения была сходной с таковой, описанной для Y. pseudotuberculosis. Бактериальные клетки погружаются в фибриллярный матрикс, агглютинируют, образуя агрегаты, адгезируются к поверхности целомоцитов и фагоцитируются ими. Однако механизм токсического действия Vibrio sp. отличается от такового иерсиний. Вибрионы вызывают лизис и разрушение клеток тканей подопытных животных, что в конечном итоге приводит к их гибели. Строение бактерий также подвергается значительным изменениям, что отражает их приспособление к враждебным условиям среды.

Моделирование естественной бактериальной инвазии у иглокожих показало, что бактерии Y. pseudotuberculosis способны проникать в организм A. japonicus и S. nudus через наружные покровы и вызывать защитные реакции с участием клеток ЦЖ (Рис. 8 А-Г). Известно, что иерсиний могут проникать в эпителиальные клетки позвоночных, индуцируя процесс незавершенного фагоцитоза (Finlay, Falkow, 1997). Иерсиний в наших экспериментах индуцировали незавершенный фагоцитоз в клетках покровного эпителия A japonicus и в покровном эпителии амбулакральных

Рис. 8. Взаимодействие клеток кожного эпителия дальневосточного трепанга с бактериями Y. pseudotuberculosis. Яд - ядро, яр - ядрышко. Стрелками указаны бактериальные клетки.

ножек S. nudus (Рис. 8 А). Затем иерсинии разрушали мембрану фагосом и через плазматическую мембрану попадали в межклеточное пространство (Рис. 8 В-Г). Впоследствии их обнаруживали в ЦЖ подопытных животных. После попадания в ЦЖ происходила активация защитных реакций, в ходе которых, в одном случае, одиночные либо слившиеся в синцитий амебоциты фагоцитировали Y. pseudotuberculosis с последующим формированием крупной пищеварительной вакуоли и лизисом бактерий, а в другом случае морулярные клетки вместе с амебоцитами формировали коричневые тела -специализированные защитные экскреторные структуры.

ВЫВОДЫ

1. В ЦЖ четырех видов иглокожих {Apostichopus japonicus, Cucumaria japonica, Eupentacta fraudatrix и Strongylocentrotus nudus) имеются сходные типы целомоцитов: ювенильные клетки, амебоциты, морулярные и жгутиковые клетки. Основными клетками, осуществляющими защитные функции, являются амебоциты, ответственные за фагоцитоз, и морулярные клетки, синтезирующие гуморальные факторы иммунитета. Видовые различия проявляются лишь в наличии (или отсутствии) в ЦЖ типов клеток, направленных на выполнение определенных физиологических функций.

2. В стенке тела A. japonicus обнаружена резервная популяция низкодифференцированных клеток, которые в экспериментальных условиях могут выселяться в целомическую полость и давать начало клеткам амебоцитарного и морулярного рядов дифференцировки.

3. Восстановление клеточного состава ЦЖ после эвисцерации у дальневосточного трепанга происходит не за счет пролиферации, а за счет миграции и последующей дифференцировки низкодифференцированных клеток или за счет трансдифференцировки клеток тканей, составляющих стенку тела.

4. Стимуляция защитной системы иглокожих антигенами различной природы вызывает неспецифический совокупный иммунный ответ. Установлена положительная корреляция между изменением числа основных типов целомоцитов и содержанием лектинов в ЦЖ в ходе иммунного ответа.

5. Показано, что бактерии Y. pseudotuberculosis способны проникать через тканевые барьеры A. japonicus и S. nudus и вызывать защитные реакции с участием клеток ЦЖ. Элиминация бактерий осуществляется двумя путями: первый связан с формированием коричневых тел, а второй обеспечивается слиянием амебоцитов в многоядерный синцитий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Магарламов Т.Ю., Елисейкина М.Г. Целомоциты трех видов дальневосточных голотурий // II Региональная конференция по актуальным проблемам морской биологии. 1999. Владивосток: Изд-во ДВГУ. С. 95-97.

2. Магарламов Т.Ю., Елисейкина М.Г. Изменение содержания разных типов целомоцитов в целомической жидкости дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus в ходе «иммунного» ответа, стимулированного введением бактерий Yersinia pseudotuberculosis II III Региональная конференция по актуальным проблемам морской биологии. 2000. Владивосток: Изд-во ДВГУ. С. 59-62

3. Магарламов Т.Ю., Елисейкина М.Г. Защитные реакции дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus при введении бактерий псевдотуберкулеза // IV Региональная конференция по актуальным проблемам морской биологии. 2001. Владивосток: Изд-во ДВГУ. С. 86-89.

4. Елисейкина М.Г., Тимченко Н.Ф., Недашковская Е.П., Магарламов Т.Ю., Петрова И.Ю., Галимова А.Р. Взаимодействие Yersinia pseudotuberculosis и ее токсинов с компонентами иммунной системы морских беспозвоночных животных // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. №. 1. С. 28-32.

5. Елисейкина М.Г., Магарламов Т.Ю. Морфология целомоцитов голотурий Apostichopus japonicus (Aspidochirota: Stichopodidae) и Cucumaria japonica (Dendrochirota: Cucumariidae) // Биология моря. 2002. Т. 28, №. 3. С. 214219.

6. Магарламов Т.Ю., Беленева И.В., Елисейкина М.Г. Действие морских бактерий, выделенных из трепанга Apostichopus japonicus, на организм и культуру эмбриональных клеток морского ежа Strongylocentrotus nudus II Материалы конференции «Фундаментальные исследования морской биоты». 2002. Владивосток: Изд-во ДВГУ. С. 37-40.

7. Eliseikina M., Timchenko N., Bulgakov A., Magarlamov Т., Petrova I. Influence of Yersinia pseudotuberculosis on the immunity of Echinoderms // The Genus Yersinia Entering the Functional Genomic Era. 2003. P. 173-175.

8. Елисейкина М.Г., Булгаков АА., Магарламов Т.Ю., Петрова И.Ю. Целомоциты - основной компонент защитной системы иглокожих // Цитология. [Тезисы докладов] 2003. Т. 45. С. 873.

9. Eliseikina M., Timchenko N., Bulgakov A., Magarlamov Т., Petrova I. Influence of Yersinia pseudotuberculosis on the Immunity of Echinoderms // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. V. 529. P. 172-175.

10. Беленева И.А., Масленикова Э.Ф., Магарламов Т.Ю. Физико-биохимические свойства галофильных вибрионов Vibrio parahaemoliticus и Vibrio alginolyticus, изолированных из гидробионтов залива Петра Великого // Биология моря. 2004. Т. 30, №. 2. С. 114-119.

11. Eliseikina M.G., Petrova I.Yu, Magarlamov T.Yu., Dolmatov I.Yu., Bulgakov A.A. Mannan-binding lectins of echinoderms are components of humoral defense // Echinoderms: Munchen - Leiden - London - New York -Philadelphia - Singapore: Balkema. 2004. P. 119-126.

Тимур Юсифович МАГАРЛЛМОВ

ЦЕЛОМОЦИТЫ ИГЛОКОЖИХ И ИХ РОЛЬ В ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЯХ

Автореферат

Изд. лиц. № 05497 от 01.08.2001 г. Подписано к печати 22.11.2004 г. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Печать офсетная. Уел п.л. 1,5. Уч.-изд.л. 1,04. Тираж 100 экз. Заказ 166

Отпечатано в типографии ФГУП Издательство "Дальнаука" ДВО РАН 690041, г. Владивосток, ул. Радио,7

-2619 6